JP6412552B2 - 酵母及び他の形質転換細胞中のポリペプチドの高収率発現のための温度シフト - Google Patents

Description

関連出願の開示

本願は、「ＴＥＭＰＥＲＡＴＵＲＥ ＳＨＩＦＴ ＦＯＲ ＨＩＧＨ ＹＩＥＬＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＡＮＤ ＯＴＨＥＲ ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＥＤ ＣＥＬＬＳ」と題する２０１３年３月１５日出願の米国仮出願第６１／７９１，４７１号の利益を主張し、２０１３年３月１５日出願の米国仮出願第６１／７９０，６１３号の利益も主張し、それらのそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

本願は、２０１４年３月１３日に作成された、「４３２５７ｏ３４１３．ｔｘｔ」という名の、１４，２８６バイトのサイズを有するファイル中に含有される、生物学的配列表を、その開示の一部として含み、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、概して、酵母及び他の細胞中で所望のタンパク質を生成するための方法に関する。抗体を含む、単一及びマルチサブユニットタンパク質を発現させるために使用され得る方法が、本開示に含まれる。例示的な実施形態では、細胞は、ピキア・パストリスなどの酵母である。本方法の実施形態は、従来の方法と比較して、収率が増加した抗体または他の所望のタンパク質を生成することができる。加えて、本発明は、発酵の分野に関する。具体的には、本発明は、組み換え酵母細胞の発酵に関する。

多数の組み換え生成されたタンパク質は、ヒトの治療用途に対する規制当局の承認を受けている。ますます多くのこれらの治療用タンパク質は、微生物発現系において生成される。実際に、近年の調査によると、微生物発現系は、米国食品医薬品局または欧州医薬品庁によって２００９年１月までに許可された１５１個のタンパク質ベースの組み換え製剤のほぼ半分の生成に使用される（Ｆｅｒｒｅｒ−Ｍｉｒａｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２００９，８：１７）。

これらの組み換え生成されたタンパク質の中には、抗体があり、それは従来、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖からなる四量体タンパク質である。何百もの治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が現在、市場に出ているか、または開発中である。機能的抗体の生成は概して、２つのポリペプチド鎖の合成、ならびにＮ末端分泌シグナル配列のタンパク質分解処理；ポリペプチドの四量体への適切な折り畳み及び集合；ジスルフィド結合の形成；及び典型的には特異的Ｎ結合型グリコシル化を含む、多くの翻訳後事象を伴う。

酵母ピキア・パストリスは、治療用途の組み換えタンパク質の製造のための産生宿主として以前使用されてきた。例としては、ヒト血清アルブミン及びカリクレイン阻害剤、エカランチドの生成が挙げられる（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｊ．ｍＡｂｓ ４：３ １−３，２０１２）。ピキア・パストリスは、正しく集合した重鎖及び軽鎖を有する組み換えモノクローナル抗体の生成にために使用されてきた（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９２７，８６３号）。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモータは、酵母中のＮ−グリコシル化を欠く抗体の発現を促進し得る（米国特許第７，９２７，８６３号）。

組み換え抗体Ｆａｂフラグメントを生成するためにＧＡＰ系を使用する、Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．による近年の研究（ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１１，１２：２１８）は、構成的であると以前考えられていたこの系が、グルコースを炭素及びエネルギー源として使用した、低酸素条件下での発現の増加を示している。低酸素条件は、発酵における溶存酸素濃度が非常に低いレベルまで低下することを可能にする一方でなお、通気及び撹拌を通して培養物に酸素を供給する条件である。これは、混合型の好気及び発酵代謝をもたらす。発酵槽中の低酸素条件の使用は、エタノールの毒性蓄積をもたらし得、毒性レベルが蓄積しないように過程を制御するために、注意が払われなければならない。Ｂａｕｍａｎｎは、発酵槽中のエタノールのレベルを測定し、その蓄積を低減するようにグルコース供給速度を調節することによって、これを達成した。しかしながら、この方法は、大型発酵槽中のエタノールを確実に測定するための技術が広く利用可能ではないため、あまり拡張性がない。

メチロトローフ酵母ピキア・パストリスなどの真菌宿主は、それらが大量の内因性タンパク質を分泌しないこと、異種タンパク質を生成するために利用可能な強力な誘導性プロモータを有すること、既知組成培地中で、かつ動物血清の使用なしで増殖され得ること、及び高力価の組み換えタンパク質を生成することができることを含む、治療用タンパク質発現のための明確な利点を有する（Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２４：４５−６６（２０００））。本発明者らによって実施された研究を含む従来の研究は、研究、診断、及び治療用途に好適である機能的抗体を生成するための費用効率の良いプラットフォームとして、ピキア・パストリスを確立するのに役立った。それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、共同所有された米国特許第７，９２７，８６３号及び同第７，９３５，３４０号を参照されたい。方法はまた、組み換えタンパク質の発現のためのピキア・パストリス発酵の設計に関する文献においても既知であり、細胞密度、培養液体積、ｐＨ、基質供給速度、及び各反応相の長さを含むパラメータに関する最適化が記載されてきた。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ ａｎｄ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ”ｉｎ Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｄ．，２００７，Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３８９，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ｐｇｓ．４３−６３を参照されたい。

加えて、本出願者ら及びその他による従来の研究は、生成相の開始時または開始間近に、培養物へのエタノールボーラス添加を含む方法を通して、酵母中のタンパク質の生成を増加させること、かつ抗体などのマルチサブユニットタンパク質に対して、遺伝子コピーの数及びサブユニット遺伝子間のコピー数の比を変化させることを説明している。それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、「Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ Ｓｔｒａｔｅｇｙ Ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ｔｉｔｅｒ Ａｎｄ Ｈｉｇｈ−Ｐｕｒｉｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｕｃｈ Ａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｓｕｃｈ Ａｓ Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ」と題する、ＵＳ２０１３００４５８８８；及び「Ｈｉｇｈ−Ｐｕｒｉｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｕｃｈ Ａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｓｕｃｈ Ａｓ Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ」と題する、ＵＳ２０１２０２７７４０８を参照されたい。

上記のＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．の論文は、上記のパラメータを最適化するための系統的アプローチを説明し、かつこれらのパラメータの一部の間の相互作用を理解するための理論的アプローチを示すためにかなりの努力をしているが、発現最適化は、大いに経験的な過程のままである。この相互作用のために、全ての他のパラメータを一定に保ちながら、各個々のパラメータを最適化することは、概して不十分である。例えば、最適な培地組成は、培養密度、菌株の背景、供給速度、撹拌、酸素化によって異なってもよい。この複合体の相互作用のため、試験され得るパラメータの組合せの数は、潜在的に無限であり、発現系が広く最適化されている場合でさえ、収率及び／または純度に役立ち得る多数の未試験の条件が常に残っている。

以下にさらに記載されるように、出願者らは、酵母などの真核細胞中で生成される所望のタンパク質の収率を大幅に増加させる方法を特定した。すでに高度に最適化されている発現系に対してでさえ、本方法は、所望のタンパク質の収率を最大で約３０％増加させた。

一態様では、本開示は、所望のタンパク質を生成する方法を提供し、（ａ）第１の温度で、上記の所望のタンパク質の発現を提供する、１つ以上の遺伝子を含む、真核細胞を培養することと、（ｂ）第２の温度で上記の真核細胞を培養し、上記の真核細胞が上記の所望のタンパク質を生成することを可能にすることと、を含み、上記の第２の温度は、上記の第１の温度とは異なる。任意に、上記の培養は、（ａ）フェドバッチ発酵条件下で、培養培地中で酵母細胞集団を培養するステップであって、各酵母細胞は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を含み、上記のＤＮＡ断片は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）転写プロモータ及び転写ターミネータに作動可能に連結され、タンパク質は、グリセルアルデヒド−３−リン酸ではなく、発酵は、第１の供給速度での発酵性糖供給を含み、発酵は、第１の酸素移動速度で撹拌される、ステップと、（ｂ）バッチ発酵中の集団の呼吸商（ＲＱ）を測定し、それが所望の所定の範囲内であるか決定するステップであって、培養の開始後約２０〜４０時間におけるＲＱの所望の所定の範囲は、約１．０８〜約１．３５である、ステップと、（ｃ）ＲＱが所望の所定の範囲外であるとき、発酵性糖供給速度の第２の供給速度への調節または酸素移動速度の第２の酸素移動速度への調節のうちの片方または両方を行うステップと、（ｄ）培養ステップ全体にわたって１回以上、ステップ（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すステップと、（ｅ）培養培地から酵母細胞を採取するステップと、（ｆ）細胞及び／または培養培地からポリペプチドを回収するステップと、を含んでもよい。

上記の第１の温度は、約２０℃〜約３２℃であってもよい。

上記の第１の温度は、約２４℃〜約３１．５℃であってもよい。

上記の第１の温度は、約２７℃〜約３１℃であってもよい。

上記の第１の温度は、約２７．５℃〜約３０℃であってもよい。

上記の第１の温度は、約２０℃〜約２９．５℃であってもよい。

上記の第１の温度は、約２４℃〜約２９℃であってもよい。

上記の第１の温度は、約２７℃〜約２８．５℃であってもよい。

上記の第１の温度は、約２７．５℃〜約２８．５℃であってもよい。

上記の第２の温度は、上記の第１の温度よりも約１℃〜約６℃高くてもよい。

上記の第２の温度は、上記の第１の温度よりも約１℃〜約３℃高くてもよい。

上記の第２の温度は、上記の第１の温度よりも約２℃〜約４℃高くてもよい。

上記の第２の温度は、上記の第１の温度よりも約２℃〜約３℃高くてもよい。

上記の第２の温度は、約３０℃〜約３４℃であってもよい。

上記の第２の温度は、約３０℃〜約３２℃であってもよい。

上記の第２の温度は、約３０℃〜約３１．５℃であってもよい。

上記の第２の温度は、約３０℃または約３１℃であってもよい。

上記の第２の温度は、上記の第１の温度よりも高くてもよい。

上記の所望のタンパク質は、マルチサブユニット複合体を含む。

上記のマルチサブユニット複合体は、抗体を含んでもよい。

上記の抗体は、ヒトまたはヒト化であってもよい。

上記の抗体は、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＣＧＲＰ、ＰＣＳＫ９、ＨＧＦ、またはＮＧＦに特異的であってもよい。

上記の方法は、上記の所望のタンパク質の収率を増加させてもよい。

上記の方法は、上記の第１の温度と上記の第２の温度との間の差なしで達成される同じ方法に対して、１つ以上の産物関連変異体の相対存在量を減少させてもよい。

上記の方法は、上記の第１の温度と上記の第２の温度との間の差なしで達成される同じ方法に対して、サイズ排除クロマトグラフィまたはゲル電気泳動によって検出されるような、上記の所望のマルチサブユニット複合体よりも高いまたは低い見かけの分子量を有する、産物関連変異体の相対存在量を減少させてもよい。

上記の方法は、上記の第１の温度と上記の第２の温度との間の差なしで達成される同じ方法に対して、異常なジスルフィド結合を有する複合体の相対存在量を減少させてもよい。

上記の方法は、上記の第１の温度と上記の第２の温度との間の差なしで達成される同じ方法に対して、減少したシステインを有する複合体の相対存在量を減少させてもよい。

上記の方法は、上記の第１の温度と上記の第２の温度との間の差なしで達成される同じ方法に対して、異常なグリコシル化を有する複合体の相対存在量を減少させてもよい。

上記の方法は、上記の第１の温度と上記の第２の温度との間の差なしで達成される同じ方法に対して、１つ以上の産物関連変異体の相対存在量を減少させてもよい。

上記の真核細胞は、酵母細胞を含んでもよい。

上記の酵母細胞は、メチロトローフ酵母を含んでもよい。

上記のメチロトローフ酵母は、ピキア属であってもよい。

ピキア属の上記のメチロトローフ酵母は、ピキア・パストリスであってもよい。

ピキア属の上記のメチロトローフ酵母は、ピキア・アンガスタ、ピキア・ギリエルモンディイ、ピキア・メタノリカ、及びピキア・イノシトベラからなる群より選択されてもよい。

上記の所望のタンパク質の発現を提供する遺伝子は、１つ以上のゲノム遺伝子座に組み込まれてもよい。

上記のゲノム遺伝子座のうちの少なくとも１つは、ｐＧＡＰ遺伝子座、３’ＡＯＸ ＴＴ遺伝子座；ＰｐＵＲＡ５；ＯＣＨ１；ＡＯＸ１；ＨＩＳ４；ＧＡＰ；ｐＧＡＰ；３’ＡＯＸ ＴＴ；ＡＲＧ；及びＨＩＳ４ ＴＴ遺伝子座からなる群より選択されてもよい。

上記の所望のタンパク質の上記のサブユニットをコードする遺伝子のうちの少なくとも１つは、誘導性または構成的プロモータの制御下で発現されてもよい。

上記の誘導性プロモータは、ＡＯＸ１、ＣＵＰ１、テトラサイクリン誘導性、チアミン誘導性、及びＦＬＤ１プロモータからなる群より選択されてもよい。

ステップ（ａ）は、グリセロールが枯渇するまで、上記のグリセロールを炭素源として含む培養培地中で、上記の真核細胞を培養することを含んでもよい。

上記の所望のタンパク質は、ＣＵＰ１、ＡＯＸ１、ＩＣＬ１、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、ＦＬＤ１、ＡＤＨ１、アルコールデヒドロゲナーゼＩＩ、ＧＡＬ４、ＰＨＯ３、ＰＨＯ５、及びＰｙｋプロモータ、テトラサイクリン誘導性プロモータ、チアミン誘導性プロモータ、それから得られるキメラプロモータ、酵母プロモータ、哺乳類プロモータ、昆虫プロモータ、植物プロモータ、爬虫類プロモータ、両生類プロモータ、ウイルスプロモータ、及び鳥類プロモータからなる群より選択されるプロモータの制御下で発現されてもよい。

上記の真核細胞は、２倍体、４倍体細胞、または倍数体であってもよい。

方法は、上記の真核細胞から、または培養培地から上記の所望のタンパク質を精製することをさらに含んでもよい。

上記の所望のタンパク質は、上記の真核細胞の細胞内成分、細胞質、核質、または膜から精製されてもよい。

上記の真核細胞は、上記の所望のタンパク質を培養培地中に分泌してもよい。

ステップ（ａ）は、バッチ相を含んでもよい。

上記のバッチ相は、炭素源を含む培地中で真核細胞を培養することを含んでもよい。

上記のバッチ相の終了は、培養培地中の炭素源の枯渇によって決定されてもよい。

ステップ（ｂ）は、フェドバッチ相を含んでもよい。

呼吸商（ＲＱ）は、ステップ（ｂ）中に指定値で、または指定範囲中で維持されてもよい。

上記の指定されたＲＱ値は、約１．１２であってもよい。

上記の指定されたＲＱ範囲は、約１．０〜１．２４、または約１．０６〜１．１８、または約１．０９〜１．１５であってもよい。

上記のＲＱ値または上記のＲＱ範囲は、供給速度、供給組成、送気流量、撹拌速度、及び／または送気の酸素濃度のうちの１つ以上を調整することによって維持されてもよい。

方法は、バッチ相及びフェドバッチ相を含んでもよい。

バッチ相は、上記の炭素源が枯渇するまで、炭素源で真核細胞を培養することを含んでもよい。上記の炭素源は、グリセロール、グルコース、エタノール、クエン酸塩、ソルビトール、キシロース、トレハロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、メリビオース、ラクトース、マルトース、ラムノース、リボース、マンノース、マンニトール、及びラフィノースのうちの１つ以上を含んでもよく、好ましくはグリセロールを含む。

フェドバッチ相は、バッチ相後に開始されてもよい。

温度シフトは、バッチ相の終了時または終了間近、フェドバッチ相の開始時または開始間近、バッチ相とフェドバッチ相との間に達成されてもよい。

例えば、温度シフトは、炭素源の枯渇後、または供給物添加を開始する前、または供給物添加を開始した後に達成されてもよい。

好ましくは、温度シフトは、供給物添加を開始した後５時間未満、例えば、供給物添加を開始した後４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、３０分未満、２０分未満、または５分未満に達成される。しかしながら、温度シフトは、より早いまたは遅い時間に達成されてもよい。

方法は、培養物へのエタノールボーラス添加を含んでもよい。エタノールボーラスは、初期の培養物に添加される炭素源の枯渇と同時に添加されてもよく、それは、溶存酸素濃度（溶存酸素スパイク）の急速な増加によって、または他の手段によって検出されてもよい。

