JP7237365B2 - 高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するための組成物及び方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年3月10日に出願された米国仮特許出願第62/470,144号の利益を主張し、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、組み換えタンパク質を産生するための方法、及びそのような方法に使用され、且つ方法により産生される組成物、に関する。具体的には、本開示は、高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するための方法、ならびに、そのような方法に使用される発現構築物、組み換えベクター、組み換え宿主細胞、及び発酵に関する。
研究、産業、または治療目的のために必要な多くのタンパク質(例えば、酵素、ワクチン、ホルモン、及びバイオ医薬品タンパク質)は、組み換え宿主細胞内で工業的に産生されている。酵母、特に、出芽酵母は、そのような用途に好まれる真核生物の宿主生物である。酵母細胞は、安価な培地中で高細胞密度まで急速に成長し、タンパク質のフォールディング及び翻訳後修飾(例えば、タンパク質分解性成熟、ジスルフィド結合の形成、リン酸化、O結合型及びN結合型グリコシル化)のための細胞機序を含む。組み換えタンパク質の産生に最も一般に使用される酵母種は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、及びクライベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)を含む。これらのうち、ピキア・パストリスは、高密度の細胞成長を達成することができるので、特に、組み換えタンパク質がより大きな(例えば、工業用)規模で産生されることになる用途に適する。
[本発明1001]
発現構築物であって、組み換え分泌シグナルに作動可能に連結されているタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記組み換え分泌シグナルがリーダーペプチド及びシグナルペプチドを含み、前記リーダーペプチドが天然pro-αMF(sc)、または配列番号1と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体であり、前記シグナルペプチドがpre-αMF(sc)を含まない、前記発現構築物。
[本発明1002]
前記機能的変異体が、1つまたは2つの置換アミノ酸を含む天然pro-αMF(sc)である、本発明1001の発現構築物。
[本発明1003]
前記機能的変異体が、配列番号2である、本発明1001の発現構築物。
[本発明1004]
前記機能的変異体が、配列番号1と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1001の発現構築物。
[本発明1005]
前記シグナルペプチドが表1から選択されるか、または、表1から選択されるシグナルペプチドと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、本発明1001の発現構築物。
[本発明1006]
前記機能的変異体が、表1から選択されるシグナルペプチドと少なくとも85%、少なくとも90%同一、少なくとも95%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1005の発現構築物。
[本発明1007]
前記組み換え分泌シグナルが表2から選択されるか、または、表2から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、本発明1001の発現構築物。
[本発明1008]
前記組み換え分泌シグナルが、表2から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1001の発現構築物。
[本発明1009]
前記ポリヌクレオチド配列が、複数のコピーで存在する、本発明1001の発現構築物。
[本発明1010]
前記ポリヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、本発明1001の発現構築物。
[本発明1011]
前記プロモーターが、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)のpGCW14プロモーターである、本発明1010の発現構築物。
[本発明1012]
前記プロモーターが、ピキア・パストリスのpGAPプロモーターである、本発明1010の発現構築物。
[本発明1013]
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、本発明1010の発現構築物。
[本発明1014]
前記タンパク質が、シルクまたはシルク様タンパク質である、本発明1001の発現構築物。
[本発明1015]
前記タンパク質が、配列番号17を含む、本発明1014の発現構築物。
[本発明1016]
前記タンパク質が、配列番号17の複数のコピーを含む、本発明1014の発現構築物。
