JP2024506650A - 増加したタンパク質分泌のためのシグナルペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び場合により(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;及び目的のタンパク質を含む分泌シグナルを含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明はさらに、本明細書中で定義される分泌シグナル、前記核酸分子を含む発現カセット、ならびに前記核酸分子又は発現カセットを含む組換え真核宿主細胞に関する。さらに包含されるのは、真核宿主細胞において目的のタンパク質を製造する方法及び真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法である。さらに提供されるのは、真核宿主細胞からの目的の組換えタンパク質の分泌を増加させるための分泌シグナルの使用及び目的の組換えタンパク質を製造するための組換え宿主細胞の使用である。
Description
関連出願への相互参照
本出願は、2021年2月12日に出願されたEP特許出願第21 156 986.8号の優先権の利益を主張し、その内容は、全ての目的のためにその全体において参照により本明細書により組み入れられる。
発明の技術分野
本発明は、(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;ならびに場合により(ii)α接合因子(MFα)プロ配列、及び目的のタンパク質を含む分泌シグナルを含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明はさらに、本明細書中で定義される分泌シグナル、当該核酸分子を含む発現カセットならびに当該核酸分子又は発現カセットを含む組換え真核宿主細胞に関する。さらに包含されるのは、真核宿主細胞において目的のタンパク質を製造する方法及び真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法である。さらに提供されるのは、真核宿主細胞からの目的の組換えタンパク質の分泌を増加させるための分泌シグナルの使用及び目的の組換えタンパク質を製造するための組換え宿主細胞の使用である。
発明の背景
本出願は、2021年2月12日に出願されたEP特許出願第21 156 986.8号の優先権の利益を主張し、その内容は、全ての目的のためにその全体において参照により本明細書により組み入れられる。
発明の技術分野
本発明は、(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;ならびに場合により(ii)α接合因子(MFα)プロ配列、及び目的のタンパク質を含む分泌シグナルを含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明はさらに、本明細書中で定義される分泌シグナル、当該核酸分子を含む発現カセットならびに当該核酸分子又は発現カセットを含む組換え真核宿主細胞に関する。さらに包含されるのは、真核宿主細胞において目的のタンパク質を製造する方法及び真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法である。さらに提供されるのは、真核宿主細胞からの目的の組換えタンパク質の分泌を増加させるための分泌シグナルの使用及び目的の組換えタンパク質を製造するための組換え宿主細胞の使用である。
発明の背景
一般的に酵母、特にピキア・パストリス(P.パストリス、同義語:コマガタエラ・ファフィ)は、組換えタンパク質を分泌するためのポピュラーな発現システムである。分泌における最初の重要な工程は、小胞体(ER)中への組換えタンパク質の移行である。この過程は、組換えタンパク質に融合されたN末端分泌シグナルにより指示される。シグナル配列によって、従来の分泌経路上のERへの同時翻訳的な又は翻訳後の標的化経路が指定される(Ng et al., 1996)。P.パストリスにおいて最も一般に使用される分泌シグナルは、サッカロミセス・セレビシエα接合プレプロリーダー(MFα)である(Lin-Cereghino et al., 2013)。このシグナルは、S.セレビシエにおいて、最も可能性が高くは、P.パストリスにおいても翻訳後の移行を媒介する(Fitzgerald and Glick, 2014; Ng et al., 1996)。他の分泌シグナルが、継続的にレパートリーに加えられ、異なる組換えタンパク質でテストされる。
多くの哺乳類タンパク質の生合成には同時翻訳的な移行が要求され得るため、MFαシグナル配列は、実際には、最適ではない可能性があり、同時翻訳シグナル配列を使用することが好ましいであろう(Ng et al., 1996)。今日、哺乳動物抗体は、バイオ医薬品市場における主要な産物クラスとなっている(Ecker et al., 2015)。抗体は、それらの天然環境において同時翻訳的に移行することが公知である(Feige et al., 2010)。より小さな抗原結合断片(例、Fab、scFv、及びVHH)の開発に向かう傾向も明らかである(Nelson and Reichert、2009; Walsh、2014)。特に、Fab断片は時々非効率的に分泌され、従って、低い産生力価だけに達する(Looser et al., 2015; Pfeffer et al., 2011)。これは、翻訳後シグナル配列 MFαに起因し得るが、それによって、移行におけるボトルネックが起こされることが既に報告されている(Fitzgerald and Glick, 2014; Zahrl et al., 2018)。WO2018165589A2及びWO2018165594には、サッカロミセス・セレビシエから由来するMFαプロリーダー及びサッカロミセス・セレビシエから由来するMFαプレ配列以外のシグナルペプチドを含む組換え分泌シグナルが開示されている。Fitzgerald et al.(Microb Cell Fact 13, 125(2014))は、Ost1シグナル配列、それに続くMFαプロ配列からなるハイブリッド分泌シグナルを開示している。
結果的に、種々のタンパク質、例えば抗体などの分泌を増加させる分泌シグナルについての必要性が依然としてある。技術的な問題は、従って、このニーズに応えることである。
発明の概要
発明の概要
この技術的問題は、特許請求の範囲において定義される主題により解決される。本発明者らは、驚くべきことに、KRE1タンパク質(内部名称SP14)又はSWP1タンパク質(内部名称SP4)から由来するシグナルペプチド配列、シグナルペプチド又はプレ配列(全ての用語を互換的に使用することができる)を含む融合タンパク質の分泌が、場合によりα接合因子(MFα)プロ配列との組み合わせにおいて、有意に増加する。言い換えれば、本発明の分泌シグナルを含むタンパク質はより高い速度で分泌される一方で、その分泌シグナルは切断されるであろう(実施例6~8を参照のこと)。
したがって、本発明は、N末端からC末端まで以下を含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関する:
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(I)(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;
あるいは
(II)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(I)(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;
あるいは
(II)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
本発明は、N末端からC末端まで以下を含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関する:
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;及び
(b)目的のタンパク質。
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;及び
(b)目的のタンパク質。
特に、本発明は、N末端からC末端まで以下を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する:
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;及び
(b)目的のタンパク質。
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;及び
(b)目的のタンパク質。
本発明はまた、N末端からC末端まで以下を含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関する:
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(i)SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;及び
(b)目的のタンパク質。
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(i)SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;及び
(b)目的のタンパク質。
本発明はさらに、N末端からC末端まで以下を含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関する:
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
特に、本発明はさらに、N末端からC末端まで以下を含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関する:
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
本発明はさらに、N末端からC末端まで以下を含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関する:
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(i)SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(i)SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
本発明はさらに、N末端からC末端まで以下を含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関する:
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルは以下からなる:
(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルは以下からなる:
(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
特に、本発明はさらに、N末端からC末端まで以下を含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関する:
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルは以下からなる:
(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルは以下からなる:
(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
本発明はさらに、N末端からC末端まで以下を含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関する:
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルは以下からなる:
(i)SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルは以下からなる:
(i)SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
分泌シグナルによって、本明細書中で定義される核酸分子を発現するが、しかし、本明細書中で定義される分泌シグナルの代わりに野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(配列番号4など)を含む当該真核宿主細胞との比較において、真核宿主細胞からの目的の当該タンパク質の分泌が増加することが想定される。
KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号1又はその機能的ホモログを含み得る。KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号1又はその機能的ホモログからなり得る。具体的には、配列番号1の機能的ホモログは、配列番号1と少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも94%、又は少なくとも95%の配列同一性を含む。具体的には、機能的ホモログは、配列番号1と比較して、1つ、2つ、又は3つの点変異を含む。具体的には、機能的ホモログは、真核宿主細胞、例えば、真菌宿主細胞もしくは酵母宿主細胞、例えばコマガタエラ宿主細胞などにおいてシグナルペプチドの機能を有する。
SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号2もしくは52、又はその機能的ホモログを含み得る。SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号2もしくは52、又はそれらの機能的ホモログからなり得る。具体的には、配列番号2もしくは配列番号52の機能的ホモログは、配列番号2もしくは配列番号52と少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも94%、又は少なくとも95%の配列同一性を含む。具体的には、機能的ホモログは、それぞれの配列番号2もしくは配列番号52と比較して、1つ、2つ、又は3つの点変異を含む。特に、機能的ホモログは、真核宿主細胞、例えば真菌宿主細胞もしくは酵母宿主細胞、例えばコマガタエラ宿主細胞などにおいてシグナルペプチドの機能を有する。
MFαプロ配列は、配列番号3、53、もしくは74~80のいずれか1つ、又はその機能的ホモログを含み得る。MFαプロ配列は、配列番号3、53、74~80のいずれか1つ、又はその機能的ホモログ、好ましくは配列番号3もしくは53又はその機能的ホモログからなり得る。具体的には、配列番号3、53、もしくは74~80のいずれか1つの機能的ホモログは、それぞれの配列番号3、53、もしくは74~80と少なくとも80%、又は少なくとも85%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%、又は少なくとも98%の配列同一性を含む。具体的には、機能的ホモログは、それぞれの配列番号3、53、もしくは74~80と比較して、1つ、2つ、又は3つの点変異を含む。具体的には、機能的ホモログは、真核宿主細胞、例えば、真菌宿主細胞もしくは酵母宿主細胞、例えばコマガタエラ又はサッカロミセス宿主細胞などにおいてプロ配列の機能を有する。MFαプロ配列は、好ましくは、配列番号53の位置23に対応する位置にSerを、及び/又は配列番号53の位置64に対応する位置にGluを含む。
目的のタンパク質は、抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体など、又は二重特異性抗体、又は抗原結合抗体断片、例えばFabもしくはF(ab)2など、単鎖抗体、例えばscFvなど、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科動物のVHH断片又は重鎖抗体又はドメイン抗体(dAb)など、人工抗原結合分子、例えばDARPINなど、ibody、アフィボディ、ヒューマボディ、又はリポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、酵素、例えばプロセス酵素など、サイトカイン、成長因子、ホルモン、タンパク質抗生物質、融合タンパク質、例えば毒素融合タンパク質など、構造タンパク質、調節タンパク質、及びワクチン抗原からなる群より選択され、好ましくは、目的のタンパク質は、治療用タンパク質、食品添加物、又は飼料添加物である。
別の態様では、本発明は、本明細書中で定義される分泌シグナルに関する。特に、本発明は、(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び(ii)α接合因子(MFα)プロ配列を含む分泌シグナルに関する。より具体的には、本発明は、(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列及び(ii)α接合因子(MFα)プロ配列を含む分泌シグナルに関する。より具体的には、本発明は、(i)SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び(ii)α接合因子(MFα)プロ配列を含む分泌シグナルに関する。本発明は、さらに具体的には、KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列を含む分泌シグナルに関する。さらに具体的には、本発明は、SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列を含む分泌シグナルに関する。本発明は、さらに具体的には、KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列からなる分泌シグナルに関する。さらに具体的には、本発明は、SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列からなる分泌シグナルに関する。
さらに別の態様では、本発明はさらに、本発明の核酸分子及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットに関する。発現カセットは、ベクター、好ましくは発現ベクター中に含まれてもよく、染色体、特に人工染色体内に組み込まれてもよい。
別の態様では、本発明はさらに、本発明の核酸分子、本発明のベクター、又は本発明の発現カセットを含む組換え真核宿主細胞を提供する。そのような核酸分子又は発現カセットで操作された組換え真核宿主細胞が、それぞれの核酸分子、ベクター、又は発現カセットを組み入れるように遺伝的に操作されることが本明細書中で理解される。組換え真核宿主細胞は、宿主細胞ゲノム内にそのような核酸分子、ベクター、又は発現カセットを含むように遺伝的に操作され得る。
組換え真核宿主細胞は、真菌宿主細胞もしくは酵母宿主細胞、好ましくはコマガタエラ・ファフィ(ピキア・パストリス)、ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニ、コマガタエラ属、及びシゾサッカロミセス・ポンベからなる群より選択される酵母宿主細胞、又はトリコデルマ・リーゼイもしくはアスペルギルス・ニガーから選択される真菌宿主細胞であり得る。
宿主細胞は、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように操作されてもよい。
本発明はさらに、本発明の核酸分子を発現し、分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌する条件下で本発明の宿主細胞を培養し、ならびに宿主細胞培養物から目的のタンパク質を単離し、及び場合により目的のタンパク質を精製し、及び場合により修飾し、及び場合により製剤化することにより、目的のタンパク質を産生する方法に関する。
別の態様では、本発明はさらに、真核宿主細胞において目的のタンパク質を製造する方法であって、以下を含む:
(i)本発明の核酸分子を用いて、又は本発明の発現カセットもしくはベクターを用いて真核宿主細胞を遺伝的に操作し、及び場合により、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように真核宿主細胞を遺伝的に操作すること;
(ii)核酸分子及び場合によりSRPの1つ又は複数の成分を発現し、分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌する条件下で遺伝的に操作された宿主細胞を培養すること、
(iii)場合により細胞培養物から目的のタンパク質を単離すること、
(iv)場合により目的のタンパク質を精製すること、
(v)場合により目的のタンパク質を修飾すること、及び
(vi)場合により目的のタンパク質を製剤化すること。
(i)本発明の核酸分子を用いて、又は本発明の発現カセットもしくはベクターを用いて真核宿主細胞を遺伝的に操作し、及び場合により、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように真核宿主細胞を遺伝的に操作すること;
(ii)核酸分子及び場合によりSRPの1つ又は複数の成分を発現し、分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌する条件下で遺伝的に操作された宿主細胞を培養すること、
(iii)場合により細胞培養物から目的のタンパク質を単離すること、
(iv)場合により目的のタンパク質を精製すること、
(v)場合により目的のタンパク質を修飾すること、及び
(vi)場合により目的のタンパク質を製剤化すること。
さらに別の態様では、本発明はさらに、真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法に関し、当該真核宿主細胞において本発明の核酸分子を発現させること、及び場合により真核宿主細胞を操作して、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現させ、それにより、本発明の核酸分子を発現するが、しかし、本明細書中に記載される分泌シグナルの代わりに野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(例えば配列番号4など)を含む当該宿主細胞との比較において、当該目的のタンパク質の分泌を増加させることを含む。
真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法は、加えて、以下を含み得る:
(i)本発明の核酸分子を発現する発現構築物を組み入れるように前記宿主細胞を操作し、及び場合によりシグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように宿主細胞を遺伝的に操作すること;
(ii)当該核酸分子を発現し、及び場合によりSRPの1つ又は複数の成分を過剰発現し、分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌する条件下で宿主細胞を培養すること、
(iii)場合により細胞培養物から目的のタンパク質を単離すること、
(iv)場合により目的のタンパク質を精製すること、
(v)場合により目的のタンパク質を修飾すること、及び
(vi)場合により目的のタンパク質を製剤化すること。
(i)本発明の核酸分子を発現する発現構築物を組み入れるように前記宿主細胞を操作し、及び場合によりシグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように宿主細胞を遺伝的に操作すること;
(ii)当該核酸分子を発現し、及び場合によりSRPの1つ又は複数の成分を過剰発現し、分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌する条件下で宿主細胞を培養すること、
(iii)場合により細胞培養物から目的のタンパク質を単離すること、
(iv)場合により目的のタンパク質を精製すること、
(v)場合により目的のタンパク質を修飾すること、及び
(vi)場合により目的のタンパク質を製剤化すること。
本発明の核酸分子は、前記宿主細胞の染色体中に組み込まれていてもよく、あるいは発現カセット、ベクター、もしくはプラスミド中に含まれてもよく、それは、当該宿主細胞の染色体中に組み込まれない。
別の態様では、本発明はさらに、真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させるための、本明細書中に記載される分泌シグナルの使用に関する(例、本発明の核酸分子の一部として、又はその中)。分泌シグナルが、本発明により定義される分泌シグナルの代わりに、野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(例えば配列番号4など)を含む、本明細書中に記載される融合タンパク質を発現する当該真核宿主細胞との比較において、真核宿主細胞からの当該目的のタンパク質の分泌をさらに増加させる。
さらに別の態様では、本発明は、目的のタンパク質を製造するための、本発明の組換え宿主細胞の使用に関する。
本発明は、非限定的な実施例及び添付の図面と併せて考慮した場合に、詳細な説明を参照して、よりよく理解されるであろう。図面は以下を示す
本発明を以下に詳細に説明し、また、添付の実施例及び図面により例証する。
本発明者らは、驚くべきことに、KRE1(また、本明細書中でSP14として命名される)又はSWP1(また、本明細書中でSP4として命名される)のシグナルペプチド(以下におけるシグナルペプチド配列)を含む融合タンパク質の分泌及び収量が、特に、プロ配列、例えばα接合因子のプロ配列などと組み合わされて、それにより本発明の分泌シグナルが形成される場合に有意に増加する一方で(実施例6~8を参照のこと)、他のシグナルペプチド又は組み合わせによって、目的のタンパク質の分泌は改善されないことを見出した。本発明に従った分泌シグナルを含む融合タンパク質は、このように、より効率的に分泌される。本発明者らはさらに、シグナル認識粒子(SRP)のタンパク質を加えて過剰発現させることにより、目的のタンパク質の分泌及び収量がさらに増加することを見出した(実施例6~8を参照のこと)。
本明細書中で上に概説されるように、本発明の分泌シグナル及び目的のタンパク質を含む融合タンパク質は、本明細書中で定義される分泌シグナルの代わりに、野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナルを含む、本明細書中で定義される融合タンパク質を発現する真核宿主細胞と比較した場合に、組換え宿主細胞によりより効率的に分泌され、即ち、本発明の融合タンパク質中に含まれる目的のタンパク質は分泌される一方で、分泌シグナルは分泌中に切断される。したがって、本発明は、驚くべきことに、N末端からC末端まで、(a)分泌シグナル、(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び(ii)場合によって、α接合因子(MFα)プロ配列を含む分泌シグナル;ならびに(b)目的のタンパク質を含む融合タンパク質は、優れた特性、例えば、目的のタンパク質の分泌増加を提供することを実証する(実施例6~8を参照のこと)。
表現「N末端からC末端まで」は、分泌シグナル、シグナルペプチド配列及びα接合因子(MFα)プロ配列を含む、ならびに目的のタンパク質が、1つ又は複数のアミノ酸により分離されていることを必ずしも除外しない。これらの1つ又は複数のアミノ酸は、リンカー又はリンカー配列であり得る。「リンカー配列」(また、「スペーサー配列」又は「リンカー」として言及される)は、本明細書中で定義される分泌シグナル及び本明細書中で定義される目的のタンパク質の間に導入されるアミノ酸配列である。「リンカー配列」はまた、シグナルペプチド配列とα接合因子(MFα)プロ配列の間、及び/又はα接合因子(MFα)プロ配列と目的のタンパク質の間に導入されるアミノ酸配列であり得る。好ましくは、しかし、シグナルペプチド配列とα接合因子(MFα)プロ配列の間にリンカーはない。可能なリンカー配列の大きな多様性があり、例えば、本発明のポリペプチドのサイズ、配列、及び物理的特性(例えば疎水性など)に基づいて適切なリンカー配列を選ぶことは当業者の知識の範囲内である。リンカー配列は、グリシン及びセリンのような柔軟な残基、又はアラニン-プロリンリピートのようなかなり硬い残基で構成されることができる。最大限の柔軟性を確保するために、リンカー配列が二次構造(例えばαヘリックス構造又はβシートなど)を採用しないことが好ましいであろう。リンカー配列は、特定のプロテアーゼにより、例えば、ズブチリシン/ケキシン様プロタンパク質転換酵素(PC)ファミリーのメンバーにより認識されるような、プロテアーゼ切断部位であり得る。本明細書中で使用される用語「リンカー配列」又は「リンカー」は、連結されているエレメントの機能に干渉しない任意のアミノ酸配列を指す。リンカーは、例えば、ヌクレオチド配列、又はアミノ酸配列を接続し得る。リンカーを使用して、適した量の柔軟性を操作してもよい。好ましくは、リンカーは短く、例えば、1~20ヌクレオチド又はアミノ酸、又はさらにそれ以上であり、典型的には柔軟性がある。一般に使用されるアミノ酸リンカーは、任意の順番において、多数のグリシン、セリン、及び、場合によりアラニンからなる。そのようなリンカーは、通常、必要な場合、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、又は20のアミノ酸の少なくともいずれか1つの長さを有する。好ましくは、本明細書中で使用されるリンカーは、1~12のアミノ酸残基を含み、好ましくは、それは、5までのアミノ酸からなる短いリンカーである。好ましくは、本明細書中で使用されるリンカーは、GS、GGSGG、GSAGSAAGSG、(GS)n(「n」は1~10の間の任意の数である)、GSGSGSG、GSGもしくはGGGGS(「G4S」)リンカー、又はそれらの任意の組み合わせのいずれか1つである。一部の実施形態では、リンカーは、モチーフ、例えばGS、GSG、又はG4Sなどの1つ又は複数の単位、リピート、又はコピーを含む。