エタノールボーラスは、約０．０１％〜約４％、約０．０２％〜約３．７５％、約０．０４％〜約３．５％、約０．０８％〜約３．２５％、約０．１％〜約３％、約０．２％〜約２．７５％、約０．３％〜約２．５％、約０．４％〜約２．２５％、約０．５％〜約１．５％、約０．５％〜約２％、約０．６％〜約１．７５％、約０．７％〜約１．５％、または約０．８％〜約１．２５％の培養物（ｃｕｔｌｔｕｒｅ）中のエタノールの濃度をもたらしてもよい。

エタノールボーラスは、少なくとも約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１０％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、または０．９％（重量／体積）であってもよい培養物中のエタノールの濃度をもたらしてもよい。

エタノールボーラスは、最大で約４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．８％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３５％、０．３％、０．２５％、０．２％、または０．１５％（重量／体積）であってもよい培養物中のエタノールの濃度をもたらしてもよい。

エタノールボーラスを添加するステップは、上記の培養物にエタノールを添加すること、上記の培養物にエタノールを含む担体を添加すること、エタノールを含む培地もしくは担体に上記の細胞を添加すること、または培養培地の一部を交換することを含んでもよい。

上記の所望のタンパク質は、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む、１つ以上のポリペプチドを含有してもよい。

上記の所望のタンパク質は、マルチサブユニット複合体を含んでもよい。

上記のマルチサブユニット複合体は、抗体を含んでもよい。

方法は、温度シフトの非存在下で達成される同じ方法に対して、１つ以上の産物関連変異体の相対存在量を減少させてもよい。

方法は、温度シフトの非存在下で達成される同じ方法に対して、サイズ排除クロマトグラフィまたはゲル電気泳動によって検出されるような、上記の所望のマルチサブユニット複合体よりも高いまたは低い見かけの分子量を有する、産物関連変異体の相対存在量を減少させてもよい。

方法は、温度シフトの非存在下で達成される同じ方法に対して、異常な化学量論を有する複合体の相対存在量を減少させてもよい。

方法は、温度シフトの非存在下で達成される同じ方法に対して、異常なジスルフィド結合を有する複合体の相対存在量を減少させてもよい。

方法は、真核細胞に供給物を添加することを含んでもよい。

呼吸商（ＲＱ）値は、指定値で、または指定範囲中で維持されてもよい。上記の指定されたＲＱ値は、１．１２であってもよい。上記の指定されたＲＱ範囲は、例えば、１．０〜１．２４、または１．０６〜１．１８、または１．０９〜１．１５であってもよい。

指定されたＲＱ値または範囲は、グルコースの濃度、酸素の利用率、撹拌の強度、ガス圧力、送気または他のガス混合物の流量、培養物の粘度、培養密度、送気または他のガス混合物中の酸素の濃度、及び温度のうちの１つ以上を調整（増加または減少）することによって維持されてもよい。例えば、供給物添加の速度（供給速度）は、例えば、指定されたＲＱ値または範囲を維持するために、呼吸商（ＲＱ）を制御するために調整（増加または減少）されてもよい。

上記の供給物は、少なくとも１つの発酵性炭素源を含んでもよい。

上記の炭素源は、グリセロール、グルコース、エタノール、クエン酸塩、ソルビトール、キシロース、トレハロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、メリビオース、ラクトース、マルトース、ラムノース、リボース、マンノース、マンニトール、及びラフィノースのうちの１つ以上を含んでもよい。

上記の所望のタンパク質の発現を提供する遺伝子は、１つ以上のゲノム遺伝子座に組み込まれてもよい。

上記のゲノム遺伝子座のうちの少なくとも１つは、ｐＧＡＰ遺伝子座、３’ＡＯＸ ＴＴ遺伝子座；ＰｐＵＲＡ５；ＯＣＨ１；ＡＯＸ１；ＨＩＳ４；ＧＡＰ；ｐＧＡＰ；３’ＡＯＸ ＴＴ；ＡＲＧ；及びＨＩＳ４ ＴＴ遺伝子座からなる群より選択されてもよい。

マルチサブユニット複合体の上記のサブユニットをコードする遺伝子のうちの少なくとも１つは、誘導性または構成的プロモータの制御下で発現されてもよい。

上記の誘導性プロモータは、ＡＯＸ１、ＣＵＰ１、テトラサイクリン誘導性、チアミン誘導性、及びＦＬＤ１プロモータからなる群より選択されてもよい。

マルチサブユニット複合体の上記のサブユニットをコードする遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＵＰ１、ＡＯＸ１、ＩＣＬ１、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、ＦＬＤ１、ＡＤＨ１、アルコールデヒドロゲナーゼＩＩ、ＧＡＬ４、ＰＨＯ３、ＰＨＯ５、及びＰｙｋプロモータ、テトラサイクリン誘導性プロモータ、チアミン誘導性プロモータ、それから得られるキメラプロモータ、酵母プロモータ、哺乳類プロモータ、昆虫プロモータ、植物プロモータ、爬虫類プロモータ、両生類プロモータ、ウイルスプロモータ、及び鳥類プロモータからなる群より選択されるプロモータの制御下で発現されてもよい。

上記の真核細胞は、２倍体、４倍体細胞、または倍数体であってもよい。

方法は、上記の真核細胞から、または培養培地から上記のマルチサブユニット複合体を精製することをさらに含んでもよい。

上記のマルチサブユニット複合体は、上記の真核細胞の細胞内成分、細胞質、核質、または膜から精製されてもよい。

上記の真核細胞は、上記の所望のタンパク質を培養培地中に分泌する。

上記の所望のタンパク質は、上記の培養培地から精製されてもよい。

上記の所望のタンパク質は、単一特異性または二重特異性抗体を含んでもよい。

上記の所望のタンパク質は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体、またはそのフラグメントを含んでもよい。

上記のヒト化抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウシ由来であってもよい。

上記のヒト化抗体は、ウサギ由来であってもよい。

上記の所望のタンパク質は、一価、二価、または多価抗体を含んでもよい。

上記の抗体は、タンパク質Ａ及び／またはタンパク質Ｇ親和性によって、上記の培養から精製されてもよい。

上記の所望のタンパク質の発現を提供する遺伝子のうちの少なくとも１つは、上記の真核細胞中の発現のために最適化されてもよい。

上記の所望のタンパク質は、抗体を含んでもよく、上記の抗体の純度は、予想される見かけの流体力学半径を有する抗体複合体中に含有され得る、予想される分子量を有する抗体複合体中に含有され得る、及び／または上記の抗体の標的に特異的に結合する、上記の真核細胞によって生成される抗体の分画を測定することによって評価されてもよい。

上記の所望のタンパク質は、抗体を含んでもよく、上記の抗体の収率は、異常にグリコシル化され得る、予想される見かけの流体力学半径を有する複合体以外の抗体複合体中に含有され得る、予想される分子量を有する抗体複合体中に含有され得る、及び／または上記の抗体の標的に特異的に結合することができない、任意の産物関連変異体を考慮に入れない、上記の真核細胞によって生成される抗体の量を決定することによって評価されてもよい。

上記の抗体複合体の分子量は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されてもよい。

上記の所望のタンパク質は、抗体を含んでもよく、上記の方法は、上記の抗体を精製することをさらに含んでもよい。

上記の培養細胞は、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３００ｍｇ／Ｌ、１００〜３００ｍｇ／Ｌ、１００〜５００ｍｇ／Ｌ、１００〜１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２５０ｍｇ／リットル、少なくとも１５００ｍｇ／リットル、少なくとも約１７５０ｍｇ／リットル、少なくとも約２０００ｍｇ／リットル、少なくとも約１００００ｍｇ／リットル、またはそれ以上の上清抗体力価を生成してもよい。

上記の所望のタンパク質は、マルチサブユニット複合体を含んでもよく、上記のマルチサブユニット複合体の１つ以上のサブユニットは、２つ以上の遺伝子コピーから発現されてもよい。

上記の所望のタンパク質は、上記の抗体の軽鎖をコードする遺伝子の１〜１０個のコピー、及び上記の抗体の重鎖をコードする遺伝子の１〜１０個のコピーから発現されてもよい、抗体を含んでもよい。

上記の所望のタンパク質の発現を提供する遺伝子（複数可）は、上記の細胞のゲノムに組み込まれてもよい。

上記の所望のタンパク質の発現を提供する遺伝子（複数可）は、染色体外要素、プラスミド、または人工染色体上に含有されてもよい。

上記の細胞は、上記の抗体の重鎖の発現を提供する遺伝子のコピーよりも多い、上記の抗体の軽鎖の発現を提供する遺伝子のコピーを含んでもよい。

上記の細胞中の上記の抗体の重鎖をコードする遺伝子のコピー数及び上記の抗体の軽鎖をコードする遺伝子のコピー数のそれぞれは、２及び２、２及び３、３及び３、３及び４、３及び５、４及び３、４及び４、４及び５、４及び６、５及び４、５及び５、５及び６、または５及び７であってもよい。

上記の細胞中の上記の抗体の重鎖をコードする遺伝子のコピー数及び上記の抗体の軽鎖をコードする遺伝子のコピー数のそれぞれは、２及び１、３及び１、４及び１、５及び１、６及び１、７及び１、８及び１、９及び１、１０及び１、１及び２、２及び２、３及び２、４及び２、５及び２、６及び２、７及び２、８及び２、９及び２、１０及び２、１及び３、２及び３、３及び３、４及び３、５及び３、６及び３、７及び３、８及び３、９及び３、１０及び３、１及び４、２及び４、３及び４、４及び４、５及び４、６及び４、７及び４、８及び４、９及び４、１０及び４、１及び５、２及び５、３及び５、４及び５、５及び５、６及び５、７及び５、８及び５、９及び５、１０及び５、１及び６、２及び６、３及び６、４及び６、５及び６、６及び６、７及び６、８及び６、９及び６、１０及び６、１及び７、２及び７、３及び７、４及び７、５及び７、６及び７、７及び７、８及び７、９及び７、１０及び７、１及び８、２及び８、３及び８、４及び８、５及び８、６及び８、７及び８、８及び８、９及び８、１０及び８、１及び９、２及び９、３及び９、４及び９、５及び９、６及び９、７及び９、８及び９、９及び９、１０及び９、１及び１０、２及び１０、３及び１０、４及び１０、５及び１０、６及び１０、７及び１０、８及び１０、９及び１０、１０及び１０であってもよい。

本開示の方法を使用して、望ましくない副産物（複数可）の相対存在量は、従来の方法に対して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％減少されてもよく、または初期の存在レベルと比較して検出不可能なレベルまで減少されてもよい。相対存在量がそのように減少され得る、例示的な望ましくない副産物は、所望のマルチサブユニット複合体とは異なる見かけの分子量を有する、１つ以上の種を含んでもよい。例えば、見かけの分子量は、化学量論、折り畳み、複合体集合、及び／またはグリコシル化の差の影響を受ける可能性がある。例えば、そのような望ましくない副産物は、サイズ排除クロマトグラフィ及び／またはゲル電気泳動を使用して検出されてもよく、所望のマルチサブユニット複合体よりも高いまたは低い見かけの分子量を有してもよい。例示的な実施形態では、望ましくない副産物は、還元条件下で検出されてもよい。他の例示的な実施形態では、望ましくない副産物は、非還元条件下で検出されてもよい。

例示的な実施形態では、本開示はまた、高い収率で、抗体及び他のマルチサブユニット複合体の組み換え生成を提供する、改善された方法及び組成物も提供する。例示的な実施形態では、収率は、本明細書に開示される方法を使用して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、またはそれ以上（従来の方法に対して）増加されてもよい。

例示的な実施形態では、所望のタンパク質が生成され得る真核細胞は、例えば、ピキア・パストリスもしくは別のメチロトローフ酵母などのピキア種の酵母、またはサッカロミセス・セレビシアなどのサッカロミセス種の酵母、もしくはシゾサッカロミセス（例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ）などの別の酵母であってもよい。本発明で利用され得るメチロトローフ酵母の他の例としては、ピキア・アンガスタ（ハンセヌラ・ポリモルファとしても当該技術分野において既知）、ピキア・ギリエルモンディイ、ピキア・メタノリカ、ピキア・イノシトベラ、オガタエア・ニトラトアベルサ、及びカンジダ・ボインドニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｎｉｉ）が挙げられる。

真核細胞は、ピキア属の酵母などのメチロトローフ酵母など、酵母細胞であってもよい。ピキア属の例示的なメチロトローフ酵母としては、ピキア・パストリス、ピキア・アンガスタ、ピキア・ギリエルモンディイ、ピキア・メタノリカ、及びピキア・イノシトベラが挙げられる。宿主細胞は、接合することによって、例えば、マルチサブユニット複合体のサブユニットをコードする少なくとも１つの遺伝子の１つ以上のコピーをそれぞれ含有する、２つの１倍体酵母細胞を接合することによって生成されてもよい。

好ましい実施形態では、ピキア属のメチロトローフ酵母は、ピキア・パストリスである。真核細胞は、１倍体、２倍体、または４倍体細胞であってもよい。

上記の所望のタンパク質をコードする遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＵＰ１（培地中の銅レベルによって誘導される。Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ ２０００；１６：６５１−６５６を参照されたい）、テトラサイクリン誘導性プロモータ（例えば、Ｓｔａｉｂ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｊａｎ．２００８，ｐ．１４６−１５６を参照されたい）、チアミン誘導性プロモータ、ＡＯＸ１、ＩＣＬ１、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、ＦＬＤ１、ＡＤＨ１、アルコールデヒドロゲナーゼＩＩ、ＧＡＬ４、ＰＨＯ３、ＰＨＯ５、及びＰｙｋプロモータ、それから得られるキメラプロモータ、酵母プロモータ、哺乳類プロモータ、昆虫プロモータ、植物プロモータ、爬虫類プロモータ、両生類プロモータ、ウイルスプロモータ、及び鳥類プロモータなど、誘導性または構成的プロモータの制御下で発現されてもよい。

真核細胞は、上記の所望のタンパク質を培養培地中に分泌してもよい。例えば、上記の所望のタンパク質は、分泌シグナルペプチドを含んでもよい。あるいは、または加えて、上記の所望のマルチサブユニット複合体は、上記の宿主細胞中に保持されてもよく、それから単離されてもよい。

所望のタンパク質は、単一特異性または二重特異性抗体などの抗体を含んでもよい。抗体は、任意の抗原に特異的に結合する抗体であってもよい。

所望のタンパク質は、任意の種類の抗体を含んでもよい。例示的な抗体の種類としては、任意の哺乳類種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシなどの抗体が挙げられる。好ましくは、抗体は、ヒト抗体、またはウサギ由来であってもよいヒト化抗体である。抗体は、一価、二価、または多価抗体であってもよい。

上記の真核細胞中の所望の抗体の軽鎖及び／または重鎖などの所望のタンパク質の発現を提供する上記の遺伝子のうちの少なくとも１つは、上記の宿主細胞中の発現のために最適化されてもよい（例えば、好ましいコドンを選択する、及び／またはコドン選択を通してＡＴの割合を変化させることによって）。

所望の抗体などの上記の所望のタンパク質の純度は、非グリコシル化である、予想される見かけの流体力学半径及び／もしくは見かけの分子量（例えば、サイズ排除クロマトグラフィによって測定される）を有する複合体中に含有される、予想される電気泳動移動度（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどのゲル電気泳動、及び任意にウエスタンブロット法によって検出される）を有する、上記の宿主細胞によって生成される、所望のタンパク質の分画を測定することによって、ならびに／またはマルチサブユニット複合体の特異的活性（例えば、所望の抗体の標的への特異的結合）を測定することによって、評価されてもよい。

所望のタンパク質は、抗体であってもよく、上記の抗体の収率は、グリコシル化される、予想される見かけの分子量もしくは流体力学半径を有する複合体以外の抗体複合体中に含有される、及び／または上記の所望の抗体の標的に特異的に結合することができない、任意の産物関連変異体を考慮に入れない、上記の宿主細胞によって生成される所望の抗体の量を決定することによって評価されてもよい。

