CN105121652B

CN105121652B - 用于在酵母和其它转化细胞中高产量表达多肽的温度变动法

Info

Publication number: CN105121652B
Application number: CN201480014647.8A
Authority: CN
Inventors: G·莱斯尼基; P·D·麦克内尔; F·哈特内尔; M·杨
Original assignee: Alder Biopharmaceuticals Inc
Current assignee: H Lundbeck AS
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2034-03-17
Also published as: MX2019008417A; EP2971037A4; US10138294B2; IL241176A0; NZ711400A; EP3597664A3; ES2749751T3; US11447540B2; WO2014145650A1; AU2014232813B2; CA2905180A1; JP6412552B2; US20160039911A1; KR20150140678A; MX2015011968A; TWI636136B; KR102202477B1; AU2014232813A1; CN105121652A; TW201512401A

Abstract

本发明公开了用于产生异源性蛋白质的方法。特别是，本公开提供了产生所需蛋白，包括多亚基蛋白质，例如抗体的改进型方法，所述方法具有较高的产量以及改进的纯度。在例示性实施方案中，转化细胞为酵母，例如甲基营养型酵母，诸如巴斯德毕赤酵母。

Description

用于在酵母和其它转化细胞中高产量表达多肽的温度变动法

相关的申请公开

本申请要求2013年3月15日提交、标题为“TEMPERATURE SHIFT FOR HIGH YIELDEXPRESSION OF POLYPEPTIDES IN YEAST AND OTHER TRANSFORMED CELLS”的美国临时申请序号61/791,471的权益，并且还要求2013年3月15日提交的美国临时申请序号61/790,613的权益，这两个美国临时申请各自据此以引用的方式整体并入本文中。

本申请包括一个生物序列表作为其公开内容的一部分，所述序列表包含于在2014年3月13日创建的被命名为“43257o3413.txt”并且大小为14,286个字节的文件中，所述序列表据此以引用的方式整体并入本文中。

技术领域

本公开大体而言涉及在酵母和其它细胞中产生所需蛋白质的方法。本公开包括可用于表达单亚基和多亚基蛋白质，包括抗体的方法。在例示性实施方案中，所述细胞为酵母，诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。与常规方法相比，主题方法的实施方案可以高产量产生抗体或其它所需蛋白质。另外，本发明涉及发酵领域。特别是，本发明涉及重组酵母细胞的发酵。

发明背景

许多重组产生的蛋白质已经获得管制许可而用于人类治疗性用途。越来越多的这些治疗性蛋白质是在微生物表达系统内产生的。实际上，根据最近的综述，直至2009年1月由美国食品与药物管理局或欧洲药品管理局所许可的151种以蛋白质为基的重组药物中，有接近一半是使用微生物表达系统来产生的(Ferrer-Miralles等人，Microbial CellFactories 2009，8:17)。

在这些重组产生的蛋白质之中有抗体，这些抗体按照惯例为由二条相同轻链与二条相同重链组成的四聚体蛋白质。目前有数百种治疗性单克隆抗体(mAb)已上市或是正在研发之中。功能性抗体的产生一般涉及二条多肽链的合成，以及数个翻译后事件，包括对N端分泌信号序列的蛋白质水解加工；将多肽适当折叠与组装成为四聚体；形成二硫键；并且通常包括特异性N-连接的糖基化。

先前已经使用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为用于制造具有治疗效用的重组蛋白质的产生宿主。实例包括产生人类血清白蛋白和激肽释放酶(Kallikrein)抑制剂、艾卡拉肽(Ecallantide)(Reichert,J.mAbs 4:3 1-3,2012)。已经使用巴斯德毕赤酵母来产生具有正确组装的重链与轻链的重组单克隆抗体(美国专利7,927,863，其据此以引用的方式整体并入本文中)。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子能驱动缺乏N-糖基化的抗体表达于酵母内(美国专利7,927,863)。

Baumann等人近来使用GAP系统来产生重组抗体Fab片段的工作(BMC Genomics2011，12:218)已经显示出先前认为是组成型的此系统在使用葡萄糖作为碳源与能源的缺氧条件下展现出增高的表达量。缺氧条件为允许发酵中的溶氧水平降至非常低的水平，同时仍然经由通气和搅拌来向培养物供应氧的那些条件。这会导致混合的需氧性代谢和发酵性代谢。在发酵罐中使用缺氧条件会导致乙醇的毒性累积，因此必须小心地控制该过程，以使毒性水平不会累积。Baumann通过测量发酵罐中的乙醇水平并且调整葡萄糖进料速率来降低其累积而实现此举。然而，这种方法不太可扩充，因为用于可靠地测量大规模发酵罐中的乙醇的技术不是可广泛利用的。

真菌宿主，诸如甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母，在治疗性蛋白质表达中具有一些明显的优点，包括它们不会分泌大量内源性蛋白质、具有可用于产生异源性蛋白质的强力可诱导性启动子、能在成分确定的化学培养基中并且在没有使用动物血清的情况下生长，以及能产生高滴度的重组蛋白质(Cregg等人，FEMS Microbiol.Rev.24:45-66(2000))。先前的工作，包括由本发明人进行的工作，已有助于将巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)确立为用于产生功能性抗体的具成本效益的平台，这些功能性抗体适用于研究、诊断和治疗性用途。参见共同拥有的美国专利7,927,863与7,935,340，其各自以引用的方式整体并入本文中。还在文献中获悉用于设计巴斯德毕赤酵母发酵作用以便表达重组蛋白质的方法，并且描述了有关包括细胞密度、培养液(broth)体积、pH值、底物进料速率以及各反应阶段的持续时间的参数的最佳化。参见Zhang等人,"Rational Design and Optimization ofFed-Batch and Continuous Fermentations"，Cregg,J.M.编辑,2007,Pichia Protocols(第2版),Methods in Molecular Biology,第389卷,Humana Press,Totowa,N.J.,第43-63页，其据此以引用的方式整体并入本文中。

此外，本申请人和其余人先前的工作已说明了经由包括在产生阶段开始时或者接近产生阶段开始时，添加乙醇团注剂至培养物中，以及关于多亚基蛋白质，例如抗体，改变基因拷贝数目和介于亚基基因之间的拷贝数目比率的方法来增加酵母中蛋白质的产生。参见US20130045888，标题为Multi-Copy Strategy For High-Titer And High-PurityProduction Of Multi-Subunit Proteins Such As Antibodies In TransformedMicrobes Such As Pichia Pastoris；以及US20120277408，标题为High-PurityProduction Of Multi-Subunit Proteins Such As Antibodies In TransformedMicrobes Such As Pichia Pastoris，其各自据此以引用的方式整体并入本文中。

虽然前述的Zhang等人的文章作了一些努力来说明一种用于最佳化前述参数的系统性方法，并且给出一种理解这些参数中的一些彼此之间的相互影响的理论性方法，但是表达最佳化仍然为主要是凭经验的过程。因为存在此种相互影响，大体而言不足以最佳化各个别参数，同时使所有其余者保持恒定。举例来说，最佳的培养基组成会随着培养密度、菌株背景(strain background)、进料速率、搅拌、氧合作用等等而变化。因为存在此种复杂的相互影响，可以测试的参数组合的数量可能是无限大的，并且即使已经广泛地最佳化了表达系统，总还是会有大量未经测试、可能对产量和/或纯度有益的条件。

发明概要

如同以下进一步所述，申请人已经识别出大幅增加真核细胞，诸如酵母中产生的所需蛋白质的产量的方法。即使对于已经高度最佳化的表达系统，本发明方法也会使所需蛋白质的产量增加达到约30％。

在一个方面，本公开提供一种产生所需蛋白质的方法，其包括：(a)在第一温度下培养包含一个或多个基因的真核细胞，所述一个或多个基因提供所述所需蛋白质的表达；以及(b)在第二温度下培养所述真核细胞，并且允许所述真核细胞产生所述所需蛋白质；其中所述第二温度与所述第一温度不同。任选地，所述培养可包括以下步骤：(a)在分批补料发酵条件下在培养基中培养酵母细胞群体，其中各酵母细胞包含编码多肽的DNA区段，其中所述DNA区段可操作地连接至甘油醛-3-磷酸(GAP)转录启动子和转录终止子，其中所述蛋白质不为甘油醛-3-磷酸，其中所述发酵包含处于第一进料速率下的可发酵糖进料，并且其中所述发酵是以第一氧输送速率进行搅拌；(b)测量所述群体在所述分批发酵期间的呼吸商(RQ)，并且确定所述呼吸商是否在所需预定范围内，其中在开始所述培养之后约20-40小时时的RQ的所需预定范围是介于约1.08与约1.35之间；(c)当所述RQ在所需预定范围之外时，进行调整所述可发酵糖进料速率至第二进料速率抑或调整所述氧输送速率至第二氧输送速率中的一项或二项；(d)在整个培养步骤中重复步骤(b)和(c)一或多次；(e)从所述培养基收获所述酵母细胞；以及(f)从所述细胞和/或所述培养基回收所述多肽。

所述第一温度可介于约20℃与约32℃之间。

所述第一温度可介于约24℃与约31.5℃之间。

所述第一温度可介于约27℃与约31℃之间。

所述第一温度可介于约27.5℃与约30℃之间。

所述第一温度可介于约20℃与约29.5℃之间。

所述第一温度可介于约24℃与约29℃之间。

所述第一温度可介于约27℃与约28.5℃之间。

所述第一温度可介于约27.5℃与约28.5℃之间。

所述第二温度可比所述第一温度高约1℃与约6℃之间。

所述第二温度可比所述第一温度高约1℃与约3℃之间。

所述第二温度可比所述第一温度高约2℃与约4℃之间。

所述第二温度可比所述第一温度高约2℃与约3℃之间。

所述第二温度可介于约30℃与约34℃之间。

所述第二温度可介于约30℃与约32℃之间。

所述第二温度可介于约30℃与约31.5℃之间。

所述第二温度可为约30℃或约31℃。

所述第二温度可比所述第一温度高。

所述所需蛋白质包含多亚基复合体。

所述多亚基复合体可包含抗体。

所述抗体可为人类的或人源化的(humanized)。

所述抗体可对IL-6、TNF-α、CGRP、PCSK9、HGF或NGF具特异性。

所述方法可以增加所述所需蛋白质的产量。

相对于在所述第一温度与所述第二温度之间没有差异的情况下所进行的相同方法，所述方法可以减低一个或多个产物相关变体的相对丰度。

相对于在所述第一温度与所述第二温度之间没有差异的情况下所进行的相同方法，所述方法可以减低产物相关变体的相对丰度，所述产物相关变体具有高于或低于所述所需多亚基复合体的表观分子量，所述表观分子量是通过尺寸排阻色谱法或凝胶电泳所检测。

相对于在所述第一温度与所述第二温度之间没有差异的情况下所进行的相同方法，所述方法可以减低具有异常二硫键的复合体的相对丰度。

相对于在所述第一温度与所述第二温度之间没有差异的情况下所进行的相同方法，所述方法可以减低具有减少的半胱氨酸的复合体的相对丰度。

相对于在所述第一温度与所述第二温度之间没有差异的情况下所进行的相同方法，所述方法可以减低具有异常糖基化的复合体的相对丰度。

所述真核细胞可包含酵母细胞。

所述酵母细胞可包含甲基营养型酵母。

所述甲基营养型酵母可属于毕赤酵母(Pichia)属。

所述毕赤酵母属的所述甲基营养型酵母可为巴斯德毕赤酵母。

所述毕赤酵母属的所述甲基营养型酵母可选自以下项：安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermordii)、嗜甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)，以及因诺托毕赤酵母(Pichia inositovera)。

可将提供所述所需蛋白质的表达的基因整合至一个或多个基因组基因座中。

所述基因组基因座中的至少一者可选自以下项：pGAP基因座、3’AOX TT基因座；PpURA5；OCH1；AOX1；HIS4；GAP；pGAP；3’AOX TT；ARG；以及HIS4 TT基因座。

编码所述所需蛋白质的所述亚基的基因中的至少一者可在可诱导型或组成型启动子的控制下得以表达。

所述可诱导型启动子可选自以下项：AOX1、CUP1、四环素可诱导型启动子、硫胺素可诱导型启动子，以及FLD1启动子。

步骤(a)可包括在包含甘油作为碳源的培养基中培养所述真核细胞，直到所述甘油耗尽为止。

所述所需蛋白质可在选自以下项的启动子的控制下得以表达：CUP1、AOX1、ICL1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)、FLD1、ADH1、醇脱氢酶II、GAL4、PHO3、PHO5以及Pyk启动子、四环素可诱导型启动子、硫胺素可诱导型启动子、由其所衍生的嵌合启动子、酵母启动子、哺乳动物启动子、昆虫启动子、植物启动子、爬行动物启动子、两栖动物启动子、病毒启动子，以及禽类启动子。

所述真核细胞可为二倍体、四倍体细胞，或是多倍体细胞。

所述方法可进一步包括从所述真核细胞或从所述培养基中纯化出所述所需蛋白质。

所述所需蛋白质可从所述真核细胞的细胞内组分、细胞质、核质，或是膜中纯化而来。

所述真核细胞可将所述所需蛋白质分泌至所述培养基中。

步骤(a)可包括分批阶段。

所述分批阶段可包括在包含碳源的培养基中培养所述真核细胞。

所述分批阶段的终止可以由所述培养基中所述碳源的耗尽来确定。

步骤(b)可包括分批补料阶段。

呼吸商(RQ)在步骤(b)期间可维持为指定值或在指定范围内。

所述指定RQ值可为约1.12。

所述指定RQ范围可为约1.0至1.24，或约1.06至1.18，或约1.09至1.15。

所述RQ值可以或是所述RQ范围可通过调节以下中的一项或多项而得以维持：进料速率、进料组成、供气流速、搅拌速率，和/或供气的氧浓度。

所述方法可包括分批阶段和分批补料阶段。

所述分批阶段可包括用碳源来培养所述真核细胞，直到所述碳源耗尽为止。所述碳源可包含以下中的一项或多项：甘油、葡萄糖、乙醇、柠檬酸盐、山梨糖醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、蜜二糖、乳糖、麦芽糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、甘露醇以及棉子糖，并且优选包括甘油。

所述分批补料阶段可在所述分批阶段之后开始。

可在所述分批阶段终止时或即将终止时，在所述分批补料阶段开始时或即将开始时，在所述分批阶段与所述分批补料阶段之间进行温度变动。

举例来说，可在碳源耗尽之后，或者在开始进料添加之前，或者在开始进料添加之后，进行温度变动。

优选在开始进料添加之后不超过5小时，例如在开始进料添加之后不超过4小时，不超过3小时，不超过2小时，不超过1小时，不超过30分钟，不超过20分钟，或不超过5分钟，进行温度变动。然而，可在更早抑或在更晚的时间进行温度变动。

所述方法可包括添加乙醇团注剂至培养物中。乙醇团注剂的添加可以与添加至初始培养物中的碳源的耗尽同时发生，初始培养物中的碳源的耗尽可通过溶氧浓度的快速增加(溶氧尖峰(spike))或是其它方式而检测到。

乙醇团注剂可在培养物中产生介于约0.01％与约4％之间，介于约0.02％与约3.75％之间，介于约0.04％与约3.5％之间，介于约0.08％与约3.25％之间，介于约0.1％与约3％之间，介于约0.2％与约2.75％之间，介于约0.3％与约2.5％之间，介于约0.4％与约2.25％之间，介于约0.5％与约1.5％之间，介于约0.5％与约2％之间，介于约0.6％与约1.75％之间，介于约0.7％与约1.5％之间，或者介于约0.8％与约1.25％之间的乙醇浓度。

乙醇团注剂可在培养物中产生可为至少约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％或0.9％(w/v)的乙醇浓度。

乙醇团注剂可在培养物中产生可为至多约4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.8％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.35％、0.3％、0.25％、0.2％，或者0.15％(w/v)的乙醇浓度。

添加乙醇团注剂的步骤可包括添加乙醇至所述培养物中、添加包含乙醇的载体至所述培养物中、添加所述细胞至包含乙醇的培养基或载体中，或者替换部分的培养基。

所述所需蛋白质可含有一种或多种多肽，其包含至少一个二硫键。

所述所需蛋白质可包含多亚基复合体。

所述多亚基复合体可包含抗体。

相对于在无温度变动的情况下所进行的相同方法，所述方法可以减低一个或多个产物相关变体的相对丰度。

相对于在无温度变动的情况下所进行的相同方法，所述方法可以减低产物相关变体的相对丰度，所述产物相关变体具有高于或低于所述所需多亚基复合体的表观分子量，所述表观分子量是通过尺寸排阻色谱法或凝胶电泳所检测。

相对于在无温度变动的情况下所进行的相同方法，所述方法可以减低具有异常化学计量数的复合体的相对丰度。

相对于在无温度变动的情况下所进行的相同方法，所述方法可以减低具有异常二硫键的复合体的相对丰度。

所述方法可包括添加进料至所述真核细胞中。

呼吸商(RQ)的值可维持为指定值或在指定范围内。所述指定RQ值可为1.12。所述指定RQ范围可为例如1.0至1.24，或1.06至1.18，或是1.09至1.15。

所述指定RQ值或范围可通过调节(增加或减低)以下中的一项或多项而得以维持：葡萄糖浓度、氧的可用性、搅拌强度、气体压力、供应的空气或其它气体混合物的流速、培养物的粘度、培养物密度、供应的空气或其它气体混合物中的氧浓度，以及温度。举例来说，可调节(增加或减低)进料添加速率(进料速率)，以便控制呼吸商(RQ)，诸如以维持指定RQ值或范围。

所述进料可包含至少一种可发酵的碳源。

所述碳源可包含以下中的一项或多项：甘油、葡萄糖、乙醇、柠檬酸盐、山梨糖醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、蜜二糖、乳糖、麦芽糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、甘露醇以及棉子糖。

编码所述多亚基复合体的所述亚基的基因中的至少一者可在可诱导型或组成型启动子的控制下得以表达。

编码所述多亚基复合体的所述亚基的基因中的至少一者可在选自以下项的启动子的控制下得以表达：CUP1、AOX1、ICL1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)、FLD1、ADH1、醇脱氢酶II、GAL4、PHO3、PHO5以及Pyk启动子、四环素可诱导型启动子、硫胺素可诱导型启动子、由其所衍生的嵌合启动子、酵母启动子、哺乳动物启动子、昆虫启动子、植物启动子、爬行动物启动子、两栖动物启动子、病毒启动子，以及禽类启动子。

