TW201105793A

TW201105793A - CHO/CERT cell lines

Info

Publication number: TW201105793A
Application number: TW099114252A
Authority: TW
Inventors: Lore Florin; Eric Becker; Hitto Kaufmann
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 2009-05-05
Filing date: 2010-05-04
Publication date: 2011-02-16
Also published as: EP2427557B1; EP2427557A1; WO2010128032A1; CN102498212B; US20120100553A1; SG175332A1; US9340592B2; CN102498212A; JP2012525826A; CA2759602A1; KR20120014899A

Description

201105793 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於細胞培養技術之領域，明確言之，係關於產生含有載體構築體之宿主細胞株之領域，該載體構築體包括N-(脂）醯基（神經）鞠氮醇轉移蛋白質（^^…心transfer protem ·’ CERT)表現卡匣。相較於非轉殖基因細胞株，該等細胞株具有經改善之分泌特性。【先前技術】生物藥劑用於人類療法的市場持續快速成長，在2〇1〇年，超過900種生物藥劑正以臨床研究進行評估，且預估有500億銷售額。近幾年中，由於哺乳動物細胞能正確地處理及修飾人類蛋白質，因此有越來越多的生物㈣❹ 自哺乳動物細胞。因此’從哺乳動物細胞成功且高產率地產生生物藥劑至關重要，且其係取決於製程中所用重組單一純系細胞株之特性。由於大多數生物藥劑是在生產過程期間從細胞所分泌之蛋白質，因此，針對新穎性宿主工程化策略而言，生產用細胞株之分泌運送架構是另一個關注的標的。蛋白質分泌作用是-種複雜的多步驟機轉：由基因決定被運运至胞外空間或外部質體膜之蛋白質首先係以共同轉譯方式輸送至内質網。於該處，該等蛋白質被封裝於脂質囊泡中，並被運送至高爾基體，且最終從反面高爾基網路 (fs-Gdgi network; TGN)運送至質體膜，在該處將蛋白質釋放至培養基中。 148131.doc 201105793 許夕工程化方法已採用日益瞭解可驅使諸如轉錄及轉譯之過程’以增加該等步驟產生蛋白f產率的分子網路。然而，對於任一多步驟生產過程而言，解決系列過程中早期步驟的瓶頸可能會使得在下游（尤其是轉譯作用後）產生瓶頸。已有報導指出’高到某一閾值以上，生產用細胞之比生產力係與產物基因之轉錄作用程度呈線性關連性。然而，在mRNA階段進一步加強產物表現會導致蛋白質合成作用、折叠或運送架構的負荷超載，而導致蛋白質產物在胞内累積。事實上，在現有之製造方法中經常看到此現象。因此’有需要改善用於產生重組蛋白質之宿主細胞的分泌能力。此在與新穎性轉錄加強技術組合時，及在高效價製程中甚至更為重要，以防止轉譯作用後之瓶頸及蛋白質產物之胞内累積作用。然而’先前以轉譯作用後架構為標靶之方法未竟全功，反倒疋會因研究所用的細胞株或產物、或初始生產力程度而產生了相反的結果： -過度表現ER-駐留型分子伴護蛋白Bip(結合蛋白質 BiP/GRP78)意外地導致分泌減少；酵素蛋白雙硫鍵異構酶（protein disulfide isomer as e ; PDI) 的加強表現顯示具有相反的結果。使用轉錄因子X-盒結合蛋白l(X_b〇x binding protein 1) (XBP-1)之分泌工程化方法經發現不是沒有作用，就是在加強分泌的同時使細胞凋亡性細胞死亡增加，導致表型不 148131.doc 201105793 穩定，且阻礙了高度表現ΧΒΡ-l選殖體之分離。因此，在達成對分泌運送架構之目標操縱的道路中，目前存在兩種主要阻礙：仍然有限之關於潛在調節機轉之知識，及需要防止生產用細胞同時出現生長抑制或細胞凋亡反應。【發明内容】本發明闡述兩種特定且新穎之生產用宿主細胞株 CHO/CERT 2.20 及 CHO/CERT 2.41。該等以編號 DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20) K DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)寄存於DSMZ之兩種細胞株為用於產生重組蛋白質之理想宿主細胞株，因為其具有經改善的分泌能力、及良好的生長特性。吾人最近已證明，藉由使與急性調節類脂醇生成相關之脂質轉移（START)區域家族中之蛋白質（較佳為N-(脂）醯基 (神經）鞘氮醇轉移蛋白質（CERT))過度表現的分泌工程化方法，提供一種有效改善蛋白生產之方法，該蛋白質係從真核細胞經由分泌途徑所運送的。參見以引用的方式併入文中之Florin等人，2009及專利申請案WO 2008/107388。 CERT(亦稱為古德巴斯得抗原結合蛋白質（Goodpasture antigen-binding protein))為一種細胞質蛋白質，該蛋白質對於將N-(脂）醯基（神經）鞘氮醇從其在内質網（ER)產生位置處以非囊泡方式運送至高爾基膜具有重要性，於高爾基膜處，可將N-(艏）醯基（神經）鞘氮醇轉換成成神經鞘磷脂 (SM)(Hanada等人，2003) 〇 148131.doc 201105793 吾人現在可證實，帶有Ser +Ala點突變，且不再被蛋白激酶D磷酸化之CERT突變體S132A比野生型蛋白質可明顯更有效地加強分泌。更進一步，吾人現在證明，CERT S132A表現程度係與其分泌加強效應具有關聯性，其意指：細胞中異種CERT S132A含量越高，該細胞之分泌能力越強（圖2)。為研究CERT S132A表現量與特異性抗體生產力之間的關聯性，吾人分析兩種具有低CERT突變體表現量之選殖細胞株及兩種具有高CERT突變體表現量之選殖細胞株，表現量之高低係由胞内FACS染色時之信號強度加以判定 (圖2 A)。在7天批次進料製程中，經偽轉染處理之對照細胞株所顯示之平均生產力為15 pcd(圖2B)。表現低含量 CERT S A突變體之細胞株的比生產力僅略為提高，而該等具有高含量之CERT突變體的細胞株則分泌出約23 pcd之 IgG產物，且因此顯示出較偽處理對照組明顯更高之比生產力（圖2B)。該等數據顯示，對重組蛋白質分泌之正面效應與CERT S132A過度表現程度之間存在關聯性。此外，吾人驚奇地證明，所挑選之細胞株CHO/CERT 8132人2.20及(：110/€£10'8132八2.41的生長較其他細胞株顯著更佳，且甚至比CHO野生型母細胞株生長更佳（圖5 A 及B)。良好的生長特性對生產用宿主細胞株而言特別重要，因為低生長能力對生物藥劑生產製程之多個態樣具有負面影響，因為其導致：

S 148131.doc -7- 201105793 細胞增殖時間延長’此導致發展細胞株之時間延長；單一細胞選殖後的效率降低，且此後生長緩慢；擴大規模期間的時間範圍會延長，尤其是接種體在大規模生產用發酵槽中的情況；每一發酵槽運作生產產量會降低。因此’經本發明解決之特定問題是產生一種經工程化 CERT S132A宿主細胞株，該細胞株顯示出：高程度表現CERT突變體S132A，及最理想的細胞生長。本發明闡述該等兩種經工程化CH0/CERT S132A細胞株之產生，該等細胞株具有最佳化的分泌作用及良好生長特性。本發明所提供之單株細胞株特別適於作為最佳宿主細胞系統，其對於重組蛋白產物的表現及製造具有強化的生產能力。該等兩種細胞株之產生方法為：用編碼人類cert S132A蛋白之表現構築體轉染CH〇_DG44宿主細胞株，且隨後經選擇產生出具有穩定性細胞庫。從這些細胞庫，藉由以FACS為基礎之單細胞選殖術獲得單株細胞株，並進仃進-步蒒選並鑑定特徵。共計分析1〇〇個以上之細胞株且最終以下列要求為基礎挑選出該兩種ch〇/cert S132A 細胞株 2.20 及 2.41 : 乂月已内染色及西方墨點法測定，CERT表現程度高；以接種細㈣備培養時’生長良好（存活率、增倍時間）；及 148131.doc 201105793 以批次進料培養時，生長最佳，其反映產業生產製程 (峰細胞密度、一段時間内活細胞之積分值（IVC)、存活率）。由於本發明所述細胞株僅包含以嘌呤黴素作為選擇標記，因此該等細胞株與最廣泛使用之選擇系統及增殖系統 DHFR、麩胺醯胺合成酶（GS)及新黴素（Neo)具有相容性，且因此可用於表現重組抗體，而無須調整/改變表現系統之設計。根據該等標準，吾人從所產生的1〇〇個以上之CHO/CERT S132A細胞株中，挑選出特定兩種新穎性衍生自CHO-〇〇44之單株細胞株，稱為細胞株2.20及細胞株2_41，該等細胞株被寄存於德國微生物與細胞培養物保存中心 (DSMZ ; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH): -吾人稱為「CHO/CERT 2.20」，且以編號DSM ACC2989寄存於DSMZ之細胞株具有極高之CERT SI32A表現程度及極佳生長特性，其甚至比CHO野生型母細胞之表現程度及生長特性更佳。藉由鑑別該細胞株細胞中所插入之DNA與鄰近染色體 DNA之間的連接片段可獨特闡述該細胞株。例如，該細胞株DNA可以一或多種限制酶消化，且（例如）利用該所插入 DNA的經適宜標記片段，以南方墨點分析法鑑別出該等連接片段，產生可鑑別基因組中所插入位點的特定條帶圖譜。該等限制酶例如闡述於下文，且包括EcoRV、

C 148131.doc 201105793

Hindlll、ΚρηΙ、Ncol、Ndel、PvuII、Spel、Xhol、 Avail、BstXI、Sail ° -吾人稱為「CHO/CERT 2.41」，且以編號DSM ACC2990寄存於DSMZ之細胞株具有極高之CERT S132A表現程度、及極佳生長特性，其甚至比DHO野生型母細胞的表現程度及生長特性更佳。藉由鑑別該細胞株細胞中所插入DNA與鄰近染色體DNA 之間的連接片段可獨特闡述該細胞株。例如，該細胞株 DNA可以一或多種限制酶消化，並（例如）利用該所插入 DNA之經適宜標記片段，以南方墨點分析法鑑別出該等連接片段，產生可鑑別基因組中所插入位點的特定條帶圖譜。該等限制酶例如闡述於下文，且包括EcoRV、 Hindlll、Kpnl、Ncol、Ndel、PvuII、Spel、Xhol、 Avail、BstXI、Sail。本發明因此特別闡述一種以編號DSM ACC2989寄存於 DSMZ之細胞株，及另一種以編號DSM ACC2990寄存於 DSMZ之細胞株。為實現本申請案之目的，該等兩種細胞株亦稱為「conCERT™」細胞株。較之CHO-DG44母細胞株，該等兩種細胞株在經相應表現質體轉染之後的分泌治療用蛋白產物之速率會增加，且生長特性良好。該等細胞株整併了 CHO-DG44宿主細胞株的優點（已良好闡述其特徵、經FDA核准、攜帶病毒風險低、高生產力、強韌、具有轉染能力、於無血清培養基中可懸浮生長）及在生產製程中具有強化分泌性與最佳化成 148131.doc •10- 201105793 果之新特性》本發明所述之特定conCERT™細胞株實例包含如圖1A及 B所述之編碼經flag標記之人類CERT突變體s 132A之表現卡匣（SEQ ID NO : 1) ’其包括衍生自巨細胞病毒 (cytomegalovirus ; CMV)啟動子/增強子區域之上游調節序列（600 bp)、與132位置處帶有點突變（Ser 132~>Ala)之人類CERT cDNA融合之N_末端Flag-抗原決定基標記、終止密碼子、及包含聚腺苷酸化信號之Y非轉譯區域。用於產生本發明所述conCERT™細胞株的載體構築體如圖1B所示，且其包含如下功能元件： -巨細胞病毒（CMV)增強子/啟動子、多選殖位點（MCS) ' 聚腺苷酸化信號； -CERT S132A表現卡匣； -於真核細胞中編碼作為選擇標記之嘌呤黴素N-乙醯基化轉移酶的表現卡匣； -複製起點；及 -β-内醯胺酶表現卡匣，用於在細菌中產生胺苄西林 (ampicillin)抗性。

conCERT™細胞株中抗體濃度顯著高於經穩定轉染之野生型細胞中所測得之效價，平均差異為1.5至2.5倍（圖6)。因此，於並列比較時，conCERT™細胞株所產生之產物效價顯著高於野生型CHO細胞。該等數據證實，相較於 DG44母細胞株，以編號DSMACC2989(CHO/CERT2.20)及 DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)寄存於 DSMZ 之 CHO/CERT