本発明の別の実施形態によると、酵母細胞中で抗体または抗体の抗原結合フラグメントなどの所望のタンパク質を生成する方法が提供される。酵母細胞集団は、培養培地中で、フェドバッチ発酵条件下で培養される。各酵母細胞は、抗体の重鎖ポリペプチドなどの所望のタンパク質をコードするＤＮＡ断片、及び任意に軽鎖ポリペプチドなどの第２の所望のタンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む。１つ以上のＤＮＡ断片は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）転写プロモータ及び転写ターミネータに作動可能に連結される。発酵は、第１の供給速度での発酵性糖供給を含み、発酵は、第１の酸素移動速度で酸素化される。集団の呼吸商（ＲＱ）は、フェドバッチ発酵の供給相中に測定され、それは、所望の所定の範囲と比較される。ＲＱが所望の所定の範囲外であるとき、発酵性糖供給速度及び酸素移動速度のうちの片方または両方が、第２の速度に調節される。測定及び調節は、培養の全部または一部にわたって実施される。酵母細胞は、培養培地から採取される。酵母細胞によって生成される重鎖及び軽鎖ポリペプチドなどの所望のタンパク質は、酵母細胞枯渇培養培地から、または酵母細胞から回収される。

本発明の別の実施形態によると、ピキア酵母細胞中に２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む抗体を生成するための方法が提供される。ピキア酵母細胞集団は、培養培地中で、低酸素、フェドバッチ発酵条件下で培養される。各酵母細胞は、抗体の重鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片及び軽鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を含む。ＤＮＡ断片は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）転写プロモータ及び転写ターミネータに作動可能に連結される。酵母細胞は、培養培地から採取される。酵母細胞によって生成される抗体は、酵母細胞から、または酵母細胞枯渇培養培地から回収される。

本開示はまた、酸素化及び／または発酵性糖供給のレベルを調節する呼吸商測定を使用する、所望のタンパク質を作製するために、酵母細胞の発酵のためのフィードバック制御機構も提供する。フィードバック制御機構は、エタノールの毒性蓄積を回避しながら、十分な量の産物を生成する、よく制御された培養を可能にする。加えて、そのようにして生成された所望のタンパク質は、優れた均一性及び適切なサブユニット間集合など、優れた定性的性質を有する。例えば、本開示は、酵母細胞中で所望のタンパク質を生成するための方法を提供し、（ａ）培養培地中で、フェドバッチ発酵条件下で、酵母細胞集団を培養するステップであって、各酵母細胞は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を含み、上記のＤＮＡ断片は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）転写プロモータ及び転写ターミネータに作動可能に連結され、タンパク質は、グリセルアルデヒド−３−リン酸ではなく、発酵は、第１の供給速度での発酵性糖供給を含み、発酵は、第１の酸素移動速度で撹拌される、ステップと、（ｂ）バッチ発酵中に集団の呼吸商（ＲＱ）を測定し、それが所望の所定の範囲内であるか決定するステップであって、培養の開始後約２０〜４０時間におけるＲＱの所望の所定の範囲は、約１．０８〜約１．３５である、ステップと、（ｃ）ＲＱが所望の所定の範囲外であるとき、発酵性糖供給速度の第２の供給速度への調節または酸素移動速度の第２の酸素移動速度への調節のうちの片方または両方を行うステップと、（ｄ）培養ステップ全体にわたって１回以上、ステップ（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すステップと、（ｅ）培養培地から酵母細胞を採取するステップと、（ｆ）細胞及び／または培養培地からポリペプチドを回収するステップと、を含む。任意に、上記の方法は、（ａ）第１の温度で、上記の所望のタンパク質の発現を提供する１つ以上の遺伝子を含む、真核細胞を培養することと、（ｂ）第２の温度で上記の真核細胞を培養し、上記の真核細胞が上記の所望のタンパク質を生成することを可能にすることと、を含んでもよく、上記の第２の温度は、上記の第１の温度とは異なってもよく、例えば、上記の第１の温度は、約２０℃〜約３２℃、約２４℃〜約３１．５℃、約２７℃〜約３１℃、約２７．５℃〜約３０℃、約２０℃〜約２９．５℃、約２４℃〜約２９℃、約２７℃〜約２８．５℃、もしくは約２７．５℃〜約２８．５℃であってもよく、及び／または任意に、上記の第２の温度は、上記の第１の温度よりも約１℃〜約６℃、上記の第１の温度よりも約１℃〜約３℃、上記の第１の温度よりも約２℃〜約４℃、もしくは上記の第１の温度よりも約２℃〜約３℃高くてもよく、及び／または任意に、上記の第２の温度は、約３０℃〜約３４℃、約３０℃〜約３２℃、もしくは約３０℃〜約３１．５℃であってもよく、例えば、上記の第１の温度は、約２８℃であってもよく、上記の第２の温度は、約３０℃もしくは約３１℃であってもよく、または上記の第１の温度は、約２７．５℃〜約２８．５℃であってもよく、上記の第２の温度は、約３０℃〜約３１℃であってもよく、任意に、上記の第１の温度は、上記の第２の温度よりも高い。

上記のステップ（ｄ）は、約３分の間隔でなど、約１〜５分の間隔で実施されてもよい。

上記のステップ（ｄ）は、連続的に実施されてもよい。

供給速度に対する少なくとも１つの調節は、ステップ（ｃ）において行われてもよい。

ステップ（ｃ）は、ＲＱを測定するデバイスに連結されるフィードバック制御機構を使用して、自動的に実施されてもよい。

酵母細胞は、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・アンガスタ、ピキア・サーモメタノリカ、及びサッカロミセス・セレヴィシエからなる群より選択される種からであってもよい。

方法は、約８．０〜約１２．０ｇ／Ｌのエタノールの発酵中のレベルを達成するために、培養の約１０〜１４時間において酵母細胞にエタノールを送達することをさらに含んでもよい。

培養の開始後約２０〜４０時間におけるＲＱの所望の所定の範囲は、約１．０９〜約１．２５であってもよい。

採取するステップは、培養の開始後約８０〜１１０時間に実施されてもよい。

エタノール濃度は、培養ステップ中に測定されてもよく、調節は、約５ｇ／Ｌ超及び約２５ｇ／Ｌ未満のエタノール濃度を安定させるために行われてもよく、上記の調節は、発酵性糖供給速度の第３の供給速度への調節または酸素移動速度の第３の酸素移動速度への調節のうちの片方または両方を行うことによって行われてもよい。例えば、上記の調節は、約５ｇ／Ｌ超及び約１７ｇ／Ｌ未満のエタノール濃度を安定させるために行われてもよい。

発酵の２０〜１１０時間におけるＲＱの所望の所定の範囲は、約１．０８〜１．１；約１．０８〜１．１５；約１．０８〜１．２；約１．０８〜１．２５；約１．０８〜１．３；及び約１．０８〜１．３５からなる群より選択されてもよい。

測定するステップ（ｂ）は、発酵の排出ガスをサンプリングすることによって実施されてもよい。

測定するステップ（ｂ）は、質量分析計、赤外線分析器、または常磁性分析器を使用して実施されてもよい。

ステップ（ｃ）において、酸素移動速度は、ＲＱが高すぎる場合に酸素移動速度を増加させるか、あるいはＲＱが低すぎる場合に酸素移動速度を減少させることによって、調節されてもよい。

ステップ（ｃ）において、発酵性糖供給速度は、ＲＱが低すぎる場合に発酵性糖供給速度を増加させるか、あるいはＲＱが高すぎる場合に発酵性糖供給速度を減少させることによって、調節されてもよい。

ステップ（ｃ）において、発酵性糖供給速度はまた、ＲＱが低すぎる場合に発酵性糖供給速度を増加させ、かつＲＱが高すぎる場合に発酵性糖供給速度を減少させることによって、調節されてもよい。

ステップ（ｃ）は、培養の撹拌速度を調整することによって実施されてもよい。

ＤＮＡ断片は、抗体重鎖もしくは抗体軽鎖、または抗体のフラグメントをコードしてもよい。

ポリペプチドは、培養培地から採取されてもよい。

各酵母細胞は、抗体の重鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片及び軽鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を含んでもよい。

別の態様では、本開示は、ピキア酵母細胞中の２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む抗体または抗体フラグメントを生成するための方法を提供し、（ａ）培養培地中で、低酸素、フェドバッチ発酵条件下で、ピキア酵母細胞集団を培養するステップであって、各酵母細胞は、抗体の重鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片及び軽鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を含み、上記のＤＮＡ断片は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）転写プロモータ及び転写ターミネータに作動可能に連結されてもよい、ステップと、（ｂ）培養培地から酵母細胞を採取するステップと、（ｃ）酵母細胞枯渇培養培地から、酵母細胞によって生成される抗体を回収するステップと、を含む。任意に、上記の方法は、（ａ）第１の温度で、上記の所望のタンパク質の発現を提供する１つ以上の遺伝子を含む、真核細胞を培養することと、（ｂ）第２の温度で上記の真核細胞を培養し、上記の真核細胞が上記の所望のタンパク質を生成することを可能にすることと、を含んでもよく、上記の第２の温度は、上記の第１の温度とは異なってもよく、例えば、上記の第１の温度は、約２０℃〜約３２℃、約２４℃〜約３１．５℃、約２７℃〜約３１℃、約２７．５℃〜約３０℃、約２０℃〜約２９．５℃、約２４℃〜約２９℃、約２７℃〜約２８．５℃、もしくは約２７．５℃〜約２８．５℃であってもよく、及び／または任意に、上記の第２の温度は、上記の第１の温度よりも約１℃〜約６℃、上記の第１の温度よりも約１℃〜約３℃、上記の第１の温度よりも約２℃〜約４℃、もしくは上記の第１の温度よりも約２℃〜約３℃高くてもよく、及び／または任意に、上記の第２の温度は、約３０℃〜約３４℃、約３０℃〜約３２℃、もしくは約３０℃〜約３１．５℃であってもよく、例えば、上記の第１の温度は、約２８℃であってもよく、上記の第２の温度は、約３０℃もしくは約３１℃であってもよく、または上記の第１の温度は、約２７．５℃〜約２８．５℃であってもよく、上記の第２の温度は、約３０℃〜約３１℃であってもよく、任意に、上記の第１の温度は、上記の第２の温度よりも高い。

ピキア酵母細胞は、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・アンガスタ、及びピキア・サーモメタノリカからなる群より選択されてもよい。例えば、ピキア酵母細胞は、ピキア・パストリスであってもよい。

別の態様では、本開示は、（ｉ）大規模、フェドバッチ発酵条件下で、酵母細胞を培養するステップであって、上記の培養された酵母細胞は、所望のタンパク質を発現させるように操作されてもよい、ステップと、（ｉｉ）フェドバッチ発酵中にＲＱ値を定期的または連続的に監視し、ＲＱ値が指定範囲内に入るかどうか決定するステップと、（ｉｉｉ）フェドバッチ酵母培養のＲＱ値を調節または維持し、それによりＲＱ値が指定範囲内に入ることができるようにするために、フェドバッチ発酵中に少なくとも１回、少なくとも１つの培養パラメータを調節するステップと、（ｉｖ）酵母細胞または培養培地を採取し、ステップ（ｉｉｉ）の採取された細胞または培養培地から所望のタンパク質を回収するステップと、を含む、大規模の発酵過程を提供する。任意に、上記の方法は、（ａ）第１の温度で、上記の所望のタンパク質の発現を提供する１つ以上の遺伝子を含む、真核細胞を培養することと、（ｂ）第２の温度で上記の真核細胞を培養し、上記の真核細胞が上記の所望のタンパク質を生成することを可能にすることと、を含んでもよく、上記の第２の温度は、上記の第１の温度とは異なってもよく、例えば、上記の第１の温度は、約２０℃〜約３２℃、約２４℃〜約３１．５℃、約２７℃〜約３１℃、約２７．５℃〜約３０℃、約２０℃〜約２９．５℃、約２４℃〜約２９℃、約２７℃〜約２８．５℃、もしくは約２７．５℃〜約２８．５℃であってもよく、及び／または任意に、上記の第２の温度は、上記の第１の温度よりも約１℃〜約６℃、上記の第１の温度よりも約１℃〜約３℃、上記の第１の温度よりも約２℃〜約４℃、もしくは上記の第１の温度よりも約２℃〜約３℃高くてもよく、及び／または任意に、上記の第２の温度は、約３０℃〜約３４℃、約３０℃〜約３２℃、もしくは約３０℃〜約３１．５℃であってもよく、例えば、上記の第１の温度は、約２８℃であってもよく、上記の第２の温度は、約３０℃もしくは約３１℃であってもよく、または上記の第１の温度は、約２７．５℃〜約２８．５℃であってもよく、上記の第２の温度は、約３０℃〜約３１℃であってもよく、任意に、上記の第１の温度は、上記の第２の温度よりも高い。

タンパク質は、抗体タンパク質または抗体フラグメントであってもよい。

タンパク質（例えば、抗体タンパク質または抗体フラグメント）は、酵母によって分泌されてもよい。

調節された培養パラメータは、（ａ）空気流量、（ｂ）酸素濃度、（ｃ）供給組成、（ｄ）供給速度、（ｅ）細胞密度、及び（ｆ）撹拌のうちの１つ以上を含んでもよい。

調節された培養パラメータは、（ａ）供給組成、（ｂ）供給速度、及び（ｃ）酸素移動速度のうちの１つ以上を含んでもよく、培養パラメータは、ＲＱ値が指定範囲内に入ることができるように、フェドバッチ酵母のＲＱ値を調節または維持するために、過程中少なくとも１回調節されてもよい。

方法は、フェドバッチ発酵培養に先行するバッチ発酵をさらに含んでもよい。

フェドバッチ発酵は、少なくとも５０時間にわたって、または少なくとも７０時間にわたって実施されてもよい。

酵母細胞は、倍数体、１倍体、または２倍体ピキア・パストリスなどのピキア・パストリスであってもよい。

フェドバッチ培養の細胞密度は、１〜７００ｇ／Ｌの細胞湿重量を構成してもよい。

ステップ（ｉｉｉ）において、供給速度は、ＲＱ値を指定範囲内に入るように調節するために、増加または減少されてもよい。

ステップ（ｉｉｉ）において、供給組成は、ＲＱ値を指定範囲内に入るように調節するために、少なくとも１つの発酵性糖または他の炭化水素の量を変化させることによって変化させられてもよい。

ステップ（ｉｉｉ）において、フェドバッチ発酵中の酸素量は、ＲＱ値を指定範囲内に入るように調節するために、フェドバッチ発酵中に増加または減少されてもよい。

ステップ（ｉｉｉ）において、少なくとも１つの発酵性糖または他の発酵性炭化水素の量は、ＲＱ値を指定範囲内に入るように調節するために、増加または減少されてもよい。

ステップ（ｉｉｉ）において、供給速度は、ＲＱ値を指定範囲内に入るように調節するために、フェドバッチ発酵中に増加または減少されてもよい。

過程は、ステップ（ｉｉｉ）を含まないフェドバッチ過程に対して、抗体純度及び抗体生成から選択される特性の改善をもたらし得る。

ステップ（ｉｉｉ）におけるＲＱ値に対する指定範囲は、約１．０８〜１．３５、または約１．０８〜１．２であってもよい。

本明細書を読むことによって当業者に明らかとなるであろう、これら及び他の実施形態は、当該技術分野に、改善された信頼性、予測可能性、効率性、及び品質を有する方法及び産物を提供する。