所述真核细胞可为二倍体、四倍体细胞，或是多倍体细胞。

所述方法可进一步包括从所述真核细胞或从所述培养基中纯化出所述多亚基复合体。

所述多亚基复合体可从所述真核细胞的细胞内组分、细胞质、核质，或是膜中纯化而来。

所述真核细胞将所述所需蛋白质分泌至培养基中。

所述所需蛋白质可从所述培养基中纯化而来。

所述所需蛋白质可包含单特异性或双特异性抗体。

所述所需蛋白质可包含人类抗体或人源化抗体或其片段。

所述人源化抗体可源自小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊或牛。

所述人源化抗体可源自兔。

所述所需蛋白质可包含单价、二价或多价抗体。

所述抗体可利用蛋白A和/或蛋白G亲和性，而从所述培养物中纯化而来。

提供所述所需蛋白质的表达的基因中的至少一者可被最佳化以便表达于所述真核细胞中。

所述所需蛋白质可包含抗体，并且可通过测量由所述真核细胞所产生以及可能包含在具有预期表观流体动力学半径的抗体复合体中、可能包含在具有预期分子量的抗体复合体中，和/或与所述抗体的标靶特异性结合的抗体的分数而评估所述抗体的纯度。

所述所需蛋白质可包含抗体，并且可通过测定由所述真核细胞所产生的抗体量且扣除可能被异常糖基化、包含在除具有预期表观流体动力学半径的复合体以外的抗体复合体中、包含在具有预期分子量的抗体复合体中，和/或未能与所述抗体的标靶特异性结合的任何产物相关变体而评估所述抗体产量。

所述抗体复合体的分子量可通过非还原性SDS-PAGE来测定。

所述所需蛋白质可包含抗体，所述方法可进一步包括纯化所述抗体。

所述培养细胞可产生至少100mg/L、至少150mg/L、至少200mg/L、至少250mg/L、至少300mg/L、介于100与300mg/L之间、介于100与500mg/L之间、介于100与1000mg/L之间、至少1000mg/L、至少1250mg/L、至少1500mg/L、至少约1750mg/L、至少约2000mg/L、至少约10000mg/L或更大的上清液抗体滴度。

所述所需蛋白质可包含多亚基复合体，并且所述多亚基复合体中的一个或多个亚基可由不止一个基因拷贝来表达。

所述所需蛋白质可包含抗体，所述抗体可由编码所述抗体轻链的基因的1至10个拷贝来表达，以及由编码所述抗体重链的基因的1至10个拷贝来表达。

可将提供所述所需蛋白质的表达的基因整合至所述细胞的基因组中。

提供所述所需蛋白质的表达的基因可包含在染色体外元件、质粒或人工染色体上。

所述细胞所包含的提供所述抗体轻链的表达的基因的拷贝数目可多于提供所述抗体重链的表达的基因的拷贝数目。

在所述细胞中，编码所述抗体重链的基因的拷贝数目与编码所述抗体轻链的基因的拷贝数目可分别为：2与2、2与3、3与3、3与4、3与5、4与3、4与4、4与5、4与6、5与4、5与5、5与6、或5与7。

在所述细胞中，编码所述抗体重链的基因的拷贝数目与编码所述抗体轻链的基因的拷贝数目可分别为：2与1、3与1、4与1、5与1、6与1、7与1、8与1、9与1、10与1、1与2、2与2、3与2、4与2、5与2、6与2、7与2、8与2、9与2、10与2、1与3、2与3、3与3、4与3、5与3、6与3、7与3、8与3、9与3、10与3、1与4、2与4、3与4、4与4、5与4、6与4、7与4、8与4、9与4、10与4、1与5、2与5、3与5、4与5、5与5、6与5、7与5、8与5、9与5、10与5、1与6、2与6、3与6、4与6、5与6、6与6、7与6、8与6、9与6、10与6、1与7、2与7、3与7、4与7、5与7、6与7、7与7、8与7、9与7、10与7、1与8、2与8、3与8、4与8、5与8、6与8、7与8、8与8、9与8、10与8、1与9、2与9、3与9、4与9、5与9、6与9、7与9、8与9、9与9、10与9、1与10、2与10、3与10、4与10、5与10、6与10、7与10、8与10、9与10、10与10。

相对于常规方法来说，使用本公开方法，可使非所需副产物的相对丰度相较于初始丰度水平减低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或降至检测不出的水平。相对丰度可能因此被降低的例示性非所需副产物可包括具有不同于所需多亚基复合体的表观分子量的一种或多种物质。举例来说，表观分子量可能因化学计量、折叠、复合体组装和/或糖基化方面的差异而受到影响。举例来说，此类非所需副产物可使用尺寸排阻色谱法和/或凝胶电泳来检测，并且可具有高于或低于所需多亚基复合体的表观分子量。在例示性实施方案中，可在还原条件下检测非所需副产物。在其它例示性实施方案中，可在非还原条件下检测非所需副产物。

在例示性实施方案中，本公开还提供可以较高产量提供抗体和其它多亚基复合体的重组产生的改进型方法和物质组成物。在例示性实施方案中，使用本文公开的方法可使产量增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或更多(相对于常规方法来说)。

在例示性实施方案中，可产生所需蛋白质的真核细胞可以是酵母，例如毕赤酵母属物种中的，如巴斯德毕赤酵母或另一种甲基营养型酵母，或是酵母(Saccharomyces)属物种中的，如酿酒酵母(S.cerevisiae)或另一种酵母，如裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(S.pombe))。可用于本发明中的甲基营养型酵母的其它实例包括安格斯毕赤酵母(本领域中还称为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))、季也蒙毕赤酵母、嗜甲醇毕赤酵母、因诺托毕赤酵母、绪方奈川氏酵母(Ogataea nitratoaversa)，以及波伊德氏假丝酵母(Candida boidnii)。

真核细胞可以是酵母细胞，诸如甲基营养型酵母，诸如毕赤酵母属酵母。例示性毕赤酵母属的甲基营养型酵母包括巴斯德毕赤酵母、安格斯毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、嗜甲醇毕赤酵母，以及因诺托毕赤酵母。宿主细胞可通过配对作用来产生，例如通过配对二个单倍体酵母细胞来产生，而所述单倍体酵母细胞各含有编码所述多亚基复合体的亚基的至少一个基因的一个或多个拷贝。

在一个优选实施方案中，毕赤酵母属的甲基营养型酵母为巴斯德毕赤酵母。真核细胞可以是单倍体、二倍体或四倍体细胞。

编码所述所需蛋白质的基因中的至少一者可在可诱导型或组成型启动子的控制下得以表达，所述启动子诸如有：CUP1(由培养基中的铜水平所诱导；参见Koller等人，Yeast 2000；16:651-656.)、四环素可诱导型启动子(参见如Staib等人，AntimicrobialAgents And Chemotherapy,2008年1月,第146-156页)、硫胺素可诱导型启动子、AOX1、ICL1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)、FLD1、ADH1、醇脱氢酶II、GAL4、PHO3、PHO5以及Pyk启动子、由其所衍生的嵌合启动子、酵母启动子、哺乳动物启动子、昆虫启动子、植物启动子、爬行动物启动子、两栖动物启动子、病毒启动子以及禽类启动子。

真核细胞可将所述所需蛋白质分泌至培养基中。举例来说，所述所需蛋白质可包含分泌信号肽。可选地或另外地，所述所需多亚基复合体可保留在所述宿主细胞中，并且可从其中分离出来。

所需蛋白质可包含抗体，诸如单特异性或双特异性抗体。所述抗体可为以特异性方式与任何抗原结合的抗体。

所述所需蛋白质可包含任何类型的抗体。例示性抗体类型包括例如以下的任何哺乳动物物种的抗体：人类、小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊，牛等等。优选地，所述抗体为人类抗体或可源自兔的人源化抗体。所述抗体可为单价、二价或多价抗体。

提供所述所需蛋白质，例如所需抗体的轻链和/或重链在所述真核细胞中的表达的所述基因中的至少一者可被最佳化以便表达于所述宿主细胞中(如通过选择优选密码子和/或经由密码子选择而改变AT百分比)。

可通过测量由所述宿主细胞所产生的未被糖基化的、包含在具有预期表观流体动力学半径和/或表观分子量(如通过尺寸排阻色谱法测量)的复合体中、具有预期电泳迁移率(如通过凝胶电泳，诸如SDS-PAGE以及任选地通过西方印迹法检测)的所需蛋白质的分数，和/或通过测量所述多亚基复合体的特异性活性(例如特异性结合所需抗体的标靶)而评估所述所需蛋白质，诸如所需抗体的纯度。

所需蛋白质可为抗体，并且可通过测定由所述宿主细胞所产生的所需抗体的量且扣除任何已被糖基化、包含在除具有预期表观分子量或流体动力学半径的复合体以外的抗体复合体中，和/或未能与所述所需抗体的标靶特异性结合的产物相关变体而评估所述抗体的产量。

根据本发明的另一个实施方案，提供一种在酵母细胞中产生所需蛋白质，诸如抗体或抗体的抗原结合片段的方法。在分批补料发酵条件下在培养基中培养酵母细胞群体。各酵母细胞包含编码所需蛋白质，例如抗体的重链多肽的DNA区段，以及任选的编码第二所需蛋白质，例如抗体的轻链多肽的DNA区段。所述一个或多个DNA区段可操作地连接至甘油醛-3-磷酸(GAP)转录启动子和转录终止子。所述发酵包含处于第一进料速率下的可发酵糖进料，并且所述发酵是以第一氧输送速率进行氧化。在分批补料发酵的进料阶段期间测量所述群体的呼吸商(RQ)，并且将其与所需预定范围相比较。当所述RQ在所需预定范围之外时，将可发酵糖进料速率和氧输送速率中的一者或二者调整至第二速率。在整个培养期间或部分培养期间进行测量和调整。从所述培养基中收获所述酵母细胞。从去除酵母细胞的培养基中或从所述酵母细胞中回收由所述酵母细胞产生的所需蛋白质，例如重链多肽和轻链多肽。

根据本发明的另一个实施方案，提供一种在毕赤酵母细胞中产生包含二条重链和二条轻链的抗体的方法。在缺氧、分批补料发酵条件下在培养基中培养毕赤酵母细胞群体。各酵母细胞包含编码抗体的重链多肽的DNA区段，以及编码抗体的轻链多肽的DNA区段。DNA区段可操作地连接至甘油醛-3-磷酸(GAP)转录启动子和转录终止子。从所述培养基中收获所述酵母细胞。从所述酵母细胞中或从去除酵母细胞的培养基中回收由所述酵母细胞产生的抗体。

本公开还提供一种用于使酵母细胞发酵以制造所需蛋白质的反馈控制机构，其使用呼吸商测量法，所述测量法调整氧合作用和/或可发酵糖进料的水平。所述反馈控制机构允许良好地控制培养物，以产生充分量的产物，同时避免乙醇毒性的累积。此外，如此产生的所需蛋白质具有优良的定性性质，例如优良的同质性以及恰当的亚基间组装。举例来说，本公开提供了在酵母细胞中产生所需蛋白质的方法，其包括以下步骤：(a)在分批补料发酵条件下在培养基中培养酵母细胞群体，其中各酵母细胞包含编码多肽的DNA区段，其中所述DNA区段可操作地连接至甘油醛-3-磷酸(GAP)转录启动子和转录终止子，其中所述蛋白质不为甘油醛-3-磷酸，其中所述发酵包含处于第一进料速率下的可发酵糖进料，并且其中所述发酵是以第一氧输送速率进行搅拌；(b)测量所述群体在分批发酵期间的呼吸商(RQ)，并且确定所述呼吸商是否在所需预定范围内，其中在开始所述培养之后约20-40小时时的RQ的所需预定范围是介于约1.08与约1.35之间；(c)当所述RQ在所需预定范围之外时，进行调整所述可发酵糖进料速率至第二进料速率抑或调整所述氧输送速率至第二氧输送速率中的一项或二项；(d)在整个培养步骤中重复步骤(b)和(c)一或多次；(e)从所述培养基收获所述酵母细胞；以及(f)从所述细胞和/或所述培养基回收所述多肽。任选地，所述方法可包括：(a)在第一温度下培养包含一个或多个基因的真核细胞，所述一个或多个基因提供所述所需蛋白质的表达；以及(b)在第二温度下培养所述真核细胞，并且允许所述真核细胞产生所述所需蛋白质；其中所述第二温度可能与所述第一温度不同；举例来说，所述第一温度可介于约20℃与约32℃之间，介于约24℃与约31.5℃之间，介于约27℃与约31℃之间，介于约27.5℃与约30℃之间，介于约20℃与约29.5℃之间，介于约24℃与约29℃之间，介于约27℃与约28.5℃之间，或介于约27.5℃与约28.5℃之间；和/或任选地，所述第二温度可比所述第一温度高约1℃与约6℃之间，比所述第一温度高约1℃与约3℃之间，比所述第一温度高约2℃与约4℃之间，或比所述第一温度高约2℃与约3℃之间；和/或任选地，所述第二温度可介于约30℃与约34℃之间，介于约30℃与约32℃之间，或介于约30℃与约31.5℃之间；诸如，所述第一温度可为约28℃，并且所述第二温度可为约30℃或约31℃；或所述第一温度可介于约27.5℃与约28.5℃之间并且所述第二温度可介于约30℃与约31℃之间；其中任选地，所述第一温度比所述第二温度高。

所述步骤(d)可以介于约1与5分钟之间的时间间隔进行，例如以约3分钟的时间间隔进行。

所述步骤(d)可以持续地进行。

可在步骤(c)中对进料速率作出至少一个调整。

可使用连接至测量RQ的装置的反馈控制机构来自动地进行步骤(c)。

所述酵母细胞可来自选自以下项的物种：巴斯德毕赤酵母、嗜甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母、嗜热甲醇毕赤酵母，以及酿酒酵母。

所述方法可进一步包括在培养约10至14小时时，递送乙醇至酵母细胞中，以在发酵中达到约8.0至12.0g/l乙醇的水平。

在开始所述培养之后约20-40小时时的RQ的所需预定范围可介于约1.09与约1.25之间。

可在开始所述培养之后约80-110小时时，进行收获步骤。

可在培养步骤期间测量乙醇浓度，并且可进行调整来稳定高于约5g/l且低于约25g/l的乙醇浓度，其中所述调整可通过进行调整可发酵糖进料速率至第三进料速率或调整氧输送速率至第三氧输送速率中的一项或二项来进行。举例来说，可进行所述调整来稳定高于约5g/l且低于约17g/l的乙醇浓度。

在发酵20-110小时时的RQ的所需预定范围可选自以下项：约1.08-1.1；约1.08-1.15；约1.08-1.2；约1.08-1.25；约1.08-1.3；以及约1.08-1.35。

测量步骤(b)可通过对发酵的排气取样来进行。

测量步骤(b)可使用质谱仪、红外线分析仪或顺磁分析仪来进行。

在步骤(c)中，可通过在RQ可能太高时增加氧输送速率，抑或在RQ可能太低时减低氧输送速率来调整氧输送速率。

在步骤(c)中，可通过在RQ可能太低时增加可发酵糖进料速率，抑或在RQ可能太高时减低可发酵糖进料速率来调整可发酵糖进料速率。

在步骤(c)中，还可通过在RQ可能太低时增加可发酵糖进料速率，并且在RQ可能太高时减低可发酵糖进料速率来调整可发酵糖进料速率。

步骤(c)可通过调节对培养物的搅拌速率来进行。

所述DNA区段可编码抗体重链或抗体轻链，或者抗体的片段。

可从所述培养基收获所述多肽。

各酵母细胞可包含编码抗体的重链多肽的DNA区段，以及编码抗体的轻链多肽的DNA区段。

在另一个方面，本公开提供一种在毕赤酵母细胞中产生包含二条重链和二条轻链的抗体或抗体片段的方法，其包括以下步骤：(a)在缺氧、分批补料发酵条件下在培养基中培养毕赤酵母细胞群体，其中各酵母细胞包含编码抗体的重链多肽的DNA区段，以及编码抗体的轻链多肽的DNA区段，其中所述DNA区段可操作地连接至甘油醛-3-磷酸(GAP)转录启动子和转录终止子；(b)从所述培养基收获所述酵母细胞；以及(c)从去除酵母细胞的培养基回收由所述酵母细胞产生的抗体。任选地，所述方法可包括：(a)在第一温度下培养包含一个或多个基因的真核细胞，所述一个或多个基因提供所述所需蛋白质的表达；以及(b)在第二温度下培养所述真核细胞，并且允许所述真核细胞产生所述所需蛋白质；其中所述第二温度可能与所述第一温度不同；举例来说，所述第一温度可介于约20℃与约32℃之间，介于约24℃与约31.5℃之间，介于约27℃与约31℃之间，介于约27.5℃与约30℃之间，介于约20℃与约29.5℃之间，介于约24℃与约29℃之间，介于约27℃与约28.5℃之间，或介于约27.5℃与约28.5℃之间；和/或任选地，所述第二温度可比所述第一温度高约1℃与约6℃之间，比所述第一温度高约1℃与约3℃之间，比所述第一温度高约2℃与约4℃之间，或比所述第一温度高约2℃与约3℃之间；和/或任选地，所述第二温度可介于约30℃与约34℃之间，介于约30℃与约32℃之间，或介于约30℃与约31.5℃之间；诸如，所述第一温度可为约28℃，并且所述第二温度可为约30℃或约31℃；或所述第一温度可介于约27.5℃与约28.5℃之间并且所述第二温度可介于约30℃与约31℃之间；其中任选地，所述第一温度比所述第二温度高。

毕赤酵母属酵母细胞可选自以下项：巴斯德毕赤酵母、嗜甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母，以及嗜热甲醇毕赤酵母。举例来说，所述毕赤酵母属酵母细胞可为巴斯德毕赤酵母。

