KR102202477B1 - 효모 및 기타 형질전환 세포에서 폴리펩티드의 고수율 발현을 위한 온도 전환 - Google Patents

효모 및 기타 형질전환 세포에서 폴리펩티드의 고수율 발현을 위한 온도 전환 Download PDF

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Abstract

이종 단백질 생산 방법이 개시된다. 특히, 본 개시는 항체와 같은 다중 서브유닛의 단백질을 포함하는 원하는 단백질을 더 높은 수율 및 개선된 순도로 생산하는 개선된 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 형질전환 세포는 효모, 예컨대, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 메탄올 자화 효모이다.

Description

효모 및 기타 형질전환 세포에서 폴리펩티드의 고수율 발현을 위한 온도 전환{TEMPERATURE SHIFT FOR HIGH YIELD EXPRESSION OF POLYPEPTIDES IN YEAST AND OTHER TRANSFORMED CELLS}
관련 출원 개시
본 출원은 "효모 및 기타 형질전환 세포에서 폴리펩티드의 고수율 발현을 위한 온도 전환(TEMPERATURE SHIFT FOR HIGH YIELD EXPRESSION OF POLYPEPTIDES IN YEAST AND OTHER TRANSFORMED CELLS)"이라는 명칭으로 2013년 3월 15일 출원된 미국 가출원 일련번호 61/791,471의 이익을 주장하고, 2013년 3월 15일 출원된 미국 가출원 일련번호 61/790,613호의 이익도 주장한다. 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본 출원에 포함된다.
본 출원은 "43257o3413.txt"라는 명칭으로, 2014년 3월 13일 생성된 14,286바이트 크기의 파일에 포함된 생물학적 서열 목록을 그 개시의 일부분으로서 포함하며, 이는 그 전체가 참조로서 본 출원에 포함된다.
본 개시는 일반적으로 효모 및 기타 세포에서 원하는 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 항체를 포함하는, 단일 및 다중 서브유닛 단백질을 발현시키는 데에 이용할 수 있는 방법이 본 개시에 포함된다. 예시적인 구현예에서, 이러한 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모이다. 본 발명의 방법의 구현예는 종래의 방법과 비교하여 증가된 수율로 항체 또는 기타 원하는 단백질을 생산할 수 있다. 추가적으로, 이러한 발명은 발효 분야에 관련된다. 특히, 본 발명은 재조합 효모 세포의 발효에 관한 것이다.
다수의 재조합적으로 생산된 단백질들이 인간 치료용으로 규제 승인을 받았다. 점점 더 많은 수의 이러한 치료적 단백질은 미생물 발현 시스템에서 생산된다. 실제로, 최근 리뷰에 따르면, 미생물 발현 시스템은 미국 식품의약국 또는 유럽 의약품 기구(European Medicines Agency)에 의해 2009년 1월까지 허가된 151개 단백질 기반재조합 제약 중 거의 절반의 생산에 이용된다(Ferrer-Miralles 등, Microbial Cell Factories 2009, 8:17).
이러한 재조합적으로 생산된 단백질 중에는 항체가 있는데, 통상적으로 이들은 두 개의 동일한 경쇄 및 두 개의 동일한 중쇄로 구성된 4합체 단백질이다. 수백 개의 치료적 단일 클론성 항체(mAb)가 현재 시중에 나와 있거나 개발 중에 있다. 기능적 항체의 생산은 일반적으로는 두 개의 폴리펩티드 사슬의 합성뿐만 아니라, N-말단 분비 신호 서열의 단백질 가수분해 프로세싱; 폴리펩티드의 4합체로의 적절한 접힘과 조립; 이황화 결합의 형성을 포함하는 다수의 번역 후 사건들을 수반하며, 통상적으로 특이적인 N-결합 당화를 포함한다.
효모 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 이전에 치료적 용도의 재조합 단백질 제조를 위한 생산 숙주로서 이용되어 왔다. 예로서 인간 혈청 알부민 및 칼리크레인 저해제인 에칼란티드의 생산을 포함한다(Reichert, J. mAbs 4:3 1-3, 2012). 피치아 파스토리스는 정확하게 조립된 중쇄 및 경쇄를 가지고 있는 재조합 단일 클론성 항체들의 생산에 이용되었다(전체가 참조로서 본 출원에 포함되는 미국 특허 7,927,863). 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAP) 프로모터는 효모에서 N-당화가 없는 항체의 발현을 추진시킬 수 있다(미국 특허 7,927,863).
재조합 항체 Fab 단편을 생산하기 위하여 GAP 시스템을 이용한, 바우만(Baumann) 등의 최근 연구(BMC Genomics 2011, 12:218)는 이전에 항시성이라고 여겨졌던 이러한 시스템이 탄소와 에너지의 공급원으로서 글루코오스를 이용하는 저산소 조건 하에서 증가된 발현을 나타냄을 보여주었다. 저산소 조건은 폭기 및 교반을 통해 여전히 배양물에 산소를 공급하면서 발효물의 용존 산소 수준을 매우 낮은 수준까지 낮추도록 하는 조건이다. 이는 혼합된 호기 및 발효 대사를 초래한다. 발효조 내에서의 저산소 조건의 이용은 에탄올의 치명적인 누적을 초래할 수 있으며, 유독한 수준이 누적되지 않도록 공정을 제어하는 데에 주의를 기울여야 한다. 바우만은 발효조 내의 에탄올 수준을 측정하여, 그 누적을 감소시키기 위하여 글루코오스 공급 속도를 조절함으로써 이를 달성했다. 그러나 대규모 발효조 내의 에탄올을 신뢰할 수 있게 측정하는 기술은 널리 이용될 수 없으므로 이 방법은 그다지 확장 가능하지 않다.
메탄올 자화 효모 피치아 파스토리스와 같은 진균류 숙주는 많은 양의 내인성 단백질을 분비하지 않는다는 점, 이종 단백질을 생산하는 데 이용할 수 있는 강한 유도성의 프로모터를 보유한다는 점, 한정된 화학적 배지 내에서 동물 혈청을 사용하지 않고 생장시킬 수 있다는 점, 그리고 높은 역가의 재조합 단백질을 생산할 수 있다는 점을 포함하여, 치료용 단백질 발현에서 분명한 장점들을 가지고 있다(Cregg 등, FEMS Microbiol. Rev. 24: 45-66 (2000)). 본 발명자들이 수행한 연구를 포함한 과거의 연구는 P. 파스토리스를 연구, 진단 및 치료적 용도에 적합한 기능적 항체들을 생산하는 비용 효율적인 플랫폼으로 확립하는 데 도움을 주었다. 공동 소유된 미국 특허 7,927,863와 7,935,340를 참조한다. 이들 각각은 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된다. 재조합 단백질의 발현을 위한 P. 파스토리스 발효의 설계를 위한 방법들 또한 문헌에 공지되어 있으며, 세포 밀도, 배양액 부피, pH, 기질 공급 속도 및 반응의 각 시기의 길이를 포함하는 매개변수들과 관련하여 최적화가 기술되어 있다. Zhang 등의 문헌("Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations" in Cregg, J. M, Ed., 2007, Pichia Protocols (2nd edition), Methods in Molecular Biology, vol. 389, Humana Press, Totowa, N.J., pgs. 43-63)을 참조한다. 이는 본 출원에 그 전체가 참조로서 포함된다.
추가적으로, 본 출원인과 다른 이들에 의한 이전의 연구에서는 생산기 개시시 또는 생산기 개시 근처에서 배양물에 에탄올 볼러스를 첨가하고, 항체와 같은 다중 서브유닛에 대하여 유전자 카피 수와 서브유닛 유전자들 사이의 카피 수 비율을 변화시키는 것을 포함하는 방법을 통해 효모에서 단백질의 생산이 증가함을 설명하고 있다. "Multi-Copy Strategy For High-Titer And High-Purity Production Of Multi-Subunit Proteins Such As Antibodies In Transformed Microbes Such As Pichia Pastoris"라는 명칭의 US20130045888; "High-Purity Production Of Multi-Subunit Proteins Such As Antibodies In Transformed Microbes Such As Pichia Pastoris"라는 명칭의 US20120277408을 참조한다. 이들 각각은 본 출원에 그 전체가 참조로서 포함된다.
전술된 장(Zhang) 등의 논문이 전술된 매개변수들을 최적화하는 체계적인 접근법을 설명하고, 이들 매개변수 일부 사이에서 상호 작용을 이해하는 이론적인 접근법을 제공하는 데에 얼마간 노력을 기울였지만, 발현 최적화는 대체로 실험적 공정으로 남아 있다. 이러한 상호 작용 때문에, 나머지 모두를 일정하게 유지하면서 각각의 개별적인 매개변수를 최적화하는 것은 일반적으로 불충분하다. 예를 들어, 최적의 배지 조성은 배양물 밀도, 균주 배경, 공급 속도, 교반, 산소 첨가 등에 따라 달라질 수 있다. 이러한 복잡한 상호 작용 때문에, 시험할 수 있는 매개변수들의 조합의 수는 잠재적으로 무한하며, 설령 발현 시스템이 광범위하게 최적화되었다 하더라도, 수율 및/또는 순도에 이익을 줄 수 있는 다수의 시험되지 않은 조건들은 항상 남아 있다.
아래에서 더 설명되는 바와 같이, 본 출원인들은 효모와 같은 진핵 세포에서 생산된, 원하는 단백질의 수율을 크게 증가시키는 방법을 확인하였다. 이미 고도로 최적화된 발현 시스템의 경우에도, 대상 방법은 원하는 단백질의 수율을 최대 약 30%까지 증가시켰다.
일 양태에서, 본 개시는 원하는 단백질을 생산하는 방법으로서, (a) 상기 원하는 단백질의 발현을 제공하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 진핵 세포를 제1 온도에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 진핵 세포를 제2 온도에서 배양하여, 상기 진핵 세포가 상기 원하는 단백질을 생산하도록 하는 단계를 포함하되, 상기 제2 온도는 상기 제1 온도와는 상이한 것인 방법을 제공한다. 선택적으로, 상기 배양은 (a) 유가식 발효 조건 하에서 배양 배지에서 효모 세포 군집을 배양하는 단계(이때, 각각의 효모 세포는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 세그먼트를 포함하되, 상기 DNA 세그먼트는 글리세르알데히드-3-인산(GAP) 전사 프로모터 및 전사 터미네이터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질은 글리세르알데히드-3-인산이 아니며, 발효물은 제1 공급 속도의 발효 가능한 당 원료를 포함하고, 발효물은 제1 산소 이동 속도에서 교반된다); (b) 회분식 발효 중 군집의 호흡률(RQ)을 측정하고, RQ가 원하는 소정의 범위 내인지를 결정하는 단계(이때, 배양 개시 후 약 20-40시간에서의 RQ의 원하는 소정의 범위는 약 1.08 내지 약 1.35이다); (c) RQ가 원하는 소정 범위 밖일 때, 발효 가능한 당 공급 속도를 제2 공급 속도까지, 또는 산소 이동 속도를 제2 산소 이동 속도까지 중 하나 또는 둘 다를 조절하는 단계; (d) 배양하는 단계 전체에 걸쳐, 단계 (b)와 단계 (c)를 1회 이상 반복하는 단계; (e) 배양 배지로부터 효모 세포를 수확하는 단계; 및 (f) 세포 및/또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제1 온도는 약 섭씨 20도 내지 약 섭씨 32도일 수 있다.
상기 제1 온도는 약 섭씨 24도 내지 약 섭씨 31.5도일 수 있다.
상기 제1 온도는 약 섭씨 27도 내지 약 섭씨 31도일 수 있다.
상기 제1 온도는 약 섭씨 27.5도 내지 약 섭씨 30도일 수 있다.
상기 제1 온도는 약 섭씨 20도 내지 약 섭씨 29.5도일 수 있다.
상기 제1 온도는 약 섭씨 24도 내지 약 섭씨 29도일 수 있다.
상기 제1 온도는 약 섭씨 27도 내지 약 섭씨 28.5도일 수 있다.
상기 제1 온도는 약 섭씨 27.5도 내지 약 섭씨 28.5도일 수 있다.
상기 제2 온도는 상기 제1 온도보다 약 섭씨 1도 내지 약 섭씨 6도 높을 수 있다.
상기 제2 온도는 상기 제1 온도보다 약 섭씨 1도 내지 약 섭씨 3도 높을 수 있다.
상기 제2 온도는 상기 제1 온도보다 약 섭씨 2도 내지 약 섭씨 4도 높을 수 있다.
상기 제2 온도는 상기 제1 온도보다 약 섭씨 2도 내지 약 섭씨 3도 높을 수 있다.
상기 제2 온도는 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 34도일 수 있다.
상기 제2 온도는 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 32도일 수 있다.
상기 제2 온도는 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 31.5도일 수 있다.
상기 제2 온도는 약 섭씨 30도 또는 약 섭씨 31도일 수 있다.
상기 제2 온도는 상기 제1 온도보다 높을 수 있다.
상기 원하는 단백질은 다중 서브유닛 복합체를 포함한다.
상기 다중 서브유닛 복합체는 항체를 포함할 수 있다.
상기 항체는 인간 또는 인간화 항체일 수 있다.
상기 항체는 IL-6, TNF알파, CGRP, PCSK9, HGF, 또는 NGF에 대해 특이적일 수 있다.
상기 방법은 상기 원하는 단백질의 수율을 증가시킬 수 있다.
상기 방법은, 상기 제1 온도와 상기 제2 온도 사이의 차이 없이 시행되는 동일한 방법에 비해, 하나 이상의 생성물 관련 변이형들의 상대적인 존재비를 감소시킬 수 있다.
상기 방법은, 상기 제1 온도와 상기 제2 온도 사이의 차이 없이 시행되는 동일한 방법에 비해, 크기 배제 크로마토그래피 또는 겔 전기영동법에 의해 검출된 바와 같이, 상기 원하는 다중 서브유닛 복합체보다 크거나 작은 겉보기 분자량을 나타내는 생성물 관련 변이형들의 상대적인 존재비를 감소시킬 수 있다.
상기 방법은, 상기 제1 온도와 상기 제2 온도 사이의 차이 없이 시행되는 동일한 방법에 비해, 특이한 이황화 결합을 가지고 있는 복합체들의 상대적인 존재비를 감소시킬 수 있다.
상기 방법은, 상기 제1 온도와 상기 제2 온도 사이의 차이 없이 시행되는 동일한 방법에 비해, 감소된 시스테인을 가지고 있는 복합체들의 상대적인 존재비를 감소시킬 수 있다.
상기 방법은, 상기 제1 온도와 상기 제2 온도 사이의 차이 없이 시행되는 동일한 방법에 비해, 특이한 당화를 나타내는 복합체들의 상대적인 존재비를 감소시킬 수 있다.
상기 방법은, 상기 제1 온도와 상기 제2 온도 사이의 차이 없이 시행되는 동일한 방법에 비해, 하나 이상의 생성물 관련 변이형들의 상대적인 존재비를 감소시킬 수 있다.
상기 진핵 세포는 효모 세포를 포함할 수 있다.
상기 효모 세포는 메탄올 자화 효모를 포함할 수 있다.
상기 메탄올 자화 효모는 피치아 속일 수 있다.
상기 피치아 속의 메탄올 자화 효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris )일 수 있다.
상기 피치아 속의 메탄올 자화 효모는 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 귈리어몬디(Pichia guilliermondii), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica) 및 피치아 이노시토베라(Pichia inocitovera)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 원하는 단백질의 발현을 제공하는 유전자들은 하나 이상의 유전자좌에 통합될 수 있다.
상기 유전자좌 중 적어도 하나는 pGAP 유전자좌, 3' AOX TT 유전자좌, PpURA5, OCH1, AOX1, HIS4, GAP, pGAP, 3' AOX TT, ARG 및 HIS4 TT 유전자좌로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 원하는 단백질의 상기 서브유닛들을 암호화하는 유전자들 중 적어도 하나는 유도성 또는 항시성 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
상기 유도성 프로모터는 AOX1, CUP1, 테트라사이클린 유도성, 티아민 유도성 및 FLD1 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
단계 (a)는 글리세롤을 탄소 공급원으로서 포함하는 배양 배지에서 상기 진핵 세포를 상기 글리세롤이 고갈될 때까지 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 원하는 단백질은 CUP1, AOX1, ICL1, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAP), FLD1, ADH1, 알코올 탈수소효소 II, GAL4, PHO3, PHO5 및 Pyk 프로모터, 테트라사이클린 유도성 프로모터, 티아민 유도성 프로모터, 이로부터 유래된 키메라 프로모터, 효모 프로모터, 포유류 프로모터, 곤충 프로모터, 식물 프로모터, 파충류 프로모터, 양서류 프로모터, 바이러스 프로모터 및 조류 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택된 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
상기 진핵 세포는 이배체, 사배체 세포, 또는 다배수체일 수 있다.
이러한 방법은 상기 원하는 단백질을 상기 진핵 세포로부터 또는 배양 배지로부터 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 원하는 단백질은 세포 내 성분, 세포질, 핵원형질 또는 상기 진핵 세포의 막으로부터 정제될 수 있다.
상기 진핵 세포는 상기 원하는 단백질을 배양 배지로 분비할 수 있다.
단계 (a)는 회분식 시기를 포함할 수 있다.
상기 회분식 시기는 탄소 공급원을 포함하는 배지에서 진핵 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 회분식 시기의 종결은 배양 배지 내의 탄소 공급원의 고갈에 의해 결정될 수 있다.
단계 (b)는 유가식 시기를 포함할 수 있다.
호흡률(RQ)은 단계 (b) 동안 특정 값으로 또는 특정 범위로 유지될 수 있다.
상기 특정 RQ 값은 약 1.12일 수 있다.
상기 특정 RQ 범위는 약 1.0 내지 1.24, 또는 약 1.06 내지 1.18, 또는 약 1.09 내지 1.15일 수 있다.
상기 RQ 값 또는 상기 RQ 범위는 공급 속도, 원료 조성, 공급된 공기 유속, 교반 속도 및/또는 공급된 공기의 산소 농도 중 하나 이상을 조절하여 유지될 수 있다.
방법은 회분식 시기 및 유가식 시기를 포함할 수 있다.
회분식 시기는 진핵 세포를 탄소 공급원과 함께, 상기 탄소 공급원이 고갈될 때까지 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 탄소 공급원은 글리세롤, 글루코오스, 에탄올, 시트르산염, 소르비톨, 자일로오스, 트레할로오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 멜리비오스, 락토오스, 말토오스, 람노오스, 리보오스, 만노오스, 만니톨 및 라피노오스 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 글리세롤을 포함한다.
유가식 시기는 회분식 시기 후에 개시될 수 있다.
온도 전환은 회분식 시기의 끝에서 또는 회분식 시기의 끝 근처에서, 유가식 시기의 시작에서 또는 유가식 시기의 시작 근처에서, 회분식 시기와 유가식 시기 사이에서 시행될 수 있다.
예를 들어, 온도 전환은 탄소 공급원의 고갈 후, 또는 원료 첨가 개시 전, 또는 원료 첨가 개시 다음에 시행될 수 있다.
바람직하게는, 온도 전환은 원료 첨가 개시 후 5시간 미만, 예컨대, 원료 첨가 개시 후 4시간 미만, 3시간 미만, 2시간 미만, 1시간 미만, 30분 미만, 20분 미만, 또는 5분 미만에 시행된다. 그러나 온도 전환은 더 일찍 또는 더 늦게 시행될 수 있다.
이러한 방법은 배양물에 에탄올 볼러스를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 에탄올 볼러스는 초기 배양물에 첨가된 탄소 공급원의 고갈과 동시에 첨가될 수 있는데, 초기 배양물에 첨가된 탄소 공급원의 고갈은 용존 산소 농도(용존 산소 스파이크)의 급격한 증가에 의해 또는 다른 수단에 의해 검출될 수 있다.
에탄올 볼러스는 약 0.01 % 내지 약 4%, 약 0.02% 내지 약 3.75%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.08% 내지 약 3.25%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.2% 내지 약 2.75%, 약 0.3% 내지 약 2.5%, 약 0.4% 내지 약 2.25%, 약 0.5% 내지 약 1.5%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 0.6% 내지 약 1.75%, 약 0.7% 내지 약 1.5%, 또는 약 0.8% 내지 약 1.25%의 배양물 내 에탄올 농도를 초래할 수 있다.
에탄올 볼러스는 적어도 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.10%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8% 또는 0.9%(w/v)일 수 있는 배양물 내 에탄올 농도를 초래할 수 있다.
에탄올 볼러스는 최대 약 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.8%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1.0%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.35%, 0.3%, 0.25%, 0.2%, 또는 0.15%(w/v)일 수 있는 배양물 내 에탄올 농도를 초래할 수 있다.
에탄올 볼러스를 첨가하는 단계는 상기 배양물에 에탄올을 첨가하는 단계, 상기 배양물에 에탄올을 포함하는 담체를 첨가하는 단계, 에탄올을 포함하는 배지 또는 담체에 상기 세포를 첨가하는 단계, 또는 배양 배지의 일부분을 교체하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 원하는 단백질은 적어도 하나의 이황화 결합을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 함유할 수 있다.
상기 원하는 단백질은 다중의 서브유닛 복합체를 포함할 수 있다.
상기 다중의 서브유닛 복합체는 항체를 포함할 수 있다.
이러한 방법은, 온도 전환의 부재 하에 시행되는 동일한 방법에 비해, 하나 이상의 생성물 관련 변이형의 상대적인 존재비를 감소시킬 수 있다.
이러한 방법은, 온도 전환의 부재 하에 시행되는 동일한 방법에 비해, 크기 배제 크로마토그래피 또는 겔 전기영동법에 의해 검출된 바와 같이, 상기 원하는 다중 서브유닛 복합체보다 크거나 작은 겉보기 분자량을 나타내는 생성물 관련 변이형들의 상대적인 존재비를 감소시킬 수 있다.
이러한 방법은, 온도 전환의 부재 하에 시행되는 동일한 방법에 비해, 특이한 화학량론을 나타내는 복합체들의 상대적인 존재비를 감소시킬 수 있다.
이러한 방법은, 온도 전환의 부재 하에 시행되는 동일한 방법에 비해, 특이한 이황화 결합을 가지고 있는 복합체들의 상대적인 존재비를 감소시킬 수 있다.
이러한 방법은, 진핵 세포에 원료를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
호흡률(RQ) 값은 특정 값으로 또는 특정 범위로 유지될 수 있다. 상기 특정 RQ 값은 1.12일 수 있다. 상기 특정 RQ 범위는 예를 들어, 1.0 내지 1.24, 또는 1.06 내지 1.18, 또는 1.09 내지 1.15일 수 있다.
특정 RQ 값 또는 범위는 글루코오스의 농도, 산소의 이용 가능성, 교반 강도, 기체 압력, 공급된 공기 또는 기타 기체 혼합물의 유속, 배양물의 점도, 배양물 밀도, 공급된 공기 또는 기타 기체 혼합물의 산소 농도 및 온도 중 하나 이상을 조절(증가 또는 감소)함으로써 유지될 수 있다. 예를 들어, 원료 첨가 속도(공급 속도)는 호흡률(RQ)을 제어하기 위하여, 예컨대, 특정 RQ 값 또는 범위를 유지하기 위하여, 조절(증가 또는 감소)될 수 있다.
상기 원료는 적어도 하나의 발효 가능한 탄소 공급원을 포함할 수 있다.
상기 탄소 공급원은 글리세롤, 글루코오스, 에탄올, 시트르산염, 소르비톨, 자일로오스, 트레할로오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 멜리비오스, 락토오스, 말토오스, 람노오스, 리보오스, 만노오스, 만니톨 및 라피노오스 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 원하는 단백질의 발현을 제공하는 유전자들은 하나 이상의 유전자좌에 통합될 수 있다.
상기 유전자좌 중 적어도 하나는 pGAP 유전자좌, 3' AOX TT 유전자좌, PpURA5, OCH1, AOX1, HIS4, GAP, pGAP, 3' AOX TT, ARG 및 HIS4 TT 유전자좌로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
다중 서브유닛 복합체의 상기 서브유닛들을 암호화하는 유전자들 중 적어도 하나는 유도성 또는 항시성 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
상기 유도성 프로모터는 AOX1, CUP1, 테트라사이클린 유도성, 티아민 유도성 및 FLD1 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
다중 서브유닛 복합체의 상기 서브유닛들을 암호화하는 유전자들 중 적어도 하나는 CUP1, AOX1, ICL1, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAP), FLD1, ADH1, 알코올 탈수소효소 II, GAL4, PHO3, PHO5 및 Pyk 프로모터, 테트라사이클린 유도성 프로모터, 티아민 유도성 프로모터, 이로부터 유래된 키메라 프로모터, 효모 프로모터, 포유류 프로모터, 곤충 프로모터, 식물 프로모터, 파충류 프로모터, 양서류 프로모터, 바이러스 프로모터 및 조류 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택된 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
상기 진핵 세포는 이배체, 사배체 세포, 또는 다배수체일 수 있다.
이러한 방법은 상기 다중 서브유닛 복합체를 상기 진핵 세포 또는 배양 배지로부터 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 다중 서브유닛 복합체는 세포 내 성분, 세포질, 핵원형질 또는 상기 진핵 세포의 막으로부터 정제될 수 있다.
상기 진핵 세포는 상기 원하는 단백질을 배양 배지로 분비한다.
상기 원하는 단백질은 상기 배양 배지로부터 정제될 수 있다.
상기 원하는 단백질은 단일 특이적 또는 이중 특이적 항체를 포함할 수 있다.
상기 원하는 단백질은 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
상기 인간화 항체는 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양, 또는 소 기원의 항체일 수 있다.
상기 인간화 항체는 토끼 기원의 항체일 수 있다.
상기 원하는 단백질은 1가, 2가 또는 다가 항체를 포함할 수 있다.
상기 항체는 단백질 A 및/또는 단백질 G 친화도에 의하여 상기 배양물로부터 정제될 수 있다.