３つの異なるＭａｂ１菌株Ａ、Ｂ、及びＣのＲＱプロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 ３つの異なるＭａｂ１菌株Ａ、Ｂ、及びＣの撹拌プロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 ３つの異なるＭａｂ１菌株Ａ、Ｂ、及びＣのエタノールプロファイルを示す。 ３つの異なるＭａｂ１菌株Ａ、Ｂ、及びＣの成長プロファイルを示す。 ３つの異なるＭａｂ１菌株Ａ、Ｂ、及びＣの全培養液力価プロファイルを示す。 ３つの異なるＲＱ設定値、ＲＱ１．０９〜１．１５、１．１９〜１．２５、１．２９〜１．３５におけるＭａｂ１菌株ＡのＲＱプロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 ３つの異なるＲＱ設定値、ＲＱ１．０９〜１．１５、１．１９〜１．２５、１．２９〜１．３５におけるＭａｂ１菌株Ａの撹拌プロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 ３つの異なるＲＱ設定値、ＲＱ１．０９〜１．１５、１．１９〜１．２５、１．２９〜１．３５におけるＭａｂ１菌株Ａのエタノールプロファイルを示す。 ３つの異なるＲＱ設定値、ＲＱ１．０９〜１．１５、１．１９〜１．２５、１．２９〜１．３５におけるＭａｂ１菌株Ａの成長プロファイルを示す。 ３つの異なるＲＱ設定値、ＲＱ１．０９〜１．１５、１．１９〜１．２５、１．２９〜１．３５におけるＭａｂ１菌株Ａの全培養液力価プロファイルを示す。 好気及び低酸素条件下で成長したＭａｂ１菌株ＡのＲＱプロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 好気及び低酸素条件下で成長したＭａｂ１菌株Ａの撹拌プロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 好気及び低酸素条件下で成長したＭａｂ１菌株Ａのエタノールプロファイルを示す。 好気及び低酸素条件下で成長したＭａｂ１菌株Ａの成長プロファイルを示す。 好気及び低酸素条件下で成長したＭａｂ１菌株Ａの％ＤＯプロファイルを示す。 好気及び低酸素条件下で成長したＭａｂ１菌株Ａの全培養液力価プロファイルを示す。 ４つの異なるＭａｂ２菌株Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤのＲＱプロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 ４つの異なるＭａｂ２菌株Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ菌株の撹拌プロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 ４つの異なるＭａｂ２菌株Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ菌株のエタノールプロファイルを示す。 ４つの異なるＭａｂ２菌株Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ菌株の成長プロファイルを示す。 ４つの異なる菌株Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ菌株の全培養液力価プロファイルを示す。 ３つの異なるＭａｂ３菌株Ａ、Ｂ、及びＣのＲＱプロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 ３つの異なるＭａｂ３菌株Ａ、Ｂ、及びＣの撹拌プロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 ３つの異なるＭａｂ３菌株Ａ、Ｂ、及びＣのエタノールプロファイルを示す。 ３つの異なるＭａｂ３菌株Ａ、Ｂ、及びＣの成長プロファイルを示す。 ３つの異なるＭａｂ３菌株Ａ、Ｂ、及びＣの全培養液力価プロファイルを示す。 異なる供給速度でのＭａｂ３菌株ＢのＲＱプロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 異なる供給速度でのＭａｂ３菌株Ｂの撹拌プロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 異なる供給速度でのＭａｂ３菌株Ｂのエタノールプロファイルを示す。 異なる供給速度でのＭａｂ３菌株Ｂの成長プロファイルを示す。 異なる供給速度でのＭａｂ３菌株Ｂの全培養液力価プロファイルを示す。 異なる供給速度でのＭａｂ４菌株ＡのＲＱプロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 異なる供給速度でのＭａｂ４菌株Ａの撹拌プロファイルを示す。縦線は、ＲＱ制御が開始された時間を示す。 異なる供給速度でのＭａｂ４菌株Ａ菌株のエタノールプロファイルを示す。 異なる供給速度でのＭａｂ４菌株Ａ菌株の成長プロファイルを示す。 異なる供給速度でのＭａｂ４菌株Ａ菌株の全培養液プロファイルを示す。 大規模発酵における好気（Ｂ１）及び低酸素（Ｂ２）過程に対するＭａｂ２菌株Ａの全培養液プロファイルを示す。 好気及び低酸素過程条件に対する、発酵時間６２、７０、及び８６時間における、Ｍａｂ１菌株ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元及び還元ゲルを示す。 発酵時間６２、６９、及び８５時間における、Ｍａｂ１菌株ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元及び還元ゲルを示す。 組み換え抗体生成に対する培養温度シフトの有益な効果を示す。全培養液（「ＷＢ」）抗体力価（任意単位）は、５つの異なる温度シフト及び非シフト対照（２８℃で維持）に対する発酵全体にわたる時点に対して表示される。シフト前温度は、２８℃であり、シフト後温度は、示されるように２５℃、２９．５℃、３１℃、３２．５℃、または３４℃であった。１．５℃〜３℃の上方温度シフト（それぞれの最終温度、２９．５℃〜３１℃）は、最終力価の増加をもたらした。これらの実験で生成された抗体は、Ａｂ−Ａであった。３１℃にシフトされた培養物に対して、最終力価は、非シフト対照培養物（２８℃で維持）と比較して約３０％増加した。 図４０の培養温度シフトで生成された組み換え抗体の純度を要約する。純度は、抗体生成の終了時に採取されたタンパク質Ａ精製抗体のサイズ排除クロマトグラフィによって評価した。パネルＡは、非還元条件下で評価された純度を示す。完全抗体（「主ピークＩｇＧ」）及び２つの異常な抗体複合体（「ピーク前ＨＨＬ」及び「７５ｋＤ ＨＬ」）に対応するピークを検出した。示される数値は、各ピークに含有される検出された総タンパク質の百分率である。非シフト培養物（すなわち、２８℃で維持された）及び２９．５℃〜３１℃にシフトされた培養物に対して、総タンパク質の同様の割合が主な抗体ピークに含有された。パネルＢは、還元条件下で検出された純度を示す。各温度条件に対して、重鎖（「ＨＣ」）、軽鎖（「ＬＣ」）、及び総重鎖及び軽鎖タンパク質（「総ＨＣ＋ＬＣ」）に含有される検出された総タンパク質の百分率が、３つの他のピーク（「ＲＴ９．８０」、「ＲＴ１０．１６」、及び「ＲＴ１０．８０」）に含有される百分率と共に示される。２８℃で維持される非シフト培養物と比較すると、重鎖及び軽鎖ピークに含有されるタンパク質の百分率は、２９．５℃にシフトされた培養物に対して同様のままであり、より高い温度シフトに対して約４％増加した。 ２５℃に下方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 ２５℃に下方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 ２５℃に下方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 温度シフトなしで生成され、２８℃で維持された対照培養物に対する、図４０に示されるような組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 温度シフトなしで生成され、２８℃で維持された対照培養物に対する、図４０に示されるような組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 温度シフトなしで生成され、２８℃で維持された対照培養物に対する、図４０に示されるような組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 １．５℃〜２９．５℃上方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 １．５℃〜２９．５℃上方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 １．５℃〜２９．５℃上方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 ３℃〜３１℃上方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 ３℃〜３１℃上方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 ３℃〜３１℃上方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 ４．５℃〜３２．５℃上方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 ４．５℃〜３２．５℃上方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 ４．５℃〜３２．５℃上方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 ６℃〜３４℃上方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 ６℃〜３４℃上方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 ６℃〜３４℃上方シフトされた培養物に対する、図４０に示されるように生成された組み換え抗体の純度を詳述する。パネルＡ、非還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。パネルＢ、非還元（レーン１）及び還元（レーン３）試料に対するクマシー染色ゲル電気泳動結果。レーン２及び４は、サイズマーカーを示す。パネル３、還元試料に対するサイズ排除クロマトグラフィトレース及び表集計結果。クロマトグラフィ結果は、図４１で表集計及び要約される。 培養中の温度シフトによるＡｂ−Ｂの力価の改善を示す。パネルＡ：全培養液抗体力価（任意単位）が、Ａｂ−Ｂ重鎖遺伝子の４個のコピー及びＡｂ−Ｂ軽鎖遺伝子の３個のコピーを含む高発現菌株の培養物（「Ｈ４／Ｌ３」）において、時間に対してグラフで示される。温度シフト培養物（「Ｈ４／Ｌ３ ３０Ｃ」）は、２つの非シフト培養物（「Ｈ４／Ｌ３ ２８Ｃ」）よりも全ての時点でより大きい力価を示した。平均最終抗体力価は、約２８％増加した。パネルＢ：全培養液抗体力価（任意単位）が、Ａｂ−Ｂ重鎖遺伝子の３個のコピー及びＡｂ−Ｂ軽鎖遺伝子の３個のコピーを含む低発現菌株の培養物（「Ｈ３／Ｌ３」）において、時間に対してグラフで示される。温度シフト培養物（「Ｈ３／Ｌ３ ３０Ｃ」）は、２つの非シフト培養物の平均（「Ｈ３／Ｌ３ ２８Ｃ」）より大きい力価を示した。 培養中の温度シフトによるＡｂ−Ｂの力価の改善を示す。パネルＡ：全培養液抗体力価（任意単位）が、Ａｂ−Ｂ重鎖遺伝子の４個のコピー及びＡｂ−Ｂ軽鎖遺伝子の３個のコピーを含む高発現菌株の培養物（「Ｈ４／Ｌ３」）において、時間に対してグラフで示される。温度シフト培養物（「Ｈ４／Ｌ３ ３０Ｃ」）は、２つの非シフト培養物（「Ｈ４／Ｌ３ ２８Ｃ」）よりも全ての時点でより大きい力価を示した。平均最終抗体力価は、約２８％増加した。パネルＢ：全培養液抗体力価（任意単位）が、Ａｂ−Ｂ重鎖遺伝子の３個のコピー及びＡｂ−Ｂ軽鎖遺伝子の３個のコピーを含む低発現菌株の培養物（「Ｈ３／Ｌ３」）において、時間に対してグラフで示される。温度シフト培養物（「Ｈ３／Ｌ３ ３０Ｃ」）は、２つの非シフト培養物の平均（「Ｈ３／Ｌ３ ２８Ｃ」）より大きい力価を示した。 図４８に示されるような培養温度シフトで生成された組み換え抗体の純度を要約する。純度は、抗体生成の終了時に採取されたタンパク質Ａ精製抗体のサイズ排除クロマトグラフィによって評価した。ラベルは、図４１に記載される通りである。 培養中の温度シフトによるＡｂ−Ａの力価の改善を示す。全培養液抗体力価（任意単位）が、培養中に温度シフトを受けた培養物または温度シフトを実施しなかった対照培養物に関して、時間に対して示される。供給物添加の開始後に、４つの培養物を２８℃から３０℃にシフトし（ラベル「３０Ｃ」）、５つの対照培養物を培養全体にわたってシフトなしで２８℃で維持した。シフトされた培養物のそれぞれは、非シフト培養物よりも高い力価を示した。温度シフトによる力価の平均増加は、約４７％であった。 図５０に示されるような培養温度シフトで生成された組み換え抗体の純度を要約する。純度は、抗体生成の終了時に採取されたタンパク質Ａ精製抗体のサイズ排除クロマトグラフィによって評価した。ラベルは、図４１に記載される通りである。 培養中の時間に対して表示される、実施例１３の各培養物の温度を示す。

本開示は、抗体及び他のマルチサブユニットタンパク質を含む、組み換え発現されたタンパク質の収率及び／または純度を改善する方法を記載する。温度シフトが細胞培養中に達成される方法が提供される。温度シフトを含むことが、シフトの非存在下での発現と比較して、組み換え発現された抗体の収率及び純度を改善することが以下に実証される。

理論によって制限されることを意図しないが、温度シフトは、組み換えタンパク質生成の永続的な改善をもたらす遺伝子発現の持続的な変化を引き起こす可能性があることが仮定される。上記の改善は、例えば、熱ショックタンパク質の発現の持続的な増加による、タンパク質発現、安定性、折り畳み、翻訳後プロセシング、ならびに（抗体及び他のマルチサブユニット複合体の場合）適切なサブユニット集合の改善によって仲介されてもよい。

好ましい宿主細胞は酵母を含み、特に好ましい酵母としては、メチロトローフ酵母菌株、例えば、ピキア・パストリス、ハンセヌラ・ポリモルファ（ピキア・アンガスタ）、ピキア・ギリエルモンディイ、ピキア・メタノリカ、ピキア・イノシトベラなどが挙げられる（例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８１２，４０５号、同第４，８１８，７００号、同第４，９２９，５５５号、同第５，７３６，３８３号、同第５，９５５，３４９号、同第５，８８８，７６８号、及び同第６，２５８，５５９号を参照されたい）。宿主細胞は、形質転換、接合、胞子形成など、当該技術分野において既知の方法によって生成されてもよい。

例示的な実施形態では、本開示は、１つ以上の望ましくない副産物の生成を減少させる方法を提供する。所望のタンパク質に対して、望ましくない副産物（複数可）は、化学量論の変化（マルチサブユニット複合体の場合）、異常なグリコシル化、見かけの分子量の差、ジスルフィド結合の差、流体力学半径、フラグメント、及び／または切断の差のうちの１つ以上を示す可能性がある。望ましくない副産物はまた、１つ以上の追加の差を示す可能性がある。望ましくない副産物はまた、調製に対するそれらの影響、例えば、特異的活性レベルの変化、免疫原性、または所望のマルチサブユニット複合体の物理的構造及び／もしくは機能に対する他の影響によって検出されてもよい。

例えば、所望のタンパク質が抗体である場合、望ましくない副産物としては、Ｈ１Ｌ１もしくは「半抗体」種（すなわち、重鎖及び軽鎖を含有し、重鎖は、ジスルフィド結合によって別の重鎖に結合していない）、ならびに／またはＨ２Ｌ１種（すなわち、２つの重鎖及び１つの軽鎖を含有するが、第２の軽鎖を欠いている）が挙げられ得る。

好ましい実施形態では、宿主細胞は、所望のタンパク質をコードする遺伝子またはそのサブユニットをコードする遺伝子のうちの１つ以上の２つ以上のコピーを含んでもよい。例えば、サブユニット遺伝子の複数のコピーは、１つ以上の染色体座にタンデムに組み込まれてもよい。タンデムに組み込まれた遺伝子コピーは、好ましくは、マルチサブユニット複合体の生成のための培養中に、安定したコピー数で保持される。例えば、ＵＳ２０１３／００４５８８８として公開された、共同所有された出願は、遺伝子コピー数が、軽鎖及び重鎖抗体遺伝子の３〜４つのタンデムに組み込まれたコピーを含有するピキア・パストリス菌株に対して概して安定していた、実験を記載する。

所望のタンパク質をコードする遺伝子のうちの１つ以上は、宿主細胞の１つまたは複数の染色体座に組み込まれてもよい。遺伝子間配列、プロモータ配列、コード配列、終止配列、調節配列などを含む組み込みのために、任意の好適な染色体座が利用されてもよい。ピキア・パストリスで使用され得る例示的な染色体座としては、ＰｐＵＲＡ５；ＯＣＨ１；ＡＯＸ１；ＨＩＳ４；及びＧＡＰが挙げられる。コードする遺伝子はまた、標的とされるよりもむしろ、１つ以上のランダム染色体座に組み込まれてもよい。例示的な実施形態では、染色体座は、ｐＧＡＰ遺伝子座、３’ＡＯＸ ＴＴ、及びＨＩＳ４ ＴＴ遺伝子座からなる群より選択される。さらなる例示的な実施形態では、異種タンパク質サブユニットをコードする遺伝子は、１つ以上の染色体外要素、例えば、１つ以上のプラスミドまたは人工染色体に含有されてもよい。

例示的な実施形態では、所望のタンパク質は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の同一のまたは異なるサブユニットを含む、マルチサブユニット複合体であってもよい。加えて、各サブユニットは、各マルチサブユニットタンパク質中に１回以上存在してもよい。例えば、所望のタンパク質は、２つの異なる軽鎖及び２つの異なる重鎖を含む二重特異性抗体など、多重特異性抗体を含んでもよい。さらなる例として、所望のタンパク質は、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含む抗体を含んでもよい。

サブユニットは、単シストロン遺伝子、多シストロン遺伝子、またはこれらの任意の組合せから発現されてもよい。各多シストロン遺伝子は、同じサブユニットの複数のコピーを含んでもよく、または各異なるサブユニットの１つ以上のコピーを含んでもよい。

ピキア・パストリスの操作のために使用され得る例示的な方法（培養、形質転換、及び接合する方法を含む）は、米国特許出願第２００８０００３６４３号、同第２００７０２９８５００号、及び同第２００６０２７００４５号を含む公開された出願、ならびにＨｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｄｓ．１９９８．Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．、及びＣｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｄ．，２００７，Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．に開示され、それらのそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

利用され得る例示的な発現カセットは、分泌シグナルをコードする配列、続いて発現される遺伝子の配列、続いてピキア・パストリスアルコールオキシダーゼＩ遺伝子（ＡＯＸ１）からのピキア・パストリス転写終止シグナルをコードする配列と融合する、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰ遺伝子）プロモータからなる。ゼオシン耐性マーカー遺伝子は、より高いレベルのゼオシンに耐性を有する形質転換体を選択することによって、菌株中に発現ベクターの複数の組み込まれたコピーを含有する菌株に対する増菌の手段を提供し得る。同様に、Ｇ４１８またはカナマイシン耐性マーカー遺伝子は、より高いレベルのジェネティシンまたはカナマイシンに耐性を有する形質転換体を選択することによって、菌株中に発現ベクターの複数の組み込まれたコピーを含有する菌株に対する増菌の手段を提供するために使用され得る。