在另一方面，本公开提供一种大规模发酵方法，其包括以下步骤：(i)在大规模、分批补料发酵条件下培养酵母细胞，其中可对所述已培养的酵母细胞进行工程设计以表达所需蛋白质；(ii)在分批补料发酵的期间周期性地或连续不断地监测RQ值；并且确定所述RQ值是否在指定范围内；(iii)在分批补料发酵的期间调整至少一个培养参数至少一次，以便调整或维持所述分批补料酵母培养物的RQ值，由此其可处于所述指定范围内；以及(iv)收获所述酵母细胞或所述培养基，并且从步骤(iii)所收获的细胞或培养基回收所述所需蛋白质。任选地，所述方法可包括：(a)在第一温度下培养包含一个或多个基因的真核细胞，所述一个或多个基因提供所述所需蛋白质的表达；以及(b)在第二温度下培养所述真核细胞，并且允许所述真核细胞产生所述所需蛋白质；其中所述第二温度可能与所述第一温度不同；举例来说，所述第一温度可介于约20℃与约32℃之间，介于约24℃与约31.5℃之间，介于约27℃与约31℃之间，介于约27.5℃与约30℃之间，介于约20℃与约29.5℃之间，介于约24℃与约29℃之间，介于约27℃与约28.5℃之间，或介于约27.5℃与约28.5℃之间；和/或任选地，所述第二温度可比所述第一温度高约1℃与约6℃之间，比所述第一温度高约1℃与约3℃之间，比所述第一温度高约2℃与约4℃之间，或比所述第一温度高约2℃与约3℃之间；和/或任选地，所述第二温度可介于约30℃与约34℃之间，介于约30℃与约32℃之间，或介于约30℃与约31.5℃之间；诸如，所述第一温度可为约28℃，并且所述第二温度可为约30℃或约31℃；或所述第一温度可介于约27.5℃与约28.5℃之间并且所述第二温度可介于约30℃与约31℃之间；其中任选地，所述第一温度比所述第二温度高。

所述蛋白质可为抗体蛋白质或抗体片段。

所述蛋白质(例如，抗体蛋白质或抗体片段)可由所述酵母分泌。

所调整的培养参数可包括以下中的一项或多项：(a)空气流速，b)氧浓度，(c)进料组成，(d)进料速率，(e)细胞密度，以及(f)搅拌。

所调整的培养参数可包含以下中的一项或多项：(a)进料组成，(b)进料速率以及(c)氧输送速率；并且其中在所述方法期间可调整所述培养参数至少一次，以便调整或维持所述分批补料酵母培养物的RQ值，以使其可处于所述指定范围内。

所述方法可进一步包括在分批补料发酵培养之前进行分批发酵。

所述分批补料发酵可进行至少50小时，或至少70小时。

所述酵母细胞可为巴斯德毕赤酵母，诸如多倍体、单倍体或二倍体巴斯德毕赤酵母。

所述分批补料培养的细胞密度可包含1至700g/l湿细胞重量。

在步骤(iii)中，可增加或减低进料速率，以便调整所述RQ值，使其处于所述指定范围内。

在步骤(iii)中，可通过改变至少一种可发酵糖或其它烃的量而改变进料组成，以便调整所述RQ值，使其处于所述指定范围内。

在步骤(iii)中，在分批补料发酵的期间可增加或减低分批补料发酵中氧的量，以便调整所述RQ值，使其处于所述指定范围内。

在步骤(iii)中，其中可增加或减低至少一种可发酵糖或其它可发酵烃的量，以便调整所述RQ值，使其处于所述指定范围内。

在步骤(iii)中，在分批补料发酵的期间可增加或减低进料速率，以便调整所述RQ值，使其处于所述指定范围内。

相对于不包括步骤(iii)的分批补料方法，所述方法可导致选自抗体纯度和抗体产生的性质的改进。

在步骤(iii)中，所述RQ值的指定范围可介于约1.08-1.35之间，或介于约1.08-1.2之间。

这些和其它实施方案对于本领域技术人员在阅读本说明书之后将会是显而易见的，并且向本领域提供具有改进的可靠性、可预测性、效率以及质量的方法和产物。

附图简述

图1显示3种不同的Mab1菌株A、B和C的RQ特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图2显示3种不同的Mab1菌株A、B和C的搅拌特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图3：显示3种不同的Mab1菌株A、B和C的乙醇特征图。

图4：显示3种不同的Mab1菌株A、B和C的生长特征图。

图5：显示3种不同的Mab1菌株A、B和C的全培养液滴度特征图。

图6：显示Mab1菌株A在3个不同RQ设定点RQ 1.09-1.15、1.19-1.25、1.29-1.35下的RQ特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图7：显示Mab1菌株A在3个不同RQ设定点RQ 1.09-1.15、1.19-1.25、1.29-1.35下的搅拌特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图8：显示Mab1菌株A在3个不同RQ设定点RQ 1.09-1.15、1.19-1.25、1.29-1.35下的乙醇特征图。

图9：显示Mab1菌株A在3个不同RQ设定点RQ 1.09-1.15、1.19-1.25、1.29-1.35下的生长特征图。

图10：显示Mab1菌株A在3个不同RQ设定点RQ 1.09-1.15、1.19-1.25、1.29-1.35下的全培养液滴度特征图。

图11：显示在需氧和缺氧条件下生长的Mab1菌株A的RQ特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图12：显示在需氧和缺氧条件下生长的Mab1菌株A的搅拌特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图13：显示在需氧和缺氧条件下生长的Mab1菌株A的乙醇特征图。

图14：显示在需氧和缺氧条件下生长的Mab1菌株A的生长特征图。

图15：显示在需氧和缺氧条件下生长的Mab1菌株A的％DO特征图。

图16：显示在需氧和缺氧条件下生长的Mab1菌株A的全培养液滴度特征图。

图17：显示4种不同的Mab2菌株A、B、C和D的RQ特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图18：显示4种不同的Mab2菌株A、B、C和D菌株的搅拌特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图19：显示4种不同的Mab2菌株A、B、C和D菌株的乙醇特征图。

图20：显示4种不同的Mab2菌株A、B、C和D菌株的生长特征图。

图21：显示4种不同的菌株A、B、C和D菌株的全培养液滴度特征图。

图22：显示3种不同的Mab3菌株A、B和C的RQ特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图23：显示3种不同的Mab3菌株A、B和C的搅拌特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图24：显示3种不同的Mab3菌株A、B和C的乙醇特征图。

图25：显示3种不同的Mab3菌株A、B和C的生长特征图。

图26：显示3种不同的Mab3菌株A、B和C的全培养液滴度特征图。

图27：显示Mab3菌株B在不同进料速率下的RQ特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图28：显示Mab3菌株B在不同进料速率下的搅拌特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图29：显示Mab3菌株B在不同进料速率下的乙醇特征图。

图30：显示Mab3菌株B在不同进料速率下的生长特征图。

图31：显示Mab3菌株B在不同进料速率下的全培养液滴度特征图。

图32：显示Mab4菌株A在不同进料速率下的RQ特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图33：显示Mab4菌株A在不同进料速率下的搅拌特征图。垂直线指示开始RQ控制时的时间。

图34：显示Mab4菌株A菌株在不同进料速率下的乙醇特征图。

图35：显示Mab4菌株A菌株在不同进料速率下的生长特征图。

图36：显示Mab4菌株A菌株在不同进料速率下的全培养液滴度特征图。

图37：显示Mab2菌株A在大规模发酵中在需氧(B1)和缺氧(B2)方法中的全培养液特征图。

图38：显示Mab1菌株A在需氧和缺氧方法条件下在发酵时间62、70和86小时时的SDS-PAGE非还原和还原凝胶。

图39：显示Mab1菌株A在发酵时间62、69和85小时时的SDS-PAGE非还原和还原凝胶。

图40展示培养温度变动对重组抗体产生的有益效应。在五个不同的温度变动和一个未变动的对照条件(维持为28℃)下，将全培养液(“WB”)抗体滴度(任意单位)针对整个发酵期间的时间点进行作图。变动前的温度为28℃，并且变动后的温度如图所示为25℃、29.5℃、31℃、32.5℃或34℃。向上的1.5℃与3℃之间的温度变动(最后温度分别为29.5℃和31℃)导致最终滴度增大。这些实验中产生的抗体为Ab-A。在变动至31℃的培养中，与未变动的对照培养(维持为28℃)相比，最终滴度增加了约30％。

图41A-B汇总在图40的培养温度变动下所产生的重组抗体的纯度。通过对在抗体产生终止时收获的蛋白A纯化抗体进行尺寸排阻色谱分析来评估纯度。图A显示在非还原条件下评估出的纯度。对应于全抗体(“主峰IgG”)以及二个异常的抗体复合体(“前峰HHL”和“75kD HL”)检测到峰值。所示数字为各峰中所含的总体检测蛋白质的百分比。在未变动的培养(即，维持为28℃)以及变动至29.5℃和31℃的培养的主抗体峰中含有类似比例的总蛋白质。图B显示在还原条件下检测到的纯度。显示在各个温度条件下的重链(“HC”)、轻链(“LC”)以及总体重链+轻链蛋白质(“总HC+LC”)中所含的总体检测蛋白质的百分比，加上三个其它峰(“RT 9.80”、“RT 10.16”以及“RT 10.80”)中所含的百分比。与维持为28℃的未变动的培养相比较，在变动到29.5℃的培养中重链和轻链峰中所含的蛋白质百分比保持相似，而在更高的温度变动下所述蛋白质百分比增加了约4％。

图42A-C详示在向下变动直到25℃的培养中，如图40中所示所产生的重组抗体的纯度。图A：非还原样本的尺寸排阻色谱迹线和表列结果。图B：非还原(第1道)和还原(第3道)样本的考马斯染色的凝胶电泳结果。第2道和第4道显示尺寸标记。图3：还原样本的尺寸排阻色谱迹线和表列结果。色谱结果表列且汇总于图41中。

图43A-C详示在对照培养中，在没有温度变动并且维持为28℃的情况下所产生的如图40中所示所产生的重组抗体的纯度。图A：非还原样本的尺寸排阻色谱迹线和表列结果。图B：非还原(第1道)和还原(第3道)样本的考马斯染色的凝胶电泳结果。第2道和第4道显示尺寸标记。图3：还原样本的尺寸排阻色谱迹线和表列结果。色谱结果表列且汇总于图41中。

图44A-C详示在按1.5℃向上变动至29.5℃的培养中，如图40中所示所产生的重组抗体的纯度。图A：非还原样本的尺寸排阻色谱迹线和表列结果。图B：非还原(第1道)和还原(第3道)样本的考马斯染色的凝胶电泳结果。第2道和第4道显示尺寸标记。图3：还原样本的尺寸排阻色谱迹线和表列结果。色谱结果表列且汇总于图41中。

图45A-C详示在按3℃向上变动至31℃的培养中，如图40中所示所产生的重组抗体的纯度。图A：非还原样本的尺寸排阻色谱迹线和表列结果。图B：非还原(第1道)和还原(第3道)样本的考马斯染色的凝胶电泳结果。第2道和第4道显示尺寸标记。图3：还原样本的尺寸排阻色谱迹线和表列结果。色谱结果表列且汇总于图41中。

图46A-C详示在按4.5℃向上变动至32.5℃的培养中，如图40中所示所产生的重组抗体的纯度。图A：非还原样本的尺寸排阻色谱迹线和表列结果。图B：非还原(第1道)和还原(第3道)样本的考马斯染色的凝胶电泳结果。第2道和第4道显示尺寸标记。图3：还原样本的尺寸排阻色谱迹线和表列结果。色谱结果表列且汇总于图41中。

图47A-C详示在按6℃向上变动至34℃的培养中，如图40中所示所产生的重组抗体的纯度。图A：非还原样本的尺寸排阻色谱迹线和表列结果。图B：非还原(第1道)和还原(第3道)样本的考马斯染色的凝胶电泳结果。第2道和第4道显示尺寸标记。图3：还原样本的尺寸排阻色谱迹线和表列结果。色谱结果表列且汇总于图41中。

图48A-B显示培养期间由温度变动所产生的Ab-B滴度的改进。图A：用图示出在包含Ab-B重链基因的4个拷贝以及Ab-B轻链基因的3个拷贝(“H4/L3”)的高表达菌株的培养中的全培养液抗体滴度(任意单位)与时间的关系图。有温度变动的培养(“H4/L3 30C”)展现出在所有时间点的滴度均比二个无变动的培养(“H4/L3 28C”)大。平均最终抗体滴度增加了约28％。图B：用图示出在包含Ab-B重链基因的3个拷贝以及Ab-B轻链基因的3个拷贝(“H3/L3”)的低表达菌株的培养中的全培养液抗体滴度(任意单位)与时间的关系图。有温度变动的培养(“H3/L3 30C”)展现出滴度比二个无变动的培养(“H3/L3 28C”)的平均值大。

图49汇总在如图48中所示的培养温度变动下所产生的重组抗体的纯度。通过对在抗体产生终止时收获的蛋白A纯化抗体进行尺寸排阻色谱分析来评估纯度。标签是如图41中所述。

图50显示培养期间由温度变动所产生的Ab-A滴度的改进。关于在培养期间进行温度变动的培养物或是未进行温度变动的对照培养物，将全培养液抗体滴度(任意单位)针对时间进行作图。四个培养物在开始进料添加之后从28℃变动至30℃(标示“30C”)，并且五个对照培养物在整个培养过程中未作变动且维持为28℃。有变动的培养物各自展现出比无变动的培养物更大的滴度。由温度变动所产生的平均滴度增量为约47％。

图51汇总在如图50中所示的培养温度变动下所产生的重组抗体的纯度。通过对在抗体产生终止时收获的蛋白A纯化抗体进行尺寸排阻色谱分析来评估纯度。标签是如图41中所述。

图52显示各个培养在实施例13中的温度相对于培养中的时间绘制的关系图。

发明详述

本公开描述了改进重组表达的蛋白质的产量和/或纯度的方法，所述蛋白质包括抗体和其它多亚基蛋白质。提供了在细胞培养期间进行温度变动的方法。与无变动的情况下的表达相比，以下展示出包括温度变动会改进重组表达的抗体的产量和纯度。

虽然不意在受限于理论，但假定温度变动会导致基因表达的持续性变化，这在重组蛋白质产生中带来持久的改进效应。所述改进可能由蛋白质表达、稳定性、折叠、翻译后加工以及(在抗体和其它多亚基复合体的情况下)适当的亚基组装的改进所介导，例如由于热休克蛋白表达的持续性增加所致。

优选的宿主细胞包括酵母，并且尤其优选的酵母包括甲基营养型酵母菌株，例如巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母)、季也蒙毕赤酵母、嗜甲醇毕赤酵母、因诺托毕赤酵母等等(参见例如，美国专利4,812,405、4,818,700、4,929,555、5,736,383、5,955,349、5,888,768，以及6,258,559，其各自以引用的方式整体并入本文中)。宿主细胞可通过本领域中所知的方法来产生，诸如转化、配对、孢子形成等等。

在例示性实施方案中，本公开提供减少一种或多种非所需副产物的产生的方法。相对于所需蛋白质，非所需副产物可能展现以下中的一项或多项：改变的化学计量(在多亚基复合体的情况下)、异常的糖基化、表观分子量的差异、二硫键的差异、流体动力学半径的差异、片段和/或截断。非所需副产物也可能展现一种或多种其它的差异。非所需副产物还可通过其对制备的影响，例如比活性、免疫原性的水平的改变，或其它对所需多亚基复合体的物质组成和/或功能的影响来检测。

举例来说，当所需蛋白质为抗体时，非所需副产物可包括H1L1或“半抗体”物质(即，含有一条重链与一条轻链，其中所述重链未经由二硫键连接至另一条重链)，和/或H2L1物质(即，含有两条重链与一条轻链，但缺乏第二轻链)。

在一个优选实施方案中，宿主细胞可包含编码所需蛋白质的基因或编码其亚基的基因中的一个或多个的一个以上的拷贝。举例来说，可将亚基基因的多个拷贝串联地整合至一个或多个染色体基因座中。在用于产生多亚基复合体的培养期间，串联整合的基因拷贝优选地保持稳定的拷贝数目。举例来说，以US 2013/0045888公开的共同拥有的申请描述了以下实验，其中在含有轻链与重链抗体基因的3至4个串联整合的拷贝的巴斯德毕赤酵母菌株中，基因拷贝数目大致维持稳定。

可将编码所需蛋白质的基因中的一个或多个整合至宿主细胞的一个或多个染色体基因座中。可使用任何适合的染色体基因座来进行整合，包括基因间序列、启动子序列、编码序列、终止序列、调控序列等等。可在巴斯德毕赤酵母中使用的例示性染色体基因座包括PpURA5；OCH1；AOX1；HIS4；以及GAP。还可将编码基因整合至一个或多个随机染色体基因座中，而不是被靶向。在例示性实施方案中，染色体基因座是选自pGAP基因座、3’AOX TT，以及HIS4 TT基因座。在其它例示性实施方案中，编码异源性蛋白质亚基的基因可包含在一个或多个染色体外元件中，例如在一个或多个质粒或人工染色体中。

在例示性实施方案中，所需蛋白质可为多亚基复合体，其包含二、三、四、五、六个或更多个相同或不相同的亚基。此外，各个亚基可在各个多亚基蛋白质中出现一次或多次。举例来说，所需蛋白质可包含多特异性抗体，诸如包含两条不相同的轻链与两条不相同的重链的双特异性抗体。作为另一实例，所需蛋白质可包含包含两条相同的轻链与两条相同的重链的抗体。

这些亚基可由单顺反子基因、多顺反子基因，或其任何组合来表达。各多顺反子基因可包含相同亚基的多个拷贝，或可包含各不同亚基的一个或多个拷贝。

可用于操纵巴斯德毕赤酵母的例示性方法(包括培养、转化以及配对方法)公开于以下文献中：包括以下项的公开申请：U.S.20080003643、U.S.20070298500和U.S.20060270045，以及Higgins,D.R.和Cregg,J.M.编辑.1998.PichiaProtocols.Methods in Molecular Biology.Humana Press,Totowa,N.J.，和Cregg,J.M.编辑,2007,Pichia Protocols(第2版),Methods in Molecular Biology.Humana Press,Totowa,N.J.，其各自以引用的方式整体并入本文中。