[本発明1017]
本発明1001~1016のいずれかの発現構築物を含む組み換えベクター。
[本発明1018]
前記発現構築物が、複数のコピーで存在する、本発明1017の組み換えベクター。
[本発明1019]
前記ベクターが、PARSを含む、本発明1017の組み換えベクター。
[本発明1020]
本発明1001~1016のいずれかの発現構築物を含む組み換え宿主細胞。
[本発明1021]
酵母細胞である、本発明1020の組み換え宿主細胞。
[本発明1022]
出芽酵母細胞である、本発明1021の組み換え宿主細胞。
[本発明1023]
メチロトローフ酵母細胞である、本発明1021の組み換え宿主細胞。
[本発明1024]
ピキア種である、本発明1022の組み換え宿主細胞。
[本発明1025]
ピキア・パストリスである、本発明1023の組み換え宿主細胞。
[本発明1026]
前記発現構築物が、前記組み換え宿主細胞のゲノム内に安定して組み込まれている、本発明1020の組み換え宿主細胞。
[本発明1027]
前記発現構築物が、前記組み換え宿主細胞において染色体外に維持されている、本発明1020の組み換え宿主細胞。
[本発明1028]
前記組み換え宿主細胞により産生される前記タンパク質の総収量の少なくとも30重量%の分泌収量である、前記発現構築物に含まれる前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記タンパク質を産生する、本発明1020の組み換え宿主細胞。
[本発明1029]
本発明1020~1028のいずれかの組み換え宿主細胞及び培養培地を含む、発酵。
[本発明1030]
前記組み換え宿主細胞により産生される前記発現構築物に含まれる前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記タンパク質の総収量の少なくとも30重量%を分泌タンパク質として含む、本発明1029の発酵。
[本発明1031]
前記発酵の前記培養培地が、前記発現構築物に含まれる前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記タンパク質を少なくとも0.5g/L含む、本発明1029の発酵。
[本発明1032]
タンパク質を産生するための方法であって、
(a)培養培地中で本発明1020~1028のいずれかの組み換え宿主細胞を培養して、本発明1029~1031のいずれかの発酵を得るステップ、及び
(b)前記培養培地から前記タンパク質を抽出するステップ
を含む、前記方法。
定義
別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
発現構築物、組み換えベクター、組み換え宿主細胞、及び発酵、ならびに、高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するために、そのような発現構築物、組み換えベクター、組み換え宿主細胞。及び発酵を使用する方法が、本明細書で提供される。
本明細書で提供される組み換え分泌シグナルに作動可能に連結されているタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物が本明細書で提供される。組み換え分泌シグナルは通常、タンパク質のN末端に作動可能に連結されている。
分泌されるために、タンパク質は、それを産生する細胞の細胞内分泌経路を通って運ばれる必要がある。タンパク質は、N末端分泌シグナルにより、選ぶべき細胞の行き先ではなく、この経路に向けられる。少なくとも、分泌シグナルは、シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは通常、N末端の塩基性アミノ酸及びC末端の極性アミノ酸に隣接する13~36の、主に疎水性アミノ酸で構成されている。シグナルペプチドは、サイトゾルからERの内腔への新生タンパク質の共翻訳もしくは翻訳後移行を媒介するシグナル認識粒子(SRP)または他の輸送タンパク質(例えば、SND、GET)と相互作用する。ERでは、シグナルペプチドは通常、切断され、タンパク質は、フォールディングし、翻訳後修飾を受ける。次に、タンパク質は、ERからゴルジ体に、次に、分泌小胞及び細胞外部に送達される。シグナルペプチドに加えて、本来分泌が予定される新生タンパク質のサブセットは、リーダーペプチドも含む分泌シグナルを保有する。リーダーペプチドは通常、荷電または極性アミノ酸が割り込む疎水性アミノ酸で構成されている。理論に拘束されることを望むものではないが、リーダーペプチドは、タンパク質の輸送を停滞させ、適切なフォールディングを確実にし、且つ/またはERから、リーダーペプチドが通常切断されるゴルジ体へのタンパク質の輸送を促進すると考えられている。
本明細書で提供される発現構築物に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、任意のタンパク質であってよい。
{GGY-[GPG-X1]n1-GPS-(A)n2}n3(式1)
X1=SGGQQまたはGAGQQまたはGQGPYまたはAGQQまたはSQ(式2)
Xqr=Xsqr+Xlqr(式3)、