利用され得る宿主菌株としては、栄養要求性ピキア・パストリスまたは他のピキア菌株、例えば、ｍｅｔ１、ｌｙｓ３、ｕｒａ３、及びａｄｅ１、または他の栄養要求性関連遺伝子の突然変異を有する菌株が挙げられる。好ましい突然変異は、任意の感知できるほどの頻度で復帰変異体を引き起こすことが不可能であり、好ましくは部分、またはさらにより好ましくは完全欠失変異体である。例えば、原栄養２倍体または４倍体菌株が、栄養要求性菌株の相補セットを接合することによって生成される。上記の菌株は、最小の培地上で成長することが可能であるという利点を有し、加えて上記の培地は、胞子形成を通して生じ得る１倍体細胞の成長に対して選択する傾向がある。

１倍体及び２倍体ピキア・パストリス菌株の形質転換、ならびにピキア・パストリス性周期の遺伝子操作は、上記のＰｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９８，２００７）に記載されるように実施されてもよい。

形質転換の前に、各発現ベクターは、宿主細胞中の標的遺伝子座へのベクターの組み込みを誘導するために、標的ゲノム遺伝子座（例えば、ＧＡＰプロモータ配列）に相同の領域内の制限酵素切断によって線形化されてもよい。次いで、各ベクターの試料は、エレクトロポレーションまたは他の方法によって、所望の菌株の培養中に個々に形質転換されてもよく、形質転換体の成功は、選択可能なマーカー、例えば、抗生物質抵抗性または栄養要求性の相補性を用いて選択されてもよい。分離株が採取され、選択条件下で単一コロニーに対してストリーキングされ、次いで、各菌株から抽出されたゲノムＤＮＡに対するサザンブロットまたはＰＣＲアッセイによって、所望のタンパク質をコードする遺伝子のコピー数またはマルチサブユニット複合体（例えば、所望の抗体）のサブユニットを確認するために検査されてもよい。任意に、予想されるサブユニット遺伝子産物の発現は、例えば、ＦＡＣＳ、ウエスタンブロット、コロニーリフト及び免疫ブロット、ならびに当該技術分野において既知の他の手段によって、確認されてもよい。任意に、分離株は、追加の異種遺伝子、例えば、所望のタンパク質をコードする遺伝子の追加のコピーを導入するために、追加の回数、形質転換されるか、またはマルチサブユニットタンパク質の場合、同じサブユニットをコードする遺伝子が、異なる遺伝子座において組み込まれてもよく、及び／または異なるサブユニットのコピーが組み込まれてもよい。菌株は、１倍体、２倍体、または他の倍数性（４倍体及びより高い倍数性を含む）として生成されてもよい。遺伝子コピー数、例えば、所望のタンパク質をコードする単一遺伝子のコピー数、またはマルチサブユニットタンパク質のサブユニットをコードする異なる遺伝子のコピー数の異なる組合せを迅速に試験するために、１倍体菌株が生成及び接合されてもよい。所望のタンパク質遺伝子または各予想されるサブユニット遺伝子の存在は、サザンブロット法、ＰＣＲ、及び当該技術分野において既知の他の検出手段によって確認されてもよい。加えて、抗体または他の所望のタンパク質の発現もまた、コロニーリフト／免疫ブロット法（Ｗｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１ ８０８−８１２（１９９６））及び／またはＦＡＣＳによって確認され得る。

形質転換は、異種遺伝子を第２の遺伝子座に標的化するために、任意に繰り返され、それは、第１の遺伝子座に標的化されたものと同じ遺伝子または異なる遺伝子であってもよい。第２の遺伝子座に組み込まれる構築物が、第１の遺伝子座によってコードされる配列と同一の、または高度に類似したタンパク質をコードするとき、その配列は、第１の遺伝子座への望ましくない組み込みの可能性を減少させるように変更されてもよい。そのような配列の差はまた、後続の組み換え事象の可能性を減少させることによって、遺伝子安定性を促進してもよい。例えば、第２の遺伝子座に組み込まれる配列は、第１の遺伝子座に組み込まれる配列に対して、プロモータ配列、終止配列、コドン使用の差、及び／または他の許容できる配列の差を有し得る。

ピキア・パストリス１倍体菌株を接合するために、交配される各菌株は、接合プレート上に一緒にパッチされ得る。例えば、複数の接合は、その成長に好適なプレートにわたって接合される各菌株をストリーキングすることによって、同時に便利に実施され得、接合パートナーは、第２のプレートにわたってストリーキングされてもよい（好ましくは、プレートは、ＹＰＤなどの富栄養培地である）。典型的には、３０℃での１日または２日のインキュベーション後、２つのプレートからの細胞は、接合プレート上に交差してレプリカプレートされてもよく、同時にプレートされ、一対の元のストリーク線の交差点で接合する条件を有する、各対の菌株のとの斜交平行パターンをもたらす。次いで、接合プレートは、菌株間の接合の開始を促進するために、インキュベートされ得る（例えば、３０℃で）。約２日後、接合プレート上の細胞は、所望の２倍体菌株に対して選択的な培地上に、ストリーキング、パッチ、またはレプリカプレートされ得る（例えば、接合された菌株が相補的独立栄養性を有する場合、ドロップアウトまたは最少培地プレートが使用されてもよい）。これらのプレートは、所望の２倍体菌株の選択成長を可能にするために好適な継続時間（例えば、約３日間）にわたって、インキュベートされ得る（例えば、３０℃で）。生じるコロニーは、各２倍体菌株を単離及び精製するために、採取及び単一コロニーに対してストリーキングされ得る。

本発明の方法で使用するための発現ベクターは、選択可能な栄養要求性または形質転換された酵母菌株を同定するための薬物マーカーを含む、酵母特異的配列をさらに含んでもよい。薬物マーカーは、例えば、高濃度の薬物中で細胞集団を培養することによって、それにより高いレベルの耐性遺伝子を発現させる形質転換体を選択することによって、酵母宿主細胞中のベクターのコピー数を増幅するために、さらに使用されてもよい。

例示的な実施形態では、異種タンパク質サブユニットをコードする遺伝子のうちの１つ以上は、誘導性プロモータに結合される。好適な例示的なプロモータとしては、アルコールオキシダーゼ１遺伝子プロモータ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＬＤ；米国特許出願第２００７／０２９８５００号を参照されたい）、及び当該技術分野において既知の他の誘導性プロモータが挙げられる。アルコールオキシダーゼ１遺伝子プロモータは、グルコース、グリセロール、またはエタノールなど、最も一般的な炭素源上の酵母の成長中にしっかりと抑制されるが、メタノール上の成長中に高度に誘導される（Ｔｓｃｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｓｔｒｏｍａｎ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ ａｌの米国特許第４，８５５，２３１号）。異種タンパク質の生成に対して、菌株は、バイオマスを生成するために抑制炭素源上で最初に増殖され、次いで、異種遺伝子の発現を誘導するために、唯一の（または主な）炭素及びエネルギー源として、メタノールに移行されてもよい。この調節系の１つの利点は、発現産物が細胞毒性を有する異種遺伝子で形質転換されたピキア・パストリス菌株が、抑制条件下で成長することによって維持され得るということである。

別の例示的な実施形態では、異種遺伝子のうちの１つ以上は、調節されたプロモータに結合されてもよく、その発現レベルは、適切な条件下で上方制御され得る。例示的な調節されたプロモータとしては、ＣＵＰ１プロモータ（培地中の銅レベルによって誘導される）、テトラサイクリン誘導性プロモータ、チアミン誘導性プロモータ、ＡＯＸ１プロモータ、及びＦＬＤ１プロモータが挙げられる。

別の態様では、本開示は、発酵の生産性を高めるために、特定の種類のフィードバック制御機構を採用し得る、酵母中で所望のタンパク質を作製するための過程を提供する。そのフィードバック制御機構は、所望の産物の最適な生成を促進する混合型の好気及び発酵代謝のロバストかつ精密な制御を可能にする。これは、酵母中で、具体的にはピキア・パストリス中で、及びより具体的にはグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）プロモータを使用して、モノクローナル抗体などの組み換えタンパク質を生成するために効果的に使用され得る。

フィードバック制御機構を使用した過程は、完全長、正しく集合した組み換えモノクローナル抗体に、ならびに抗体フラグメント及び他の組み換えタンパク質、すなわちグリセルアルデヒド−３−リン酸ではないものの生成に適用できる。我々が採用する制御機構は、機械化及び自動化が容易であり、したがって発酵条件の監視及び調節におけるほとんどの作業を排除する。過程は、種々の抗体及び他の所望のタンパク質の生成に適用でき、商業的な、例えば、大規模の生成の必要性に応えるように容易に拡張可能である。

生成過程は、呼吸商（ＲＱ）をフィードバック制御変数として使用してもよい。ＲＱは、発酵代謝の副産物である、エタノールの毒性蓄積を阻止しながら、培養中の低酸素状態を維持するために、物質移動パラメータ及び／または発酵性糖供給速度の均衡をとるために使用され得る。ＲＱは、培養中で消費された酸素のモル比で割られる、生成された二酸化炭素のモル比として定義される。それは、二酸化炭素及び酸素の含有量に対して発酵槽から生じる排出ガスを分析することによって測定され得る。この代謝パラメータは、容易に利用可能な手段を用いて、所望の成長相全体にわたって連続的または断続的に測定され得る。測定のための適切な間隔の例は、１時間毎、３０分毎、１５分毎、１０分毎、５分毎、４分毎、３分毎、２分毎、１分毎である。測定中の期間は、培養の開始から採取まで成長条件によって変化し得る。例示的な測定及び制御期間は、発酵槽中の培養の開始後２０〜４０時間、１０〜６０時間、５〜７０時間、及び２０〜１１０時間である。

酵母細胞が、酸素の存在なしで、完全に嫌気状態で増殖される場合、それらは、成長するのに必要とするエネルギーを生成するために発酵代謝を使用していると言われる。この場合、グルコースからエタノールへの変換のための以下の化学量論式が適用される。
Ｃ_６Ｈ_１２Ｏ_６→２Ｃ_２Ｈ_５ＯＨ＋２ＣＯ_２＋Ｈ_２Ｏ＋エネルギー
酵母細胞が、グルコースの好気代謝からのみそれらのエネルギーを得る場合、酸素は消費され、二酸化炭素及び水のみが生成される。
Ｃ_６Ｈ_１２Ｏ_６＋３Ｏ_２→３ＣＯ_２＋６Ｈ_２Ｏ＋エネルギー
酸素の存在下で、酵母細胞は、より効率的な好気代謝を使用し、すなわち、より多くのエネルギーが、発酵代謝下よりも好気代謝下で、１モルのグルコースから得られる。

グルコースからエタノールのみを生成する培養のＲＱは、無限大に近づき（酸素が消費されないため、ＲＱの分母はゼロである）、一方でグルコースの純好気代謝に対して、ＲＱは、１．０の値に近づく（３モルの二酸化炭素を生成するために、３モルの酸素が消費される）。したがって、１よりも高い値は、好気及び発酵代謝の両方が同時に行われている混合代謝条件を示す。典型的には、酸素移動速度及び／または発酵性糖供給速度は、この混合代謝を達成するために、フィードバック制御変数としてＲＱを使用して調節され得る。そのような混合型の代謝を使用して、低酸素条件は維持され得る。低酸素状態は、酸素移動速度及び発酵性糖供給速度の平衡によって制御される発酵代謝のレベルが低い場合に存在する。低酸素条件は、溶存酸素が約５％未満の、１．０を超えるＲＱによって定義され得る。

ＲＱは、発酵槽からの排出ガス流中で測定され得る。消費された酸素及び生成された二酸化炭素のモル濃度を確認するための任意の既知の、かつ好適な方法が使用され得る。使用され得る例示的な技術は、質量分析法、赤外線分光学法、及び常磁性分析である。

低酸素成長は、ピキア中の抗体などの完全長の、適切に集合したタンパク質の生成に対して有益な効果を有する。我々は、単純に発酵中の撹拌速度の低減によって、溶存酸素濃度を減少させようと試みた。しかしながら、撹拌速度または発酵性糖供給速度の小さい差が、エタノールの毒性レベルの蓄積をすばやくもたらすため、この方法では信頼できる制御を得ることが不可能であった。

フィードバック制御機構はまた、例えば、撹拌速度による、発酵性糖供給速度及び／または酸素移動速度のいずれかの調整を通して、エタノール濃度を測定及び制御するために使用され得る。エタノールの蓄積の制御は、より安定した過程を可能にするはずである。エタノール濃度の監視するために、発酵槽中に挿入されたプローブを使用することができる。プローブは、連続的に発酵培養液中のエタノール濃度を監視することができる。しかしながら、そのようなプローブは、十分に較正され得る出力を有しないため、それを適正製造基準下で分子の商業的製造において使用することは、実行可能ではない。

ＲＱが約１．１〜約２の狭い範囲で維持される場合、エタノール蓄積は、毒性ではないレベルで安定する。好ましくは、エタノールの濃度は、約５ｇ／Ｌ〜１７ｇ／Ｌで維持される。さらに、これらの同じ条件は、ＧＡＰプロモータを刺激し、好気発酵条件よりも有意に増加した所望のタンパク質、例えば、抗体生成をもたらす。望ましくあり得るＲＱ範囲は、約１．０８〜２．０；約１．０８〜１．８５；約１．０８〜１．６５；約１．０８〜１．４５；約１．０８〜１．３５；約１．０８〜１．２５；約１．０８〜１．２；及び約１．０８〜１．１５を含む。グルコース以外の代替の炭素源は、１未満のＲＱを達成することができる。そのような炭素源としては、アセテート及びグリセロールが挙げられる。他の好適なＲＱ範囲は、１．０８〜１．３５及び１．１５〜１．２５を含む。ＲＱは、発酵の任意の所望の部分の間、例えば、０〜１１０時間、２０〜４０時間、２０〜７０時間、２０〜９０時間、２０〜１１０時間、または任意の他の所望の期間、監視及び制御され得る。

したがって、ＲＱは、種々の炭素源の添加によって、種々の量の炭素源の添加によって、及び酸素レベルの操作によって、操作及び経時的に変化され得る。一実施形態では、酸素レベルは、撹拌を増加または減少させることによって操作される。別の実施形態では、気体供給中の酸素：窒素ガスの比は、制御される。酸素移動速度が調節され得る方法としては、空気流量、酸素濃度、細胞密度、温度、及び撹拌の変化が挙げられる。別の実施形態では、グルコースまたは他の発酵性糖供給は、ＲＱに影響を及ぼすように調整される。供給中で使用され得る他の発酵性糖としては、フルクトース、スクロース、マルトース、及びマルトトリオースが挙げられるがこれらに限定されない。供給速度または組成は、ＲＱに影響を及ぼすように調整され得る。ＲＱの制御は、手動または自動であってもよい。

タンパク質をコードする核酸、例えば、コードする抗体は、組み換え構築物の単一または複数の連続または不連続断片上にあってもよい。抗体は、任意の種類のフラグメントまたは構築物または完全長であってもよい。これらは、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｃ、及びＳｃＦｖであってもよい。いくつかの実施形態では、鎖及び鎖フラグメントは、インビボで適切に集合する。集合が適切ではない場合、インビトロ集合が必要な可能性がある。望ましく作製され得る他のタンパク質は、異種または同種であるかを問わず、１つ以上のサブユニットを有するものである。典型的には、タンパク質は、診断または治療目的で有用である。タンパク質は、成長因子、サイトカイン、血液凝固因子、治療的毒素、再構成に有用な構造タンパク質、酵素などであってもよい。

抗体などのタンパク質は、当該技術分野において既知の任意の技術によって、細胞枯渇培養培地から、または細胞から回収されてもよい。典型的には、結合ステップは、調製物の容積を減少させるために使用される。結合は、便利なように、フィルタもしくはカラム、または他の固体担体上で行われ得る。いくつかの実施形態では、タンパク質Ａは、抗体捕捉剤として使用されてもよい。タンパク質Ａは、ポリマーマトリクスに結合されてもよい。

サッカロミセス、ハンゼヌラ、及びピキア種を含む、任意の種類の酵母細胞が使用され得る。使用され得る、例示的であるが限定されない種は、ピキア・パストリス、Ｐ．メタノリカ、Ｐ．アングスタ、Ｐ．サーモメタノリカ、ハンセヌラ・ポリモルファ、及びサッカロミセス・セレビシアである。酵母は、１倍体または２倍体であってもよい。