可使用的例示性表达盒是由以下所组成：甘油醛脱氢酶基因(GAP基因)启动子，与编码分泌信号的序列融合，接着是待表达的基因的序列，接着是编码来自巴斯德毕赤酵母醇氧化酶I基因(AOX1)的巴斯德毕赤酵母转录终止信号的序列。博来霉素(Zeocin)抗性标记基因可通过选择对更高水平的博来霉素具有抗性的转化体而提供富集在一菌株中含有表达载体的多重整合拷贝的菌株的方式。同样地，G418或卡那霉素(Kanamycin)抗性标记基因可通过选择对更高水平的遗传霉素(Geneticin)或卡那霉素具有抗性的转化体而用于提供富集在一菌株中含有表达载体的多重整合拷贝的菌株的方式。

可使用的宿主菌株包括营养缺陷型巴斯德毕赤酵母或其它毕赤酵母属菌株，例如具有met1、lys3、ura3以及ade1或其它营养缺陷性相关基因的突变的菌株。优选突变无法以任何明显的频率产生回复突变体(revertant)，并且优选为部分缺失型或甚至更优选为全缺失型突变体。举例来说，通过将互补的营养缺陷型菌株集合配对而产生原养型二倍体或四倍体菌株。所述菌株具有能够在基本培养基上生长的优点，并且另外，所述培养基倾向于针对可经由孢子形成而产生的单倍体细胞的生长进行选择。

可如Pichia Protocols(1998,2007),同上文中所述，进行单倍体和二倍体巴斯德毕赤酵母菌株的转化以及巴斯德毕赤酵母生殖周期的基因操纵。

在转化之前，可在与靶基因座(例如，GAP启动子序列)同源的区域内通过限制酶裂解而使各表达载体线性化，以引导载体整合至宿主细胞中的靶基因座中。然后可通过电穿孔或其它方法，将各载体样本单独转化至所需菌株的培养物中，并且可借助于可选标记，例如抗生素抗性，或营养缺陷型的互补，来选择成功的转化体。可在选择性条件下挑取分离株，划线接种成单一菌落，然后通过对从各菌株提取的基因组DNA进行南方墨点分析或PCR分析来检验，以确认编码所需蛋白质或多亚基复合体(例如所需抗体)的亚基的基因的拷贝数目。任选地，可例如通过FACS、西方印迹法、菌落转移法和免疫印迹法，以及本领域中所知的其它方式来确认所预期的亚基基因产物的表达。任选地，对分离株进行额外多次的转化，以引入额外的异源基因，例如编码所需蛋白质的基因的额外拷贝，或在多亚基蛋白质的情况下，编码相同亚基的基因可整合至不同基因座处，和/或可整合不同亚基的多个拷贝。可产生单倍体、二倍体或其它倍体(包括四倍体和更高倍体)的菌株。可产生单倍体菌株并且进行配对，以便快速测试基因拷贝数目的不同组合，例如编码所需蛋白质的单一基因的拷贝数目，或编码多亚基蛋白质的亚基的不同基因的拷贝数目。可通过南方印迹法、PCR以及本领域中所知的其它检测方式来确认所需蛋白质基因或所预期的各亚基基因的存在。此外，抗体或其它所需蛋白质的表达也可通过菌落转移法/免疫印迹法(Wung等人，Biotechniques 21 808-812(1996))和/或通过FACS来确认。

任选地，重复进行转化，以使异源基因靶向第二基因座中，所述异源基因可为与靶向第一基因座中的基因相同或不同的基因。当待整合至第二基因座中的构建体编码与由第一基因座所编码的序列相同或高度相似的蛋白质时，可改变其序列，以降低不合需要地整合至第一基因座中的可能性。此类基因差异还可通过降低后续重组事件的可能性而促进遗传稳定性。举例来说，相对于整合至第一基因座中的序列而言，待整合至第二基因座中的序列可能在启动子序列、终止序列、密码子使用方面有所差异，和/或具有其它可容许的序列差异。

为使巴斯德毕赤酵母单倍体菌株配对，可使待杂交的各菌株在配对板上片状接种在一起。举例来说，可通过将待配对的各菌株划线接种在适合其生长的整个板上，而便利地同时进行多重配对，并且可将配对伙伴划线接种在第二板(所述板优选为丰富培养基，诸如YPD)上。通常，在30℃下孵育一天或两天后，可将来自两块板的细胞以十字形方式复制接种于配对板上，产生交叉阴影图案，而各对菌株被共同接种且有机会在一对原始划线的交叉点配对。然后可对配对板进行孵育(例如，在30℃下)，以刺激引发菌株之间的配对。在约两天后，可将配对板上的细胞划线接种、片状接种或复制接种至对所需二倍体菌株具有选择性的培养基上(例如，当所配对的菌株具有互补自养作用时，可使用省却(drop-out)或基本培养基板)。可对这些板进行孵育(例如在30℃下)持续一段适合时间(例如约三天)，以容许所需二倍体菌株的选择性生长。可挑取所产生的菌落并且划线接种成单一菌落，以分离且纯化各二倍体菌株。

用于本发明方法中的表达载体可进一步包括酵母特异性序列，包括用于鉴定转化酵母菌株的可选营养缺陷型或药物标记。药物标记可进一步用于扩增酵母宿主细胞中载体的拷贝数目，例如通过在浓度升高的药物中培养一群细胞，从而选择出表达较高水平的抗性基因的转化体来实现。

在一个例示性实施方案中，编码异源性蛋白质亚基的基因中的一个或多个与可诱导型启动子偶联。适合的例示性启动子包括醇氧化酶1基因启动子、甲醛脱氢酶基因(FLD；参见美国公开案号2007/0298500)以及本领域中所知的其它可诱导型启动子。酵母在最常见的碳源，诸如葡萄糖、甘油或乙醇上生长期间，醇氧化酶1基因启动子受到严密阻抑，但是在甲醇上生长期间则被高度诱导(Tschopp等人，1987；颁予Stroman,D.W.等人的美国专利号4,855,231)。为了产生外来蛋白质，菌株最初可在阻抑性碳源上生长，以产生生物质，然后转换使用甲醇作为唯一(或主要)的碳源和能源，以诱导外来基因的表达。这种调控系统的一个优点在于以外来基因转化的巴斯德毕赤酵母菌株可通过在阻抑性条件下生长而获得维持，其中所述外来基因的表达产物对细胞具有毒性。

在另一例示性实施方案中，异源基因中的一个或多个可与受调控启动子偶联，所述受调控启动子的表达水平可在适当条件下被上调。例示性受调控启动子包括CUP1启动子(由培养基中的铜水平所诱导)、四环素可诱导型启动子、硫胺素可诱导型启动子、AOX1启动子以及FLD1启动子。

在另一方面，本公开提供一种在酵母中制造所需蛋白质的方法，其可采用特定类型的反馈控制机构来增加发酵的生产力。所述反馈控制机构允许稳健又精确地控制混合型需氧性和发酵性代谢，其刺激所需蛋白质的最佳产生。这能带来良好的效应以在酵母中，特别是在巴斯德毕赤酵母中，并且更特别地使用甘油醛-3-磷酸(GAP)启动子来产生重组蛋白质，例如单克隆抗体。

所述使用反馈控制机构的方法可适用于产生全长、正确组装的重组单克隆抗体，以及抗体片段和其它重组蛋白质，即不是甘油醛-3-磷酸。我们采用的控制机构易于机械化并且致使自动化，从而消除许多监测和调整发酵条件的劳力。所述方法可适用于产生各种抗体和其它所需蛋白质，并且可容易扩充以适应商业化，例如大规模的生产需求。

所述产生方法可使用呼吸商(RQ)作为反馈控制变量。可使用RQ来平衡质量转移参数和/或可发酵糖进料速率，以便维持培养物中的缺氧状态，同时防止发酵性代谢的副产物乙醇的毒性累积。RQ是定义为培养物中产生的二氧化碳摩尔比率除以消耗的氧的摩尔比率。它可通过分析来自发酵罐的排气中二氧化碳和氧的含量来测量。可在整个所需生长阶段使用可容易获得的方式连续地或间歇地测量此代谢参数。适当的测量时间间隔的实例为每小时、每半小时、每四分之一小时、十分钟、五分钟、四分钟、三分钟、二分钟、一分钟。从开始培养一直到收获，测量期间的时间周期可随着生长条件而变化。例示性的测量和控制周期在发酵罐中开始培养之后介于20与40小时之间，介于10与60小时之间，介于5与70小时之间，以及介于20与110小时之间。

当酵母细胞在完全厌氧的状态下，在不存在氧的情况下生长时，据说其使用发酵性代谢来产生其生长所需要的能量。在此情况下，下列有关将葡萄糖转化成乙醇的化学计量方程式适用：

C₆H₁₂O₆→2C₂H₅OH+2CO₂+H₂O+能量

当酵母细胞仅仅从葡萄糖需氧性代谢来获得其能量时，则会消耗氧，且只产生二氧化碳和水：

C₆H₁₂O₆+3O₂→3CO₂+6H₂O+能量

在存在氧的情况下，酵母细胞使用需氧性代谢，需氧性代谢更有效率，即，1摩尔的葡萄糖在需氧性代谢下比在发酵性代谢下获得更多能量。

只从葡萄糖产生乙醇的培养物的RQ接近无限大(因为没有消耗氧，因此RQ的分母为零)，而就葡萄糖的完全需氧性代谢来说，RQ的值接近1.0(消耗3摩尔的氧来产生3摩尔的二氧化碳)。因而，高于1的值指示出混合型代谢条件，其中需氧性代谢和发酵性代谢二者均同时发生。通常，可使用RQ作为反馈控制变量来调整氧输送速率和/或可发酵糖进料速率以完成此种混合型代谢。使用此种混合型代谢，可维持缺氧条件。当存在有通过平衡氧输送速率和可发酵糖进料速率所控制的低水平的发酵性代谢时，会存在缺氧状态。缺氧条件可依据RQ高于1.0且溶氧低于约5％来确定。

可在来自发酵罐的排气流中测量RQ。可使用任何已知且适合用于确定消耗的氧和产生的二氧化碳的摩尔浓度的方法。可使用的例示性技术为质谱术、红外线光谱术以及顺磁分析。

缺氧性生长对于在毕赤酵母中产生全长、正确组装的蛋白质，例如抗体，具有有益效应。吾人尝试仅仅通过降低发酵期间的搅拌器速度来降低溶氧浓度。然而，不可能以此方式获得可靠的控制，因为搅拌速率或可发酵糖进料速率的微小差异会快速导致乙醇毒性水平的累积。

反馈控制机构还可经由调节可发酵糖进料速率和/或氧输送速率，例如通过搅拌器速度，来用于测量和控制乙醇水平。控制乙醇的累积应该允许更稳定的方法。为了监测乙醇水平，可使用插入至发酵罐中的探针。所述探针可连续地监测发酵培养液中的乙醇水平。然而，在优良制造方法下，在商业化分子制造中使用此类探针是不可行的，因为无法得到能被充分校正的输出。

当RQ被维持在大约1.1至大约2的狭小范围内时，乙醇的累积稳定在无毒性的水平。优选地，乙醇浓度被维持在约5g/l与17g/l之间。此外，这些同样的条件会刺激GAP启动子，导致产生超过需氧性发酵条件的显著增加的所需蛋白质，例如抗体。可合乎需要的RQ范围包括约1.08-2.0；约1.08-1.85；约1.08-1.65；约1.08-1.45；约1.08-1.35；约1.08-1.25；约1.08-1.2；以及约1.08-1.15。除了葡萄糖以外的替代性碳源能实现小于1的RQ。此类碳源包括醋酸盐和甘油。其它合适的RQ范围包括1.08至1.35，以及1.15至1.25。可在发酵的任何所需部分期间监测和控制RQ，举例来说，从0至110小时，从20-40小时，从20-70小时，从20-90小时，从20-110小时，或任何其它所需时间周期。

因此，可通过添加各种碳源、通过添加各种量的碳源，以及通过操控氧水平而随着时间操控和改变RQ。在一个实施方案中，通过增加或减少搅拌而操控氧水平。在另一个实施方案中，控制气体进料中氧与氮气的比率。可调整氧输送速率的方式包括改变空气流速、氧浓度、细胞密度、温度，以及搅拌。在另一个实施方案中，调节葡萄糖或其它可发酵糖进料来影响RQ。可用于进料中的其它可发酵糖包括但不限于果糖、蔗糖、麦芽糖，以及麦芽三糖。可调节进料速率或组成来影响RQ。RQ的控制可为手动或自动的。

编码蛋白质的核酸，例如，编码抗体，可位于重组构建体的单个或多个连续或不连续的区段上。抗体可为任何类型的片段或构建体或全长。这些可为例如Fab、F(ab’)₂、Fc，以及ScFv。在一些实施方案中，链或链的片段会在体内适当地组装。若未适当地组装，则可能需要体外组装。可能希望制造的其它蛋白质为具有一个或多个亚基的那些蛋白质，而不管是异聚型或是同聚型。通常，所述蛋白质将适用于诊断或治疗目的。所述蛋白质可为生长因子、细胞激素、凝血因子、治疗性毒素、可用于重建的结构蛋白质、酶等等。

诸如抗体的蛋白质可通过本领域中所知的任何技术从去除细胞的培养基或从细胞加以回收。通常会使用结合步骤来减小制备物的体积。当方便时，结合可于滤器或管柱或其它支撑体上进行。在一些实施方案中，可使用蛋白A作为抗体捕捉剂。蛋白A可与聚合基体结合。

可使用任何类型的酵母细胞，包括酵母属(Saccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)以及毕赤酵母属物种。可使用的例示性但非限制性的物种为巴斯德毕赤酵母、嗜甲醇毕赤酵母、安格斯毕赤酵母、嗜热甲醇毕赤酵母、多形汉逊酵母，以及酿酒酵母。酵母细胞可为单倍体或二倍体。

可以同样地使用如同GAP的其它启动子。这些通常为在诸如毕赤酵母的酵母细胞中，在缺氧、葡萄糖限制性生长中得到上调的基因的启动子。可使用的此类启动子包括(但不限于)以下基因的启动子：YHR140W、YNL040W、NTA1、SGT1、URK1、PGI1、YHR112C、CPS1、PET18、TPA1、PFK1、SCS7、YIL166C、PFK2、HSP12、ERO1、ERG11、ENO1、SSP120、BNA1、DUG3、CYS4、YEL047C、CDC19、BNA2、TDH3、ERG28、TSA1、LCB5、PLB3、MUP3、ERV14、PDX3、NCP1、TPO4、CUS1、COX15、YBR096W、DOG1、YDL124W、YMR244W、YNL134C、YEL023C、PIC2、GLK1、ALD5、YPR098C、ERG1、HEM13、YNL200C、DBP3、HAC1、UGA2、PGK1、YBR056W、GEF1、MTD1、PDR16、HXT6、AQR1、YPL225W、CYS3、GPM1、THI11、UBA4、EXG1、DGK1、HEM14、SCO1、MAK3、ZRT1、YPL260W、RSB1、AIM19、YET3、YCR061W、EHT1、BAT1、YLR126C、MAE1、PGC1、YHL008C、NCE103、MIH1、ROD1、FBA1、SSA4、PIL1、PDC1-3、THI3、SAM2、EFT2，以及INO1。

大规模发酵方法为通常在商业化方法中用来产生有用产物的那些方法。通常，这些方法的体积大于100升。分批补料发酵为在发酵期间添加营养素以影响细胞密度与产物累积的一种方法。

先前公布的专利申请以及专利U.S.7927863、U.S.8268582、U.S.App 2012/0277408的公开内容明确地并入本文中。

虽然本公开的大部分描述了抗体的产生，但是本文中所述的方法可容易适用于其它所需蛋白质，包括单亚基和多亚基蛋白质。此外，本发明的方法不限于产生多蛋白复合体，而是还可容易适用于核糖核蛋白(RNP)复合体，包括端粒酶、hnRNP、核糖体、snRNP、信号识别粒子、原核与真核生物RNase P复合体，以及含有多个不同的蛋白和/或RNA亚基的任何其它复合体。表达多亚基复合体的宿主细胞可通过本领域中所知的方法来产生。举例来说，含有不同的基因拷贝数目组合的一组二倍体或四倍体酵母细胞可通过使含有个别亚基基因的不同拷贝数目(优选在配对之前得知拷贝数目)的细胞配对而产生。

定义

应了解，本发明不限于所描述的特定方法学、方案、细胞系、动物种类或属，以及试剂，因为这些可以变化。还应了解，本文中所使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而并非意在限制本发明范畴，本发明范畴仅受所附权利要求的限制。

除非上下文另外明确规定，否则如本文中所使用的单数形式“一”、“和”，以及“所述”包括复数所指物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞并且提及“所述蛋白质”包括提及一个或多个蛋白质和本领域技术人员所知的其等效物，等等。除非另有明确规定，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。

团注添加(Bolus addition)：在本公开中，“团注添加”一般是指快速改变与培养细胞接触(例如，在培养基中)的物质(诸如乙醇)的浓度。例如，可向培养细胞中单次添加、一连串一次以上添加，和/或在一段时间内(如在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、90或120分钟内)输注所述物质。还可通过部分或完全更换培养基而添加所述物质，例如通过将细胞浓缩(使用离心、过滤、沉降或其它方法)，移除部分或所有培养基并且添加所述物质，或是通过向含有所述物质的培养基中添加细胞来实现。所述物质可与载体(例如，培养基、水、盐水等等)掺混。例如，乙醇的团注添加可包括向培养基中添加纯或浓乙醇(例如，100％、95％、70％、50％、60％、40％、30％、20％等等)，所添加的乙醇量足以产生所需浓度。作为另一实例，可将细胞添加至含有乙醇的培养基中，例如通过将含有细胞的接种物添加至含有乙醇的培养基中来实现。

团注浓度：在本公开中，“团注浓度”一般是指由团注添加一种物质(例如乙醇)所产生的浓度。

能配对的酵母物种：在本发明中，这意在广泛地涵盖可在培养物中生长的任何二倍体或四倍体酵母。此类酵母物种可以单倍体、二倍体或其它多倍体形式存在。给定倍数性的细胞可在适当条件下，以那种形式增殖无限代。二倍体细胞也能形成孢子以形成单倍体细胞。相继配对能经由二倍体菌株进一步的配对或融合而产生四倍体菌株。本发明涵盖单倍体酵母以及例如通过配对或融合(如原生质球融合)所产生的二倍体或其它多倍体酵母细胞的用途。