あるいは又は加えて、融合タンパク質は、MFαプロ配列と目的のタンパク質の間に切断部位を含み得る。融合タンパク質はまた、以下に記載されるように、例えば、タグの切断のための1つ又は複数のさらなる切断部位を含み得る。切断部位は、特定のプロテアーゼにより認識されるようなプロテアーゼ切断部位であり得る。このように、用語「プロテアーゼ切断部位」は、プロテアーゼにより特異的に認識されるアミノ酸配列である特定のプロテアーゼの認識部位、及び切断が起こる、タンパク質の2つのアミノ酸間の部位を含む。プロテアーゼは、TEV(タバコエッチウイルス)プロテアーゼ、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、ペプシン、好中球エラスターゼ、プロテイナーゼK、サーモリシン、トロンビン、及びトリプシンからなる群より選択され得る。切断が特定のプロテアーゼにより起こる部位は、好ましくは、本明細書中で定義される目的のタンパク質のN末端アミノ酸と、本明細書中で定義されるN末端融合タグの又はN末端融合α接合因子(MFα)プロ配列のC末端アミノ酸との間、あるいは本明細書中で定義される目的のタンパク質のC末端アミノ酸と、C末端融合タグの又はC末端融合α接合因子(MFα)プロ配列のN末端アミノ酸との間である。認識部位は、切断が、本明細書中で定義される目的のタンパク質(POI)の外側(タグ内)で起こるそれぞれの部位に隣接することができる。より詳細には、タグの切断のために有用なプロテアーゼは、好ましくは、第Xa因子のようなエンドペプチダーゼ、トロンビン、TEV(タバコエッチウイルスプロテアーゼ)、システイニルアスパラギン酸特異的プロテアーゼ(カスパーゼ)、及びエンテロキナーゼからなる群より選択される。このように、使用される認識部位は、第Xa因子、トロンビン、TEV(タバコエッチウイルスプロテアーゼ)、システイニルアスパラギン酸特異的プロテアーゼ(カスパーゼ)、及びエンテロキナーゼ認識部位からなる群より選択することができるが、しかし、また、公知のプロテアーゼについての任意の他のプロテアーゼ切断部位が、タンパク質からのタグの切断のために有用である。カスパーゼ2についての好ましい切断部位は、VDVADである。
実施例において示されるように、分泌シグナルによって、融合タンパク質、より正確には、分泌シグナルが切断された目的のタンパク質の、真核宿主細胞からの分泌が、本発明の状況内で、本明細書中に記載される分泌シグナルの代わりに、野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(例えば配列番号4など)を含む融合タンパク質を発現する真核宿主細胞との比較において増加する。このように、野生型S.セレビシエのMFα分泌シグナル(配列番号4)は、比較のための対照又は参照として使用され得る。
本発明に従って、本発明の核酸、及び、場合により、また、SRPの1つ又は複数の成分によりコードされる融合タンパク質の一部としての目的のタンパク質の(過剰)発現に起因して、目的のタンパク質(POI、分泌シグナル及び分泌自体の切断後)が、バイオマスが低く保たれている場合でも、高収量において入手可能である。このように、高い収量が、POImg/g乾燥バイオマスで測定され、実験室、パイロット、及び工業規模では、1~200、例えば50~200など、例えば100~200などの範囲中であり得る。本明細書中で使用される「分泌増加」は、対照との比較において、宿主細胞の上清又は培養培地中での、より多量の検出可能な目的のタンパク質に関連する;両方とも、同一の条件(例、宿主細胞種、培養培地、培養時間、培養温度、供給及び誘導戦略)下で培養された。対照は同じ宿主細胞であり得るが、しかし、同じ宿主細胞において目的のタンパク質は、本発明の分泌シグナルの代わりに配列番号4において描写されるようなMFα分泌シグナルを含む融合タンパク質として発現される。この増加は、分泌の倍率変化(FC)、例えば、少なくとも1.1倍、少なくとも1.2倍、少なくとも1.3倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.5倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.7倍、少なくとも1.8倍、少なくとも1.9倍、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、又は少なくとも10倍だけの増加で表現することができる。宿主細胞の上清又は培養培地中の検出可能な目的のタンパク質の量は、[目的のタンパク質のg/細胞培養液L]の容積力価として、又は[目的のタンパク質mg/乾燥細胞重量g]の収量もしくは同様のものとして表現することができる。分泌の倍率変化は次に、宿主細胞の培養の容積力価又は収量と、対照の培養の容積力価又は収量の比率である。
融合タンパク質、又は目的のタンパク質は、1つ又は複数の(検出可能な)タグ、1つ又は複数のプロテアーゼ切断部位、及び/又は1つ又は複数のリンカーを、例えば融合タンパク質の特定のエレメント(例、分泌シグナル、シグナルペプチド配列、α接合因子(MFα)プロ配列、又は目的のタンパク質より選択される)の間で及びそれらを接続するなど、及び/又はエレメントの任意の1つの部分として、特に、目的のタンパク質の部分としてさらに含み得る。例えば、リンカーは、目的のタンパク質、タグ、及び/又は切断部位の間に位置付けられ得る。このように、本発明の融合タンパク質が、N末端からC末端まで、本明細書中で定義される分泌シグナル、また、本明細書中で定義される目的のタンパク質からなる場合、そのような目的のタンパク質は、場合により、1つ又は複数の(検出可能な)タグ、1つ又は複数のプロテアーゼ切断部位、ならびに/あるいは 1つ又は複数のリンカーをさらに含み得る。言い換えれば、本明細書中で定義される1つ又は複数のタグ、1つ又は複数の切断部位、ならびに/あるいは1つ又は複数のリンカーがまた、そのような目的のタンパク質にN又はC末端で融合され得るが、このように、また、本発明の融合タンパク質が、N末端からC末端まで、分泌シグナルから、及び本発明により本明細書中に記載されるような目的の当該タンパク質からなる場合には、本発明の当該タンパク質により構成されている。この状況において、そのような目的のタンパク質にN末端又はC末端で融合されたそのような1つ又は複数のタグ、1つ又は複数の切断部位、ならびに/あるいは1つ又は複数のリンカーは、そのような目的のタンパク質の一部であり得る。また、本発明の融合タンパク質が、N末端からC末端まで、本明細書中で定義される分泌シグナルと、同様に本明細書中で定義される目的のタンパク質とからなる場合、本明細書中で定義される分泌シグナルは、場合により、1つ又は複数の(検出可能な)タグ、1つ又は複数のプロテアーゼ切断部位、及び/又は1つ又は複数のリンカーをさらに含む。この状況において、そのような1つ又は複数のタグ、1つ又は複数のプロテアーゼ切断部位、及び/又は1つ又は複数のリンカーは、そのような分泌シグナルのN末端又はC末端のいずれかに、又は本明細書中で定義されるそれぞれのシグナルペプチド配列に、又は本明細書中で定義されるα接合因子(MFα)プロ配列に融合され、次に、そのような分泌シグナルの一部であり得る。
リンカーは、例えば、段落[38]において定義されている。(検出可能な)タグは、目的のタンパク質の精製のために、ならびに/あるいは発現及び/又は溶解性又は検出を増強するために使用されるタグであり得る。当業者に公知である、多くの精製タグ、発現増強タグ、溶解性増強タグならびに目的のタンパク質の容易な検出及び定量を可能にするタグがある。「精製タグ」(また、「親和性タグ」と呼ばれる)は、例えば、それが付着しているタンパク質(例、そのN末端に親和性タグを含む目的のタンパク質)の精製のために使用することができるアミノ酸配列である。このタグは、クロマトグラフィー樹脂などの固体支持体の適したリガンドに、又は直接的に樹脂に高い親和性を有する。精製タグを含む目的のタンパク質を、特定の樹脂に選択的に結合させることにより、目的のタンパク質を、1つのクロマトグラフィー工程だけにより高度に効果的に精製することができる。精製タグは当業者に公知であり、タンパク質精製タグ、好ましくはGSTタグ、FLAGタグ、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、例えば6Hisタグなど、MBPタグ、Sタグ、インフルエンザウイルスHAタグ、チオレドキシンタグ、又はブドウ球菌プロテインAタグなどであり得る。より詳細には、本明細書中で使用される精製タグ配列は、ヒスチジン(His)タグ、好ましくはポリヒスチジンタグ、例えばヘキサヒスチジン(6His)タグなど;アルギニンタグ、好ましくはポリアルギニンタグ、抗体についてのペプチド基質、キチン結合ドメイン、RNAse Sペプチド、プロテインA、S-ガラクトシダーゼ、FLAGタグ、Strep IIタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド(SBP)タグ、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、Sタグ、HAタグ、c-Mycタグ、又は融合されたタンパク質の効率的な精製のために有用であることが公知である任意の他のタグのいずれか1つである。具体的には、融合タンパク質、特にポリヒスチジンタグ又はヘキサヒスチジンタグ(Hisタグ)を含む目的のタンパク質は、好ましくはNi-NTAクロマトグラフィー材料を使用して、IMACにより捕捉及び精製することができる。本発明の好ましい一実施形態では、ポリヒスチジンタグ、又はヘキサヒスチジンタグ(Hisタグ)、さらにより好ましくは6-Hisタグが、融合タンパク質により含まれる、又は本明細書中で上に定義される目的のタンパク質により含まれ、本明細書中で適用される。また、当業者に公知の対応するプロテアーゼを使用して宿主細胞からの目的のタンパク質の発現及び/又は分泌後、目的のタンパク質からタグを切断するために使用することができる多くのプロテアーゼ切断部位がある。「発現及び/又は溶解性増強タグ」を、本明細書中で定義されるように、目的のタンパク質のC末端又はN末端に融合することができる。発現及び/又は溶解性増強タグは、宿主細胞、例えば、原核細胞又は真核細胞、細菌細胞又は酵母細胞、例えば、大腸菌、例えばピキア・パストリスにおいて発現される場合、目的のタンパク質の発現及び/又は力価及び/又は溶解性及び/又は可溶性発現及び/又は可溶性力価を増加させることができ、発現及び/又は溶解性増強タグを用いない目的のタンパク質の発現と比較して、有意には、例えば、サイトゾル、ペリプラズマ中で発現される、又は宿主細胞から分泌される。本明細書中で使用される発現及び/又は溶解性増強タグ配列は、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、ポリArg、ポリLys、G B1ドメイン、プロテインD、ブドウ球菌プロテインAのZドメイン、及びチオレドキシン又は、例えば、宿主細胞における発現中に、それが融合されたタンパク質の発現及び/又は溶解性を改善することが公知である任意の他のタグからなる群より選択することができる。発現及び/又は溶解性増強タグは、バクテリオファージ遺伝子、例えば、US 8,535,908 B2において列挙されているものなどの高度に荷電したペプチドに基づくことができる。好ましくは、溶解性促進タグは、T7C、T7B、T7B1、T7B2、T7B3、T7B3、T7B4、T7B5、T7B6、T7B6、T7B7、T7B8、T7B9、T7B10、T7B11、T7B12、T7B13、T7A、T7A1、T7A2、T7A3、T7A4、T7A5、T7AC T3、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、ポリArg、ポリLys、G B1ドメイン、プロテインD、ブドウ球菌プロテインAのZドメイン、DsbA、DsbC、及びチオレドキシン、ならびにいくつかのアミノ酸、例えば1、2、3、又はそれ以上などの置換により得られるそれらの変異体からなる群より選択される。本発明の好ましい一実施形態では、融合タンパク質により含まれる、又は本明細書中で上に定義される目的のタンパク質により含まれるT7AC溶解性タグが、本明細書中で適用される。「目的のタンパク質の容易な検出及び定量を可能にするタグ」は、本明細書中で定義されるように、目的のタンパク質のC末端又はN末端に融合することができるタグである。それは、産生過程を通じて目的のタンパク質を検出、定量、分析するために使用することができるタグである(例、発酵ブロス中の目的のタンパク質の力価又は製造過程を通じた異なる溶液中のPOIの含量の測定、例えば、クロマトグラフィーの溶出液、細胞ホモジネート、フィルター残留物又は濾液などにおいて、例えば、分光学的もしくは蛍光分析もしくは他の方法により直接的にインライン、インサイチュ、オンライン、又はアットラインで、あるいは最先端の方法によりオフラインで)。それにより、タグによって、例えば、蛍光、UV-VIS吸光度、ならびに当技術分野において公知のオンライン、インライン、アトライン、又はインサイチュ定量方法のために使用される他の分光方法又は蛍光定量方法のために有用な他の吸光度のようなPOI特徴が与えられる。タグはまた、親和性タグ、又は定量的親和性クロマトグラフィー、例えば、オフライン測定としての親和性HPLC又はELISAのようなイムノアッセイのために使用することができる他のタグであることができる。例えば、目的のタンパク質の容易な検出及び定量を可能にするタグの一例としてのモニタリングタグは、m-Cherry、GFP、もしくはfアクチンのいずれか1つ、又はUV、IR、ラマン、蛍光などの単純なインサイチュ、インラインオンライン、もしくはアトライン検出器による発酵、単離、及び精製を含む、目的のタンパク質の産生中での目的のタンパク質の検出もしくは定量のために有用な任意の他のタグである。目的のタンパク質の容易な検出及び定量を可能にするタグの別の例としての検出タグは、また、定量的HPLC又はELISAにおける使用のためのプロテインAタグ、S-ガラクトシダーゼタグ、FLAGタグ、Strepタグ、又はストレプトアビジン結合ペプチド(SBP)タグもしくはStrep IIタグであることができる。
本発明の一実施形態では、本明細書中で定義される分泌シグナルを含み(例えば、KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列を含み、場合により、α接合因子(MFα)プロ配列を含み)、ならびに本明細書中で定義される目的のタンパク質を含む融合タンパク質は、また、溶解性増強タグ、さらにより好ましくはT7AC、及び/又は精製タグ、さらにより好ましくは6Hisタグ、及び/又はカスパーゼについての、好ましくはカスパーゼ-2、例えばVDVADなどについてのプロテアーゼ切断部位を含み、好ましくは、本明細書中で定義される溶解性増強タグ及び/又は本明細書中で定義される精製タグ及び/又は本明細書中で定義されるプロテアーゼ切断部位は、本明細書中で定義される目的のタンパク質にN末端で融合されている。詳細には、本発明の一実施形態では、融合タンパク質は、KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列及びα接合因子(MFα)プロ配列を含む分泌シグナルを含み、ならびに本明細書中で定義される目的のタンパク質を含む融合タンパク質は、また、溶解性増強タグ、さらにより好ましくはT7AC、及び/又は精製タグ、さらにより好ましくは6Hisタグ、及び/又はカスパーゼ、好ましくはカスパーゼ-2、例えばVDVADなどについてのプロテアーゼ切断部位も含み、好ましくは、本明細書中で定義される溶解性増強タグ及び/又は本明細書中で定義される精製タグ及び/又は本明細書中で定義されるプロテアーゼ切断部位は、本明細書中で定義される目的のタンパク質にN末端で融合されている。詳細には、本発明の別の実施形態では、SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列及びα接合因子(MFα)プロ配列を含む分泌シグナルを含み、ならびに本明細書中で定義される目的のタンパク質を含む融合タンパク質は、また、溶解性増強タグ、さらにより好ましくはT7AC、及び/又は精製タグ、さらにより好ましくは6Hisタグ、及び/又はカスパーゼについての、好ましくはカスパーゼ-2、例えばVDVADなどについてのプロテアーゼ切断部位を含み、好ましくは、本明細書中で定義される溶解性増強タグ及び/又は本明細書中で定義される精製タグ及び/又は本明細書中で定義されるプロテアーゼ切断部位は、本明細書中で定義される目的のタンパク質にN末端で融合されている。本発明の好ましい実施形態では、本明細書中で定義される分泌シグナルを含み(例えば、KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列を含み、α接合因子(MFα)プロ配列を含み)、ならびに本明細書中で定義される目的のタンパク質を含む融合タンパク質は、また、溶解性増強タグT7AC及び6His精製タグ及びプロテアーゼ切断部位VDVADを含み、さらにより好ましくは、溶解性増強タグT7AC及び6His精製タグ及びプロテアーゼ切断部位VDVADは、本明細書中で定義される目的のタンパク質のN末端に融合されている。本発明の融合タンパク質が、N末端からC末端まで、本明細書中で定義される分泌シグナル(例えば、KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列を含み、場合により、α接合因子(MFα)プロ配列を含み)から、及び、また、本明細書中で定義される目的のタンパク質からなり、そのような目的のタンパク質は、場合により、溶解性増強タグ、さらにより好ましくはT7AC、及び/又は精製タグ、さらにより好ましくは6Hisタグ、及び/又はカスパーゼについての、好ましくはカスパーゼ-2、例えばVDVADなどについてのプロテアーゼ切断部位を含み、好ましくは、本明細書中で定義される溶解性増強タグ及び/又は本明細書中で定義される精製タグ及び/又は本明細書中で定義されるプロテアーゼ切断部位は、本明細書中で定義される目的のタンパク質にN末端で融合されている。この状況において、そのようなタグ及び/又は切断部位は、目的のタンパク質の一部である。好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質が、N末端からC末端まで、KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列及びα接合因子(MFα)プロ配列を含む分泌シグナルから、ならびに本明細書中で定義される目的のタンパク質からなり、そのような目的のタンパク質はまた、溶解性増強タグT7AC及び6His精製タグ及びプロテアーゼ切断部位VDVADを含み、さらにより好ましくは、溶解性増強タグT7AC及び6His精製タグ及びプロテアーゼ切断部位VDVADは、本明細書中で定義される目的のタンパク質にN末端で融合されている。別の好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質が、N末端からC末端まで、SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列及びα接合因子(MFα)プロ配列を含む分泌シグナルから、ならびに、また、本明細書中で定義される目的のタンパク質からなる場合、そのような目的のタンパク質はまた、溶解性増強タグT7AC及び6His精製タグ及びプロテアーゼ切断部位VDVADを含み、さらにより好ましくは、溶解性増強タグT7AC及び6His精製タグ及びプロテアーゼ切断部位VDVADは、本明細書中で定義される目的のタンパク質にN末端で融合されている。再び、この状況において、そのようなT7AC及び6Hisタグ及び当該VDVAD切断部位は、目的のタンパク質の一部である。
分泌シグナル
分泌シグナル
分泌されるためには、タンパク質は、それを産生する細胞の細胞内分泌経路を通じて移動しなければならない。このタンパク質は、N末端分泌シグナルを介して、代わりの細胞の目的地よりむしろ、この経路に向けられる。最小限、分泌シグナルはシグナルペプチド配列を含む。シグナルペプチド配列は、典型的には、N末端の塩基性アミノ酸及びC末端の極性アミノ酸により隣接された13~36のほとんど疎水性のアミノ酸からなる。シグナルペプチド配列は、細胞質ゾルからERの内腔中への新生タンパク質の同時翻訳的な又は翻訳後の移行を媒介するシグナル認識粒子(SRP)又は他の輸送タンパク質(例、SND、GET)と相互作用することができる。ERでは、シグナルペプチド配列が典型的には切断され、タンパク質が折り畳まれて、翻訳後修飾を受ける。タンパク質は次に、ERからゴルジ装置に、次に分泌小胞及び細胞の外側に送達される。シグナルペプチド配列に加えて、天然で分泌される運命にある新生タンパク質のサブセットは、リーダーペプチド、例えばα接合因子プロ配列なども含む分泌シグナルを保有する。リーダーペプチドは、典型的には、荷電アミノ酸又は極性アミノ酸により中断された疎水性アミノ酸からなる。理論により縛られることを望まないが、リーダーペプチドは輸送を遅らせ、タンパク質の適当な折り畳みを確実にし、及び/又はERからゴルジ装置へのタンパク質の輸送を促進して、そこでリーダーペプチドは、典型的には、切断されると考えられている。本明細書中で使用される「KRE1又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列」は、アミノ酸配列、即ち、シグナルペプチド配列を記載し、それは、本明細書中で定義されるKRE1タンパク質又は本明細書中で定義されるSWP1タンパク質中に存在する。シグナルペプチド配列を含む分泌シグナルは通常、分泌中に切断されるため、本明細書中に記載されるシグナルペプチド配列は、分泌前及び/又はシグナルペプチド配列の切断前にKRE1タンパク質又はSWP1から由来する。「から由来する(originating from)」は「から由来する(derived from)」と互換的に使用してもよい。
KRE1は、キラー毒素耐性タンパク質1としても公知であり、分泌される酵母のタンパク質である。KRE1は、細胞壁1,6-ベータ-グルカン合成及び組立の後期段階に含まれ得る。それは、恐らくは、1,6-β-グルカンと、他の細胞壁成分、例えば1,3-β-グルカン、キチン、特定のマンノプロテインなどを共有結合的に架橋させる際に含まれることにより、細胞壁1,6-β-グルカンの集合体及び構造内で、酵素的よりむしろ、構造的な機能を有する。それは、さらに、酵母K1ウイルス毒素の原形質膜受容体として機能する。そのようなものとして、それは、シグナルペプチド配列を保有する。KRE1は、任意の真核生物種から、特に任意の酵母からであり得る。例示的な酵母は、限定されないが、コマガタエラ・ファフィ(ピキア・パストリス)、ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・パラドクサス、サッカロミセス・ユーバヤヌス、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィ、サッカロミセス・クルイベリ、サッカロミセス・ウヴァルム、クルイベロミセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニ、コマガタエラ属、及びシゾサッカロミセス・ポンベを含む。KRE1はまた、トリコデルマ・リーゼイ又はアスペルギルス・ニガーからであり得る。好ましくは、KRE1はK.ファフィからである。KRE1から由来するシグナルペプチド配列は、全長KRE1タンパク質(特に、KRE1タンパク質をコードするmRNAから翻訳されたシグナルペプチドを含むタンパク質)、例えばK.ファフィからのKRE1タンパク質などの最初の18アミノ酸又はその機能的ホモログを含む、又はそれらからなり得る。好ましい実施形態では、KRE1タンパク質は、UniProtデータベースエントリF2QWV3、2011年5月31日の配列バージョン1(染色体位置PP7435_Chr3-0933)又はその機能的ホモログに対応し、シグナルペプチド配列は、好ましくは、配列番号1においても描写されている当該データベースエントリのアミノ酸1~18に対応する。したがって、KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号1又はその機能的ホモログを含む、又はそれからなり得る。KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号1又はその機能的ホモログからなり得る。KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号1と80%、85%、90%、94%、又は95%の配列同一性の少なくともいずれか1つを含み得るが、それは、本明細書中で定義されるその機能的ホモログを指し得る。KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を含み得る。KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号1と少なくとも94%の配列同一性を含み得る。KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号1と少なくとも95%の配列同一性を含み得る。
SWP1は、ドリチル二リン酸オリゴ糖-タンパク質グリコシルトランスフェラーゼサブユニットSWP1としても公知であり、タンパク質のN-グリコシル化の最初の工程である、新生ポリペプチド鎖中のAsn-X-Ser/Thrコンセンサスモチーフ内での、脂質担体ドリコールピロリン酸からアスパラギン残基への定義されたグリカン(真核生物においてGlc3Man9GlcNAc2)の初期転移を触媒するオリゴ糖転移酵素(OST)複合体のサブユニットである。また、SWP1はシグナルペプチド配列を保有する。SWP1は、任意の真核生物種から、特に任意の酵母からであり得る。例示的な酵母は、限定されないが、コマガタエラ・ファフィ(ピキア・パストリス)、ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・パラドクサス、サッカロミセス・ユーバヤヌス、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィ、サッカロミセス・クルイベリ、サッカロミセス・ウヴァルム、クルイベロミセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニ、コマガタエラ属、コマガタエラ・パストリス、及びシゾサッカロミセス・ポンベを含む。SWP1はまた、トリコデルマ・リーゼイ又はアスペルギルス・ニガーからであり得る。好ましくは、SWP1はK.ファフィからである。SWP1から由来するシグナルペプチド配列は、全長SWP1(特に、SWP1タンパク質をコードするmRNAから翻訳されたシグナルペプチドを含むタンパク質)タンパク質、例えばK.ファフィからのSWP1タンパク質又はその機能的ホモログなどの最初の18アミノ酸を含む、又はそれからなり得る。好ましい実施形態では、SWP1タンパク質は、UniProtデータベースエントリF2QNI3、2011年5月31日の配列バージョン1(遺伝子PP7435_Chr1-0255)又はその機能的ホモログに対応し、シグナルペプチド配列は、好ましくは、配列番号2においても描写される、当該データベースエントリのアミノ酸1~18に対応する。したがって、SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号2又はその機能的ホモログを含む、又はそれからなり得る。SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号2又はその機能的ホモログからなり得る。SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号2と80%、85%、90%、94%、又は95%の配列同一性の少なくともいずれか1つを含み得るが、それは、本明細書中で定義されるその機能的ホモログを指し得る。SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を含み得る。SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号2と少なくとも94%の配列同一性を含み得る。SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号2と少なくとも95%の配列同一性を含み得る。好ましくは、SWP1はK.パストリスからである。したがって、SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号52又はその機能的ホモログを含み得る。SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号52又はその機能的ホモログからなり得る。SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号52と80%、85%、90%、94%、又は95%の配列同一性の少なくともいずれか1つを含み得るが、それは、本明細書中で定義されるその機能的ホモログを指し得る。SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号52と少なくとも90%の配列同一性を含み得る。SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列は、配列番号52と少なくとも95%の配列同一性を含み得る。