ＧＡＰのような他のプロモータも同様に使用され得る。これらは、典型的には、ピキアなど、酵母細胞中の低酸素、グルコース制限成長で上方制御される遺伝子のためのプロモータである。使用され得る、そのようなプロモータとしては、遺伝子ＹＨＲ１４０Ｗ、ＹＮＬ０４０Ｗ、ＮＴＡ１、ＳＧＴ１、ＵＲＫ１、ＰＧＩ１、ＹＨＲ１１２Ｃ、ＣＰＳ１、ＰＥＴ１８、ＴＰＡ１、ＰＦＫ１、ＳＣＳ７、ＹＩＬ１６６Ｃ、ＰＦＫ２、ＨＳＰ１２、ＥＲＯ１、ＥＲＧ１１、ＥＮＯ１、ＳＳＰ１２０、ＢＮＡ１、ＤＵＧ３、ＣＹＳ４、ＹＥＬ０４７Ｃ、ＣＤＣ１９、ＢＮＡ２、ＴＤＨ３、ＥＲＧ２８、ＴＳＡ１、ＬＣＢ５、ＰＬＢ３、ＭＵＰ３、ＥＲＶ１４、ＰＤＸ３、ＮＣＰ１、ＴＰＯ４、ＣＵＳ１、ＣＯＸ１５、ＹＢＲ０９６Ｗ、ＤＯＧ１、ＹＤＬ１２４Ｗ、ＹＭＲ２４４Ｗ、ＹＮＬ１３４Ｃ、ＹＥＬ０２３Ｃ、ＰＩＣ２、ＧＬＫ１、ＡＬＤ５、ＹＰＲ０９８Ｃ、ＥＲＧ１、ＨＥＭ１３、ＹＮＬ２００Ｃ、ＤＢＰ３、ＨＡＣ１、ＵＧＡ２、ＰＧＫ１、ＹＢＲ０５６Ｗ、ＧＥＦ１、ＭＴＤ１、ＰＤＲ１６、ＨＸＴ６、ＡＱＲ１、ＹＰＬ２２５Ｗ、ＣＹＳ３、ＧＰＭ１、ＴＨＩ１１、ＵＢＡ４、ＥＸＧ１、ＤＧＫ１、ＨＥＭ１４、ＳＣＯ１、ＭＡＫ３、ＺＲＴ１、ＹＰＬ２６０Ｗ、ＲＳＢ１、ＡＩＭ１９、ＹＥＴ３、ＹＣＲ０６１Ｗ、ＥＨＴ１、ＢＡＴ１、ＹＬＲ１２６Ｃ、ＭＡＥ１、ＰＧＣ１、ＹＨＬ００８Ｃ、ＮＣＥ１０３、ＭＩＨ１、ＲＯＤ１、ＦＢＡ１、ＳＳＡ４、ＰＩＬ１、ＰＤＣ１−３、ＴＨＩ３、ＳＡＭ２、ＥＦＴ２、及びＩＮＯ１のためのプロモータが挙げられるがこれらに限定されない。

大規模発酵過程は、有用な産物を生成するための商業的過程で典型的に使用されるものである。典型的には、これらは、容積が１００リットルよりも大きい。フェドバッチ発酵は、細胞密度及び産物蓄積に影響を及ぼすために、発酵中に栄養素が添加される過程である。

すでに公開された特許出願及び特許、ＵＳ７９２７８６３、ＵＳ８２６８５８２、米国特許出願第２０１２／０２７７４０８号の開示は、本明細書に明示的に組み込まれる。

本開示の大部分が、抗体の生成を記載するが、本明細書に記載される方法は、単一サブユニット及びマルチサブユニットタンパク質を含む、他の所望のタンパク質に容易に適応する。加えて、本方法は、マルチタンパク質複合体の生成に限定されず、テロメラーゼ、ｈｎＲＮＰ、リボソーム、ｓｎＲＮＰ、シグナル認識粒子、原核及び真核ＲＮａｓｅ Ｐ複合体、ならびに複数の異なるタンパク質及び／またはＲＮＡサブユニットを含有する、任意の他の複合体を含む、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体と使用するためにも容易に適応され得る。マルチサブユニット複合体を発現する宿主細胞は、当該技術分野において既知の方法によって生成されてもよい。例えば、遺伝子コピー数の異なる組合せを含有する２倍体または４倍体酵母細胞のパネルは、個々のサブユニット遺伝子の異なるコピー数を含有する細胞を接合することによって生成されてもよい（コピー数は、好ましくは、接合よりも前に既知である）。

定義

本発明は、記載される特定の方法、プロトコル、細胞株、動物種または属、及び試薬が異なり得るため、それらに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語が、特定の実施形態を説明する目的であり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限することを目的としてないことも理解されたい。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「タンパク質（ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は、１つ以上のタンパク質及び当業者に既知のその同等物への言及を含むなどである。本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、明らかにそうでないと示されない限り、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

ボーラス添加：本開示において、「ボーラス添加」は概して、培養された細胞と接触している物質（エタノールなど）の濃度の急速な変化を指す（例えば、培養培地中）。例えば、物質は、単回添加で、２回以上の添加の連続で、培養された細胞に添加されてもよく、及び／またはある期間にわたって注入されてもよい（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、９０、または１２０分間にわたって）。物質はまた、部分的または完全に培養培地を置き換えることによって、例えば、細胞を濃縮し（遠心分離、濾過、沈降、もしくは他の方法を使用して）、培地の一部もしくは全部を除去し、物質を添加することによって、または物質を含有する培地に細胞を添加することによって、添加されてもよい。物質は、担体（例えば、培養培地、水、生理食塩水など）と混合されてもよい。例えば、エタノールのボーラス添加は、所望の濃度を生成するために十分な量で、培養培地に純または濃縮エタノール（例えば、１００％、９５％、７０％、５０％、６０％、４０％、３０％、２０％、など）を添加することを含んでもよい。別の例として、細胞は、例えば、エタノールを含有する培地に細胞を含有する接種材料を添加することによって、エタノールを含有する培地に添加されてもよい。

ボーラス濃度：本開示において、「ボーラス濃度」は概して、物質（例えば、エタノール）のボーラス添加によって生じる濃度を指す。

接合コンピテント酵母種：本発明において、これは、培養中で成長し得る任意の２倍体または４倍体酵母を広く包含することを目的とする。そのような酵母の種は、１倍体、２倍体、または他の倍数体形態で存在してもよい。所与の倍数性の細胞は、適切な条件下で、その形態の不特定の世代数にわたって増殖し得る。２倍体細胞はまた、１倍体細胞を形成するために胞子形成することができる。連続接合は、２倍体菌株のさらなる接合または融合を通して４倍体菌株をもたらし得る。本発明は、１倍体酵母、ならびに例えば、接合または融合（例えば、スフェロプラスト融合）によって生成される、２倍体または他の倍数体酵母細胞の使用を考慮する。

本発明の一実施形態では、接合コンピテント酵母は、アルキシオザイマ属；アスコボトリオザイマ属；シテロミセス属；デバリオミセス属；デッケラ属；エレモテシウム属；イサチェンキア属；カザツタニア属；クルイベロミセス属；コダマエ属；ロッデロミセス属；パチソレン属；ピキア属；サッカロミセス属；サターニスポラ属；テトラピシスポラ属；トルラスポラ属；ウイリオプシス属；及びジゴサッカロミセス属を含む、サッカロミケス科のメンバーである。本発明で潜在的に有用な他の種類の酵母としては、ヤロウィア；ロドスポリジウム；カンジダ；ハンゼヌラ；フィロバシウム；スポリジオボーラス；ブレラ；ロイコスポリジウム及びフィロバシデラが挙げられる。

本発明の好ましい実施形態では、接合コンピテント酵母は、ピキア属のファミリーであるか、または別のメチロトローフである。本発明のさらなる好ましい実施形態では、ピキア属の接合コンピテント酵母は、以下の種のうちの１つである：ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、及びハンセヌラ・ポリモルファ（ピキア・アンガスタ）。本発明の特に好ましい実施形態では、ピキア属の接合コンピテント酵母は、ピキア・パストリス種である。

１倍体酵母細胞：その正常ゲノム（染色体）相補体の各遺伝子の単一コピーを有する細胞。

倍数体酵母細胞：その正常ゲノム（染色体）相補体の２つ以上のコピーを有する細胞。

２倍体酵母細胞：典型的には２つの１倍体細胞の融合（接合）過程によって形成される、その正常ゲノム相補体の本質的に全ての遺伝子の２つのコピー（対立遺伝子）を有する細胞。

４倍体酵母細胞：典型的には２つの２倍体細胞の融合（接合）過程によって形成される、その正常ゲノム相補体の本質的に全ての遺伝子の４つのコピー（対立遺伝子）を有する細胞。４倍体は、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なる発現カセットを担持してもよい。そのような４倍体は、選択的接合ホモ接合性異体性ａ／ａ及びアルファ／アルファ２倍体によって、サッカロミセス・セレビシア中で、及び栄養要求性２倍体を得るための１倍体の連続接合によって、ピキア中で得られ得る。例えば、［ｍｅｔ ｈｉｓ］１倍体は、２倍体［ｈｉｓ］を得るために［ａｄｅ ｈｉｓ］１倍体と接合され得、［ｍｅｔ ａｒｇ］１倍体は、２倍体［ａｒｇ］を得るために［ａｄｅ ａｒｇ］１倍体と接合され得、次いで、２倍体［ｈｉｓ］は、４倍体原栄養体を得るために２倍体［ａｒｇ］と接合され得る。２倍体細胞の利点及び使用への言及がまた、４倍体細胞にも適用し得ることが、当業者によって理解されるであろう。

酵母接合：２つの酵母細胞が単一の酵母細胞を形成するために融合する過程。融合した細胞は、１倍体細胞またはより高い倍数性の細胞であってもよい（例えば、４倍体細胞を生成するために２つの２倍体細胞を接合すること）。

減数分裂：２倍体酵母細胞が４つの１倍体胞子産物を形成するために還元的分裂を受ける過程。各胞子は次いで、発芽し、細胞株を栄養成長させる１倍体を形成してもよい。

選択可能なマーカー：選択可能なマーカーは、例えば形質転換事象を通したようなその遺伝子を受け取る細胞に、成長表現型（物理的成長特徴）を与える遺伝子または遺伝子フラグメントである。選択可能なマーカーは、その細胞が、その選択可能なマーカー遺伝子を受け取らない細胞が成長することができない条件下で、選択成長培地中で生存及び成長することを可能にする。選択可能なマーカー遺伝子は概して、抗生物質または他の薬物に対する抵抗性、２つの温度感受性（「ｔｓ」）突然変異体が交配されるか、もしくは１つのｔｓ突然変異体が形質転換される場合に温度に対する抵抗性を細胞に与える遺伝子などの、正の選択可能なマーカー遺伝子；その生合成遺伝子を有しない全ての細胞によって必要とされる特定の栄養素なしで、培地中で成長する能力を細胞に与える生合成遺伝子などの、負の選択可能なマーカー遺伝子、または野生型遺伝子を有しない細胞によって、細胞を成長できなくさせる突然変異生合成遺伝子などを含む、いくつかの種類に分類される。好適なマーカーとしては、ＺＥＯ；ＮＥＯ（Ｇ４１８）；ＬＹＳ３；ＭＥＴ１；ＭＥＴ３ａ；ＡＤＥ１；ＡＤＥ３；ＵＲＡ３などが挙げられるがこれらに限定されない。

組み込まれる：生物の染色体に共有結合される遺伝要素（典型的には、異種遺伝要素）。

タンデムに組み込まれる：染色体中の隣接する位置に組み込まれる遺伝要素の２個以上のコピー。２個以上のコピーは、その配向を必ずしも有するとは限らず、例えば、転写遺伝子に対して、いくつかのコピーは、ワトソン鎖から転写されてもよく、他のコピーは、クリック鎖から転写されてもよい。

宿主細胞：本開示の文脈において、宿主細胞という用語は、異種遺伝子を含有する細胞（例えば、ピキア細胞などの真核細胞）を指す。例えば、異種遺伝子は、所望のマルチサブユニット複合体のサブユニット、タンパク質折り畳み（例えば、シャペロン）、発現、もしくは分泌に関与する遺伝子、及び／または別の所望の遺伝子の発現を提供し得る。異種遺伝子は、真核細胞のゲノムに組み込まれてもよく、またはプラスミドもしくは人工染色体などの染色体外要素中に含有されてもよい。

呼吸商（ＲＱ）は、消費されたＯ_２のモル数で割られる、生成されたＣＯ_２のモル数として定義される。炭水化物の完全な酸化に対して、ＲＱ値は、１．０である。発酵は、１よりも大きいＲＱ値によって示され、Ｏ_２を全くまたはほとんど利用することなく（例えば、分子酸素の非存在下での代謝に対して）、ＲＱは、非常に大きいまたは理論的に無限の値に達し得る。

発現ベクター：これらのＤＮＡベクターは、標的宿主細胞内の異種タンパク質の発現のための操作を促進する要素を含有する。便利に、形質転換のためのＤＮＡの配列及び生成の操作は、最初に細菌宿主、例えば、大腸菌中で実施され、通常、ベクターは、複製の細菌起源及び適切な細菌選択マーカーを含む、そのような操作を促進するための配列を含む。選択マーカーは、選択培養培地中で成長する形質転換された宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中で生き残らない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素に対する抵抗性を与える、（ｂ）栄養要求性不足を補う、または（ｃ）複合培地からは入手不可能な重要栄養素を供給する、タンパク質をコードする。酵母の形質転換のための例示的なベクター及び方法は、例えば、Ｂｕｒｋｅ，Ｄ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｄ．，＆ Ｓｔｅａｒｎｓ，Ｔ．（２０００）．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ ｍａｎｕａｌ．Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の方法で使用するための発現ベクターは、形質転換された酵母菌株を同定するための選択可能な栄養要求性または薬物マーカーを含む、酵母特異的配列をさらに含んでもよい。薬物マーカーはさらに、酵母宿主細胞中のベクターのコピー数の増幅を選択するために使用されてもよい。

対象となるポリペプチドコード配列は、典型的には、酵母細胞中のポリペプチドの発現を提供する転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結される。これらのベクター成分としては、以下のうちの１つ以上が挙げられ得るがこれらに限定されない：エンハンサ要素、プロモータ、及び転写終止配列。例えば、シグナル配列などの、ポリペプチドの分泌のための配列もまた含まれ得る。発現ベクターが多くの場合、酵母ゲノムに組み込まれるため、複製の酵母起源は任意である。