在本发明的一个实施方案中，能配对的酵母是酵母(Saccharomycetaceae)科的一员，其包括：阿斯霉属(Arxiozyma)；类盘酵母属(Ascobotryozyma)；固囊酵母属(Citeromyces)；德巴利酵母属(Debaryomyces)；德克酵母属(Dekkera)；假囊酵母属(Eremothecium)；伊萨酵母属(Issatchenkia)；哈萨克酵母属(Kazachstania)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)；柯达菌属(Kodamaea)；路德酵母属(Lodderomyces)；管囊酵母属(Pachysolen)；毕赤酵母属(Pichia)；酵母属(Saccharomyces)；子囊酵母属(Saturnispora)；四盾酵母属(Tetrapisispora)；有孢圆酵母属(Torulaspora)；拟威尔酵母属(Williopsis)；以及接合酵母属(Zygosaccharomyces)。在本发明中可能有用的其它类的酵母包括：耶氏酵母属(Yarrowia)；红冬孢酵母属(Rhodosporidium)；念珠菌属(Candida)；汉逊酵母属(Hansenula)；线黑粉菌属(Filobasium)；锁掷酵母属(Sporidiobolus)；布勒掷孢酵母属(Bullera)；白冬孢酵母属(Leucosporidium)以及线担菌属(Filobasidella)。

在本发明的一个优选实施方案中，能配对的酵母是毕赤酵母属的一员或是另一种甲基营养菌。在本发明的另一优选实施方案中，毕赤酵母属的能配对的酵母为下列物种之一：巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母，以及多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母)。在本发明的一个尤其优选的实施方案中，毕赤酵母属的能配对的酵母为巴斯德毕赤酵母种。

单倍体酵母细胞：在其正常基因组(染色体组)中每个基因具有单个拷贝的细胞。

多倍体酵母细胞：具有其正常基因组(染色体组)的一个以上拷贝的细胞。

二倍体酵母细胞：在其正常基因组中基本上每个基因都有两个拷贝(等位基因)的细胞，通常通过两个单倍体细胞的融合(配对)过程形成。

四倍体酵母细胞：在其正常基因组中基本上每种基因都有四个拷贝(等位基因)的细胞，通常通过两个二倍体细胞的融合(配对)过程形成。四倍体可以携带2、3、4或更多个不同的表达盒。可在酿酒酵母中通过对纯合异宗配合的a/a与α/α二倍体进行选择性配对并且在毕赤氏酵母中通过对单倍体进行相继配对来获得营养缺陷型二倍体，从而获得此类四倍体。例如，一个[met his]单倍体可与[ade his]单倍体配对，以获得二倍体[his]；并且一个[met arg]单倍体可与[ade arg]单倍体配对，以获得二倍体[arg]；接着，所述二倍体[his]可与所述二倍体[arg]配对，以获得一个四倍体原养型。本领域技术人员应了解，提及二倍体细胞的益处和用途也可适用于四倍体细胞。

酵母配对：两个酵母细胞融合形成单个酵母细胞的过程。融合细胞可为单倍体细胞或更高倍体的细胞(例如，使两个二倍体细胞配对而产生一个四倍体细胞)。

减数分裂：二倍体酵母细胞进行减数分裂形成四个单倍体孢子产物的过程。各孢子接着可发芽并形成单倍体无性生长细胞系。

可选标记：可选标记是基因或基因片段，其赋予接受该基因(例如通过转化事件)的细胞生长表型(物理生长特征)。可选标记允许该细胞在未接受该可选标记基因的细胞不能生长的条件下，在选择性生长培养基中存活并生长。可选标记基因通常分成几类，包括：正可选标记基因，诸如赋予细胞对抗生素或其它药物、在将两个温度敏感性(“ts”)突变体杂交或转化ts突变体时的温度的抗性的基因；负可选标记基因，诸如生物合成基因，其赋予细胞在不含为不具有该生物合成基因的所有细胞所需的特殊营养素的培养基中生长的能力，或诱变生物合成基因，其使细胞不能通过不具有野生型基因的细胞生长；等等。适合的标记包括但不限于ZEO、NEO(G418)、LYS3、MET1、MET3a、ADE1、ADE3、URA3等。

整合：遗传元件(通常为异源遗传元件)共价连接到生物体的染色体中。

串联整合：遗传元件的两个或更多个拷贝整合到染色体中的相邻位置。所述两个或更多个拷贝不一定有取向；例如，对于转录基因而言，一些拷贝可从沃森链(Watsonstrand)转录，而其它拷贝可从克里克链(Crick strand)转录。

宿主细胞：在本公开的上下文中，术语宿主细胞是指含有异源基因的细胞(例如，真核细胞，诸如毕赤酵母细胞)。例如，异源基因可提供所需多亚基复合体的亚基的表达，是与蛋白质折叠(例如，伴侣蛋白)、表达或分泌有关的基因和/或另一所需基因。异源基因可整合到真核细胞的基因组中，或含在染色体外元件，例如质粒或人工染色体中。

呼吸商(RQ)是定义为所产生的CO₂摩尔数除以所消耗的O₂的摩尔数。就碳水化合物的完全氧化而言，RQ值为1.0。发酵是依据RQ值大于1，并且没有使用O₂或O₂使用率很低(例如，在无分子氧存在下的代谢中)来指示。RQ可能达到非常大或理论上无限大的值。

表达载体：这些DNA载体含有有助于操纵外来蛋白质在靶宿主细胞内的表达的元件。方便地，首先在细菌宿主，例如大肠杆菌(E.coli)中进行对序列的操纵和用于转化的DNA的生成，并且载体通常将包括有助于此类操纵的序列，包括细菌复制起点和适当的细菌可选标记。选择标记编码为在选择性培养基中生长的转化宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用含选择基因的载体转化的宿主细胞在培养基中将不能存活。通常的选择基因编码如下性质的蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，(b)补充营养缺陷型不足，或(c)供给不能由复合培养基获得的重要营养素。用于酵母转化的例示性载体和方法描述于例如以下文献中：Burke,D.,Dawson,D.,& Stearns,T.(2000).Methods in yeastgenetics:a Cold Spring Harbor Laboratory course manual.Plainview,N.Y.:ColdSpring Harbor Laboratory Press中，其以引用的方式整体并入本文中。

用于本发明方法中的表达载体还可包括酵母特异性序列，包括用于鉴定转化酵母菌株的可选营养缺陷型或药物标记。药物标记还可用于选择扩增酵母宿主细胞中的载体拷贝数。

目标多肽编码序列通常与提供多肽在酵母细胞中的表达的转录和翻译调控序列可操作地连接。这些载体组分可包括但不限于下列一项或多项:增强子元件、启动子和转录终止序列。还可包括用于分泌多肽的序列，例如信号序列等。因为表达载体常常整合到酵母基因组中，所以酵母复制起点可任选。

虽然可任选，但是在本发明的一个实施方案中，所需蛋白质或所需多亚基复合体的亚基与提供所表达的多肽在培养基中的分泌的分泌序列可操作地连接或融合，这可有助于收获和纯化所需蛋白质或复合体。甚至更优选地，分泌序列提供多肽从宿主细胞(例如，酵母二倍体细胞)的最优化分泌，诸如通过选择优选密码子和/或通过密码子选择改变AT百分比来实现。在本领域中已知，分泌效率和/或稳定性可受分泌序列的选择影响并且最优分泌序列在不同蛋白质之间可以不同(参见，例如，Koganesawa等人，Protein Eng.2001年9月；14(9):705-10，其以引用的方式整体并入本文中)。在本领域中已知许多可能适合的分泌信号并且可容易地测试其对特定所需蛋白质或复合体产量和/或纯度的影响。任何分泌序列均可能使用，包括酵母和其它物种的分泌蛋白中存在的那些分泌序列以及工程化分泌序列。可利用的例示性分泌信号序列包括：鸡溶菌酶(CLY)信号肽(MRSLLILVLCFLPLAALG(SEQ ID NO:5))、CLY-L8(MRLLLLLLLLPLAALG(SEQ ID NO:6))、酿酒酵母转化酶(SUC2)信号肽(MLLQAFLFLLAGFAAKISA(SEQ ID NO:7))、MF-α(Prepro)(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR(SEQ ID NO:8))、MF-α(Pre)-apv(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APV(SEQ IDNO:9))、MF-α(Pre)-apv-SLEKR(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVSLEKR(SEQ ID NO:10))、MF-α(Prepro)-(EA)3(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR-EAEAEA(SEQ ID NO:11))、αF信号肽(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-DETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKE-EGVSLEKR(SEQ ID NO:12))、KILM1信号肽(MTKPTQVLVRSVSILFFITLLHLVVALNDVAGPAETAPVSLLPR(SEQ ID NO:13))、可阻抑型酸性磷酸酯酶(PHO1)信号肽(MFSPILSLEIILALATLQSVFA(SEQ ID NO:14))、黑曲霉(A.niger)GOX信号肽(MQTLLVSSLVVSLAAALPHYIR(SEQ ID NO:15))、西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)葡萄糖淀粉酶基因(GAM1)信号肽(MIFLKLIKSIVIGLGLVSAIQA(SEQ ID NO:16))、具有前序列(pro-sequence)的人血清白蛋白(HSA)信号肽(MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR(SEQ ID NO:17))、不具有前序列的人血清白蛋白(HSA)信号肽(MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ ID NO:18))、ISN信号肽(MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA(SEQID NO:19))、IFN信号肽(MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCDLP(SEQ ID NO:20))、HGH信号肽(MAADSQTPWLLTFSLLCLLWPQEPGA(SEQ ID NO:21))、植物血球凝集素(phytohaemagglutinin)(PHA)(MKKNRMMMMIWSVGVVWMLLLVGGSYG(SEQ ID NO:22))、蚕溶菌酶(MQKLIIFALVVLCVGSEA(SEQ ID NO:23))、人溶菌酶(LYZ1)(MKALIVLGLVLLSVTVQG(SEQ ID NO:24))、活化素(activin)I型受体(MVDGVM ILPVLIMIALPSPS(SEQ ID NO:25))、活化素II型受体(MGAAAKLAFAVFLISCSSG(SEQ ID NO:26))、巴斯德毕赤酵母免疫球蛋白结合蛋白(PpBiP)(MLSLKPSWLTLAALMYAMLLVVVPFAKPVRA(SEQ ID NO:27))，以及人抗体3D6轻链前导序列(MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC(SEQ ID NO:28))。参见Hashimoto等人，Protein Engineering第11卷2号，第75-77页，1998年；Oka等人，Biosci Biotechnol Bio chem.1999年11月；63(11):1977-83；Gellissen等人，FEMS Yeast Research 5(2005)1079-1096；Ma等人，Hepatology.2005年12月；42(6):1355-63；Raemaekers等人，Eur J Biochem.1999年10月1日；265(1):394-403；Koganesawa等人，Protein Eng.(2001)14(9):705-710；Daly等人，Protein Expr Purif.2006年4月；46(2):456-67；Damasceno等人，Appl MicrobiolBiotechnol(2007)74:381-389；以及Felgenhauer等人，Nucleic Acids Res.1990年8月25日；18(16):4927，其中各自以引用的方式整体并入本文中)。

所需蛋白质或复合体还可被分泌至培养基中，而不与分泌信号可操作地连接或融合。例如，已经证明，当在巴斯德毕赤酵母中表达时，即使不与分泌信号连接或融合，一些异源多肽也被分泌到培养基中。另外，可使用本领域已知的方法从宿主细胞中纯化出所需蛋白质或多亚基复合体(例如，如果复合体被分泌不足，则这可为可优选的)。

可从培养物中回收包含所需蛋白质或多亚基复合体的培养基或细胞。任选地，所分泌的蛋白质可被纯化。例如，可使用机械、化学、酶和/或渗透方法(例如，用液氮冷冻、使用均化器、原生质球化、超声处理、在玻璃珠的存在下搅拌、使用洗涤剂等)溶解包含所需蛋白质或多亚基复合体的细胞。可使用本领域已知的方法对所需蛋白质或多亚基复合体进行浓缩、过滤、透析等操作。所需蛋白质或多亚基复合体可基于例如其分子质量(例如，尺寸排阻色谱法)、等电点(例如，等电聚焦)、电泳迁移率(例如，凝胶电泳)、疏水作用色谱(例如，HPLC)、电荷(例如，离子交换色谱法)、亲和力(例如，在抗体的情况下，与蛋白A、蛋白G和/或所需抗体结合的表位的结合)和/或糖基化状态(例如，通过凝集素结合亲和力检测)来纯化。可进行多个纯化步骤以获得所需水平的纯度。在一个例示性实施方案中，所需蛋白质或多亚基复合体可包含免疫球蛋白恒定结构域并且可使用蛋白A或蛋白G亲和力、尺寸排阻色谱法，并且没有与凝集素结合(以去除糖基化形式)而加以纯化。任选地，可添加A蛋白酶抑制剂，诸如苯基甲基磺酰氟来抑制纯化期间的蛋白水解降解。

当核酸与另一个核酸序列处于功能关系时，则该核酸被“可操作地连接”。例如，如果信号序列的DNA被表达成参与多肽分泌的前蛋白，则它与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指相连DNA序列邻近，并且在分泌前导序列的情况下邻近且位于阅读框中。然而，增强子不一定邻近。相连可通过便利限制性位点处的连接或经由本领域技术人员熟悉的PCR/重组法实现(

Technology；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)。如果不存在此类位点，则依照常规作法可使用合成的寡核苷酸适配子或连接子。所需核酸(包括含可操作连接的序列的核酸)也可通过化学合成生成。

启动子是位于结构基因的起始密码子上游(5')(通常在约100-1000bp内)的非翻译序列，它控制与之可操作地连接的特定核酸序列的转录和翻译。此类启动子分为几类：诱导型、组成型和阻抑型启动子(其响应于阻抑物的缺乏而提高转录水平)。诱导型启动子可响应于培养条件的某些变化(例如营养素的存在或缺乏或温度的变化)而提高受它控制的DNA的转录水平。

酵母启动子片段也可用作将表达载体同源重组和整合到酵母基因组中相同位点的位点；可选地，使用可选标记作为同源重组的位点。在Cregg等人，(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376-3385中描述了毕赤酵母转化，所述文献以引用的方式整体并入本文中。

来自毕赤酵母的适合启动子的实例包括CUP1(受培养基中的铜水平所诱导)、四环素可诱导型启动子、硫胺素可诱导型启动子、AOX1启动子(Cregg等人(1989)Mol.Cell.Biol.9:1316-1323)；ICL1启动子(Menendez等人(2003)Yeast 20(13):1097-108)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAP)(Waterham等人(1997)Gene 186(1):37-44)；以及FLD1启动子(Shen等人(1998)Gene 216(1):93-102)。GAP启动子为强力组成型启动子，而CUP1、AOX和FLD1启动子为可诱导型启动子。前述各参考文献以引用的方式整体并入本文中。

其它酵母启动子包括：ADH1、醇脱氢酶II、GAL4、PHO3、PHO5、Pyk，以及由其衍生的嵌合启动子。另外，可在本发明中使用非酵母启动子，诸如哺乳动物、昆虫、植物、爬行动物、两栖动物、病毒和禽类启动子。最通常，启动子将包括哺乳动物启动子(对表达基因可能为内源性)或将包括提供酵母系统中的有效转录的酵母或病毒启动子。

不但可直接重组生成目标多肽，而且可作为与异源多肽(例如信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N端具有特异性裂解位点的其它多肽)的融合多肽。一般而言，信号序列可为载体的组分，或者它可为插入载体中的多肽编码序列的一部分。优先选择的异源信号序列是经由宿主细胞内可用的标准路径之一来识别和加工的信号序列。酿酒酵母α因子前原信号(pre-pro signal)已经证明在多种重组蛋白质从巴斯德毕赤酵母分泌的过程中有效。其它酵母信号序列包括α配对因子信号序列、转化酶信号序列和源自其它分泌的酵母多肽的信号序列。另外，这些信号肽序列可经工程化以在二倍体酵母表达系统中提供增强的分泌。其它目标分泌信号还包括哺乳动物信号序列，其可能对于所分泌的蛋白质异源，或者可能对于所分泌的蛋白质而言是天然序列。信号序列包括前肽(pre-peptide)序列，而且在有些情况下可包括原肽(propeptide)序列。本领域已知许多此类信号序列，包括在免疫球蛋白链上发现的信号序列，例如K28前毒素原(preprotoxin)序列、PHA-E、FACE、人MCP-1、人血清白蛋白信号序列、人Ig重链、人Ig轻链等等。例如,参见Hashimoto等人,Protein Eng 11(2)75(1998)；和Kobayashi等人,Therapeutic Apheresis 2(4)257(1998)，其各自以引用的方式整体并入本文中。

可通过在载体中插入转录激活子序列来提高转录。这些激活子是DNA的顺式作用元件，通常为约10至300bp，其作用于启动子以提高其转录。转录增强子相对不依赖于取向和位置，已经发现位于转录单位的5'端和3'端，内含子内以及编码序列本身中。可将增强子剪接到表达载体中，位于编码序列的5'位或3'位,但是优选位于启动子的5'位点。

用于真核宿主细胞中的表达载体还可含有为终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以由真核或病毒DNA或cDNA非翻译区中的翻译终止密码子的3'端获得。这些区域含有转录成mRNA非翻译部分中的多聚腺苷酸片段的核苷酸区段。

含一种或多种以上所列组分的适合载体的构建采用标准连接技术或PCR/重组方法。以期望的形式将分离的质粒或DNA片段裂解，剪裁并重新连接或者通过重组方法生成所需质粒。为了分析确认所构建质粒中的正确序列，使用连接混合物来转化宿主细胞，并且在适当的情况下通过抗生素抗性(例如氨苄青霉素或博来霉素)选择成功的转化体。由转化体制备质粒，通过限制性核酸内切酶消化进行分析和/或加以测序。