α接合因子(MFα)は、接合因子アルファ-1、アルファ-1交配フェロモン、又は接合因子アルファとしても公知であり、ホルモンであり、活性因子(分泌シグナルを伴わないMFα)が、α接合型の半数体細胞により培養培地中に分泌され、反対の接合型(a型)の細胞に作用する。それは、a型細胞におけるDNA合成の開始を阻害し、それらをアルファ型と同期させることにより、2つの型の間の接合過程を媒介する。MFαは、シグナルペプチド配列(プレ配列)及びプロ配列を含む分泌シグナルを保有する。MFαは、任意の真核生物種から、特に任意の酵母から、好ましくは、サッカロミセス属、例えばサッカロミセス・パラドクサス、サッカロミセス・ユーバヤヌス、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・クルイベリ、サッカロミセス・ウヴァルム、又はサッカロミセス・クドリアヴゼヴィなどの任意の酵母からであり得る。例示的な酵母は、限定されないが、コマガタエラ・ファフィ(ピキア・パストリス)、ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・パラドクサス、サッカロミセス・ユーバヤヌス、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィ、サッカロミセス・クルイベリ、サッカロミセス・ウヴァルム、クルイベロミセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニ、コマガタエラ属、及びシゾサッカロミセス・ポンベを含む。MFαはまた、トリコデルマ・リーゼイ又はアスペルギルス・ニガーからであり得る。好ましくは、その起源はS.セレビシエからである。プロ配列は、全長MFαタンパク質(即ち、シグナルペプチドを含むタンパク質及びMFαタンパク質をコードするmRNAから翻訳されたプロ配列)、例えばS.セレビシエからのMFαタンパク質又はその機能的ホモログなどのアミノ酸20~89を含む、又はそれからなり得る。好ましい実施形態では、全長MFαタンパク質は、UniProtデータベースエントリP01149、1988年4月1日の配列バージョン1、又はその機能的ホモログに対応し、α接合因子(MFα)プロ配列は、好ましくは、当該データベースエントリの配列番号53において描写されるアミノ酸20~89、より好ましくは、アミノ酸20~85に対応する。MFαプロ配列は、配列番号3又はその機能的ホモログを含み得る。MFαプロ配列は、配列番号3又はその機能的ホモログからなり得る。MFαプロ配列は、配列番号3と80%、85%、90%、95%、又は98%の配列同一性の少なくともいずれか1つを含み得るが、それは、本明細書中で定義されるその機能的ホモログを指し得る。MFαプロ配列は、配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号3と少なくとも95%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号3と少なくとも98%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号53又はその機能的ホモログを含み得る。MFαプロ配列は、配列番号53又はその機能的ホモログからなり得る。MFαプロ配列は、配列番号53と80%、85%、90%、95%、又は98%の配列同一性の少なくともいずれか1つを含み得るが、それは、本明細書中で定義されるその機能的ホモログを指し得る。MFαプロ配列は、配列番号53と少なくとも90%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号53と少なくとも95%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号53と少なくとも98%の配列同一性を含み得る。
MFαプロ配列は、サッカロミセス・パラドクサスから由来し得る。MFαプロ配列は、配列番号74又はその機能的ホモログを含み得る。MFαプロ配列は、配列番号74又はその機能的ホモログからなり得る。MFαプロ配列は、配列番号74と80%、85%、90%、95%、又は98%の配列同一性の少なくともいずれか1つを含み得るが、それは、本明細書中で定義されるその機能的ホモログを指し得る。MFαプロ配列は、配列番号74と少なくとも90%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号74と少なくとも95%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号74と少なくとも98%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号75又はその機能的ホモログを含み得る。MFαプロ配列は、配列番号75又はその機能的ホモログからなり得る。MFαプロ配列は、配列番号75と80%、85%、90%、95%、又は98%の配列同一性の少なくともいずれか1つを含み得るが、それは、本明細書中で定義されるその機能的ホモログを指し得る。MFαプロ配列は、配列番号75と少なくとも90%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号75と少なくとも95%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号75と少なくとも98%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号76又はその機能的ホモログを含み得る。MFαプロ配列は、配列番号76又はその機能的ホモログから構成され得る。MFαプロ配列は、配列番号76と80%、85%、90%、95%、又は98%の配列同一性の少なくともいずれか1つを含み得るが、それは、本明細書中で定義されるその機能的ホモログを指し得る。MFαプロ配列は、配列番号76と少なくとも90%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号76と少なくとも95%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号76と少なくとも98%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号77又はその機能的ホモログを含み得る。MFαプロ配列は、配列番号77又はその機能的ホモログからなり得る。MFαプロ配列は、配列番号77と80%、85%、90%、95%、又は98%の配列同一性の少なくともいずれか1つを含み得るが、それは、本明細書中で定義されるその機能的ホモログを指し得る。MFαプロ配列は、配列番号77と少なくとも90%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号77と少なくとも95%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号77と少なくとも98%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号78又はその機能的ホモログを含み得る。MFαプロ配列は、配列番号78又はその機能的ホモログからなり得る。MFαプロ配列は、配列番号78と80%、85%、90%、95%、又は98%の配列同一性の少なくともいずれか1つを含み得るが、それは、本明細書中で定義されるその機能的ホモログを指し得る。MFαプロ配列は、配列番号78と少なくとも90%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号78と少なくとも95%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号78と少なくとも98%の配列同一性を含み得る。
MFαプロ配列は サッカロミセス・ユーバヤヌスから由来し得る。MFαプロ配列は、配列番号79又はその機能的ホモログを含み得る。MFαプロ配列は、配列番号79又はその機能的ホモログからなり得る。MFαプロ配列は、配列番号79と80%、85%、90%、95%、又は98%の配列同一性の少なくともいずれか1つを含み得るが、それは、本明細書中で定義されるその機能的ホモログを指し得る。MFαプロ配列は、配列番号79と少なくとも90%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号79と少なくとも95%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号79と少なくとも98%の配列同一性を含み得る。
MFαプロ配列はサッカロミセス・クドリアヴゼヴィから由来し得る。MFαプロ配列は、配列番号80又はその機能的ホモログを含み得る。MFαプロ配列は、配列番号80又はその機能的ホモログからなり得る。MFαプロ配列は、配列番号80と80%、85%、90%、95%、又は98%の配列同一性の少なくともいずれか1つを含み得るが、それは、本明細書中で定義されるその機能的ホモログを指し得る。MFαプロ配列は、配列番号80と少なくとも90%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号80と少なくとも95%の配列同一性を含み得る。MFαプロ配列は、配列番号80と少なくとも98%の配列同一性を含み得る。
MFαプロ配列は、好ましくは、配列番号53の位置23に対応する位置にSerを、及び/又は配列番号53の位置64に対応する位置にGluを、好ましくは両方の位置に有する。これによって、分泌をさらに増加させることができる。配列番号3は、これらの変異を既に含む。
機能的ホモログは、本文書中に記載される核酸配列又はペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質の機能的等価物である。機能的ホモログは、ポリペプチドの所与の配列、例えば配列番号1、2、3、52、又は53の配列などと少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有する、生物学的に活性な配列であり得る。一部の実施形態では、機能的ホモログは、天然配列ポリペプチドと少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性な配列である。核酸配列に関しては、遺伝暗号の縮重によって、同じアミノ酸を指定し、それ故に同じタンパク質が生じ得る、他のコドンによる特定のコドンの置換が可能になる。核酸配列は実質的に変動し得る。なぜなら、メチオニン及びトリプトファンを除いて、公知のアミノ酸は、1を上回るコドンによりコードされ得るからである。このように、本明細書中に記載される核酸配列の一部又は全部を合成して、それらの示された配列において示されるものとは有意に異なる核酸配列を与えるように合成され得る。そのコードされたアミノ酸配列は、しかし、保存され得る。
機能的ホモログはまた、本文書において記載されているアミノ酸配列又はペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の機能的等価物を記載し得るが、それは、5つまでの保存的変異を有する、即ち、機能的ホモログは、1、2、3、4、又は5の保存的変異を有することができる。一部の実施形態では、特にMFαプロ配列の機能的ホモログについて、機能的ホモログはまた、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14の保存的変異を有することができる。本明細書中で使用される「保存的変異」は、好ましくは、例えば、1つのアミノ酸の置換、挿入、又は欠失である点変異をもたらす変異であり、特に、置換は、化学的に類似したアミノ酸残基でのアミノ酸残基の置換である。保存的置換の例は、以下の群のメンバー間での置換である:1)アラニン、セリン、及びスレオニン;2)アスパラギン酸及びグルタミン酸;3)アスパラギン及びグルタミン;4)アルギニン及びリジン;5)イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリン;ならびに6)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン。保存的変異はまた、本明細書中に記載されるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列の生物学的活性に影響を及ぼさない1つのアミノ酸の置換、挿入、又は欠失のいずれかであり得る。機能的ホモログは、14までの保存的変異を含み得る。機能的ホモログは、13までの保存的変異を含み得る。機能的ホモログは、12までの保存的変異を含み得る。機能的ホモログは、11までの保存的変異を含み得る。機能的ホモログは、10までの保存的変異を含み得る。機能的ホモログは、9つまでの保存的変異を含み得る。機能的ホモログは、8つまでの保存的変異を含み得る。機能的ホモログは、7つまでの保存的変異を含み得る。機能的ホモログは、6つの保存的変異を含み得る。機能的ホモログは、5つまでの保存的変異を含み得る。機能的ホモログは、4つまでの保存的変異を含み得る。機能的ホモログは、3つまでの保存的変異を含み得る。機能的ホモログは、2つまでの保存的変異を含み得る。機能的ホモログは、1つの保存的変異を含み得る。
本発明はさらに、本明細書中で定義される分泌シグナルに関する。さらに本明細書中で開示されるのは分泌シグナルであり、分泌シグナルは、(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び(ii)α接合因子(MFα)プロ配列を含む。シグナルペプチド配列は、配列番号1又はその機能的ホモログを含み得るが、α接合因子(MFα)プロ配列は、配列番号3又はその機能的ホモログを含み得る。シグナルペプチド配列は、配列番号1又はその機能的ホモログを含み得るが、α接合因子(MFα)プロ配列は、配列番号53又はその機能的ホモログを含み得る。本発明はさらに、分泌シグナルに関し、当該分泌シグナルは、(i)SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び(ii)α接合因子(MFα)プロ配列を含む。シグナルペプチド配列は、配列番号2又はその機能的ホモログを含み得るが、α接合因子(MFα)プロ配列は、配列番号3又はその機能的ホモログを含み得る。シグナルペプチド配列は、配列番号2又はその機能的ホモログを含み得るが、α接合因子(MFα)プロ配列は、配列番号53又はその機能的ホモログを含み得る。シグナルペプチド配列は、配列番号52又はその機能的ホモログを含み得るが、α接合因子(MFα)プロ配列は、配列番号3又はその機能的ホモログを含み得る。シグナルペプチド配列は、配列番号52又はその機能的ホモログを含み得るが、α接合因子(MFα)プロ配列は、配列番号53又はその機能的ホモログを含み得る。
目的のタンパク質
目的のタンパク質
本明細書中で使用される用語「目的のタンパク質」(POI)は、宿主細胞において組換え技術を用いて産生されるタンパク質を指す。より具体的には、タンパク質は、宿主細胞中で天然に生じないポリペプチド、即ち、異種タンパク質、例えば、人工タンパク質、例えば野生型細胞により自然に産生されないタンパク質など、又はその他、宿主細胞に対して天然、即ち、宿主細胞に対する相同なタンパク質であり得るが、しかし、例えば、POIをコードする核酸配列を含む自己複製ベクターでの形質転換により、あるいは、宿主細胞のゲノム中への、POIをコードする核酸配列の1つ又は複数のコピーの組換え技術による組み込み時に、あるいは、POIをコードする遺伝子の発現を制御する1つ又は複数の調節配列の、例えば、プロモーター配列の組換え修飾により産生される。一般的に、本明細書中で言及される目的のタンパク質は、当業者に周知の組換え発現の方法により産生され得る。目的のタンパク質は、組換えタンパク質であり得る。
目的のタンパク質(POI)に関する限定はない。POIは、通常、真核生物もしくは原核生物のポリペプチド、その変異体もしくは誘導体、又は人工ポリペプチド、例えば野生型細胞により天然には産生されないポリペプチドなどである。POIは、任意の真核生物又は原核生物のタンパク質であり得る。タンパク質は、自然に分泌されるタンパク質又は細胞内タンパク質、即ち、自然には分泌されないタンパク質であり得る。本発明はまた、タンパク質の生物学的に活性な断片を含む。別の実施形態では、POIは、アミノ酸鎖であり得る、又は複合体、例えば二量体、三量体、ヘテロ二量体、多量体、もしくはオリゴマーなどの中に存在し得る。本発明の分泌シグナルとPOIとの融合によって、任意のPOIを分泌させることができる。POIは、同時翻訳的な移行を要求するタンパク質であり得る。
目的のタンパク質は、栄養、食事、消化、サプリメントとして、例えば食品、飼料製品、又は化粧品などにおいて使用されるタンパク質であり得る。食品は、例えば、ブイヨン、デザート、シリアルバー、菓子、スポーツドリンク、栄養製品、又は他の栄養製品であり得る。好ましくは、目的のタンパク質は食品添加物である。
別の実施形態では、目的のタンパク質を動物飼料中に使用してもよい。
POIのさらなる例は、抗菌タンパク質、例えばラクトフェリン、リゾチーム、ラクトフェリシン、ラクトヘドリン、カッパ-カゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、乳タンパク質、急性期タンパク質、例えば、感染への応答において産生動物において通常産生されるタンパク質など、ならびに小さな抗菌タンパク質、例えばリゾチーム及びラクトフェリンなどを含む。他の例は、殺菌タンパク質、抗ウイルスタンパク質、急性期タンパク質(感染への応答において産生動物において誘導される)、プロバイオティクスタンパク質、静菌タンパク質、及びカチオン性抗菌タンパク質を含む。
「飼料」は、非ヒト動物により食べられ、摂取され、消化されることを意図した、又はそのために適切な、任意の天然又は人工の食餌、食事もしくは同様のもの、又はそのような食事の成分を意味する。「飼料添加物」は、一般的に、飼料に加えられる物質を指す。それは、典型的には、1つ又は複数の化合物、例えばビタミン、ミネラル、酵素、ならびに適切な担体及び/又は賦形剤などを含む。本発明については、食品添加物は酵素又は他のタンパク質であり得る。飼料添加物として使用できる酵素の例は、フィターゼ、キシラナーゼ、及びβグルカナーゼを含む。「食品」は、ヒトにより食べられ、摂取され、消化されることを意図した又はそのために適切な、任意の天然又は人工の食事もしくは同様のもの、又はそのような食事の成分を意味する。
「食品添加物」は、一般的に、食品に加えられる物質を指す。それは、典型的には、1つ又は複数の化合物、例えばビタミン、ミネラル、酵素、ならびに適切な担体及び/又は賦形剤などを含む。本発明については、食品添加物は酵素又は他のタンパク質であり得る。食品添加物として使用することができる酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、トランスグルタミナーゼ、アミラーゼ、βグルカナーゼ、アセト乳酸脱炭酸酵素、及びラッカーゼを含む。
一部の実施形態では、食品添加物は抗菌タンパク質であり、それは、例えば、(i)抗菌乳タンパク質(ヒト又は非ヒトのいずれか)ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトフェリシン、ラクトヘドリン、カッパーカゼイン、ハプトコリン、ラクトペルオキシダーゼ、アルファ-1-アンチトリプシン、及び免疫グロブリン、例えば、IgA、(ii)急性期タンパク質、例えばC反応性タンパク質(CRP);ラクトフェリン;リゾチーム;血清アミロイド A(SAA);フェリチン;ハプトグロビン(Hp);補体2~9、特に、補体3;セロムコイド;セルロプラスミン(Cp);15-ケト-13,14-ジヒドロ-プロスタグランジンF2 アルファ(PGFM);フィブリノーゲン(Fb);アルファ(1)酸性糖タンパク質(AGP);アルファ(1)-アンチトリプシン;マンノース結合タンパク質;リポ多糖結合タンパク質;アルファ-2 マクログロブリン及び種々のディフェンシンなど、(iii)抗菌ペプチド、例えばセクロピン、マガイニン、ディフェンシン、タキプレシン、パラシンl.ブフォリンI、PMAP-23、モロネシジン、アノプリン、ガンビシン、及びSAMP-29など、ならびに(iv)他の抗菌タンパク質、CAP37、グラニュリシン、分泌型白血球プロテアーゼ阻害剤、CAP18、ユビキシジン、ウシ抗菌タンパク質1、Ace-AMP1、タキプレシン、ビッグディフェンシン、Ac-AMP2、Ah-AMP1、及びCAP18を含む。
POIは酵素であってもよい。好ましい酵素は、工業用途のために、例えば界面活性剤、デンプン、燃料、繊維、パルプ及び紙、油、パーソナルケア製品の製造、又は、例えば製パン、有機合成などのために使用することができる酵素である。そのような酵素の例は、汚れの除去及び洗浄のためのプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及びセルロース;デンプンの液化及び糖化のためのプルラナーゼアミラーゼ及びアミログルコシダーゼ;グルコースからフルクトースへの変換のためのグルコースイソメラーゼ;シクロデキストリン産生のためのシクロデキストリン-グリコシルトランスフェラーゼ;燃料及びデンプンにおける粘度低下のためのキシラナーゼ;生地の安定性及びベーキングにおける条件設定のためのアミラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、グルコース、オキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、トランスグルタミナーゼ;繊維製造におけるデニムの仕上げ及び綿の柔軟化のためのセルラーゼ;繊維製品の糊抜き用のアミラーゼ;精練用のペクチン酸リアーゼ;漂白停止用のカタラーゼ;漂白用のラッカーゼ;過剰な色素の除去用のペルオキシダーゼ;パルプ及び紙産生におけるリパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、セルロース;脂肪加工油脂におけるエステル交換用のリパーゼ及び脱ガム用のホスホリパーゼ;有機合成におけるキラルアルコール及びアミドの分解用のリパーゼ;半合成ペニシリンの合成用のアシラーゼ、エナンチオピュアなカルボン酸の合成用のニトリラーゼ;皮革産生用のプロテアーゼ及びリパーゼ;パーソナルケア製品を作製するためのアミログルコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、及びペルオキシダーゼを含む(Kirk et al., Current Opinion in Biotechnology(2002)13:345-351を参照のこと)。
POIは治療用タンパク質であってもよい。POIは、限定されないが、抗体もしくは抗体断片、成長因子、ホルモン、酵素、又はワクチンなどの生物医薬品物質として適切なタンパク質であり得る。
POIは、自然に分泌されるタンパク質、細胞内タンパク質、即ち、自然に分泌されないタンパク質であってもよい。本発明はまた、天然に分泌される又は天然に分泌されないタンパク質の機能的ホモログ、機能的等価変異体、誘導体及び生物学的に活性な断片の組換え産生を提供する。機能的ホモログは、好ましくは、配列と同一である、又は対応する、及びその機能的特徴を有する。
POIは、天然タンパク質と構造的に類似していてもよく、天然タンパク質のC末端及びN末端のいずれか又は両方あるいは側鎖への1つ又は複数のアミノ酸の付加、天然アミノ酸配列中の1つ又は多数の異なる部位での1つ又は複数のアミノ酸の置換、天然タンパク質の一方もしくは両方の末端での、又はアミノ酸配列中の1つ又はいくつかの部位での1つ又は複数のアミノ酸の欠失、あるいは天然アミノ酸配列中の1つ又は複数の部位での1つ又は複数のアミノ酸の挿入により、天然タンパク質から由来し得る。そのような修飾は、上で言及されるタンパク質のいくつかについて周知である。
好ましくは、目的のタンパク質は、哺乳動物のポリペプチド、さらにより好ましくはヒトのポリペプチドである。好ましくは、目的のタンパク質は、治療用又は生物医薬品用のタンパク質である。特に好ましい治療用タンパク質は、哺乳動物に、さらにより好ましくはヒトに投与され得る、任意のポリペプチド、タンパク質、タンパク質変異体、融合タンパク質及び/又はその断片を指す。目的のタンパク質はまた、人工タンパク質、又は天然タンパク質の、もしくは天然タンパク質の、もしくは人工タンパク質の、もしくは融合タンパク質の一部であってもよい。本発明に従った治療用タンパク質が細胞に対して異種であることが想定されるが、しかし、要求されない。本発明の細胞により産生され得るタンパク質の例は、限定されないが、酵素、調節タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、足場結合タンパク質(例、リポカリンファミリーに基づくムテイン)、構造タンパク質、リンホカイン、接着分子、受容体、膜タンパク質又は輸送タンパク質、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストとしての役割を果たし得る、及び/又は治療用又は診断用の使用を有し得る他の任意のポリペプチドである。さらに、目的のタンパク質は、ワクチン接種、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質のために使用される抗原であり得る。それはまた、抗体の抗原結合断片であってもよく、それは、当技術分野において公知である、任意の適切な抗原結合抗体断片を含み得る。例えば、抗体断片は、限定されないが、Fv(VL及びVHを含む分子)、単鎖Fv(scFV)(ペプチドリンカーにより接続されたVL及びVHを含む分子)、Fab、Fab’、F(ab’)2、単一ドメイン抗体(sdAb)(単一可変ドメイン及び3つのCDRを含む分子)、及びその多価提示を含み得る。抗体又はその断片は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体、又はそれらの断片であり得る。治療用タンパク質の例は、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体断片、例えばFab’、F(ab’)2、Fv、scFv、di-scFv、bi-scFv、タンデムscFv、二重特異性タンデムscFv、sdAb、VHH、VH、及びVLなど、又はヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、IgA抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG抗体、IgM抗体、イントラボディ、ミニボディ、もしくはモノボディとしても公知である分子足場としての、フィブロネクチンIII型ドメインを使用して構築された合成結合タンパク質(FN3)を含む。
目的のタンパク質はさらに、抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、もしくはヒト抗体など、又は二重特異性抗体、又は抗原結合抗体断片、例えばFabもしくはF(ab)2など、一本鎖抗体、例えばscFvなど、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科動物のVHH断片又は重鎖抗体又はドメイン抗体(dAb)など、人工抗原結合分子、例えばDARPIN、ibody、affibody、humabody、もしくはリポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテインなど、酵素、例えばプロセス酵素など、サイトカイン、成長因子、ホルモン、タンパク質抗生物質、融合タンパク質、例えば毒素融合タンパク質、構造タンパク質、調節タンパク質、及びワクチン抗原などからなる群より選択され得るが、好ましくは、目的のタンパク質は、治療用タンパク質、食品添加物、又は飼料添加物である。
治療用タンパク質は、限定されないが、インスリン、インスリン様成長因子、hGH、tPA、サイトカイン、例えば、インターロイキン、例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18など、インターフェロン(IFN)アルファ、IFN ベータ、IFN ガンマ、IFNオメガ又はIFNタウ、腫瘍壊死因子(TNF)、TNF アルファ及びTNFベータ、TRAIL;G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1、及びVEGFを含む。