상기 원하는 단백질의 발현을 제공하는 유전자들 중 적어도 하나는 상기 진핵 세포에서의 발현에 최적화될 수 있다.
상기 원하는 단백질은 항체를 포함할 수 있고, 상기 항체의 순도는, 예상 겉보기 유체역학적 반경을 나타내는 항체 복합체에 함유될 수 있고/있거나, 예상 분자량을 나타내는 항체 복합체에 함유될 수 있고/있거나, 상기 항체의 표적과 특이적으로 결합하는, 상기 진핵 세포에 의해 생산되는 항체의 분획을 측정함으로써 평가할 수 있다.
상기 원하는 단백질은 항체를 포함할 수 있고, 상기 항체의 수율은, 예상 분자량을 나타내는 항체 복합체에 함유된, 예상 겉보기 유체역학적 반경을 나타내는 복합체 이외의 항체 복합체에 함유된, 비정상적으로 당화될 수 있는 임의의 생성물 관련 변이형 및/또는 상기 항체의 표적과 특이적으로 결합할 수 없는 임의의 변이형을 고려에 넣지 않는, 상기 진핵 세포에 의해 생산된 항체의 양을 결정함으로써 평가할 수 있다.
상기 항체 복합체의 분자량은 비환원 SDS-PAGE에 의해 결정될 수 있다.
상기 원하는 단백질은 항체를 포함할 수 있고, 상기 방법은 상기 항체를 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 배양 세포는 적어도 100 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 200 mg/L, 적어도 250 mg/L, 적어도 300 mg/L, 100 내지 300 mg/L, 100 내지 500 mg/L, 100 내지 1000 mg/L, 적어도 1000 mg/L, 적어도 1250 mg/리터, 적어도 1500 mg/리터, 적어도 약 1750 mg/리터, 적어도 약 2000 mg/리터, 적어도 약 10000 mg/리터 이상의 상층액 항체 역가를 생산할 수 있다.
상기 원하는 단백질은 다중 서브유닛 복합체를 포함할 수 있고, 상기 다중 서브유닛 복합체의 하나 이상의 서브유닛은 둘 이상의 유전자 카피로부터 발현될 수 있다.
상기 원하는 단백질은 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 유전자의 1~10 카피 내지 상기 항체의 중쇄를 암호화하는 유전자의 1~10 카피로부터 발현될 수 있는 항체를 포함할 수 있다.
상기 원하는 단백질의 발현을 제공하는 유전자(들)는 상기 세포의 게놈으로 통합될 수 있다.
상기 원하는 단백질의 발현을 제공하는 유전자(들)는 염색체 외 요소, 플라스미드, 또는 인공 염색체 상에 함유될 수 있다.
상기 세포는 상기 항체의 중쇄의 발현을 제공하는 유전자 카피들보다 상기 항체의 경쇄의 발현을 제공하는 유전자 카피들을 더 많이 포함할 수 있다.
상기 세포에서 상기 항체의 중쇄를 암호화하는 유전자 카피와 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 유전자 카피의 각각의 수는 2와 2, 2와 3, 3과 3, 3과 4, 3과 5, 4와 3, 4와 4, 4와 5, 4와 6, 5와 4, 5와 5, 5와 6, 또는 5와 7일 수 있다.
상기 세포에서 상기 항체의 중쇄를 암호화하는 유전자 카피와 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 유전자 카피의 각각의 수는 2와 1, 3과 1, 4와 1, 5와 1, 6과 1, 7과 1, 8과 1, 9와 1, 10과 1, 1과 2, 2와 2, 3과 2, 4와 2, 5와 2, 6과 2, 7과 2, 8과 2, 9와 2, 10과 2, 1과 3, 2와 3, 3과 3, 4와 3, 5와 3, 6과 3, 7과 3, 8과 3, 9와 3, 10과 3, 1과 4, 2와 4, 3과 4, 4와 4, 5와 4, 6과 4, 7과 4, 8과 4, 9와 4, 10과 4, 1과 5, 2와 5, 3과 5, 4와 5, 5와 5, 6과 5, 7과 5, 8과 5, 9와 5, 10과 5, 1과 6, 2와 6, 3과 6, 4와 6, 5와 6, 6과 6, 7과 6, 8과 6, 9와 6, 10과 6, 1과 7, 2와 7, 3과 7, 4와 7, 5와 7, 6과 7, 7과 7, 8과 7, 9와 7, 10과 7, 1과 8, 2와 8, 3과 8, 4와 8, 5와 8, 6과 8, 7과 8, 8과 8, 9와 8, 10과 8, 1과 9, 2와 9, 3과 9, 4와 9, 5와 9, 6과 9, 7과 9, 8과 9, 9와 9, 10과 9, 1과 10, 2와 10, 3과 10, 4와 10, 5와 10, 6과 10, 7과 10, 8과 10, 9와 10, 10과 10일 수 있다.
본 개시의 방법을 이용하여, 원치 않는 부산물(들)의 상대적인 존재비는, 통상적인 방법에 비해, 초기 존재비 수준과 비교할 때 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 만큼 또는 검출 불가능한 수준에 이르기까지 감소될 수 있다. 또한, 상대적인 존재비가 감소될 수 있는 예시적인 원치 않는 부산물로는 원하는 다중 서브유닛 복합체와 상이한 겉보기 분자량을 나타내는 하나 이상의 종들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 겉보기 분자량은 화학량론, 접힘, 복합체 조립 및/또는 당화의 차이에 의해 영향 받을 수 있다. 예를 들어, 이러한 원치 않는 부산물은 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 겔 전기 영동법을 이용하여 검출할 수 있고, 원하는 다중 서브유닛 복합체보다 크거나 작은 겉보기 분자량을 나타낼 수 있다. 예시적인 구현예에서, 원치 않는 부산물은 환원 조건 하에서 검출될 수 있다. 다른 예시적인 구현예에서, 원치 않는 부산물은 비환원 조건 하에서 검출될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 본 개시는 더 높은 수율로 항체 및 기타 다중 서브유닛 복합체의 재조합 생산을 제공하는 개선된 방법 및 물질의 조성물도 제공한다. 예시적인 구현예에서, 수율은 본 출원에 개시된 방법을 이용하여, (통상적인 방법에 비해) 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 100% 이상 증가될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 원하는 단백질이 생성될 수 있는 진핵 세포는 효모, 예를 들어, P. 파스토리스(P. pastoris)와 같은 피치아 종 또는 다른 메탄올 자화 효모, 또는 S. 세레비시에(S. cerevisiae)와 같은 사카로미세스(Saccharomyces)종, 또는 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces)(예컨대, S. 폼베(S. pombe))와 같은 다른 효모일 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 메탄올 자화 효모의 다른 예로는 (당해 분야에서 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)라고도 알려져 있는) 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 귈리어몬디(Pichia guilliermondii), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 이노시토베라(Pichia inositovera), 오가타에아 니트라토아베르사(Ogataea nitratoaversa) 및 칸디다 보이드니이(Candida boidnii)를 포함한다.
진핵 세포는 피치아 속의 효모와 같이, 메탄올 자화 효모와 같은, 효모 세포일 수 있다. 피치아 속의 예시적인 메탄올 자화 효모로는 피치아 파스토리스, 피치아 앙구스타, 피치아 귈리어몬디, 피치아 메타놀리카 및 피치아 이노시토베라를 포함한다. 숙주 세포는 교배에 의해, 예컨대, 각각이 다중 서브유닛 복합체의 서브유닛을 암호화하는 적어도 하나의 유전자의 하나 이상의 카피들을 함유하는 두 개의 반수체 효모 세포를 교배시켜, 생산될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 피치아 속의 메탄올 자화 효모는 피치아 파스토리스이다. 진핵 세포는 반수체, 이배체 또는 사배체 세포일 수 있다.
상기 원하는 단백질을 암호화하는 유전자들 중 적어도 하나는 (배지 내 구리 수준에 의해 유도된) CUP1(Koller 등, Yeast 2000; 16: 651-656 참조), 테트라사이클린 유도성 프로모터(예컨대, Staib 등, Antimicrobial Agents And Chemotherapy, Jan. 2008, p. 146-156 참조), 티아민 유도성 프로모터, AOX1, 1CL1, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAP), FLD1, ADH1, 알코올 탈수소효소 II, GAL4, PHO3, PHO5, 그리고 Pyk 프로모터, 이로부터 유래된 키메라 프로모터, 효모 프로모터, 포유류 프로모터, 곤충 프로모터, 식물 프로모터, 파충류 프로모터, 양서류 프로모터, 바이러스 프로모터 및 조류 프로모터와 같은 유도성 또는 항시성 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.
진핵 세포는 상기 원하는 단백질을 배양 배지로 분비할 수 있다. 예를 들어, 상기 원하는 단백질은 분비 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 원하는 다중 서브유닛 복합체는 상기 숙주 세포 내에 보유될 수 있고, 이로부터 분리될 수 있다.
원하는 단백질은 단일 특이적 또는 이중 특이적 항체와 같은 항체를 포함할 수 있다. 항체는 임의의 항원과 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
원하는 단백질은 임의의 유형의 항체를 포함할 수 있다. 예시적인 항체 유형은 임의의 포유류 종, 예컨대, 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양, 소 등의 항체를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 인간 항체 또는 토끼 기원일 수 있는 인간화 항체이다. 항체는 1가, 2가, 또는 다가 항체일 수 있다.
상기 진핵 세포에서 원하는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄와 같은, 원하는 단백질의 발현을 제공하는 상기 유전자들 중 적어도 하나는 (예컨대, 바람직한 코돈을 선택하고/하거나 코돈 선택을 통한 AT 백분율을 변경함으로써) 상기 숙주 세포에서의 발현에 최적화될 수 있다.
원하는 항체와 같은, 상기 원하는 단백질의 순도는, 당화되지 않고, (예컨대, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된) 예상 겉보기 유체역학적 반경 및/또는 겉보기 분자량을 나타내는 복합체 내에 함유되고, (예컨대, SDS-PAGE, 및 선택적인 웨스턴 블랏과 같은 겔 전기영동에 의해 검출된) 예상 전기영동 이동도를 나타내는, 상기 숙주 세포에 의해 생산된 원하는 단백질의 분획을 측정하고/하거나 다중 서브유닛 복합체의 특이적 활성(예컨대, 원하는 항체의 표적과의 특이적 결합)을 측정함으로써 평가할 수 있다.
원하는 단백질은 항체일 수 있고, 상기 항체의 수율은, 당화된, 예상 겉보기 분자량 또는 유체역학적 반경을 나타내는 복합체 이외의 항체 복합체에 함유된 임의의 생성물 관련 변이형, 및/또는 상기 원하는 항체의 표적과 특이적으로 결합할 수 없는 변이형을 고려에 넣지 않는, 상기 숙주 세포에 의해 생산된 원하는 항체의 양을 결정함으로써 평가할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 효모 세포에서 항체 또는 항체의 항원 결합 단편과 같은 원하는 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 효모 세포의 군집은 배양 배지에서 유가 발효 조건 하에서 배양된다. 각각의 효모 세포는 중쇄 폴리펩티드와 같은, 원하는 단백질을 암호화하는 DNA 단편 및 선택적으로, 항체의 경쇄 폴리펩티드와 같은, 제2의 원하는 단백질을 암호화하는 DNA 세그먼트를 포함한다. 하나 이상의 DNA 세그먼트는 글리세르알데히드-3-인산(GAP) 전사 프로모터 및 전사 터미네이터에 작동 가능하게 연결된다. 발효물은 제1 공급 속도의 발효 가능한 당 원료를 포함하고, 발효물은 제1 산소 이동 속도로 산소가 첨가된다. 군집의 호흡률(RQ)은 유가식 발효의 공급 시기 중에 측정되고, 그것은 원하는 소정의 범위와 비교된다. 발효 가능한 당 공급 속도 및 산소 이동 속도 중 하나 또는 둘 다는 RQ가 원하는 소정의 범위 밖일 때 제2의 속도로 조절된다. 측정 및 조절은 배양의 전체 또는 일부에 걸쳐 수행된다. 효모 세포는 배양 배지로부터 수확된다. 효모 세포에 의해 생산된, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드와 같은, 원하는 단백질은 효모 세포가 고갈된 배양 배지로부터 또는 효모 세포로부터 회수된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 피치아 효모 세포에서 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 포함하는 항체를 생산하는 방법이 제공된다. 피치아 효모 세포의 군집은 배양 배지에서 저산소, 유가식 발효 조건 하에서 배양된다. 각각의 효모 세포는 항체의 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 세그먼트 및 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 세그먼트를 포함한다. DNA 세그먼트는 글리세르알데히드-3-인산(GAP) 전사 프로모터 및 전사 터미네이터에 작동 가능하게 연결된다. 효모 세포는 배양 배지로부터 수확된다. 효모 세포에 의해 생산된 항체는 효모 세포로부터 또는 효모 세포가 고갈된 배양 배지로부터 회수된다.
또한, 본 개시는 효모 세포의 발효물이 원하는 단백질을 만들기 위하여, 발효 가능한 당 원료 및/또는 산소 첨가의 수준을 조절하는 호흡률 측정치를 이용하는 피드백 제어 메커니즘을 제공한다. 이러한 피드백 제어 메커니즘은 에탄올의 유독한 누적을 피하면서, 양호한 양의 생성물을 생산하는 잘 제어된 배양을 허용한다. 추가적으로, 그렇게 생산된 원하는 단백질은 우수한 균질성 및 적절한 서브유닛 간 조립과 같은 우수한 질적인 성질을 나타낸다. 예를 들어, 본 개시는 다음의 단계를 포함하는 효모 세포에서 원하는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 배양 배지에서 효모 세포의 군집을 유가식 발효 조건 하에서 배양하는 단계(이때, 각각의 효모 세포는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 세그먼트를 포함하되, 상기 DNA 세그먼트는 글리세르알데히드-3-인산(GAP) 전사 프로모터 및 전사 터미네이터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질은 글리세르알데히드-3-인산이 아니며, 발효물은 제1 공급 속도의 발효 가능한 당 원료를 포함하고, 발효물은 제1 산소 이동 속도에서 교반됨); (b) 회분식 발효 중 군집의 호흡률(RQ)을 측정하고, 호흡률이 원하는 소정의 범위 내인지를 결정하는 단계(이때, 배양 개시 후 약 20~40시간에서의 RQ의 원하는 소정의 범위는 약 1.08 내지 약 1.35임); (c) (RQ가 원하는 소정의 범위 밖일 때) 발효 가능한 당 공급 속도를 제2 공급 속도까지, 또는 산소 이동 속도를 제2 산소 이동 속도까지 조절하거나 둘 다를 조절하는 단계(이때, RQ는 원하는 소정의 범위 밖임); (d) 배양 단계 전체에 걸쳐, 단계 (b)와 단계 (c)를 1회 이상 반복하는 단계; (e) 배양 배지로부터 효모 세포를 수확하는 단계; 및 (f) 세포 및/또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계.
선택적으로, 상기 방법은 (a) 상기 원하는 단백질의 발현을 제공하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 진핵 세포를 제1 온도에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 진핵 세포를 제2 온도에서 배양하고, 상기 진핵 세포가 상기 원하는 단백질을 생산하도록 하는 단계를 포함할 수 있는데, 이때, 상기 제2 온도는 상기 제1 온도와 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 온도는 약 섭씨 20도 내지 약 섭씨 32도, 약 섭씨 24도 내지 약 섭씨 31.5도, 약 섭씨 27도 내지 약 섭씨 31도, 약 섭씨 27.5도 내지 약 섭씨 30도, 약 섭씨 20도 내지 약 섭씨 29.5도, 약 섭씨 24도 내지 약 섭씨 29도, 약 섭씨 27도 내지 약 섭씨 28.5도, 또는 약 섭씨 27.5도 내지 약 섭씨 28.5도일 수 있고/있거나 선택적으로 상기 제2 온도는 상기 제1 온도보다 약 섭씨 1도 내지 약 섭씨 6도, 상기 제1 온도보다 약 섭씨 1도 내지 약 섭씨 3도, 상기 제1 온도보다 약 섭씨 2도 내지 약 섭씨 4도, 또는 상기 제1 온도보다 약 섭씨 2도 내지 약 섭씨 3도 높을 수 있고/있거나 선택적으로 상기 제2 온도는 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 34도, 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 32도, 또는 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 31.5도일 수 있으며; 예를 들어, 상기 제1 온도는 약 섭씨 28도일 수 있고, 상기 제2 온도는 약 섭씨 30도 또는 약 섭씨 31도일 수 있거나; 또는 상기 제1 온도는 약 섭씨 27.5도 내지 약 섭씨 28.5도일 수 있고, 상기 제2 온도는 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 31도일 수 있으며; 이때, 선택적으로, 상기 제1 온도는 상기 제2 온도보다 높다.
상기 단계 (d)는 약 1 내지 5분의 간격, 예를 들어, 약 3분의 간격으로 이루어질 수 있다.
상기 단계 (d)는 연속적으로 이루어질 수 있다.
공급 속도에 대한 적어도 하나의 조절이 단계 (c)에서 이루어질 수 있다.
단계 (c)는 RQ를 측정하는 장치에 연결된 피드백 제어 메커니즘을 이용하여 자동적으로 수행될 수 있다.
효모 세포는 피치아 파스토리스, 피치아 메타놀리카, 피치아 앙구스타, 피치아 서모메타놀리카(Pichia thermomethanolica) 및 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어지는 군으로부터 선택된 종에서 유래될 수 있다.
이러한 방법은 배양 약 10 내지 14시간에 효모 세포에 에탄올을 전달하여 발효물에서 약 8.0 내지 약 12.0 g/l 에탄올의 수준을 달성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
배양 개시 후 약 20~40시간에서의 RQ의 원하는 소정의 범위는 약 1.09 내지 약 1.25 사이일 수 있다.
수확 단계는 배양 개시 후 약 80~110 시간에 수행될 수 있다.
에탄올 농도는 배양 단계 중에 측정될 수 있고, 에탄올 농도를 약 5 g/l 초과 및 약 25 g/l 미만으로 안정화하기 위하여 조절이 이루어질 수 있는데, 이때, 상기 조절은 발효 가능한 당 공급 속도를 제3의 공급 속도로 또는 산소 이동 속도를 제3의 산소 이동 속도로 조절하거나 둘 다를 조절함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 조절은 에탄올 농도를 약 5 g/l 초과 및 약 17 g/l 미만으로 안정화하기 위하여 이루어질 수 있다.
발효 20~110시간에서 RQ의 원하는 소정의 범위는 약 1.08-1.1; 약 1.08-1.15; 약 1.08-1.2; 약 1.08-1.25; 약 1.08-1.3; 및 약 1.08-1.35로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
측정 단계 (b)는 발효물의 배기가스를 샘플링하여 수행될 수 있다.
측정 단계 (b)는 질량 분광분석기, 적외선 분석기, 또는 상자성 분석기를 이용하여 수행될 수 있다.
단계 (c)에서, 산소 이동 속도는, RQ가 너무 높을 수 있는 경우 산소 이동 속도를 증가시키거나 RQ가 너무 낮을 수 있는 경우 산소 이동 속도를 감소시켜 조절할 수 있다.
단계 (c)에서, 발효 가능한 당 공급 속도는, RQ가 너무 낮을 수 있을 경우 발효 가능한 당 공급 속도를 증가시키거나 RQ가 너무 높을 수 있을 경우 발효 가능한 당 공급 속도를 감소시켜 조절할 수 있다.
또한, 단계 (c)에서, 발효 가능한 당 공급 속도는, RQ가 너무 낮을 수 있을 경우 발효 가능한 당 공급 속도를 증가시키거나 RQ가 너무 높을 수 있을 경우 발효 가능한 당 공급 속도를 감소시켜 조절할 수 있다.
단계 (c)는 배양물의 교반 속도를 조절하여 수행될 수 있다.
DNA 세그먼트는 항체 중쇄 또는 항체 경쇄, 또는 항체의 단편을 암호화할 수 있다.
폴리펩티드는 배양 배지로부터 수확될 수 있다.
각각의 효모 세포는 항체의 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 세그먼트 및 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 세그먼트를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다음의 단계를 포함하는 피치아 효모 세포에서 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 저산소, 유가식 발효 조건 하에서 배양 배지에서 피치아 효모 세포의 군집을 배양하는 단계(이때, 각각의 효모 세포는 항체의 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 세그먼트 및 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 세그먼트를 포함하며, 상기 DNA 세그먼트는 글리세르알데히드-3-인산(GAP) 전사 프로모터 및 전사 터미네이터에 작동 가능하게 연결될 수 있음); (b) 배양 배지로부터 효모 세포를 수확하는 단계; 및 (c) 효모 세포가 고갈된 배양 배지로부터 효모 세포에 의해 생산된 항체를 회수하는 단계. 선택적으로, 상기 방법은 (a) 상기 원하는 단백질의 발현을 제공하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 진핵 세포를 제1의 온도에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 진핵 세포를 제2의 온도에서 배양하고, 상기 진핵 세포가 상기 원하는 단백질을 생산하도록 하는 단계를 포함할 수 있는데; 이때, 상기 제2의 온도는 상기 제1의 온도와 상이할 수 있으며; 예를 들어, 상기 제1 온도는 약 섭씨 20도 내지 약 섭씨 32도, 약 섭씨 24도 내지 약 섭씨 31.5도, 약 섭씨 27도 내지 약 섭씨 31도, 약 섭씨 27.5도 내지 약 섭씨 30도, 약 섭씨 20도 내지 약 섭씨 29.5도, 약 섭씨 24도 내지 약 섭씨 29도, 약 섭씨 27도 내지 약 섭씨 28.5도, 또는 약 섭씨 27.5도 내지 약 섭씨 28.5도일 수 있고/있거나; 선택적으로 상기 제2 온도는 상기 제1 온도보다 약 섭씨 1도 내지 약 섭씨 6도, 상기 제1 온도보다 약 섭씨 1도 내지 약 섭씨 3도, 상기 제1 온도보다 약 섭씨 2도 내지 약 섭씨 4도, 또는 상기 제1 온도보다 약 섭씨 2도 내지 약 섭씨 3도 높을 수 있고/있거나; 선택적으로 상기 제2 온도는 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 34도, 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 32도, 또는 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 31.5도일 수 있고; 예를 들어, 상기 제1 온도는 약 섭씨 28도일 수 있고, 상기 제2 온도는 약 섭씨 30도 또는 약 섭씨 31도일 수 있거나; 또는 상기 제1 온도는 약 섭씨 27.5도 내지 약 섭씨 28.5도일 수 있고, 상기 제2 온도는 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 31도일 수 있으며; 이때, 선택적으로, 상기 제1 온도는 상기 제2 온도보다 높다.
피치아 효모 세포는 피치아 파스토리스, 피치아 메타놀리카, 피치아 앙구스타 및 피치아 서모메타놀리카로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 피치아 효모 세포는 피치아 파스토리스일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 (i) 대규모, 유가식 발효 조건 하에서 효모 세포를 배양하는 단계(이때, 상기 배양된 효모 세포는 원하는 단백질을 발현하도록 유전자 조작될 수 있음); (ii) 유가식 발효 중에 RQ 값을 주기적으로 또는 연속적으로 모니터링하고; RQ 값이 특정 범위 내에 해당하는지를 결정하는 단계; (iii) 유가식 발효 중에 적어도 1회 적어도 하나의 배양 매개변수를 조절하여, 유가식 효모 배양물의 RQ 값이 특정 범위 내에 있을 수 있도록 RQ 값을 조절하거나 유지하는 단계; 및 (iv) 효모 세포 또는 배양 배지를 수확하고, 단계 (iii)의 수확된 세포 또는 배양 배지로부터 원하는 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 대규모 발효 공정을 제공한다. 선택적으로, 상기 방법은 (a) 상기 원하는 단백질의 발현을 제공하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 진핵 세포를 제1의 온도에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 진핵 세포를 제2의 온도에서 배양하고, 상기 진핵 세포가 상기 원하는 단백질을 생산하도록 하는 단계를 포함할 수 있는데, 이때, 상기 제2의 온도는 상기 제1의 온도와 상이할 수 있고; 예를 들어, 상기 제1 온도는 약 섭씨 20도 내지 약 섭씨 32도, 약 섭씨 24도 내지 약 섭씨 31.5도, 약 섭씨 27도 내지 약 섭씨 31도, 약 섭씨 27.5도 내지 약 섭씨 30도, 약 섭씨 20도 내지 약 섭씨 29.5도, 약 섭씨 24도 내지 약 섭씨 29도, 약 섭씨 27도 내지 약 섭씨 28.5도, 또는 약 섭씨 27.5도 내지 약 섭씨 28.5도일 수 있고/있거나; 선택적으로 상기 제2 온도는 상기 제1 온도보다 약 섭씨 1도 내지 약 섭씨 6도, 상기 제1 온도보다 약 섭씨 1도 내지 약 섭씨 3도, 상기 제1 온도보다 약 섭씨 2도 내지 약 섭씨 4도, 또는 상기 제1 온도보다 약 섭씨 2도 내지 약 섭씨 3도 높을 수 있고/있거나; 선택적으로 상기 제2 온도는 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 34도, 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 32도, 또는 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 31.5도일 수 있고; 예를 들어, 상기 제1 온도는 약 섭씨 28도일 수 있고, 상기 제2 온도는 약 섭씨 30도 또는 약 섭씨 31도일 수 있거나; 또는 상기 제1 온도는 약 섭씨 27.5도 내지 약 섭씨 28.5도일 수 있고, 상기 제2 온도는 약 섭씨 30도 내지 약 섭씨 31도일 수 있으며; 이때, 선택적으로, 상기 제1 온도는 상기 제2 온도보다 높다.
단백질은 항체 단백질 또는 항체 단편일 수 있다.
단백질(예컨대, 항체 단백질 또는 항체 단편)은 효모에 의해 분비될 수 있다.