任意ではあるが、本発明の一実施形態では、所望のタンパク質または所望のマルチサブユニット複合体のサブユニットは、培養培地への発現されたポリペプチドの分泌を提供する分泌配列に作動可能に連結または融合され、それは、所望のタンパク質または複合体の採取及び精製を促進することができる。さらにより好ましくは、分泌配列は、好ましいコドンを選択すること、及び／またはコドン選択を通してＡＴの割合を変化させることなどを通して、宿主細胞（例えば、酵母２倍体細胞）からのポリペプチドの最適化された分泌を提供する。分泌効率性及び／または安定性が分泌配列の選択の影響を受ける可能性があり、最適な分泌配列が異なるタンパク質間で異なる可能性があることは、当該技術分野において既知である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｇａｎｅｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２００１ Ｓｅｐ；１４（９）：７０５−１０を参照されたい）。多くの潜在的に好適な分泌シグナルが当該技術分野において既知であり、特定の所望のタンパク質または複合体の収率及び／または純度に対するそれらの効果に対して、容易に試験され得る。酵母及び他の種の分泌されたタンパク質中に存在する分泌配列、ならびに操作された分泌配列を含む、任意の分泌配列が潜在的に使用され得る。利用され得る例示的な分泌シグナル配列としては、ニワトリリゾチーム（ＣＬＹ）シグナルペプチド（ＭＲＳＬＬＩＬＶＬＣＦＬＰＬＡＡＬＧ（配列番号５））、ＣＬＹ−Ｌ８（ＭＲＬＬＬＬＬＬＬＬＰＬＡＡＬＧ（配列番号６））、サッカロミセス・セレビシアインベルターゼ（ＳＵＣ２）シグナルペプチド（ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ（配列番号７））、ＭＦ−α（Ｐｒｅｐｒｏ）（ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡ−ＡＰＶＮＴＴＴＥ−ＥＧＶＳＬＥＫＲ（配列番号８））、ＭＦ−α（Ｐｒｅ）−ａｐｖ（ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡ−ＡＰＶ（配列番号９））、ＭＦ−α（Ｐｒｅ）−ａｐｖ−ＳＬＥＫＲ（ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡ−ＡＰＶＳＬＥＫＲ（配列番号１０））、ＭＦ−α（Ｐｒｅｐｒｏ）−（ＥＡ）３（ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡ−ＡＰＶＮＴＴＴＥ−ＥＧＶＳＬＥＫＲ−ＥＡＥＡＥＡ（配列番号１１））、αＦシグナルペプチド（ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＦＡＡＳＳＡＬＡ−ＡＰＶＮＴＴＴＥ−ＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥ−ＥＧＶＳＬＥＫＲ（配列番号１２））、ＫＩＬＭ１シグナルペプチド（ＭＴＫＰＴＱＶＬＶＲＳＶＳＩＬＦＦＩＴＬＬＨＬＶＶＡＬＮＤＶＡＧＰＡＥＴＡＰＶＳＬＬＰＲ（配列番号１３））、抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナルペプチド（ＭＦＳＰＩＬＳＬＥＩＩＬＡＬＡＴＬＱＳＶＦＡ（配列番号１４））、Ａ．ニガーＧＯＸシグナルペプチド（ＭＱＴＬＬＶＳＳＬＶＶＳＬＡＡＡＬＰＨＹＩＲ（配列番号１５））、シュワニオミセス・オキシデンタリス・グルコアミラーゼ遺伝子（ＧＡＭ１）シグナルペプチド（ＭＩＦＬＫＬＩＫＳＩＶＩＧＬＧＬＶＳＡＩＱＡ（配列番号１６））、プロ配列を有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）シグナルペプチド（ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ（配列番号１７））、プロ配列を有しないヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）シグナルペプチド（ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ（配列番号１８））、ＩＳＮシグナルペプチド（ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬＬＡＬＬＡＬＷＧＰＤＰＡＡＡ（配列番号１９））、ＩＦＮシグナルペプチド（ＭＫＹＴＳＹＩＬＡＦＱＬＣＩＶＬＧＳＬＧＣＤＬＰ（配列番号２０））、ＨＧＨシグナルペプチド（ＭＡＡＤＳＱＴＰＷＬＬＴＦＳＬＬＣＬＬＷＰＱＥＰＧＡ（配列番号２１））、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（ＭＫＫＮＲＭＭＭＭＩＷＳＶＧＶＶＷＭＬＬＬＶＧＧＳＹＧ（配列番号２２））、カイコリゾチーム（ＭＱＫＬＩＩＦＡＬＶＶＬＣＶＧＳＥＡ（配列番号２３））、ヒトリゾチーム（ＬＹＺ１）（ＭＫＡＬＩＶＬＧＬＶＬＬＳＶＴＶＱＧ（配列番号２４））、アクチビン受容体Ｉ型（ＭＶＤＧＶＭＩＬＰＶＬＩＭＩＡＬＰＳＰＳ（配列番号２５））、アクチビンＩＩ型受容体（ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧ（配列番号２６））、ピキア・パストリス免疫グロブリン結合タンパク質（ＰｐＢｉＰ）（ＭＬＳＬＫＰＳＷＬＴＬＡＡＬＭＹＡＭＬＬＶＶＶＰＦＡＫＰＶＲＡ（配列番号２７））、及びヒト抗体３Ｄ６軽鎖リーダー（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＫＣ（配列番号２８））が挙げられる。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｏｌ．１１ ｎｏ．２ ｐｐ．７５−７７，１９９８；Ｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９ Ｎｏｖ；６３（１１）：１９７７−８３；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５（２００５）１０７９−１０９６；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００５ Ｄｅｃ；４２（６）：１３５５−６３；Ｒａｅｍａｅｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９ Ｏｃｔ １；２６５（１）：３９４−４０３；Ｋｏｇａｎｅｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．（２００１）１４（９）：７０５−７１０；Ｄａｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００６ Ａｐｒ；４６（２）：４５６−６７；Ｄａｍａｓｃｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００７）７４：３８１−３８９；及びＦｅｌｇｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０ Ａｕｇ ２５；１８（１６）：４９２７を参照されたく、それらのそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

所望のタンパク質または複合体はまた、分泌シグナルに作動可能に連結または融合されることなく、培養培地に分泌されてもよい。例えば、いくつかの異種ポリペプチドは、分泌シグナルに結合または融合さえされることなく、ピキア・パストリス中で発現されるとき、培養培地に分泌されることが実証されている。加えて、所望のタンパク質またはマルチサブユニット複合体は、当該技術分野において既知の方法を使用して、宿主細胞から精製されてもよい（それは、例えば、複合体が不十分に分泌されている場合、好ましくあり得る）。

所望のタンパク質またはマルチサブユニット複合体を含む培地または細胞は、培養から回収されてもよい。任意に、分泌されたタンパク質は、精製されてもよい。例えば、所望のタンパク質またはマルチサブユニット複合体を含む細胞は、機械的、化学的、酵素的、及び／または浸透圧方法（例えば、液体窒素による冷凍、ホモジナイザーの使用、スフェロプラスト化、超音波処理、ガラスビーズの存在下での撹拌、洗剤の使用など）を使用して溶解されてもよい。所望のタンパク質またはマルチサブユニット複合体は、当該技術分野において既知の方法を使用して、濃縮、濾過、透析などされてもよい。所望のタンパク質またはマルチサブユニット複合体は、例えば、その分子量（例えば、サイズ排除クロマトグラフィ）、等電点（例えば、等電点電気泳動法）、電気泳動移動度（例えば、ゲル電気泳動）、疎水性相互作用クロマトグラフィ（例えば、ＨＰＬＣ）、電荷（例えば、イオン交換クロマトグラフィ）、親和性（例えば、抗体の場合、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、及び／もしくは所望の抗体が結合するエピトープへの結合）、ならびに／またはグリコシル化状態（例えば、レクチン結合親和性によって検出される）に基づき、精製されてもよい。複数の精製ステップは、所望の純度レベルを得るように実施されてもよい。例示的な実施形態では、所望のタンパク質またはマルチサブユニット複合体は、免疫グロブリン定常領域を含んでもよく、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ親和性、サイズ排除クロマトグラフィ、及び（グリコシル化形態を除去するための）レクチンへの結合の欠損を用いて、精製されてもよい。任意に、精製中にタンパク質分解を阻害するために、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）などのＡプロテアーゼ阻害剤が添加されてもよい。

核酸は、別の核酸配列との機能的な関係に置かれるとき、「作動可能に連結される」。例えば、シグナル配列のためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現された場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモータまたはエンハンサは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。概して、「作動可能に連結される」は、結合されているＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合、連続的かつリーディングフレーム中であることを意味する。しかしながら、エンハンサは、連続的である必要はない。結合は、便利な制限部位での連結によって、あるいは当業者によく知られているＰＣＲ／組み換え方法を介して達成されてもよい（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ Ｃａｌｉｆ）。そのような制限部位が存在しない場合、従来の慣例に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用されてもよい。所望の核酸（作動可能に連結された配列を含む拡散を含む）はまた、化学合成によって生成されてもよい。

プロモータは、それらが作動可能に連結される特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（概して約１００〜１０００ｂｐ以内）に位置する非翻訳配列（５’）である。そのようなプロモータは、いくつかの種類に分類される：誘導性、構成的、及び抑制プロモータ（リプレッサの非存在に応答して転写レベルを増加する）。誘導性プロモータは、培養条件の何らかの変化、例えば、栄養素の存在もしくは非存在、または温度の変化に応答したそれらの制御下で、ＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始し得る。

酵母プロモータフラグメントはまた、相同組み換え及び酵母ゲノム中の同一部位への発現ベクターの組み込みのための部位としての役割を果たし得る。あるいは、選択可能なマーカーが、相同組み換えのための部位として使用される。ピキア形質転換は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６−３３８５に記載される。

ピキアからの好適なプロモータの例としては、ＣＵＰ１（培地中の銅レベルによって誘導される）、テトラサイクリン誘導性プロモータ、チアミン誘導性プロモータ、ＡＯＸ１プロモータ（Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１３１６−１３２３）；ＩＣＬ１プロモータ（Ｍｅｎｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｙｅａｓｔ ２０（１３）：１０９７−１０８）；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモータ（ＧＡＰ）（Ｗａｔｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅ １８６（１）：３７−４４）；及びＦＬＤ１プロモータ（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ ２１６（１）：９３−１０２）が挙げられる。ＧＡＰプロモータは、強力な構成的プロモータであり、ＣＵＰ１、ＡＯＸ、及びＦＬＤ１プロモータは、誘導性である。各上記の参考文献の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

他の酵母プロモータとしては、ＡＤＨ１、アルコールデヒドロゲナーゼＩＩ、ＧＡＬ４、ＰＨＯ３、ＰＨＯ５、Ｐｙｋ、及びそれから得られるキメラプロモータが挙げられる。加えて、哺乳類、昆虫、植物、爬虫類、両生類、ウイルス、及び鳥類プロモータなどの非酵母プロモータが、本発明で使用されてもよい。最も典型的には、プロモータは、哺乳類プロモータ（発現された遺伝子に対して潜在的に内因性）を含むか、または酵母系において効率的な転写を提供する酵母もしくはウイルスプロモータを含む。

対象となるポリペプチドは、直接的にだけではなく、異種ポリペプチド、例えば、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端における特異的切断部位を有する、シグナル配列または他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組み換え生成され得る。一般的に、シグナル配列は、ベクターの一構成要素であってもよく、またはそれは、ベクターに挿入されるポリペプチドコード配列の一部であってもよい。好ましく選択される異種シグナル配列は、宿主細胞内で利用可能な標準的な経路のうちの１つを通して認識及び処理されるものである。サッカロミセス・セレビシアα因子プレプロシグナルは、ピキア・パストリスからの種々の組み換えタンパク質の分泌において有効であることが証明されている。他の酵母シグナル配列としては、α接合因子シグナル配列、インベルターゼシグナル配列、及び他の分泌された酵母ポリペプチドから得られるシグナル配列が挙げられる。加えて、これらのシグナルペプチド配列は、２倍体酵母発現系中の強化された分泌を提供するように操作されてもよい。対象となる他の分泌シグナルはまた、哺乳類シグナル配列を含み、それは、分泌されるタンパク質に対して異種であってもよく、または分泌されるタンパク質に対して天然配列であってもよい。シグナル配列は、プレペプチド配列を含み、場合によっては、プロペプチド配列を含んでもよい。免疫グロブリン鎖上などに見られるシグナル配列、例えば、Ｋ２８プレプロ毒素配列、ＰＨＡ−Ｅ、ＦＡＣＥ、ヒトＭＣＰ−１、ヒト血清アルブミンシグナル配列、ヒトＩｇ重鎖、ヒトＩｇ軽鎖を含む、多くのそのようなシグナル配列は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １１（２）７５（１９９８）；及びＫｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ．ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ２（４）２５７（１９９８）を参照されたく、それらのそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

転写は、ベクターに転写活性化配列を挿入することによって増加されてもよい。これらの活性化因子は、その転写を増加させるためにプロモータに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの、ＤＮＡのシスエレメントである。転写エンハンサは、イントロン内、ならびにコード配列自体のうちで、比較的配向及び位置に依存せず、転写単位に対して５’及び３’に見られている。エンハンサは、コード配列に対して位置５’または３’で発現ベクターにスプライスされてもよいが、好ましくは、プロモータから部位５’に位置する。

真核宿主細胞で使用される発現ベクターはまた、転写の終止及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有してもよい。そのような配列は、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの非翻訳領域中で、３’から翻訳終止コドンまで一般的に利用可能である。これらの領域は、ｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチド断片を含有する。

上記の構成要素のうちの１つ以上を含有する好適なベクターの構築は、標準的な連結技術またはＰＣＲ／組み換え方法を採用する。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、必要とされるプラスミドを生成するのに所望の形態で、または組み換え方法を介して、切断、調整、及び再連結される。構築されるプラスミド中の正確な配列を確認するための分析に対して、宿主細胞を形質転換するために、連結混合物が使用され、成功した形質転換体は、適切な場合、抗生物質抵抗性（例えば、アンピシリンまたはゼオシン）によって選択される。形質転換体からのプラスミドが調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され、及び／または配列される。

フラグメントの制限及び連結の代替方法として、ａｔｔ部位及び組み換え酵素に基づく組み換え方法が、ベクターにＤＮＡ配列を挿入するために使用されてもよい。そのような組み換え方法は、例えば、Ｌａｎｄｙ（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３−９４９によって記載され、当業者に既知である。そのような方法は、λ及び大腸菌によりコードされる組み換えタンパク質の混合物によって媒介される分子間ＤＮＡ組み換えを利用する。組み換えは、相互作用するＤＮＡ分子上の特異的な付着（ａｔｔ）部位の間で生じる。ａｔｔ部位の記載については、Ｗｅｉｓｂｅｒｇ ａｎｄ Ｌａｎｄｙ（１９８３）Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ，ｉｎ Ｌａｍｂｄａ ＩＩ，Ｗｅｉｓｂｅｒｇ，ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．２１１−２５０を参照されたい。組み換え部位に隣接するＤＮＡ断片は、組み換え後に、ａｔｔ部位が各親ベクターにより供与される配列を含むハイブリッド配列になるように切り換えられる。組み換えは、任意のトポロジーのＤＮＡの間で生じ得る。各上記の参考文献の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

Ａｔｔ部位は、対象となる配列を適切なベクターに連結すること；ａｔｔ Ｂ部位を含有するＰＣＲ産物を特異的プライマーの使用によって生成すること；ａｔｔ部位を含有する適切なベクターへクローン化されるｃＤＮＡライブラリを生成することなどによって、対象となる配列へ導入されてもよい。

単シストロン及び多シストロン遺伝子。単シストロン遺伝子は、単一のタンパク質のみを翻訳するために、遺伝子情報を含有するＲＮＡをコードする。多シストロン遺伝子は、２つ以上のタンパク質を翻訳するために、遺伝子情報を含有するｍＲＮＡをコードする。多シストロン遺伝子でコードされたタンパク質は、同一もしくは異なる配列またはこれらの組合せを有してもよい。ジシストロニックまたはバイシストロニックは、２つのタンパク質をコードする多シストロン遺伝子を指す。多シストロン遺伝子は任意に、キャップ非依存性翻訳開始を促進するための１つ以上の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素を含み、それは、ｍＲＮＡ分子の５’末端に結合される５’キャップ構造とは無関係に、下流タンパク質コード領域の翻訳を促すことができる位置に置かれてもよい。任意の既知のＩＲＥＳ配列（例えば、本来ウイルス、真核、または人工の）が使用され得る。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＰＮＡＳ ９８：１２９７２−１２９７７に記載されるように、遺伝子間領域（ＩＧＲ）中のコオロギ麻痺ウイルスＩＲＥＳ配列が使用されてもよい。任意に、ＩＲＥＳ機能は、遺伝子変化によって、例えば、ｅＩＦ２キナーゼＧＣＮ２の構成的発現を引き起こすか、または破壊された２つの開始ｔＲＮＡ（ｍｅｔ）遺伝子を破壊することによって強化されてもよい（同文献）。

本明細書で使用される折り畳みは、アミノ酸残基間の相互作用がその構造を安定化するように作用する、ポリペプチド及びタンパク質の三次元構造を指す。非共有相互作用が構造の決定において重要であるが、通常、対象となるタンパク質は、２つのシステイン残基によって形成される分子内及び／または分子間の共有ジスルフィド結合を有する。自然発生的なタンパク質及びポリペプチドまたはその誘導体及び変異体に対して、適切な折り畳みは、典型的には、最適な生物活性をもたらす配置であって、便利に、活性、例えば、リガンド結合、酵素活性などのアッセイによって監視され得る。

場合によっては、例えば、所望の産物が合成起源である場合、生物活性に基づくアッセイは、あまり意味がないであろう。そのような分子の適切な折り畳みは、物理特性、エネルギー的考察、モデリング試験などに基づき決定されてもよい。

発現宿主は、折り畳み及びジスルフィド結合形成を増強する１つ以上の酵素、すなわち、フォルダーゼ、シャペロニン、ＰＤＩ、ＢＩＰ、シクロフィリンなどをコードする配列の導入によってさらに修飾されてもよい。そのような配列は、当該技術分野において既知のベクター、マーカーなどを使用して、酵母宿主細胞中で構成的または誘導的に発現されてもよい。好ましくは、所望の発現パターンに十分な転写調節要素を含む配列は、標的化方法によって酵母ゲノムに安定的に組み込まれる。