作为限制和连接片段的替代方法，可使用基于att位点和重组酶的重组方法将DNA序列插入载体中。例如，Landy(1989)Ann.Rev.Biochem.58:913-949描述了此类方法；并且为本领域技术人员所知。此类方法利用由λ噬菌体和大肠杆菌编码的重组蛋白的混合物介导的分子间DNA重组。重组发生在相互作用的DNA分子上的特异性附着(att)位点之间。关于att位点的描述，参见Weisberg和Landy(1983)Site-Specific Recombination in PhageLambda,于Lanbda II,Weisberg编辑(Cod Spring Hatbor，N.Y.:CoId Spring HarborPress)，第211-250页。转换侧接重组位点的DNA区段，以致重组后，att位点是由每种亲本载体提供的序列构成的杂交序列。重组可发生在具有任何拓扑结构的DNA之间。前述各参考文献以引用的方式整体并入本文中。

可通过将目标序列连接到适当载体中；经由使用特异性引物生成含att B位点的PCR产物；生成克隆到含有att位点的适当载体中的cDNA文库等等将att位点引入目标序列中。

单顺反子(Monocistronic)与多顺反子(polycistronic)基因。单顺反子基因编码含仅翻译一种蛋白质的遗传信息的RNA。多顺反子基因编码含翻译一种以上蛋白质的遗传信息的mRNA。多顺反子基因中编码的蛋白质可具有相同或不同序列或其组合。双顺反子或二顺反子指编码两种蛋白质的多顺反子基因。多顺反子基因任选包括一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)元件以有助于非帽子依赖性翻译开始，所述元件可位于可以独立于与mRNA分子5'末端结合的5'-帽子结构驱动下游蛋白质编码区域翻译的位置。可使用任何已知的IRES序列(例如，病毒、真核或人工来源)。例如，如Thompson等人(2001年)PNAS 98:12972-12977中所述，可使用基因间区域(IGR)中的蟋蟀麻痹病毒IRES序列。任选地，IRES功能可通过遗传改变加强，例如通过引起eIF2激酶GCN2的组成型表达或破坏两个已破坏(同上)的起始子tRNA(met)基因来实现。

如本文中所使用，折叠是指多肽和蛋白质的三维结构，其中氨基酸残基之间的相互作用起到了稳定结构的作用。虽然非共价相互作用在决定结构时很重要，但是目标蛋白通常将具有由两个半胱氨酸残基形成的分子内和/或分子间共价二硫键。对于天然存在的蛋白质和多肽或其衍生物和变体而言，正确折叠通常是产生最佳生物学活性的排列，而且可以通过测定法方便监测活性，例如配体结合、酶活性等。

在一些情况下，例如当所需产物源自合成时，基于生物学活性的测定法的意义不大。可根据物理性质、能量考虑因素、建模研究等来确定此类分子的正确折叠。

可通过引入编码增强折叠和二硫键形成的一种或多种酶(即折叠酶、伴侣蛋白、PDI、BIP、亲环蛋白等)的序列进一步修饰表达宿主。可使用如本领域已知的载体、标记等在酵母宿主细胞中组成性或诱导性表达此类序列。优选地，通过靶向方法学将包括足以实现所需表达模式的转录调控元件在内的序列稳定整合到酵母基因组中。

例如，真核PDI不但是蛋白质半胱氨酸氧化和二硫键异构化的有效催化剂，而且展示出伴侣蛋白活性。PDI的共表达可有助于具有多个二硫键的活性蛋白的生成。同样感兴趣的是BIP(免疫球蛋白重链结合蛋白)、亲环素等的表达。在本发明的一个实施方案中，可由通过配对产生的酵母菌株表达多亚基复合体,其中每一种单倍体亲本菌株表达不同的折叠酶，例如一种菌株可能表达BIP，而另一种菌株可能表达PDI或其组合。

术语“所需蛋白质”或“靶蛋白质”可互换使用，并且一般是指异源多亚基蛋白质，诸如本文所述的抗体(例如，人源化抗体)或其结合部分。

术语“抗体”包括任何含多肽链的分子结构，所述分子结构具有适合且识别表位的特定形状，其中一种或多种非共价结合相互作用稳定了分子结构与表位之间的复合体。原型抗体分子为免疫球蛋白，而且认为来自所有来源例如人、啮齿动物、兔、牛、绵羊、猪、犬、其它哺乳动物、鸡、其它禽类等的所有类型的免疫球蛋白、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等都是“抗体”。用于生成根据本发明可用作起始材料的抗体的优选来源为兔。已经描述了许多抗体编码序列；并且可通过本领域众所周知的方法产生其它抗体编码序列。其实例包括嵌合抗体、人抗体和其它非人哺乳动物抗体、人源化抗体、单链抗体(诸如scFv)、骆驼抗体、纳米抗体、IgNAR(源自鲨鱼的单链抗体)、小模块免疫药物(SMIP)和抗体片段，诸如Fab、Fab'、F(ab')₂等。参见Streltsov V A等人，Structure of a shark IgNAR antibody variable domainand modeling of an early-developmental isotype,Protein Sci.2005年11月；14(11):2901-9.Epub 2005年9月30日；Greenberg A S等人，A new antigen receptor genefamily that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification insharks,Nature.1995年3月9日；374(6518):168-73；Nuttall S D等人，Isolation of thenew antigen receptor from wobbegong sharks,and use as a scaffold for thedisplay of protein loop libraries,Mol Immunol.2001年8月；38(4):313-26；Hamers-Castennan C等人，Naturally occurring antibodies devoid of light chains,Nature.1993年6月3日；363(6428):446-8；Gill D S等人，Biopharmaceutical drugdiscovery using novel protein scaffolds,Curr Opin Biotechnol.2006年12月；17(6):653-8.Epub 2006年10月19日。前述各参考文献以引用的方式整体并入本文中。

例如，可通过基因工程化生成抗体或抗原结合片段。在这种技术中，正如其它方法一样，使产生抗体的细胞对所需抗原或免疫原敏化。使用从产生抗体的细胞分离的信使RNA作为模板以使用PCR扩增制备cDNA。通过将已扩增的免疫球蛋白cDNA的适合区段插入表达载体中来生成每个都含有保留了最初抗原特异性的一个重链基因和一个轻链基因的载体文库。通过组合重链基因文库与轻链基因文库来构建组合文库。这导致产生了共表达重链和轻链(组装抗体分子的Fab片段或抗原结合片段)的克隆文库。将携带这些基因的载体共转染到宿主细胞中。在经转染宿主中诱导抗体基因合成时，重链和轻链蛋白自我组装，生成可以通过利用抗原或免疫原的筛选来检测的活性抗体。

目标抗体编码序列包括由天然序列编码的那些序列，以及因遗传密码简并性，由与公开的核酸和其变体的序列不同的核酸编码的那些序列。变体多肽可包括氨基酸(aa)取代、添加或缺失。氨基酸取代可为保守性氨基酸取代或是用于消除非必需氨基酸，例如用于改变糖基化位点或用于通过取代或缺失一个或多个并非功能所必需的半胱氨酸残基而将错误折叠减至最少的取代。变体可设计成保留或具有提高的蛋白质特定区域(例如功能结构域、催化氨基酸残基等)的生物学活性。变体还包括本文公开的多肽的片段，特别是生物学活性片段和/或与功能结构域对应的片段。已知用于对克隆基因进行体外诱变的技术。本发明还包括已经使用普通分子生物学技术修饰而提高其对蛋白水解降解作用的抗性或优化了溶解性质或使之更适于作为治疗剂的多肽。

可通过将从一个物种的产生抗体的细胞获得的轻链和重链可变区(V_L和V_H)与从另一个物种得到的轻链和重链恒定区组合在一起，利用重组方法来生成嵌合抗体。通常，嵌合抗体利用啮齿类或兔可变区和人恒定区，以便生成人结构域为主的抗体。此类嵌合抗体的生成在本领域中众所周知，而且可通过标准方法来实现(例如美国专利号5,624,659中所述，所述文献以引用的方式整体并入本文中)。还可预期到，本发明嵌合抗体的人恒定区可选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。

对人源化抗体进行工程化而含有甚至更多人样免疫球蛋白结构域，并且只并入了动物源性抗体的互补决定区。这是通过仔细检查单克隆抗体可变区高变环的序列并使其与人抗体链的结构拟合而实现。虽然表面上复杂，但是实际上该过程简单明了。参见，例如美国专利号6,187,287，其以引用的方式完整地并入本文中。先前在已颁布的美国专利号7935340中已经描述了使抗体人源化的方法，其公开内容以引用的方式整体并入本文中。在一些情况下，必须确定是否需要额外的兔框架残基来维持活性。在一些情况下，人源化抗体仍需保留一些关键的兔框架残基以使亲和力或活性丧失最小化。在这些情况下，必须将来自人生殖系序列的单个或多个框架氨基酸变回到原始兔氨基酸，以便具有所需活性。用实验方法测定这些变化以鉴定哪些兔残基是保持亲和力和活性所必需的。

除完整免疫球蛋白(或其重组对应物)外，还可合成包含表位结合位点的免疫球蛋白片段(例如Fab'、F(ab')₂或其它片段)。可利用重组免疫球蛋白技术设计“片段”或最小免疫球蛋白。例如，可通过合成融合的轻链可变区和重链可变区来生成用于本发明的“Fv”免疫球蛋白。对抗体的组合同样感兴趣，例如包含两种不同Fv特异性的双链抗体。在本发明的另一实施方案中，免疫球蛋白片段涵盖SMIP(小分子免疫药物)、骆驼抗体、纳米抗体和IgNAR。

可在翻译后修饰免疫球蛋白和其片段，例如添加效应部分(诸如化学连接子)、可检测部分(诸如荧光染料、酶、毒素、底物、生物发光物质、放射性物质、化学发光部分等)或特异性结合部分(例如链霉亲和素、亲和素或生物素)等，它们可用于本发明的方法和组合物中。下文提供了其它效应分子的实例。

产物相关变体：除所需产物(例如，所需多亚基复合体)外，存在于所需产物的制剂中并且与所需产物有关的产物。示例性产物相关变体包括截短或延长的肽、糖基化模式与所需糖基化不同的产物(例如，如果需要非糖基化产物，则将任何糖基化产物视为产物相关变体)、具有异常化学计量、组装不正确、二硫键异常、折叠异常或不完全、具有聚集、蛋白酶裂解或其它异常的复合体。例示性产物相关变体可展现出以下一项或多项的改变：分子质量(例如，通过尺寸排阻色谱法检测)、等电点(例如，通过等电聚焦检测)、电泳迁移率(例如，通过凝胶电泳检测)、磷酸化状态(例如，通过质谱法检测)、电荷质量比(例如，通过质谱法检测)、蛋白水解片段的质量或同一性(例如，通过质谱法或凝胶电泳检测)、疏水性(例如，通过HPLC检测)、电荷(例如，通过离子交换色谱法检测)、亲和力(例如，在抗体的情况下，通过与蛋白A、蛋白G和/或为所需抗体所结合的表位的结合来检测)和糖基化状态(例如，通过凝集素结合亲和力来检测)。当所需蛋白质为抗体时，术语产物相关变体可包括糖基-重链变体和/或半抗体种类(如下文所描述)。

例示性产物相关变体包括含异常二硫键的变体形式。例如，大多数IgG1抗体分子通过总计16个链内和链间二硫桥键稳定，所述二硫桥键稳定了重链和轻链中IgG结构域的折叠，而链间二硫桥键稳定了重链和轻链之间的缔合。其它抗体类型同样含稳定链内和链间二硫键的特征。此外，一些抗体(包括本文公开的Ab-A和Ab-B)含有称为非经典二硫键的额外二硫键。因此，由于缺乏与额外亚基的稳定共价键联和/或二硫键联，所以异常的链间二硫键会导致异常的复合体化学计量。另外，异常的二硫键(无论链间还是链内)会降低抗体的结构稳定性，这可导致活性降低、稳定性降低、形成聚集物的倾向增加和/或免疫原性增加。含异常二硫键的产物相关变体可用多种方法检测，包括非还原变性SDS-PAGE、毛细管电泳、cIEX、质谱法(任选地加上利用化学修饰在游离半胱氨酸中产生质量偏移)、尺寸排阻色谱法、HPLC、光散射变化和本领域已知的任何其它适合方法。参见，例如，The ProteinProtocols Handbook 2002年,第五部,581-583,DOI:10.1385/1-59259-169-8:581。

半抗体、半抗体种类或H1L1是指包括单条抗体重链和单条抗体轻链，但是缺乏与第二抗体重链和轻链的共价键联的蛋白质复合体。两个半抗体可在一些条件下保持非共价缔合，但可在适当条件(例如，清洗剂、盐或温度)下分开，以有助于其检测与全H2L2抗体分开。类似地，H2L1是指包括两条抗体重链和单条抗体轻链，但是缺乏与第二抗体轻链的共价键联的蛋白质复合体；这些复合体也可与另一条抗体轻链非共价缔合(并且同样产生与全抗体类似的特性)。与全抗体一样，半抗体种类和H2L1种类可在还原条件下离解成单条重链和轻链。可在非还原SDS-PAGE凝胶上检测半抗体种类和H2L1种类为在低于全抗体的表观分子量下迁移的种类，例如H1L1在全抗体约一半的表观分子量(例如，约75kDa)下迁移。

糖基-重链变体是指有时存在于抗体制剂中并且至少含有部分Fe序列的糖基化产物相关变体。糖基-重链变体的特征在于，通过SDS-PAGE(相对于正常重链)可观察到的电泳迁移率降低，凝集素结合亲和力降低，与抗Fc抗体的结合降低和通过尺寸排阻色谱法测定，含糖基-重链变体的抗体复合体的表观分子量更高。参见2011年8月31日提交的美国临时申请序号61/525,307(代理人案号67858.730200)，其以引用的方式整体并入本文中。

术语“稳定表达或长时间表达所需分泌型异源多肽的多倍体酵母”是指在阈值表达水平下，在通常为至少50-500mg/L(在培养中约90小时后)并且优选基本上更高的水平下，分泌所述多肽持续至少几天到一周，更优选至少一个月，还更优选至少1-6个月并且甚至更优选一年以上的酵母培养物。

术语“分泌所需量的重组多肽的多倍体酵母培养物”是指稳定地或长时间地分泌至少50-500mg/L并且最优选500-1000mg/L或更多的培养物。

如果根据遗传密码翻译多核苷酸序列产生多肽序列(即，多核苷酸序列“编码”多肽序列)，则多核苷酸序列与多肽序列“对应”，如果两个序列编码同一多肽序列，则一个多核苷酸序列与另一核苷酸序列“对应”。

DNA构建体的“异源”区域或结构域是在较大DNA分子中，发现在自然界中不与较大分子缔合的DNA可识别区段。因此，当异源区域编码哺乳动物基因时，基因通常将侧接在源生物基因组中不侧接哺乳动物基因组DNA的DNA。异源区域的另一实例是编码序列本身在自然界中不存在的构建体(例如，其中基因组编码序列含有内含子的cDNA或具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。等位变异或天然存在的突变事件不会产生如本文所定义的DNA的异源区域。

“编码序列”是对应于或编码蛋白质或肽序列的密码子框内序列(由遗传密码来看)。如果两个编码序列或其互补序列编码相同氨基酸序列，则这两个编码序列相互对应。与适当调控序列缔合的编码序列可被转录并翻译为多肽。多腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码序列的3'端。“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并且引发下游(3'方向)编码序列转录的DNA调控区。启动子序列通常含有用于结合影响编码序列转录的调控分子(例如，转录因子)的额外位点。当RNA聚合酶结合细胞中的启动子序列并将编码序列转录为mRNA,然后mRNA转而被翻译为由编码序列所编码的蛋白质时，编码序列受启动子序列的“控制”或与启动子“可操作地连接”。

使用载体向生物体或宿主细胞中引入外来物质，诸如DNA、RNA或蛋白质。典型载体包括重组病毒(对于多核苷酸而言)和脂质体(对多肽而言)。“DNA载体”为复制子，诸如质粒、噬菌体或粘粒，另一多核苷酸区段可附于其上以致引起所附区段的复制。“表达载体”是DNA载体，其含有将指导适当宿主细胞的多肽合成的调控序列。这通常意味着结合RNA聚合酶并引发mRNA的转录的启动子，以及指导mRNA翻译为多肽的核糖体结合位点和起始信号。向表达载体的恰当位点和正确阅读框内并入多核苷酸序列，接着用载体转化适当宿主细胞，使得能够生成由所述多核苷酸序列编码的多肽。

多核苷酸序列的“扩增”是在体外生成特定核酸序列的多个拷贝。扩增的序列通常呈DNA形式。在下列综述文章中描述了进行此类扩增的多种技术，其各自以引用的方式整体并入本文中：Van Brunt 1990,Bio/Technol.,8(4):291-294；和Gill和Ghaemi,Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.2008年3月；27(3):224-43。聚合酶链式反应或PCR是核酸扩增的原型，并且本文PCR的使用应视为其它适合扩增技术的例示。

大多数脊椎动物(包括哺乳动物)中抗体的一般结构现已得到充分认识(Edelman,G.Μ.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,190:5(1971))。常规抗体由分子量为约23,000道尔顿的两条相同多肽轻链(“轻链”)和分子量为53,000-70,000的两条相同重链(“重链”)组成。4条链呈“Y”构型通过二硫键连接，其中轻链托住从“Y”构型开口处开始的重链。将“Y”构型的“分支”部分指定为F_ab区；将“Y”构型的茎干部分指定为F_C区。氨基酸序列取向为从“Y”构型顶部的N末端延伸到每条链底部的C末端。N末端具有对诱导它的抗原有特异性的可变区，并且长度为约100个氨基酸，在轻链和重链以及抗体之间稍有不同。

每条链中可变区与恒定区连接，恒定区延伸链的剩余长度并且在特定类别的抗体内不会随抗体的特异性(即，诱导它的抗原)而变化。已知5大类决定免疫球蛋白分子类别的恒定区(IgG、IgM、IgA、IgD，以及IgE，对应于γ、μ、α、δ，和ε重链恒定区)。恒定区或类别决定抗体的后续效应功能，包括激活补体(Kabat,E.A.,Structural Concepts in Immunologyand Immunochemistry,第2版,第413-436页,Holt,Rinehart,Winston(1976))和其它细胞反应(Andrews,D.W.，等人，Clinical Immunobiology,第1-18页,W.B.Sanders(1980)；Kohl,S.等人，Immunology,48:187(1983))；而可变区决定将与之反应的抗原。轻链分为κ或λ。每个重链类别可与κ或λ轻链配对。轻链和重链相互共价键合，并且当免疫球蛋白由杂交瘤或B细胞生成时，两条重链的“尾”部通过共价二硫键相互键合。