(式中、Xqrは、2~20の数であり、Xsqrは、短い準反復の数及び1~(Xqr-1)の数であり、Xlqrは、長い準反復の数及び1~(Xqr-1)の数である)である。一部の実施形態では、Xqrは、2~20の数である。反復単位のアミノ酸配列の非限定例が表3に示される。
一部の実施形態では、発現構築物に含まれるポリヌクレオチド配列はさらに、タンパク質のC末端に作動可能に連結されているタグペプチドまたはポリペプチドをコードする。そのようなタグペプチドまたはポリペプチドは、組み換えタンパク質の精製に役立ち得る。タグペプチドまたはポリペプチドの非限定例としては、アフィニティータグ(すなわち、ある特定の薬剤またはマトリックスに結合するペプチドまたはポリペプチド)、可溶化タグ(すなわち、タンパク質の適切なフォールディングを助け、沈殿を防ぐペプチドまたはポリペプチド)、クロマトグラフィータグ(すなわち、特定の分離技術に対して異なる解像度を得るために、タンパク質のクロマトグラフィー特性を変更するペプチドまたはポリペプチド)、エピトープタグ(すなわち、抗体により結合されるペプチドまたはポリペプチド)、蛍光タグ、発色タグ、酵素基質タグ(すなわち、特定の酵素反応の基質であるペプチドまたはポリペプチド)、化学基質タグ(すなわち、特定の化学修飾の基質であるペプチドまたはポリペプチド)、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好適なアフィニティータグの非限定例としては、マルトース結合タンパク質(MBP)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、ポリ(His)タグ、SBPタグ、Strepタグ、及びカルモジュリンタグが挙げられる。好適な溶解度タグの非限定例としては、チオレドキシン(TRX)、ポリ(NANP)、MBP、及びGSTが挙げられる。クロマトグラフィータグの非限定例としては、ポリアニオン性アミノ酸(例えば、FLAGタグ)及びポリグルタミン酸タグが挙げられる。エピトープタグの非限定例としては、V5タグ、VSVタグ、Mycタグ、HAタグ、Eタグ、NEタグ、Haタグ、Mycタグ、及びFLAGタグが挙げられる。蛍光タグの非限定例としては、緑色蛍光タンパク質(GFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、シアン色蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、橙赤色蛍光タンパク質(OFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、及びそれらの誘導体が挙げられる。酵素基質タグの非限定例としては、ビオチン化に適する配列内にリジンを含むペプチドまたはポリペプチドが挙げられる(例えば、AviTag、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質[BCCP])。化学基質タグの非限定例としては、FIAsH-EDT2との反応に適する基質が挙げられる。C末端タグの組み換えタンパク質とのペプチドまたはポリペプチドの融合は、(例えば、TEVプロテアーゼ、トロンビン、第Xa因子、またはエンテロペプチダーゼにより)切断可能であるか、または切断不可能であり得る。
本明細書で提供される組み換えベクターは、本明細書で提供される発現構築物を含む。一部の実施形態では、組み換えベクターは、複数の発現構築物(例えば、2、3、4、5など)を含む。一部のそのような実施形態では、発現構築物は、同一である。他のそのような実施形態では、発現構築物のうちの少なくとも2つは、同一ではない。発現構築物のうちの少なくとも2つが同一ではない実施形態では、少なくとも2つの発現構築物は、タンパク質、組み換え分泌シグナル、プロモーター、ターミネーター、及び/またはそれらがコードする他の構成要素において互いに異なってもよい。
本明細書で提供される組み換え宿主細胞は、本明細書で提供される発現構築物を含む細胞である。組み換え宿主細胞は、哺乳動物、植物、藻類、真菌、または微生物のものとし得る。
本明細書で提供される発酵は、本明細書で提供される組み換え宿主細胞、及び組み換え宿主細胞を成長させるのに適する培養培地を含む。
高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するための方法が、本明細書で提供される。方法は一般に、別途指示のない限り、本明細書を通して引用及び考察される当該技術分野で周知の且つ種々の一般的でより具体的な参考文献に記載されるような従来の方法に従って実施される。例えば、Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989;Ausubel et al.Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,1992,and Supplements to 2002);Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1990;Taylor and Drickamer,Introduction to Glycobiology,Oxford Univ.Press,2003;Worthington Enzyme Manual,Worthington Biochemical Corp.,Freehold,N.J.;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,Vol I,CRC Press,1976;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,Vol II,CRC Press,1976;Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999を参照のこと。