S 148I31.doc 201105793 S132A細胞為用於生產重組蛋白質之較佳宿主細胞。作為用於產生重組蛋白質之宿主細胞的c〇nCERTTM細胞特定實例係用於產生IgG4亞型及IgG1亞型抗體、Fc融合體蛋白質、單鏈-Fv(scFv)分子及奈米抗體。但c〇nCERTTM細胞亦為用於重組蛋白質生產以下其他蛋白質、多肽或其片段的較佳佰主細胞：諸如酵素、細胞激素、淋巴細胞活素、結構分子、黏附分子、受體及其衍生物或片段、及可作為促效劑或拮抗劑及/或具有治療或診斷用途之其他多肽。本發明所提供之細胞株能夠增加以真核細胞為基礎之生產製程的蛋白質產率。此將降低該等製程之生產成本，且同時減少為了產生於研究、診斷、臨床研究、或市場供應冶療用蛋白質時所需之物質而需要生產之批次數量。此外，本發明c〇nCERTTM細胞株將加快藥物發展，因為產生足夠數量之用於臨床前研究之物質通常對時程表而言係重要工作事務。本土明最佳c〇nCERTTM細胞株可用於產生一或數種用於斷目的研究目的（標乾識別、先導識別、先導最佳化）之特疋蛋白質，或用於製造供出售或臨床發展之治療用蛋質該等細胞株同樣可用於表現或產生分泌型或膜結合型蛋白質（諸如表面受體、GpCR、金屬蛋白酶或受體激酶）°玄等蛋白質具有相同之分泌途徑，且同樣係於脂質載體中運送。隨後該等蛋白質可用於意欲闡述細胞表面受 =功此特徵的研究，例如用於產生且隨後純化、結晶及/ 或刀析表面蛋白質。此對發展新穎性人類藥物療法特別重 ^8]3i.d0( 201105793 要，因為細胞表面受體為主要類別之藥物標靶。此外，其對研究與細胞表面受體相關之細胞内信號轉導複合物、或對分析部份藉由可溶性生長因子與彼等之位於同一或另一細胞上之對應受體的相互作用所介導之細胞-細胞-通信可能有利。【實施方式】通常具體化文字「包括」或「包含」涵蓋更特定具體化文字「由…組成」。此外，單數及複數形式係依不限制性方式使用。本發明範圍中所用之術語具有如下含義。術語「CERT」係指N-(脂）醯基（神經）鞘氮醇轉移蛋白質 CERT，其亦稱為古德巴斯得抗原結合蛋白質（Goodpasture antigen-binding protein)。CERT為一種細胞質蛋白，其對於將N-(脂）醯基（神經）鞘氮醇從其在内質網（ER)產生位置處以非囊泡方式運送至高爾基膜具有重要性，並於高爾基膜處，可將N-(脂）醯基（神經）鞘氮醇轉換成神經鞘磷脂 (SM)(Hanada等人，2003)。術語「CHO/CERT」/「CHO/CERT SA」/「CHO/CERT S13 2 A」可相互交換使用。此外，可相互交換使用細胞株名稱「CHO/CERT 2.20」/「CHO/CERT SA 2.20」/「CHO/ CERT SI32A 2.20」，且其所有均闡述以寄存編號DSMZ DSM ACC2989寄存之相同細胞株-細胞株2.20。可相互交換使用細月包株名稱「CHO/CERT 2.41」、「CHO/CERT SA 2.41」、「CHO/CERT S132A 2.41」，且其所有均闡述以寄存 148131.doc •13· 201105793 編號DSMZ DSM ACC2990寄存之相同細胞株-細胞株 2.4卜術語「衍生物」一般包括適於實現本發明所需用途的序列，其意指該等序列可介導細胞中分泌運送的增加。「宿主細胞」於本發明中係意指諸如倉鼠細胞之細胞，較佳為 BHK21、ΒΗΚ ΤΚ_、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1、及 CHO-DG44細胞；或為任一該細胞株之衍生物/子代。特佳者為（^0-0044、0110-DUKX、CHO-K1、CHO-S 及 BHK21，且更佳者為 CHO-DG44及CHO-DUKX細胞。於本發明另一項實施例中，宿主細胞亦意指鼠骨髓瘤細胞，較佳為NS0及Sp2/0細胞，或為任一該細胞株之衍生物/子代。亦可用於本發明之含意的鼠及倉鼠細胞實例概括於表1中。然而，該等細胞之衍生物/子代、其他哺乳動物細胞（包括但不限於人類、小鼠、大鼠、猴、及鳥類，或較佳為齧齒動物細胞株）、或真核細胞（包括但不限於酵母菌、昆蟲及植物細胞）亦可用於本發明之含意，特定言之用於產生生物醫藥蛋白質。表1 :真核型生產用細胞株細胞株訂購號 NS0 ECACC第85110503號 Sp2/0-Agl4 ATCC CRL-1581 BHK21 ATCC CCL-10 ΒΗΚ ΤΚ' £匸八(：(：第85011423號 HaK ATCC CCL-15 2254-62.2(BHK-21衍生物） ATCC CRL-8544 148l31.doc • 14- 201105793 CHO ECACC 第 8505302號 CHO野生型 ECACC 00102307 CHO-K1 ATCC CCL-61 CHO-DUKX (=CHO duk·、CHO/dhfr·) ATCC CRL-9096 CHO-DUKX Bll ATCC CRL-9010 CHO-DG44 Urlaub 等人，1983 CHO Pro-5 ATCC CRL-1781 V79 ATCC CCC-93 B14AF28-G3 ATCC CCL-14 PER.C6 (Fallaux，F.J.等人，1998) HEK 293 ATCC CRL-1573 COS-7 ATCC CRL-1651 U266 ATCC TIB-196 HuNSl ATCC CRL-8644 CHL ECACC 第 87 111 906號當宿主細胞經培養、適應、且完全培養於不含血清之條件下，且視需要於不含任一動物來源之蛋白質/肽之培養基中時，則該宿主細胞是最佳的。諸如Ham's F12(Sigma， Deisenhofen，Germany)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco 經改質之Eagle培養基（DMEM ; Sigma)、最低基本培養基 (MEM ; Sigma)、Iscove經改質之 Dulbecco培養基（IMDM ; Sigma)、CD-CHO(Invitrogen，Carlsbad, CA)、CHO-S-Invtirogen、無血清CHO培養基（Sigma)及無蛋白質CHO培養基（Sigma)之市售培養基為適宜營養溶液實例。當必要時，可在任一培養基補充多種化合物，化合物實例為激素及/或其他生長因子（諸如胰島素、鐵傳遞蛋白、表皮生長因子、類胰島素生長因子）、鹽（諸如氯化鈉、鈣鹽、鎂 148131.doc -15- 201105793 鹽、填酸鹽）、緩衝劑（諸如HEPES)、核發酸（諸如腺皆、胸苷）、麩胺醯胺、葡萄糖或其他等價能量源、抗生素、微量元素。亦可包含適宜濃度之熟習此項技術者所知之任 -其他必要補充物質。於本發明中’較佳使用無血清培養基，但補充適宜含量血清的培養基亦可用於培養宿主°細胞。爲了使表現出可篩選基因之經遺傳學改質之細胞生長並對其進行挑擇’在培養基添加適宜之選擇試劑。術語「蛋白質」可與胺基酸殘基序列或多肽相互交換使用，且係指任一長度之胺基酸聚合物。該等術語亦包括透過下列反應經轉譯後修飾之蛋白質，該等反應包括但不限於糖基化、乙醯基化、磷酸化或蛋白質加工。在保持多肽分子生物功能活性的同時，可對多肽結構進行修改及改變，例如與其他蛋白質融合、胺基酸序列取代、刪除或插入。例如，某些胺基酸序列取代可在多肽或其所構成基礎之核酸編碼序列下進行，而獲得具有類似性質之蛋白質。術語「多肽」意指具有10個以上胺基酸之序列，且術語「肽」意指長度至多為〗0個胺基酸之序列。本發明適於產生供產生生物醫藥多肽/蛋白質之宿主細胞。本發明特別適於藉由強化細胞生產力之細胞高產率表現許多不同所期望之基因。所期望之基因」（gene of interest ; GOI)、「所選擇序列」、或「產物基因」於文中具有相同含意，且係指編喝所期望之產物或「所期望之蛋白質j (術語亦稱為「所需產物」）的任一長度多聚核苷酸序列。所選擇之序列可為 148131.doc •16· 201105793 全長或經裁斷之基因、融合或經標記之基因，且 cDNA、基因纽職、或驅片段，較佳為携a。: 天然序列’亦即天然存在形式，或若需要，則可經突變或修飾。該等修飾包括密碼子最佳化作用（以便在所選擇之宿主細胞中最佳化使㈣碼子）、人源化或標記。所選擇之序列可編碼分泌型、細胞質、肖、膜綁定型、或細胞面多肽。 ^ 「所期望蛋白質」包括蛋白質、多肽、其片段、肽，其全部可於所選擇之宿主細胞中表現。所需之蛋白質可為例如抗體、酵素、細胞激素、#巴細胞活素、黏附分子、受體及其衍生物或片R、及可作為促效劑或结抗劑及/或: 有治療或診斷用途之任一其他多肽。所需之蛋白質/多肽之實例亦出示於下文。若為諸如單株抗體之更複雜分子，G〇I可編碼兩條抗體鏈中之一條或兩條。所期望產物」亦可為反義RNA。「所期望蛋白質」或「所需蛋白質」為彼等於上文中所提及者。特別地，所需蛋白質/多肽或所期望蛋白質為例如但不限於胰島素、類胰島素生長因子、hGH、tpA、細胞激素（諸如介白素（IL)，例如il_i ' IL·2、IL_3、IL 4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-ll、il-12、 IL-13、iL_i4、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18 ;干擾素 (IFN)a、IFN β、IFN γ、IFN ω 或 IFN τ ;腫瘤壞死因子 (TNF)，諸如 TNF a&TNF β、TNF γ ; TRAIL ; g csf、 148131.doc •17- £ 201105793 GM-CSF、M-CSF、MCIM及VEGF。亦包括紅血球生成素產品或任一其他激素生長因子。根據本發明方法亦可利於用於生產抗體或其片段。該等片段包括例如Fab片段（抗原結合片段=Fab)。Fab片段係經鄰近恒定區域連接的兩條鏈之可變區域所組成，Fab片段可藉由（例如利用木瓜蛋白酶）蛋白酶消化一般抗體加以形成，但類似Fab片段亦可藉由基因工程技術同時產生。其他抗體片段包括F(ab,)2片段，其可利用胃蛋白酶，藉由蛋白質裂解製得。所期望蛋白質係較佳為從培養基回收分泌型多肽，或者，若其表現物沒有分泌信號’則其可自冑主細胞溶胞產物回收。必須藉由可獲得大體上均質的所期望蛋白質製備物的方式，自其他重組蛋白質及宿主細胞蛋白質中純化出所期望蛋白f °第—步’去除培養基或溶胞產物中細胞及/ 或顆粒細胞碎片。隨後自可溶性蛋白質、多肽及核酸混合物^純化出所期望產物，例如，係藉由免疫親和或離子交換管柱分級分離、乙醇沉澱、反相HpLC、以沖以以層析術、石夕膠或諸如DEAE之陽離子交換樹脂層析。通常，相關技術中已熟知教示熟習此項技術者如何純化由宿主細胞所表現之異種蛋白質之方法。使用遺傳學工程方法可能產生縮短的抗體片&，該等片奴僅係由重鏈可變區域（VH)及輕鏈可變區域（vl)組成，其稱為FV片段（可變片段（Fragment variable)=可變部份之片 )由於„亥等FV_片段缺少由恒定鍵之半耽胺酸所形成之兩條鏈間的共價鍵結，因此Fv片段通常穩定。較佳是藉由 14813I.doc 201105793 短狀片段（例如10至3〇個胺基酸，較佳15個胺基酸）將重鏈的可變區域及輕鏈可變區域連接起來。依此方式，可獲得藉由肽連接子連接之VH&VL組成之單一肽鏈。該種類型之抗體蛋白質稱為單鏈_FV(SCFV)。於先前技術中已知該種類型之scFv-抗體蛋白質實例。近些年，已發展出製備scFv多聚衍生物的多種方法。其思名人產生特疋言之具有改善的藥物動力學及生物分佈性質、及增加的結合親和力之重組抗體。爲了獲得scFv多聚物’製得呈具有多聚化區域之融合蛋白質的scFv，多聚化區域可為例如IgG之CH3區域或捲曲螺旋結構（螺旋結構），諸如凴胺酸-拉鍊域。然而’亦存在其中scFv之VH/Vl區域之間的相互作用係用於多聚化（例如雙功能、三功能、及四功忐抗體）的方法。熟習此項技術者所指之雙功能抗體係心心一彳貝同一聚scFv衍生物。將scpv分子中之連接子縮短至5-10個胺基酸導致形成同二聚體，其中會發生内部_ VH/VL鏈-疊加。另外可藉由併入二硫橋使雙功能抗體穩定。先耵技術中已知雙功能抗體_抗體蛋白質實例。熟習此項技術者所指之微型抗體（minib〇dy)係意指二價、同二聚scFv衍生物，其係由融合蛋白質組成，其含有作為二聚化區域之免疫球蛋白（較佳為IgG，最佳為 IgGl)，及經鉸鏈區（例如亦源自IgCH)及連接子區域與其相連之scFv。先前技術中已知微型抗體-抗體蛋白質實例。热習此項技術者所指之三功能抗體係意指三價、同三聚 scFv衍生物，其中VH-VL·直接融合而不經連接子序列之 148131.doc 201105793