好ましい実施形態では、タンパク質は抗体である。用語「抗体」は、エピトープに適合して認識する特定の形状を伴う任意のポリペプチド鎖含有分子構造を含むことを意図しており、ここで、1つ又は複数の非共有結合相互作用によって、分子構造とエピトープの間での複合体が安定化される。原型の抗体分子は免疫グロブリンであり、全ての供給源、例えば、ヒト、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、他の哺乳類、ニワトリ、他の鳥類などからの全ての種類の免疫グロブリン、IgG、IgM、IgA、IgE、IgDなどが、「抗体」であると考えられる。多数の抗体コード配列が記載されている;及び他は、当技術分野において周知の方法により生じさせることができる。
例えば、抗体又は抗原結合抗体断片は、当技術分野において公知の方法により産生され得る。一般的に、抗体産生細胞は、所望の抗原又は免疫原に対して感作される。抗体産生細胞から単離されたメッセンジャーRNAは、PCR増幅を使用してcDNAを作製するためのテンプレートとして使用される。ベクターのライブラリーは、各々が、最初の抗原特異性を保持する1つの重鎖遺伝子及び1つの軽鎖遺伝子を含み、発現ベクター中への、増幅された免疫グロブリンcDNAの適したセクションの挿入により産生される。コンビナトリアルライブラリーは、重鎖遺伝子ライブラリー及び軽鎖遺伝子ライブラリーを組み合わせることにより構築される。これによって、重鎖及び軽鎖を共発現するクローンのライブラリーがもたらされる(抗体分子のFab断片又は抗原結合断片に似ている)。これらの遺伝子を保有するベクターは、宿主細胞中にコトランスフェクトされる。抗体遺伝子合成がトランスフェクトされた宿主において誘導される場合、重鎖及び軽鎖タンパク質が自己組織化して活性抗体を産生し、それは、抗原又は免疫原を用いたスクリーニングにより検出することができる。
目的の抗体コード配列は、天然配列によりコードされる配列、ならびに遺伝コードの縮重により、開示された核酸と配列において同一ではない核酸、及びその変異体を含む。変異体ポリペプチドは、アミノ酸(aa)の置換、付加、又は欠失を含み得る。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換、あるいは非必須アミノ酸を排除する、例えばグリコシル化部位を改変する、あるいは機能のために必要ではない1つ又は複数のシステイン残基の置換又は欠失によりミスフォールディングを最小限にする置換であり得る。変異体は、タンパク質の特定の領域(例、機能ドメイン、触媒的アミノ酸残基など)の増強した生物学的活性を保持する又は有するように設計することができる。変異体はまた、本明細書中に開示されるポリペプチドの断片、特に生物学的に活性な断片及び/又は機能的ドメインに対応する断片を含む。クローン化された遺伝子のインビトロ変異誘発のための技術は公知である。また、本発明中に含まれるのは、タンパク質分解に対するその耐性を改善するため、又は溶解特性を最適化するため、又は治療薬としてより適切なものにするために、通常の分子生物学的技術を使用して修飾されたポリペプチドである。
キメラ抗体は、1つの種の抗体産生細胞から得られる可変軽鎖及び重鎖領域(VK及びVH)を、別の種の軽鎖及び重鎖の定常領域と組み合わせることにより、組換え手段により作製され得る。典型的には、キメラ抗体は、主にヒトドメインを伴う抗体を産生するために、げっ歯類又はウサギ可変領域及びヒト定常領域を利用する。そのようなキメラ抗体の産生は当技術分野において周知であり、標準的な手段により達成され得る(例えば、米国特許第5,624,659号において記載されているとおり)。
ヒト化抗体は、さらに多くのヒト様免疫グロブリンドメインを含むように操作され、動物由来の抗体の相補性決定領域だけを組み入れる。これは、モノクローナル抗体の可変領域の超可変ループの配列を注意深く調べ、それらをヒト抗体鎖の構造に適合させることにより達成される。表面的には複雑であるが、この過程は実際にはわかりやすい。例えば、米国特許第6,187,287号を参照のこと。
完全な免疫グロブリン(又はそれらの組換え対応物)に加えて、エピトープ結合部位を含む免疫グロブリン断片(例、Fab’、F(ab’)2、又は他の断片)を合成してもよい。「断片」又は最小限の免疫グロブリンは、組換え免疫グロブリン技術を利用して設計され得る。例えば、本発明中での使用のための「Fv」免疫グロブリンは、可変軽鎖領域及び可変重鎖領域を合成することにより産生され得る。抗体の組み合わせも興味深く、例えば、ダイアボディであり、2つの異なる Fv 特異性を含む。
免疫グロブリンは翻訳後に修飾され、化学リンカー、検出可能部分、例えば蛍光色素、酵素、基質、化学発光部分及び同様のものを加えてもよく、あるいは特異的結合部分、例えばストレプトアビジン、アビジン、又はビオチン、及び同様のものを、本発明の方法及び組成物において利用してもよい。
治療用タンパク質のさらなる例は、血液凝固因子(VII、VIII、IX)、フザリウムからのアルカリプロテアーゼ、カルシトニン、CD4受容体ダルベポエチン、DNase(嚢胞性線維症)、エリスロポエチン、eutropin(ヒト成長ホルモン誘導体)、卵胞刺激ホルモン(フォリトロピン)、ゼラチン、グルカゴン、グルコセレブロシダーゼ(ゴーシェ病)、A.ニガーからのグルコサミラーゼ、A.ニガーからのグルコースオキシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子(GCSF、GMCSF)、成長ホルモン(ソマトトロピン)、B型肝炎ワクチン、ヒルジン、ヒト抗体断片、ヒトアポリポタンパク質AI、ヒトカルシトニン前駆体、ヒトコラゲナーゼIV、ヒト上皮成長因子、ヒトインスリン様成長因子、ヒトインターロイキン6、ヒトラミニン、ヒトプロアポリポタンパク質AI、ヒト血清アルブミン、インスリン及びムテイン、インスリン、インターフェロンアルファ及びムテイン、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ(ムテイン)、インターロイキン2、黄体形成ホルモン、モノクローナル抗体5T4、マウスコラーゲン、OP-1(骨形成、神経保護因子)、オプレルベキン(インターロイキン11 アゴニスト)、有機ホスホヒドロラーゼ、PDGFアゴニスト、フィターゼ、血小板由来成長因子(PDGF)、組換えプラスミノーゲンアクチベーターG、スタフィロキナーゼ、幹細胞因子、破傷風毒素断片C、組織プラスミノーゲンアクチベーター、及び腫瘍壊死因子を含む(Schmidt、Appl Microbiol Biotechnol(2004)65:363-372を参照のこと)。
目的のタンパク質は、配列番号26において描写されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなり得る。目的のタンパク質は、配列番号27において描写されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなり得る。目的のタンパク質は、配列番号28において描写されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなり得る。目的のタンパク質は、配列番号29において描写されるアミノ酸配列を含む、又はそれからなり得る。本発明の融合タンパク質が、N末端からC末端まで、本明細書中で定義される分泌シグナルから、及び配列番号26、27、28又は29において描写される目的のタンパク質からなる場合、そのような目的のタンパク質は、場合により、1つ又は複数の(検出可能な)タグ、1つ又は複数のプロテアーゼ切断部位、ならびに/あるいは本明細書中の他の場所で定義される1つ又は複数のリンカーをさらに含み得る。言い換えれば、本明細書中で定義される1つ又は複数のタグ、1つ又は複数の切断部位、及び/又は1つ又は複数のリンカーはまた、配列番号26、27、28、又は29において描写される、そのような目的のタンパク質にN末端又はC末端で融合され得るが、このように、本発明の融合タンパク質が、N末端からC末端で、この状況において定義される分泌シグナル及びそのような目的のタンパク質からなる場合、また、目的の当該タンパク質により含まれる。この状況において、そのような1つ又は複数のタグ、1つ又は複数の切断部位、ならびに/あるいは1つ又は複数のリンカーは、本明細書中の他の場所で定義されるような目的のタンパク質にN末端又はC末端で融合され、次に、そのような目的のタンパク質の一部であり得る。また、本発明の融合タンパク質が、N末端からC末端で、本明細書中で定義される分泌シグナルから、及び配列番号26、27、28、又は29において描写される目的のタンパク質からなる場合、本明細書中で定義される分泌シグナルは、本明細書中で既に定義されているように、場合により、1つ又は複数の(検出可能な)タグ、1つ又は複数のプロテアーゼ切断部位、ならびに/あるいは1つ又は複数のリンカーをさらに含み得る。
本明細書中に記載される融合タンパク質が、本明細書中で定義される目的のタンパク質に作動可能に連結された、本明細書中にさらに記載される分泌シグナルのエレメントを含むことも本発明により含まれる。
特定の態様に従って、本発明は、以下を含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関する:
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(I)(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;
又は
(II)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質、
分泌シグナルは、目的のタンパク質に作動可能に連結されている。
本発明の核酸分子
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(I)(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;
又は
(II)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質、
分泌シグナルは、目的のタンパク質に作動可能に連結されている。
本発明の核酸分子
本発明の分泌シグナルを利用するために、それらを目的のタンパク質に融合させてもよい。本明細書中に記載されるような融合タンパク質は、核酸分子によりコードされ得る。本発明の核酸分子は、例えば、宿主細胞中に形質転換することができる。したがって、本発明は、N末端からC末端で、(a)分泌シグナルを含む融合タンパク質をコードする核酸分子に関し、分泌シグナルは、(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;ならびに(b)目的のタンパク質を含む。
本明細書中で使用される「コードする」は、タンパク質をコードする核酸又はポリヌクレオチドが発現される場合、それが、当該タンパク質の産生に導くことを意味する。
本明細書中で使用される用語「核酸分子」は、DNA又はRNAのいずれかを指す。「核酸分子」、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、又は単に「ヌクレオチド」は、その全てが互換的に使用され得るが、5’末端から3’末端まで読まれたデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを指す。それは、自己複製プラスミド、DNA又はRNAの感染性ポリマー、及び非機能的なDNA又はRNAの両方を含む。
本明細書中で使用される「発現カセット」は、遺伝子、例えば本発明の核酸分子など、及び、調節配列、例えばトランスフェクトされた細胞により発現されるプロモーターなどを含む(ベクター)DNAの異なる成分に関する。発現カセットは、宿主細胞の機構に、目的のタンパク質を発現するように指示し得る。典型的には、発現カセットは 1つ又は複数の遺伝子及びそれらの発現を制御する配列で構成される。したがって、本発明はさらに、本発明の核酸分子及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットに関する。発現カセットはベクターの形態であり得る。発現カセットはベクターにより含まれ得る。
他の実施形態では、本発明の核酸分子及び/又はSRPの1つ又は複数の成分をコードするポリヌクレオチドは、プラスミド又はベクター中に組み込むことができる。したがって、本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターに関する。用語「プラスミド」は、外来遺伝物質を人工的に別の細胞中に運ぶ媒体として使用されるDNA分子に関し、そこで、それは複製及び/又は発現されることができる(例、プラスミド、コスミド、ラムダファージ)。外来DNAを含むベクターは、組換えDNAと呼ばれる。ベクターは、限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体、好ましくはプラスミドを含む。ベクター自体は一般的に、インサート(導入遺伝子)及びベクターの「骨格」としての役割を果たすより大きな配列からなるDNA配列であり得る。全てのベクターはクローニングのために使用してもよく、従って、クローニングベクターとして見なされるが、しかし、また、クローニング用に特別に設計されたベクターがある一方で、他は、他の目的、例えば転写及びタンパク質発現などのために特別に設計され得る。標的細胞における導入遺伝子の発現のために特別に設計されたベクターは、発現ベクターと呼ばれ、一般的に導入遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列を有する。当業者は、使用される宿主細胞に依存して、適切なプラスミド又はベクターを用いることができる。
好ましくは、ベクターは真核生物発現ベクター、好ましくは酵母発現ベクターである。
好ましくは、ベクターは真核生物発現ベクター、好ましくは酵母発現ベクターである。酵母を宿主として使用するベクターの例は、YIp型ベクター、YEp型ベクター、YRp型ベクター、YCp型ベクター、pGPD-2、pAO815、pGAPZ、pGAPZα、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、pPICZ、pPICZα、pPIC3K、pHWO10、pPUZZLE及び2μmプラスミドを含む。そのようなベクターは公知であり、例えば、Cregg et al., Mol Biotechnol.(2000)16(1):23-52において記載されている。好ましくは、ベクターはpPM2dZ30ベクター(WO2008/128701A2において記載されている)である。あるいは、ベクターは、骨格BB1、BB2及びBB3aK/BB3eH/BB3rNからなるGolden GateベースのGoldenPiCSである(Prielhofer et al., 2017)。
ベクターは、適切な宿主生物におけるクローン化された組換えヌクレオチド配列、即ち、組換え遺伝子の転写及びそれらのmRNAの翻訳のために使用することができる。ベクターはまた、J.Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(2001)又はStearns et al.(1990), Methods in Enzymology, 185:280-297により記載されているような当技術分野において公知の方法により、標的ポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノム中に組み込むために使用することができる。「ベクター」は、通常、宿主細胞における自律複製のための、好ましくは、本発明の宿主細胞についての細菌起点及び真核生物起点の両方のための起点、選択マーカー、多数の制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列及び転写ターミネーターを含み、それらの構成要素は作動可能に一緒に連結されている。目的のポリペプチドコード配列は、宿主細胞においてポリペプチドの発現を提供する転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結される。
多数の適切なプラスミド又はベクターが当業者に公知であり、多くは商業的に入手可能である。適切なベクターの例は、Sambrook et al, eds., Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Ed.), Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)、及びAusubel et al, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York(1997)において提供されている。
本発明のベクター又はプラスミドは、酵母人工染色体を包含し、それは、テロメア配列、セントロメア配列、及び複製の起点(複製起点)配列を含む異種DNA配列(例、3000kbもの大きさのDNA配列)を含むように遺伝的に改変することができるDNA構築物を指す。
本発明の融合タンパク質又は分泌シグナルをコードする配列は、プロモーターに作動可能に連結され得る。本明細書中で使用される用語「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を促進する領域を指す。プロモーターによって、典型的には、プロモーターが存在しない場合での発現された組換え産物の量と比較して、ヌクレオチド配列から発現された組換え産物の量が増加する。1つの生物からのプロモーターを利用して、別の生物から由来する配列からの組換え産物の発現を増強することができる。プロモーターは、当技術分野において公知の方法を使用する相同組換えにより宿主細胞染色体中に組み込むことができる(例、Datsenko et al, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 97(12):6640-6645(2000))。また、1つのプロモーターエレメントは、タンデムに付着された複数の配列について発現される産物の量を増加させることができる。それ故に、1つのプロモーターエレメントによって、1つ又は複数の組換え産物の発現を増強することができる。
プロモーターは、「誘導性プロモーター」又は「構成的プロモーター」であり得る。「誘導性プロモーター」は、特定の因子の存在又は非存在により誘導され得るプロモーターを指し、「構成的プロモーター」は、その関連する遺伝子又は遺伝子の連続転写を可能にする未調節プロモーターを指す。
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質又は本発明の分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターにより駆動される。
多くの誘導性プロモーターが当技術分野において公知である。多くは、Gatz, Curr.Op.Biotech., 7:168(1996)(また、Gatz, Ann.Rev.Plant.Physiol.Plant Mol.Biol., 48:89(1997)を参照のこと)による総説において記載されている。例は、テトラサイクリンリプレッサーシステム、Lacリプレッサーシステム、銅誘導性システム、サリチル酸誘導性システム(PR1 aシステムなど)、グルココルチコイド誘導性システム(Aoyama et al., 1997)、アルコール誘導性システム、例えば、AOXプロモーター、及びエクジソーム誘導性システムを含む。また、含まれるのは、ベンゼンスルホンアミド誘導性(米国特許第5,364,780号)及びアルコール誘導性(WO 97/06269及びWO 97/06268)誘導性システム及びグルタチオンS-トランスフェラーゼプロモーターである。
酵母宿主細胞での使用のための適切なプロモーター配列が、Mattanovich et al., Methods Mol.Biol.(2012)824:329-58において記載されており、トリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH又はGAP)及びその変異体、ラクターゼ(LAC)及びガラクトシダーゼ(GAL)などの解糖酵素、P.パストリスのグルコース-6-リン酸イソメラーゼプロモーター(PPGI)、3-ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(PPGK)、グリセロールアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼプロモーター(PGAP)、翻訳伸長因子プロモーター(PTEF)、及びP.パストリスエノラーゼ1(PENO1)、トリオースリン酸イソメラーゼ(PTPI)、リボソームサブユニットタンパク質(PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPL1)のプロモーター、アルコールオキシダーゼプロモーター(PAOX)又は改変された特徴を伴うその変異体、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼプロモーター(PFLD)、イソクエン酸リアーゼプロモーター(PICL)、アルファ-ケトイソカプロン酸デカルボキシラーゼプロモーター(PTHI)、熱ショックタンパク質ファミリーメンバー(PSSA1、PHSP90、PKAR2)、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(PGND1)、ホスホグリセリン酸ムターゼ(PGPM1)、トランスケトラーゼ(PTKL1)、ホスファチジルイノシトールシンターゼ(PPIS1)、フェロ-O2-オキシドレダクターゼ(PFET3)、高親和性鉄パーミアーゼ(PFTR1)、抑制性アルカリホスファターゼ(PPHO8)、N-ミリストイルトランスフェラーゼ(PNMT1)、フェロモン応答転写因子(PMCM1)、ユビキチン(PUBI4)、単鎖DNAエンドヌクレアーゼ(PRAD2)のプロモーター、ミトコンドリア内膜の主要なADP/ATP担体(PPET9)(WO2008/128701)のプロモーター、及びギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)プロモーターを含む。GAPプロモーター、AOXプロモーター、又はGAPもしくはAOXプロモーターから由来するプロモーターが特に好ましい。AOXプロモーターはメタノールにより誘導され、グルコースにより抑制される。メタノール誘導性ならびにメタノール非含有産生のためのAOXプロモーターから由来するプロモーターが、WO2006/089329、EP1851312B1、及びEP2199389B1において記載されている。炭素源調節可能なプロモーター、例えば、WO2013050551(例、pG1~pG8、pG1の断片、pG1a~pG1fと命名される)及びWO2017021541(例、pG1-D1240、又はpG1-D1427)において記載されているような抑制解除可能なプロモーターを使用してもよい。さらなる例は、構成的プロモーター、例えばMDH3、POR1、PDC1、FBA1-1、又はGPM1などであり(Prielhofer et al.2017, BMC Sys Biol.11:123)、又はWO2014139608において開示されているとおりである(例、pCS1)。
適切なプロモーターのさらなる例は、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ(ENO-1)、サッカロミセス・セレビシエのガラクトキナーゼ(GAL1)、サッカロミセス・セレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH1、ADH2/GAP)、サッカロミセス・セレビシエのトリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)、サッカロミセス・セレビシエのメタロチオネイン(CUP1)、及びサッカロミセス・セレビシエの3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、ならびにマルターゼ遺伝子プロモーター(MAL)を含む。
酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romanos et al, 1992, Yeast 8:423-488において記載されている。
本発明の宿主細胞
本発明の宿主細胞
本明細書中で使用されるように、「宿主細胞」は、タンパク質の発現及びタンパク質の分泌が可能である細胞を指す。そのような宿主細胞は、本発明の方法において適用することができる。その目的のために、宿主細胞がポリペプチドを発現するために、融合タンパク質をコードする核酸分子が細胞中に存在する、又は導入される。本発明により提供される宿主細胞は、真核生物であり得る。当業者により理解されるように、原核細胞は膜結合核を欠く一方で、真核細胞は膜結合核を有する。真核細胞の例は、限定されないが、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、線虫細胞、昆虫細胞、幹細胞、真菌細胞又は酵母細胞を含む。好ましくは、宿主細胞は酵母細胞である。
したがって、本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞に関する。加えて、本発明は、本発明の発現カセットを含む宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。
酵母細胞の例は、限定されないが、サッカロミセス属(例、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・クルイベリ、サッカロミセス・ウヴァルム、サッカロミセス・パラドクサス、サッカロミセス・ユーバヤヌス、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィ)、コマガタエラ属(コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又はコマガタエラ・ファフィ)、クルイベロミセス属(例、クルイベロミセス・ラクティス、クルイベロミセス・マルシアヌス)、カンジダ属(例、カンジダ・ユティリス、カンジダ・カカオイ)、ゲオトリクム属(例、ゲオトリクム・ファーメンタンス)、ならびにハンセヌラ・ポリモルファ及びヤロウィア・リポリティカを含む。したがって、本発明の真核宿主細胞又は本発明の方法及び使用において使用される真核宿主細胞は、真菌宿主細胞もしくは酵母宿主細胞、好ましくは酵母宿主細胞であり得るが、コマガタエラ・ファフィ(ピキア・パストリス)、ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニ、コマガタエラ種、及びシゾサッカロミセス・ポンベ、又は真菌宿主細胞、例えばトリコデルマ・リーゼイ、アスペルギルス・ニガーなどからなる群から選択される。
ピキア属が特に興味深い。ピキアは多くの種を含み、ピキア・パストリス種、ピキア・メタノリカ種、ピキア・クルイベリ種、及びピキア・アングスタ種を含む。最も好ましいのは、ピキア・パストリス種である。
旧種ピキア・パストリスは分割され、コマガタエラ・パストリス及びコマガタエラ・ファフィに改名された。従って、ピキア・パストリスは、コマガタエラ・パストリス及びコマガタエラ・ファフィの両方についての同義語であり、好ましくはコマガタエラ・ファフィについての同義である。
本発明において有用なピキア・パストリス株についての例は、X33及びそのサブタイプGS115、KM71、KM71H;X33及びそのサブタイプCBS7435 muts、CBS7435 mutsΔArg、CBS7435 mutsΔHis、CBS7435 mutsΔArg、ΔHis, CBS7435 muts PDI+、CBS 704(=NRRL Y-1603 = DSMZ 70382)、CBS 2612(=NRRL Y-7556)、CBS 9173-9189、及びDSMZ 70877ならびにそれらの変異体である。好ましくは、宿主細胞は、P.パストリスCBS7435mutS又はそのサブタイプ、より好ましくはP.パストリスCBS7435mutSである。
さらに好ましい実施形態に従って、宿主細胞は、ピキア・パストリス、ハンセヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・リーゼイ、サッカロミセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニ、及びコマガタエラ、及びシゾサッカロミセス・ポンベである。それはまた、ウスチラゴ・メイディスからの宿主細胞であり得る。
本明細書中で使用されるように、「組換え」は、ヒトの介入による遺伝物質の改変を指す。典型的には、組換えは、クローニング及び組換えを含む、分子生物学(組換えDNA技術)方法による、ウイルス、細胞、プラスミド、又はベクターにおけるDNA又はRNAの操作を指す。組換え細胞、ポリペプチド、又は核酸は、典型的には、それが、天然に生じる対応物(「野生型」)とどのように異なるかを参照して記載することができる。「組換え細胞」又は「組換え宿主細胞」は、当該細胞に対して天然ではない核酸配列を含むように遺伝的に改変された細胞又は宿主細胞を指す。
現在使用されている用語「製造する」又は「製造している」は、目的のタンパク質が発現される過程を指す。「目的のタンパク質を製造するための宿主細胞」は、目的のタンパク質をコードする核酸配列が導入され得る宿主細胞を指す。本発明内の組換え宿主細胞は、目的のタンパク質をコードする核酸配列を必ずしも含まない。宿主細胞を、例えば、キットにおいて、所望のヌクレオチド配列を宿主細胞中に挿入するために提供することができることが、当業者により理解される。