種々の組み換えベクターでGS115(NRRL Y15851)のHIS+誘導体を形質転換することにより、シルク様タンパク質を分泌するピキア・パストリス(コマガタエラ・ファフィ(Komagataella phaffii))組み換え宿主細胞を生成した。
種々の組み換えベクターでGS115(NRRL Y15851)のHIS+誘導体を形質転換することにより、α-アミラーゼまたは緑色蛍光タンパク質のいずれかを分泌するピキア・パストリス(コマガタエラ・ファフィ)組み換え宿主細胞を生成した。
Claims (16)
- 発現構築物であって、組み換え分泌シグナルに作動可能に連結されているシルクまたはシルク様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記組み換え分泌シグナルがリーダーペプチド及びシグナルペプチドを含み、前記リーダーペプチドが配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を含み、前記シグナルペプチドがpre-αMF(sc)を含まない、前記発現構築物。
- 前記シグナルペプチドが表1から選択されるか、または、表1から選択されるシグナルペプチドと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を含む、請求項1に記載の発現構築物。
- 前記組み換え分泌シグナルが、表2から選択されるか、または、表2から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を含む、請求項1に記載の発現構築物。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、複数のコピーで存在する、請求項1に記載の発現構築物。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項1に記載の発現構築物。
- 前記プロモーターが、
ピキア・パストリス(Pichia pastoris)のpGCW14プロモーターである、
ピキア・パストリスのpGAPプロモーターである、または
誘導性プロモーターである、
請求項5に記載の発現構築物。 - 前記シルクまたはシルク様タンパク質が、配列番号17を含む、または配列番号17の複数のコピーを含む、請求項1に記載の発現構築物。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載の発現構築物を含む組み換えベクターであって、
前記発現構築物が、複数のコピーで存在する、または
前記ベクターが、PARSを含む、
組み換えベクター。 - 請求項1~7のいずれか1項に記載の発現構築物を含む組み換え宿主細胞。
- 酵母細胞である、請求項9に記載の組み換え宿主細胞。
- 出芽酵母細胞またはメチロトローフ酵母細胞である、請求項9に記載の組み換え宿主細胞。
- ピキア種である、またはピキア・パストリスである、請求項10に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記発現構築物が、前記組み換え宿主細胞のゲノム内に安定して組み込まれている、
前記発現構築物が、前記組み換え宿主細胞において染色体外に維持されている、または
前記組み換え宿主細胞により産生される前記タンパク質の総収量の少なくとも30重量%の分泌収量である、前記発現構築物に含まれる前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記タンパク質を産生する、
請求項9に記載の組み換え宿主細胞。 - 請求項9~13のいずれか1項に記載の組み換え宿主細胞及び培養培地を含む、組成物。
- 前記組み換え宿主細胞により産生される、前記発現構築物に含まれる前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記タンパク質の総収量の少なくとも30重量%を分泌タンパク質として含む、または、
前記培養培地が、前記発現構築物に含まれる前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記タンパク質を少なくとも0.5g/L含む、
請求項14に記載の組成物。 - タンパク質を産生するための方法であって、
(a)培養培地中で請求項9~13のいずれか1項に記載の組み換え宿主細胞を培養して、組成物を得るステップ、及び
(b)前記培養培地から前記タンパク質を抽出するステップ
を含む、前記方法。
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