조절된 배양 매개변수는 (a) 공기 유속, (b) 산소 농도, (c) 원료 조성, (d) 공급 속도, (e) 세포 밀도, 및 (f) 교반 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
조절된 배양 매개변수는 (a) 원료 조성, (b) 공급 속도 및 (c) 산소 이동 속도 중 하나 이상을 포함할 수 있는데, 이때, 배양 매개변수는 공정 중에 적어도 1회 조절되어 유가식 효모 배양물의 RQ 값이 특정 범위 내에 있을 수 있도록 조절 또는 유지된다.
이러한 방법은 유가식 발효 배양에 선행하는 회분식 발효를 더 포함할 수 있다.
유가식 발효는 적어도 50시간 동안, 또는 적어도 70시간 동안 수행될 수 있다.
이러한 효모 세포는 다배수체, 반수체, 또는 이배체 피치아 파스토리스와 같은 피치아 파스토리스일 수 있다.
유가식 배양물의 세포 밀도는 1 내지 700 g/l의 젖은 세포 중량을 포함할 수 있다.
단계 (iii)에서, RQ 값을 특정 범위 내에 해당하도록 조절하기 위하여, 공급 속도가 증가 또는 감소될 수 있다.
단계 (iii)에서, RQ 값을 특정 범위 내에 해당하도록 조절하기 위하여, 적어도 하나의 발효 가능한 당 또는 기타 탄화수소의 양을 변경함으로써, 원료 조성이 변경될 수 있다.
단계 (iii)에서, RQ 값을 특정 범위 내에 해당하도록 조절하기 위하여, 유가식 발효에서의 산소의 양은 유가식 발효 중에 증가되거나 감소될 수 있다.
단계 (iii)에서, RQ 값을 특정 범위 내에 해당하도록 조절하기 위하여, 적어도 하나의 발효 가능한 당 또는 기타 발효 가능한 탄화수소의 양은 증가되거나 감소될 수 있다.
단계 (iii)에서, RQ 값을 특정 범위 내에 해당하도록 조절하기 위하여, 유가식 배양 중에 공급 속도는 증가되거나 감소될 수 있다.
이러한 공정은, 단계 (iii)을 포함하지 않는 유가식 공정에 비해, 항체 순도 및 항체 생산으로부터 선택된 성질에서의 개선을 가져올 수 있다.
단계 (iii)에서 RQ 값에 대한 특정 범위는 약 1.08~1.35, 또는 약 1.08~1.2일 수 있다.
본 명세서를 읽음으로써 당업자에게 명백해질 이러한 구현예 및 기타 구현예는 개선된 신뢰도, 예측 가능성, 효율 및 품질을 나타내는 방법 및 생성물을 당해 분야에 제공한다.
도 1은 3가지 상이한 Mab1 균주 A, B 및 C의 RQ 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 2는 3가지 상이한 Mab1 균주 A, B 및 C의 교반 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 3은 3가지 상이한 Mab1 균주 A, B 및 C의 에탄올 프로파일을 보여준다.
도 4는 3가지 상이한 Mab1 균주 A, B 및 C의 성장 프로파일을 보여준다.
도 5는 3가지 상이한 Mab1 균주 A, B 및 C의 전체 배양액 역가 프로파일을 보여준다.
도 6은 3가지 상이한 RQ 설정값 RQ 1.09 ~ 1.15, 1.19 ~ 1.25, 1.29 ~ 1.35에서의 Mabl 균주 A의 RQ 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 7은 3가지 상이한 RQ 설정값 RQ 1.09 ~ 1.15, 1.19 ~ 1.25, 1.29 ~ 1.35에서의 Mabl 균주 A의 교반 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 8은 3가지 상이한 RQ 설정값 RQ 1.09 ~ 1.15, 1.19 ~ 1.25, 1.29 ~ 1.35에서의 Mabl 균주 A의 에탄올 프로파일을 보여준다.
도 9는 3가지 상이한 RQ 설정값 RQ 1.09 ~ 1.15, 1.19 ~ 1.25, 1.29 ~ 1.35에서의 Mabl 균주 A의 성장 프로파일을 보여준다.
도 10은 3가지 상이한 RQ 설정값 RQ 1.09 ~ 1.15, 1.19 ~ 1.25, 1.29 ~ 1.35에서의 Mabl 균주 A의 전체 배양액 역가 프로파일을 보여준다.
도 11은 호기성 및 저산소 조건 하에서 성장시킨 Mab1 균주 A의 RQ 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 12는 호기성 및 저산소 조건 하에서 성장시킨 Mab1 균주 A의 교반 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 13은 호기성 및 저산소 조건 하에서 성장시킨 Mab1 균주 A의 에탄올 프로파일을 보여준다.
도 14는 호기성 및 저산소 조건 하에서 성장시킨 Mab1 균주 A의 성장 프로파일을 보여준다.
도 15는 호기성 및 저산소 조건 하에서 성장시킨 Mab1 균주 A의 %DO 프로파일을 보여준다.
도 16은 호기성 및 저산소 조건 하에서 성장시킨 Mab1 균주 A의 전체 배양액 역가 프로파일을 보여준다.
도 17은 4가지 상이한 Mab2 균주 A, B, C 및 D의 RQ 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 18은 4가지 상이한 Mab2 균주 A, B, C 및 D 균주의 교반 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 19는 4가지 상이한 Mab2 균주 A, B, C 및 D 균주의 에탄올 프로파일을 보여준다.
도 20은 4가지 상이한 Mab2 균주 A, B, C 및 D 균주의 성장 프로파일을 보여준다.
도 21은 4가지 상이한 균주 A, B, C 및 D 균주의 전체 배양액 역가 프로파일을 보여준다.
도 22는 3가지 상이한 Mab3 균주 A, B 및 C의 RQ 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 23은 3가지 상이한 Mab3 균주 A, B 및 C의 교반 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 24는 3가지 상이한 Mab3 균주 A, B 및 C의 에탄올 프로파일을 보여준다.
도 25는 3가지 상이한 Mab3 균주 A, B 및 C의 성장 프로파일을 보여준다.
도 26은 3가지 상이한 Mab3 균주 A, B 및 C의 전체 배양액 역가 프로파일을 보여준다.
도 27은 상이한 공급 속도에서의 Mab3 균주 B의 RQ 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 28은 상이한 공급 속도에서의 Mab3 균주 B의 교반 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 29는 상이한 공급 속도에서의 Mab3 균주 B의 에탄올 프로파일을 보여준다.
도 30은 상이한 공급 속도에서의 Mab3 균주 B의 성장 프로파일을 보여준다.
도 31은 상이한 공급 속도에서의 Mab3 균주 B의 전체 배양액 역가 프로파일을 보여준다.
도 32는 상이한 공급 속도에서의 Mab4 균주 A의 RQ 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 33은 상이한 공급 속도에서의 Mab4 균주 A의 교반 프로파일을 보여준다. 수직선은 RQ 제어가 개시된 시간을 나타낸다.
도 34는 상이한 공급 속도에서의 Mab4 균주인 A 균주의 에탄올 프로파일을 보여준다.
도 35는 상이한 공급 속도에서의 Mab4 균주인 A 균주의 성장 프로파일을 보여준다.
도 36은 상이한 공급 속도에서의 Mab4 균주인 A 균주의 전체 배양액 프로파일을 보여준다.
도 37은 대규모 발효에서 호기성(B1) 및 저산소(B2) 공정에 대한 Mab2 균주 A의 전체 배양액 프로파일을 보여준다.
도 38은 호기성 및 저산소 공정 조건에 대한 발효 시간 62, 70 및 86시간에서 Mab1 균주 A의 SDS-PAGE 비환원 및 환원 겔을 보여준다.
도 39는 발효 시간 62, 69 및 85시간에서 Mab1 균주 A의 SDS-PAGE 비환원 및 환원 겔을 보여준다.
도 40은 재조합 항체 생산에 미치는 배양 온도 전환의 이로운 영향을 도시한다. 다섯 가지의 상이한 온도 전환 및 (28로 유지된) 비전환 대조군에 대한, 발효 전반에 걸친 시점에 대해 전체 배양액("WB") 항체 역가(임의의 단위)를 그래프로 나타내었다. 표시된 바와 같이, 전환 전 온도는 28였고, 전환 후 온도는 25, 29.5, 31, 32.5, 또는 34였다. 1.5 내지 3의 상향 온도 전환(최종 온도, 각각 29.5와 31)은 증가된 최종 역가를 초래하였다. 이러한 실험에서 생산된 항체는 Ab-A였다. 31까지 전환된 배양물의 경우, 최종 역가는 (28로 유지된) 비전환 대조군 배양물에 비해 약 30% 증가되었다.
도 41A 및 B는 도 40에서 배양 온도 전환으로 생산된 재조합 항체들의 순도를 요약한 것이다. 항체 생산 종료 시에 수확된, 단백질 A로 정제된 항체의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 순도를 평가하였다. 패널 A는 비환원 조건 하에서 평가된 순도를 보여준다. 전체 항체에 해당하는 피크("주요 피크 IgG")와 두 개의 특이한 항체 복합체에 해당하는 피크("사전 피크 HHL"과 "75kD HL")가 검출되었다. 나타내어진 숫자는 각 피크에 함유된, 전체 검출된 단백질의 백분율이다. 비슷한 비율의 전체 단백질이 비전환 배양물(즉, 28로 유지됨) 및 29.5 및 31까지 전환된 배양물에 대한 주요 항체 피크 내에 함유되었다. 패널 B는 환원 조건 하에서 검출된 순도를 보여준다. 각각의 온도 조건에 대해, 중쇄("HC"), 경쇄("LC") 및 전체 중쇄 및 경쇄 단백질("전체 HC+LC")에 함유된 전체 검출된 단백질의 백분율을 세 개의 다른 피크("RT 9.80", "RT 10.16" 및 "RT 10.80")에 함유된 백분율과 함께 나타내었다. 28로 유지된 비전환 배양물과 비교할 때, 중쇄 및 경쇄 피크에 함유된 단백질의 백분율은 29.5까지 전환된 배양물에 대해 비슷하게 유지되었고, 더 높은 온도 전환에 대해 약 4% 증가되었다.
도 42a 내지 c는 25까지 하향 전환된 배양물에 대해 도 40에 나타난 바와 같이 생산된 재조합 항체들의 순도를 상술한 것이다. 패널 a, 크기 배제 크로마토그래피 기록 및 비환원 샘플에 대하여 도표화된 결과. 패널 b, 비환원(1번 레인) 및 환원(3번 레인) 샘플에 대하여 쿠마시 염색된 겔 전기영동법 결과. 2번 레인과 4번 레인은 크기 마커를 보여준다. 패널 3, 크기 배제 크로마토그래피 기록 및 환원 샘플에 대하여 도표화된 결과. 크로마토그래피 결과를 도 41에 도표화하고 요약하였다.
도 43a 내지 c는 온도 전환 없이 생산되고, 28로 유지된 대조군 배양물에 대해 도 40에 나타낸 바와 같은 재조합 항체의 순도를 상술한 것이다. 패널 a, 크기 배제 크로마토그래피 기록 및 비환원 샘플에 대하여 도표화된 결과. 패널 b, 비환원(1번 레인) 및 환원(3번 레인) 샘플에 대하여 쿠마시 염색된 겔 전기영동법 결과. 2번 레인과 4번 레인은 크기 마커를 보여준다. 패널 3, 크기 배제 크로마토그래피 기록 및 환원 샘플에 대하여 도표화된 결과. 크로마토그래피 결과를 도 41에 도표화하고 요약하였다.
도 44a 내지 c는 1.5 상향되어 29.5까지 전환된 배양물에 대해 도 40에 나타낸 바와 같이 생산된 재조합 항체의 순도를 상술한 것이다. 패널 a, 크기 배제 크로마토그래피 기록 및 비환원 샘플에 대하여 도표화된 결과. 패널 b, 비환원(1번 레인) 및 환원(3번 레인) 샘플에 대하여 쿠마시 염색된 겔 전기영동법 결과. 2번 레인과 4번 레인은 크기 마커를 보여준다. 패널 3, 크기 배제 크로마토그래피 기록 및 환원 샘플에 대하여 도표화된 결과. 크로마토그래피 결과를 도 41에 도표화하고 요약하였다.
도 45a 내지 c는 3 상향되어 31까지 전환된 배양물에 대해 도 40에 나타낸 바와 같이 생산된 재조합 항체의 순도를 상술한 것이다. 패널 a, 크기 배제 크로마토그래피 기록 및 비환원 샘플에 대하여 도표화된 결과. 패널 b, 비환원(1번 레인) 및 환원(3번 레인) 샘플에 대하여 쿠마시 염색된 겔 전기영동법 결과. 2번 레인과 4번 레인은 크기 마커를 보여준다. 패널 3, 크기 배제 크로마토그래피 기록 및 환원 샘플에 대하여 도표화된 결과. 크로마토그래피 결과를 도 41에 도표화하고 요약하였다.
도 46a 내지 c는 4.5 상향되어 32.5까지 전환된 배양물에 대해 도 40에 나타낸 바와 같이 생산된 재조합 항체의 순도를 상술한 것이다. 패널 a, 크기 배제 크로마토그래피 기록 및 비환원 샘플에 대하여 도표화된 결과. 패널 b, 비환원(1번 레인) 및 환원(3번 레인) 샘플에 대하여 쿠마시 염색된 겔 전기영동법 결과. 2번 레인과 4번 레인은 크기 마커를 보여준다. 패널 3, 크기 배제 크로마토그래피 기록 및 환원 샘플에 대하여 도표화된 결과. 크로마토그래피 결과를 도 41에 도표화하고 요약하였다.
도 47a 내지 c는 6 상향되어 34까지 전환된 배양물에 대해 도 40에 나타낸 바와 같이 생산된 재조합 항체의 순도를 상술한 것이다. 패널 a, 크기 배제 크로마토그래피 기록 및 비환원 샘플에 대하여 도표화된 결과. 패널 b, 비환원(1번 레인) 및 환원(3번 레인) 샘플에 대하여 쿠마시 염색된 겔 전기영동법 결과. 2번 레인과 4번 레인은 크기 마커를 보여준다. 패널 3, 크기 배제 크로마토그래피 기록 및 환원 샘플에 대하여 도표화된 결과. 크로마토그래피 결과를 도 41에 도표화하고 요약하였다.
도 48a 및b는 배양 중 온도 전환에 기인한 Ab-B의 역가의 개선을 보여준다. 패널 a: 전체 배양액 항체 역가(임의의 단위)를 Ab-B 중쇄 유전자의 4카피 및 Ab-B 경쇄 유전자의 3카피를 포함하는 고발현 균주의 배양물("H4/L3")에서 시간에 대한 그래프로 나타낸 것이다. 온도 전환된 배양물("H4/L3 30C")은 모든 시점에서 두 개의 비전환 배양물("H4/L3 28C")보다 더 큰 역가를 나타냈다. 평균 최종 항체 역가는 약 28% 증가되었다. 패널 b: 전체 배양액 항체 역가(임의의 단위)를 Ab-B 중쇄 유전자의 3카피 및 Ab-B 경쇄 유전자의 3카피를 포함하는 저발현 균주의 배양물("H3/L3")에서 시간에 대한 그래프로 나타낸 것이다. 온도 전환된 배양물("H3/L3 30C")은 두 개의 비전환 배양물("H3/L3 28C")의 평균보다 더 큰 역가를 나타냈다.
도 49는 도 48에 나타난 바와 같은 배양 온도 전환으로 생산된 재조합 항체들의 순도를 요약한 것이다. 항체 생산 종료 시에 수확된, 단백질 A로 정제된 항체의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 순도를 평가하였다. 라벨은 도 41에 기술된 바와 같다.
도 50은 배양 중 온도 전환에 기인한 Ab-A의 역가의 개선을 보여준다. 배양 중에 온도 전환을 시킨 배양물 또는 온도 전환이 수행되지 않은 대조군 배양물에 대하여, 전체 배양액 항체 역가(임의의 단위)를 시간에 대한 그래프로 나타낸 것이다. 네 개의 배양물을 원료 첨가 개시 후 28℃로부터 30℃까지 전환시켰고(라벨 "30C"), 다섯 개의 대조군 배양물을 비전환시키고, 배양 전반에 걸쳐 28℃로 유지시켰다. 전환된 배양물 각각은 비전환 배양물보다 더 높은 역가를 나타냈다. 온도 전환으로부터 초래된 역가의 평균 증가는 약 47%였다.
도 51은 도 50에 나타난 바와 같이 배양 온도 전환으로 생산된 재조합 항체의 순도를 요약한 것이다. 항체 생산 종료 시에 수확된, 단백질 A로 정제된 항체의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 순도를 평가하였다. 라벨은 도 41에 기술된 바와 같다.
도 52는 배양 시간에 대하여 그래프화된, 실시예 13의 각 배양물의 온도를 보여준다.
본 개시는 항체 및 기타 다중 서브유닛 단백질을 포함하는, 재조합으로 발현된 단백질의 수율 및/또는 순도를 개선하는 방법을 기술한다. 세포 배양 중에 온도 전환이 시행되는 방법이 제공된다. 전환 부재 하의 발현에 비해 재조합으로 발현된 항체의 수율 및 순도를 개선하기 위한 온도 전환의 포함을 아래에 설명하였다.
이론에 의해 제한되는 것을 의도하지는 않지만, 온도 전환이 재조합 단백질 생산에 지속적인 개선을 제공하는, 유전자 발현의 지속적인 변화를 유발할 수 있다고 가정된다. 상기 개선은 예컨대, 열 충격 단백질 발현의 지속된 증가로 인한, 단백질 발현, 안정성, 접힘, 번역 후 프로세싱 및 (항체 및 기타 다중 서브유닛 복합체의 경우) 적절한 서브유닛 조립의 개선에 의해 매개될 수 있다.
바람직한 숙주 세포는 효모를 포함하고, 특히 바람직한 효모로는 메탄올 자화 효모 균주, 예컨대, 피치아 파스토리스, 한세눌라 폴리모파(피치아 앙구스타), 피치아 귈리어몬디, 피치아 메타놀리카, 피치아 이노시토베라 및 기타를 포함한다(예컨대, 미국 특허 4,812,405, 4,818,700, 4,929,555, 5,736,383, 5,955,349, 5,888,768 및 6,258,559 참조, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본 출원에 포함된다). 이러한 숙주 세포는 형질전환, 교배, 포자 형성 등과 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 본 개시는 하나 이상의 원치 않는 부산물의 생산을 감소시키는 방법을 제공한다. 원하는 단백질에 비해, 원치 않는 부산물(들)은 (다중 서브유닛 복합체의 경우) 변형된 화학량론, 특이한 당화, 겉보기 분자량의 차이, 이황화 결합의 차이, 유체역학적 반경의 차이, 단편 및/또는 절단 중 하나 이상을 나타낼 수 있다. 원치 않는 부산물들은 하나 이상의 추가적인 차이점도 나타낼 수 있다. 또한, 원치 않는 부산물들은 제조에 미치는 부산들의 영향, 예컨대, 특이적 활성 수준의 변형, 면역원성, 또는 원하는 다중 서브유닛 복합체의 물리적 구성 및/또는 기능에 미치는 기타 영향에 의해 검출될 수 있다.
예를 들어, 원하는 단백질이 항체일 때, 원치 않는 부산물들은 H1L1 또는 "절반 항체(half antibody)" 종(즉, 중쇄 및 경쇄를 함유하는 종으로서, 중쇄는 다른 중쇄에 이황화 결합에 의해 연결되지 않은 종) 및/또는 H2L1 종(즉, 두 개의 중쇄와 한 개의 경쇄를 함유하나, 제2의 경쇄가 없는 종)을 포함할 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 원하는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 이의 서브유닛들을 암호화하는 유전자들의 둘 이상의 카피를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서브유닛 유전자의 다수의 카피들은 하나 이상의 염색체 유전자좌(loci)에 나란히 통합될 수 있다. 나란히 통합된 유전자 카피들은 바람직하게는 다중 서브유닛 복합체의 생산을 위한 배양 중에 안정적인 카피 수로 보유된다. 예를 들어, US 2013/0045888로 공개된 공동 소유된 출원은 경쇄 및 중쇄 항체 유전자들의 세 개 내지 네 개의 나란히 통합된 카피들을 함유하는 P. 파스토리스 균주에 대해, 유전자 카피 수가 일반적으로 안정적이었던 실험을 기술하고 있다.
원하는 단백질을 암호화하는 유전자들 중 하나 이상은 숙주 세포의 하나 또는 복수의 염색체 유전자좌에 통합될 수 있다. 유전자간 서열, 프로모터 서열, 암호화 서열, 종결 서열, 조절 서열 등을 포함하는 임의의 적합한 염색체 유전자좌 통합에 활용될 수 있다. P. 파스토리스에서 이용될 수 있는 예시적인 염색체 유전자좌는 PpURA5; OCH1; AOX1; HIS4; 및 GAP를 포함한다. 또한, 암호화 유전자들은 표적화되기 보다는 하나 이상의 임의의 염색체 유전자좌에 통합될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 염색체 유전자좌는 pGAP 유전자좌, 3' AOX TT, 및 HIS4 TT 유전자좌로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 추가적인 예시적 구현예에서, 이종 단백질 서브유닛을 암호화하는 유전자들은 하나 이상의 염색체 외 요소, 예를 들어, 하나 이상의 플라스미드 또는 인공 염색체에 함유될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 원하는 단백질은 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개 이상의 동일한 또는 동일하지 않은 서브유닛을 포함하는 다중 서브유닛 복합체일 수 있다. 추가적으로, 각각의 서브유닛은 각각의 다중 서브유닛 단백질에 1회 이상 존재할 수 있다. 예를 들어, 원하는 단백질은 두 개의 동일하지 않은 경쇄 및 두 개의 동일하지 않은 중쇄를 포함하는 이중 특이적인 항체와 같은, 다중 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 추가적인 예로, 원하는 단백질은 두 개의 동일한 경쇄 및 두 개의 동일한 중쇄를 포함하는 항체를 포함할 수 있다.
이러한 서브유닛은 단일 시스트론성 유전자, 다시스트론성 유전자 또는 이의 임의의 조합으로부터 발현될 수 있다. 각각의 다시스트론성 유전자는 동일한 서브유닛의 여러 카피들을 포함할 수 있거나, 각각의 상이한 서브유닛의 하나 이상의 카피들을 포함할 수 있다.
피치아 파스토리스의 조작에 이용될 수 있는 예시적인 방법(배양 방법, 형질전환방법 및 교배 방법을 포함)은 미국 20080003643, 미국 20070298500, 및 미국 20060270045을 포함하는 공개된 출원 및 Higgins, D. R., 및 Cregg, J. M의 문헌(Eds. 1998. Pichia Protocols. Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J.) 그리고 Cregg, J. M.의 문헌(Ed., 2007, Pichia Protocols (2nd edition), Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J.)에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 포함된다.
이용될 수 있는 예시적인 발현 카세트는 분비 신호를 암호화하는 서열에 융합된 글리세르알데히드 탈수소효소 유전자(GAP 유전자) 프로모터, 이어서 발현될 유전자의 서열, 이어서 P. 파스토리스 알코올 산화효소 1 유전자(AOX1)로부터의 P. 파스토리스 전사 종결 신호를 암호화하는 서열들로 구성된다. 지오신(zeocin) 저항성 마커 유전자는 더 높은 수준의 지오신에 대해 저항성을 나타내는 형질전환체를 선택함으로써, 균주 내에 발현 벡터의 다수의 통합된 카피들을 함유하는 균주들의 강화 수단을 제공할 수 있다. 마찬가지로, G418 또는 카나마이신 저항성 마커 유전자들은 더 높은 수준의 게네티신 또는 카나마이신에 대해 저항성을 나타내는 형질전환체를 선택함으로써, 균주 내에 발현 벡터의 다수의 통합된 카피들을 함유하는 균주들의 강화 수단을 제공하는 데에 이용될 수 있다.
이용될 수 있는 숙주 균주들로는 영양 요구성 P. 파스토리스 또는 기타 피치아 균주, 예를 들어, metl, lys3, ura3 및 ade1 또는 다른 영양 요구성 관련 유전자들에 돌연변이가 있는 균주를 포함한다. 바람직한 돌연변이는 임의의 주목할 만한 빈도로 복귀 돌연변이체를 발생시킬 수 없으며, 바람직하게는 부분적인 결실 돌연변이 또는 훨씬 더 바람직하게는 전체 결실 돌연변이체이다. 예를 들어, 영양 요구성 균주들의 상보적인 세트를 교배시킴으로써 독립 영양 이배체 또는 사배체 균주가 생산된다. 상기 균주들은 최소 배지에서 성장시킬 수 있다는 장점이 있으며, 추가적으로 상기 배지는 포자 형성을 통해 발생할 수 있는 반수체 세포들의 성장에 대해 선택하는 경향이 있다.