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は互換的に使用される。用語「ポリペプチド」は、2つ又はそれ以上のアミノ酸、典型的には少なくとも3つ、好ましくは少なくとも20、より好ましくは少なくとも30、例えば少なくとも50のアミノ酸を含むタンパク質又はペプチドを指す。したがって、ポリペプチドはアミノ酸配列を含み、このように、時折、アミノ酸配列を含むポリペプチドは、本明細書中で「ポリペプチド配列を含むポリペプチド」として言及される。このように、本明細書中で、用語「ポリペプチド配列」は、用語「アミノ酸配列」と互換的に使用される。
用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と類似の様式において機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に生じるアミノ酸は、遺伝コードによりコードされているアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、及びO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びR基に結合された炭素を有する化合物を指す(例、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム)。そのような類似体は、修飾されたR基(例、ノルロイシン)又は修飾されたペプチド骨格を有するが、しかし、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。合成アミノ酸又はアミノ酸類似体を含む目的のタンパク質を発現するシステムは、当業者に公知であり、限定されないが、拡張された遺伝コードの使用を含む。遺伝コードを拡張するための重要な前提条件は、コードする非標準アミノ酸、採用する未使用コドン、このコドンを認識するtRNA、及びそのtRNA及び非標準アミノ酸だけを認識するtRNA合成酵素である。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、しかし、天然に生じるアミノ酸と類似の様式において機能する化合物を指す。
本明細書中に記載される分泌シグナルの切断後の融合タンパク質又は目的のタンパク質の分泌をさらに増加させるために(実施例4~9を参照のこと)、(組換え)宿主細胞は、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように追加で操作され得る。
本明細書中で使用されるシグナル認識粒子(SRP)は、特定のタンパク質を認識し、それを真核生物における小胞体及び原核生物における原形質膜に標的化する、豊富に存在するサイトゾルの普遍的に保存されたリボ核タンパク質(タンパク質-RNA複合体)に関する。真核生物では、SRPは、それがリボソームから出現する際に、新たに合成されたペプチドのシグナルペプチド配列、例えばSWP1又はKRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列などに結合する。この結合は、「伸長停止」として公知のタンパク質合成の遅延に導き、タンパク質翻訳過程及びタンパク質移行過程の共役を促進するSRPの保存された機能である。SRPによって、次に、この複合体全体(リボソーム-新生鎖複合体)が、ER(小胞体)膜において、トランスロコンとしても公知であるタンパク質伝導チャネルに標的化される。これは、トランスロコンへの近接において位置付けられるその同族SRP受容体とSRPの相互作用及びドッキングを介して生じる。
真核生物では、SRPとその受容体の間に、グアノシン三リン酸(GTP)結合及び加水分解において機能する3つのドメインがある。これらは、SRP受容体(SRα及びSRβ)及びSRPタンパク質SRP54における2つの関連するサブユニットにおいて位置付けられる。ドッキング時に、新生ペプチド鎖がトランスロコンチャネル中に挿入され、そこで、それはER中に入る。タンパク質合成が、SRPがリボソームから放出される際に再開される。SRP-SRP受容体複合体は、GTP加水分解を介して解離し、SRP媒介性のタンパク質移行のサイクルが継続する。このように、SRP依存性の移行は、一部の場合では、移行の同時翻訳モードと見ることもできる。特定の一実施形態では、ER中への本発明の融合タンパク質の移行は、同時翻訳的である。
一度、ER内に入ると、シグナルペプチド配列は、シグナルペプチダーゼによりコアタンパク質から切断される。シグナルペプチド配列は、従って、成熟タンパク質の一部、例えば本発明の融合タンパク質からの分泌シグナルの切断後の目的の分泌タンパク質などではない。
SRPは、SRP68、SRP72、SRP9~21、SRP54、SRP14、Sec65、及び7SL RNAを含み得る。したがって、「SRPの1つ又は複数の成分」は、SRP68、SRP72、SRP9-21、SRP54、SRP14、Sec65、及び7SL RNAからなる群より選択される少なくとも1つに関し得る。好ましい実施形態では、SRPの全ての成分、即ち、SRP68、SRP72、SRP9-21、SRP54、SRP14、Sec65、及び7SL RNAが宿主細胞中で過剰発現される。有利には、宿主細胞において過剰発現されるSRPの1つ又は複数の成分は、宿主細胞と同じ種から由来する。しかし、また、本発明により包含されるのは、SRPの異種の1つ又は複数の成分が過剰発現され得ることである。さらに、包含されるのは、SRPのもう1つの成分の機能的ホモログが過剰発現されることであり、限定されないが、好ましくはコマガタエラ・ファフィのSRP68、SRP72、SRP9-21、SRP54、SRP14、Sec65、及び7SL RNAの1つ又は複数の機能的ホモログ;あるいは好ましくはコマガタエラ・ファフィのSRP68、SRP72、SRP9-21、SRP54、SRP14、Sec65、及び7SL RNAの機能的ホモログを含む。
したがって、本発明の宿主細胞、好ましくはピキア・パストリスの宿主細胞は、配列番号5~11の1つ又は複数あるいはその機能的ホモログを過剰発現するように操作され得る。本発明の宿主細胞、好ましくはピキア・パストリスの宿主細胞は、配列番号5~11の1つ又は複数を過剰発現するように操作され得る。本発明の宿主細胞、好ましくはピキア・パストリスの宿主細胞は、配列番号5~11又はその機能的ホモログを過剰発現するように操作され得る。本発明の宿主細胞、好ましくはピキア・パストリスの宿主細胞はまた、配列番号5~11を過剰発現するように操作され得る。あるいは、本発明の宿主細胞、好ましくはピキア・パストリスの宿主細胞は、配列番号11~17の1つ又は複数あるいはその機能的ホモログを過剰発現するように操作され得る。本発明の宿主細胞、好ましくはピキア・パストリスの宿主細胞は、配列番号11~17の1つ又は複数を過剰発現するように操作され得る。本発明の宿主細胞、好ましくはピキア・パストリスの宿主細胞は、配列番号11~17又はその機能的ホモログを過剰発現するように操作され得る。本発明の宿主細胞、好ましくはピキア・パストリスの宿主細胞は、配列番号11~17を過剰発現するように操作され得る。
本明細書中で使用されるように、「操作された」宿主細胞は、遺伝子工学を使用して、即ち、ヒトの介入により操作された宿主細胞である。宿主細胞が所与のタンパク質を「過剰発現するように操作」される場合、宿主細胞は、操作されていない宿主細胞との比較において、タンパク質又は機能的ホモログを発現する、増加した能力を有するように操作され、それにより、所定のタンパク質、例えば、本発明の融合タンパク質又は、加えて、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分の発現が、操作前の同じ条件下で宿主細胞と比較して増加する。
「操作前」は、本発明の宿主細胞の状況において使用される場合、そのような宿主細胞が、タンパク質、例えば本発明の融合タンパク質など及び/又はSRPもしくはその機能的ホモログの1つ又は複数の成分をコードするポリヌクレオチドが過剰発現されるように操作されないことを意味する。
本明細書中で使用される用語「組換え」は、本発明の宿主細胞が、目的のタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを備えている、即ち、本発明の宿主細胞が、目的のタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むように操作されることを意味する。これは、例えば、形質転換もしくはトランスフェクション、又は宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入のための当技術分野において公知の任意の他の適切な技術により達成することができる。
過剰発現は、以下に詳細に記載されるように、当業者に公知である任意の方法において達成することができる。一般的に、それは、遺伝子の転写及び/又は翻訳を増加させることにより、例えば遺伝子のコピー数を増加させる、又は遺伝子の発現に関連付けられる調節配列もしくは部位を改変又は修飾することにより達成することができる。例えば、過剰発現は、タンパク質、例えば、目的のタンパク質及び/又はシグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分、あるいは調節配列(例、プロモーター)に作動可能に連結された機能的ホモログをコードするポリヌクレオチドの1つ又は複数のコピーを、宿主細胞中への、又はさらには宿主細胞のそれぞれのゲノム、染色体中への形質転換により導入することにより達成することができる。例えば、遺伝子は、高い発現レベルに達するために、構成的プロモーター及び/又は遍在性プロモーター又は誘導性プロモーターに作動可能に連結することができる。そのようなプロモーターは、内因性プロモーター又は組換えプロモーターであることができる。あるいは、発現が、負の調節配列が除去された場合に構成的になる及び/又は増加するように、調節配列を除去することが可能である。所与の遺伝子の天然プロモーターを、遺伝子の発現を増加させる、又は遺伝子の構成的発現に導く宿主細胞のゲノム、染色体中の異種プロモーターで置換することができる。例えば、プロモーターは、天然プロモーターよりも高い発現レベルに達するために、強力な構成的プロモーター及び/又は強力な遍在性プロモーター又は強力な誘導性プロモーターであることができる。POIならびに/あるいは宿主細胞に対して外来のシグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分が発現される場合では、用語「発現」又は「発現する」及び「過剰発現」又は「過剰発現する」及び「(過剰)発現」及び「(過剰)発現する」は互換的に使用される。例えば、目的のタンパク質ならびに/あるいはシグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分は、操作及び同じ条件下で培養される前の宿主細胞と比較した宿主細胞により、1%超、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、又は300%超だけ(過剰)発現され得る。本明細書中で使用される「過剰発現」は、タンパク質を天然に発現しているが、しかし、当該タンパク質を過剰発現するように操作されていない宿主細胞(対照)との比較において、宿主細胞によるタンパク質(例、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分あるいは目的のタンパク質)発現の増加に関連し得るが、タンパク質発現は、1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、又は300%のいずれか以上だけ増加され得る。さらに、本明細書中で使用される「過剰発現」は、タンパク質を発現するように操作されていない場合にタンパク質を発現しない宿主細胞との比較において、タンパク質(例、目的のタンパク質)の発現に関連し得る。誘導性プロモーターを使用することによって、加えて、宿主細胞の培養の経過において発現を増加させることが可能になる。さらに、過剰発現はまた、例えば、特定の遺伝子の染色体位置を改変すること、特定の遺伝子、例えばリボソーム結合部位又は転写ターミネーターなどに隣接する核酸配列を変更すること、遺伝子の転写及び/又は遺伝子産物の翻訳において含まれるタンパク質(例、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーター及び同様のもの)を修飾すること、あるいは当技術分野における特定の遺伝子ルーチンの発現を調節解除する任意の他の従来の手段(限定されないが、例えば、リプレッサータンパク質の発現をブロックするためのアンチセンス核酸分子の使用を含む)、あるいは、過剰発現されることが望まれる遺伝子の発現を通常は抑制する転写因子についての遺伝子を欠失又は変異させることにより達成することができる。mRNAの寿命を延長することによって、また、発現のレベルが改善され得る。例えば、特定のターミネーター領域を使用して、mRNAの半減期を延長してもよい(Yamanishi et al., Biosci.Biotechnol.Biochem.(2011)75:2234及びUS 2013/0244243)。遺伝子の複数のコピーが含まれる場合、遺伝子は可変のコピー数のプラスミド中に位置付けられる、又は染色体中に組み込まれて増幅される。宿主細胞が遺伝子産物を含まない場合、発現のために遺伝子産物を宿主細胞中に導入することが可能である。この場合では、「過剰発現」は、当業者に公知である任意の方法を使用して遺伝子産物を発現させることを意味する。上に記載される対照との比較における過剰発現、例えば、シグナル認識粒子(SRP)又はその機能的ホモログの1つ又は複数の成分の過剰発現は、当業者に公知の方法により、例えば、SDS Page、SDS Page/ウェスタンプロット、ELISA、又はその後の質量分析(プロテオミクス)を用いたペプチドマップにより測定することができる。例えば、細胞内のシグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分の含量を測定し、対照における含量と比較することができる。従って、細胞を分解しなければならず、含量を次に細胞溶解物中で測定する。目的のタンパク質の過剰発現、それぞれの発現は、例えば、それぞれの宿主細胞及び対照の上清中の目的のタンパク質の含量を測定することにより測定することができ、その含量を次に比較する。上清中の目的のタンパク質の含量は、当業者により公知の方法により、例えば、SDS Page、SDS Page/ウェスタンブロット、ELISA、RP(逆相)HPLC、イオン交換HPLC及び同様のものにより測定することができる。
当業者は、Martin et al.(Bio/Technology 5, 137-146(1987))、Guerrero et al.(Gene 138, 35-41(1994))、Tsuchiya and Morinaga(Bio/Technology 6, 428-430(1988))、Eikmanns et al.(Gene 102, 93-98(1991))、EP 0 472 869、US 4,601,893、Schwarzer and Puehler(Bio/Technology 9, 84-87(1991))、Reinscheid et al.(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132(1994))、LaBarre et al.(Journal of Bacteriology 175, 1001- 1007(1993))、WO 96/15246、Malumbres et al.(Gene 134, 15- 24(1993))、JP-A-10-229891、Jensen and Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195(1998))、及びMakrides(Microbiological Reviews 60, 512-538(1996))において、とりわけ、遺伝学及び分子生物学に関する有名な教科書において関連する説明書を見出すであろう。
本発明の融合タンパク質をコードする核酸又はベクターならびに/あるいはSRPの1つ又は複数の成分をコードするポリヌクレオチドは、好ましくはゲノム中に組み込まれ、より好ましくは宿主細胞の染色体又は非染色体ゲノム部位中に組み込まれる。用語「ゲノム」は、一般的に、DNA(又は特定のウイルス種についてはRNA)中にコード化されている生物の遺伝情報全体を指す。それは、染色体中、プラスミドもしくはベクター上、又はその両方に存在し得る。SRPの1つ又は複数の成分をコードするベクター又は核酸は、好ましくは宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。
本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び/又はSRPの1つ又は複数の成分をコードするポリヌクレオチドは、関連遺伝子の各々を、1つのベクター中に連結することにより宿主細胞中で組換えられ得る。遺伝子を保有する単一ベクター、又は2つの別々のベクター、本発明の融合タンパク質を保有する1つ及びSRPの1つ又は複数の成分を保有する他の1つを構築することが可能である。これらの遺伝子は、そのような核酸、例えば本発明の核酸又は本明細書中に記載されるベクターなどを使用して宿主細胞を形質転換することにより宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子がゲノム中に組み込まれ、SRPの1つ又は複数の成分をコードする遺伝子がプラスミド又はベクター中に組み込まれる。一部の実施形態では、SRPの1つ又は複数の成分をコードする遺伝子がゲノム中に組み込まれ、融合タンパク質をコードする遺伝子がプラスミド又はベクター中に組み込まれる。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子及びSRPの1つ又は複数の成分をコードするポリヌクレオチドが、ゲノム中に組み込まれる。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子及び/又はSRPの1つ又は複数の成分をコードするポリヌクレオチドが、プラスミド又はベクター中に組み込まれる。融合タンパク質をコードする複数の遺伝子が使用される場合、融合タンパク質をコードする一部の遺伝子がゲノム中に組み込まれることができる一方で、他は同じ又は異なるプラスミド又はベクター中に組み込まれることができる。SRPの1つ又は複数の成分をコードする複数の遺伝子が使用される場合、SRPの1つ又は複数の成分をコードする遺伝子の一部がゲノム中に組み込まれることができる一方で、他は同じ又は異なるプラスミド又はベクター中に組み込まれることができる。
SRPの1つ又は複数の成分の過剰発現は、また、宿主細胞の内因性SRPタンパク質の調節エレメントを、宿主細胞の内因性SRPタンパク質のより高い転写に導く調節エレメントにより交換することにより達成され得る。
本発明の方法
本発明の方法
本発明はさらに、真核宿主細胞中で目的のタンパク質を製造する方法に関し、以下を含む
(i)本発明の核酸分子を用いて、又は本発明の発現カセットを用いて組換え宿主細胞を遺伝的に操作し、場合により、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように組換え宿主細胞を遺伝的に操作すること;
(ii)核酸分子及び場合によりSRPの1つ又は複数の成分を発現させ、分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌させる条件下で遺伝的に操作された宿主細胞を培養すること、
(iii)場合により細胞培養物から目的のタンパク質を単離すること、
(iv)場合により目的のタンパク質を精製すること、
(v)場合により目的のタンパク質を修飾すること、ならびに
(vi)場合により目的のタンパク質を製剤化すること。
(i)本発明の核酸分子を用いて、又は本発明の発現カセットを用いて組換え宿主細胞を遺伝的に操作し、場合により、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように組換え宿主細胞を遺伝的に操作すること;
(ii)核酸分子及び場合によりSRPの1つ又は複数の成分を発現させ、分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌させる条件下で遺伝的に操作された宿主細胞を培養すること、
(iii)場合により細胞培養物から目的のタンパク質を単離すること、
(iv)場合により目的のタンパク質を精製すること、
(v)場合により目的のタンパク質を修飾すること、ならびに
(vi)場合により目的のタンパク質を製剤化すること。
製造の方法の工程(i)は、また、本発明の融合タンパク質及び場合によりSRPの1つ又は複数の成分を過剰発現するように組換え宿主細胞を遺伝的に操作することとしても理解され得る(また、セクション「本発明の宿主細胞」における関連開示を参照のこと)。宿主細胞が所与のタンパク質を「過剰発現するように操作」される場合、宿主細胞が操作されて、宿主細胞が、本発明の核酸分子及び場合によりSRPの1つ又は複数の成分を発現する、好ましくは過剰発現する能力を有するようにし、それにより、所与のタンパク質、例えば、本発明の融合タンパク質及び場合によりSRPの1つ又は複数の成分の発現が、操作前の同じ条件下の宿主細胞と比較して増加する。一実施形態では、「過剰発現するように操作された」は、遺伝子改変が、タンパク質の発現を過剰発現又は発現させるために宿主細胞に対して作製される、即ち、細胞が、そのようなタンパク質を過剰発現するように(意図的に)遺伝的に操作されることを意味する。過剰発現するように操作することには、SRPの内因性の1つ又は複数の成分のプロモーターを、より高い転写に導くプロモーターと交換することを含み得る。過剰発現するように操作することは、本明細書中に記載される融合タンパク質及び/又はSRPの1つ又は複数の成分をコードする核酸分子、発現カセット、又はベクターを用いて、宿主細胞を遺伝的に操作することを含み得る。
本発明はさらに、本発明の組換え真核宿主細胞を、本発明の核酸分子を発現させ、分泌シグナルの切断時に分泌シグナルの切断後に目的のタンパク質を分泌させる条件下で培養すること、ならびに分泌シグナルの切断時に宿主細胞培養物から目的のタンパク質を単離すること、及び場合により目的のタンパク質を精製すること、及び場合により修飾すること、及び場合により製剤化することにより、目的のタンパク質を産生する方法に関する。
本明細書中に開示される宿主細胞の状況において使用される「操作前(prior to engineering)」又は「操作前(prior to manipulation)」は、そのような宿主細胞が本発明の融合タンパク質をコードする核酸を使用して操作されていないことを意味する。当該用語は、このように、また、宿主細胞が、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を過剰発現しない、ならびに/あるいはSRPの1つ又は複数の成分を過剰発現するように操作されていないことを意味する。
例えば、本発明の融合タンパク質及び/又はSRPの1つ又は複数の成分をコードする核酸分子配列、プロモーター、エンハンサー、リーダーなどを操作するために使用される手順は、当業者に周知であり、例えば、J.Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(2001)により記載されている。
外来又は標的ポリヌクレオチド、例えば本発明の核酸分子などは、様々な手段、例えば、相同組換えにより、又は組み込み部位の配列を特異的に標的化するハイブリッドリコンビナーゼを使用することより、染色体中に挿入することができる。上に記載される外来又は標的ポリヌクレオチドは、典型的には、ベクター(「挿入ベクター」)中に存在している。これらのベクターは、典型には、相同組換えのために使用される前に環状であり、直線化されている。代替物として、外来又は標的ポリヌクレオチドは、融合PCRにより連結されたDNA断片、又は次に宿主細胞中に組換えられる合成的に構築されたDNA断片であり得る。相同性アームに加えて、ベクターはまた、選択又はスクリーニングのための適切なマーカー、複製の起点、及び他のエレメントを含み得る。ランダム又は非標的組み込みをもたらす異種組換えを使用することも可能である。異種組換えは、有意に異なる配列を伴うDNA分子間の組換えを指す。組換えの方法は当技術分野において公知であり、例えば、Boer et al., Appl Microbiol Biotechnol(2007)77:513-523において記載されている。また、酵母細胞の遺伝子操作については、Principles of Gene Manipulation and Genomics by Primrose and Twyman(7th edition, Blackwell Publishing 2006)を参照してもよい。
本発明の核酸分子及び/又はSRPの1つ又は複数の成分は、また、ベクター、例えば発現ベクターなどの上に存在し得る。そのようなベクターは当技術分野において公知である。発現ベクター中では、プロモーターが、異種タンパク質をコードする遺伝子の上流に配置され、遺伝子の発現を調節する。マルチクローニングベクターは、それらのマルチクローニングサイトに起因して特に有用である。発現のために、プロモーターは、一般的に、マルチクローニングサイトの上流に配置される。本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子あるいはSRPの1つ又は複数の成分の組み込みのためのベクターは、本発明の融合タンパク質あるいはSRPの1つ又は複数の成分をコードする全DNA配列を含むDNA構築物を最初に調製し、その後にこの構築物を適切な発現ベクター中に挿入することにより、又は、個々のエレメント、例えばDNA結合ドメイン、活性化ドメインなどについての遺伝情報を含むDNA断片を連続的に挿入し、それに続くライゲーションにより構築してもよい。断片の制限及びライゲーションに対する代替として、付着部位(att)及び組換え酵素に基づく組換え方法を使用して、DNA配列をベクター中に挿入してもよい。そのような方法は、例えば、Landy(1989)Ann.Rev.Biochem.58:913-949により記載されており;当業者に公知である。
本発明に従った宿主細胞は、標的ポリヌクレオチド配列、例えば本発明の核酸分子などを含むベクター又はプラスミドを細胞中に導入することにより得ることができる。真核細胞をトランスフェクトもしくは形質転換する、又は原核細胞を形質転換するための技術は、当技術分野において周知である。これらは、脂質小胞媒介性の取り込み、熱ショック媒介性の取り込み、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介性のトランスフェクション(リン酸カルシウム/DNA共沈殿)、特に改変ウイルス、例えば、改変アデノウイルスなどを使用したウイルス感染、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションを含み得る。原核生物の形質転換のために、技術は、熱ショック媒介性の取り込み、インタクト細胞との細菌プロトプラスト融合、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションを含み得る。植物形質転換の技術は、例えばA.ツメフアシェンスなどによるアグロバクテリウム媒介性転移、迅速推進タングステン又は金微粒子、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、及びポリエチレングリコール媒介性の取り込みを含む。DNAは、一本鎖又は二本鎖、線状又は環状、弛緩又はスーパーコイルDNAであり得る。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための種々の技術については、例えば、Keown et al.(1990)Processes in Enzymology 185:527-537を参照のこと。
本発明の核酸分子を発現し、場合により「SRPの1つ又は複数の成分」を過剰発現する条件下で(遺伝的に操作された)宿主細胞を培養するという語句は、目的の所望のタンパク質の産生を得る、あるいはSRPの1つ又は複数の成分を過剰発現させるのに適した又は十分な条件(例、温度、圧力、pH、誘導、成長速度、培地、期間、供給など)下で真核宿主細胞を維持及び/又は成長させることを指す。
本発明の核酸分子で、又は本発明の発現カセットで宿主細胞を操作し、場合により、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように宿主細胞を遺伝的に操作することにより得られる、本発明に従った宿主細胞は、好ましくは、組換えタンパク質を発現させる負担を伴うことなく、多数の細胞まで効率的に成長する条件で最初に培養してもよい。細胞を、融合タンパク質の発現のために調製する場合、適切な培養条件を選択及び最適化して、融合タンパク質を産生する。
例として、融合タンパク質及びSRPの1つ又は複数の成分について異なるプロモーター及び/又はコピー及び/又は組み込み部位を使用して、融合タンパク質の発現を、SRPの1つ又は複数の成分の発現に関連する誘導の時間点及び強度に関して制御することができる。例えば、融合タンパク質の誘導の前に、SRPの1つ又は複数の成分が最初に発現され得る。これは、SRPの1つ又は複数の成分が、融合タンパク質の翻訳の開始時に既に存在しているという利点を有する。あるいは、融合タンパク質及びSRPの1つ又は複数の成分を同時に誘導することができる。