表述“可变区”或“VR”是指抗体中每对轻链和重链内直接牵涉于使抗体与抗原结合的结构域。每条重链在一端具有可变结构域(V_H)，后面是数个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(V_L)并且在其另一端有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。

表述“互补决定区”、“高变区”或“CDR”是指在抗体轻链或重链的可变区中发现的一个或多个高变或互补决定区(CDR)(参见Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,(1987))。这些表述包括如Kabat等定义的高变区(“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,”Kabat E.等人，US Dept.of Health and Human Services,1983)或抗体三维结构中的高变环(Chothia和Lesk,J Mol.Biol.196 901-917(1987))。每条链中的CDR保持紧密靠近框架区并且，和来自另一条链的CDR一起，有助于形成抗原结合位点。在CDR内有已经作为选择性决定区(SDR)加以描述的选定氨基酸，其表示抗体-抗原相互作用中由CDR使用的关键接触残基(Kashmiri,S.,Methods,36:25-34(2005))。

表述“框架区”或“FR”是指抗体轻链和重链可变区内的一个或多个框架区(参见Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.,(1987))。这些表述包括插入在抗体轻链和重链可变区内的CDR之间的那些氨基酸序列区域。

表述“稳定拷贝数”是指宿主细胞在长时间内(诸如至少一天、至少一周或至少一个月或更长时间内)或在更多增殖代数(例如，至少30、40、50、75、100、200、500或1000代或更多代)内基本上维持基因(诸如抗体链基因)的拷贝数。例如，在给定时间点或代数下，培养物中至少50％，并且优选至少70％、75％、85％、90％、95％或更多的细胞可维持与起始细胞中相同的基因拷贝数。在一个优选实施方案中，宿主细胞含有编码所需蛋白质或编码所需多亚基复合体(例如，抗体)的每个亚基的基因的稳定拷贝数。

表述“稳定表达”是指宿主细胞在长时间内(例如至少一天、至少一周或至少一个月或更长时间内)或在更多增殖代数(例如，至少30、40、50、75、100、200、500或1000代或更多代)内维持基因或蛋白质(诸如抗体)的相似表达水平。例如，在给定时间点或代数下，基因或蛋白质的生产率或产量可为初始生产率的至少50％，并且优选至少70％、75％、85％、90％、95％或更高。在一个优选实施方案中，宿主细胞稳定表达所需蛋白质或多亚基复合体(例如，抗体)。

实施例

提出下列实施例以便为本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的全面公开和描述，而并非旨在限制视为本发明的内容的范围。已经做出努力来确保关于所用数字(例如，量、温度、浓度等)的精确性，但是应容许一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数为重量份，分子量为平均分子量，温度按摄氏度计；并且压力为大气压或接近大气压。

上述公开内容大体上描述了本发明。本文中所公开的所有参考资料明确地以引用的方式并入本文。通过参考下列具体实施例可获得更完整的了解，本文提供这些具体实施例仅是用于说明的目的，而不意在限制本发明的范畴。

实施例1

实施例1至10显示用于产生四种不同的人源化单克隆抗体的方法的适用性。在巴斯德毕赤酵母中使用甘油醛-3-磷酸(GAP)启动子系统来产生各个抗体。

我们发现了抗体Mab2的需氧和缺氧培养物之间的滴度差异。通过降低发酵罐中的搅拌速率来限制培养物对氧的可用性会导致产物形成的显著增加。此为我们的第一次确认：缺氧条件当应用于产生全长抗体时，会导致完全组装的、适当二硫键键结的人源化单克隆抗体的产物形成显著增加。参见图37。

实施例2

使抗体Mab1的各自具有不同拷贝数目的三种不同菌株生长在20升发酵罐中，其使用RQ控制策略(使用反馈控制来调节搅拌，所述控制调节搅拌器速度以维持RQ在所需水平(在此情况下，为1.12的值))来以受控方式促进缺氧条件的混合型代谢，以便确保乙醇浓度不会达到毒性水平。在各个情况下，反馈控制机构的稳健本质允许进行混合型代谢，而不累积毒性水平的乙醇(通常大于20g/L)。(参见图1-5)

实施例3

在缺氧条件下使用RQ控制策略，以三个不同的RQ控制设定点来培养Mab1。在此情况下，增加RQ设定点会增加乙醇累积水平，减少细胞累积，但是对总体产物累积不会有显著的影响。此显示出设定点在1.09至1.35范围内的RQ方法的效用。(参见图6-10)。

实施例4

我们比较关于Mab1通过RQ控制来实现的缺氧生长的效应对比于在需氧条件下相同的方法下的效应。需氧方法导致较低的乙醇产量(正如所预期)，以及显著较少的产物形成。(参见图11-16)。

实施例5

RQ控制策略是针对Mab2的发酵来进行，所述发酵具有在各个重链与轻链的拷贝数目上有所不同的生产菌株。此项研究显示RQ策略在控制乙醇的累积同时提供混合型代谢的缺氧环境时的稳健本质。(参见图17-21)。

实施例6

RQ控制策略是针对Mab3的发酵来进行，所述发酵具有在各个重链与轻链的拷贝数目上有所不同的生产菌株。此项研究显示RQ策略在控制乙醇的累积同时提供混合型代谢的缺氧环境时的稳健本质。(参见图22-26)

实施例7

使用RQ控制策略，但是加上了不同的葡萄糖进料速率来使含有不同的重链与轻链的拷贝数目的Mab3菌株生长。此外，RQ策略允许有效地控制乙醇水平，从而导致非常相似的产物累积速率。此提供了进一步的证据来表明RQ策略对于各种各样的发酵条件具有稳健性。(参见图27-31)。

实施例8

有关MAb4对RQ策略进行证明，所述MAb4跟MAb1一样结合至相同的靶，但是其CDR序列与MAb1不同。我们比较二个不同的葡萄糖进料速率。该策略再次允许稳定的乙醇浓度以及相似的抗体累积速率。(参见图32-36)。

实施例9

此实施例描述了产生抗体的发酵方法或抗原结合发酵培养基。

以下表1中描述接种物培养基。

表1.接种物培养基

组分*	最终浓度
		酵母提取物	30g/l
KH2PO4	27.2g/l
		甘油或葡萄糖	20g/l

酵母氮碱，无胺基酸	13.4g/l
		生物素	0.4mg/l

*保持相同的摩尔浓度，任何化学品(X nH₂O；n≥0)可用另一种含有相同的活性成分但含有不同量的水(X kH₂O；k≠n)的化学品取代。

种子发酵培养基

以下表2中描述培养基。

组成：种子发酵培养基

组分*	最终浓度
		柠檬酸钠二水合物	10.0g/l
MgSO4-7H2O	3.7g/l
		NH4H2PO4	36.4g/l
K2HPO4	12.8g/l
		K2SO4	18.2g/l
无水甘油	40.0g/l
		酵母提取物	30.0g/l
消泡剂204	0.5ml/l
		微量矿物质溶液(PTM1)	4.35ml/l

以下表3中描述微量矿物质溶液。

表3.微量矿物质溶液(PTM1)

组分*	最终浓度
		ZnCl21或硫酸锌七水合物2	20g/l1或35g/l2
FeSO4-7H2O	65g/l
		95-98％ H2SO4	5ml/l
NaI	0.08g/l

MnSO4-2H2O	3g/l
		Na2MoO4-2H2O	0.2g/l
H3BO3	0.02g/l
		CoCl2	0.5g/l
CuSO4-5H2O	6g/l
		生物素	0.2g/l

当所有组分完全地溶解于DI水中时，通过无菌的0.2μm滤器无菌过滤。

以下表4中描述生产培养分批培养基

表4.生产培养分批培养基

组分*	最终浓度
		柠檬酸钠二水合物	10.0g/l
MgSO4-7H2O	3.7g/l
		NH4H2PO4	35.6g/l
K2HPO4	12.8g/l
		K2SO4	18.2g/l
无水甘油	40.0g/l
		酵母提取物	30.0g/l
消泡剂204	1.6ml/l

*保持相同的摩尔浓度，任何化学品(X nH2O；n≥0)可用另一种含有相同的活性成分但含有不同量的水(X kH2O；k≠n)的化学品取代。

上述者是通过121℃高压蒸气灭菌持续至少20分钟来加以灭菌。在灭菌和冷却之后，将4.35ml/l的微量矿物质溶液(PTM1)添加至生产培养分批培养基中。在对发酵罐接种之前，含有4.35ml/l的PTM1的生产培养分批培养基应该用24-30％ NH₄OH调整至pH 6.0。上述值应以包括培养基和接种物培养物两者的总发酵开始体积为基准。

以下表5中描述葡萄糖/酵母提取物进料溶液。

组分*	最终浓度
		无水右旋葡萄糖	500g/l
酵母提取物	50g/l
		MgSO4-7H2O	3g/l
消泡剂204	0.1ml/l
		柠檬酸钠二水合物	1.66g/l
PTM1	12ml/l

以下表6中描述乙醇团注组成。

组分*	最终浓度
		乙醇，200酒度(Proof)	11g/l

*可任选地使用更稀的乙醇溶液来获得相同的最终浓度。

发酵方法

由酵母，例如巴斯德毕赤酵母，来完成用于产生抗体或抗原结合片段的发酵方法。发酵起始于解冻冰冻的含工作细胞库(working cell bank)的小瓶。解冻的细胞接着于摇瓶内增殖。来自摇瓶的培养物接着用于接种物步骤中，然后进行用于产生抗体的分批补料方法。任选地，可使用接种物来增殖种子分批发酵中的细胞，然后其可用来接种生产发酵罐。

1.接种物步骤

将解冻的工作细胞库细胞转移至加挡板的摇瓶(1至4个挡板)中，所述摇瓶含有8-20％工作体积容量的烧瓶接种物培养基。以接种物培养基体积的0.1-1.0％添加解冻的工作细胞库至摇瓶中。以220-260rpm的搅拌速度在29-31℃下孵育接种物培养物。一旦达到与600nm下15-30(最佳为20-30)的吸光度(OD₆₀₀)相关联的细胞密度，就收获种子培养物。培养时间通常为20-26小时(最佳为23-25小时)。

2.种子发酵分批发酵(任选的)

用来自“接种物步骤”的接种物来接种发酵罐

接种物＝0.3％的种子发酵罐培养基体积

温度：30℃

％DO：30％

pH：6.0

搅拌：100-490RPM的串级策略

气流：1vvm((空气体积/发酵罐开始的培养基体积)/分钟)

压力：0.2巴

当达到最大的搅拌时，将会补充氧，并且气流相应有减少以维持恒定vvm，从而维持所需％DO设定点：30％。

继续监测DO尖峰。

当依据搅拌减少并且DO增加而指示出出现DO尖峰时，表示碳源(甘油或葡萄糖)已被完全利用，并且所测量的光密度OD₆₀₀大于20，转移一体积的种子分批发酵或接种物培养物，所述体积等于生产发酵罐开始批次体积的1.0-10％。

3.分批培养阶段

分批培养起始于用种子培养物接种发酵罐，并且终止于甘油的耗尽。发酵罐含有最大工作体积的30-40％的制备的生产培养分批培养基。使用种子培养物在发酵罐内产生1-10％的接种物。最初的工程化参数设定如下：

温度：27-29℃；

搅拌(P/V)：2-16KW/m³

顶部空间压力：0.7-0.9巴

气流：0.9-1.4VVM(每分钟每体积培养物的空气体积，以开始的体积为基准)

DO：无控制

pH：5.9至6.1，用24-30％ NH₄OH控制

开始的搅拌速度和气流在分批培养阶段期间保持恒定，以便满足最初的每体积的功率(P/V)以及每分钟每体积的体积(VVM)要求。在甘油耗尽时通过开始进料来终止分批培养阶段。溶氧(DO)值尖峰指示出甘油的耗尽。DO尖峰被定义为当几分钟之内DO的值增加超过30％时的值。分批培养阶段通常持续10-15小时(最佳为11-13小时)。

4.乙醇团注添加(任选的)

一旦观测到如上文所提及的DO尖峰后，就将8-16g/l的呈团注形式的200酒度的乙醇添加至发酵罐中。此通常发生在分批培养阶段的12-14小时之内。

5.分批补料培养阶段

在DO尖峰之后以及在乙醇团注添加之后，在分批培养阶段内约12-14小时，开始向发酵罐进给葡萄糖/酵母提取物进料溶液并且持续至发酵结束。葡萄糖/酵母提取物进料溶液进料的速率被设定成允许每小时6-11g的葡萄糖/升开始体积。葡萄糖/酵母提取物进料溶液的起始开始了分批补料培养阶段。

6.RQ控制起始

在分批补料培养阶段起始之后8小时开始呼吸商(RQ)控制。最初的RQ设定点在1.09至1.35范围内。使用搅拌来控制RQ。在RQ控制设定点以外，搅拌为串级式。从开始分批培养阶段大约20-22小时时起始RQ控制且持续至发酵结束。RQ控制的持续期间持续大约60至90小时。

调整搅拌以便维持RQ的设定水平。RQ控制策略详细说明如下：

RQ高(Hi)控制设定点：1.35

RQ低控制设定点：1.08

最大搅拌器设定点：255-950rpm

最小搅拌器设定点：150-300rpm

搅拌器步骤变更(按各等待时间间隔变化)：3-25rpm

等待时间(介于评估之间的时间)：3-10分钟

乙醇/RQ控制策略

已经并入此策略以确保乙醇浓度不会超过对细胞可能有毒的最大值，并且不会超过会减少产物表达的最小值。

实施例10

图38显示在缺氧和需氧条件下产生的Mab1的SDS-PAGE凝胶。在非还原凝胶中，除了在150kD处的主带之外，在主带下方的其它谱带指示出有关于链间二硫桥键水平的产物异质性。此类凝胶显示使用缺氧条件降低了异质性水平。全长、完全交联的产物增加的同质性指示出增加的纯度，即，增加的所需产物，这是相对于所存在的其它蛋白质而言的。

图38还显示相同样本的还原SDS-PAGE凝胶。在此情况下，在25kD和50kD处的预期谱带代表抗体的重链与轻链。其它谱带，特别是在重链上方大约55kD处的一条谱带代表存在抗体的变体种类。这些凝胶显示与需氧培养相比，当细胞在缺氧条件下生长时，此变体的存在显著地减少。

实施例11

此实施例测试温度变动对由巴斯德毕赤酵母表达的抗体的产量和纯度的影响。在培养期间实施的向上的温度变动使得抗体产量增加了达约30％。此外，所述温度变动提高了纯度，这是由产物相关变体和异常复合体的丰度减低所指示。

方法

由含有重链基因的4个整合拷贝以及轻链基因的3个整合拷贝(分别为SEQ ID NO:1和2)的巴斯德毕赤酵母菌株来表达Ab-A。使用包含下列营养素(％w/v)的培养基来扩充接种物：酵母提取物3％、甘油2％、YNB 1.34％、生物素0.004％以及27.2g/l磷酸二氢钾。为在发酵罐中产生接种物，使细胞在振荡孵育器中在30℃和300rpm下生长大约24-28小时。

Ab-A序列如下：

Ab-A重链多核苷酸序列：

gaggtgcagcttgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagtctctggaatcgacctcagtggctactacatgaactgggtccgtcaggctccagggaaggggctggagtgggtcggagtcattggtattaatggtgccacatactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccagagacaattccaagaccacggtgtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatttctgtgctagaggggacatctggggccaagggaccctcgtcaccgtctcgagcgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacgcgagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc gacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQ ID NO：1)

Ab-A轻链多核苷酸序列：

caagtgctgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcaattgccaggccagtcagagtgtttatcataacacctacctggcctggtatcagcagaaaccagggaaagttcctaagcaactgatctatgatgcatccactctggcatctggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatgttgcaacttattactgtctgggcagttatgattgtactaatggtgattgttttgttttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQ ID NO：2)

接着将10％接种物添加至含有6L无菌生长培养基的Applikon 17L工作体积容器中。生长培养基包含下列营养素：硫酸钾18.2g/L、磷酸二氢铵35.6g/L、磷酸二氢钾12.8g/L、硫酸镁七水合物3.72g/L、柠檬酸钠二水合物10g/L、甘油40g/L、酵母提取物30g/L、PTM1微量金属4.35mL/L，以及消泡剂204 1.67mL/L。PTM1微量金属溶液包含下列组分：五水合硫酸铜6g/L、碘化钠0.08g/L、硫酸锰水合物3g/L、二水合钼酸钠0.2g/L、硼酸0.02g/L、氯化钴0.5g/L、氯化锌20g/L、七水合硫酸亚铁65g/L、生物素0.2g/L，以及硫酸5mL/L。生物反应器过程控制参数设定如下：搅拌为950rpm，气流为每分钟1.35标准升，温度为28℃，并且使用氢氧化铵控制pH值(为6)。并未提供氧补充。

使发酵培养物在28℃下生长大约12至16小时，直至起始的甘油消耗为止，后者是依据溶氧浓度激增(称为DO尖峰)而检测到。在检测到DO尖峰之后，每升培养物立即添加11克的100％乙醇团注剂至反应器中，以获得约1.1％乙醇(w/v)的最终浓度。使发酵培养物平衡20分钟。然后在发酵持续期间以11g葡萄糖/L/h的恒定速率开始进料添加。在开始进料添加之后大约8h，使用搅拌反馈控制，以最小搅拌速度500rpm和最大搅拌速度950rpm开始RQ控制，进而在剩余的发酵期间将RQ设定点维持为1.12。进料包含下列组分：酵母提取物50g/L、无水右旋葡萄糖500g/L、硫酸镁七水合物3g/L，以及PTM1微量金属12mL/L。任选地，还添加柠檬酸钠二水合物(1.66g/L)至进料中。进料pH为6.0。

在开始进料之后五分钟，将培养温度迅速地变动为五个不同温度之一(25℃、29.5℃、31℃、32.5℃，以及34℃)。此外，对照培养物维持为28℃，即，没有温度变动。总发酵时间为大约86-87小时。