반수체 및 이배체 P. 파스토리스 균주들의 형질전환 및 P. 파스토리스 성 주기의 유전적 조작은 위의 피치아 프로토콜(1998, 2007, 위와 같음)에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
벡터들의 숙주 세포 내 표적 유전자좌로의 통합을 유도하기 위하여, 형질전환 전에, 각각의 발현 벡터는 표적 유전자좌(예컨대, GAP 프로모터 서열)에 상동하는 부위 내에서 제한 효소 절단에 의해 선형화될 수 있다. 그런 다음, 각 벡터의 샘플들은 전기천공법 또는 기타 방법에 의해 원하는 균주들의 배양물 내로 개별적으로 형질전환될 수 있고, 성공적인 형질전환체들은 선택 가능한 마커, 예컨대, 항생제 저항성 또는 영양 요구성의 보완에 의해 선택될 수 있다. 분리균을 찍어, 선택적인 조건 하에서 단일 콜로니에 대해 획선 도말한 다음, 각 균주로부터 추출된 게놈 DNA에 대한 서던 블롯 또는 PCR 분석법에 의해 원하는 단백질 또는 다중 서브유닛 복합체(예컨대, 원하는 항체)의 서브유닛을 암호화하는 유전자의 카피 수를 확인하여 시험할 수 있다. 선택적으로, 예상 서브유닛 유전자 생성물의 발현은 예컨대, FACS, 웨스턴 블롯, 콜로니 리프트와 면역 블롯 및 기타 당해 분야에 공지된 수단에 의해 확인할 수 있다. 선택적으로, 분리균은 추가적인 이종 유전자들, 예컨대, 원하는 단백질을 암호화하는 유전자의 추가적인 카피들을 도입하고자 추가로 여러 차례 형질전환되거나, 다중 서브유닛 단백질의 경우, 동일한 서브유닛을 암호화하는 유전자들이 상이한 유전자좌에서 통합될 수 있고/있거나, 상이한 서브유닛의 카피들이 통합될 수 있다. 균주들은 반수체, 이배체, 또는 기타 (사배체 이상의 다배수체를 포함하는) 다배수체로 생산될 수 있다. 유전자 카피 수의 상이한 조합들, 예컨대, 원하는 단백질을 암호화하는 단일 유전자의 다수의 카피들, 또는 다중 서브유닛 단백질의 서브유닛을 암호화하는 상이한 유전자들의 다수의 카피들을 신속하게 시험하기 위하여 반수체 균주를 생산하여 교배할 수 있다. 원하는 단백질 유전자 또는 각각의 예상 서브유닛 유전자의 존재는 서던 블로팅, PCR 및 기타 당해 분야에 공지된 검출 수단에 의해 확인할 수 있다. 추가적으로, 항체 또는 기타 원하는 단백질의 발현은 콜로니 리프트/면역 블롯 방법((Wung 등 Biotechniques 21 808-812 (1996)) 및/또는 FACS에 의해 확인할 수 있다.
형질전환은 선택적으로 이종 유전자를 제2의 유전자좌로 표적화하기 위하여 반복되는데, 이종 유전자는 제1의 유전자좌로 표적화되었던 유전자와 동일한 유전자 또는 상이한 유전자일 수 있다. 제2의 유전자좌로 통합되는 구성체가 제1의 유전자좌에 의해 암호화된 서열과 동일하거나 매우 유사한 단백질을 암호화할 때, 제1 유전자좌로의 원치 않는 통합이 일어날 가능성을 줄이기 위하여 그 서열은 달라질 수 있다. 또한, 이러한 서열 차이는 이후의 재조합 사건들의 가능성을 감소시킴으로써 유전적 안정성을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 제2 유전자좌로 통합되는 서열은 제1 유전자좌로 통합된 서열에 비해, 프로모터 서열, 종결 서열, 코돈 사용빈도 및/또는 기타 허용 가능한 서열에서 차이를 나타낼 수 있다.
P. 파스토리스 반수체 균주들을 교배하기 위하여, 교배되는 각각의 균주는 교배 플레이트 상에서 함께 패치될 수 있다. 예를 들어, 그 성장에 적합한 플레이트 전체에 걸쳐 교배될 각각의 균주를 획선 도말함으로써 복수의 교배를 동시에 편리하게 수행할 수 있고, 교배 파트너들은 제2의 플레이트 전체에 걸쳐 획선 도말될 수 있다(바람직하게는, 이러한 플레이트는 YPD와 같은 풍부 배지이다). 통상적으로, 30에서의 항온배양 하루 또는 이틀 후, 두 개의 플레이트의 세포들을 교배 플레이트 상에 십자형의 방식으로 레플리카 평판배양할 수 있어, 함께 평판배양되는 균주들의 각 쌍으로 이루어진 그물코 형상이 초래되고 본래 획선 쌍의 교차점에서 교배할 기회를 갖는다. 그런 다음, 교배 플레이트를 (예컨대, 30에서) 항온배양하여 균주들 사이의 교배 개시를 자극한다. 약 이틀 후, 교배 플레이트 위의 세포들은 획선 도말되거나, 패치되거나, 원하는 이배체 균주들에 대해 선택적인 배지 상으로 레플리카 평판배양될 수 있다(예컨대, 교배된 균주들이 상호 보완적인 독립 영양성을 나타내는 경우, 드롭아웃 또는 최소 배지 플레이트가 이용될 수 있다). 원하는 이배체 균주들의 선택적인 성장을 가능하게 하기 위하여 적절한 지속시간(예컨대, 약 3일) 동안 이러한 플레이트들을 (예컨대, 30에서) 항온배양할 수 있다. 그렇게 발생된 콜로니를 찍어 단일 콜로니에 대해 획선 도말하여, 각각의 이배체 균주를 분리 정제할 수 있다.
본 발명의 방법에 이용하기 위한 발현 벡터들은 형질 전환된 효모 균주를 확인하기 위한 선택 가능한 영양 요구성 또는 약물 마커를 포함하는, 효모 특이적 서열들을 더 포함할 수 있다. 약물 마커는 예컨대, 높아진 약물 농도에서 세포 군집을 배양하여, 그에 의해 상승된 수준의 저항성 유전자를 발현하는 형질전환체를 선택함으로써, 효모 숙주 세포에서 벡터의 카피 수를 증폭시키는 데에 더 이용될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 이종 단백질 서브유닛들을 암호화하는 유전자들 중 하나 이상은 유도성 프로모터와 결합된다. 적절한 예시적인 프로모터로는 알코올 산화효소 1 유전자 프로모터, 포름알데히드 탈수소효소 유전자(FLD; 미국 공개번호 2007/0298500 참조) 및 기타 당해 분야에 공지된 유도성 프로모터를 포함한다. 알코올 산화효소 1 유전자 프로모터는 글루코오스, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 가장 흔한 탄소 공급원 상에서의 효모의 성장 중에 단단히 억제되지만, 메탄올 상에서의 성장 중에는 고도로 유도된다(Tschopp 등, 1987; Stroman, D. W. 등의 미국 특허번호 4,855,231). 외래 단백질의 생산을 위해, 균주들은 처음에는 바이오매스를 생성하기 위하여 억제성 탄소 공급원 상에서 성장된 다음, 외래 유전자의 발현을 유도하기 위하여 유일한(또는 주요한) 탄소 및 에너지 공급원으로서 메탄올로 이동될 수 있다. 이러한 조절 시스템의 한 가지 장점은 그 발현 생성물이 세포에 유독한 외래 유전자들로 형질전환된 P. 파스토리스 균주들이 억제성 조건 하에서의 성장에 의해 유지될 수 있다는 점이다.
또 다른 예시적인 구현예에서, 이종 유전자들 중 하나 이상은 조절 프로모터와 결합될 수 있으며, 조절 프로모터의 발현 수준은 적절한 조건 하에서 상향 조절될 수 있다. 예시적인 조절 프로모터로는 (배지 내의 구리 수준에 의해 유도된) CUPl 프로모터, 테트라사이클린 유도성 프로모터, 티아민 유도성 프로모터, AOX1 프로모터 및 FLD1 프로모터를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 발효의 생산성을 증가시키기 위하여 특별한 유형의 피드백 제어 메커니즘을 이용할 수 있는 효모에서 원하는 단백질을 제조하는 공정을 제공한다. 이러한 피드백 제어 메커니즘은 원하는 생성물의 최적 생산을 자극하는 혼합 호기성 및 발효성 대사의 확실하고도 정확한 제어를 허용한다. 이는 효모, 특히 피치아 파스토리스에서, 더욱 특별하게는 글리세르알데히드-3-인산(GAP) 프로모터를 이용하여, 단일 클론성 항체와 같은 재조합 단백질을 효과적으로 생산하는 데에 이용될 수 있다.
피드백 제어 메커니즘을 이용하는 공정은 전체 길이의, 정확하게 조립된 재조합 단일 클론성 항체의 생산뿐만 아니라, 즉, 글리세르알데히드-3-인산이 아닌 항체 단편 및 기타 재조합 단백질에도 적용될 수 있다. 본 발명자들이 이용하는 제어 메커니즘은 기계화하기 용이하고 쉽게 자동화할 수 있어서, 발효 조건을 모니터링하고 조절하는 데 있어서 많은 노력을 줄인다. 이러한 공정은 다양한 항체 및 기타 원하는 단백질의 생산에 적용 가능하며, 상업적인, 예컨대, 대규모의 생산 요구에 부응하기 위하여 용이하게 확장 가능하다.
이러한 생산 공정은 피드백 제어 변수로서 호흡률(RQ)을 이용할 수 있다. 발효 대사의 부산물인 에탄올의 치명적인 누적을 방지하는 한편 배양물에서 저산소 상태를 유지하기 위하여, RQ가 질량 이동 매개변수 및/또는 발효 가능한 당 공급 속도의 균형을 맞추는 데에 이용될 수 있다. RQ는 배양물에서 소비된 산소의 몰 비율로 나눈, 생산된 이산화탄소의 몰 비율로 정의된다. RQ는 이산화탄소 및 산소 함유량에 대해 발효조로부터 나오는 배기가스를 분석함으로써 측정할 수 있다. 이러한 대사성 매개변수는 용이하게 이용 가능한 수단을 이용하여 원하는 성장 시기 전반에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 측정할 수 있다. 측정을 위한 적절한 간격의 예는 매 시, 매 30분, 매 15분, 10분, 5분, 4분, 3분, 2분, 1분이다. 측정하는 동안의 기간은 성장 조건에 따라, 배양 개시로부터 수확에 걸쳐서 다를 수 있다. 측정 및 제어를 위한 예시적인 기간은 발효조에서 배양을 개시한 후, 20 내지 40시간, 10 내지 60시간, 5 내지 70시간 및 20 내지 110시간이다.
효모 세포가 산소 부존재 하의 완전히 혐기성인 상태에서 성장될 때, 그들은 성장을 위해 필요한 에너지를 생산하기 위해 발효 대사를 이용하고 있다고 한다. 이러한 경우, 글루코오스의 에탄올로의 전환에 대해 다음의 화학량론 식이 적용된다:
C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + H2O + 에너지
효모 세포가 오로지 글루코오스의 호기성 대사로부터 에너지를 얻을 때, 산소가 소비되고, 이산화탄소와 물만 생산된다:
C6H12O6 + 3O2 → 3CO2 + 6H2O + 에너지
산소 존재 하에서, 효모 세포는 호기성 대사를 이용하는데, 이는 훨씬 효율적이다. 즉, 발효 대사 하에서보다 호기성 대사 하에서 글루코오스 1몰로부터 더 많은 에너지가 얻어진다.
글루코오스로부터 에탄올만을 생산하는 배양물의 RQ는 무한대에 근접하지만(어떠한 산소도 소비되지 않으므로, RQ의 분모가 0이다), 글루코오스의 순수한 호기성 대사의 경우, RQ는 1.0의 값에 근접한다(이산화탄소 3몰을 생산하는 데에 산소 3몰이 소비된다). 따라서, 1보다 큰 값은 호기성 및 발효성 대사 둘 다가 동시에 발생하는 혼합 대사 조건을 나타낸다. 통상적으로 산소 이동 속도 및/또는 발효 가능한 당 공급 속도는 이러한 혼합 대사를 달성하기 위한 피드백 제어 변수로서 RQ를 이용하여 조절할 수 있다. 이러한 혼합 대사를 이용하여, 저산소 조건이 유지될 수 있다. 산소 이동 속도와 발효 가능한 당 공급 속도의 평형에 의해 제어된 낮은 수준의 발효 대사가 존재할 때, 저산소 상태가 존재한다. 저산소 상태는 약 5% 미만의 용존 산소와 함께, 1.0 초과의 RQ에 의해 정의될 수 있다.
RQ는 발효조로부터의 배기가스 스트림에서 측정할 수 있다. 소비된 산소 및 생성된 이산화탄소의 몰 농도를 확인하는 임의의 공지되고 적절한 방법이 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 예시적인 기법은 질량 분광분석법, 적외선 분광분석법 및 상자성 분석이다.
저산소 성장은 피치아에서 항체와 같은 전체 길이의, 적절하게 조립된 단백질의 생산에 유리한 효과를 나타낸다. 본 발명자들은 발효하는 동안 단순히 교반기 속도를 감소시킴으로써 용존 산소 농도를 감소시키고자 하였다. 그러나 이러한 방식으로 신뢰할 만한 제어를 얻는 것은 불가능했는데, 교반 속도 또는 발효 가능한 당 공급 속도의 작은 차이가 유독한 수준의 에탄올의 누적을 빠르게 초래할 수 있기 때문이다.
피드백 제어 메커니즘은 예컨대, 교반기 속도에 의해, 발효 가능한 당 공급 속도 및/또는 산소 이동 속도의 조절을 통하여 에탄올 수준을 측정하고 제어하는 데에도 이용될 수 있다. 에탄올 누적 제어는 더욱 안정적인 공정을 가능케 할 것이다. 에탄올 수준을 모니터링하기 위하여, 발효조에 삽입된 탐침을 이용할 수 있다. 이러한 탐침은 발효 배양액 내의 에탄올 수준을 연속적으로 모니터링할 수 있다. 그러나 제조 및 품질관리 기준(Good Manufacturing Process, GMP) 하에서 분자의 상업적인 제조에 이러한 탐침을 이용하는 것은 실현 가능하지 않은데, 이는 충분히 보정할 수 있는 생산량을 나타내지 않기 때문이다.
RQ가 대략 1.1 내지 대략 2의 좁은 범위에서 유지될 때, 에탄올 누적은 유독하지 않은 수준에서 안정화된다. 바람직하게는, 에탄올 농도는 약 5 g/l 내지 17 g/l로 유지된다. 나아가, 이러한 동일한 조건은 GAP 프로모터를 자극하여, 호기성 발효 조건에 비해 유의하게 증가된 원하는 단백질, 예컨대, 항체 생산을 가져온다. 바람직할 수 있는 RQ 범위로는 약 1.08 ~ 2.0; 약 1.08 ~ 1.85; 약 1.08 ~ 1.65; 약 1.08 ~ 1.45; 약 1.08 ~ 1.35; 약 1.08 ~ 1.25; 약 1.08 ~ 1.2; 및 약 1.08 ~ 1.15를 포함한다. 글루코오스 이외의 대안적인 탄소 공급원은 1 미만의 RQ를 달성할 수 있다. 이러한 탄소 공급원은 아세트산염 및 글리세롤을 포함한다. 기타 적절한 RQ 범위는 1.08 내지 1.35, 그리고 1.15 내지 1.25를 포함한다. RQ는 발효의 임의의 원하는 부분 동안, 예를 들어, 0 내지 110시간, 20~40시간, 20~70시간, 20~90시간, 20~110시간, 또는 임의의 기타 원하는 기간 동안, 모니터링하고 제어할 수 있다.
따라서, 시간이 지남에 따라 다양한 탄소 공급원의 첨가에 의해, 다양한 양의 탄소 공급원의 첨가에 의해, 그리고 산소 수준의 조작에 의해, RQ를 조작하고 변경할 수 있다. 일 구현예에서, 산소 수준은 교반을 증가시키거나 감소시켜 조작한다. 또 다른 구현예에서, 기체 공급에서 질소 기체에 대한 산소의 비율이 제어된다. 산소 이동 속도를 조절할 수 있는 방법으로는 공기 유속, 산소 농도, 세포 밀도, 온도 및 교반의 변경을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 글루코오스 또는 기타 발효 가능한 당 원료가 조절되어 RQ에 영향을 미친다. 공급에 이용될 수 있는 기타 발효 가능한 당으로는 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 및 말토트리오스를 제한 없이 포함한다. 공급 속도 또는 조성이 조절되어 RQ에 영향을 미칠 수 있다. RQ의 제어는 수동 또는 자동일 수 있다.
단백질 암호화 핵산, 예컨대, 항체를 암호화하는 핵산은 재조합 구성체의 단일 또는 다수의 연속 또는 불연속 세그먼트 상에 있을 수 있다. 항체는 임의의 유형의 단편 또는 구성체 또는 전체 길이일 수 있다. 이들은 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fc 및 ScFv일 수 있다. 일부 구현예에서, 쇄 또는 쇄 단편들은 생체 내에서 적절히 조립될 것이다. 조립이 적절하지 않은 경우, 시험관 내 조립이 필요할 수 있다. 바람직하게 제조될 수 있는 기타 단백질은 이종체형이든 동종체형이든, 하나 이상의 서브유닛을 가지고 있는 것들이다. 통상적으로, 이러한 단백질은 진단 또는 치료 목적에 유용할 것이다. 이러한 단백질은 성장 인자, 사이토카인, 혈액 응고 인자, 치료적 독소, 재구성에 유용한 구조 단백질, 효소 등일 수 있다.
항체와 같은 단백질은 세포가 고갈된 배양 배지로부터 또는 세포로부터 당해 분야에 공지된 임의의 기술에 의해 회수될 수 있다. 통상적으로 결합 단계는 제제의 부피를 감소시키는 데에 이용될 것이다. 결합은 편리한 대로, 필터 또는 컬럼 또는 기타 고체 지지체 상에서 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 A는 항체 포획제로 이용될 수 있다. 단백질 A는 고분자 매트릭스에 결합될 수 있다.
사카로미세스, 한세눌라 및 피치아 종들을 포함하는 임의의 유형의 효모 세포들이 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 예시적이지만 제한적이지 않은 종들은 P. 파스토리스, P. 메타놀리카, P. 앙구스타, P. 서모메타놀리카, 한세눌라 폴리모파 및 S. 세레비시에이다. 효모는 반수체 또는 이배체일 수 있다.
GAP 같은 기타 프로모터들은 유사하게 이용될 수 있다. 이들은 통상적으로, 피치아와 같은 효모 세포에서, 저산소, 글루코오스 제한 성장에서 상향 조절되는 유전자를 위한 프로모터들이다. 이용될 수 있는 이러한 프로모터로는, 제한 없이, 유전자 YHR140W, YNL040W, NTA1, SGTl, URKl, PGI1, YHR112C, CPS1, PET18, TPA1, PFK1, SCS7, YIL166C, PFK2, HSP12, ERO1, ERG11, ENO1, SSP120, BNA1, DUG3, CYS4, YEL047C, CDC19, BNA2, TDH3, ERG28, TSA1, LCB5, PLB3, MUP3, ERV14, PDX3, NCP1, TPO4, CUS1, COX15, YBR096W, DOG1, YDL124W, YMR244W, YNL134C, YEL023C, PIC2, GLK1, ALD5, YPR098C, ERG1, HEM13, YNL200C, DBP3, HAC1, UGA2, PGK1, YBR056W, GEF1, MTD1, PDR16, HXT6, AQR1, YPL225W, CYS3, GPM1, THI11, UBA4, EXG1, DGK1, HEM14, SCO1, MAK3, ZRT1, YPL260W, RSB1, AIM19, YET3, YCR061W, EHT1, BAT1, YLR126C, MAE1, PGC1, YHL008C, NCE103, MIH1, ROD1, FBA1, SSA4, PIL1, PDC1-3, THI3, SAM2, EFT2 및 INOl을 위한 프로모터들을 포함한다.
대규모 발효 공정들은 유용한 생성물을 생산하기 위한 상업적 공정에 통상적으로 이용되는 것들이다. 통상적으로 이들은 부피가 100리터를 초과한다. 유가식 발효는 세포 밀도 및 생성물 누적에 영향을 미치기 위하여 발효 중에 영양분이 첨가되는 공정이다.
이전에 공개된 특허 출원 및 특허 미국 7927863, 미국 8268582, 미국 출원 2012/0277408의 개시 내용은 본 출원에 명백히 포함된다.
본 개시의 많은 부분이 항체의 생산을 기술하고 있지만, 본 출원에 기술된 방법은 단일 서브유닛 및 다중 서브유닛 단백질을 포함하는 기타 원하는 단백질에 용이하게 적응된다. 추가적으로, 본 방법은 다수 단백질 복합체들의 생산에 한정되지 않고, 텔로머라제, hnRNP, 리보솜, snRNP, 신호 인식 입자, 원핵 및 진핵 RNase P 복합체들, 그리고 다수의 별개의 단백질 및/또는 RNA 서브유닛들을 함유하는 임의의 기타 복합체들을 포함하는, 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체와 함께 사용하기 위해 용이하게 적응될 수 있다. 당해 분야에 공지된 방법에 의해 다중 서브유닛 복합체를 발현시키는 숙주 세포가 생성될 수 있다. 예를 들어, 상이한 조합의 유전자 카피 수를 함유하는 이배체 또는 사배체 효모 세포들의 패널은 다양한 카피 수의 개별 서브유닛 유전자들을 함유하는 세포들을 교배시킴으로써 생성될 수 있다(그 카피 수는 바람직하게는 교배 전에 공지된 것이다).
정의
본 발명은 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 그리고 기술된 시약들에 제한되지 않으며, 따라서 이들은 달라질 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 본 출원에서 사용된 용어는 오로지 특정 구현예를 기술하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하고자 한 것이 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것으로 이해된다.
본 출원에 사용된 단수형 "a" "the", "및(and)"은 맥락상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상들을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 세포들을 포함하고, "단백질"에 대한 언급은 하나 이상의 단백질 및 당업자에 공지된 이의 등가물들에 대한 언급을 포함한다. 본 출원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 명백히 달리 표현되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 나타낸다.
볼러스 (bolus) 첨가: 본 개시에서, "볼러스 첨가"는 일반적으로 (예를 들어, 배양 배지 내의) 배양된 세포들과 접촉하는 (에탄올과 같은) 물질의 농도의 신속한 변화를 일반적으로 지칭한다. 예를 들어, 이러한 물질은 단일 첨가, 2회 이상 첨가의 연속으로 배양된 세포에 첨가될 수 있고/있거나, 일정 시간에 걸쳐(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 90 또는 120 분에 걸쳐) 주입될 수 있다. 또한, 이러한 물질은, 예를 들어 이러한 세포들을 농축(원심분리, 여과, 침전, 또는 기타 방법들을 이용)시키고, 배지의 일부 또는 전부를 제거하고, 그리고 이러한 물질을 첨가함으로써, 또는 세포에 이러한 물질을 함유하는 배지를 첨가함으로써, 배양 배지를 부분적으로 또는 완전히 교체함으로써 첨가될 수 있다. 이러한 물질은 담체(예컨대, 배양 배지, 물, 식염수 등)와 혼합될 수 있다. 예를 들어, 에탄올의 볼러스 첨가는 순수 또는 농축된 에탄올(예컨대, 100%, 95%, 70%, 50%, 60%, 40%, 30%, 20% 등)을 원하는 농도가 만들어지도록 충분한 양으로 배양 배지에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 이러한 세포들은, 예컨대, 에탄올을 함유하는 배지에 세포들을 포함하는 접종원을 첨가함으로써, 에탄올을 함유하는 배지에 첨가될 수 있다.
볼러스 농도: 본 개시에서, "볼러스 농도"는 일반적으로 물질(예컨대, 에탄올)의 볼러스 첨가로 생성되는 농도를 지칭한다.
교배 허용(competent) 효모 종: 본 발명에서, 교배 허용 효모 종은 배양물에서 성장될 수 있는 임의의 이배체 또는 사배체 효모를 광범위하게 포괄하고자 한 것이다. 이러한 효모 종은 반수체, 이배체, 또는 기타 다배수체 형태로 존재할 수 있다. 주어진 배수성(ploidy) 세포들은 적절한 조건 하에서 그 형태로 무한대의 세대 동안 증식할 수 있다. 또한, 이배체 세포들은 포자를 형성하여 반수체 세포들을 형성할 수 있다. 이배체 균주들의 추가 교배 또는 융합을 통하여, 순차적 교배는 사배체 균주들을 가져올 수 있다. 본 발명은 반수체 효모뿐만 아니라, 예를 들어, 교배 또는 융합(예컨대, 원형질체 융합)에 의해 생성된 이배체 또는 기타 다배수체 효모 세포들의 용도를 포괄한다.
본 발명의 일 구현예에서, 교배 허용 효모는 아릭시오지마(Arxiozyma); 아스코보트리오지마(Ascobotryozyma); 씨테로미세스(Citeromyces); 데바르요미세스(Debaryomyces); 데케라(Dekkera); 에레모테시움(Eremothecium); 이사트켄키아(Issatchenkia); 카자체스타니아(Kazachstania); 클루에베로미세스(Kluyveromyces); 코다마에아(Kodamaea); 로데로미세스(Lodderomyces); 파치솔렌(Pachysolen); 피치아; 사카로미세스; 사투르니스포라(Saturnispora); 테트라피시스포라(Tetrapisispora); 토루라스포라(Torulaspora); 윌리옵시스(Williopsis); 및 자이고사카로미세스(Zygosaccharomyces) 속을 포함하는 사카로미세타세(Saccharomycetaceae) 과의 구성원이다. 본 발명에 잠재적으로 유용한 기타 유형의 효모는 야로위아(Yarrowia); 로도스포리디움(Rhodosporidium); 칸디다(Candida); 한세눌라; 필로바시움(Filobasium); 스포리디오볼러스(Sporidiobolus); 부레라(Bullera); 류코스포리디움(Leucosporidium) 및 필로바시델라(Filobasidella)를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 교배 허용 효모는 피치아 속의 구성원이거나, 또 다른 메틸 영양체(methylotroph)이다. 본 발명의 추가적인 바람직한 일 구현예에서, 피치아 속의 교배 허용 효모는 다음 종 중 하나이다: 피치아 파스토리스, 피치아 메타놀리카 및 한세눌라 폴리모파(피치아 앙구스타). 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 피치아 속의 교배 허용 효모는 피치아 파스토리스 종이다.
반수체 효모 세포: 정상적인 게놈(염색체) 상보체의 각 유전자의 하나의 카피를 보유하는 세포.
다배수체 효모 세포: 정상적인 게놈(염색체) 상보체의 하나 초과의 카피를 보유하는 세포.