ScFv衍生物形成三聚體。熟習此項技術者亦熟悉所謂之微小抗體（miniantib〇dy)，其具有二-、三·或四價結構，且衍生自scFv。藉由二_、三-或四聚捲曲螺旋結構完成多聚化。熟習此項技術者亦熟悉多肽分子，其係由獲自駱馬或其他駱駝科動物之單鏈抗體的一或多個可變區域組成。此外，熟習此項技術者已知該等駱駝抗體之衍生物及變體。該等分子亦稱為「區域抗體」Q區域抗體變體包括數種由肽連接子共價連接之可變區域。為增加血清半衰期，可產生與諸如抗體Fc部份之多肽部份或諸如白蛋白之存在於血清中之另—種蛋白質融合之區域抗體。熟習此項技術者所知之「鷹架蛋白」係意指藉由基因選殖術或藉由共同轉譯方法，與具有另一功能之另—種蛋白質或蛋白質部份偶聯之蛋白質之任一功能區域。根據定義，將任一序列或基因引入至宿主相對於該宿主田胞而5疋「異源性之序列」或「異源性之基因」戈「轉殖基因」’即使所引入之序列或基因與宿主細。T 内调性序列或基因相同β 因此’「異源性J蛋白質是由異源性序列所表質。凡又蛋白於本發明之說明書全文中，且尤其係於有關蛋白質之内容中，術語「重組」可與術語「異源性」相互*現用。因此，「重組」蛋白質是由異源性序列所表現 148131.doc •20- 201105793 質。可藉由利用「表現載體」（較佳為真核表現載體，且更佳為喷乳動物表現載體)，將異源性基因序列導入至標乾細胞中。熟習此項技術者p孰去 • 少又彳了嘗匕热知用於構築載體之方法，且其係闡述於許多公開幸中。拉令一闹木〒特疋s之，構築適宜載體之技術，包括關於功能性組件（諸如啟動子、增強子、終止子及聚腺苦酸化信號、筛選標記、複製起點、及剪接信號）之闡述可參見先前之技術。載體亦包括但不限於質體載體、嗟菌體載體、黏粒、人工/微型_色體（例如ACE)、或病毒載體’諸如桿狀病毒、逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純疱疹病毒、逆轉錄病毒、噬菌體。真核表現載體通常亦含有促進載體在細菌中繁殖之原核序列，諸如細菌中之複製起點及用於選擇之抗生素抗性基因。在相關技術中已熟知含有可依人工操作方式連接多核苷酸之選殖位點的多種真核表現載體，且其中一些可購自諸如 Stratagene, La Jolla, CA ； Invitrogen, Carlsbad, CA ；

Promega，Madison，WI 或 BD Biosciences Clontech, Palo

Alto，CA之公司。 - 於一項較佳實施例中，該表現載體包括至少一種核酸序列，其係用於轉錄及轉譯為編碼所期望之肽/多肽/蛋白質的核苷酸序列所必須之調節序列。如文中所用，術語「表現」係指於宿主細胞内轉錄及/ 或轉譯異源性核酸序列。所需產物/所期望之蛋白質於宿主細胞中表現程度可取決於存在於細胞中之對應mRNA之 148131.doc -21- 201105793 含量丨或於該實例中由所選望蛋白質的含量。例如，列列編碼之所需多肽/所期含量之方法為：北方墨點雜交、之序列轉錄的mRNA 法、與細胞RNA原位雜交、或pc核糖核酸酶RNA保護碼的蛋白質含量之方法有許多R。測定由所選之序列編七® ’例如藉由ELISA、藉由西方墨點法、藉由放射免疫分析八挤;a ® 糈由免疫沉澱法、藉由刀析蛋白質之生物學活性、#由免疫學染色蛋白質，且隨 S分析、或藉由均相時間-解析螢光（HTRF)分析法。可藉由技術中已熟知之任—方「結4 方法使夕核苷酸或表現載體」真㈣主細胞’以產生經遺傳學改質之細胞或轉殖基因細胞。轉染方法包括但不限於脂質體介導之轉染、碟酸妈共沉殿、電穿孔、多陽離子（諸如DEAE_葡聚糖）_介導之轉染、原生質體融合、病毒感染及顯微注射。該轉染較佳為具有經穩定㈣4可提供最佳轉染頻率及使異源性基因較佳表現於特定宿主細胞株及類型中的轉染方法較佳。可藉由常用步驟確定適宜的方法。為獲得具有穩定性的轉染體，可將構築體整合入宿主細胞基因組或人造染色體/微型染色體’或以游離基因組型式，以穩定性的方式存在於宿主細胞内。除非另外指出，否則本發明實務將採用屬於熟習此項技術者能力範圍内之細胞生物學、分子生物學、細胞培養、免疫學等中之常用技術。於當前之文獻中，已全部揭示該荨技術。實施例 14813 丨.do, -22- 201105793 本發明係關於一種以編號DSM ACC2989寄存於德國微生物與細胞培養物保存中心（DSMZ ; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)之細胞 (CHO/CERT 2.20)。本發明係關於一種細胞/細胞株，其代表物係以編號DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)寄存於 DSMZ。可藉由鑑定所插入之DNA與該細胞株之細胞中的相鄰染色體DNA之間的連接片段獨特闡述該細胞株。例如，利用一或多種限制酶消化該細胞株之DNA，且例如利用所插入DNA之經適宜標記片段，藉由南方墨點法，鑑定該等連接片段，產生可鑑別基因組之插入位點的特異性條帶圖。該等限制酶例如闡述於下文，且包括EcoRV、 Hindlll、Kpnl、Ncol、Ndel、PvuII、Spel、Xhol、 Avail、BstXI、Sail。本發明另外關於一種以編號DSM ACC2990寄存於DSMZ 之細胞（CHO/CERT 2.41)。本發明係關於一種細胞/細胞株，其代表物係以編號DSM ACC2990寄存於DSMZ (CHO/CERT 2.41)。可藉由鑑別所插入之DNA與該細胞株細胞中相鄰染色體DNA之間的連接片段獨特闡述該細胞株。例如，以一或多種限制酶消化該細胞株之DNA，並例如利用所插入DNA之經適宜標記片段，藉由南方墨點分析法，鑑別該等連接片段，產生可鑑別基因組中之插入位點的特異性條帶圖譜。該等限制酶例如闡述於下文，且包括 EcoRV、Hindlll、Kpnl、Ncol、Ndel、PvuII、Spel、 Xhol、Avail、BstXI、Sail。 £ 148131.doc -23* 201105793 於本發明一項特定實施例中，本發明細胞（CHO/CERT 2.20或CH0/CERT 2.41)還另外含有至少一個第二載體構築體，該構築體包括編碼所期望蛋白質之所期望基因。該細胞較佳另外含有至少一個第二載體構築體，該構築體包括編碼所期望蛋白質之所期望基因、及選擇標記及/或擴增標記。第二載體構築體上之該選擇及/或擴增標記係以麩胺醯胺合成酶（GS)或脫氫葉酸還原酶（DHFR)較佳，且以 DHFR最佳。於本發明另一較佳實施例中，所有載體構築體均穩定性地整併至細胞基因組中。於本發明另一較佳實施例中，該細胞之特徵為：當利用基因組DNA作為模板時，具有特異性PCR條帶圖譜/指紋圖譜，其中利用寡核苷酸引子SEQ ID NO : 2及 SEQ ID NO : 3 會產生 2373 bp PCR產物；或當利用基因組DNA作為模板時，具有特異性PCR條帶圖譜/指紋圖譜，其中利用寡核苷酸引子SEQ ID NO : 4及 SEQ ID NO : 5 會產生 660 bp PCR 產物（SEQ ID NO : 6);或與如下限制酶一起培養（a)之CERT-特異性2373 bp-PCR 產物，會產生特異性之片段數量及片段尺寸：酶片段數量片段大小(bp) EcoRV 2 2236、137 Hindlll 2 2176、197 ΚρηΙ 2 2142'231 Ncol 2 2096 、 277 Ndel 2 1973 、 400 148131.doc -24- 201105793