誘導性プロモーターを使用してもよく、それは、誘導刺激が適用されるとすぐに活性化され、その制御下で遺伝子の転写を指示する。誘導刺激を伴う成長条件下では、細胞は、通常条件よりも遅く成長するが、しかし、培養が、以前の段階において既に高い細胞数まで成長しているため、培養システムは、全体として多量の組換えタンパク質を産生する。誘導刺激は、好ましくは、適した薬剤(例、AOXプロモーターについてはメタノール)の添加又は適した栄養素(例、MET3プロモーターについてはメチオニン)の枯渇である。また、エタノール、メチルアミン、カドミウム又は銅、ならびに熱又は浸透圧増加剤の添加は、融合タンパク質及びSRPの1つ又は複数の成分に作動可能に連結されたプロモーターに依存して発現を誘導することができる。
少なくとも1g/L、好ましくは少なくとも10g/L細胞乾燥重量、より好ましくは少なくとも50g/L細胞乾燥重量を得るために、最適化された成長条件下で本発明に従った宿主細胞をバイオリアクター中で培養することが好ましい。生体分子産生のそのような収量を、実験室規模だけでなく、しかし、また、パイロット規模又は工業規模で達成することが有利である。
本発明に従った宿主細胞は、細胞培養物の上清又は細胞均質化後の細胞の細胞ホモジネート中の目的のタンパク質の力価を、標準的なテスト、例えば、ELISA、活性アッセイ、HPLC、表面プラズモン共鳴(Biacore)、ウェスタンブロット、キャピラリー電気泳動(Caliper)又はSDS-Pageを使用することにより測定することにより、その発現/分泌能力又は収量についてテストされ得る。
好ましくは、宿主細胞は、適切な炭素源を伴う最少培地中で培養され、それにより、単離過程がさらに有意に単純化される。一例として、最少培地は、利用可能な炭素源(例、グルコース、グリセロール、エタノール、又はメタノール)、多量元素(カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、硫酸塩、リン酸塩)及び微量元素(銅、ヨウ化物、マンガン、モリブデン酸塩、コバルト、亜鉛、及び鉄塩、ならびにホウ酸)を含む塩を含む。
酵母細胞の場合では、細胞は、上に記載する発現ベクターの1つ又は複数で形質転換され、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適するように修飾された従来の栄養培地中で培養され得る。酵母の成長のために適切な多数の最少培地が、当技術分野において公知である。これらの培地のいずれかが、必要に応じて、塩(例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩)、緩衝液(例えばHEPES、クエン酸、及びリン酸緩衝液)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジンなど)、微量元素、ビタミン、及びグルコース又は等価のエネルギー供給源で添加され得る。任意の他の必要なサプリメントがまた、適した濃度で含まれてもよく、それは当業者に公知であろう。培養条件、例えば温度、pH及び同様のものなどは、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用された培養条件であり、当業者に公知である。他の種類の宿主細胞のための細胞培養条件も公知であり、当業者により容易に決定することができる。種々の微生物のための培養培地の説明は、例えば、米国細菌学会のハンドブック「Manual of Methods for General Bacteriology」(ワシントンD.C、米国、1981年)に含まれている。
宿主細胞は、継続的又は断続的に、従来の培養方法、例えば試験管培養、振盪培養(例、回転振盪培養、振盪フラスコ培養など)、通気スピナー培養、発酵などにより培養することができる。一部の実施形態では、細胞は振盪フラスコ又はディープウェルプレート中で培養される。さらに他の実施形態では、細胞はバイオリアクター中で(例、バイオリアクター培養過程中で)培養される。培養過程は、限定されないが、バッチ、フェドバッチ培養、及び連続培養方法を含む。用語「バッチ過程」及び「バッチ培養」は、培地、栄養素、補助添加剤及び同様のものの組成が、培養の開始時に設定され、培養の間の改変に供されない閉鎖システムを指す;しかし、試みが、過剰な培地の酸性化及び/又は細胞死を防止するために、pH及び酸素濃度などの因子を制御するためになされ得る。用語「フェドバッチ過程」及び「フェドバッチ培養」は、培養が進行するにつれて、1つ又は複数の基質又はサプリメントが加えられる(例、増分又は連続的に加えられる)ことを除いて、バッチ培養を指す。用語「連続過程」及び「連続培養」は、定義された培養培地が、バイオリアクターに連続的に加えられ、等量の使用済み又は「条件づけ」培地が、例えば、所望の産物回収のために同時に除去されるシステムを指す。多様なそのような過程が開発されており、当技術分野において周知である。
一部の実施形態では、宿主細胞は約12~24時間にわたり培養され、他の実施形態では、宿主細胞は約24~36時間、約36~48時間、約48~72時間、約72~96時間、約96時間~120時間、約120~144時間、又は144時間を超える期間にわたり培養される。さらに他の実施形態では、培養は、POIの望ましい産生収量に達するのに十分な時間にわたり継続される。
本発明の方法、例えば、目的のタンパク質を製造する方法又は目的のタンパク質の分泌を増加させる方法は、発現されたPOIを単離する工程をさらに含み得る。POIは細胞から分泌され、最先端の技術を使用して培養培地から単離及び精製することができる。分泌の過程の間に、分泌シグナルは切断される。細胞からのPOIの分泌が一般的に好ましい。なぜなら、産物が、細胞が破壊されて細胞内タンパク質が放出された場合にもたらされるタンパク質の複雑な混合物からではなく、培養上清から回収される。プロテアーゼ阻害剤は、精製の間にタンパク質分解を阻害するのに有用であり得る。組成物は、当技術分野において公知の方法を使用して、濃縮、濾過、透析などされ得る。発酵/培養後の細胞培養物は、セパレーター又はチューブ遠心機を使用して遠心分離し、細胞を培養上清から分離することができる。上清を次に、タンジェンシャルフロー濾過を使用することにより濾過又は濃縮することができる。
POIを得るための単離及び精製方法は、溶解度における差を利用した方法、例えば塩析、溶媒沈殿、加熱沈殿など、分子量における差を利用した方法、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、及びゲル電気泳動など、電荷における差を利用した方法、例えばイオン交換クロマトグラフィーなど、特異的親和性を利用した方法、例えば親和性クロマトグラフィーなど、疎水性における差を利用した方法、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー及び逆相高速液体クロマトグラフィーなど、等電点における差を利用した方法、例えば等電点電気泳動など、特定のアミノ酸を利用する方法、例えばIMAC(固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー)などに基づき得る。POIが不活性で可溶性の封入体として発現される場合、可溶化された封入体をリフォールディングする必要がある。
単離及び精製されたPOIは、従来の方法、例えばウェスタンブロッティング又はPOI活性についての特異的アッセイなどにより同定することができる。精製されたPOIの構造は、アミノ酸分析、アミノ末端ペプチド配列決定、例えば質量分析による一次構造分析、RP-HPLC、イオン交換-HPLC、ELISA及び同様のものにより決定することができる。POIは、大量に及び高純度レベルにおいて入手可能であり、このように、医薬組成物中の活性成分として、又は飼料もしくは食品添加物として使用するための必要な要件を満たすことが好ましい。
本明細書中で使用される用語「単離された」は、自然界において生じない形態又は環境中の物質を意味する。単離された物質の非限定的な例は、(1)任意の非天然物質、(2)限定されないが、自然界において関連付けられる天然成分の1つ又は複数あるいは全てから少なくとも部分的に除去された、任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド、又は補因子を含む任意の物質;(3)自然において関連付けられる物質に対して人間の手により修飾された物質、例えば、mRNAから作製されたcDNA;又は(4)天然に関連付けられる他の成分と比べて、物質の量を増加させることにより修飾された任意の物質(例、宿主細胞における組換え産生;物質をコードする遺伝子の複数のコピー;及びその物質をコードする遺伝子に天然に関連付けられるプロモーターよりも強いプロモーターの使用)を含む。
用語「目的のタンパク質を修飾する」は、POIが化学的又は酵素的に修飾されることを意味する。タンパク質を修飾するための、当技術分野において公知である多くの方法がある。タンパク質は炭水化物又は脂質と共役することができる。POIは、半減期延長のためにPEG化(ポリエチレングリコールに化学的に共役されたPOI)又はHES化(ヒドロキシエチルデンプンに化学的に共役されたPOI)されてもよい。POIはまた、他の部分、例えば、半減期延長のためのヒト血清アルブミンについての親和性ドメインなどと共役されてもよい。POIはまた、プロテアーゼにより、又は切断のための加水分解条件下で処理されて、プレ配列から活性成分を形成する、又は精製のためにタグ、例えば親和性タグなどを切断し得る。POIはまた、他の部分、例えば毒素、放射性部分、又は他の任意の部分などに共役され得る。POIは、二量体、三量体及び同様のものを形成する条件下でさらに処理され得る。
さらに、用語「目的のタンパク質を配合する」は、POIをより長時間にわたり保存することができる条件にPOIをもたらすことを指す。当技術分野において公知の多くの異なる方法が、タンパク質を安定化するために利用可能である。POIが精製及び/又は修飾後に存在する緩衝液を交換することにより、POIをより安定な条件下に置くことができる。異なる緩衝物質及び添加剤、例えばスクロース、中性界面活性剤、安定剤及び同様のものが、当技術分野において公知であり、使用することができる。POIはまた、凍結乾燥により安定化することができる。一部のPOIについては、製剤化を、POIと、脂質又はリポタンパク質、例えばポリプレックスなど、及び同様のものとの複合体の形成により行うことができる。一部のタンパク質は、他のタンパク質と同時製剤化され得る。
本発明の分泌シグナルの使用によって、目的のタンパク質の分泌が増加し得る。したがって、本発明はまた、真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法に関し、当該真核宿主細胞において本発明の核酸分子を発現させること、及び場合により宿主細胞を遺伝的に操作して、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現させ、それにより、本明細書中で定義される融合タンパク質を発現するが、しかし、本発明の核酸分子において定義される分泌シグナルの代わりに野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(例えば配列番号4など)を含む宿主細胞との比較において、当該目的のタンパク質の分泌を増加させることを含む。
本明細書中で使用される「分泌」は、本発明の融合タンパク質の一部を形成する目的のタンパク質の(組換え)宿主細胞からの転移に関する。このように、分泌シグナルではなく、目的のタンパク質だけが分泌される。シグナルペプチド配列は小胞体中で切断され、MFαプロ配列はゴルジ装置中で切断される。このように、分泌が増加する場合、目的のタンパク質の分泌だけが増加する。細胞培養物の上清中の目的のタンパク質の力価は、標準的なテスト、例えば、ELISA、活性アッセイ、HPLC、表面プラズモン共鳴(Biacore)、ウェスタンブロット、キャピラリー電気泳動(Caliper)、又はSDS-Pageを使用して決定することができる。
真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法は、本発明の核酸分子を発現するための発現構築物を組み入れるように当該宿主細胞を操作すること、及び、場合により、真核宿主細胞を遺伝的に操作して、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現させることをさらに含み得る。
真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法は、本発明の核酸分子を発現する条件下で当該宿主細胞を培養すること、ならびに、場合により、SRPの1つ又は複数の成分を過剰発現するように、及び分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌するように宿主細胞を遺伝的に操作することをさらに含み得る。
真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法は、細胞培養物から目的のタンパク質を単離することをさらに含み得る。
真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法は、目的のタンパク質を精製することをさらに含み得る。
真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法は、目的のタンパク質を修飾することをさらに含み得る。
真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法は、目的のタンパク質を製剤化することをさらに含み得る。
真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法において、本発明の核酸分子は、当該宿主細胞の染色体中に組み込まれ得る、又はベクターもしくはプラスミド中に含まれ得るが、それは、当該宿主細胞の染色体中に組み込まれない。
本発明の使用
本発明の使用
当業者であれば、本明細書中に記載される分泌シグナルを使用して、目的の組換えタンパク質の分泌を増加させることができることを容易に認識するであろう。したがって、本発明はまた、真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させるための、本明細書中で定義される分泌シグナルの使用に関する。本明細書中で既に記載されているように、分泌シグナルは、N末端からC末端まで、KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列、場合により、それに続くα接合因子(MFα)プロ配列を含み得る。したがって、本発明はまた、真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させるための、本明細書中で定義される分泌シグナルの使用にも関し、それにおいて、分泌シグナルは、N末端からC末端まで、KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列、それに続くα接合因子(MFα)プロ配列を含む。本発明はまた、真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させるための、本明細書中で定義される分泌シグナルの使用に関し、それにおいて、分泌シグナルは、KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列を含む。本明細書中で既に記載されるように、分泌シグナルは、N末端からC末端まで、SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列、場合により、それに続くα接合因子(MFα)プロ配列を含み得る。したがって、本発明はまた、真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させるための、本明細書中で定義される分泌シグナルの使用に関し、それにおいて、分泌シグナルは、N末端からC末端まで、SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列、それに続くα接合因子(MFα)プロ配列を含む。本発明はまた、真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させるための、本明細書中で定義される分泌シグナルの使用に関し、それにおいて、分泌シグナルは、SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列を含む。
分泌シグナルは、本明細書中で定義される分泌シグナルの代わりに、野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(例えば配列番号4など)を含む、本発明の融合タンパク質を発現する真核宿主細胞との比較において、真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させ得る。
当業者が容易に理解するように、本発明の組換え宿主細胞は、目的の種々のタンパク質の産生のために有用である。なぜなら、それらは、上清に効率的に分泌され、それにより宿主細胞の溶解を回避するためである。したがって、本発明はさらに、目的のタンパク質を製造するための、本発明の組換え宿主細胞の使用に関する。
項目
1.N末端からC末端まで以下を含む融合タンパク質をコードする核酸分子:
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(I)(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;
又は
(II)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
2.分泌シグナルによって、項目1の核酸分子を発現するが、しかし、項目1において定義される分泌シグナルの代わりに野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(配列番号4など)を含む当該真核宿主細胞との比較において、真核宿主細胞からの目的の当該タンパク質の分泌が増加する、項目1の核酸分子。
3.KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列が、配列番号1又はその機能的ホモログを含む、項目1又は2の核酸分子。
4.SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列が、配列番号2もしくは52又はその機能的ホモログを含む、項目1又は2の核酸分子。
5.MFαプロ配列が、配列番号3もしくは53又はその機能的ホモログを含む、ならびに/あるいはMFαプロ配列が、配列番号53の位置23に対応する位置にSer及び/又は配列番号53の位置64に対応する位置にGluを含む、項目1~4のいずれか一つの核酸分子。
6.項目1~5のいずれか一つの核酸分子であって、目的のタンパク質は、抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体など、又は二重特異性抗体、又は抗原結合抗体断片、例えばFabもしくはF(ab)2など、単鎖抗体、例えばscFvなど、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科動物のVHH断片又は重鎖抗体又はドメイン抗体(dAb)など、人工抗原結合分子、例えばDARPINなど、ibody、アフィボディ、ヒューマボディ、又はリポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、酵素、例えばプロセス酵素など、サイトカイン、成長因子、ホルモン、タンパク質抗生物質、融合タンパク質、例えば毒素融合タンパク質など、構造タンパク質、調節タンパク質、及びワクチン抗原からなる群より選択され、好ましくは、目的のタンパク質は、治療用タンパク質、食品添加物、又は飼料添加物である。
7.項目1~6のいずれか一つにおいて定義される分泌シグナル。
8.項目1~6のいずれか一つの核酸分子及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット又はベクター。
9.項目1~6のいずれか一つの核酸分子、又は項目8の発現カセットもしくはベクターを含む組換え真核宿主細胞であって、好ましくは、
(a)宿主細胞が、コマガタエラ・ファフィ(ピキア・パストリス)、ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニ、コマガタエラ属、及びシゾサッカロミセス・ポンベからなる群より選択される真菌もしくは酵母宿主細胞、好ましくは酵母宿主細胞、又は真菌宿主細胞、例えばトリコデルマ・リーゼイもしくはアスペルギルス・ニガーなどであり得る;及び/又は
(b)宿主細胞が、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように操作される。
10.真核宿主細胞において目的のタンパク質を製造する方法であって、
(i)項目1~6のいずれか一つの核酸分子を用いて、又は項目8の発現カセットもしくはベクターを用いて真核宿主細胞を遺伝的に操作すること、及び場合によりシグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように真核宿主細胞を遺伝的に操作すること;
(ii)核酸分子を発現し、及び場合によりSRPの1つ又は複数の成分を過剰発現し、分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌する条件下で遺伝的に操作された宿主細胞を培養すること、
(iii)場合により細胞培養物から目的のタンパク質を単離すること、
(iv)場合により目的のタンパク質を精製すること、
(v)場合により目的のタンパク質を修飾すること、及び
(vi)場合により目的のタンパク質を製剤化することを含む方法。
11.真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法であって、当該真核宿主細胞において項目1~6のいずれか一つの核酸分子を発現させること、及び、場合により真核宿主細胞を操作して、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現させ、それにより、項目1~6の核酸分子を発現するが、ただし、項目1~6のいずれかにおいて定義される分泌シグナルの代わりに野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(例えば配列番号4など)を含むことを除く、当該宿主細胞との比較において、当該目的のタンパク質の分泌を増加させることを含む。
12.項目10又は11の方法であって、
(a)方法が、
(i)項目1~6のいずれか一つの核酸分子を発現する発現構築物を組み入れるように当該宿主細胞を操作すること、及び場合によりシグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように宿主細胞を遺伝的に操作すること、
(ii)当該核酸分子を発現し、及び場合によりSRPの1つ又は複数の成分を過剰発現し、分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌する条件下で当該宿主細胞を培養すること、
(iii)場合により細胞培養物から目的のタンパク質を単離すること、
(iv)場合により目的のタンパク質を精製すること、
(v)場合により目的のタンパク質を修飾すること、及び
(vi)場合により目的のタンパク質を製剤化することを含み、ならびに/あるいは
(b)核酸分子は、当該宿主細胞の染色体中に組み込まれる、又は当該宿主細胞の染色体中に組み込まれない発現カセット、ベクター、もしくはプラスミド中に含まれる;ならびに/あるいは
(c)真核宿主細胞が真菌宿主細胞もしくは酵母宿主細胞であり、好ましくは、コマガタエラ・ファフィ(ピキア・パストリス)、ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・パラドクサス、サッカロミセス・ユーバヤヌス、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィ、サッカロミセス・クルイベリ、サッカロミセス・ウヴァルム、クルイベロミセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニ、コマガタエラ属、及びシゾサッカロミセス・ポンベからなる群より選択される真菌宿主細胞もしくは酵母宿主細胞、好ましくは酵母宿主細胞、又は真菌宿主細胞、例えばトリコデルマ・リーゼイもしくはアスペルギルス・ニガーである;ならびに/あるいは
(d)目的のタンパク質が、抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体など、又は二重特異性抗体、又は抗原結合抗体断片、例えばFabもしくはF(ab)2など、単鎖抗体、例えばscFvなど、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科動物のVHH断片又は重鎖抗体又はドメイン抗体(dAb)など、人工抗原結合分子、例えばDARPINなど、ibody、アフィボディ、ヒューマボディ、又はリポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、酵素、例えばプロセス酵素など、サイトカイン、成長因子、ホルモン、タンパク質抗生物質、融合タンパク質、例えば毒素融合タンパク質など、構造タンパク質、調節タンパク質、及びワクチン抗原からなる群より選択され、好ましくは、目的のタンパク質は、治療用タンパク質、食品添加物、又は飼料添加物である。
13.真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させるための、項目1~7のいずれか一つにおいて定義される分泌シグナルの使用であって、好ましくは、分泌シグナルは、項目1において定義される分泌シグナルの代わりに、野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(例えば配列番号4など)を含む、項目1において定義される融合タンパク質を発現する当該真核宿主細胞との比較において、真核宿主細胞からの当該目的のタンパク質の分泌を増加させる。
14.目的のタンパク質を製造するための、項目9の組換え真核宿主細胞の使用。
15.項目1~6のいずれか一つの核酸分子を発現し、分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌する条件下で項目9の組換え真核宿主細胞を培養し、ならびに宿主細胞培養物から目的のタンパク質を単離し、及び場合により目的のタンパク質を精製し、及び場合により修飾し、及び場合により製剤化することにより、目的のタンパク質を産生する方法。
項目
1.N末端からC末端まで以下を含む融合タンパク質をコードする核酸分子:
(a)分泌シグナルであって、分泌シグナルが以下を含む:
(I)(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;
又は
(II)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(b)目的のタンパク質。
2.分泌シグナルによって、項目1の核酸分子を発現するが、しかし、項目1において定義される分泌シグナルの代わりに野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(配列番号4など)を含む当該真核宿主細胞との比較において、真核宿主細胞からの目的の当該タンパク質の分泌が増加する、項目1の核酸分子。
3.KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列が、配列番号1又はその機能的ホモログを含む、項目1又は2の核酸分子。
4.SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列が、配列番号2もしくは52又はその機能的ホモログを含む、項目1又は2の核酸分子。
5.MFαプロ配列が、配列番号3もしくは53又はその機能的ホモログを含む、ならびに/あるいはMFαプロ配列が、配列番号53の位置23に対応する位置にSer及び/又は配列番号53の位置64に対応する位置にGluを含む、項目1~4のいずれか一つの核酸分子。
6.項目1~5のいずれか一つの核酸分子であって、目的のタンパク質は、抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体など、又は二重特異性抗体、又は抗原結合抗体断片、例えばFabもしくはF(ab)2など、単鎖抗体、例えばscFvなど、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科動物のVHH断片又は重鎖抗体又はドメイン抗体(dAb)など、人工抗原結合分子、例えばDARPINなど、ibody、アフィボディ、ヒューマボディ、又はリポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、酵素、例えばプロセス酵素など、サイトカイン、成長因子、ホルモン、タンパク質抗生物質、融合タンパク質、例えば毒素融合タンパク質など、構造タンパク質、調節タンパク質、及びワクチン抗原からなる群より選択され、好ましくは、目的のタンパク質は、治療用タンパク質、食品添加物、又は飼料添加物である。