이배체 효모 세포: 2개의 반수체 세포의 융합(교배) 과정에 의해 통상적으로 형성되는, 정상적인 게놈 상보체의 모든 유전자의 2개 카피(대립형질)를 필수적으로 보유하는 세포.
사배체 효모 세포: 2개의 반수체 세포의 융합(교배) 과정에 의해 통상적으로 형성되는, 정상적인 게놈 상보체의 모든 유전자의 4개 카피(대립형질)를 필수적으로 보유하는 세포. 사배체는 2개, 3개, 4개 이상의 상이한 발현 카세트를 운반할 수 있다. 이러한 사배체는 동형접합성 이체성(homozygotic heterothallic) a/a 및 알파/알파 이배체의 선택적 교배에 의해 S. 세레비시에에서 획득될 수 있고, 그리고 영양요구성 이배체를 획득하기 위한 반수체의 연속 교배에 의해 피치아에서 획득될 수 있다. 예를 들어, [met his] 반수체는 [ade his] 반수체와 교배되어 이배체 [his]를 획득할 수 있고; [met arg] 반수체는 [ade arg] 반수체와 교배되어 이배체 [arg]를 획득할 수 있고; 이배체 [his]는 이배체 [arg]와 교배되어 사배체 원영양체(prototroph)를 획득할 수 있다. 이배체 세포들의 장점들 및 용도에 대한 언급은 사배체 세포들에도 적용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
효모 교배: 2개 효모 세포들이 융합되어 단일한 효모 세포를 형성하는 과정. 융합된 세포들은 반수체 세포들 또는 더 높은 배수성의 세포들일 수 있다(예컨대, 사배체 세포를 만들기 위하여 이배체 세포 2개를 교배함).
감수분열: 이배체 효모 세포가 감소성 분할을 하여 4개의 반수체 포자 생성물을 형성하는 과정. 그런 다음, 각 포자는 성장하여 반수체의 무성생식으로 성장하는 세포주를 형성할 수 있다.
선택 가능한 마커: 선택 가능한 마커는 예를 들어, 형질전환 사건을 통하여 유전자를 제공 받은 세포에서 성장 표현형(물리적인 성장 특징)을 부여하는 유전자 또는 유전자 단편이다. 선택 가능한 마커는 그러한 선택 가능한 마커 유전자를 제공 받지 못한 세포들이 성장할 수 없는 조건 하에서 세포들이 선택성 성장 배지에서 생존하고 성장하도록 한다. 선택 가능한 마커 유전자들은 일반적으로 몇 가지 유형에 속하는데, 항생제 또는 기타 약물, 2가지 온도 민감성("ts") 돌연변이체를 교배할 때 또는 하나의 ts 돌연변이체가 형질전환될 때 온도에 대한 세포 저항성을 부여하는 유전자와 같이 양성 선택 가능한 마커 유전자; 생합성 유전자를 보유하지 않는 모든 세포들이 필요로 하는 특정 영양분이 없는 배지에서 성장할 수 있는 능력을 세포에 부여하는 생합성 유전자, 또는 세포에게 야생형 유전자를 보유하지 않는 세포들에 의해 성장하지 못하는 능력을 부여하는 돌연변이된 생합성 유전자 등과 같이 음성 선택 가능한 마커 유전자 등을 포함한다. 적합한 마커들은 ZEO; NEO(G418); LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
통합된(Integrated): 유기체의 염색체에 공유적으로 연결된 유전자 요소 (통상적으로 이종 유전자 요소).
나란히 통합된( tandemly integrated): 염색체에서 인접 위치에 통합된 유전자 요소의 2개 이상의 카피. 2개 이상의 카피는 필수적으로 방향을 가지지는 않는다; 예컨대, 전사된 유전자들의 경우, 일부 카피는 왓슨 가닥으로부터 전사되고, 다른 카피들은 크릭 가닥으로부터 전사될 수 있다.
숙주 세포: 본 개시의 맥락에서, 숙주 세포라는 용어는 이종 유전자를 함유하는 세포(예컨대, 피치아 세포와 같은 진핵세포)를 지칭한다. 예를 들어, 이종 유전자는 원하는 다중 서브유닛 복합체의 서브유닛, 단백질 접힘(예컨대, 샤프론(chaperone))), 발현, 또는 분비에 관련된 유전자, 및/또는 또 다른 원하는 유전자의 발현을 위하여 제공될 수 있다. 이종 유전자는 진핵 세포의 게놈에 통합되거나 또는 플라스미드 또는 인공 염색체와 같은 염색체 외의 요소에 함유될 수 있다.
호흡률(RQ)은 소비된 O2의 몰 수로 나눈 생산된 CO2의 몰 수로서 정의된다. 탄수화물의 완전한 산화의 경우, RQ 값은 1.0이다. 발효는 1을 초과하는 RQ 값으로 표현되며, O2 이용이 없거나 낮을 경우(예컨대, 분자 산소의 부재 하에서의 대사의 경우), RQ는 매우 크거나 이론상으로 무한대의 값에 이를 수 있다.
발현 벡터: 이들 DNA 벡터는 표적 숙주 세포 내에서 외부 단백질을 발현시키기 위한 조작을 용이하게 할 수 있는 요소들을 함유한다. 편리하게는, 형질전환을 위하여 서열의 조작 및 DNA의 생산이 먼저 박테리아 숙주, 예컨대 E. 콜라이(E. coli)에서 실행되며, 일반적으로 벡터들은 박테리아 복제 원점 및 적절한 박테리아 선별 마커를 포함하는, 이러한 조작을 용이하게 하기 위한 서열들을 포함할 것이다. 선별 마커들은 선택적 배양 배지에서 성장된, 형질전환된 숙주 세포들의 생존 또는 성장에 필수적인 단백질들을 암호화한다. 이 선별 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포들은 이 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 통상적인 선별 유전자들은 (a) 항생제 또는 기타 독소에 저항성을 부여하거나 (b) 영양 요구성 결핍을 보완하거나 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양분을 공급하는 단백질을 암호화한다. 예시적인 벡터 및 효모의 형질전환 방법은 예를 들어, Burke, D., Dawson, D., & Stearns, T.의 문헌((2000). Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된다.
본 발명의 방법에 이용하기 위한 발현 벡터들은, 형질전환된 효모 균주들을 식별하기 위한 선택 가능한 영양 요구성 또는 약물 마커를 포함하는, 효모 특이적 서열을 더 포함할 수 있다. 약물 마커는 효모 숙주 세포 내에서 벡터의 카피 수 증폭을 선택하는 데에 더 이용될 수 있다.
관심 서열을 코딩하는 폴리펩티드는 통상적으로, 효모 세포에서 폴리펩티드의 발현을 제공하는, 전사 및 번역 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 이들 벡터 성분은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다: 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열. 폴리펩티드의 분비용 서열, 예컨대 신호 서열 등도 포함될 수 있다. 효모 복제 원점은 발현 벡터가 대개 효모 게놈 내로 통합되기 때문에 선택적이다.
선택적이기는 하지만, 본 발명의 일 구현예에서, 원하는 단백질 또는 원하는 다중 서브유닛 복합체의 서브유닛은, 배양 배지 내로 발현된 폴리펩티드의 분비를 제공하는 분비 서열에 작동 가능하도록 연결되거나 또는 융합되며, 이는 원하는 단백질 또는 복합체의 수확 및 정제를 촉진시킬 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 분비 서열은 예컨대, 코돈 선별을 통하여 바람직한 코돈을 선택하고/하거나 AT 백분율을 변경시킴으로써, 숙주 세포(예컨대, 효모 이배체 세포들)로부터 폴리펩티드의 최적화된 분비를 제공한다. 분비 효율 및/또는 안정성은 분비 서열의 선택에 의해 영향 받을 수 있고, 최적의 분비 서열은 상이한 단백질들간에 다를 수 있다는 점은 당해 분야에 공지되어 있다(예컨대, Koganesawa 등, Protein Eng. 2001 Sep;14(9):705-10 참고, 이는 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된다). 많은 잠재적으로 적합한 분비 신호들이 당해 분야에 공지되어 있으며, 특정 원하는 단백질 또는 복합체의 수율 및/또는 순도에 미치는 이들의 효과에 대해 용이하게 테스트할 수 있다. 효모 및 기타 종의 분비된 단백질에 존재하는 것들뿐만 아니라, 조작된 분비 서열을 포함하는, 임의의 분비 서열이 잠재적으로 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 예시적인 분비 신호 서열은 닭 라이소자임(CLY) 신호 펩티드(MRSLLILVLCFLPLAALG(서열 번호 5)), CLY-L8(MRLLLLLLLLPLAALG(서열 번호 6)), S. 세레비시에 전화효소(SUC2) 신호 펩티드(MLLQAFLFLLAGFAAKISA(서열 번호 7)), MF-알파(프리프로)(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR(서열 번호 8)), MF-알파(프리)-apv(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APV(서열 번호 9)), MF-알파(프리)-apv-SLEKR(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVSLEKR(서열 번호 10)), MF-알파(프리프로)-(EA)3(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR-EAEAEA(서열 번호 11)), αF 신호 펩티드(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-DETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKE-EGVSLEKR(서열 번호 12)), KILM1 신호 펩티드(MTKPTQVLVRSVSILFFITLLHLVVALNDVAGPAETAPVSLLPR(서열 번호 13)), 억제성 산 포스파타제(PHO1) 신호 펩티드(MFSPILSLEIILALATLQSVFA(서열 번호 14)), A.나이져(A. niger) GOX 신호 펩티드(MQTLLVSSLVVSLAAALPHYIR(서열 번호 15)), 쉬반니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 글루코아밀라제 유전자(GAM1) 신호 펩티드(MIFLKLIKSIVIGLGLVSAIQA(서열 번호 16)), 전구-서열이 있는 인간 혈청 알부민(HSA) 신호 펩티드(MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR(서열 번호 17)), 전구-서열이 없는 인간 혈청 알부민(HSA) 신호 펩티드(MKWVTFISLLFLFSSAYS(서열 번호 18)), ISN 신호 펩티드(MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA(서열 번호 19)), IFN 신호 펩티드(MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCDLP(서열 번호 20)), HGH 신호 펩티드 (MAADSQTPWLLTFSLLCLLWPQEPGA(서열 번호 21)), 피토헤마글루티닌(PHA)(MKKNRMMMMIWSVGVVWMLLLVGGSYG(서열 번호 22)), 누에 라이소자임 (MQKLIIFALVVLCVGSEA(서열 번호 23)), 인간 라이소자임(LYZ1) (MKALIVLGLVLLSVTVQG(서열 번호 24)), 액티빈 수용체 1형(MVDGVMILPVLIMIALPSPS(서열 번호 25)), 액티빈 II형 수용체(MGAAAKLAFAVFLISCSSG(서열 번호 26)), P. 파스토리스 면역글로불린 결합 단백질(PpBiP)(MLSLKPSWLTLAALMYAMLLVVVPFAKPVRA(서열 번호 27)) 및 인간 항체 3D6 경쇄 리더(MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC(서열 번호 28))를 포함한다(Hashimoto 등, Protein Engineering vol. 11 no. 2 pp.75-77, 1998; Oka 등, Biosci Biotechnol Biochem. 1999 Nov; 63(11):1977-83; Gellissen 등, FEMS Yeast Research 5 (2005) 1079-1096; Ma 등, Hepatology. 2005 Dec;42(6):1355-63; Raemaekers 등, Eur J Biochem. 1999 Oct 1;265(1):394-403; Koganesawa 등, Protein Eng. (2001) 14 (9): 705-710; Daly 등, Protein Expr Purif. 2006 Apr;46(2):456-67; Damasceno 등, Appl Microbiol Biotechnol (2007) 74:381-389; 및 Felgenhauer 등, Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25;18(16):4927 참조, 이들 각각은 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된다).
또한, 원하는 단백질 또는 복합체는 분비 신호에 작동 가능하도록 연결되거나 융합되지 않고 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 예를 들어, 일부 이종 폴리펩티드는 P. 파스토리스에서 발현될 때 분비 신호에 연결되거나 융합되지 않고도 배양 배지로 분비된다는 점이 증명된 바 있다. 추가적으로, 당해 분야에 공지된 방법들을 이용하여, 원하는 단백질 또는 다중 서브유닛 복합체가 숙주 세포들로부터 정제될 수 있다(이는 예를 들어, 복합체가 잘 분비되지 않는 경우에 바람직할 수 있다).
원하는 단백질 또는 다중 서브유닛 복합체를 포함하는 배지 또는 세포들은 배양물로부터 회수될 수 있다. 선택적으로, 분비된 단백질이 정제될 수 있다. 예를 들어, 원하는 단백질 또는 다중 서브유닛 복합체를 포함하는 세포들은 기계적, 화학적, 효소적 및/또는 삼투적 방법들을 이용(예컨대, 액화 질소로 동결, 균질화기 이용, 스페로플라스팅, 초음파분쇄, 유리 비드 존재 하에서 교반, 세제의 이용 등)하여 용해될 수 있다. 원하는 단백질 또는 다중 서브유닛 복합체는 당해 분야에 공지된 방법들을 이용하여 농축, 여과, 투석 등이 될 수 있다. 원하는 단백질 또는 다중 서브유닛 복합체는 예를 들어, 이의 분자량(예컨대, 크기 배제 크로마토그래피), 등전점(예컨대, 등전점 전기영동), 전기영동 이동성(예컨대, 겔 전기영동), 소수성 상호작용 크로마토그래피(예컨대, HPLC), 전하(예컨대, 이온 교환 크로마토그래피), 친화도(예컨대, 항체의 경우, 단백질 A, 단백질 G에 결합 및/또는 원하는 항체가 결합하는 에피토프에 결합) 및/또는 당화 상태(예컨대, 렉틴 결합 친화도에 의해 검출됨)에 기반하여 정제될 수 있다. 원하는 수준의 순도를 획득하기 위하여 다수의 정제 단계들이 수행될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 원하는 단백질 또는 다중 서브유닛 복합체는 면역글로불린 불변 도메인을 포함할 수 있고, 단백질 A 또는 단백질 G 친화도, 크기 배제 크로마토그래피, 그리고 (당화된 형태를 제거하기 위하여) 렉틴에 대한 결합 부족을 이용하여 정제될 수 있다. 선택적으로 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드(PMSF)와 같은 A 프로테아제 억제제가 정제 중에 단백질 가수분해성 분해를 억제하기 위하여 첨가될 수 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적인 상관 관계에 놓여질 때 "작동 가능하게 연결"된다. 예를 들어, 신호 서열용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로 발현되는 경우, 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동 가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열들이 연속적이고, 분비 리더의 경우, 연속적이면서 리딩 프레임 안에 있음을 의미한다. 그러나 인핸서들은 연속적일 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 또는 대안적으로 당업자에게 익숙한 PCR/재조합 방법(게이트웨이(Gateway®) 테크놀로지; 인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아 주 칼즈배드)을 통하여 이루어질 수 있다. 이러한 부위들이 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커들이 통상적인 실시에 따라 이용될 수 있다. 또한, 원하는 핵산(작동 가능하게 연결된 서열을 포함하는 핵산 포함)은 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다.
프로모터는, 프로모터가 작동 가능하게 연결된, 특정 핵산 서열의 전사 및 번역을 제어하는 구조적 유전자의 시작 코돈의 상류(5')(일반적으로 약 100 내지 1000bp 이내)에 위치된 미번역 서열이다. 이러한 프로모터는 몇 가지 부류에 속한다: 유도성, 항시성 및 억제성 프로모터(억제제의 부재에 반응하여 전사 수준을 증가시킴). 유도성 프로모터는 배양 조건들에서의 일부 변화, 예컨대, 영양분의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화와 같은 일부 변화에 반응하여 이들의 제어 하에 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시할 수 있다.
또한, 효모 프로모터 단편은 상동성 재조합 및 효모 게놈의 동일한 부위로 발현 벡터 통합을 위한 부위로 기능할 수 있다. 대안적으로, 선택 가능한 마커는 상동성 재조합을 위한 부위로 이용된다. 피치아 형질전환은 Cregg 등의 문헌((1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385)에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된다.
피치아로부터의 적절한 프로모터의 예는 CUP1(배지 내의 구리 수준에 의해 유도됨), 테트라사이클린 유도성 프로모터, 티아민 유도성 프로모터, AOX1 프로모터(Cregg 등 (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); ICL1 프로모터 (Menendez 등 (2003) Yeast 20(13):1097-108); 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 프로모터(GAP)(Waterham 등 (1997) Gene 186(1):37-44); 및 FLD1 프로모터(Shen 등 (1998) Gene 216(1):93-102)를 포함한다. GAP 프로모터는 강력한 항시성 프로모터이며, CUP1, AOX 및 FLD1 프로모터는 유도성이다. 각각의 전술한 참고 문헌은 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된다.
기타 효모 프로모터는 ADH1, 알코올 탈수소효소 II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk 및 이로부터 유래된 키메라 프로모터를 포함한다. 추가적으로, 포유류, 곤충, 식물, 파충류, 양서류, 바이러스 및 조류 프로모터와 같은 비-효모 프로모터가 본 발명에 이용될 수 있다. 가장 통상적으로 프로모터는 포유류 프로모터(발현된 유전자에 잠재적으로 내인성임)를 포함하거나 또는 효모 시스템에서 효율적인 전사를 제공하는 효모 또는 바이러스 프로모터를 포함할 것이다.
관심 폴리펩티드는 재조합에 의해 직접적으로 생성될 수 있을 뿐만 아니라, 이종 폴리펩티드, 예컨대 신호 서열 또는, 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N 말단에 특이적 절단 부위를 보유하는 기타 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생성될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 벡터 내로 삽입되는 폴리펩티드 코딩 서열의 일부분일 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 이러한 숙주 세포 내에서 이용 가능한 표준 경로 중 하나를 통해 인지되고 처리되는 것이다. S. 세레비시에 알파 인자 예비-전구 신호가 P. 파스토리스로부터의 다양한 재조합 단백질들의 분비에 효과적인 것으로 증명되었다. 기타 효모 신호 서열은 알파 교배 인자 신호 서열, 전화효소 신호 서열, 그리고 기타 분비된 효모 폴리펩티드로부터 유래된 신호 서열을 포함한다. 추가적으로, 이들 신호 펩티드 서열은 이배체 효모 발현 시스템 안에서 강화된 분비를 제공하도록 조작될 수 있다. 기타 관심 있는 분비 신호들은 또한 포유류 신호 서열도 포함하는데, 이는 분비되는 단백질에 대해 이종 기원일 수 있거나, 분비되는 단백질에 대한 고유(native) 서열일 수 있다. 신호 서열은 예비-펩티드 서열을 포함하며, 일부 경우에서 전구펩티드 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 쇄에서 발견되는 신호 서열, 예컨대, K28 예비전구독소 서열, PHA-E, FACE, 인간 MCP-1, 인간 혈청 알부민 신호 서열, 인간 Ig 중쇄, 인간 Ig 경쇄 등을 포함하는 이러한 많은 신호 서열이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Hashimoto 등의 문헌(Protein Eng 11(2) 75(1998)); 및 Kobayashi 등의 문헌(Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998)) 참조. 이들 각각은 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된다.
전사는 전사 활성화인자 서열을 벡터 내에 삽입하여 증가시킬 수 있다. 이들 활성화인자는 DNA의 시스(cis)-작용 요소들로서, 보통 약 10 내지 300 bp이며, 프로모터 상에 작용하여 이의 전사를 증가시킨다. 전사 인핸서들은 상대적으로 방향성 및 위치 독립적이며, 인트론 내에서, 전사 단위에 대해 5' 및 3'에서 발견되며, 뿐만 아니라 코딩 서열 자체에서도 발견되었다. 인핸서는 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에서 발현 벡터 내로 스플라이스될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5'부위에 위치된다.
또한, 진핵 숙주 세포에서 이용되는 발현 벡터들은 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 이러한 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA들 또는 cDNA들의 미번역된 영역에서 번역 종결 코돈에 대해 3'으로부터 통상적으로 입수 가능하다. 이들 영역들은 mRNA의 미번역된 영역에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트들을 함유한다.
하나 이상의 위에 열거된 성분들을 함유하는 적절한 벡터의 구축은 표준 라이게이션 기술 또는 PCR/재조합 방법들을 이용한다. 분리된 플라스미드 또는 DNA 단편들이 절단되고, 재단되고, 요구되는 플라스미드를 생성하기에 바람직한 형태로 또는 재조합 방법들을 통해 다시 라이게이션된다. 구축된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하기 위한 분석을 위하여, 라이게이션 혼합물들을 이용하여 숙주 세포들을 형질전환시키고, 적절한 경우, 항생제 저항성(예컨대, 암피실린 또는 제오신)에 의해 성공적인 형질전환체가 선택된다. 형질전환체로부터 플라스미드를 준비하고, 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 분석하고/분석하거나 시퀀싱한다.
단편들의 제한 및 라이게이션에 대한 대안으로, att 부위들과 재조합 효소들에 기반한 재조합 방법들을 이용하여 벡터 내로 DNA 서열들을 삽입할 수 있다. 이들 방법들은 예를 들어, 문헌(Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949)에 기술되어 있으며, 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법들은 람다 및 대장균 암호화된 재조합 단백질의 혼합물에 의해 매개되는 분자간 DNA 재조합을 이용한다. 재조합은 상호 작용하는 DNA 분자들 상의 특이적 부착(att) 부위 사이에서 일어난다. att 부위에 대한 설명은 Weisberg 및 Landy의 문헌((1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Press), pp. 211-250)을 참조한다. 재조합 부위의 측면 DNA 세그먼트들이 스위치되어서, 재조합 후, att 부위들은 각각의 모 벡터가 제공한 서열로 이루어진 하이브리드 서열이다. 재조합은 임의의 위상의 DNA 간에 발생할 수 있다. 전술한 각 참고문헌은 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된다.
Att 부위들은, 적절한 벡터 내로 관심 서열을 라이게이션시킴으로써, 특정 프라이머를 이용함으로써 att B 부위들을 함유하는 PCR 산물들을 생성함으로써, att 부위들을 함유하는 적절한 벡터 내로 클로닝된 cDNA 라이브러리를 생성함으로써 등에 의해, 관심 서열 내로 도입될 수 있다.
단일 시스트론성 및 다시스트론성 유전자. 단일 시스트론성 유전자는 단일 단백질만을 번역하기 위하여 유전적 정보를 함유하는 RNA를 암호화한다. 다시스트론성 유전자는 하나를 초과하는 단백질을 번역하기 위하여 유전적 정보를 함유하는 mRNA를 암호화한다. 다시스트론성 유전자에 암호화된 단백질은 동일한 또는 상이한 서열들 또는 이의 조합을 보유할 수 있다. 이중 시스트론성(dicistronic 또는 bicistronic)은 2개 단백질을 암호화하는 다시스트론성 유전자를 지칭한다. 다시스트론성 유전자들은 선택적으로 캡(cap)-비의존적 번역 개시를 촉진하기 위하여 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소들을 포함하고, 이는 mRNA 분자의 5' 말단에 결합된 5'-캡 구조에 비의존적인 하류 단백질 코딩 영역의 번역을 구동시킬 수 있는 위치에 있을 수 있다. (예컨대, 바이러스, 진핵, 또는 인공 기원의) 임의의 공지된 IRES 서열이 이용될 수 있다. 예를 들어, Thompson 등의 문헌((2001) PNAS 98:12972-12977)에서 기술된 바와 같이 유전자간 영역(IGR)의 크리켓 마비 바이러스 IRES 서열이 이용될 수 있다. 선택적으로, IRES 기능은 유전적 변경에 의해, 예컨대, eIF2 키나아제 GCN2의 항시적 발현을 초래하여 또는 붕괴된 2개의 개시제 tRNA(met) 유전자를 파괴하여, 강화될 수 있다(동일 문헌).
본 출원에서 사용된 접힘은 폴리펩티드 및 단백질들의 3차원 구조를 지칭하는데, 여기서 아미노산 잔기들 사이의 상호 작용은 이 구조를 안정화시키도록 작용한다. 비공유적 상호 작용이 구조를 결정함에 있어서 중요하지만, 보통 관심 단백질은 2개 시스테인 잔기에 의해 형성된 분자간 및/또는 분자 내 공유적 이황화 결합을 보유할 것이다. 자연적으로 발생하는 단백질 및 폴리펩티드 또는 이의 유도체 및 변이체의 경우, 적합한 접힘은 통상적으로 최적의 생물학적 활성을 가져오는 배열이며, 활성, 예컨대 리간드 결합, 효소 활성 등의 분석으로 편리하게 모니터링될 수 있다.
일부 경우에서, 예를 들어 원하는 생성물이 합성 기원인 경우, 생물학적 활성에 기반한 분석은 덜 의미있을 것이다. 이러한 분자들의 적합한 접힘은 물리적 성질, 에너지적인 고려, 모델링 연구 등을 기반으로 하여 결정될 수 있다.
발현 숙주는 접힘 및 이황화 결합 형성을 증진시키는 하나 이상의 효소, 즉, 폴다아제, 샤페로닌, PDI, BIP, 시클로필린 등을 암호화하는 서열을 도입시킴으로써 더 변형될 수 있다. 이러한 서열은 당해 분야에 공지된, 벡터, 마커 등을 이용하여, 효모 숙주 세포에서 항시적으로 또는 유도적으로 발현될 수 있다. 바람직하게는, 원하는 발현 패턴에 충분한 전사 조절 요소들을 포함하는 서열들이 표적화된 방법을 통하여 효모 게놈에 안정적으로 통합된다.
예를 들어, 진핵 PDI는 단백질 시스테인 산화 및 이황화 결합 이성질화의 효율적인 촉매일 뿐만 아니라, 샤프론 활성도 나타낸다. PDI의 공동 발현은 다수의 이황화 결합을 보유하는 활성 단백질들의 생산을 촉진할 수 있다. BIP(면역글로불린 중쇄 결합 단백질), 시클로필린 등의 발현도 관심 대상이다. 본 발명의 일 구현예에서, 다중 서브유닛 복합체는 교배에 의해 생성된 효모 균주로부터 발현될 수 있는데, 이때 각 반수체 부모 균주들은 별개의 접힘 효소를 발현시키는데, 예컨대 한 균주는 BIP를 발현시킬 수 있고, 나머지 균주는 PDI 또는 이의 조합을 발현시킬 수 있다.