PvuII 2 1241 ' 1132 Spel 2 2128 、 245 Xhol 2 2257、116 Avail 3 1140、832、401 BstXI 3 1980、266、127 Sail 3 1673 ' 491 ' 209 其中，以與Hindlll—起培養為較佳。於本發明一項較佳實施例中，該細胞之特徵為：在以利用基因組DNA作為模板，且利用寡核苷酸引子SEQ ID NO : 2及SEQ ID NO : 3所產生之CERT-特異性2373 bp PCR產物與如下限制酶一起培養之後，會產生2個具有如上表之大小的特異性片段：EcoRV、Kpnl、Ncol、Ndel、 PvuII、Spel、Xhol。於本發明一項最佳實施例中，該細胞之特徵為：在與限制酶Hindlll—起培養經利用基因組DNA作為模板，且利用寡核苷酸引子SEQ ID NO : 2及SEQ ID NO : 3所產生之 CERT-特異性2373 bp PCR產物之後，會產生2個大小分別為2176bp及197bp之特異性片段。於本發明一項特定實施例中，該CERT S132A表現卡匣係由SEQ ID NO : 1組成。於本發明另一特定實施例中，該所期望之蛋白質為治療用蛋白質，較佳為抗體或抗體融合蛋白質。本發明另外係關於一種產生宿主細胞株之方法，其特徵為如下步驟： (a)提供母本宿主細胞，較佳為CHO或NSO細胞，最佳為 148131.doc -25- 201105793 CHO DG44細胞， (b) 將包括CERT S132A表現卡匣之載體構築體引入至步驟 (a)之細胞， (c) 挑選出經穩定轉染之細胞群， (d) 藉由以FACS為基礎之單細胞選殖術分離出單株細胞株， (e) 根據如下標準篩選 -CERT S132A表現程度高， -接種細胞儲備培養時生長最佳， -批次進料埼養時生長最佳， ⑴根據步驟（e)之篩選標準，自步驟（d)細胞株挑選出單株細胞株。本發明另外係關於一種產生宿主細胞株之方法，其特徵為如下步輝： a) 提供母本宿主細胞，較佳為CH〇或NSO細胞， b) 將包括CERT S132A表現卡匣之載體構築體引入至步驟U)之母本宿主細胞， c) 挑選出經穩定轉染之細胞群， d) 藉由以FACS為基礎之單細胞選殖術分離出單株細胞株， e) 根據如下標準筛選該單株細胞株： i) CERT S132A表現程度高，接種細胞儲備培養時生長最佳， ui)批次進料培養時生長最佳， 148131.doc -26· 201105793 f)根據步驟⑷之篩選標準，自步驟⑷中之細胞株挑選出單株細胞株作為宿主細胞株。本么明更進一步係關於一種產生宿主細胞之方法，其特徵為如下步驟： a) 提供母本宿主細胞，較佳^CH〇或ns〇細胞， b) 將包括CERT S132A表現卡匣之載體構築體引入至步驟（a)之該母本宿主細胞， Ο挑選出經穩定轉染之細胞群， d) 藉由以FACS為基礎之單細胞選殖術分離細胞， e) 根據如下標準篩選該等細胞： 1) CERTS 132A表現程度高， u)接種細胞儲備培養時生長最佳， iii)批次進料培養時生長最佳， f) 根據步驟⑷中之筛選標準，$出單一選殖體或細胞庫作為伯主細胞。步驟（a)中之母本宿主細胞較佳為上述定義下之宿主細胞。步驟（a)中之母本宿主細胞較佳為齧齒動物細胞，諸如小鼠或倉鼠細胞，最佳為CH〇 DG44細胞。步驟(b)之該載體構築體較佳包括㈣ΐβ㈣之如下功能元件： -巨細胞病毒（CMV)增強子/啟動子； -多選殖位點（MCS); -CERT S132A表現卡艮； -表現卡E ’其可於真核細胞中編碼作為筛選標記之。票呤 148131.doc •27, £ 201105793 黴素N-乙醯基化轉移酶； -聚腺苷酸化信號； -複製起點； -β-内醯胺酶表現卡匣，用用於在細菌中產生胺苄西林 (ampicillin)抗性。師選生長最佳之步驟（e)ii)中之接種細胞儲備培養物的特疋標準為：存活率、增倍時間。師遠生長最佳之步驟（e)iii)中之批次進料培養物的特定標準為：峰細胞密度、一段時間内之存活細胞的積分值 (IVC)、存活率。該批次進料培養物之篩選標準特別具有重要性，此係因為其反應出產業生產製程中之環境條件。於一種較佳方法中，步驟（b)之CERT S132A表現卡匣係由 SEQ ID NO : 1組成。本發明另外係關於一種在上述細胞中產生由所期望之基因所編碼之所期望之蛋白質的方法，其特徵為如下步驟： a)提供如上所述細胞，b)於允許至少一種所期望之基因表現的條件下培養細胞。於一項特定實施例中，該方法包括額外步驟c)收集所期望之蛋白質。於一項更特定之實施例中’該方法包括另一額外步驟d)純化所期望之蛋白質。本發明更進一步係關於一種於上述細胞中，產生由所期望之基因編碼之所期望之蛋白質的方法，其特徵為如下+ 驟：a)提供上述細胞，b)於允許該細胞增殖且至少_ ^ ^ —種所期望之基因表現的條件下’培養該細胞。於—項赛定實^ 14813l.doc -28· 201105793 望之蛋白質。於一額外步驟d)純化所例中，該方法包括額外步驟C)收集所期項更特定之實施例中，該方法包括另— 期望之蛋白質。本發明特定言之係關於一種於本發明細胞中產生由所期望之基因編碼之所期望之蛋白質的方法，其特徵為如下步 0)提供本發明細胞， (b)於允許細胞增殖及至少一種所期望之基因表現之條件下’培養該細胞， (e)收集所期望之蛋白質，且 (d)純化所期望之蛋白質。於一較佳產生方法中，該宿主細胞包括作為所期望之基因的選擇及/或擴增標^己之麵胺酿胺合成酶（Gs)或djjfr，且以DHFR較佳。本發明另外係關於一種鑑別出經轉殖CERT S 132A(SEQ ID NO : 1)之細胞的方法，其係藉由 (a) 進行聚合酶連鎖反應pcr， (b) 使用基因組DNA作為模板，且 (c) 使用具有SEq id NO : 2及SEQ ID NO : 3之寡核音酸引子，藉此產生2373 bp PCR產物。視需要’該細胞可藉由下列進一步鑑別特徵：與以下限制酶一起培養CERT-特異性2373 bp-PCR產物之後，產生特異性片段數量及片段大小： 148131.doc -29-

S 201105793 酶片段數量片段大小(bp) EcoRV 2 2236 、 137 Hindlll 2 2176 ' 197 ΚρηΙ 2 2142 ' 231 Ncol 2 2096'277 Ndel 2 1973 、 400 PvuII 2 1241 ' 1132 Spel 2 2128 ' 245 Xhol 2 2257 、 116 Avail 3 1140、832、401 BstXI 3 1980、266、127 Sail 3 1673 ' 491 ' 209 本發明特定言之係關於一種鑑別經轉殖CERT S132A (SEQ ID NO : 1)之細胞/闡述其特徵之方法，其係藉由 PCR，利用基因組DNA作為模板，其中當利用寡核苷酸引子8£(^1〇!^〇:2及8丑(）1〇1^〇:3時，產生 23 73 5??011產物。本發明另外係關於一種鑑別經轉殖CERT S132A(SEQ ID NO : 1)之細胞/闡述其特徵之方法，其係藉由PCR，利用基因組DNA作為模板，其中當利用寡核苷酸引子SEQ ID NO : 2及SEQ ID NO : 3時，產生2373 bp PCR產物，且其中該細胞之特徵為：在與如下限制酶一起培養CERT-特異性23 73 bp-PCR產物之後，產生特異性片段數量及片段大小：酶片段數量片段大小(bp) EcoRV 2 2236 、 137 Hindlll 2 2176 、 197 148131.doc •30· 201105793

Kpnl 2 2142'231 Ncol 2 2096、277 Ndel 2 1973、400 PvuII 2 1241 、 1132 Spel 2 2128、245 Xhol 2 2257 ' 116 Avail 3 1140、832、401 BstXI 3 1980、266、127 Sail 3 1673'491 ' 209 於該方法之一項較佳實施例中，該細胞之特徵為：在與限制酶 EcoRV、Kpnl、Ncol、Ndel、PvuII、Spel、Xhol — 起培養CERT-特異性2373 bp PCR產物之後，產生2個大小如上表之特異性片段，其中該PCR產物之產生方法為：利用基因組DNA作為模板，且採用寡核苷酸引子SEQ ID NO : 2及 SEQ ID NO : 3。於該方法之最佳實施例中，該細胞之特徵為：在與限制酶Hindlll—起培養CERT-特異性2373 bp PCR產物之後，產生2個大小分別為2176 bp及197 bp之特異性片段，其中該 PCR產物之產生方法為：利用基因組DNA作為模板，且採用寡核苷酸引子SEQ ID NO : 2及SEQ ID NO : 3。於另一項實施例中，該以編號DSM ACC2989 (CHO/ CERT 2.20)寄存於德國微生物與細胞培養物保存中心 (DSMZ)之細胞的特徵為：當利用基因組DNA時，產生特異性限制酶切物或特異性PCR條帶圖譜，其中該分析產生對細胞株DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)之〇£11丁轉殖基因/ CERT S132A表現卡匣中之基因組插入位點具特異性之獨 £ 148131.doc -31 - 201105793 特指紋圖譜。該細胞株081^八(：02989((：110/0£10'2.20)可藉由連接片段加以獨特性地闡述/鑑別特徵。細胞株DSM 八(^2989((：110/0£10'2.20)可藉由所插入0财(=€£111'轉殖基因/CERT S132A表現卡匣）與鄰近染色體DNA之間的連接片段加以獨特性地闡述/鑑別特徵，其中利用一或多種諸如 EcoRV、Hindlll、Kpnl、Ncol、Ndel、PvuII、Spel、 Xhol、Avail、BstXI、Sail之限制酶消化該細胞株之 DNA(以基因組DNA較佳），並例如利用一或多種適宜之視需要經標記之DNA片段，藉由南方墨點分析法或PCR，鑑定該等連接片段。該（等）DNA片段顯示特異性條帶圖譜或指紋圖譜，其特徵為031^八(：€2989((：110/0£10'2.20)基因組中CERT轉殖基因/CERT S132A表現卡匣之獨特插入位點。於另一實施例中，該以編號DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)寄存於德國微生物與細胞培養物保存中心（DSMZ)之細胞株的特徵為：當利用基因組DNA時，產生特異性限制酶切物或特異性PCR條帶圖譜，其中該分析產生對細胞株 DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)中之 CERT 轉殖基因/CERT S 132A表現卡匣的基因組插入位點具特異性之獨特指紋圖譜。該細胞株DSMACC2990(CHO/CERT2.41)可藉由連接片段加以獨特闡述/鑑別特徵。該細胞株DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)可藉由所插入DNA(=CERT轉殖基因/CERT S132A表現卡匣）及鄰近染色體DNA之間的連接片段加以獨特闡述/鑑別特徵，其中利用一或多種諸如EcoRV、 148131.doc •32- 201105793