7.項目1~6のいずれか一つにおいて定義される分泌シグナル。
8.項目1~6のいずれか一つの核酸分子及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット又はベクター。
9.項目1~6のいずれか一つの核酸分子、又は項目8の発現カセットもしくはベクターを含む組換え真核宿主細胞であって、好ましくは、
(a)宿主細胞が、コマガタエラ・ファフィ(ピキア・パストリス)、ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニ、コマガタエラ属、及びシゾサッカロミセス・ポンベからなる群より選択される真菌もしくは酵母宿主細胞、好ましくは酵母宿主細胞、又は真菌宿主細胞、例えばトリコデルマ・リーゼイもしくはアスペルギルス・ニガーなどであり得る;及び/又は
(b)宿主細胞が、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように操作される。
10.真核宿主細胞において目的のタンパク質を製造する方法であって、
(i)項目1~6のいずれか一つの核酸分子を用いて、又は項目8の発現カセットもしくはベクターを用いて真核宿主細胞を遺伝的に操作すること、及び場合によりシグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように真核宿主細胞を遺伝的に操作すること;
(ii)核酸分子を発現し、及び場合によりSRPの1つ又は複数の成分を過剰発現し、分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌する条件下で遺伝的に操作された宿主細胞を培養すること、
(iii)場合により細胞培養物から目的のタンパク質を単離すること、
(iv)場合により目的のタンパク質を精製すること、
(v)場合により目的のタンパク質を修飾すること、及び
(vi)場合により目的のタンパク質を製剤化することを含む方法。
11.真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法であって、当該真核宿主細胞において項目1~6のいずれか一つの核酸分子を発現させること、及び、場合により真核宿主細胞を操作して、シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現させ、それにより、項目1~6の核酸分子を発現するが、ただし、項目1~6のいずれかにおいて定義される分泌シグナルの代わりに野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(例えば配列番号4など)を含むことを除く、当該宿主細胞との比較において、当該目的のタンパク質の分泌を増加させることを含む。
12.項目10又は11の方法であって、
(a)方法が、
(i)項目1~6のいずれか一つの核酸分子を発現する発現構築物を組み入れるように当該宿主細胞を操作すること、及び場合によりシグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように宿主細胞を遺伝的に操作すること、
(ii)当該核酸分子を発現し、及び場合によりSRPの1つ又は複数の成分を過剰発現し、分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌する条件下で当該宿主細胞を培養すること、
(iii)場合により細胞培養物から目的のタンパク質を単離すること、
(iv)場合により目的のタンパク質を精製すること、
(v)場合により目的のタンパク質を修飾すること、及び
(vi)場合により目的のタンパク質を製剤化することを含み、ならびに/あるいは
(b)核酸分子は、当該宿主細胞の染色体中に組み込まれる、又は当該宿主細胞の染色体中に組み込まれない発現カセット、ベクター、もしくはプラスミド中に含まれる;ならびに/あるいは
(c)真核宿主細胞が真菌宿主細胞もしくは酵母宿主細胞であり、好ましくは、コマガタエラ・ファフィ(ピキア・パストリス)、ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・パラドクサス、サッカロミセス・ユーバヤヌス、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィ、サッカロミセス・クルイベリ、サッカロミセス・ウヴァルム、クルイベロミセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニ、コマガタエラ属、及びシゾサッカロミセス・ポンベからなる群より選択される真菌宿主細胞もしくは酵母宿主細胞、好ましくは酵母宿主細胞、又は真菌宿主細胞、例えばトリコデルマ・リーゼイもしくはアスペルギルス・ニガーである;ならびに/あるいは
(d)目的のタンパク質が、抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体など、又は二重特異性抗体、又は抗原結合抗体断片、例えばFabもしくはF(ab)2など、単鎖抗体、例えばscFvなど、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科動物のVHH断片又は重鎖抗体又はドメイン抗体(dAb)など、人工抗原結合分子、例えばDARPINなど、ibody、アフィボディ、ヒューマボディ、又はリポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、酵素、例えばプロセス酵素など、サイトカイン、成長因子、ホルモン、タンパク質抗生物質、融合タンパク質、例えば毒素融合タンパク質など、構造タンパク質、調節タンパク質、及びワクチン抗原からなる群より選択され、好ましくは、目的のタンパク質は、治療用タンパク質、食品添加物、又は飼料添加物である。
13.真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させるための、項目1~7のいずれか一つにおいて定義される分泌シグナルの使用であって、好ましくは、分泌シグナルは、項目1において定義される分泌シグナルの代わりに、野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(例えば配列番号4など)を含む、項目1において定義される融合タンパク質を発現する当該真核宿主細胞との比較において、真核宿主細胞からの当該目的のタンパク質の分泌を増加させる。
14.目的のタンパク質を製造するための、項目9の組換え真核宿主細胞の使用。
15.項目1~6のいずれか一つの核酸分子を発現し、分泌シグナルの切断時に目的のタンパク質を分泌する条件下で項目9の組換え真核宿主細胞を培養し、ならびに宿主細胞培養物から目的のタンパク質を単離し、及び場合により目的のタンパク質を精製し、及び場合により修飾し、及び場合により製剤化することにより、目的のタンパク質を産生する方法。
本明細書中で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数の参照を含むことに注意する。このように、例えば、「試薬(reagent)」への言及は、そのような異なる試薬の1つ又は複数を含み、「方法(method)」への参照は、本明細書中に記載される方法について修飾又は置換することができる、当業者に公知の同等の工程及び方法への言及を含む。
他に示さない限り、一連の要素の前にある用語「少なくとも(at least)」は、一連のすべての要素を指すと理解すべきである。当業者は、本明細書中に記載される、本発明の特定の実施形態との多くの等価物を認識する、又はルーチン実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような等価物は、本発明により包含されることが意図される。
用語「及び/又は(and/or)」は、本明細書中で使用される場合はいつでも、「及び(and)」、「又は(or)」、及び「当該用語により接続される要素の全て又は任意の他の組み合わせ(all or any other combination of the elements connected by said term)」の意味を含む。
用語「約(about)」は、プラス又はマイナス20%、好ましくはプラス又はマイナス10%、より好ましくはプラス又はマイナス5%、最も好ましくはプラス又はマイナス1%を意味する。
用語「未満(less than)」又は次に「を上回る(more than)」は、具体的な数字を含まない。
例えば、20未満は、示された数未満であることを意味する。同様に、「を上回る(more than)」又は「より大きい(greater than)」は、示された数値を上回る又はそれより大きいことを意味し、例えば、「80%を上回る(more than 80 %)」は、示された数値の80%を上回る又はそれより大きいことを意味する。
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲全体を通じて、文脈が他に要求しない限り、語「含む(comprise)」、及び変形、例えば「含む(comprises)」及び「含んでいる(comprising)」などは、記載された整数もしくは工程又は整数もしくは工程の群の包含を意味するが、しかし、任意の他の整数もしくは工程又は整数もしくは工程の群の除外を意味しないと理解され得る。本明細書中で使用される場合、用語「含んでいる(comprising)」は、用語「含んでいる(containing)」又は「含んでいる(including)」で、時折、本明細書中で使用される場合、用語「有する(having)」で置換することができる。本明細書中で使用される場合、「からなる(consisting of)」は、特定されていない要素、工程、又は成分を除外する。
用語「含んでいる(including)」は、「限定されないが、含む(including but not limited to)」を意味する。「含んでいる(including)」及び「限定されないが、含む(including but not limited to)」は、互換的に使用される。
本発明は、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコール、材料、試薬、及び物質などに限定されず、そのようなものとして、変動し得ることを理解すべきである。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載することだけの目的のためであり、本発明の範囲を限定することを意図せず、それは、特許請求の範囲のみにより定義される。
本明細書の本文全体を通して引用される全ての刊行物(全ての特許、特許出願、科学出版物、説明書などを含む)は、上記又は下記のいずれでも、それらの全体において参照により本明細書により組み入れられる。本明細書中のいかなるものも、本発明が、先願発明のおかげでそのような開示に先立つ権利がないことの承認として解釈すべきではない。参照により組み入れられた資料が、本明細書と矛盾する、又は不一致である限り、本明細書は、任意のそのような資料に取って代わる。
本明細書中で引用される全ての文書及び特許文書の内容が、それらの全体において参照により組み入れられる。
実施例
実施例
本発明の及びその利点のさらに良い理解が、例証目的だけのために提供される以下の実施例から明らかであろう。実施例は、任意の方法において本発明の範囲を限定することを意図しない。努力が、使用される数値(例、量、温度、濃度など)に関する正確性を確保するためになされてきたが、しかし、一部の実験誤差及び偏差が許容されるべきである。他に示されない限り、部分は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり;及び圧力は大気圧である、もしくはそれに近い。
以下の実施例は、新たに同定されたシグナルペプチドが、サッカロミセス・セレビシエのアルファ接合因子のプロ配列との組み合わせにおいて、一般に使用されるS.セレビシエのアルファ接合因子プレプロリーダーを含む公知の分泌リーダーと比較し、分泌された組換えタンパク質の力価(容積当たりの産物(mg/g))及び収量(湿細胞重量として測定されるバイオマス当たりの産物(mg/L))を増加させることを実証する。一例として、新規シグナルペプチドの使用によって、酵母ピキア・パストリスにおける異なる組換えタンパク質及び抗体誘導体(単鎖可変断片、単一ドメイン抗体、抗原結合断片、及び検出が簡単なタンパク質(scR、VHH、SDZ-Fab、m-Cherry)を含む)の収量増加に導かれた。プラスの効果は、振盪培養(24ディープウェルプレート中で実施)中で及びフェドバッチバイオリアクター培養中で示された。
実施例1:新規シグナルペプチドの選択。
実施例1:新規シグナルペプチドの選択。
ピキア・パストリス(同義語コマガタエラ属)を含む最も一般に使用される分泌シグナル酵母は、サッカロミセス・セレビシエアルファ接合因子(MFα)プレプロリーダー、即ち、MFα分泌シグナルである。一部の組換えタンパク質は、MFα分泌シグナルを用いて非効率的に分泌され、従って、低い産生力価だけに達する。このように、分泌効率を増加させるための新規シグナルペプチド及び分泌シグナルについての緊急の必要性がある。
分泌における最初の重要な工程は、小胞体(ER)中への組換えタンパク質の移行である。この過程は、組換えタンパク質に融合されたN末端切断可能な分泌シグナルにより指示される。組換えタンパク質の分泌のために、少なくともN末端切断可能なシグナルペプチド配列が必要とされる。これらは、最も広く使用されているプログラムSignalPを用いて、アミノ酸配列から予測することができる(Nielsen、2017)。P.パストリスの配列データに基づいて、SignalP 4.1によって、切断可能なシグナルペプチド(SP)を有する241のタンパク質が予測された(Valli et al., 2016)。しかし、同時翻訳SP又は翻訳後SPの間には区別がなく、即ち、予測されたSPは、同時翻訳的に又は翻訳後に作用し得るが、アミノ酸配列自体は、予測されたシグナルペプチド配列が組換え体融合タンパク質(即ち、このシグナルペプチド配列により天然に分泌されるタンパク質とは異なるタンパク質)を分泌できるか否かの情報を与えない。今日まで、十分に異なる特徴は、主要な物理化学的特性、例えばシグナルペプチド配列の疎水性、推定結合モチーフ、又は他の配列パターンなどに関して見出されておらず、それらによって、組換えタンパク質の同時翻訳的な又は翻訳後の移行のための効率的なシグナルペプチドが記載される(Janda et al., 2010;Pechmann et al., 2014;Massahi et al.(2016),.J Theor Biol., 408:22-33.)。
本発明者は、新たな効率的なSPについて選択するために、インシリコのアプローチを使用した。最初に、疎水性平均値を、シグナルペプチド中のアミノ酸の数に対して標準化された疎水性指数を使用して算出した(Kyte and Doolittle, 1982)。次に、本発明者らは、SP中の8つのアミノ酸の最も疎水性であるストレッチについて検索し、コレクション全体において最も疎水性であるストレッチを表す、最大値1のスコアを割り当てた。さらに、本発明者らは、天然に関連付けられるタンパク質のコドン43~48の相対適応性の平均値(Sharp and Li, 1987)を評価し、このストレッチにおいて「最も遅い」コドンを伴う平均値を表す、最大値1のスコアを割り当てた。言い換えれば、スコア0が、最適なコドンだけがこのストレッチにおいて存在する場合に与えられた。生成された2つのスコアが合計され、異なるランキングを表す候補が選択された(表4:)。スコア化された候補のうち、SP4(SWP1の最初の18アミノ酸、PP7435_Chr1-0255)及びSP14(KRE1の最初の18アミノ酸、PP7435_Chr3-0933)は、それぞれ最高及び最低の合計スコアを伴うシグナルペプチドを表した。
実施例2:新規シグナルペプチド配列を使用した組換え分泌タンパク質を分泌するP.パストリス株の構築及び選択。
目的の遺伝子を保有するプラスミドの構築。
実施例2:新規シグナルペプチド配列を使用した組換え分泌タンパク質を分泌するP.パストリス株の構築及び選択。
目的の遺伝子を保有するプラスミドの構築。
P.パストリス CBS7435 mutS 変異体(Sturmberger et al.2016によりゲノム配列決定)を宿主株として使用した。POIをコードする遺伝子(例、SDZ-Fab-LC、SDZ-Fab-HC、scR、VHH、及びmCherry)は、Geneart又はDNA2.0(現在はATUM)によりコドン最適化され、合成DNAとして得られた。His6タグは、検出のためにscR遺伝子及びVHH遺伝子にC末端で融合された一方で、FLAGタグはmCherryのC末端に加えられた。これらのタンパク質の配列を、説明の表2中に示す。
新規シグナルペプチド配列(表4及び表7を参照のこと)を伴う発現ベクターを構築するために、クローニングのために選択された断片をPCR(Q5(登録商標)High-Fidelity DNAポリメラーゼ、New England Biolabs)により増幅した。P.パストリス株CBS7435 mutSからのゲノムDNA、合成遺伝子、又はgBlocks(Integrated DNA Technologies)は、PCRテンプレートとしての役割を果たした。増幅されたコード配列を、pPUZZLEベースの発現プラスミドpPM2dZ30(WO2008/128701A2において記載された)又はGoldenPiCSベクター(Prielhofer et al., 2017)のいずれかにクローニングした。シグナルペプチド(SP)は、プロモーター、ターミネーター、及び産物コード配列と、発現プラスミド中に直接的に組み立てた。
GoldenPiCSシステム(Prielhofer et al.2017.BMC Systems Biol.doi:10.1186/s12918-017-0492-3)は、一部のコード配列におけるサイレント変異の導入を要求する。あるいは、gBlock又は合成コドン最適化遺伝子を商業的プロバイダー(Integrated DNA Technology IDT、Geneart、及びATUMを含む)から得た。増幅されたコード配列は、pPUZZLEベースの発現プラスミドpPM2aK21もしくはpPM2eH21、又はGoldenPiCSシステム(骨格BB1、BB2、及びBB3aZ/BB3aK/BB3eH/BB3rNからなる)のいずれかの中にクローニングした。表1及び表2中に列挙される遺伝子断片を、制限酵素を使用することにより発現プラスミド中に導入した。BB2又はBB3骨格中で発現カセットを構築するために使用される全てのプロモーター及びターミネーターが、Prielhofer et al.2017(BMC Systems Biol.doi:10.1186/s12918-017-0492-3)において記載されている。pPM2aK21及びBB3aKによって、3’-AOX1ゲノム領域中への組み込みが可能になり、大腸菌及び酵母における選択のためのKanMX選択マーカーカセットを含む。pPM2eH21及びBB3eHは、5’-ENO1ゲノム組み込み領域及びハイグロマイシンでの選択のためのHphMX選択マーカーカセットを含む。BB3rNは、5’-RGI1ゲノム組み込み領域及びノーセオスリシンでの選択のためのNatMX選択マーカーカセットを含む。BB3aZプラスミドは、Zeocin選択マーカーカセットを含み、3’-AOX1ゲノム領域中への組み込みを可能にするためにAscIで直線化された。全てのプラスミドは、大腸菌のための複製起点(pUC19)を含む。
エレクトロポレーション(実施例3)後、形質転換体を、組み込まれた選択マーカーのための要求される抗生物質(Sh ble遺伝子を伴うZeocin耐性マーカーについては50μg/mL Zeocin、KanMXについては500μg/mL G418、及びNatMXについては100μg/mLノーセオスリシン)を含むYPD(酵母エキス、ペプトン、デキストロース)プレート上で、30℃で48時間にわたるインキュベーション後に選択し、同じ条件下で単一化した。
pPM2d_pGAP及びpPM2d_pAOX発現プラスミドは、WO2008/128701A2において記載されるpPuzzle_ZeoRプラスミド骨格の誘導体であり、pUC19細菌複製起点及びZeocin抗生物質耐性カセットからなる。異種遺伝子の発現は、それぞれP.パストリスのグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAP)又はアルコールオキシダーゼ(AOX)プロモーター、及びS.セレビシエCYC1転写ターミネーターにより媒介される。一部のプラスミドは、N末端S.セレビシエのアルファ接合因子のプレプロリーダー配列を既に含んでいた。XhoI及びBamHI(scRについて)又はEcoRV(VHHについて)での制限消化後、各々の遺伝子を、XhoI及びBamHI又はEcoRVで消化した両方のプラスミドpPM2d_pGAP及びpPM2d_pAOX中に連結した。
プラスミドを、P.パストリス中へのエレクトロポレーション(Gasser et al.2013.Future Microbiol.8(2):191-208において記載されている標準的な形質転換プロトコールを使用する-実施例3を参照のこと)の前に、それぞれAvrII制限酵素(pPM2d_pGAPについて)又はPmeI制限酵素(pPM2d_pAOXについて)を使用して線状化した。陽性形質転換体の選択は、50μg/mLのZeocinを含むYPDプレート(1リットル当たり:10g酵母エキス、20gペプトン、20gグルコース、20g寒天-寒天)上で実施した。
以下の実施例では、異なる異種タンパク質をレポーターとして使用した:二価ラクダ科動物抗体(VHH)の可変vH領域、シグナル鎖可変断片抗体(scRと呼ばれる scFv)、ヒトIgGの抗原結合断片(SDZ-Fab)及び蛍光タンパク質 mCherry。異種POIの発現は、適切なP.パストリスプロモーターにより、例えば、P.パストリスアルコールオキシダーゼ(AOX1)プロモーター(VHH、scR、SDZ-Fab-HC、mCherry)又はジヒドロキシアセトンシンターゼ(DAS1)プロモーター(SDZ-Fab-LC)及びS.セレビシエCYC1(VHH、scR、mCherry、及びSDZ-Fab-HC)又はP.パストリスTDH1(SDZ-Fab-LC)転写ターミネーターにより媒介された。プラスミドの構築は、Prielhofer et al.(2017)において記載されているように、Golden Gate Assemblyを使用したGoldenPiCSキットを使用して行った。POI遺伝子は、SP配列を含むプライマーを使用したPCRによりベクターDNAテンプレート(目的の遺伝子を保有する)から増幅させ、各々が、制限酵素BsaIを使用してBB1プラスミド中にライゲーションされ、それにより、テストされたシグナルペプチドを保持する発現ベクターが生成された。多量体タンパク質、例えばFabなどについては、個々の発現ベクターBB1_SDZ-Fab-HC及びBB1_SDZ-Fab-LCは、次に、制限酵素BpiIを使用してBB2プラスミド中に組み立てられ、BB2_ab_pAOX1_SDz-Fab-HC-CYC1tt及びBB2_bc_pDAS1_SDZ-Fab-LC-TDH1ttプラスミドがもたらされる。これらのBB2プラスミドを最終的に組み合わせて、Fab断片のHC及びLCの両方についての発現カセットを含むBB3aZ_SDZ-Fabプラスミドを生成した。VHH及びscRについては、BB1プラスミドをBB3aZプラスミドと直接的に構築し、それによって、それぞれBB3aZ_VHH及びBB3aZ_scRがもたらされた。新規シグナルペプチドは、融合PCRを使用することにより、PCRによりそれらを増幅させた後のGolden Gateアセンブリにより、5’プライマー配列の一部として加えられた。配列検証後、全てのタンパク質についての発現カセットを、互換性のある制限酵素BpiI及びBsaIを使用することにより、1つのベクター上に組み合わせた。組換えタンパク質のコードDNA配列を表2中に与える。分泌については、新たに同定されたシグナルペプチド単独(配列は表7を参照のこと)、S.セレビシエアルファ接合因子(MFα)分泌リーダーのプロ配列との組み合わせにおける新たに同定されたシグナルペプチド(配列番号3)、又はS.セレビシエMFαの分泌シグナル全体(配列番号4)を使用した。
実施例3:新規シグナルペプチド配列を伴う組換え分泌タンパク質を産生するP.パストリス株の生成。
実施例3:新規シグナルペプチド配列を伴う組換え分泌タンパク質を産生するP.パストリス株の生成。
POI発現プラスミド(3μgまで)は、P.パストリス中へのエレクトロポレーションの前にAscIにより直線化した。この目的のために、P.パストリス株をエレクトロコンピテントにした。株を100mL YPD培地(本培養)中に16~20時間(25℃、180rpm)にわたり接種し、2つの50mLファルコンチューブ中での遠心分離(5分、1500g、4℃)により光学密度(OD600)1.8~3で回収した。細胞ペレットを10mL YPD+20mM HEPES+25mM DTT中に再懸濁し、インキュベートした(30分間、25℃、180rpm)。インキュベーション期間後、ファルコンチューブを40mLの氷冷滅菌蒸留水で満たし、遠心分離した(5分;1500g;4℃)(Eppendorf AG、ドイツ)。細胞ペレットを氷冷滅菌1mM HEPES緩衝液(pH 8)中に再懸濁し、遠心分離した(30分;25℃;180rpm)。細胞ペレットを45mLの氷冷1Mソルビトール中に再懸濁し、遠心分離した(30分;25℃;180rpm)。ペレットを500μLの氷冷1Mソルビトール中に再懸濁し、80μLを氷冷1.5mLエッペンドルフチューブ中に分注した。分注したエレクトロコンピテント細胞を、使用まで-80℃で保った。
エレクトロポレーションは、2kVで4ミリ秒間にわたり実施した(Gene Pulser、Bio-Rad Laboratories, Inc、米国)。形質転換後、エレクトロポレーションされた細胞を1mL YPD培地中に懸濁し、サーモシェーカー(Eppendorf AG、ドイツ)上で、650rpmで振盪しながら30℃で1.5時間~3時間にわたり再生させた。その後、20μL及び200μLの細胞懸濁液を、選択のために50μg/mL Zeocin(CBS7435 mutS バックグラウンド)又は50μg/mLのZeocin及び100μg/mLのノーセオスリシン(CBS7435 mutSを共発現するSRP、実施例5を参照のこと)を含むYPDプレート(1リットル当たり:10g酵母エキス、20gペプトン、20gグルコース、20g寒天)上に播種し、30℃で48時間にわたりインキュベートした。出現したコロニーを、適した抗生物質を含む新鮮なYPDプレート上に再度画線した。
実施例4:新規シグナルペプチド配列を伴う組換え分泌タンパク質を産生するP.パストリス株の小規模培養(スクリーニング)。
培養
実施例4:新規シグナルペプチド配列を伴う組換え分泌タンパク質を産生するP.パストリス株の小規模培養(スクリーニング)。
培養
空気透過性膜で密閉された24のディープウェルプレート(DWP)をスクリーニングのために使用した。単一コロニー(各々の形質転換から20コロニー)を、前培養用の形質転換プレートから採取し、選択のために使用した抗生物質耐性に基づく、適した抗生物質を伴う2mLのYPDに接種するために使用した。前培養物を、24-DWP中で、25℃及び280rpmで約24時間にわたり成長させ、その後、開始OD600が8になるまで(t=0時間)、25g/L多糖及び0.35%グルコース放出酵素溶液(Enpresso)を含む、2mLの合成スクリーニング培地ASMv6(1リットル当たり:22.0gクエン酸一水和物、6.3g(NH4)2HPO4、0.49g MgSO4*7H2O、2.64g KCl、0.054g CaCl2*2H2O、1.47mL PTM0微量塩原液(1リットル当たり:6.0g CuSO4*5H2O、0.08g NaI、3.36g MnSO4*H2O、0.2g Na2MoO4*2H2O、0.02g H3BO3、0.82g CoCl2*2H2O、20.0g ZnCl2、65.0g FeSO4*7H2O及び5.0ml H2SO4(95%-98%))、4mg ビオチン;pHをKOHで6.5に設定(固体))に接種するために使用した。主培養は48時間にわたり続き、メタノールを誘導のために4回加えた(各々、t=4時間で0.5%、t=20時間、t=28時間、及びt=44時間で1%)。
回収及び分析
回収及び分析
48時間後、1mLの各々の培養物を取り出し、予め秤量したエッペンドルフチューブ中で遠心分離した。湿細胞重量(WCW)を、細胞ペレットを伴うエッペンドルフチューブを秤量することにより決定し、以下のように算出した:重量(満)-重量(空)=湿細胞重量(WCW)(g/L)。上清を使用して、下に記載されるように、マイクロ流体キャピラリー電気泳動(mCE)、ELISA、又は蛍光分光法を使用して、組換え分泌タンパク質濃度を定量化した。このデータから収量を算出した:収量(μg/mg)=タンパク質濃度/湿細胞重量。容量力価(また、「力価」として言及される)は、実施例4及び6において記載される培養物の上清中の目的のタンパク質(POI)の含量(g/L又はmg/L及び同様のもの)である。目的の遺伝子の1つのコピーを有するクローンだけが、分析において含まれた。バイオリアクター培養のために選択されたクローンの遺伝子コピー数を、qPCRにより決定した(実施例4)。力価及び収量の倍率変化は、S.セレビシエMFα分泌シグナル(配列番号4)を使用することにより分泌される目的の遺伝子の1コピーを有する参照クローンに対してそれぞれ与えられる。