용어 "원하는 단백질" 또는 "표적 단백질"은 상호 교환적으로 이용되며, 일반적으로 본 출원에 기술된 항체(예컨대, 인간화 항체) 또는 이의 결합 부분과 같은, 이종 다중 서브유닛 단백질을 지칭한다.
용어 "항체"는 에피토프에 꼭 맞고 이를 인지하는 특이적 형상의, 임의의 폴리펩티드 쇄를 함유하는 분자 구조를 포함하며, 이때 하나 이상의 비공유적 결합 상호 작용은 분자 구조와 에피토프 사이에서 복합체를 안정화시킨다. 전형적인 항체 분자는 면역글로불린이며, 모든 원천, 예컨대 인간, 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 기타 포유류, 닭, 기타 조류 등으로부터의, 모든 유형의 면역글로불린, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 등이 "항체"로 간주된다. 본 발명에 따라 출발 물질로서 유용한 항체를 생산하는 바람직한 원천은 토끼다. 다수의 항체 코딩 서열이 기술된 바 있고, 당해 분야에 잘 알려진 방법들에 의해 다른 것들이 만들어질 수 있다. 이의 예로는 키메라 항체, 인간 항체 및 기타 비인간 포유류 항체, 인간화된 항체, scFv와 같은 단일 쇄 항체, 카멜바디(camelbodies), 나노바디(nanobodies), IgNAR(상어로부터 유래된 단일 쇄 항체), 작은 모듈의 면역약제(SMIP), 그리고 Fab, Fab', F(ab')2 등과 같은 항체 단편을 포함한다. Streltsov V A 등의 문헌(Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an earlydevelopmental isotype, Protein Sci. 2005 November; 14(11):2901-9. Epub 2005 Sep. 30); Greenberg A S 등의 문헌(A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature. 1995 Mar. 9; 374(6518):168-73); Nuttall S D 등의 문헌(Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol Immunol. 2001 August; 38(4):313-26; Hamers-Casterman C 등의 문헌(Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. 1993 Jun. 3; 363(6428):446-8); Gill D S 등의 문헌(Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. 2006 December; 17(6):653-8. Epub 2006 Oct. 19)을 참조한다. 전술한 각각의 참고문헌은 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된다.
예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편들은 유전자 조작에 의해 생성될 수 있다. 이 기술에서, 다른 방법들과 함께, 항체 생성 세포들은 원하는 항원 또는 면역원에 감작된다. 항체 생성 세포들로부터 분리된 메신저 RNA는 PCR 증폭을 이용하여 cDNA를 만드는 데에 주형으로 이용된다. 각 벡터가 초기 항원 특이성을 유지하는 하나의 중쇄 유전자와 하나의 경쇄 유전자를 함유하는 벡터들의 라이브러리는 증폭된 면역글로불린 cDNA의 적절한 절편들을 발현 벡터 내로 삽입시킴으로써 생성된다. 조합 라이브러리는 중쇄 유전자 라이브러리와 경쇄 유전자 라이브러리를 조합함으로써 구축된다. 이로써 (항체 분자의 Fab 단편 또는 항원 결합 단편을 닮은) 중쇄 및 경쇄를 공동 발현시키는 클론의 라이브러리가 얻어진다. 이들 유전자를 운반하는 벡터는 숙주 세포 내로 공동 형질감염된다. 항체 유전자 합성이 형질감염된 숙주에서 유도될 때, 중쇄 및 경쇄 단백질들은 자가 조립하여, 항원 또는 면역원으로 스크리닝함으로써 검출될 수 있는 활성 항체를 만든다.
관심 서열을 코딩하는 항체는 고유 서열뿐만 아니라 유전자 코드의 축퇴에 의해 개시된 핵산의 서열과는 동일하지 않는 핵산 및 이의 변이형들에 의해 암호화된 것들을 포함한다. 변이성 폴리펩티드는 아미노산(aa) 치환, 첨가 또는 결실을 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 보존성 아미노산 치환 또는 비필수 아미노산들을 제거하는 치환, 이를 테면 당화 부위를 변경시키거나, 또는 기능에 필수적이지 않은 하나 이상의 시스테인 잔기의 치환 또는 결실에 의해 잘못된 접힘을 최소화하기 위한 것일 수 있다. 단백질의 특정 영역(예컨대, 기능적 도메인, 촉매성 아미노산 잔기 등)의 생물학적 활성을 유지 또는 강화되도록 변이형이 설계될 수 있다. 또한, 변이형은 본 출원에 개시된 폴리펩티드의 단편들, 특히 생물학적으로 활성이 있는 단편들 및/또는 기능적 도메인에 상응하는 단편들을 포함한다. 클로닝된 유전자들의 시험관 내 돌연변이 생성을 위한 기술이 공지되어 있다. 단백질 가수 분해에 대한 저항성을 개선시키거나 또는 용해도 성질을 최적화시키거나 이들에게 치료제로서 더 적합하게 만들기 위하여, 통상적인 분자 생물학적 기술을 이용하여 변형된 폴리펩티드도 본 대상 발명에 포함된다.
키메라 항체는 재조합 수단에 의해 한 종의 항체 생성 세포들로부터 획득된 가변 경쇄 및 중쇄 부위(VL 및 VH)를 또 다른 종으로부터의 불변 경쇄 및 중쇄 부위와 조합하여 제조될 수 있다. 주로 인간 도메인이 있는 항체를 생산하기 위하여 통상적으로 키메라 항체는 설치류 또는 토끼 가변 부위와 인간 불변 부위를 이용한다. 이러한 키메라 항체의 생산은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 표준 수단(예컨대, 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된, 미국 특허 제5,624,659호에 기술된 바와 같음)에 의해 획득될 수 있다. 본 발명의 키메라 항체의 인간 불변 부위들은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 부위로부터 선택될 수 있음이 더 고려된다.
인간화된 항체는 훨씬 더 인간 유사의 면역글로불린 도메인을 함유하도록 조작되며, 동물로부터 유래된 항체의 상보성 결정 부위만을 통합한다. 단일 클론성 항체의 가변 부위의 과가변 루프의 서열을 신중하게 조사하고, 인간 항체 쇄의 구조에 이들을 맞춤으로써 이는 달성된다. 표면상으로는 복잡하지만, 이 공정은 실제로는 간단히 실행된다. 예컨대, 전체가 본 출원에 참조로서 포함된, 미국 특허 제6,187,287호를 참조한다. 항체를 인간화시키는 방법은 등록된 미국 특허 제7935340호에서 이미 기술된 바 있으며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된다. 일부 경우에서, 추가적인 토끼 프레임워크 잔기가 활성을 유지하는데 필요한지를 결정하는 것은 필수적이다. 일부 경우에서, 인간화된 항체는 친화도 또는 활성의 상실을 최소화하기 위하여 보유되는 일부 중요한 토끼 프레임워크 잔기들을 여전히 필요로 한다. 이들 경우에서, 원하는 활성을 보유하기 위하여 인간 생식계열 서열로부터 다시 본래의 토끼 아미노산으로의 단일 또는 복수의 프레임워크 아미노산들을 변화시킬 필요가 있다. 이러한 변화는 어떤 토끼 잔기들이 친화도 및 활성을 보존하는데 필수적인지를 확인하기 위하여 실험적으로 결정된다.
전체 면역글로불린(또는 이의 재조합 대응물) 외에도, 에피토프 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 단편들(예컨대, Fab', F(ab')2, 또는 기타 단편들)이 합성될 수 있다. "단편" 또는 최소 면역글로불린은 재조합 면역글로불린 기술을 이용하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 이용하기 위한 "Fv" 면역글로불린은 융합된 가변 경쇄 부위 및 가변 중쇄 부위를 합성함으로써 생산될 수 있다. 항체의 조합 또한 관심 대상인데, 예컨대 2가지 구분되는 Fv 특이성을 포함하는 디아바디가 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, SMIP(소분자 면역약제), 카멜바디, 나노바디 및 IgNAR이 면역글로불린 단편에 포괄된다.
면역글로불린 및 이의 단편들은 예컨대, 본 발명의 방법 및 조성물에 이용될 수 있는, 화학적 링커; 형광 염료, 효소, 독소, 기질, 생물발광 물질, 방사능활성 물질, 화학발광 모이어티 등과 같은 검출 가능한 모이어티; 또는 스트렙트아비딘, 아비딘, 또는 비오틴 등과 같은 특이적인 결합 모이어티 등과 같은 효과기(effector) 모이어티를 부가하기 위하여, 번역 후 변형될 수 있다. 추가적인 효과기 분자들의 예는 아래에 제공된다.
생성물 관련 변이형: 원하는 생성물(예컨대, 원하는 다중 서브유닛 복합체)의 제제 내에 존재하고, 원하는 생성물과 관련된, 원하는 생성물 이외의 생성물. 예시적인 생성물 관련 변이형은 절단된 또는 연장된 펩티드, 원하는 당화와 상이한 당화를 보유하는 생성물(예컨대, 비당화 생성물을 원하는 경우, 임의의 당화 생성물은 생성물 관련 변이형으로 간주될 것임), 비정상적인 화학량론, 부적절한 조립, 비정상적인 이황화물 연결, 비정상적인 또는 불완전한 접힘, 응집, 프로테아제 절단, 또는 기타 비정상을 나타내는 복합체를 포함한다. 예시적인 생성물 관련 변이형은 (예컨대, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 검출된) 분자 질량, (예컨대, 등전점 전기영동에 의해 검출된) 등전점, (예컨대, 겔 전기영동에 의해 검출된) 전기영동 이동성, (예컨대, 질량 분광분석법에 의해 검출된) 인산화 상태, (예컨대, 질량 분광분석법에 의해 검출된) 질량 대 전하비, (예컨대, 질량 분광분석법 또는 겔 전기영동에 의해 검출된) 단백질 분해 단편들의 질량 또는 정체, (예컨대, HPLC에 의해 검출된) 소수성, (예컨대, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 검출된) 전하, (예컨대, 항체의 경우, 단백질 A, 단백질 G 및/또는 원하는 항체가 결합하는 에피토프에 대한 결합으로 검출된) 친화도 및 (예컨대, 렉틴 결합 친화도에 의해 검출된) 당화 상태 중 하나 이상에서 변화를 나타낼 수 있다. 원하는 단백질이 항체인 경우, 생성물 관련 변이형이라는 용어는 당-무거운 변이형 및/또는 절반 항체 종들(아래에 기술됨)을 포함할 수 있다.
예시적인 생성물 관련 변이형은 특이한 이황화 결합을 함유하는 변이형 형태를 포함한다. 예를 들어, 대부분 IgG1 항체 분자들은 중쇄 및 경쇄 모두에서 IgG 도메인의 접힘을 안정화시키는, 총 16개의 쇄내 및 쇄간 이황화 다리에 의해 안정화되는 반면, 쇄간 이황화 다리는 중쇄와 경쇄의 결합을 안정화시킨다. 마찬가지로 기타 항체 유형들은 특징적인 안정화 쇄내 및 쇄간 이황화 결합을 함유한다. 나아가, (본 출원에 개시된 Ab-A 및 Ab-B를 포함하는) 일부 항체는 비정준(non-canonical) 이황화 결합으로 지칭되는 추가적인 이황화 결합을 함유한다. 따라서, 특이한 쇄간 이황화 결합은 안정화된 공유 연결 및/또는 추가 서브유닛에 대한 이황화물 연결이 없기 때문에, 비정상적인 복합체 화학량론을 초래할 수 있다. 추가적으로, (쇄간이든 쇄내든) 특이한 이황화 결합은 항체의 구조적 안정성을 감소시킬 수 있고, 이것은 감소된 활성, 감소된 안정성, 응집물을 형성하는 경향의 증가 및/또는 증가된 면역원성을 초래할 수 있다. 특이한 이황화 결합을 함유하는 생성물 관련 변이형은 비환원 변성 SDS-PAGE, 모세관 전기영동, cIEX, 질량 분광분석법(선택적으로 유리 시스테인에서 질량 전환을 생성하기 위한 화학적 변형과 함께), 크기 배제 크로마토그래피, HPLC, 광 산란에서의 변화 및 당해 분야에 공지된 임의의 기타 적절한 방법들을 포함하는 다양한 방식으로 검출될 수 있다. 예컨대, 문헌(The Protein Protocols Handbook 2002, Part V, 581-583, DOI: 10.1385/1-59259-169-8:581)을 참조한다.
절반 항체, 절반 항체 종, 또는 H1L1은 단일 중쇄 및 단일 경쇄 항체 사슬을 포함하지만, 제2의 중쇄 및 경쇄 항체 사슬에 대한 공유 결합이 없는 단백질 복합체를 지칭한다. 2개의 절반 항체는 일부 조건 하에서 비공유적 결합을 유지할 수 있지만, 완전한 H2L2 항체들과 구분되는 절반 항체들의 검출을 촉진하기 위하여, 적절한 조건(예컨대, 세제, 염, 또는 온도) 하에서 분리될 수 있다. 유사하게, H2L1은 2개의 중쇄 항체 사슬과 단일 경쇄 항체 사슬을 포함하지만, 제2의 경쇄 항체 사슬에 대한 공유 결합이 없는 단백질 복합체를 지칭한다. 이들 복합체는 또한 또 다른 경쇄 항체 사슬과 비-공유적으로 결합될 수 있다(그리고 마찬가지로, 완전한 항체와 비슷한 거동을 제공한다). 완전한 항체와 같이, 절반 항체 종 및 H2L1 종들은 환원 조건 하에서 개별적인 중쇄 및 경쇄로 해리될 수 있다. 절반 항체 종 및 H2L1 종들은 비환원 SDS-PAGE 겔 상에서 완전한 항체보다 더 낮은 겉보기 분자량에서 이동하는 종으로 검출될 수 있다. 예컨대, H1L1은 완전한 항체의 겉보기 분자량의 대략 절반(예컨대, 약 75 kDa)으로 이동한다.
당-무거운 변이형( Glyco -heavy variant)은 항체 제제에 간혹 존재하고, 적어도 부분적인 Fc 서열을 함유하는 당화된 생성물 관련 변이형을 지칭한다. 당-무거운 변이형은, SDS-PAGE에서 관찰 가능한 (정상적인 중쇄와 비교하여) 감소된 전기영동 이동성, 렉틴 결합 친화도, 항-Fc 항체에 대한 결합 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된, 당-무거운 변이형을 함유하는 항체 복합체의 더 큰 겉보기 분자량을 특징으로 한다. 2011년 8월 31일에 출원된 미국 가출원 일련번호 61/525,307(대리인 서류 번호 67858.730200)을 참조하며, 이는 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된다.
"원하는 분비된 이종 폴리펩티드를 안정적으로 발현시키거나 오랜 시간 동안 발현시키는 다배수체 효모"라는 용어는 적어도 수일 내지 1주일, 더욱 바람직하게는 적어도 한 달, 더욱 더 바람직하게는 적어도 1~6개월, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 1년 이상 동안 임계치 발현 수준, 통상적으로 (약 90시간 배양 후) 적어도 50~500 mg/리터, (그리고 바람직하게는 실질적으로 그 보다 더 많이 상기 폴리펩티드를 분비하는 효모 배양물을 지칭한다.
"원하는 양의 재조합 폴리펩티드를 분비하는 다배수체 효모 배양물"이라는 용어는 안정적으로 또는 오랜 기간 동안 적어도 적어도 50~500 mg/리터, 그리고 가장 바람직하게는 500~1000 mg/리터 이상을 분비하는 배양물을 지칭한다.
폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 코드에 따른 폴리뉴클레오티드 서열의 번역이 폴리펩티드 서열을 산출(즉, 폴리뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드 서열을 "암호화")하는 경우, 폴리펩티드 서열에 "상응하며", 두 개의 서열이 동일한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 경우, 하나의 폴리뉴클레오티드 서열은 다른 폴리뉴클레오티드 서열에 "상응한다".
DNA 구성체의 "이종" 부위 또는 도메인은 자연적으로 더 큰 분자와 관련하여 발견되지 않는 더 큰 DNA 분자 내의, 식별 가능한 DNA의 세그먼트이다. 따라서 이종 부위가 포유류 유전자를 암호화할 때, 원천 유기체의 게놈에서 포유류 게놈 DNA의 측면에 있지 않는 DNA가 이러한 우전자의 측면에 위치하게 될 것이다. 이종 부위의 또 다른 예는 코딩 서열 그 자체가 자연적으로 발견되지 않는 구성체이다(예컨대, 게놈 코딩 서열이 고유한 유전자와 상이한 코돈을 가지고 있는 합성 서열 또는 인트론을 함유하는 cDNA). 대립형질 변이형 또는 자연적으로 발생되는 돌연변이 사건들은 본 출원에 정의된 DNA의 이종 부위를 발생시키지 않는다.
"코딩 서열"은 (유전적 코드 관점에서) 단백질 또는 펩티드 서열에 상응하거나 이를 암호화하는, 코돈의 인프레임 서열이다. 서열 또는 이들의 상보성 서열이 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 경우, 2개의 코딩 서열은 서로 상응한다. 적절한 조절 서열과 연관된 코딩 서열은 전사되어 폴리펩티드로 번역될 수 있다. 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 일반적으로 코딩 서열의 3'에 위치될 것이다. "프로모터 서열"은 세포 내에서 RNA 중합효소와 결합할 수 있고, 하류(3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 부위이다. 프로모터 서열은 통상적으로, 코딩 서열의 전사에 영향을 주는 조절 분자(예컨대, 전사 인자들)의 결합을 위한 추가적인 자리를 함유한다. RNA 중합효소가 세포 내에서 프로모터 서열에 결합하고, 이 코딩 서열을 mRNA로 전사시킨 다음, mRNA가 다시 이 코딩 서열에 의해 암호화된 단백질로 번역될 때, 코딩 서열은 프로모터 서열의 "제어 하에" 있거나 또는 프로모터에 "작동 가능하게 연결된다".
벡터들은 DNA, RNA 또는 단백질과 같은 외래 물질을 유기체 또는 숙주 세포 내로 도입하기 위하여 이용된다. 통상적인 벡터들은 재조합 바이러스(폴리뉴클레오티드의 경우)와 리포좀(폴리펩티드의 경우)을 포함한다. "DNA 벡터"는 또 다른 폴리뉴클레오티드 세그먼트가 부착될 수 있어, 부착된 세그먼트의 복제를 야기하는, 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다. "발현 벡터"는 적합한 숙주 세포에 의한 폴리펩티드 합성을 지시할 조절 서열을 함유하는 DNA 벡터이다. 이것은 일반적으로 RNA 중합효소에 결합하고, mRNA의 전사를 개시하는 프로모터뿐만 아니라, mRNA의 폴리펩티드(들)로의 번역을 지시하는 리보솜 결합 부위 및 개시 신호를 의미한다. 적절한 부위 및 정확한 해독 틀에서 폴리뉴클레오티드 서열의 발현 벡터로의 삽입 및 이에 이어지는 벡터에 의한 적합한 숙주 세포의 형질전환은 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생산을 가능하게 한다.
폴리뉴클레오티드 서열의 "증폭(amplification)"은 특정 핵산 서열의 다수 카피들의 시험관 내 생산이다. 증폭된 서열은 일반적으로 DNA의 형태이다. 이러한 증폭을 실행하는 다양한 기술들이 다음 검토 논문에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된다: Van Brunt 1990, Bio/Technol., 8(4):291-294; 및 Gill 및 Ghaemi, Nuelcosides Nucleotides Nucleic Acids. 2008 Mar;27(3):224-43. 중합효소 연쇄 반응 또는 PCR은 핵산 증폭의 원형이며, 본 출원에서 PCR의 이용은 기타 적합한 증폭 기술의 예시로 간주되어야 한다.
대부분 척추동물(포유류 포함)에서 항체의 일반적인 구조는 현재 잘 이해되어 있다(Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). 통상적인 항체는 대략적으로 23,000 달톤 분자량의 2개의 동일한 가벼운 폴리펩티드 사슬("경쇄")과 분자량 53,000~70,000인 2개의 동일한 중쇄("중쇄")로 이루어진다. 이 4개의 쇄는 "Y"자 형태로 이황화 결합에 의해 연결되며, 이때 경쇄는 "Y"자 형태의 입구에서 시작되는 중쇄를 떠받들고 있다. "Y"자 형태의 "가지" 부분은 Fab 부위로 지정된다. "Y"자 형태의 줄기 부분은 FC 부위로 지정된다. 아미노산 서열 방향(orientation)은 "Y"자 형태의 상단의 N-말단으로부터 각 쇄의 바닥의 C-말단으로 이어진다. N-말단은 항원을 유도하는, 항원에 특이성을 나타내는 가변 부위를 보유하고, 길이가 대략 100개 아미노산이며, 경쇄와 중쇄 사이에, 그리고 항체마다 약간의 변화가 있다.
가변 부위는, 각 쇄에서, 쇄의 나머지 길이까지 연장되고, 특정 항체 부류 내에서 이 항체의 특이성(즉, 항원이 유발함)에 따라 달라지지 않는 불변 부위에 연결된다. 면역글로불린 분자의 부류를 결정하는 불변 부위의 5가지 공지된 주요 부류(감마, 뮤, 알파, 델타 및 입실론 중쇄 불변 부위에 상응하는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE)가 있다. 불변 부위 또는 부류는 보체의 활성화를 포함하는 항체의 후속 효과기의 기능(Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2nd Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)), 및 기타 세포 반응(Andrews, D. W., 등, Clinical Immunobiology, pp 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., 등, Immunology, 48: 187 (1983))을 결정한다. 한편, 가변 부위는 항체와 반응하게 될 항원을 결정한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 각 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 짝을 이룰 수 있다. 경쇄 및 중쇄는 서로 공유적으로 결합되고, 두 중쇄의 "꼬리" 부분은, 면역글로불린이 하이브리도마 또는 B 세포들에 의해 생성될 때, 공유 이황화물 연결에 의해 서로 결합된다.
"가변 부위" 또는 "VR"이라는 표현은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관련되는 항체 내 경쇄 및 중쇄의 각 쌍 내의 도메인을 지칭한다. 각 중쇄는 일 말단에 가변 도메인(VH)에 이어, 다수의 불변 도메인을 가진다. 각 경쇄는 일 말단에 가변 도메인(VL)을, 다른 말단에 불변 도메인을 가진다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변성 도메인과 정렬된다.
"상보성 결정 부위", "과가변 부위" 또는 "CDR"이라는 표현은 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 부위에서 발견되는 과가변 또는 상보성 결정 부위(CDR) 중 하나 이상을 지칭한다(Kabat, E. A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987) 참조). 이러한 표현은 카밧(Kabat) 등에 의해 정의된, 과가변 부위 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat E., 등, US Dept. of Health and Human Services, 1983) 또는 항체의 3차원 구조에서 과가변 루프(Chothia and Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987))를 포함한다. 각 쇄에서 CDR들은 프레임워크 영역에 근접하도록 유지되며, 다른 쇄로부터의 CDR들은 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR들 내에는, 항체-항원 상호 작용에서 CDR에 의해 이용되는 중요한 접촉 잔기들을 나타내는 선택성 결정 영역(SDR)들로 기술되는 선택 아미노산들이 있다(Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).
"프레임워크 부위" 또는 "FR"이라는 표현은 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 부위 내의 하나 이상의 프레임워크 부위를 지칭한다(Kabat, E. A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987) 참조). 이러한 표현은 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 부위 내에서 CDR들 사이에 개재된 아미노산 서열 부위들을 포함한다.
"안정적인 카피 수(copy number)"라는 표현은 오랜 기간(예를 들어, 적어도 하루, 적어도 일주일, 또는 적어도 한 달 이상)에 걸쳐, 또는 연장된 수의 증식 세대(예컨대, 적어도 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500 또는 1000세대 이상)에 걸쳐 (항체 쇄 유전자와 같은) 유전자의 카피 수를 실질적으로 유지하는 숙주 세포를 지칭한다. 예를 들어, 주어진 시점 또는 세대 수에서, 배양물에서 적어도 50%, 그리고 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 85%, 90%, 95% 이상의 세포들은 출발 세포와 동일한 유전자 카피 수를 유지할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 이 숙주 세포는 원하는 단백질을 암호화하거나 원하는 다중 서브유닛 복합체(예컨대, 항체)의 각 서브유닛을 암호화하는 유전자의 안정적인 카피 수를 함유한다.
"안정적으로 발현시킨다"라는 표현은 오랜 기간(예를 들어, 적어도 하루, 적어도 일주일, 또는 적어도 한 달 이상)에 걸쳐, 또는 연장된 수의 증식 세대(예컨대, 적어도 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500 또는 1000세대 이상)에 걸쳐 유전자 또는 (항체와 같은) 단백질의 유사한 발현 수준을 유지하는 숙주 세포를 지칭한다. 예를 들어, 주어진 시점 또는 세대 수에서, 유전자 또는 단백질의 생산 속도 또는 수율은 초기 생산 속도의 적어도 50%, 그리고 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 85%, 90%, 95% 이상일 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 이 숙주 세포는 원하는 단백질 또는 다중 서브유닛 복합체(예컨대, 항체)를 안정적으로 발현시킨다.
실시예
다음의 실시예는 당업자에게 대상 발명의 창출 방법 및 용도에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하고자 제시하는 것으로, 본 발명으로 여겨지는 것의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 이용된 숫자(예컨대, 양, 온도, 농도 등)와 관련하여, 정확성을 확실히 하고자 노력하였으나, 일부 실험적 오류 및 편차는 허용될 것이다. 달리 표현되지 않는 한, 부(part)는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그에 가깝다.