Hindlll、ΚρηΙ、Ncol、Ndel、PvuII、Spel、Xhol、 Avail、BstXI、Sail之限制酶消化該細胞株之DNA(以基因組DNA較佳），並例如利用一或多種適宜之視需要經標記之DNA片段，藉由南方墨點分析法或PCR，鑑別該等連接片段。該（等）DNA片段顯示特異性條帶譜圖或指紋圖譜，其特徵為081^八0^2990((：110/匚£1^2.41)基因組中之〇丑10' 轉殖基因/CERTS 132A表現卡匣的獨特插入位點》本發明另外係關於一種培養細胞之方法，包括a)提供如申請專利範圍請求項1至7中任一項之細胞，及b)於允許該細胞增殖之條件下，培養該細胞.。於該方法之一項特定實施例中，該細胞另外含有至少一個（第二/額外）載體構築體，其包括編碼所期望蛋白質的所期望之基因。於一項較佳實施例中，該方法包括另外收集所期望蛋白質。於另一項較佳實施例中，該方法另外包括純化所期望蛋白質。本發明更進一步係關於一種以本發明細胞（CHO/CERT 2.20=DSM ACC2989或 CHO/CERT 2.41=DSM ACC2990)於製造蛋白質上之用途。更進一步，本發明係關於一種反應器/發酵容器，其含有於培養基中之本發明細胞。本方法亦關於一種套組，包括本發明細胞、用於表現所期望之基因的表現載體、及用於培養該細胞之細胞培養基。於本方法之一項特定實施例中，該套組包括本發明細胞，其另外含有至少一個（第二）載體構築體，該載體構築 £ 14813 Uoc -33· 201105793 體包括編碼所期望蛋白質的所期望之基因，其中於反應器/ 發酵容器中，於允許該細胞增殖之培養基中，培養該細胞。本發明更進一步係關於一種細胞，其包括CERT S 1 32A 表現卡匣，其中該細胞之特徵為： f) 當利用基因組DNA作為模板時，具有特異性PCR條帶圖譜/指紋圖譜，其中採用寡核苷酸引子SEQ ID NO : 2及SEQ ID NO : 3，會產生2373 bp PCR產物，或 g) 當利用基因組DNA作為模板時，具有特異性PCR條帶圖譜/指紋圖譜，其中採用寡核苷酸引子SEQ ID NO : 4及 SEQ ID NO : 5，會產生 660 bp PCR產物（SEQ ID NO : 6)，或 h) (a)中之CERT-特異性2373 bp-PCR產物與如下限制酶一起培養，產生特異性片段數量及片段大小：酶片段數量片段大小(bp) EcoRV 2 2236 、 137 Hindlll 2 2176 、 197 ΚρηΙ 2 2142'231 Ncol 2 2096 ' 277 Ndel 2 1973、400 PvuII 2 1241 ' 1132 Spel 2 2128 ' 245 Xhol 2 2257 ' 116 Avail 3 1140、832、401 BstXI 3 1980'266 ' 127 Sail 3 1673 ' 491 ' 209 148131.doc -34- 201105793 於一項特定實施例中，CERT SI32A表現卡匣係由SEQ ID NO : 1組成。該細胞較佳為CHO細胞或NSO細胞。於一項較佳實施例中，該細胞（CHO/CERT 2.20)係以編號DSM ACC2989寄存於德國微生物與細胞培養物保存中心 (DSMZ)。於另一較佳實施例中，該細胞（CHO/CERT 2·41)係以編號 DSM ACC2990 寄存於 DSMZ。實例材料及方法細胞培養將所有用於生產及發展階段之細胞株以系列接種細胞培養物維持於表面充氣之Τ型燒瓶（Nunc, Denmark)中，並置於37°C溫度，且含有5% C02之氛圍的培養箱（Thermo, Germany)或振盈瓶（Nunc，Denmark)中。依接種密度為1-3E5個細胞/mL，每隔2至3天轉種接種細胞儲備培養物。利用血球計數盤（hemocytometer)測定所有培養物中之細胞濃度。藉由錐藍排除法（trypan blue exclusion method)分析存活率。批次進料培養將細胞依3x105個細胞/ml接種於含於125 ml振盪瓶中之 30 ml不含抗生素或MTX之BI-專屬生產培養基（Sigma-Aldrich，Germany)。於37°C 下，及於5% C02中，依 120 rpm的速度振盈該培養物，且於3天之後，使C〇2減少至 2%。每日添加BI-專屬進料溶液，且若需要，利用NaC03 148131.doc -35- 201105793 使pH調節至pH 7·〇。利用自動CEDEX細胞計數系統 (Innovatis)，藉由錐藍排除法，測定細胞密度及存活率。藉由胞内FACS染色及西方墨點法偵測cERT si32A表現以胞内染色而言’將i X 1〇6個細胞固定於含有p/〇多聚曱酿之PBS溶液中達20分鐘，並在含有〇〇5〇/〇 Tween-20之 PBS中進行滲透。隨後’使細胞再懸浮於1% bsa/PBS中，並利用抗-Flag M2單株小鼠抗體（sigma)及經Alexa488標記之山羊抗-小鼠抗體（Invitr〇gen)染色。藉由流式細胞儀 (FACScalibur·，Coulter)定量分析螢光信號。於冰上’使5xl06個細胞於NP40-缓衝液[1 v/v% NP40、 50 mM HEPES pH 7.9 ' 150 mM NaCM、1 mM EDTA、5 mM EGTA、25 mM NaF及40 pL/mL完全蛋白酶抑制劑溶液 (Roche)]中裂解達1 5分鐘，以製得用於西方墨點法之全細胞提取物。細胞裂解物於16,000xg下離心10分鐘進行澄清化，並利用BCA1分析套組（sigma)測定樣本中蛋白質濃度。以西方墨點分析而言，根據製造商之說明，於 NuPAGE 10% Bis-Tris凝膠（Invitrogen)上，利用 MOPS緩衝液分離等量蛋白質。於XCell II墨點模組（Invitrogen)中，利用轉移緩衝液使蛋白質轉移至PVDF膜（Mmipore)。利用阻斷劑（Invitrogen)於室溫下阻斷1小時後，利用抗-Flag M2抗體（Sigma)標記該膜。採用ECL加上化學螢光偵測系統（Amersham Pharmacia)，利用與過氧化物酶耦合之第二抗體可觀察到蛋白質。產生會產生抗體之細胞 148131.doc •36- 201105793 以編碼IgGl型抗體重鏈及輕鏈的表現質體經穩定轉染 CHO-DG44細胞及conCERT™細胞株。藉由隨後於選擇性條件下培養，自DG44母細胞株及conCERT™細胞皆產生經穩定轉染之產生IgG之細胞群體。根據標準貯藏培養物方法進一步培養細胞庫，且每隔2至3天轉種一次。藉由ELISA測定重組產物之濃度為測定衍生自CHO-DG44細胞及conCERT™細胞株（經工程化可表現CERT S132A突變體）產生IgG細胞的重組抗體生產力，於三次連續繼代中之每次繼代結束時，自標準接種培養物的細胞上清液收集樣本。隨後藉由酶聯免疫吸附分析（ELISA)分析產物濃度。利用抗人類Fc片段之抗體 (Jackson Immuno Research Laboratories)、及與人類 κ輕鏈 HRP偶聯之抗體（Sigma)測定分泌型單株抗體產物之濃度。單細胞分類使用配備脈衝處理、分類加強模組、及自動細胞沉積組件之「FACS Vantage」（Becton Dickinson)流式細胞儀分析細胞並加以分類。於前散射光及側散射光之點圖 (FSC/SSC)上，在單一活細胞周圍設立柵門（gate)。使經分類細胞依每孔一個細胞沉積於具有自動細胞沉積組件之含 200 pL生長培養基之96-孔微滴定分析板中。

核酸分離及RT-PCR 根據製造商之說明，利用TRIzol®試劑（德國 Invitrogen)，自生長中細胞分離出基因組DNA及總RNA。隨後，於37°C下，以DNase I處理RNA 30分鐘。以3 pg總 148131.doc •37- 201105793 RNA及寡聚（dT)寡核苷酸為起始物，利用經選殖AMV第一股cDNA合成套組（德國Invitrogen)合成第一股cDNA。利用 Absolute™ QPCR SYBR®綠色螢光混合物（ABgene，Surrey, UK)、及受MylQ即時偵測軟體控制之熱循環裝置（德國 BioRad)，藉由即時PCR定量分析人類CERT轉錄物含量。利用如下寡核苷酸引子，藉由對基因組DNA進行PCR，偵測可鑑別conCERTTM細胞之獨特擴增物： CMV 含義：5' GACGTCAATGGGAGTTTGTTTTG 3'(SEQ ID NO : 2)及終止子反義：5，CAACTAGAAGGCACAGTCGAGG3，（SEQ ID NO : 3)。利用DNA或mRNA作為模板，利用如下寡核苷酸引子，藉由 RT-PCR，產生 660 bp之 PCR產物（SEQ ID NO : 6)，而偵測CERT S132A表現： CERT-正向：5' GCGTTCTGATGGTGACTTCTTG 3'(SEQ ID NO : 4)及 CERT-反向：5' TGTCCTGTGACGCCTTTAACTG 3'(SEQ ID NO : 5)。實例：產生CHOPPER®細胞並鑑定其特徵實例1 :鑑定CHO/CERT S132A細胞株之特徵，並獨特鑑定該細胞株 CHO/CERT S132A細胞株（文中亦稱為「conCERTTM」細胞株）大體上可闡述為可異種表現人類CERT突變體S132A 之細胞。 148131.doc -38- 201105793 本發明中所闡述之（：110/€£1^8132八細胞株含有如圖1八所示之CERT表現卡匣，其包括：衍生自CMV增強子/啟動子之上游調節序列（0.6 kb);具有突變變化（絲胺酸132突變成丙胺酸）之以Flag™抗原決定基標記開頭之人類CERT基因（GenelD 10087)編碼區域（SEQ ID NO : 1) ; TGA 終止密碼子及包括聚腺苷酸化信號之0.5 kb 3’非轉譯區域。用於產生本發明所述之CHO/CERT S132A細胞株的載體構築體示於圖1B，且含有如下功能元件：巨細胞病毒（CMV)增強子/啟動子編碼經Flag™標記之CERT-SA的表現卡匣來自牛生長激素之聚腺苷酸化信號（bGH pA) •用於產生嘌呤黴素抗性之表現卡匣複製起點用於在細菌中產生胺苄西林抗性之β-内醯胺酶表現卡匣以編號 DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2·41)寄存於 DSMZ 之兩種 CHO/CERT S132A 細胞株含有穩定性插入其基因組之CERT S132Α表現構築體。含有該構築體之CHO/CERT S132A細胞株（諸如以編號 DSM ACC2989 (CHO/CERT 2_20)寄存於DSMZ之細胞株、及以編號DSM ACC2990(CHO/CERT 2_41)寄存於 DSMZ 之細胞株）可藉由對基因組DNA進行PCR加以鑑別。一組特定之寡核苷酸引子（SEQ ID NO : 2及3)在PCR反應中會產生 2373 bp大小之獨特信號，其可以偵測CHO/CERT細胞，且 £ 148131.doc -39- 201105793 隨後可與未轉染上述CERT S132A表現構築體之細胞加以鑑別。引子之結合位置及方向顯示於圖1B(箭頭）。 CMV 含義：5' GACGTCAATGGGAGTTTGTTTTG 3，(SEQ ID NO ： 2) 終止子反義：5' CAACTAGAAGGCACAGTCGAGG 3，(SEQ ID NO ： 3) 當利用限制酶消化2373 PCR片段時，會產生如表1中所概括之限制片段圖譜。表1 :限制酶；由消化CERT-特異性2373 bp-PCR產物所產生之片段數量及片段大小：酵素片段數量片段大小(bp) EcoRV 2 2236、137 Hindlll (較佳） 2 2176、197 KDnl 2 2142'231 Ncol 2 2096、277 Ndel 2 1973、400 PvuII 2 1241 、 1132 Spel 2 2128、245 Xhol 2 2257、116 Avail 3 1140、832、401 BstXI 3 1980、266、127 Sail 3 1673'491 ' 209

使用DNA或mRNA作為模板，亦可藉由PCR偵測 c.onCERT細胞株中之CERT S132A表現，其係使用寡核苷酸引子：CERT-正向：5’ GCGTTCTGATGGTGACTTCTTG 3' (SEQ ID NO : 4)及 CERT-反向：5’ TGTCCTGTGACGCC 148131.doc -40- 201105793 TTTAACTG 3'(SEQ ID NO : 5)，PCR產生 660 bp的如下序列（SEQ ID NO : 6):