マイクロ流体キャピラリー電気泳動(mCE)による定量化。
マイクロ流体キャピラリー電気泳動(mCE)による定量化。
「LabChip GX/GXIIシステム」(PerkinElmer)は、培養上清中の分泌タンパク質力価の定量分析のために使用した。消耗品「Protein Express Lab Chip」(760499、PerkinElmer)及び「Protein Express Reagent Kit」(CLS960008、PerkinElmer)を使用した。簡単には、6μLの培養上清を21μLの非還元サンプルバッファーと混合した。この混合物を100℃で5分間にわたり変性させ、簡単に遠心分離し、さらに 105μLの水(Milli-Q(登録商標)又は等価物)と混合した。サンプルを次に、1200gで2分間にわたり遠心分離し、機器に適用した。蛍光標識されたサンプルを、マイクロ流体工学に基づく電気泳動システムを使用して、機器においてタンパク質サイズに従って分析した。内部標準によって、kDaのサイズ及び検出されたシグナルのおおよその濃度へのおおよその割り当てが可能になった。
ELISAによるFabの定量化。
ELISAによるFabの定量化。
ELISAによるインタクトなFabの定量化を、コーティング抗体として抗ヒト IgG抗体(ab7497、Abcam)を、及び検出抗体としてヤギ抗ヒトIgG(Fab特異的)-アルカリホスファターゼ結合抗体(Sigma A8542)を使用して行った。ヒトFab/カッパ、IgG断片(Bethyl P80-115)を標準として100ng/mLの開始濃度で使用し、上清サンプルをそれに応じて希釈する。検出を、pNPP(Sigma S0942)を用いて行った。コーティング緩衝液、希釈緩衝液、及び洗浄緩衝液を、PBS(2mM KH2PO4、10mM Na2HPO4.2H2O、2.7mM g KCl、8mM NaCl、pH 7.4)をベースにし、BSA(1%(w/v))及び/又はTween20(0.1%(v/v))をそれに応じて用いて完成させた。
蛍光分光法による定量化。
蛍光分光法による定量化。
分泌された mCherry蛍光は、各々のスクリーニング上清の100μLをFluoroNunc(商標)/LumiNunc(商標)96ウェルプレート(ref.10366281、Thermo Fischer Scientific、米国ウォルサム)に移すことにより直接的に測定した。mCherry標準(参照番号TP790040、OriGene Technologies、ドイツ、ヘルフォルト)を同じプレート中で、PBSG(10%グリセロール中1×PBS)中で希釈し、0~80ng/μLの標準曲線を得た。プレートを、Infinite M200デバイス中にロードし、i-control v.1.6ソフトウェアにより制御した。測定前に、サンプルを、振幅1mmを伴う線形モードにおいて5秒間にわたり振盪した。測定は、蛍光トップ読み取りモードで実行されたが、587nm(帯域幅9nm)で各々20μsの25回のフラッシュからなり、発光は、遅延時間を伴うことなく、640nm(帯域幅20nm)で読み取った。
定量的リアルタイムPCR(qPCR)による遺伝子コピー数の決定。
定量的リアルタイムPCR(qPCR)による遺伝子コピー数の決定。
1mL培養物からの細胞ペレットを、最初に、リチカーゼ(50mM 2-メルカプトエタノールの添加を伴う5U/μL)での溶解のために調製し、ゲノムDNAを次に、DNeasy(登録商標)Blood & Tissue Kit(Qiagen)でさらに抽出した。qPCR反応は、0.25μLのフォワードプライマー及び0.25μLのリバースプライマー(表5)、5μLの2x SensiMix SYBR Hi-ROXキット(Bioline)、3.5μLのヌクレアーゼ不含水、及び1μLのサンプルで構成された。qPCRを以下の条件下で実施した:Rotorgene 6000(Qiagen)での、95℃で10分間のホットスタート、それに続く95℃で15秒、60℃で20秒、及び72℃で15秒の45サイクル。GCNは、Rotor-Geneソフトウェア比較定量方法を使用することにより、それぞれのサンプルの蛍光シグナルを、選ばれた対照サンプルに対して標準化することにより決定した。この比率は、初期濃度の差について補償するために、同じサンプルのACT1シグナルに対してさらに標準化された。
実施例5:シグナル認識粒子(SRP)過剰発現P.パストリス株の生成。
実施例5:シグナル認識粒子(SRP)過剰発現P.パストリス株の生成。
本発明者らはさらに、分泌経路が、新規SPに融合された高負荷の組換えタンパク質に対処するために準備されるか否かをテストするために、SRP過剰発現株においてSPをテストすることを決定した。
SRP発現プラスミド236_BB3rNを生成するために、SRPの全て7つのサブユニット(6つのタンパク質サブユニット及び1つの非コーディングRNA)についての発現カセットを、Prielhofer et al.(2017)において記載されているように、Golden Gateベースのクローニングを使用して、1つの単一のプラスミド中に組み立てて、等しい遺伝子コピー数を確実にした。全てのサブユニットについての遺伝子を、CBS7435のゲノムから PCRにより増幅し、BB1プラスミド中にクローン化し、それらを次に、BB2プラスミド中のそれぞれのプロモーター及びターミネーターと組み合わせた。SRPサブユニットの発現のための、使用されたプロモーター及び転写ターミネーターを表6中に与える。非コーディングRNAをハンマーヘッド及びHDVリボザイムと過剰発現させ、RNAポリメラーゼII転写後のmRNA形質を除去した。
SRPを過剰発現するバックグラウンド株を作製するために、CBS7435 mutSを、全て7つのSRPサブユニットを保有するプラスミド236_BB3rNで形質転換した(実施例3)。20の形質転換体及び4の対照株を、24ディープウェルプレートスクリーニング手順(実施例4)に従って培養した。形質転換したクローン及び形質転換していない4つのクローンの湿細胞重量は、任意の有意な差を示さなかった。次に、7つのSRPタンパク質成分の遺伝子コピー数(GCN)分析(実施例4)を、3つの無作為に選択されたクローン(クローン#3、#7、及び#10)に対して実施した。#3及び#10については、SRP遺伝子のGCNは2であると決定され、ゲノム中への1つの過剰発現カセットの組み込みを示している。クローン#7(CBS7435 mutS SRP#7と命名)は、遺伝子の3つのコピーを有し、2つの過剰発現カセットの組み込みを示す。このクローンは、異種タンパク質の発現のためのバックグラウンドSRP過剰発現P.パストリス株として選択された。
実施例6:新規シグナルペプチド配列を伴う組換え分泌タンパク質を産生するP.パストリス株のバイオリアクター培養。
実施例6:新規シグナルペプチド配列を伴う組換え分泌タンパク質を産生するP.パストリス株のバイオリアクター培養。
新規シグナルペプチド配列を使用することにより目的のタンパク質(POI、例えばVHH、scR、SDZ-Fab、mCherry)を発現するクローン、ならびに全長MFα分泌シグナル(配列番号4)を使用する対照株(実施例2)を、小規模スクリーニング培養後に選択した(実施例4)。選択されたクローンは、フェドバッチバイオリアクター培養によるより大きな培養容量中でさらに評価された。
前培養
前培養
クローンを、50mLのYPhyG(1リットル当たり:20.0gのフィトン-ペプトン、10.0gのバクト酵母エキス、20.0gのグリセロール)で満たした広口、バッフル付き、蓋付き300mL振盪フラスコ中に接種し、28℃で、110rpmで一晩振盪させた(前培養物1)。前培養物2(2000mLの広口、バッフル付き、蓋付き振盪フラスコ中の200mL YPhyG)を、OD600(600nmで測定された光学密度)が午後遅くに約20(YPhyG培地に対して測定)に達する方法において前培養物1から接種した。前培養物2のインキュベーションも同様に28℃で、110rpmで実施した。
産生バッチフェーズ。
産生バッチフェーズ。
発酵(バイオリアクター培養;全段階)は、完全に機器を備えた、制御可能なInfors Multifors 1Lリアクター(750mL作業容量)において行われた。400mLのBSM 培地(1リットル当たり:13.5mL H3PO4(85%)、0.5g CaCl ・2H2O、7.5g MgSO4・7H2O、9.0g K2SO4、2.0g KOH、40g グリセロール、0.25g NaCl、0.1mL消泡剤(Glanapon 2000)、4.35mL PTM1(1リットル当たり:0.2g ビオチン、6.0g CuSO4・5H2O、0.09g KI、3.0g MnSO4・H2O、0.2g Na2MoO4・2H2O、0.02g H3BO3、0.5g CoCl2、42.2g ZnSO4・7H2O、65.0g Fe(II)SO4・7H2O、5mL H2SO4)で満たされた全ての発酵槽を、約5.5のpHで、前培養物2から2.0のOD600まで個別に接種した。P.パストリスをグリセロール上で成長させてバイオマスを産生し、培養物をその後にグリセロール供給(60% w/w+12ml/L PTM1)に供し、混合メタノール/グリセロール供給及びその後のメタノール供給が続いた。アンモニア溶液(25%)をpH制御のために使用した。
最初のバッチ段階では、温度を28℃に設定した。産生段階を開始する前の最後の時間の期間にわたり、それは24℃まで減少され、残りの過程全体を通じてこのレベルに保たれた一方で、pHは5.0に下落し、このレベルに保たれた。酸素飽和度は、全過程を通じて30%に設定された(カスケード制御:撹拌機、流れ、酸素補充)。撹拌は700~1200rpmの間で適用され、流量範囲(空気)1.0~2.0L/分が選択された。
バッチ段階の間に、バイオマスが、約110~120g/Lの湿細胞重量(WCW)まで生成された(μ~0.30/時間)。古典的なバッチ段階(バイオマス生成)は約14時間続き得る。
産生フェドバッチ段階
産生フェドバッチ段階
グリセロールは、等式2.6+0.3*t(gグリセロール(60%)/h)により定義される速度で供給され、式中、t=時間単位の時間であり、そのため、合計30gのグリセロール(60%)が8時間以内に補充された。最初のサンプリング時点は、20時間であるように選択された。次の18時間(処理時間20~38時間)中で、グリセロール/メタノールの混合フィードが適用された:
-等式:2.5+0.13*t(gグリセロール(60%)/時間)により定義されるグリセロール供給速度、66gグリセロール(60%)を供給する。
-等式:0.72+0.05*t(gメタノール(100%)/時間)により定義されるメタノール供給速度、21gのメタノールを加える。
-等式:2.5+0.13*t(gグリセロール(60%)/時間)により定義されるグリセロール供給速度、66gグリセロール(60%)を供給する。
-等式:0.72+0.05*t(gメタノール(100%)/時間)により定義されるメタノール供給速度、21gのメタノールを加える。
次の約72.5時間(過程時間38時間から約110.5時間まで)の間に、メタノールを等式2.2+0.016*t(gメタノール(100%)/時間)により供給し、約223gのメタノールの供給をもたらした。
サンプリング及び分析
サンプリング及び分析
サンプルを、以下の手順で、示された時間点で採取した:サンプリングされた発酵ブロスの最初の3mLを(シリンジを用いて)廃棄した。新たに採取されたサンプル(3~5mL)の1×1mLを1.5mL 遠心分離管中に移し、13200rpm(16100g)で5分間にわたり回転させた。上清を、対応する湿ったペレット画分とともに、別々のバイアル中に慎重に移し、直ちに凍結した。WCWを決定するために、1mLの発酵ブロスを、風袋を測定したエッペンドルフバイアル中で、13200rpm(16100g)で5分間にわたり遠心分離し、結果として得られた上清を正確に除去した。バイアルを秤量し(精度0.1mg)、空バイアルの風袋重量を引いて湿った細胞重量を得た。タンパク質の定量化は、実施例4において説明されるように実施した。
実施例7:新規シグナルペプチド配列を伴う組換え分泌タンパク質を産生するP.パストリス株のスクリーニング結果。
実施例7:新規シグナルペプチド配列を伴う組換え分泌タンパク質を産生するP.パストリス株のスクリーニング結果。
P.パストリス株の形質転換を、実施例3において記載されるように実施した。新規SP(実施例4)で得られた分泌改善は、力価及び収量倍率変化値(それぞれFC力価又は力価FC、FC収量又は収量FCとも呼ばれる)により測定され、それらは、同じ株バックグラウンド(CBS7435 mutS WT又はCBS7435 mutS SRP#7、実施例5)においてMFα分泌シグナル(配列番号4)(実施例1)を使用してPOIを分泌するそれぞれの対照クローンを指す。力価倍率変化は、それぞれの発酵又は小規模培養の力価を、対照の力価により割った商として理解される。収量変化は、それぞれの発酵又は小規模培養の収量を、対照の収量により割った商として理解される。
MFα分泌シグナルとの比較における、目的のタンパク質(POI)の産生のための新規シグナルペプチド(SP)の性能のスクリーニングを、実施例4において記載されるように実施した。
表7中に見られるように、SP4及びSP14は、POIの分泌のための唯一の分泌シグナルとして使用された場合に高度に有効なSPを表し、MFα分泌シグナルとの比較において、分泌産物力価を約1.3~1.4倍だけ超えている。
次に、本発明者らは、新規SPをプロ配列、例えばMFαプロ配列などに融合させることによりさらなる影響があるか否かをテストすることを決めた。
大きな影響が、シグナルペプチドがMFαプロ配列に融合された場合に観察された(表8を参照のこと)。これらのスクリーニングから、本発明者らは、プロ配列、例えばMFαプロ配列などの付加が、組換えタンパク質産生のためにさらにより有益であると結論付けた。
異なるシグナルペプチド(SP)の、他のピキア・パストリス(コマガタエラ・ファフィ)由来のプロ配列への融合によって、MFαプロ配列との組み合わせと比較して、より低い又はさらに無のPOIの分泌がもたらされた(表9を参照のこと)。
実施例8.新規シグナルペプチド配列を伴う組換え分泌タンパク質を産生するP.パストリス株のフェドバッチ培養。
実施例8.新規シグナルペプチド配列を伴う組換え分泌タンパク質を産生するP.パストリス株のフェドバッチ培養。
バイオリアクター培養を、実施例6において説明されるように実施した。まず、実施例3及び4において記載されるように得られた及びスクリーニングされたPOI(表2を参照のこと)を分泌する単一コピークローンを、バイオリアクター培養用に選択し、対照としてのMFα分泌シグナルとの比較において、MFαプロ配列を伴わない(表7)又は伴う(表8)SP4及びSP14の産生性能をさらに確認した。
POIの産生及び本発明のシグナルペプチド(POI力価に関してスクリーニングにおいて最も優れた成績を示す株であるSP4(配列番号2)及びSP14(配列番号1))の分泌増加効果をテストする目的のために、POI力価、POI収量、及び増殖に関するスクリーニングにおいて最良の成績を示す株が、バイオリアクター培養用に選ばれ、それはまた、マルチコピー株であり得る(即ち、それらはPOI発現カセットの複数のコピーを含む)。このように、プロ配列を伴わないSP4又はSP14単独を使用することによる、あるいはMFαプロ配列を伴うSP4又はSP14を使用することによるPOIの発現及び分泌のために、ベクター及び株は、実施例2、3、4、及び5において記載されているように生成及び選択され、実施例6において記載されるように培養されるが、実施例4において記載されるようにスクリーニング後に、最良の成績を示す株が、実施例6において記載されるように発酵のために選択されることを除く。これはまた、MFα分泌シグナル(配列番号4)を使用することにより、それぞれのPOIを発現する、それぞれの対照株に適用される。MFα分泌シグナル(配列番号4)を使用することによる発現/分泌に関連する、MFαプロ配列を伴う又は伴わないSP4又はSP14を使用することによるPOIの発現/分泌の力価及び収量倍率変化を算出する。
バイオリアクター培養を用いて、本発明者らは、MFαプロ配列と組み合わされたSP4及びSP14によって、POI力価及び収量について見られるように、MFα分泌シグナル(配列番号4)と比較して、分泌能力が明らかに改善されることを確認した(表10)。再び、WTとSRP過剰発現株バックグラウンドの間に強い差はなかったにもかかわらず、SP4を用いたscR分泌レベルは、WTにおけるよりも、SRP過剰発現株においてより高く、SRP過剰発現が一部のPOIについて利益をもたらすことを示している。
実施例9:新規シグナルペプチド配列を使用した場合の移行の同時翻訳モードの確認。
実施例9:新規シグナルペプチド配列を使用した場合の移行の同時翻訳モードの確認。
免疫蛍光顕微鏡法を使用して、SP4及びSP14の同時翻訳的な移行モードを確認した。SP4又はSP14を伴うVHHを産生するP.パストリス株を顕微鏡分析のために使用した(株の生成については実施例2を参照のこと)。マウス抗6XHis抗体(abcam、ab18184)及び適した蛍光標識二次抗体を免疫蛍光顕微鏡法のために使用した。標準的なMFα分泌シグナルを使用したクローンは、翻訳後移行を示す、優位なサイトゾルパターンを示した一方で(図1A)、SP4-VHH及びSP14-VHHの両方が、典型的なERパターン(核周囲の環)に導き、それは、同時翻訳的な移行モードについて示している(図1B-C)。これによって、それらが同時翻訳機構により優先的に移行されることが確認される。
参考文献
参考文献
Claims (28)
- N末端からC末端まで
(a)分泌シグナルであって、
(I)(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列;
又は
(II)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列又はSWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列を含む分泌シグナル;及び
(b)目的のタンパク質を含む、融合タンパク質をコードする核酸分子。 - 前記分泌シグナルが、請求項1において定義される核酸分子を発現するが、しかし、請求項1において定義される分泌シグナルの代わりに、野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(例えば配列番号4など)を含む前記真核宿主細胞との比較において、真核宿主細胞からの前記目的のタンパク質の分泌を増加させる、請求項1に記載の核酸分子。
- KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列が、配列番号1又はその機能的ホモログを含む、請求項1又は2に記載の核酸分子。
- SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列が、配列番号2もしくは52又はその機能的ホモログを含む、請求項1又は2に記載の核酸分子。
- 前記MFαプロ配列が、配列番号3、53もしくは74~80のいずれか1つ又はその機能的ホモログ、好ましくは配列番号3もしくは53又はその機能的ホモログを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記MFαプロ配列が、配列番号53の位置23に対応する位置にSerを含み、及び/又は配列番号53の位置64に対応する位置にGluを含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記目的のタンパク質が、抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体など、又は二重特異性抗体、又は抗原結合抗体断片、例えばFabもしくはF(ab)2など、単鎖抗体、例えばscFvなど、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科動物のVHH断片又は重鎖抗体又はドメイン抗体(dAb)など、人工抗原結合分子、例えばDARPINなど、ibody、アフィボディ、ヒューマボディ、又はリポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、酵素、例えばプロセス酵素など、サイトカイン、成長因子、ホルモン、タンパク質抗生物質、融合タンパク質、例えば毒素融合タンパク質など、構造タンパク質、調節タンパク質、及びワクチン抗原からなる群より選択され、好ましくは、前記目的のタンパク質は、治療用タンパク質、食品添加物、又は飼料添加物である、請求項1~6のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 請求項1~7のいずれか一項において定義される分泌シグナル。
- 請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子及びそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット又はベクター。
- 請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子、又は請求項9に記載の発現カセット、又は請求項9に記載のベクターを含む、組換え真核宿主細胞。
- 前記宿主細胞が真菌宿主細胞もしくは酵母宿主細胞である、請求項10に記載の組換え真核宿主細胞。
- 前記酵母宿主細胞が、コマガタエラ・ファフィ(ピキア・パストリス)、ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・パラドクサス、サッカロミセス・ユーバヤヌス、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィ、サッカロミセス・クルイベリ、サッカロミセス・ウヴァルム、クルイベロミセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニ、コマガタエラ属、及びシゾサッカロミセス・ポンベからなる群より選択される、又は前記真菌宿主細胞が、トリコデルマ・リーゼイもしくはアスペルギルス・ニガーより選択される、請求項11に記載の組換え真核宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、前記シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように操作される、請求項10~12のいずれか一項に記載の組換え真核宿主細胞。
- 真核宿主細胞において目的のタンパク質を製造する方法であって、
(i)請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子を用いて、又は請求項9に記載の発現カセットもしくはベクターを用いて真核宿主細胞を遺伝的に操作すること、及び場合によりシグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように真核宿主細胞を遺伝的に操作すること;
(ii)前記核酸分子を発現し、及び場合により前記SRPの1つ又は複数の成分を過剰発現し、前記分泌シグナルの切断時に前記目的のタンパク質を分泌する条件下で前記遺伝的に操作された宿主細胞を培養すること、
(iii)場合により前記細胞培養物から前記目的のタンパク質を単離すること、
(iv)場合により前記目的のタンパク質を精製すること、
(v)場合により前記目的のタンパク質を修飾すること、及び
(vi)場合により前記目的のタンパク質を製剤化することを含む、方法。 - 真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させる方法であって、前記真核宿主細胞において請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子を発現させること、及び場合により前記真核宿主細胞を操作して、前記シグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現させること、それにより請求項1~7のいずれかにおいて定義される分泌シグナルの代わりに野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(例えば配列番号4など)を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子を発現する、前記宿主細胞との比較において、前記目的のタンパク質の分泌を増加させることを含む、方法。
- 請求項14又は15に記載の方法であって、
(i)請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子を発現する発現構築物を組み入れるように前記宿主細胞を操作すること、及び場合によりシグナル認識粒子(SRP)の1つ又は複数の成分を過剰発現するように前記宿主細胞を遺伝的に操作すること、
(ii)前記核酸分子を発現し、及び場合により前記SRPの1つ又は複数の成分を過剰発現し、前記分泌シグナルの切断時に前記目的のタンパク質を分泌するのに適切な条件下で前記宿主細胞を培養すること、
(iii)場合により前記細胞培養物から前記目的のタンパク質を単離すること、
(iv)場合により前記目的のタンパク質を精製すること、
(v)場合により前記目的のタンパク質を修飾すること、及び
(vi)場合により前記目的のタンパク質を製剤化することを含む、方法。 - 前記核酸分子が、前記宿主細胞の染色体中に組み込まれる、又は前記宿主細胞のゲノム中に組み込まれない発現カセット、ベクター、もしくはプラスミド中に含まれる、請求項14~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真核宿主細胞が真菌宿主細胞もしくは酵母宿主細胞である、請求項14~17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵母宿主細胞が、コマガタエラ・ファフィ(ピキア・パストリス)、ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・メタノリカ、カンジダ・ボイディニ、コマガタエラ属、及びシゾサッカロミセス・ポンベからなる群より選択される、又は前記真菌宿主細胞が、トリコデルマ・リーゼイもしくはアスペルギルス・ニガーより選択される、請求項14~18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質が、抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体など、又は二重特異性抗体、又は抗原結合抗体断片、例えばFabもしくはF(ab)2など、単鎖抗体、例えばscFvなど、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科動物のVHH断片又は重鎖抗体又はドメイン抗体(dAb)など、人工抗原結合分子、例えばDARPINなど、ibody、アフィボディ、ヒューマボディ、又はリポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、酵素、例えばプロセス酵素など、サイトカイン、成長因子、ホルモン、タンパク質抗生物質、融合タンパク質、例えば毒素融合タンパク質など、構造タンパク質、調節タンパク質、及びワクチン抗原からなる群より選択され、好ましくは、前記目的のタンパク質は、治療用タンパク質、食品添加物、又は飼料添加物である、請求項14~19のいずれか一項に記載の方法。
- 真核宿主細胞からの目的のタンパク質の分泌を増加させるための、請求項1~8のいずれか一項に記載の分泌シグナルの使用。
- 前記分泌シグナルが、請求項1において定義される分泌シグナルの代わりに、前記野生型サッカロミセス・セレビシエα接合因子分泌シグナル(例えば配列番号4など)を含む、請求項1において定義される融合タンパク質を発現する前記真核宿主細胞との比較において、前記真核宿主細胞からの前記目的のタンパク質の分泌を増加させる、請求項21に記載の使用。
- 目的のタンパク質を製造するための、請求項10~13のいずれか一項に記載の組換え真核宿主細胞の使用。
- 前記シグナルペプチド配列がKRE1タンパク質から由来する、請求項1~7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記シグナルペプチド配列がSWP1タンパク質から由来する、請求項1~7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 分泌シグナルであって、
(i)KRE1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列
を含む分泌シグナル。 - 分泌シグナルであって、
(i)SWP1タンパク質から由来するシグナルペプチド配列;及び
(ii)α接合因子(MFα)プロ配列
を含む分泌シグナル。 - 請求項1~7のいずれか一項記載の核酸分子を発現し、前記分泌シグナルの切断時に前記目的のタンパク質を分泌する条件下で請求項10~13のいずれか一項記載の組換え真核宿主細胞を培養し、ならびに前記宿主細胞培養物から前記目的のタンパク質を単離し、及び場合により前記目的のタンパク質を精製し、及び場合により修飾し、及び場合により製剤化することにより、目的のタンパク質を産生する方法。
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