위의 개시는 일반적으로 본 발명을 설명한다. 본 출원에 개시된 모든 참고 문헌은 참조로서 명백히 포함된다. 오로지 예시의 목적으로 본 출원에 제공된 것으로, 본 발명의 범위를 제한하고자 한 것은 아닌 다음의 특정 실시예를 참조하여 더욱 완전한 이해를 얻을 수 있다.
실시예 1
실시예 1부터 10까지는 본 방법의 네 가지 상이한 인간화 단일 클론성 항체의 생산에 대한 적용 가능성을 보여준다. 각 항체는 글리세르알데히드-3-인산(GAP) 프로모터 시스템을 이용하여 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 생산된다.
본 발명자들은 항체 Mab2의 호기성 및 저산소 배양물 사이에서 역가의 차이를 발견하였다. 발효조의 교반 속도를 줄임으로써 배양물의 산소 이용 가능성을 제한하자 생성물 형성의 유의미한 증가로 이어졌다. 이로써 본 발명자들은 저산소 조건이 전체 길이 항체 생산에 적용될 때, 완전히 조립된, 적절히 이황화 결합된 인간화 단일 클론성 항체들에 대하여, 생성물 형성의 유의미한 증가를 가져온다는 점을 처음으로 확인하였다. 도 37을 참조한다.
실시예 2
에탄올 농도가 유독한 수준에 도달하지 않음을 확실히 하기 위하여, 제어된 방식으로 저산소 조건의 혼합 대사를 촉진하고자, 각각 카피 수가 상이한, 항체 Mab1의 세 가지 상이한 균주를 RQ 제어 전략(RQ를 원하는 수준(이 경우, 1.12의 값)으로 유지하기 위하여 교반기 속도를 조절하는 피드백 제어를 이용하는 교반의 조절)을 이용하여 20리터 발효조에서 성장시킨다. 각각의 경우, 피드백 제어 메커니즘의 양호한 속성이 유독한 수준의 에탄올의 누적(통상적으로 20 g/L 초과) 없이 혼합 대사를 가능하게 한다(도 1 내지 도 5 참조).
실시예 3
RQ에 대한 세 가지 상이한 제어 설정값으로 RQ 제어 전략을 이용하여 저산소 조건 하에서 Mab1을 배양한다. 이 경우, RQ 설정값을 증가시키는 것은 에탄올 누적 수준을 증가시키고 세포의 누적을 감소시키나, 전체 생성물 누적에는 유의미한 영향을 미치치 않는다. 이는 1.09 내지 1.35 범위의 설정값에서의 RQ 방법의 유용성을 보여준다(도 6 내지 도 10 참조).
실시예 4
본 발명자들은, Mab1에 대해, RQ 제어에 의해 얻어진 저산소 성장의 영향을 호기성 조건 하에서의 동일한 공정과 비교하였다. 호기성 공정은 (예상했던 대로) 더 낮은 에탄올 생성과 현저히 낮은 생성물 형성을 가져온다(도 11 내지 도 16 참조).
실시예 5
각 중쇄 및 경쇄의 카피 수가 상이한 생산 균주들을 갖는 Mab2의 발효에 대해 RQ 제어 전략을 수행하였다. 본 연구는 혼합 대사를 위한 저산소 환경을 제공하면서 에탄올의 누적을 제어하는 데 있어서의 RQ 전략의 양호한 속성을 보여준다(도 17 내지 도 21 참조).
실시예 6
각 중쇄 및 경쇄의 카피 수가 상이한 생산 균주들을 갖는 Mab3의 발효에 대해 RQ 제어 전략을 수행하였다. 본 연구는 혼합 대사를 위한 저산소 환경을 제공하면서 에탄올의 누적을 제어하는 데 있어서의 RQ 전략의 양호한 속성을 보여준다(도 22 내지 도 26 참조).
실시예 7
중쇄 및 경쇄의 다양한 카피를 함유하는 Mab3의 균주들을 RQ 제어 전략을 이용하지만, 다양한 글루코오스 공급 속도를 도입하여 성장시킨다. 다시, RQ 전략은 에탄올 수준의 효과적인 제어를 가능하게 하여, 매우 유사한 생성물 누적 속도를 가져온다. 이는 다양한 발효 조건에 대한 RQ 전략의 양호함의 추가적인 증거를 제공한다(도 27 내지 도 31 참조).
실시예 8
MAb1과 동일한 표적에 결합하지만 Mab1과 그 CDR에서 상이한 서열을 가지고 있는 Mab4에 대해 RQ 전략이 설명된다. 본 발명자들은 두 가지 상이한 속도의 글루코오스 공급을 비교하였다. 다시 한 번, 이러한 전략은 안정적인 에탄올 농도 및 유사한 항체 누적 속도를 가능하게 하였다(도 32 내지 도 36 참조).
실시예 9
본 실시예는 항체들의 생산을 위한 발효 공정 또는 항원 결합 발효 배지를 설명한다.
접종원 배지를 아래 표 1에서 설명한다.
접종원 배지
성분* 최종 농도
효모 추출물 30 g/l
KH2PO4 27.2 g/l
글리세롤 또는 글루코오스 20 g/l
아미노산이 포함되지 않은 효모 질소 베이스 13.4 g/l
비오틴 0.4 mg/l
* 동일한 몰 농도 유지, 임의의 화학물질(X nH2O; n≥0)은 동일한 활성화 성분을 함유하지만, 다양한 양의 물을 함유하는 또 다른 화학물질(X kH2O; kn)로 교체될 수 있다.
종균 발효 배지
배지를 아래 표 2에서 설명한다.
조성 종균 발효 배지
성분* 최종 농도
시트르산 나트륨 2수화물 10.0 g/l
MgSO4-7H2O 3.7 g/l
NH4H2PO4 36.4 g/l
K2HPO4 12.8 g/l
K2SO4 18.2 g/l
글리세롤, 무수 40.0 g/l
효모 추출물 30.0 g/l
소포제 204 0.5 ml/l
미량 무기물 용액(PTM1) 4.35 ml/l
* 동일한 몰 농도 유지, 임의의 화학물질(X nH2O; n≥0)은 동일한 활성화 성분을 함유하지만, 다양한 양의 물을 함유하는 또 다른 화학물질(X kH2O; kn)로 교체될 수 있다.
미량 무기물 용액을 아래 표 3에서 설명한다.
미량 무기물 용액(PTM1)
성분* 최종 농도
ZnCl2 1 또는 황산아연 7수화물 2 20 g/l1 또는 35 g/l2
F2SO4-7H2O 65 g/l
95-98% H2SO4 5 ml/l
NaI 0.08 g/l
MnSO4-2H2O 3 g/l
Na2MoO4-2H2O 0.2 g/l
H3BO3 0.02 g/l
CoCl2 0.5 g/l
CuSO4-5H2O 6 g/l
비오틴 0.2 g/l
* 동일한 몰 농도 유지, 임의의 화학물질(X nH2O; n≥0)은 동일한 활성화 성분을 함유하지만, 다양한 양의 물을 함유하는 또 다른 화학물질(X kH2O; kn)로 교체될 수 있다.
모든 성분들이 탈이온화수에 완전히 용해될 때, 멸균 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과 살균한다.
생산 배양물 회분 배지를 아래 표 4에서 설명한다.
생산 배양물 회분 배지
성분* 최종 농도
시트르산 나트륨 2수화물 10.0 g/l
MgSO4-7H2O 3.7 g/l
NH4H2PO4 35.6 g/l
K2HPO4 12.8 g/l
K2SO4 18.2 g/l
글리세롤, 무수 40.0 g/l
효모 추출물 30.0 g/l
소포제 204 1.6 ml/l
* 동일한 몰 농도 유지, 임의의 화학물질(X nH2O; n≥0)은 동일한 활성화 성분을 함유하지만, 다양한 양의 물을 함유하는 또 다른 화학물질(X kH2O; kn)로 교체될 수 있다.
위의 배지는 최소 20분 동안 121℃에서 오토클레이브 처리에 의해 멸균한다. 멸균 및 냉각 후, 4.35 ml/l의 미량 무기물 용액(PTM1)을 생산 배양물 회분 배지에 첨가한다. 발효조의 접종 전에, 4.35 ml/l의 PTM1을 함유하는 생산 배양물 회분 배지를 24~30% NH4OH로 pH 6.0까지 조정해야 한다. 위의 값은 배지 및 접종원 배양물 모두를 포함하는, 전체 발효 출발 부피에 기반해야 한다.
글루코오스/효모 추출물 원료 용액을 아래 표 5에서 설명한다.
성분* 최종 농도
덱스트로오스, 무수 500 g/l
효모 추출물 50 g/l
MgSO4-7H2O 3 g/l
소포제 204 0.1 ml/l
시트르산 나트륨 2수화물 1.66 g/l
PTM1 12 ml/l
* 동일한 몰 농도 유지, 임의의 화학물질(X nH2O; n≥0)은 동일한 활성화 성분을 함유하지만, 다양한 양의 물을 함유하는 또 다른 화학물질(X kH2O; kn)로 교체될 수 있다.
에탄올 볼러스 조성을 아래 표 6에서 설명한다.
성분* 최종 농도
에탄올, 200 프루프(Proof) 11 g/l
* 선택적으로 더 희석된 에탄올 용액이 동일한 최종 농도를 달성하기 위하여 이용될 수 있다.
발효 공정
항체 또는 항원 결합 단편의 생산을 위한 발효 공정은 P. 파스토리스와 같은 효모에 의해 달성된다. 발효는 제조용 세포 은행(working cell bank)의 동결 바이알의 해동으로부터 개시된다. 그런 다음, 해동된 세포를 진탕 플라스크에서 번식시킨다. 그런 다음, 진탕 플라스크로부터의 배양물을 접종 단계, 이어서 항체 생산을 위한 유가식 공정에 이용한다. 선택적으로, 접종원은 종균 회분식 발효에서 세포를 번식시키기 위하여 이용될 수 있고, 그런 다음, 이는 생산 발효조에 접종하는 데에 이용될 수 있다.
1. 접종원 단계
제조용 세포 은행의 해동된 세포를 플라스크 접종원 배지의 작업량의 8~20%를 함유하는 배플 진탕 플라스크(1 내지 4개의 배플)로 옮긴다. 해동된 제조용 세포 은행을 진탕 플라스크에 접종원 배지 부피의 0.1 ~ 1.0%로 첨가한다. 접종원 배양물을 220~260 rpm의 교반 속도로 29-31℃에서 배양한다. 일단 15~30(최적으로는 20~30)의 600 nm에서의 흡광도(OD600)와 관련된 세포 밀도에 도달하면 종균 배양물을 수확한다. 배양 시간은 일반적으로 20~26시간(최적으로는 23~25시간)이다.
2. 종균 발효 회분식 발효(선택적)
발효조에 "접종원 단계"로부터의 접종원을 접종한다.
접종원 = 종균 발효조 배지 부피의 0.3%
온도: 30℃
% DO: 30%
pH: 6.0
교반: 100~490 RPM의 단계식(캐스케이드) 전략
공기 흐름: 1 vvm((공기의 부피/출발 발효조 배지의 부피)/분)
압력: 0.2 바
일정한 vvm을 유지하고, 30%의 원하는 % DO 설정값을 유지하기 위하여, 상응하는 공기 흐름의 감소로 최대 교반에 이를 때, 산소 보충이 일어날 것이다.
DO 스파이크를 위한 모니터링을 계속한다.
탄소 공급원(글리세롤 또는 글루코오스)이 완전히 이용되었으며, 측정된 광학 밀도 OD600이 20을 초과함을 나타내는, 교반의 감소 및 DO의 증가로 표현되는 DO 스파이크가 발생하였을 때, 생산 발효조 출발 회분 부피의 1.0 ~ 10%와 동일한, 종균 회분식 발효 또는 접종원 배양물의 부피를 이동시킨다.
3. 회분식 배양 시기
회분식 배양은 종균 배양물로 발효조를 접종함으로써 개시되고, 글리세롤의 고갈로 종결된다. 발효조는 제조된 생산 배양물 회분식 배지를 최대 작업 부피의 30~40%로 함유한다. 종균 배양물은 발효조 내에서 1~10% 접종원을 생성하는 데에 이용된다. 초기 조작 매개변수는 다음과 같이 설정된다:
온도: 27~29℃;
교반 (P/V): 2~16 KW/m3
헤드스페이스 압력: 0.7~0.9 바
공기 흐름: 0.9~1.4 VVM(분당 배양물의 부피당 공기의 부피, 출발 부피 기준)
DO: 제어하지 않음.
pH: 5.9 내지 6.1, 24~30% NH4OH로 제어
부피당 초기 파워(P/V) 및 분당 부피당 부피(VVM) 요건을 충족시키기 위하여 회분식 배양 시기 중에는 출발 교반 속도 및 공기 흐름을 일정하게 유지한다. 회분식 배양 시기는 글리세롤이 고갈될 때, 출발 원료에 의해 종결된다. 글리세롤의 고갈은 용존 산소(DO) 값의 스파이크로서 나타내어진다. DO 스파이크는 DO의 값이 수 분 이내에 30%를 초과하여 증가할 때로 정의된다. 회분식 배양 시기는 일반적으로 10~15시간(최적으로는 11~13시간) 지속된다.
4. 에탄올 볼러스 첨가(선택적)
위에 언급된 바와 같이 DO 스파이크를 관찰하자마자, 8~16 g/l의 에탄올(200프로프)을 볼러스로서 발효조에 첨가한다. 이는 일반적으로 회분식 배양 시기의 12~14시간 이내에 일어난다.
5. 유가식 배양 시기
글루코오스/효모 추출물 원료 용액을 발효조에 공급하는 것은 회분식 배양 시기 내의 12~14시간쯤의 DO 스파이크 후, 그리고 에탄올 볼러스 첨가 후에 개시되고, 발효 종결 시까지 계속된다. 글루코오스/효모 추출물 원료 용액 공급 속도는 6~11g의 글루코오스/시간당 출발 부피 l를 허용하도록 설정된다. 글루코오스/효모 추출물 원료 용액의 출발은 유가식 배양 시기를 시작한다.
6. RQ 제어 시작
호흡률(RQ) 제어는 유가식 배양 시기 시작 8시간 후에 시작한다. 초기 RQ 설정값은 1.09 내지 1.35의 범위 내이다. 교반은 RQ를 제어하는 데에 이용된다. 교반은 RQ 제어 설정값으로부터 단계적으로 행해진다. RQ 제어는 회분식 배양 시기의 개시로부터 대략 20~22시간에 시작되고, 발효 종결까지 계속된다. RQ 제어의 지속기간은 대략 60 내지 90시간이다.
설정된 수준의 RQ를 유지하기 위하여 교반을 조절한다. RQ 조절 전략은 다음과 같이 상술된다:
RQ 높은 제어 설정값: 1.35
RQ 낮은 제어 설정값: 1.08
최대 교반기 설정값: 255 ~ 950 rpm
최소 교반기 설정값: 150 ~ 300 rpm
교반기 단계 변경(각각의 대기 시간 간격에서 변경): 3~25 rpm
대기 시간(평가 사이의 시간): 3~10분
에탄올/ RQ 제어 전략
에탄올 농도가 세포에 유독할 수 있는 최대값을 넘지 않고, 생성물 발현을 감소시킬 수 있는 최소값을 넘지 않음을 확실히 하기 위하여 이 전략을 포함시켰다.
실시예 10
도 38은 저산소 및 호기성 조건 하에서 생산된 Mab1의 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 비환원 겔의 경우, 150 kD의 주밴드 이외에도, 주밴드 아래의 추가적인 밴드들이 사슬 내 이황화 가교의 수준에 관련된 생성물의 이질성을 나타낸다. 이러한 겔은 이질성 수준이 저산소 조건 이용에 의해 감소됨을 보여준다. 전체 길이의, 완전히 가교된 생성물의 증가된 동질성은 증가된 순도, 즉, 존재하는 기타 단백질에 비해 증가된 원하는 생성물을 나타낸다.
또한, 도 38은 동일한 샘플에 대한 환원 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 이 경우, 25 kD와 50 kD의 예상 밴드들은 항체의 중쇄 및 경쇄를 나타낸다. 추가적인 밴드들, 특히 대략 55 kD의 중쇄 위의 밴드는 항체의 변이형 종들의 존재를 나타낸다. 이러한 겔은 세포가 저산소 조건 하에서 성장될 때, 호기성 배양물과 비교하여, 이러한 변이형 존재의 극적인 감소를 보여준다.
실시예 11
본 실시예는 P. 파스토리스로부터 발현된 항체들의 수율 및 순도에 미치는 온도 전환의 효과를 시험한다. 항체 수율은 배양 도중 시행된 상향 온도 전환에 의해 최대 약 30% 증가되었다. 추가적으로, 생성물 관련 변이형 및 특이 복합체들의 존재비의 감소에 의해 나타낸 바와 같이, 순도는 온도 전환에 의해 증가되었다.
방법
Ab-A를 중쇄 유전자의 4개의 통합된 카피들 및 경쇄 유전자의 3개의 통합된 카피들(각각 서열 번호 1과 2)을 함유하는 P. 파스토리스 균주로부터 발현시켰다. 다음의 영양분(%w/v)으로 이루어진 배지를 이용하여 접종원을 증식시켰다: 효모 추출물 3%, 글리세롤 2%, YNB 1.34%, 비오틴 0.004% 및 27.2 g/1 인산칼륨 일염기성. 발효조를 위한 접종원을 생성하기 위하여, 세포들을 30℃ 및 300 rpm으로 진탕 항온배양기에서 대략 24~28시간 동안 성장시켰다.
Ab-A 서열들은 다음과 같다:
Ab-A 중쇄 폴리뉴클레오티드 서열:
gaggtgcagcttgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagtctctggaatcgacctcagtggctactacatgaactgggtccgtcaggctccagggaaggggctggagtgggtcggagtcattggtattaatggtgccacatactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccagagacaattccaagaccacggtgtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatttctgtgctagaggggacatctggggccaagggaccctcgtcaccgtctcgagcgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactcc ctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacgcgagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagag cctctccctgtctccgggtaaatga (서열 번호 1)
Ab-A 경쇄 폴리뉴클레오티드 서열:
caagtgctgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcaattgccaggccagtcagagtgtttatcataacacctacctggcctggtatcagcagaaaccagggaaagttcctaagcaactgatctatgatgcatccactctggcatctggggtcccatctcgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatgttgcaacttattactgtctgggcagttatgattgtactaatggtgattgttttgttttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag (서열 번호 2)
그런 다음, 10% 접종원을 6 L 멸균 성장 배지를 함유하는 애플리콘(Applikon) 17L 작업량의 용기에 첨가하였다. 성장 배지는 다음의 영양분으로 이루어졌다: 황산칼륨 18.2 g/L, 인산암모늄 일염기 35.6 g/L, 인산칼륨 이염기 12.8 g/L, 황산마그네슘 7수화물 3.72 g/L, 시트르산 나트륨 이수화물 10 g/L, 글리세롤 40 g/L, 효모 추출물 30 g/L, PTM 1 미량 금속 4.35 mL/L 및 소포제 204 1.67 mL/L. PTM1 미량 금속 용액은 다음의 성분들로 이루어졌다: 황산구리 5수화물 6 g/L, 요오드화 나트륨 0.08 g/L, 황산마그네슘 수화물 3 g/L, 몰리브덴산나트륨 이수화물 0.2 g/L, 붕산 0.02 g/L, 염화코발트 0.5 g/L, 염화아연 20 g/L, 황산제일철 7수화물 65 g/L, 비오틴 0.2 g/L 및 황산 5 mL/L. 생물반응기 공정 제어 매개변수는 다음과 같이 설정되었다: 교반 950 rpm, 공기 흐름 1.35 표준 리터/분, 온도 28. 그리고 수산화암모늄을 이용하여 pH를 (6으로) 제어하였다. 어떠한 산소 보충도 제공되지 않았다.
발효 배양물을 초기 글리세롤이 소비될 때까지 28에서 대략 12 내지 16시간 동안 성장시켰는데, 초기 글리세롤의 소비는 DO 스파이크라고 지칭되는, 용존 산소의 농도의 급격한 증가에 의해 검출되었다. DO 스파이크가 검출된 직후, 배양물 리터당 100% 에탄올 11그램의 볼러스를 반응조에 첨가하여 약 1.1% 에탄올(w/v)의 최종 농도를 얻었다. 발효 배양물을 20분 동안 평형에 이르게 하였다. 그런 다음, 발효 지속기간 동안 11g 글루코오스/L/hr의 일정한 속도로 원료 첨가를 개시하였다. 원료 첨가가 개시된 후 대략 8시간에, 500 rpm의 최소 교반 속도와 950 rpm의 최대 교반 속도에서 교반 피드백 제어를 이용하여 RQ 제어가 개시되었으며, 그에 의해 남은 발효 중 1.12의 RQ 설정값을 유지하였다. 원료는 다음 성분들로 이루어졌다: 효모 추출물 50 g/L, 무수 덱스트로오스 500 g/L, 황산마그네슘 7수화물 3 g/L 및 PTM1 미량 금속 12 mL/L. 선택적으로, 시트르산 나트륨 2수화물(1.66 g/L)도 원료에 첨가되었다. 원료 pH는 6.0이었다.
공급 개시 후 5분에, 배양 온도는 다섯 가지의 상이한 온도(25, 29.5, 31 , 32.5 및 34) 중 하나로 신속하게 전환되었다. 추가적으로, 대조군 배양물은 28로 유지되었다. 즉, 온도 전환이 없었다. 전체 발효 시간은 대략 86~87시간이었다.
발효 전반에 걸쳐 각각의 배양물로부터 샘플을 수집하였고, 전체 배양액 역가를 결정하고, 임의의 단위로 그래프화하였는데, 이는 본 출원의 도면들 사이에서 일관적이다. 추가적으로, 시행 종결 시, 애질런트(Agilent, 캘리포니아 주 산타 클라라) 1200 시리즈 HPLC를 UV 검출 장비와 함께 이용하여 환원 및 비환원 샘플들에 대해 수행한 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC)에 의해 (단백질 A 정제 후) 항체 순도를 결정하였다. 샘플 분리를 위해, 토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience, 필라델피아 주 킹오브프러시아)의 TSK겔(gel) 가드(Guard) SWxl 6x40 mM과 연결된 TSK겔 GS3000SWx1 7.8x300 mM 컬럼을 이용하였다. 100 mM 인산나트륨, 200 mM 염화나트륨 pH 6.5를 등용매 방식으로 0.5 mL/분의 유속으로 이동상으로 이용하였고, UV 215 nm에서의 흡광도를 모니터링하였다. 샘플 주입 전, 안정적인 바탕선이 달성될 때까지 컬럼을 평형화하였다. 샘플을 이동상을 이용하여 1 mg/mL의 농도까지 희석하였고, 30 ㎕ 부피를 주입하였다. 컬럼 성능을 모니터링하기 위하여, 바이오래드(BioRad, 캘리포니아 주 허큘리스) 겔 여과 표준을 이용하였다.
결과
Ab-A를 발현하도록 조작된 P. 파스토리스를, 탄소 공급원으로서 글리세롤을 이용하여, 초기 성장기 중에 28로 유지된 배양물에서 성장시켰다. 글리세롤의 고갈 후, 연속적인 글루코오스 공급이 개시되었고, 배양 온도를 25 내지 34의 새로운 설정값 온도까지 신속하게 상향 또는 하향 전환시켰고, 새로운 온도는 배양 지속기간 동안 유지되었다. 한 배양물은 대조군으로서 28로 유지되었다.
항체 생산을 모니터링하기 위하여, 배양 배지(분비 신호의 포함으로 인하여, 배양 배지로 항체가 분비됨)를 최대 86~87시간의 최종 시점까지 주기적으로 샘플링하였다. 전체 배양액 항체 역가(임의의 단위)를 결정하였고, 도 40에 각각의 배양 온도에 대한 그래프를 나타내었다. 도시된 바와 같이, 가장 높은 최종 역가는 31로 유지된 배양물에서 달성되었다. 32.5로 유지되었던 배양물에서 초기에는 약간 더 높은 역가가 얻어졌으나, 전체 배양액 역가는 수평을 유지하다가 65~70시간 사이에서 감소하기 시작하여, 최종 역가는 비전환 배양물에서 관찰된 것보다 더 낮았다. 두 번째로 높은 최종 역가는 29.5로 유지된 배양물에서 관찰되었다. 최대 34까지 전환된 배양물과 25까지 하향 전환된 배양물 모두는 28로 유지된 배양물보다 더 낮은 역가를 생성하였다.
추가적으로, 배양 종결 시(즉, 86~87시간)에 항체 순도를 결정하였다. 특히, 각 배양물로부터 단백질 A로 정제된 항체를 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해, 그리고 쿠마시 염색과 함께 겔 전기영동법에 의해 평가하였는데(도 42 내지 도 47), 이들은 환원 및 비환원 샘플들에 대해 수행되었다. 비환원 샘플들의 SEC 분석은 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 함유하는 75 kDA "절반 항체" 종 및 두 개의 중쇄 및 단일 경쇄를 함유하는 "HHL" 복합체를 포함하는, 특이 화학량론을 나타내는 복합체들의 상대적인 존재비를 검출하였다. 환원 샘플들의 SEC 분석은 온전한 중쇄 및 경쇄뿐만 아니라, 대략 9.8분, 10.15분 및 10.8분의 용리 시간을 나타내는 특이 서브유닛들(이들은 항체 중쇄의 당화 형태에 해당하는 것으로 여겨짐)의 상대적인 존재비를 검출하였다.
SEC 결과를 도 41A 및 B에 요약되어 있다. 비환원 SEC 분석은 유사한 비율의 전체 단백질이 비전환 배양물(즉, 28로 유지됨)과 29.5와 31까지 전환된 배양물에 대한 주요 항체 피크에 함유되었고, 세 가지 조건 모두 전체 항체 피크 내 전체 단백질의 88~89%를 유지하였음을 증명하였다(도 41A). 따라서, 잘못 조립된 복합체를 고려하여, 29.5와 31까지의 상향 전환은 순도에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 나아가, 환원 SEC 분석은, 비전환 배양물에 비해, 중쇄 및 경쇄 피크에 함유된 전체 단백질의 비율이 29.5까지 전환된 배양물에 대해 비슷하게 남아 있었으며, 더 높은 온도 전환의 경우, 약 4% 증가되었음을 증명하였다.