GCGTTCTGATGGTGACTTCTTGCATAGTACCAACGGCAAT

AAAGAAAAGTTATTTCCACATGTGACACCAAAAGGAATT

AATGGTATAGACTTTAAAGGGGAAGCGATAACTTTTAAA

GCAACTACTGCTGGAATCCTTGCAACACTTTCTCATTGTA

TTGAACTAATGGTTAAACGTGAGGACAGCTGGCAGAAG

AGACTGGATAAGGAAACTGAGAAGAAAAGAAGAACAGA

GGAAGCATATAAAAATGCAATGACAGAACTTAAGAAAAA

ATCCCACTTTGGAGGACCAGATTATGAAGAAGGCCCTAA

CAGTCTGATTAATGAAGAAGAGTTCTTTGATGCTGTTGA

AGCTGCTCTTGACAGACAAGATAAAATAGAAGAACAGTC

ACAGAGTGAAAAGGTGAGATTACATTGGCCTACATCCTT

GCCCTCTGGAGATGCCTTTTCTTCTGTGGGGACACATAG

ATTTGTCCAAAAGGTTGAAGAGATGGTGCAGAACCACAT

GACTTACTCATTACAGGATGTAGGCGGAGATGCCAATTG

GCAGTTGGTTGTAGAAGAAGGAGAAATGAAGGTATACA

GAAGAGAAGTAGAAGAAAATGGGATTGTTCTGGATCCTT TAAAAGCTACCCATGCAGTTAAAGGCGTCACAGGACA。本發明所述之〇£11丁8132八細胞株（：；《0/0£10'8132人2.20 及2.41可另外藉由異種表現卩13§-〇丑10^132八融合蛋白質而加以鑑別，果係利用針對Flag™抗原決定基標記（例如抗-Flag M2單株小鼠抗體（Sigma))或人類CERT蛋白質（例如 CERT/GPBP抗體，細胞株BL2222，Bethyl Laboratories 公 £ 148131.doc -41 - 201105793 司）之抗體進行西方墨點法。兩種抗體皆不會與倉鼠CERT 蛋白質交叉反應。因此，僅可在CHO/CERT S132A細胞中測得CERT-特異性信號，而在不含有CERT S132A表現構築體之CHO細胞株中不會存在該信號。攜帶CERT表現卡匣之載體構築體亦含有嘌呤黴素抗性基因。（：11〇/€£1〇'8132八細胞因此能夠在培養基存在5-10 pg/ml嘌呤黴素下生長。以編號 DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)寄存於DSMZ之本發明所述CHO/CERT S132A細胞株為CHO-DG44細胞株之衍生物。因此，其同樣需要在培養基中補充次黃嘌呤及胸苷，以進行生長及存活（HT補充作用）。實例2 :產生經穩定轉染CHO/CERT S132A細胞庫為產生本發明所述之CHO/CERT S132A細胞株，以攜帶與N-末端Flag™抗原決定基標記融合之人類CERT蛋白質突變變異體（CERT Serl32今Ala，文中稱為「CERT-S132A」）表現卡匣之表現構築體（圖1)轉染CHO-DG44細胞[Urlaub等人，Cell 33, 1983]。蛋白質編碼區域具有如下序列（SEQ-ID NO : 1 ;依5’-3· 方向出示序列；起始密碼子及終止密碼子劃有底線並加粗印刷，Flag™-tag編碼區域劃有底線，且以斜體表示CERT 編碼區域；經突變密碼子（變化：Serl32 + Ala)係以劃底線及加粗印刷標記：

GCCAGTGTGCTGGAATTCACCATGGCCCCACTAGCCGACTACAAGG 148131.doc •42- 201105793

A.CGACGMGACKAGK\：GTCGGATAATCAGAGCTGGAACTCGTCGGGC

TCGGAGGAGGATCCAGAGACGGAGTCTGGGCCGCCTGTGGAGCGCTG

CGGGGTCCTCAGTAAGTGGACAAACTACATTCATGGGTGGCAGGATCG

TTGGGTAGTTTTGAAAAATAATGCTCTGAGTTACTACAAATCTGAAGATGA

AACAGAGTATGGCTGCAGAGGATCCATCTGTCTTAGCAAGGCTGTCATC

ACACCTCACGATTTTGATGAATGTCGATTTGATATTAGTGTAAATGATAGT

GTTTGGTATCTTCGTGCTCAGGATCCAGATCATAGACAGCAATGGATAGA

TGCCATTGAACAGCACAAGACTGAATCTGGATATGGATCTGAATCCAGC

TTGCGTCGACATGGCGCAATGGTGTCCCTGGTGTCTGGAGCAAGTGGC

TACTCTGCAACATCCACCTCTTCATTCAAGAAAGGCCACAGTTTACGTGA

GAAGTTGGCTGAAATGGAAACATTTAGAGACATCTTATGTAGACAAGTTG

ACACGGTACAGAAGTACTTTGATGCQTGTGCTGATGCTGTCTCTAAGGAT

GAACTTCAAAGGGATAAAGTGGTAGAAGATGATGAAGATGACTTTCCTAC

AACGCGTTCTGATGGTGACTTGTTGCATAGTACCAACGGCAATAAAGAAA \

AGTTATTTCCACATGTGACACCAAAAGGAATTAATGGTATAGACTTTAAAG

GGGAAGCGATAACTTTTAA4GCA4CTACTGCTGGAATCCTTGCAACACTT

TCTCATTGTATTGAACTAATGGTTAAACGTGAGGACAGCTGGCAGAAGA

GACTGGATAAGGAAACTGAGAAGAAAAGAAGAACAGAGGAAGCATATAA

AAATGCAATGACAGAACTTAAGAAAAAATCCCACTTTGGAGGACCAGATT

ATGAAGAAGGCCCTAACAGTCTGATTAATGAAGAAGAGTTCTTTGATGCT

GTTGAAGCTGCTCTTGACAGACAAGATAAAATAGAAGAACAGTCACAGA

GTGAAAAGGTGAGATTACATTGGCCTACATCCTTGCCCTCTGGAGATGC

CTTTTCTTCTGTGGGGACACATAGATTTGTCCAAAAGGTTGAAGAGATG

GTGCAGAACCACATGACTTACTCATTACAGGATGTAGGCGGAGATGCCA 148131.doc -43· 201105793

ATTGGCAGTTGGTTGTAGAAGAAGGAGAAATGAAGGTATACAGAAGAGA

AGTAGAAGAAAATGGGATTGTTCTGGATCCTTTAAAAGCTACCCATGCAG

TTAAAGGCGTCACAGGACATGAAGTCTGCAATTATTTCTGGAATGTTGAC

GTTCGCAATGACTGGGAAACAACTATAGAAAACTTTCATGTGGTGGAAA

CATTAGCTGATAATGCAATCATCATTTATCAAACACACAAGAGGGTGTGG

CCTGCTTCTCAGCGAGACGTATTATATCTTTCTGTCATTCGAAAGATACCA

GCCTTGACTGAAAATGACCCTGAAACTTGGATAGTTTGTAATTTTTCTGT

GGATCATGACAGTGCTCCTCTAAACAACCGATGTGTCCGTGCCAAAATA

AATGTTGCTATGATTTGTCAAACCTTGGTAAGCCCACCAGAGGGAAACC

AGGAAATTAGCAGGGACAACATTCTATGCAAGATTACATATGTAGCTAATG

TGAACCCTGGAGGATGGGCACCAGCCTCAGTGTTAAGGGCAGTGGCAA

AGCGAGAGTATCCTAAATTTCTAAAACGTTTTACTTCTTACGTCCAAGAAA

AAACTGCAGGAAAGCCTATTTTGTTCTAGTATTAACAGGTACTAGAAG

ATATGTTTTATCTTTTTITAACTTTATTTGACTAATATGACTG 藉由於存在抗生素嘌呤黴素下之篩選作用，產生經穩定轉染細胞庫。利用針對FlagTM標記或CERT-S132A蛋白質本身之抗體，以西方墨點法證實所產生穩定地細胞庫的 CERT-S132A轉殖基因表現。由於細胞生產力係與CERT含量相關，因此選擇CERT-S 1 32A表現量最高之細胞庫用於後續之單細胞選殖。實例3 :產生並篩選單株CHO/CERT S13 2A細胞株過量表現CERT-S 132 A之經穩定轉染細胞庫經受以FACS 為基礎之單細胞選殖，以便產生單株conCERT™細胞株。隨後根據兩個參數進一步篩選出CHO/CERT S132A細胞 148131.doc •44· 201105793 株：a)CERT-S132A表現程度高，b)在接種培養及批次進料製程時，細胞生長性質皆最佳。在第一輪篩選時，由胞内染色測定>100 CHO/CERT S132A細胞株的CERT-S132A表現。其中，選出細胞内CERT-S132A含量最高之15株細胞株用於擴大並進一步分析。利用抗-Flag™抗體，藉由西方墨點法進一步測定所選出之15株CHO/CERT S132A細胞株的 CERT-S132A表現（圖 3)。於選殖體 1.15、2.20、2.31、 2.41、2.65、2.67、3.11及 3.31 中，CERT-SA突變體過度表現程度最高。爲了以產業方式生產宿主細胞株，於接種細胞儲備培養及批次進料製程時，可在無血清之化學限定培養基中良好生長特性皆非常重要。因此，根據標準產業接種方法培養 CHO/CERT S132A細胞株，並測定增倍時間及存活率。圖4 顯示根據生長速度（A)及在數個培養繼代時之存活率（B)對 15株CHO/CERT細胞株之分級。細胞.株CHO/CERT S132A 2.20(以編號 DSM ACC2989 寄存於 DSMZ)及 CHO/CERT S132A 2.41(以編號DSM ACC2990寄存於DSMZ)為四個具有最高增倍時間之細胞株中的兩個細胞株，且所顯示之存活率為 80-100°/。（圖 5A)。隨後，研究CHO/CERT S132A 細胞株在振盪瓶中批次進料發酵時之生長，其代表生物醫藥生產製程之小規模模型。如圖5A所示，所有CHO/CERT S132A細胞株均可顯示一般生長曲線，且初始生長期之特徵為細胞濃度增加，且隨後到達高原區，且隨後減少，直至發酵結束。然而，CHO/CERT S132A細胞株在初始期生 £ 148131.doc -45- 201105793 長速度及最大細胞密度上不同。其轉化成在整個生產製程中之存活細胞的總積分值（IVC)不同（圖5B)。在所有經分析之(：11〇/€£1〇'8132八細胞株中，細胞株1.13、2.20及 2.41顯示最高之IVC，其甚至比CHO-DG44母細胞株更高 (圖5B)。然而，細胞株1.13之CERT-S132A表現量低，且因此被排除。因此，選出本發明所述之兩種細胞株 CHO/CERT 2.20(以編號 DSM ACC2989 寄存於 DSMZ)及 CHO/CERT 2.41(以編號 DSM ACC2990 寄存於 DSMZ)作為具有高CERT-SA表現量及良好生長曲線之細胞。兩種細胞株皆為用於產生重組蛋白質之較佳宿主細胞株的理想候選細胞株。實例4 : CHO/CERT S132A細胞作為用於利用GS系統產生重組蛋白質之宿主細胞以編號 DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)寄存於DSMZ之細胞株為用於產生重組蛋白質之理想宿主細胞，此係因為其具有改善的分泌能力、及良好生長特性。作為DG44母細胞株，其為dhfr-缺陷型，且因此係與在生物醫藥產業中最廣泛使用之重組蛋白質表現系統（稱為二氫葉酸還原酶（DHFR))相容。此外，其與麩胺醯胺合成酶（GS)篩選/擴增系統及諸如新黴素、博來黴素（bleomycin)、潮黴素（hygromycin)及吉歐辛 (zeozine)之其他常用篩選方法相容。實例5 : CHO/CERT S132A細胞作為用於產生重組IgGl抗體之宿主細胞 148131.doc • 46· 201105793 為證實彼等之優良特性，以編碼人類單株IgG1型抗體之表現構梁體轉染本發明所述之c〇nCERTTM細胞及CHO-DG44母細胞株。藉由在不補充ht之無血清之化學合成培養基中’在存在抗生素G418下篩選，產生穩定產生IgG之細胞群體。隨後’作為標準產業細胞株發展程式的一部份’使其利用曱胺喋呤（MTX)進行基因擴增。隨後使所得之穩定的細胞庫於振盪瓶中進行批次進料發酵製程。經i 〇天之後’收集培養物，並由ELISA測定上清液中之IgG濃度。如圖6中所示’衍生自CHO-DG44母細胞之10株產量最高之細胞庫的收穫滴度中間值顯著低於衍生自c〇iiCErttm 細胞株的生產用細胞。更進一步，DG44抗體生產者細胞的 25-75% 範圍低於 4〇〇 mg/L，而 CHO/CERT S132A IgG 生產者細胞的25-75%範圍為自>4〇〇直至約1 g/L。因此，衍生自CHO/CERT S132A細胞的生產用細胞庫中所獲之收穫滴度比衍生自母細胞株之生產用細胞庫高約2倍。該等數據證實，以編號DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20) 及 DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)寄存於 DSMZ 之 CHO/CERT S132A細胞相較於DG44母細胞株而言，是用於產生重組蛋白質之較佳宿主細胞。實例6 : CHO/CERT S132A細胞作為用於重組產生IgG4抗體之宿主細胞爲了證實彼等之較佳特性，以編碼人類單株IgG4型抗體之表現構築體轉染本發明所述之conCERT™細胞及CHO-DG44母細胞株。藉由於不含HT補充作用之無血清化學限 148l31.doc -47- 201105793 定培養基中，在不存在抗生素G4 18下篩選，產生穩定產生 IgG之細胞群體。隨後，作為標準產業細胞株發展程式之一部份，使其利用曱胺喋呤（MTX)進行基因擴增。隨後，使所得之穩定細胞庫於振盪瓶中進行批次進料發酵製程。經1 0天之後，收集培養物，並由ELISA測定上清液中之 IgG濃度。衍生自CHO-DG44母細胞之10株產量最高之細胞庫的收穫滴度中間值顯著低於衍生自conCERT™細胞株之生產用細胞。更進一步，DG44抗體生產者細胞之25-75%範圍低於 400 mg/L，而 CHO/CERT S132A IgG生產者細胞之25-75%範圍為>400至約1 g/L。因此，衍生自CHO/CERT S 1 32A細胞之生產者細胞庫的收穫滴度比衍生自母細胞株的生產者細胞庫高約2倍。製造生物醫藥需要產生用於產生cGMP之單株細胞株。因此，於下一步驟中，自表現量最高之基因異種性細胞庫產生細胞株。隨後，如上所述，於接種培養及批次進料製程時，分析各基因型中1 〇株表現量最高之重組細胞株的性能。同樣在單株細胞株階段上，衍生自conCERT™細胞株之IgG4生產者細胞株（圖7 A-衍生自產生IgG4型抗體之 CHO/CERT 2.20及2.41重組體（conCERT™)的表現量最高之前10株單株細胞株）所顯示的比生產力顯著高於衍生自 DG44細胞之前10株細胞株（經典）。更進一步，其意指批次進料製程時，自conCERT™細胞所獲之總IgG4效價最高（圖 7B)。 148131.doc -48- 201105793