在整个发酵过程中从各个培养物收集样本并且测定全培养液滴度，并以本申请的各图中前后一致的任意单位来作图。此外，在操作终止时，通过对还原和非还原样本使用具有紫外线检测仪器的安捷伦(Agilent)(Santa Clara,CA)1200系列HPLC进行尺寸排阻色谱法(SE-HPLC)来测定抗体纯度(在蛋白A纯化之后)。在样本分离中，使用Tosoh Bioscience(King of Prussia,PA)的与TSKgel Guard SWx1 6x40mM连接的TSKgel GS3000SWx17.8x300mM管柱。在等度模式中以0.5mL/min的流速使用pH 6.5的100mM磷酸钠、200mM氯化钠作为移动相，且监测UV 215nm下的吸光度。在注入样本之前，使所述管柱平衡，直到达到稳定基线。使用移动相将样本浓度稀释为1mg/mL，并且注入30μL体积。为了监测管柱性能，使用BioRad(Hercules,CA)凝胶过滤标准品。

结果

使被工程化而表达Ab-A的巴斯德毕赤酵母生长于培养物中，所述培养物在初始生长阶段期间维持为28℃且以甘油作为碳源。在甘油耗尽之后，开始连续的葡萄糖进料，并且对培养温度迅速地向上或向下变动至介于25℃与34℃之间的新设定点温度且在培养的持续期间维持于该温度。将一种培养物维持为28℃作为对照。

为了监测抗体产生，对培养基(由于包括分泌信号，抗体会分泌至该培养基之中)周期性地取样直到最终的86-87小时时间点。测定全培养液抗体滴度(任意单位)并且相对于各培养温度用图示于图40中。如图所示，维持为31℃的培养物达到最高的最终滴度。维持为32.5℃的培养物最初获得稍微较高的滴度，然而，全培养液滴度呈平稳状态且在65-70小时之间开始减小，并且最终滴度低于对于无变动的培养物所观测到的最终滴度。对维持为29.5℃的培养物观测到第二高的最终滴度。向上变动至34℃的培养物和向下变动至25℃的培养物两者都产生比维持为28℃的培养物更低的滴度。

此外，在培养终止时(即，在86-87小时时)，测定抗体纯度。具体来说，来自各培养物的蛋白A纯化抗体是通过排阻色谱法(SEC)以及通过凝胶电泳加上考马斯染色(图42-47)来评估，对还原和非还原样本二者均进行了这些测试分析。非还原样本的SEC分析检测具有异常化学计量的复合体的相对丰度，包括含有单个重链与单个轻链的75kDA“半抗体”种类，以及含有两个重链与单个轻链的“HHL”复合体。还原样本的SEC分析检测完整的重链与轻链的相对丰度，以及具有大约9.8、10.15和10.8分钟的洗脱时间的异常亚基(认为其对应于抗体重链的糖基化形式)的相对丰度。

图41A-B中汇总SEC结果。非还原SEC分析展现出，无变动的培养物(即，维持为28℃)以及变动到29.5℃和31℃的培养物的主抗体峰中含有相似比例的总蛋白质，且所有三个条件均在全抗体峰内维持88-89％的总蛋白质(图41A)。因此，关于错误组装的复合体，向上变动到29.5℃和31℃并未不利地影响纯度。另外，还原SEC分析展现出，与无变动的培养物相比，在变动到29.5℃的培养物中，重链与轻链峰中含有的总蛋白质比例仍是相似的，且在更高的温度变动下增加了约4％。

在此基础上，推断出向上温度变动至29.5℃或31℃(即，变动1.5℃至3℃)会增加最终的抗体产量。此外，在变动至31℃的培养物中纯度增加，而在变动至29.5℃的培养物中没有不利地影响纯度。

实施例12

此实施例测试温度变动对由巴斯德毕赤酵母表达的抗体的产量和纯度的影响。测试两种不同的菌株，即低生产菌株和高生产菌株。在高生产菌株中，在培养期间实施的向上温度变动使得抗体产量增加了约28％。在此基础上，推断出已经高度最佳化的菌株的生产可大大得益于温度变动。此外，温度变动会增加纯度，这在大多数情况下是由产物相关变体的丰度减低所指示。

方法

由含有重链基因的3或4个整合拷贝以及轻链基因的3个整合拷贝(分别为SEQ IDNO:3和4)的巴斯德毕赤酵母菌株来表达Ab-B。使用包含下列营养素(％w/v)的培养基来扩充接种物：酵母提取物3％、甘油2％、YNB 1.34％、生物素0.004％以及27.2g/l磷酸二氢钾。为在发酵罐中产生接种物，使细胞在振荡孵育器中在30℃和300rpm下生长大约24-28小时。

Ab-B序列如下：

Ab-B重链多核苷酸序列：

gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattctccctcagtaactactacgtgacctgggtccgtcaggctccagggaaggggctggagtgggtcggcatcatctatggtagtgatgaaaccgcctacgctacctccgctataggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacaccctgtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtattactgtgctagagatgatagtagtgactgggatgcaaagttcaacttgtggggccaagggaccctcgtcaccgtctcgagcgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO：3)

Ab-B轻链多核苷酸序列：

gctatccagatgacccagtctccttcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccaggccagtcagagcattaacaatgagttatcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatagggcatccactctggcatctggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagggttatagtctgaggaacattgataatgctttcggcggagggaccaaggtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(SEQ ID NO：4)

使发酵培养物在28℃下生长大约12至16小时，直至起始的甘油消耗为止，后者是依据溶氧浓度激增(称为DO尖峰)而检测到。然后以15g葡萄糖/l/h的速率开始进料添加持续8h。在开始进料添加之后大约8h，在发酵持续期间将进料添加速率减低至13g葡萄糖/l/h。此外，在此时使用搅拌反馈控制，以最小搅拌速度500rpm和最大搅拌速度950rpm开始RQ控制，以将RQ设定点维持为1.12。进料包含下列组分：酵母提取物50g/L、无水右旋葡萄糖500g/L、硫酸镁七水合物3g/L，以及PTM1微量金属12mL/L。任选地，还添加柠檬酸钠二水合物(1.66g/L)至进料中。

在开始进料之后，针对两个表达菌株各自的一个培养物，将培养温度迅速地变动为30℃。此外，对于两个菌株各自的两个培养物，将对照培养物维持为28℃，即，没有温度变动。总发酵时间为大约86小时。

在整个发酵过程中从各个培养物收集样本并且测定全培养液滴度，并以本申请的各图中前后一致的任意单位来作图。此外，在操作终止时，使用实施例11中所述的方法，通过尺寸排阻色谱法(SE-HPLC)来测定抗体纯度(在蛋白A纯化之后)。

结果

由含有轻链编码基因的3个拷贝和重链编码基因的3个拷贝(H3/L3)，或是含有轻链编码基因的3个拷贝和重链编码基因的4个拷贝(H4/L3)的工程化巴斯德毕赤酵母菌株表达Ab-B。培养物最初在28℃下生长且以甘油作为碳源。在甘油耗尽之后，开始连续的葡萄糖进料并且将培养温度迅速地向上变动至30℃，且在培养的持续期间维持于该温度，或是维持为28℃作为对照。

在基线时，H4/L3菌株(图48A)表达比H3/L3菌株(图48B)更高的抗体滴度，且无变动的培养物(即，维持为28℃)的平均最终全培养液滴度比H4/L3菌株高12％。

变动至30℃的H4/L3培养物显现出最终滴度进一步增加28％(相对于维持为28℃，即无变动的两个H4/L3培养物的平均滴度而言)。在H3/L3菌株中，在最终产量上所观测到的增加有点不太明显，不过，相对于维持为28℃(即，无变动)的两个H3/L3培养物的平均最终产量而言，变动至30℃的H3/L3菌株的产量增加了约5％。

图52显示各个培养物的温度相对于培养时间所作的关系图。正如所预期，一旦温度变动，细胞就迅速达到新的设定点温度30℃，并且有变动和无变动的培养物两者在整个培养过程中都维持其设定点温度。

还使用SE-HPLC来评估各培养物的抗体纯度。如实施例11中所述，非还原样本容许检测异常复合体(含有一个重链与一个轻链的75kDa“半抗体”以及含有两个重链但只有一个轻链的HHL复合体)的相对丰度。与相应无变动的对照物的平均值相比，在变动至30℃的两个样本中，全抗体(“主峰IgG”)中所含的蛋白质级分增加，这是起因于相对于无变动的样本的平均值而言，在有变动的样本中75kDA HL物质和前峰HHL物质两者均有减少。具体来说，在无变动的H4/L3样本中，全抗体峰中所含的平均蛋白质级分为74.39％，前峰HHL中为4.26％，并且75kD HL为12.65％，而相比之下，在有变动的H4/L3样本中，分别为83.44％、4.75％，和6.15％。同样地，在无变动的H3/L3样本中，全抗体峰中所含的平均蛋白质级分为82.80％，前峰HHL中为5.31％，并且75kD HL为4.76％，而相比之下，有变动的样本中分别为91.63％、2.94％，和1.44％。总之，非还原SEC分析展现出，温度变动(1)会增加全抗体峰中所含的抗体平均量，以及(2)会减少四个例子中的三个例子的异常复合体平均量。

同样如实施例11中所述，还原样本容许检测全长重链与轻链中含有的蛋白质的相对丰度，以及在三个离散洗脱峰中观测到的产物相关变体的相对丰度。与以非还原分析所观测到的异常复合体的实测减少不同，还原样本在全长重链与轻链中含有的抗体量上，并没有显示出始终一致的改进。大体说来，与无变动的培养物的平均值相比，对于两个菌株，在有变动的培养物中重链的平均相对丰度增加了约1-3％，并且在两个菌株中，轻链的平均相对丰度没有变化或减低了约0.9％。

实施例13

此实施例测试温度变动对由巴斯德毕赤酵母表达的抗体的产量和纯度的影响。在培养期间实施的向上温度变动使得抗体产量平均增加了47％。

方法

如实施例11中所述，由含有重链基因的4个整合拷贝以及轻链基因的3个整合拷贝的巴斯德毕赤酵母菌株来表达Ab-A，例外之处为将五个培养物维持为28℃(即，无变动)并且将四个培养物变动至30℃。如同实施例11中，如果真的有温度变动的话，在开始进料之后五分钟时实施温度变动。总发酵时间为大约87小时。

使用实施例11中所述的方法，在整个发酵过程中从各个培养物收集样本并且测定全培养液滴度，并以本申请的各图中前后一致的任意单位来作图，且在最终时间点(在蛋白A纯化之后)，通过对还原和非还原样本进行尺寸排阻色谱法(SE-HPLC)来测定各培养物的抗体纯度。

结果

使被工程化而表达Ab-A的巴斯德毕赤酵母生长于培养物中，所述培养物在初始生长阶段期间维持为28℃且以甘油作为碳源。在甘油耗尽之后，开始连续的葡萄糖进料，并且将培养温度迅速地向上变动至新的设定点28℃，在培养的持续期间维持于该温度(N＝4)。将五个对照培养物维持为28℃(即，无变动)。

通过周期性地取样来测定全培养液抗体滴度，并用图示于图50(任意单位)中。如图所示，变动至30℃的四个培养物各自产生比所有维持为28℃、无变动的培养物更高的最终滴度。平均而言，有变动的培养物的最终滴度比无变动的培养物的最终滴度高47％。

此外，通过SE-HLPC评估纯度且针对有变动的培养物与无变动的培养物进行比较。非还原样本显示主抗体峰中含有的蛋白质的相对量平均增加大约2％，并且前峰HHL平均减少了约21％并且75kDa HL峰增加了57％。还原样本显示，纯度有了全面的改进，并且所有三个杂质峰的平均相对丰度均有所减低。具体来说，相对于无变动的样本而言，有变动的样本显现出RT 9.80峰有26％的减少，RT 10.16峰有74％的减少，并且RT 10.80峰有70％的减少。总之，非还原SEC分析展现出，温度变动(1)会增加全抗体峰中含有的抗体平均量，以及(2)会减少三种异常复合体中二者的平均量。还原SEC分析显示三个检测到的杂质峰各自的相对丰度有大幅减少。

在此基础上，推断出温度从28℃向上变动至30℃(即，变动2℃)可再现地使最终抗体产量平均增加25-30％。此外，通过毛细管电泳分析所反映的抗体纯度还反映出，当与无变动的培养物相比时，在有温度变动的培养物中纯度有提到，在还原比较中更为显著。

以上对本发明的各说明性实施方案的描述并非意在穷举或使本发明限于公开的确切形式。虽然为了说明的目的，本文描述了本发明的特定实施方案和实施例，但是正如相关领域的技术人员将认识到那样，在本发明范围内各种等效修改都是可能的。本文提供的本发明的教导可应用于除上述实施例外的其它目的。

可按不同于在前面的描述和实施例中特别描述的方式实践本发明。根据以上教导，本发明的许多修改和改变是可能的，并且因此在所附权利要求的范围内。

根据以上详细描述可对本发明作出这些和其它变化。一般而言，在下列权利要求中，不得将所使用的术语视为使本发明限于在说明书和权利要求中公开的特定实施方案。相应地，本发明不受公开内容限制，但是相反本发明的范围完全由下列权利要求决定。

在2006年5月19日提交的美国临时专利申请号60/801,412以及美国专利申请公布号2012/0141982中公开了关于获得抗原特异性B细胞无性系种群的方法的某些教导，各文献的公开内容以引用的方式整体并入本文中。

在2008年5月21日提交的对应于国际公布号WO/2008/144757，标题为“NovelRabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies”的国际申请号PCT/US2008/064421中公开了关于兔源性单克隆抗体的人源化和维持抗原结合亲和力的优选序列修饰的某些教导，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文中。

在2006年5月8日提交的美国专利申请号11/429,053(美国专利申请公布号US2006/0270045)中公开了关于使用能配对的酵母生成抗体或其片段和相应方法的某些教导，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文中。

本文中引用的每个文件(包括专利、专利申请、期刊论文、摘要、手册、书籍或其它公开内容)，包括在背景、概述、发明详述和实施例中引用的每个文件的全部公开内容据此以引用的方式整体并入本文中。

Claims

1.一种产生所需全长抗体的方法，其包括：

(a)在第一温度下培养包含一个或多个基因的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞，所述一个或多个基因提供所述所需抗体的表达；以及

(b)在第二温度下培养真核细胞，并且允许所述巴斯德毕赤酵母细胞产生所需抗体；

其中(i)编码所需抗体的基因的表达不是受到温度可诱导型的启动子的调控，和(ii)所述第一温度是介于27.5℃与28.5℃之间，所述第二温度是介于30℃与31℃之间。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述所需抗体包含人类抗体或人源化抗体，任选地对IL-6、TNF-α、CGRP、PCSK9、HGF或NGF具特异性的人源化或人类抗体。

3.如权利要求2述的方法，其中所述所需抗体包含对IL-6、TNF-α、CGRP、PCSK9、HGF或NGF具特异性的人源化或人类抗体。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述方法增加所述所需抗体的产量。

5.如权利要求1所述的方法，其中相对于在所述第一温度与所述第二温度之间没有差异的情况下所进行的相同方法，所述方法减低一个或多个产物相关抗体变体的相对丰度。

6.如权利要求1所述的方法，其中相对于在所述第一温度与所述第二温度之间没有差异的情况下所进行的相同方法，所述方法减低具有高于或低于所述所需多亚基复合体的表观分子量的产物相关抗体变体的相对丰度，所述表观分子量是通过尺寸排阻色谱法或凝胶电泳来检测。

7.如权利要求1所述的方法，其中相对于在所述第一温度与所述第二温度之间没有差异的情况下所进行的相同方法，所述方法减低具有异常二硫键的抗体复合体的相对丰度。

8.如权利要求1所述的方法，其中相对于在所述第一温度与所述第二温度之间没有差异的情况下所进行的相同方法，所述方法减低具有减少的半胱氨酸的抗体复合体的相对丰度。

9.如权利要求1所述的方法，其中相对于在所述第一温度与所述第二温度之间没有差异的情况下所进行的相同方法，所述方法减低具有异常糖基化的抗体复合体的相对丰度。

10.如权利要求1所述的方法，其中相对于在所述第一温度与所述第二温度之间没有差异的情况下所进行的相同方法，所述方法减低一个或多个产物相关抗体变体的相对丰度。

11.如权利要求1所述的方法，其中将提供所述所需抗体的表达的所述基因整合至所述巴斯德毕赤酵母宿主细胞的一个或多个基因组基因座中，其中任选地，所述基因组基因座中的至少一者选自以下项：pGAP基因座、3’AOX TT基因座；PpURA5；OCH1；AOX1；HIS4；GAP；pGAP；3’AOX TT；ARG；以及HIS4 TT基因座。

12.如权利要求1所述的方法，其中编码所述所需抗体的亚基的基因中的至少一者在可诱导型或组成型启动子的控制下得以表达，其前提条件是所述可诱导型启动子不是温度诱导型的，并且其任选地选自以下项：AOX1、CUP1、四环素可诱导型启动子、硫胺素可诱导型启动子，以及FLD1启动子。

13.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括在包含甘油作为碳源的培养基中培养所述巴斯德毕赤酵母细胞，直到所述甘油耗尽为止。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述所需抗体在选自以下项的启动子的控制下得以表达：CUP1、AOX1、ICL1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)、FLD1、ADH1、醇脱氢酶II、GAL4、PHO3、PHO5以及Pyk启动子、四环素可诱导型启动子、硫胺素可诱导型启动子、由其所衍生的嵌合启动子、酵母启动子、哺乳动物启动子、昆虫启动子、植物启动子、爬行动物启动子、两栖动物启动子、病毒启动子，以及禽类启动子，其前提条件是所述可诱导型启动子不是温度诱导型的。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述巴斯德毕赤酵母细胞为单倍体、二倍体、四倍体细胞，或是多倍体巴斯德毕赤酵母细胞。

16.如权利要求1所述的方法，其进一步包括从所述巴斯德毕赤酵母细胞或从包含所述巴斯德毕赤酵母细胞的培养基中纯化出所述所需抗体。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述所需抗体是从所述巴斯德毕赤酵母细胞的细胞内组分、细胞质、核质，或是膜中纯化而来。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述巴斯德毕赤酵母细胞将所述所需抗体分泌至所述培养基中。

19.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括分批阶段，其中任选地，所述分批阶段包括在包含碳源的培养基中培养所述巴斯德毕赤酵母细胞，其中任选地，所述分批阶段的终止是由所述培养基中所述碳源的耗尽来确定。

20.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括分批补料阶段。