이를 기반으로, 29.5 또는 31까지의(즉, 1.5 내지 3의) 상향 온도 전환은 최종 항체 수율을 증가시켰던 것으로 결론 내린다. 추가적으로, 31까지 전환된 배양물에서 순도는 증가되었으나, 29.5까지 전환된 배양물의 경우에, 순도는 부정적으로 영향 받지 않았다.
실시예 12
본 실시예는 P. 파스토리스로부터 발현된 항체들의 수율 및 순도에 미치는 온도 전환의 효과를 시험한다. 저생산 균주와 고생산 균주의 두 가지 상이한 균주를 시험하였다. 고생산 균주의 경우, 항체 수율은 배양 도중 시행된 상향 온도 전환에 의해 약 28% 증가되었다. 이를 기반으로, 이미 고도로 최적화된 균주로부터의 생산은 온도 전환에 의해 실질적으로 이득을 얻었다는 결론을 내린다. 추가적으로, 대부분의 경우에서 생성물 관련 변이형의 존재비의 감소에 의해 나타난 바와 같이, 순도는 온도 전환에 의해 증가되었다.
방법
Ab-B를 중쇄 유전자의 3개 또는 4개의 통합된 카피들 및 경쇄 유전자의 3개의 통합된 카피들(각각 서열 번호 3과 4)을 함유하는 P. 파스토리스 균주로부터 발현시켰다. 다음의 영양분(%w/v)으로 이루어진 배지를 이용하여 접종원을 증식시켰다: 효모 추출물 3%, 글리세롤 2%, YNB 1.34%, 비오틴 0.004% 및 27.2 g/1 인산칼륨 일염기성. 발효조를 위한 접종원을 생성하기 위하여, 세포들을 30℃ 및 300 rpm으로 진탕 항온배양기에서 대략 24~28시간 동안 성장시켰다.
Ab-B 서열들은 다음과 같다:
Ab-B 중쇄 폴리뉴클레오티드 서열:
caaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (서열 번호 3)
Ab-B 경쇄 폴리뉴클레오티드 서열:
gctatccagatgacccagtctccttcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccaggccagtcagagcattaacaatgagttatcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatagggcatccactctggcatctggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagggttatagtctgaggaacattgataatgctttcggcggagggaccaaggtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtaca gtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (서열 번호 4)
그런 다음, 10% 접종원을 6 L 멸균 성장 배지를 함유하는 애플리콘 17L 작업량의 용기에 첨가하였다. 성장 배지는 다음의 영양분으로 이루어졌다: 황산칼륨 18.2 g/L, 인산암모늄 일염기 35.6 g/L, 인산칼륨 이염기 12.8 g/L, 황산마그네슘 7수화물 3.72 g/L, 시트르산 나트륨 2수화물 10 g/L, 글리세롤 40 g/L, 효모 추출물 30 g/L, PTM1 미량 금속 4.35 mL/L 및 소포제 204 1.67 mL/L. PTM1 미량 금속 용액은 다음의 성분들로 이루어졌다: 황산구리 5수화물 6 g/L, 요오드화 나트륨 0.08 g/L, 황산마그네슘 수화물 3 g/L, 몰리브덴산나트륨 2수화물 0.2 g/L, 붕산 0.02 g/L, 염화코발트 0.5 g/L, 염화아연 20 g/L, 황산제일철 7수화물 65 g/L, 비오틴 0.2 g/L 및 황산 5 mL/L. 생물반응기 공정 제어 매개변수는 다음과 같이 설정되었다: 교반 950 rpm, 공기 흐름 1.35 표준 리터/분, 온도 28. 그리고 수산화암모늄을 이용하여 pH를 (6으로) 제어하였다. 어떠한 산소 보충도 제공되지 않았다.
발효 배양물을 초기 글리세롤이 소비될 때까지 28에서 대략 12 내지 16시간 동안 성장시켰는데, 초기 글리세롤의 소비는 DO 스파이크라고 지칭되는, 용존 산소의 농도의 급격한 증가에 의해 검출되었다. 그런 다음, 8시간 동안 15g 글루코오스/l/hr의 속도로 원료 첨가를 개시하였다. 원료 첨가가 개시된 후 대략 8시간에, 원료 첨가 속도는 발효의 지속 기간 동안 13g 글루코오스/l/hr까지 감소되었다. 또한, 이때, 1.12의 RQ 설정값을 유지하기 위하여 500 rpm의 최소 교반 및 950 rpm의 최대 교반을 가지는 교반 피드백 제어를 이용하여 RQ 제어가 개시되었다. 원료는 다음의 성분들로 이루어졌다: 효모 추출물 50 g/L, 무수 덱스트로오스 500 g/L, 황산마그네슘 7수화물 3 g/L 및 PTM1 미량 금속 12 mL/L. 선택적으로, 시트르산 나트륨 2수화물(1.66 g/L)도 원료에 첨가되었다.
공급 개시 후, 배양 온도는 두 가지 발현 균주 각각에서의 하나의 배양물의 경우, 30까지 신속하게 전환되었다. 추가적으로, 두 균주 각각에서의 두 배양물의 경우, 대조군 배양물은 28로 유지되었다. 즉, 온도 전환이 없었다. 전체 발효 시간은 대략 86시간이었다.
발효 전반에 걸쳐 각각의 배양물로부터 샘플을 수집하고, 전체 배양액 역가를 결정하고, 임의의 단위로 그래프화하였는데, 이는 본 출원의 도면들 사이에서 일관적이다. 추가적으로, 시행 종결 시, 실시예 11에 기술된 방법을 이용하여, 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC)에 의해 (단백질 A 정제 후) 항체 순도를 결정하였다.
결과
Ab-B를, 경쇄를 암호화하는 유전자의 3카피 및 중쇄를 암호화하는 유전자의 3카피(H3/L3) 또는 경쇄를 암호화하는 유전자의 3카피 및 중쇄를 암호화하는 유전자의 4카피(H4/L3)를 함유하는, 조작된 P. 파스토리스 균주들로부터 발현시켰다. 배양물은 초기에는 탄소 공급원으로서 글리세롤을 이용하여, 28에서 성장시켰다. 글리세롤의 고갈 후, 연속적인 글루코오스 공급이 개시되었고, 배양 온도를 30까지 신속하게 상향 전환시켜 배양 지속기간 동안 유지시키거나, 대조군으로서 28로 유지시켰다.
바탕선에서, H4/L3 균주(도 48a)는 H3/L3 균주(도 48b)보다 더 높은 항체 역가를 나타냈으며, 비전환 배양물의 경우(즉, 28로 유지됨), 평균 최종 전체 배양액 역가는 H4/L3 균주에 대해 12% 더 높았다.
30까지 전환된 H4/L3 배양물은 (28로 유지된, 즉, 전환 없는 두 가지 H4/L3 배양물로부터의 평균 역가에 비해) 추가적인 28%의 최종 역가 증가를 나타냈다. H3/L3 균주의 경우, 관찰된 최종 수율의 증가는 다소 덜 확연했으나, 30까지 전환된 H3/L3 균주로부터의 수율은 28로 유지된(즉, 전환 없는) 두 가지 H3/L3 배양물로부터의 평균 최종 수율에 비해 약 5% 증가되었다.
도 52는 배양물에서 시간에 대한 그래프로 나타낸 각 배양물의 온도를 나타낸다. 예상대로, 온도 전환을 하자, 세포는 신속하게 30의 새로운 설정값 온도에 이르렀으며, 전환 및 비전환 배양물 양자는 배양 전체에 걸쳐 그들의 설정값 온도를 유지하였다.
또한, SE-HPLC를 이용하여 각 배양물로부터 항체 순도를 평가하였다. 실시예 11에 기술된 바와 같이, 비환원 샘플들은 특이 복합체들(하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 함유하는 75 kDa "절반 항체"와 두 개의 중쇄와 오직 하나의 경쇄를 함유하는 HHL 복합체)의 존재비 검출을 허용하였다. 전체 항체에 함유된 단백질의 분획("주요 피크 IgG")은 30까지 전환된 두 개의 샘플의 경우, 그것들 각각의 비전환 대조군의 평균과 비교하여 증가되었으며, 이는 비전환 샘플들의 평균과 비교하여, 전환된 샘플들의 75 kDA HL 종들과 사전 피크 HHL 종들의 감소로부터 기인한다. 특히, 각각 83.44%, 4.75% 및 6.15%인 전환 H4/L3 샘플의 경우에 비해, 비전환 H4/L3 샘플의 경우, 전체 항체 피크에 함유된 단백질의 평균 분율은 74.39%였고, 사전 피크 HHL에서는 4.26%였고, 75 kD HL은 12.65%였다. 마찬가지로, 각각 91.63%, 2.94% 및 1.44%에 비해, 전체 항체 피크에 함유된 단백질의 평균 분율은 82.80%였고, 사전 피크 HHL에서는 5.31%였고, 75 kD HL은 4.76%였다. 결론적으로, 비환원 SEC 분석은 온도 전환이 (1) 전체 항체 피크에 함유된 항체의 평균량을 증가시켰고, (2) 네 가지 경우 중 세 가지에서 특이 복합체들의 평균 량을 감소시켰음을 증명하였다.
또한, 실시예 11에 기술된 바와 같이, 환원 샘플들은 전체 길이의 중쇄 및 경쇄에 함유된 단백질뿐만 아니라, 세 개의 뚜렷한 용리 피크에서 관찰되었던 생성물 관련 변이형들의 상대적인 존재비의 검출을 허용하였다. 비환원 분석에서 관찰된 특이 복합체들의 관찰된 감소와는 달리, 환원 샘플들은 전체 길이의 중쇄 및 경쇄에 함유된 항체량에서 일관적인 개선을 나타내지 않았다. 종합적으로, 두 균주의 경우, 중쇄의 평균 상대적 존재비는 전환 배양물에서 비전환 배양물의 평균과 비교하여 약 1~3% 증가되었고, 경쇄의 평균 상대적 존재비는 두 균주의 경우, 변화되지 않았거나 약 0.9% 감소되었다.
실시예 13
본 실시예는 P. 파스토리스로부터 발현된 항체들의 수율 및 순도에 미치는 온도 전환의 효과를 시험한다. 항체 수율은 배양 도중 시행된 상향 온도 전환에 의해 평균적으로 47% 증가되었다.
방법
다섯 개의 배양물을 28로 유지(즉, 비전환)시켰고, 네 개의 배양물을 30까지 전환시켰다는 점을 제외하고는, 실시예 11에 기술된 바와 같이 Ab-A를 중쇄 유전자의 4개의 통합된 카피들 및 경쇄 유전자의 3개의 통합된 카피들을 함유하는 P. 파스토리스 균주로부터 발현시켰다. 실시예 11에서와 같이, 온도 전환을 시행할 경우, 공급 개시 후 5분의 시점에 온도 전환을 시행하였다. 전체 발효 시간은 대략 87시간이었다.
실시예 11에 기술된 방법을 이용하여, 발효 전반에 걸쳐 각각의 배양물로부터 샘플을 수집하고, 전체 배양액 역가를 결정하고, 임의의 단위로 그래프화하였는데, 이는 본 출원의 도면들 사이에서 일관적이며, 최종 시점에서(단백질 A 정제 후) 환원 및 비환원 샘플들에 대해 수행된 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC)에 의해 각 배양물에 대한 항체 순도를 결정하였다.
결과
Ab-A를 발현하도록 조작된 P. 파스토리스를 탄소 공급원으로 글리세롤을 이용하여, 초기 성장기 동안 28로 유지된 배양물에서 성장시켰다. 글리세롤의 고갈 후, 연속적인 글루코오스 공급이 개시되었고, 배양 온도를 28의 새로운 설정값까지 신속하게 상향 전환시켜 이를 배양 지속기간 동안 유지시켰다(N=4). 다섯 개의 대조군 배양물은 28로 유지(즉, 비전환)시켰다.
주기적인 샘플링에 의해 전체 배양액 항체 역가를 결정하였고, 도 50에 그래프(임의의 단위)로 나타내었다. 도시된 바와 같이, 30까지 전환된 네 개의 배양물 각각은 28로 유지된 비전환 배양물 전부보다 더 높은 최종 역가를 생성하였다. 평균적으로, 최종 역가는 비전환 배양물보다 전환 배양물의 경우, 47% 더 높았다.
추가적으로, SE-HLPC에 의해 순도를 평가하고, 전환 및 비전환 배양물에 대해 비교하였다. 비환원 샘플들은 평균적으로 주요 항체 피크에 함유된 단백질의 상대적인 양에서 대략 2% 증가를 나타냈고, 사전 피크 HHL은 평균적으로 약 21% 감소되었고, 75kDa HL 피크는 57% 증가되었다. 환원 샘플들은 순도의 전면적인 개선 및 모든 세 개의 불순물 피크의 평균 상대적 존재비의 감소를 나타냈다. 특히, 비전환 샘플들에 비해, 전환 샘플들은 RT 9.80 피크의 26% 감소, RT 10.16 피크의 74% 감소 및 RT 10.80 피크의 70% 감소를 나타냈다. 결론적으로, 비환원 SEC 분석은 온도 전환이 (1) 전체 항체 피크에 함유된 항체의 평균량을 증가시켰고, (2) 2/3의 특이 복합체들의 평균량을 감소시켰음을 증명하였다. 환원 SEC 분석은 세 개의 검출된 불순물 피크들 각각의 상대적인 존재비의 큰 감소를 보여주었다.
이를 기반으로, 28로부터 30까지의(즉, 2의) 상향 온도 전환은 재현 가능하게 최종 항체 수율을 평균 25~30% 증가시켰다는 결론이 된다. 나아가, 모세관 전기영동 분석에 의해 반영된 바와 같이 항체들의 순도는 비전환 배양물과 비교할 때, 환원 비교에서 더 두드러진, 온도 전환된 배양물에서 순도 증가도 나타냈다.
본 발명의 여러 예시된 구현예들에 대한 위의 기재 내용은 철저하거나 또는 본 발명을 개시된 정확한 형태로 한정하고자 하는 것이 아니다. 본 발명의 특정 구현예 및 실시예들은 본 출원에서 예시적 목적으로 기술되고,, 당업자들이 인식할 바와 같이, 본 발명의 범위 내에서 다양한 등가적인 변형이 가능하다. 본 출원에 제공된 본 발명의 교시는 전술된 실시예 이외에 다른 목적에도 적용될 수 있다.
본 발명은 전술한 설명 및 실시예에서 구체적으로 기술된 방식 이외의 방식으로 실현될 수 있다. 본 발명의 수많은 변형들 및 변경들이 위의 교시에 비추어 가능하며, 따라서 첨부된 청구범위의 범주 내에 있다.
위의 상세한 설명의 견지에서 본 발명에 대해 이러한 변화 및 기타 변화가 이루어질 수 있다. 일반적으로, 다음의 청구범위에서, 사용된 용어는 본 발명을 명세서에 개시된 특정 구현예들과 청구범위로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 따라서, 본 발명은 본 개시에 의해 제한되지 않으며, 본 발명의 범주는 다음의 청구범위에 의하여 전적으로 결정된다.
항원-특이적 B 세포들의 클론 군집을 획득하는 방법에 관한 특정 교시는 2006년 5월 19일 출원된 미국 가특허 출원번호 60/801,412 및 미국 특허출원 공개번호 2012/0141982에 개시되었으며, 이의 각각의 개시 내용은 본 출원에 그 전체가 참조로서 포함된다.
토끼 유래의 단일 클론성 항체의 인간화 및 항원 결합 친화도를 유지하기 위한 바람직한 서열 변형에 관한 특정 교시는 2008년 5월 21일 출원된, "신규한 토끼 항체 인간화 방법 및 인간화된 토끼 항체(Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies)"라는 명칭의 국제 공개 번호 WO/2008/144757에 해당하는, 국제 출원 번호 PCT/US2008/064421에 개시되었으며, 이의 개시 내용은 본 출원에 그 전체가 참조로서 포함된다.
교배 허용 효모를 이용한 항체 또는 이의 단편의 생산 및 상응하는 방법에 관한 특정 교시는 2006년 5월 8일 출원된 미국 특허 출원 번호11/429,053(미국 특허 출원 공개 번호 US2006/0270045)에 개시되어 있으며, 이의 개시 내용은 본 출원에 그 전체가 참조로서 포함된다.
배경, 요약, 상세한 설명 및 실시예에 인용된 각 문헌을 포함하는, 본 출원에 인용된 각 문헌의 전체 개시 내용(특허, 특허 출원, 논문, 요약서, 매뉴얼, 책 또는 기타 공개물 포함)은 그 전체가 본 출원에 참조로서 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> ALDER BIOPHARMACEUTICALS, INC. Lesnicki, Gary McNeill, Patricia Dianne Hartner, Franz Young, Mark <120> TEMPERATURE SHIFT FOR HIGH YIELD EXPRESSION OF POLYPEPTIDES IN YEAST AND OTHER TRANSFORMED CELLS <130> 43257.3013 <141> 2014-03-17 <150> 61/791471 <151> 2013-03-15 <150> 61/790,613 <151> 2013-03-15 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Engineered antibody sequence <400> 1 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cgacctcagt ggctactaca tgaactgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtatta atggtgccac atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgctag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agcgcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360 cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 480 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 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Artificial <220> <223> Engineered antibody sequence <400> 2 caagtgctga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtcagag tgtttatcat aacacctacc tggcctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag ttcctaagca actgatctat gatgcatcca ctctggcatc tggggtccca 180 tctcgtttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtctg ggcagttatg attgtactaa tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 3 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Engineered antibody sequence <400> 3 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 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gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350 <210> 4 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Engineered antibody sequence <400> 4 gctatccaga tgacccagtc tccttcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggccagtca gagcattaac aatgagttat cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatagg gcatccactc tggcatctgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag ggttatagtc tgaggaacat tgataatgct 300 ttcggcggag ggaccaaggt ggaaatcaaa cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360 ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540 accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 5 Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Gly <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 6 Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ala Ala Leu Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 7 Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ile Ser Ala <210> 8 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 8 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Glu Gly Val Ser Leu 20 25 30 Glu Lys Arg 35 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 9 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val 20 <210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 10 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Ser Leu Glu Lys Arg 20 25 <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 11 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Glu Gly Val Ser Leu 20 25 30 Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu Ala 35 40 <210> 12 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 12 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg 85 <210> 13 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 13 Met Thr Lys Pro Thr Gln Val Leu Val Arg Ser Val Ser Ile Leu Phe 1 5 10 15 Phe Ile Thr Leu Leu His Leu Val Val Ala Leu Asn Asp Val Ala Gly 20 25 30 Pro Ala Glu Thr Ala Pro Val Ser Leu Leu Pro Arg 35 40 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 14 Met Phe Ser Pro Ile Leu Ser Leu Glu Ile Ile Leu Ala Leu Ala Thr 1 5 10 15 Leu Gln Ser Val Phe Ala 20 <210> 15 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 15 Met Gln Thr Leu Leu Val Ser Ser Leu Val Val Ser Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Leu Pro His Tyr Ile Arg 20 <210> 16 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 16 Met Ile Phe Leu Lys Leu Ile Lys Ser Ile Val Ile Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 Val Ser Ala Ile Gln Ala 20 <210> 17 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 17 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg 20 <210> 18 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 18 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser <210> 19 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 19 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala 20 <210> 20 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 20 Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro 20 <210> 21 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 21 Met Ala Ala Asp Ser Gln Thr Pro Trp Leu Leu Thr Phe Ser Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Leu Trp Pro Gln Glu Pro Gly Ala 20 25 <210> 22 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 22 Met Lys Lys Asn Arg Met Met Met Met Ile Trp Ser Val Gly Val Val 1 5 10 15 Trp Met Leu Leu Leu Val Gly Gly Ser Tyr Gly 20 25 <210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 23 Met Gln Lys Leu Ile Ile Phe Ala Leu Val Val Leu Cys Val Gly Ser 1 5 10 15 Glu Ala <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 24 Met Lys Ala Leu Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val 1 5 10 15 Gln Gly <210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 25 Met Val Asp Gly Val Met Ile Leu Pro Val Leu Ile Met Ile Ala Leu 1 5 10 15 Pro Ser Pro Ser 20 <210> 26 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 26 Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Gly <210> 27 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 27 Met Leu Ser Leu Lys Pro Ser Trp Leu Thr Leu Ala Ala Leu Met Tyr 1 5 10 15 Ala Met Leu Leu Val Val Val Pro Phe Ala Lys Pro Val Arg Ala 20 25 30 <210> 28 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 28 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Lys Cys 20

Claims (27)

  1. 원하는 다중 서브유닛 단백질을 생산하는 방법으로서,
    (a) 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질의 발현을 제공하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 효모 세포를 제1 온도에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 효모 세포를 제2 온도에서 배양하여, 상기 효모 세포가 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질을 생산하도록 하며, 상기 배양이 유가식 시기(fed batch phase)를 포함하는 것인 단계
    를 포함하고;
    (i) 상기 효모 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포이고;
    (ii) 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질은 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함하는 전체 길이의 항체를 포함하며;
    (iii) 상기 제1 온도는 27.5℃ 내지 28.5℃이고, 상기 제2 온도는 30℃ 내지 31℃이고;
    (iv) 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 전사를 조절하는 프로모터 또는 프로모터들은 온도 유도성이 아니며;
    (v) 단계 (a)는 글리세롤을 탄소 공급원으로서 포함하는 배양 배지에서 상기 피치아 파스토리스 세포를 상기 글리세롤이 고갈될 때까지 배양하는 것을 포함하고;
    (vi) 상기 방법은 글리세롤의 고갈과 동시에 배양액에 에탄올 볼루스를 첨가하는 것을 포함하며;
    (vii) 상기 방법은 상기 단백질의 수율을 증가시키거나, 상기 제1 온도와 상기 제2 온도 사이의 차이 없이 시행되는 동일한 방법에 비해 하나 이상의 생성물 관련 변이형들의 상대적인 존재비를 감소시키거나, 상기 단백질의 수율을 증가시키고 상기 제1 온도와 상기 제2 온도 사이의 차이 없이 시행되는 동일한 방법에 비해 하나 이상의 생성물 관련 변이형들의 상대적인 존재비를 감소시키는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 온도는 상기 제1 온도보다 높은 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    i) 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질이 인간 항체, 또는 인간화 항체를 포함하거나;
    ii) 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질이 IL-6, TNF알파, CGRP, PCSK9, HGF 또는 NGF에 대해 특이적인 인간 항체, 또는 인간화 항체를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 방법은, 상기 제1 온도와 상기 제2 온도 사이의 차이 없이 시행되는 동일한 방법에 비해, 크기 배제 크로마토그래피 또는 겔 전기영동법에 의해 검출된 바와 같이, 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질보다 크거나 작은 겉보기 분자량을 갖는 생성물 관련 변이형들의 상대적인 존재비를 감소시키는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 방법은, 상기 제1 온도와 상기 제2 온도 사이의 차이 없이 시행되는 동일한 방법에 비해, 특이한 이황화 결합을 갖는 복합체들의 상대적인 존재비를 감소시키는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 방법은, 상기 제1 온도와 상기 제2 온도 사이의 차이 없이 시행되는 동일한 방법에 비해, 감소된 시스테인을 갖는 복합체들의 상대적인 존재비를 감소시키는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 방법은, 상기 제1 온도와 상기 제2 온도 사이의 차이 없이 시행되는 동일한 방법에 비해, 특이한 당화를 갖는 복합체들의 상대적인 존재비를 감소시키는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질의 발현을 제공하는 유전자들은 하나 이상의 유전자좌에 통합되거나; 또는
    (ii) 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질의 발현을 제공하는 유전자들은 하나 이상의 유전자좌에 통합되고, 추가로 상기 유전자좌 중 적어도 하나는 pGAP 유전자좌, 3' AOX TT 유전자좌; PpURA5; OCH1; AOX1; HIS4; GAP; pGAP; 3' AOX TT; ARG; 및 HIS4 TT 유전자좌로 이루어지는 군으로부터 선택되거나; 또는
    (iii) 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질의 상기 서브유닛들을 암호화하는 유전자들 중 적어도 하나는 유도성 또는 항시성 프로모터의 제어 하에서 발현되거나; 또는
    (iv) 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질의 상기 서브유닛들을 암호화하는 유전자들 중 적어도 하나는 유도성 또는 항시성 프로모터의 제어 하에서 발현되고, 추가로 상기 유도성 프로모터는 AOX1, CUP1, 테트라사이클린 유도성, 티아민 유도성 및 FLD1 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되거나; 또는
    (v) 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질은 CUP1, AOX1, ICL1, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAP), FLD1, ADH1, 알코올 탈수소효소 II, GAL4, PHO3, PHO5 및 Pyk 프로모터, 테트라사이클린 유도성 프로모터, 티아민 유도성 프로모터, 이로부터 유래된 키메라 프로모터, 효모 프로모터, 포유류 프로모터, 곤충 프로모터, 식물 프로모터, 파충류 프로모터, 양서류 프로모터, 바이러스 프로모터 및 조류 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택된 프로모터의 제어 하에서 발현되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 피치아 파스토리스 세포는 반수체, 이배체, 사배체 또는 다배수체 세포인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질을 상기 피치아 파스토리스 세포로부터 또는 배양 배지로부터 정제하는 단계를 더 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질은 상기 피치아 파스토리스 세포의 세포 내 성분, 세포질, 핵원형질 또는 막으로부터 정제되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 피치아 파스토리스 세포는 상기 원하는 다중 서브유닛 단백질을 배양 배지로 분비하는 것인 방법.
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