本實例顯示，以編號〇31\/1八(：02989((：110/0丑10'2.20)及 DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)^ ^ DSMZ^ CHO/CERT S132A細胞相較DG44母細胞株而言，是用於生產重組蛋白質之較佳宿主細胞。實例7 : conCERT™細胞株生產更多生物醫藥蛋白質（Fc融合蛋白質）以編碼Fc-融合蛋白質（意指具治療活性之與IgG抗體之 Fc部份共價連接之（多）肽）（作為所期望之基因）之載體轉染以編號 DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及 DSM ACC2990 (CHO/CERT 2.41)^#^DSMZ^conCERT™^ ' ACUO DG 44細胞。經篩選之後，在四次隨後之繼代期間，自所有穩定細胞庫之接種細胞儲備培養物獲得上清液，並由 ELISA測定產物效價，並除以細胞平均數量，以計算比生產力。比較後發現，衍生自conCERT™宿主細胞之生產用細胞的產物效價顯著高於衍生自DG44且表現Fc融合蛋白質之細胞。於批次進料培養時，同樣發現，衍生自conCERTTM之細胞的融合蛋白質生產力顯著增加，且收集時之效價亦更高。本實例證實在細胞株發展時使用conCERT™宿主細胞能夠產生在系列培養或生物反應器批次培養或批次進料培養時具有改進的比生產能力及更高效價之生產用細胞株。實例8 : conCERT™細胞株代表較佳之用於生物醫藥生產單鏈Fv(scFv)分子及區域抗體的宿主細胞 148131.doc •49- 201105793 以編碼單鏈Fv(scFv)或區域抗體（包括獲自駱馬或其他駱駝科動物之單鏈抗體的一或多種可變區域）（所期望基因）的載體轉染以編號DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及 DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)寄存於 DSMZ 之 conCERT™ 細胞、及CHO DG 44細胞。經筛選之後，在四次隨後之繼代期間，自所有穩定細胞庫的接種細胞儲備培養物中獲得上清液，並以ELISA測定產物效價，並除以細胞平均數量，以計算比生產力。比較後發現，衍生自conCERT™宿主細胞之生產用細胞的產物效價顯著高於衍生自DG44且表現 scFv蛋白質或區域抗體之細胞。批次進料培養時亦發現，衍生自conCERT™之細胞具有顯著增加之融合蛋白質生產力、及收集時之更高效價。本實例證實，於細胞株發展時使用conCERT™宿主細胞，能夠產生在系列培養或生物反應器批次培養或批次進料培養時，具有加強的比生產能力及更高效價的生產用細胞株。序列表：

SEQ ID NO : 1 Flag-CERT-SA編碼序列（利用引子 CMV 含義（SEQ ID NO : 2)及終止子反義（SEQ ID NO : 3)所產生之2373 bp片段） SEQ ID NO ： 2 引子CMV含義 SEQ ID NO ： 3 終止子反義引子，

SEQ ID NO

SEQ ID NO 4 5 引子CERT-正向引子CERT-反向 148131.doc •50· 201105793 SEQ ID NO ： 6 利用引子 CERT-正向（SEQ ID NO : 4)及 CERT-反向（SEQ ID NO: 5)所獲得之660 bp PCR產物參照案列表：

Fallaux,F. J., Bout,A., van,d.V., I, Van den Wollenberg,D.J., Hehir,K.M., Keegan,J., Auger,C.s Cramer,S.J., van，O.H_, van der Eb,A.J.，Valerio,D·,及 Hoeben,R_C.(1998).

New helper cells and matched early region 1 -deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses. Hum. Gene Ther. 9, 1909-1917.

Florin,L., Pegel,A., Becker,E·, Hausser,A., 01ayioye,M.A., 及 Kaufmann,H. Heterologous expression of the lipid transfer protein CERT increases therapeutic protein productivity of mammalian cells. Journal of Biotechnology In Press, Corrected Proof.

Hanada,K., Kumagai,K., Yasuda,S.，Miura，Y.，Kawano，M” Fukasawa，M.，及 Nishijima，M.(2003). Molecular machinery for non-vesicular trafficking of ceramide. Nature 426, 803-809.

Urlaub，G·，Kas，E·，Carothers，A.M.，及（^11&3111，1^-人.（1983)· Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells. Cell 33, 405-412. 【圖式簡單說明】圖1 : CERT S132A表現構築體之概視圖

S 148131.doc -51 - 201105793 (A) 以編號DSM ACC2989寄存於DSMZ之細胞株 (CHO/CERT 2.20)、及以編號DSM ACC2990 寄存於DSMZ 之細胞株（(：110/€£1〇'2.41)細胞中所含之卩13§<£11丁5132八表現卡匣之概視圖。CMV=巨細胞病毒（CMV)早期區域之增強子/啟動子；Flag=FlagTM抗原決定基標記物；CERT-S132A=人類 CERT S132A突變體之 cDNA; Stop=TGA終止密碼子；3’UTR=3'非轉譯區域。 (B) 轉染至CHO-DG44細胞，以產生本發明所述之 CHO/CERT S132A(conCERTTM)細胞株的載體構築體之圖譜。該質體經内部命名為「pBIP-l/Flag-CERT_SA」，且大小為7660 bp。黑色箭頭指出適於鑑別conCERT™細胞株之募核苷酸引子的結合位置。CMV=巨細胞病毒（CMV)早期區域之增強子/啟動子，隨後為多選殖位點（由所示酶之獨特識別位點指出）；F1 ori =細菌之複製起點；bla=用於胺苄西林（ampicillin)限制之β -内酿胺酶圖2 : CERT S132A表現與加強分泌之關聯 (A) 藉由以抗-Flag抗體細胞内標記，測定生產IgG之細胞株中之異種CERT S132A表現》基於信號強度，1至2號細胞株歸類為「低」（淡灰色帶點條）CERT-S132A表現量細胞株、3至4號細胞株為「高」CERT-S132A表現量細胞株（帶條形之條）。 (B) 於批次進料培養物中之相同細胞株的比抗體生產力。於加工期間之三個時間點計算所有細胞株之生產力， 148131.doc -52- 201105793 算法為：產物濃度除以IVC(活細胞之積分）。圖3 :藉由西方墨點法偵測CERT表現自14個CHO/CERT S132A細胞株製得全部細胞裂解物，且等量進行SDS-PAGE，且隨後利用針對Flag™抗原決定基標記之抗體進行免疫學偵測。於SDS-PAGE中展現出總共14個細胞株。各細胞株之名稱為其細胞株編號。分子量標記；（-)=負對照（經偽轉染處理之細胞株的溶胞產物）；（+)=正對照。圖4:接種體培養物中之CHO/CERT S132A(conCERTTM) 細胞株的生長特性於接種體培養期間之15個CHO/CERT S132A細胞株之生長特性。細胞密度維持在0.15至3xl06個細胞/ml之間，且每隔2至 3天繼代一次。 (A)根據生長速率將細胞株加以分級。（B)數個繼代階段之成活率；寄存編號DSM ACC2989寄存於DSMZ之細胞株 (CHO/CERT S132A 2.20)及以寄存編號DSM ACC2990寄存之細胞株（CHO/CERT S132A 2.41)係以實線表示，其他所有細胞株係以虛線表不。圖5 :在發酵期間之單株CHO/CERT S132A細胞株的生長在6天内，使15個單株經穩定轉染CHO/CERT S132A細胞株進行批次進料發酵。 (A)CHO/CERT S132A細胞株及DG44母細胞之生長曲線。寄存編號DSM ACC2989寄存於DSMZ之細胞株 148131.doc •53· 201105793 (CHO/CERT 2.20)、及以寄存編號DSM ACC2990寄存於 DSMZ之細胞株（CHO/CERT2.41)係以實線表示，其他所有細胞株係以虛線表示。 (B)於六天製程期間之所有細胞株之活細胞濃度的積分值（IVC)。斜線長條圖係指本發明所選擇之CHO/CERT S132A細胞株的IVC，黑色長條圖表示其他CHO/CERT S132A細胞株之IVC，影線長條圖表示母本細胞之IVC。圖6:對CHO/CERT S132A細胞與母本CHO DG44細胞株所分泌之抗體效價/蛋白質生產量的比較以編碼人類IgGl型單株抗體之表現構築體轉染如下細胞株：以寄存標號DSM ACC2989寄存於DSMZ之conCERT™ 細胞株（CHO/CERT 2.20)、及以寄存編號DSM ACC2990寄存於DSMZ之conCERT™細胞株（CHO/CERT 2.41)、及母本 CHO-DG44宿主細胞株（經典）。以盒狀圖表示每種基因型中表現量前10之細胞庫的抗體效價，該盒狀圖說明效價中間值及以盒狀表示25-75%分位數。誤差長條圖係表示標準偏差。圖7 :對CHO/CERT S132A細胞與母本CHO DG44細胞株所分泌之抗體效價/蛋白質生產量的比較以編碼人類IgGl型單株抗體之表現構築體轉染如下細胞株：以寄存標號DSM ACC2989寄存於DSMZ之conCERT™ 細胞株（CHO/CERT 2.20)、及以寄存編號DSM ACC2990寄存於DSMZ之conCERT™細胞株（CHO/CERT 2.41)、及母本 CHO-DG44宿主細胞株（經典）。選出每種基因型中表現量 14813I.doc •54· 201105793 前〗〇之細胞庫。 (Α，Β)以盒狀圖表示自各基因型 1Λ胞庫所產生之表現量前10之單株細胞株的比生產力（Α)及抗體效價（β)，該等盒狀圖說明效價中間值及以盒狀表示25_75%分位數。誤差長條圖係表示標準偏差。 148131.doc -55· 201105793 序列表 <110>德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 <120> CHO/CERT 細胞株 <130> P01-2509 <140 099114252 <141> 2010-05-04 <150> 09159439.0; 09161907.2 < 151 > 2009-05-05; 2009-06-04 <160> 6 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 1919 <212> DNA <213>人工 <220> <223〉FLAG-CERTSA 融合構築體 <400> 1 gccagtgtgc tggaattcac catggcccca ctagccgact acaaggacga cgatgacaag 60 atgtcggata atcagagctg gaactcgtcg ggctcggagg aggatccaga gacggagtct 120 gggccgcctg tggagcgctg cggggtcctc agtaagtgga caaactacat tcatgggtgg 180 caggatcgtt gggtagtttt gaaaaataat gctctgagtt actacaaatc tgaagatgaa 240 acagagtatg gctgcagagg atccatctgt cttagcaagg ctgtcatcac acctcacgat 300 tttgatgaat gtcgatttga tattagtgta aatgatagtg tttggtatct tcgtgctcag 360 gatccagatc atagacagca at£gatagat gccattgaac agcacaagac tgaatctgga 420 tatggatctg aatccagctt gcgtcgacat ggcgcaatgg tgtccctggt gtctggagca 480 agtggctact ctgcaacatc cacctcttca ttcaagaaag gccacagttt acgtgagaag 540 ttggctgaaa tggaaacatt tagagacatc ttatgtagac aagttgacac gctacagaag 600 tactttgatg cctgtgctga tgctgtctct aaggatgaac ttcaaaggga taaagtggta 660 gaagatgatg aagatgactt tcctacaacg cgttctgatg gtgacttctt gcatagtacc 720 aacggcaata aagaaaagtt atttccacat gtgacaccaa aaggaattaa tggtatagac 780 tttaaagggg aagcgataac ttttaaagca actactgctg gaatccttgc aacactttct 840 cattgtattg aactaatggt laaacgtgag gacagctggc agaagagact ggataaggaa 900 actgagaaga aaagaagaac agaggaagca tataaaaatg caatgacaga actlaagaaa 960 aaatcccact ttggaggacc agattatgaa gaaggcccta acagtctgat taatgaagaa 1020 gagttctttg atgctgttga agctgctctt gacagacaag ataaaataga agaacagtca 1080 cagagtgaaa aggtgagatt acattggcct acatccttgc cctctggaga tgccttttct 1140 tctgtgggga cacatagatt tgtccaaaag gttgaagaga tggtgcagaa ccacatgact 1200 tactcattac aggatgtagg cggagatgcc aattggcagt tggttgtaga agaaggagaa 1260 atgaaggtat acagaagaga agtagaagaa aatgggattg ttctggatcc tttaaaagct 1320 acccatgcag ttaaaggcgt cacaggacat gaagtctgca attatttctg gaatgttgac 1380 gttcgcaatg actgggaaac aactatagaa aactttcatg tggtggaaac attagctgat 1440 aatgcaatca tcatttatca aacacacaag agggtgtggc ctgcttctca gcgagacgta 1500 ttatatcttt ctgtcattcg aaagatacca gccttgactg aaaatgaccc tg抑acugg 1560 atagtttgta atttttctgt ggatcatgac agtgctcctc taaacaaccg atgtgtccgt 1620 s 148131-序列表.doc 201105793 gccaaaalaa atgttgctat gatttgtcaa accttggtaa gcccaccaga gggaaaccag 1680 gaaattagca gggacaacat tctatgcaag attacatatg tagctaatgt gaaccctgga 1740 ggatgggcac cagcctcagt gtlaagggca gtggcaaagc gagagiatcc taaatttcta 1800 aaacgtttta cttcttacgt ccaagaaaaa acigcaggaa agcctatttt gttctagtat 1860 laacagglac tagaagatat gttttatctt utuaactttamgacta atatgactg 1919 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213>人工 <220> <223>反義CMV引子 <400> 2 gacgtcaatg ggagtttgtt ttg 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>反義引子終止子 <400> 3 caaclagaag gcacagtcga gg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223>正向CERT引子 <400> 4 gcgttctgat ggtgacttct tg 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>反向CERT引子 <400> 5 tgtcctgtga cgcctttaac tg 22 <210> 6 <211> 660 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> 660bpPCR產物 CERT <4〇〇> 6 gcgttctgat ggtgacttct tgcataglac caacggcaat aaagaaaagt latttccaca 60 tgtgacacca aaaggaatia atggtataga ctttaaaggg gaagcgataa ctttiaaagc 120 aactactgct ggaatccttg caacactttc tcattgtatt gaactaatgg ttaaacgtga 180 ggacagctgg cagaagagac tggalaagga aactgagaag aaaagaagaa cagaggaagc 240 • 1· 148131-序列表.doc 201105793 atataaaaat gcaatgacag aacttaagaa aaaatcccac tttggaggac cagattatga 300 agaaggccct aacagtctga ttaatgaaga agagttcttt gatgctgttg aagctgctct 360 tgacagacaa gataaaatag aagaacagtc acagagtgaa aaggtgagat tacattggcc 420 tacatccttg ccctctggag atgccttttc ttctgtgggg acacatagat ttgtccaaaa 480 ggttgaagag atggtgcaga accacatgac ttactcatta caggatgtag gcggagatgc 540 caattggcag ttggttgtag aagaaggaga aatgaaggta tacagaagag aagtagaaga 600 aaatgggatt gttctggatc ctttaaaa£c tacccatgca gttaaaggcg tcacaggaca 660 148131-序列表.doc

Claims

201105793 七、申請專利範圍： 1. 一種細胞（CHO/CERT 2.20)，其係以編號DSM ACC2989 寄存於德國微生物與細胞培養物保存中心（DSMZ ; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)。 2. 一種細胞（CHO/CERT 2.41)，其係以編號 DSM ACC2990 寄存於DSMZ。 3. 如請求項1或2之細胞，其中該細胞另外含有至少一個第二載體構築體’該構築體包括可編碼所期望之蛋白質的所期望基因。 4_如請求項3之細胞，其中所有载體構築體均穩定性地整併至細胞基因組中。 5.如請求項1或2之細胞’其中該細胞之特徵為 a) 當利用基因組DNA作為模板時，具有特異性pCR條帶圖譜/指紋圖譜，其中利用寡核苦酸引子剛m N〇 : 2 及 SEQ ID NO : 3 會產生 2371 u η * · , “73 bp PCR產物；或 b) 當利用基因組DNA作為榲拓找辑扳時’具有特異性PCR條帶圖譜/指紋圖譜，其中利用塞访^ ^ 务核苷酸引子SEQ ID NO : 4及SEQ ID NO : 5會產生王 660 bp PCR產物（SEQ ID .NO : 6);或 c) 將（a)之 CERT-特異性 2373 bn 士 bP-PCR產物與下列限制酶培養後，會產生特異性之片段金又數置及片段尺寸：酵素片段數量 EcoRV 2 iSi^(bp) 2236、 148131.doc 201105793 Hindlll 2 2176 、 197 ΚρηΙ 2 2142 、 231 Ncol 2 20%、277 Ndel 2 1973 ' 400 PvuII 2 1241 > 1132 Spel 2 2128 ' 245 Xhol 2 2257 、 116 Avail 3 1140、832、401 BstXI 3 1980、266、127 Sail 3 1673 ' 491 ' 209 其中，以與Hindlll—起培養較佳。 6. 如請求項1或2之細胞，其中該CERT SI 3 2A表現卡匣係由 SEQ ID NO: 1 組成。 7. 如請求項3之細胞，其中該所期望蛋白質為治療用蛋白質，較佳者為抗體或抗體融合蛋白質。 8. —種產生宿主細胞株之方法，其特徵在於下列步驟： a) 提供母本宿主細胞，較佳者為CHO或NSO細胞， b) 將包括CERT S132A表現卡匣之載體構築體引入至步驟 (a)中之該母本宿主細胞， c) 選出經穩定轉染之細胞群， d) 藉由以FACS為基礎之單細胞選殖術分離出單株細胞株， e) 根據如下標準篩選該單株細胞株： i) CERTS 132A表現程度高， Π)接種細胞儲備培養時生長最佳， iii)批次進料培養時生長最佳， 148131.doc 201105793 0根據步驟⑷之㈣標準，自步驟⑷中之細胞株挑選出單株細胞株作為宿主細胞株。 9‘ 一種產±宿主細胞之方法，其特徵在於下列步驟： ^提供母本宿主細胞，較佳者為CHO或NS0細胞， b) 將包括CERT S132A表現卡£之載體構築體引人至步驟 (a)中之該母本宿主細胞， c) 選出經穩定轉染之細胞群， d) 藉由以FACS為基礎之單細胞選殖術分離出細胞， e) 根據如下標準篩選該細胞： 0 CERTS132A表現程度高， ii)接種細胞儲備培養時生長最佳， in)批次進料培養時生長最佳，〇根據步驟⑷之篩選標準，挑選出單-選殖體或-細胞庫作為宿主細胞。如π求項8或9之方法，其中該步驟（b)中之CERT S132A 表現卡匠係由SEQ ID ΝΟ:1組成。 11.種在凊求項3至7中任一項中之細胞中產生由所期望之土因、扁碼之所期望蛋白質的方法，其特徵在於下列步驟： a) 提供如請求項3至7中任一項之細胞， b) 在可以使至少一種所期望基因表現的條件下，培養該細胞。 12_如μ求項11之方法’其中該方法包括額外步驟e)收集該所期望之蛋白質。 148131.doc 201105793 13. 14. 15. 16. 17. 月长項12之方法，其令該方法包括額外步驟幻純化該所期望之蛋白質’。一種鑑別經轉殖CERT S132A(SEQ ID N〇:1)之細胞的方法’其係藉由： a) 進行聚合酶連鎖反應PCR， b) 使用基因組ONA作為模板，且 c) 使用具有SEQ ID NO : 2及SEQ ID NO : 3之寡核苷酸引子，藉此產生2373 bp PCR產物。一種培養細胞之方法，包括 a) k供如請求項1至7中任一項之細胞，及 b) 在可以使該細胞增殖之條件下，培養該細胞。一種以如請求項1至7中任一項之細胞於製造蛋白質上之用途β 一種套組’其包括如請求項1或2中任一項之細胞、用於表現所期望基因的表現載體及用於培養該細胞之細胞培養基。 148131.doc