例えば、真核ＰＤＩは、タンパク質システイン酸化及びジスルフィド結合異性化の効率的な触媒であるだけではなく、シャペロン活性も示す。ＰＤＩの同時発現は、複数のジスルフィド結合を有する活性タンパク質の生成を促進することができる。また、ＢＩＰ（免疫グロブリン重鎖結合タンパク質）；シクロフィリンなどの発現も対象となる。本発明の一実施形態では、マルチサブユニット複合体は、接合することによって生成される酵母菌株から発現されてもよく、１倍体の親株のそれぞれが異なる折り畳み酵素を発現し、例えば、一方の菌株がＢＩＰを発現してもよく、もう一方の菌株がＰＤＩまたはその組合せを発現してよい。

用語「所望のタンパク質」または「標的タンパク質」は、同じ意味で使用され、概して、本明細書に記載される抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその結合部分など、異種マルチサブユニットタンパク質を指す。

用語「抗体」は、エピトープに適し、かつそれを認識する、特定の形状を有する任意のポリペプチド鎖含有分子構造を含み、１つ以上の非共有結合相互作用は、分子構造とエピトープとの間で複合体を安定させる。典型的な抗体分子は、免疫グロブリンであり、全ての源、例えば、ヒト、齧歯動物、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、他の哺乳動物、ニワトリ、他の鳥類などからの全ての種類の免疫グロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなどが、「抗体」と見なされる。本発明に従った出発物質として有用な抗体を生成するのに好ましい源は、ウサギである。多数の抗体コード配列が記載されており、その他は、当該技術分野においてよく知られている方法によってもたらされてもよい。その例としては、キメラ抗体、ヒト抗体及び他の非ヒト哺乳類抗体、ヒト化抗体、ｓｃＦｖなどの一本鎖抗体、ラクダ抗体、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ（サメ由来の一本鎖抗体）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、及びＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２などの抗体フラグメントなどが挙げられる。Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ Ｖ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｓｈａｒｋ ＩｇＮＡＲ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ａｎ ｅａｒｌｙ−ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｉｓｏｔｙｐｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２００５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；１４（１１）：２９０１−９．Ｅｐｕｂ ２００５ Ｓｅｐ．３０；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｔｈａｔ ｕｎｄｅｒｇｏｅｓ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｈａｒｋｓ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９５ Ｍａｒ．９；３７４（６５１８）：１６８−７３；Ｎｕｔｔａｌｌ Ｓ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｒｏｍ ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ ｓｈａｒｋｓ，ａｎｄ ｕｓｅ ａｓ ａ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｏｐ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ａｕｇｕｓｔ；３８（４）：３１３−２６；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９３ Ｊｕｎ．３；３６３（６４２８）：４４６−８；Ｇｉｌｌ Ｄ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；１７（６）：６５３−８．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｏｃｔ．１９を参照されたい。各上記の参考文献の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、遺伝子操作によって生成されてもよい。他の方法と同様に、この技術において、抗体産生細胞は、所望の抗原または免疫原に感作される。抗体産生細胞から単離されたメッセンジャーＲＮＡは、ＰＣＲ増幅を使用してｃＤＮＡを作製するためのテンプレートとして使用される。それぞれが、初期の抗原特異性を保持する１つの重鎖遺伝子及び１つの軽鎖遺伝子を含有する、ベクターのライブラリは、発現ベクターへの増幅された免疫グロブリンｃＤＮＡへの適切な部分の挿入によって生成される。組合せライブラリは、軽鎖遺伝子ライブラリと重鎖遺伝子ライブラリを組み合わせることによって構築される。これは、重鎖及び軽鎖を同時発現させるクローンのライブラリをもたらす（抗体分子のＦａｂフラグメントまたは抗原結合フラグメントに似ている）。これらの遺伝子を担持するベクターは、宿主細胞に同時形質転換される。抗体遺伝子合成が形質転換された宿主中に誘導されるとき、重鎖及び軽鎖タンパク質は、抗原または免疫原を用いたスクリーニングによって検出され得る活性抗体を生成するために、自己集合する。

対象となる抗体コード配列は、天然配列、ならびに遺伝子コードの縮退によって開示された核酸と配列が同一ではない核酸、及びその変異体によってコードされるものを含む。変異体ポリペプチドは、アミノ酸（ａａ）置換、付加、または欠失を含むことができる。アミノ酸置換は、保存アミノ酸置換、またはグリコシル化部位を改変するため、もしくは機能に必要ではない１つ以上のシステイン残基の置換もしくは欠失によって誤った折り畳みを最小限に抑えるためなどの、非必須アミノ酸を排除するための置換であってもよい。変異体は、タンパク質の特定の領域（例えば、機能ドメイン、触媒アミノ酸残基など）の増強された生物活性を保持するか、または有するように設計され得る。変異体はまた、本明細書に開示されるポリペプチドのフラグメント、特に、生物活性のあるフラグメント及び／または機能ドメインに対応するフラグメントを含む。クローン化遺伝子のインビトロ突然変異誘発のための技術が既知である。また、タンパク分解に対するそれらの抵抗性を改善するために、または溶解特性を最適化するために、またはそれらを治療薬剤としてより好適にするために、通常の分子生物学的技術を使用して修飾されたポリペプチドも、本発明に含まれる。

キメラ抗体は、ある種の抗体産生細胞から得られる可変軽鎖及び重鎖領域（Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ）を、別の種からの定常軽鎖及び重鎖領域と組み合わせることによる組み換え手段によって、作製されてもよい。典型的には、キメラ抗体は、主にヒトドメインを有する抗体を生成するために、齧歯動物またはウサギの可変領域及びヒト定常領域を利用する。そのようなキメラ抗体は、当該技術分野においてよく知られており、標準的な手段によって達成され得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６２４，６５９号に記載されるような）。さらに、本発明のキメラ抗体のヒト定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４定常領域から選択されてもよいことも考慮される。

ヒト化抗体は、さらにより多くのヒト様免疫グロブリンドメインを含有するように操作され、動物由来の抗体の相補性決定領域のみを組み込む。これは、モノクローナル抗体の可変領域の超可変ループの配列を注意深く検査し、それらをヒト抗体鎖の構造に適合させることによって達成される。表面的には複雑であるが、その過程は実際には単純である。例えば、参照により本明細書に完全に組み込まれる、米国特許第６，１８７，２８７号を参照されたい。抗体をヒト化する方法は、交付済みの米国特許第７９３５３４０号にすでに記載され、その開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。場合によっては、活性を維持するために、追加のウサギフレームワーク残基が必要とされるかどうかの決定が必要である。場合によっては、ヒト化抗体は、いくつかの重要なウサギフレームワーク残基が、親和性または活性の喪失を最小限に抑えるために保持されることをなおも必要とする。これらの場合、所望の活性を有するために、ヒト生殖細胞系配列から再び元のウサギアミノ酸へと、単一または複数のフレームワークアミノ酸を変化させることが必要である。これらの変化は、どのウサギ残基が親和性及び活性を保存するために必要であるかを特定するために、実験的に決定される。

免疫グロブリン（またはそれらの組み換え対応物）全体に加えて、エピトープ結合部位を含む免疫グロブリンフラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、または他のフラグメント）が、合成されてもよい。「フラグメント」または最小免疫グロブリンは、組み換え免疫グロブリン技術を利用して設計されてもよい。例えば、本発明で使用するための「Ｆｖ」免疫グロブリンは、融合された可変軽鎖領域及び可変重鎖領域を合成することによって生成されてもよい。例えば、２つの異なるＦｖ特異性を含む二重特異性抗体など、抗体の組合せもまた対象となるものである。本発明の別の実施形態では、ＳＭＩＰ（小分子免疫製剤）、ラクダ抗体、ナノボディ、及びＩｇＮＡＲが、免疫グロブリンフラグメントによって包含される。

免疫グロブリン及びそのフラグメントは、翻訳後に修飾されてもよく、例えば、化学的リンカーなどのエフェクター部分、蛍光色素、酵素、毒素、基質、生物発光物質、放射性物質、化学発光部分などの検出可能部分、またはストレプトアビジン、アビジン、もしくはビオチンなどの特異的結合部分の付加が、本発明の方法及び組成物で利用され得る。追加のエフェクター分子の例は、以下に提供される。

産物関連変異体：所望の産物の調製物中に存在し、所望の産物に関連する、所望の産物（例えば、所望のマルチサブユニット複合体）以外の産物。例示的な産物関連変異体としては、短縮されたもしくは細長いペプチド、所望のグリコシル化とは異なるグリコシル化を有する産物（例えば、グリコシル化された産物が所望である場合、任意のグリコシル化された産物は、産物関連変異体であると見なされる）、異常な化学量論を有する複合体、不適切な集合、異常なジスルフィド結合、異常もしくは不完全な折り畳み、凝集、プロテアーゼ切断、または他の異常が挙げられる。例示的な産物関連変異体は、分子量（例えば、サイズ排除クロマトグラフィによって検出される）、等電点（例えば、等電点電気泳動法によって検出される）、電気泳動移動度（例えば、ゲル電気泳動によって検出される）、リン酸化状態（例えば、質量分析法によって検出される）、電荷質量比（例えば、質量分析法によって検出される）、タンパク質分解フラグメントの質量または同一性（例えば、質量分析法またはゲル電気泳動によって検出される）、疎水性（例えば、ＨＰＬＣによって検出される）、電荷（例えば、イオン交換クロマトグラフィによって検出される）、親和性（例えば、抗体の場合、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、及び／または所望の抗体が結合するエピトープへの結合によって検出される）、ならびにグリコシル化状態（例えば、レクチン結合親和性によって検出される）のうちの１つ以上の変化を示し得る。所望のタンパク質が抗体である場合、産物関連変異体という用語は、グリコ重鎖変異体及び／または半抗体種を含んでもよい（以下に記載される）。

例示的な産物関連変異体は、異常なジスルフィド結合を含有する変異体形態を含む。例えば、ほとんどのＩｇＧ１抗体分子は、合計で１６の鎖内及び鎖間ジスルフィド架橋によって安定化され、それらが、重鎖及び軽鎖の両方におけるＩｇＧドメインの折り畳みを安定させると同時に、鎖間ジスルフィド架橋は、重鎖と軽鎖との間の会合を安定させる。他の抗体の種類も同様に、鎖内及び鎖間ジスルフィド結合を安定させる特徴を含む。さらに、いくつかの抗体（本明細書に開示されるＡｂ−Ａ及びＡｂ−Ｂを含む）は、非標準的ジスルフィド結合と称される、追加のジスルフィド結合を含有する。したがって、異常な鎖間ジスルフィド結合は、共有結合の安定化がないことによる異常な複合体化学量論、及び／または追加のサブユニットへのジスルフィド結合をもたらす可能性がある。加えて、異常なジスルフィド結合（鎖間または鎖内であるかどうかにかかわらず）は、抗体の構造的安定性を減少させる可能性があり、それは、活性の減少、安定性の減少、凝集体を形成する傾向の増加、及び／または免疫原性の増加をもたらす可能性がある。異常なジスルフィド結合を含有する産物関連変異体は、非還元変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動法、ｃＩＥＸ、質量分析法（任意に、遊離システインの質量シフトをもたらすための化学修飾を用いた）、サイズ排除クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、光散乱性変化、及び当該技術分野において既知の任意の他の好適な方法を含む、種々の方法で検出され得る。例えば、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ２００２，Ｐａｒｔ Ｖ，５８１−５８３，ＤＯＩ：１０．１３８５／１−５９２５９−１６９−８：５８１を参照されたい。

半抗体、半抗体種、またはＨ１Ｌ１は、単一重及び単一軽抗体鎖を含むが、第２の重及び軽抗体鎖への共有結合を有しない、タンパク質複合体を指す。２つの半抗体は、いくつかの条件下で非共有結合したままであってもよいが、完全Ｈ２Ｌ２抗体とは分離したそれらの検出を促進するために、適切な条件（例えば、洗剤、塩、または温度）下で分離されてもよい。同様に、Ｈ２Ｌ１は、２つの重抗体鎖及び１つの軽抗体鎖を含むが、第２の軽抗体鎖への共有結合を有しない、タンパク質複合体を指し、これらの複合体もまた、別の軽抗体鎖と非共有結合し得る（同様に、完全抗体と同様の挙動を示す）。完全抗体のように、半抗体種及びＨ２Ｌ１種は、還元条件下で、個々の重鎖及び軽鎖に分解し得る。半抗体種及びＨ２Ｌ１種は、完全抗体よりも低い見かけの分子量で移動する種として、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで検出され得、例えば、Ｈ１Ｌ１は、完全抗体の見かけの分子量の約半分で移動する（例えば、約７５ｋＤａ）。

グリコ重鎖変異体は、時に抗体調製物中に存在し、少なくとも部分的なＦｃ配列を含有する、グリコシル化された産物関連変異体を指す。グリコ重鎖変異体は、ＳＤＳ−ＡＧＥによって観察可能な電気泳動移動度の減少（正常な重鎖に対して）、レクチン結合親和性、抗Ｆｃ抗体への結合、及びサイズ排除クロマトグラフィによって決定されるような、グリコ重鎖変異体を含有する抗体複合体のより高い見かけの分子量を特徴とする。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年８月３１日出願の米国仮出願第６１／５２５，３０７号（代理人整理番号６７８５８．７３０２００）を参照されたい。

用語「所望の分泌される異種ポリペプチドを安定的に発現するか、または長時間にわたって発現する、倍数体酵母」は、少なくとも数日〜１週間、より好ましくは少なくとも１ヶ月、なおより好ましくは少なくとも１〜６ヶ月間、及びさらにより好ましくは１年を超える間、典型的には、少なくとも５０〜５００ｍｇ／リットル（約９０時間の培養後）、及び好ましくは実質的にそれ以上の発現の閾値レベルで、上記のポリペプチドを分泌する、酵母培養を指す。

用語「所望の量の組み換えポリペプチドを分泌する倍数体酵母培養」は、安定的に、または長時間にわたって、少なくとも５０〜５００ｍｇ／リットル、及び最も好ましくは５００〜１０００ｍｇ／リットル以上を分泌する培養を指す。

遺伝子コードに従ったポリヌクレオチド配列の翻訳がポリペプチド配列をもたらす（すなわち、ポリヌクレオチド配列がポリペプチド配列を「コードする」）場合、ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチド配列に「対応し」、２つの配列が同じポリペプチド配列をコードする場合、一方のポリヌクレオチド配列は、他方のポリヌクレオチド配列に「対応する」。

ＤＮＡ構築物の「異種」領域またはドメインは、本質的により大きい分子と関連して見られない、より大きいＤＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能な断片である。したがって、異種領域が哺乳類遺伝子をコードするとき、遺伝子は通常、元の生物のゲノム中の哺乳類ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡによって隣接される。異種領域の別の例は、コード配列自体が自然において見られない構築物である（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含有するｃＤＮＡ、または本来の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変異または自然発生的突然変異事象は、本明細書で定義されるＤＮＡの異種領域を引き起こさない。

「コード配列」は、（遺伝子コードを考慮して）タンパク質またはペプチド配列に対応する、またはそれをコードするコドンのインフレーム配列である。２つのコード配列は、配列またはそれらの相補配列が同一のアミノ酸配列をコードする場合、互いに対応する。適切な調節配列と関連したコード配列は、ポリペプチドに転写及び翻訳されてもよい。ポリアデニル化シグナル及び転写終止配列は通常、コード配列に対して３’に位置する。「プロモータ配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ調節領域である。プロモータ配列は典型的には、コード配列の転写に影響を及ぼす調節分子（例えば、転写因子）の結合のための追加の部位を含有する。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼが細胞中のプロモータ配列と結合し、コード配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、それがコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳されるとき、プロモータ配列の「制御下」にあるか、またはプロモータに「作動可能に連結」される。

ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質などの異種物質を生物または宿主細胞に導入するために、ベクターが使用される。典型的なベクターとしては、組み換えウイルス（ポリヌクレオチドに対して）及びリポソーム（ポリペプチドに対して）が挙げられる。「ＤＮＡベクター」は、別のポリヌクレオチド断片が、付着した断片の複製をもたらすために付着され得る、プラスミド、ファージ、またはコスミッドなどのレプリコンである。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞によるポリペプチド合成を促す調節配列を含有する、ＤＮＡベクターである。これは通常、ＲＮＡポリメラーゼと結合し、ｍＲＮＡの転写を開始するプロモータ、ならびにｍＲＮＡのポリペプチド（複数可）への翻訳を促すリボソーム結合部位及び開始シグナルを意味する。適切な部位における、かつ正しいリーディングフレーム中の、ポリヌクレオチド配列の発現ベクターへの組み込み、それに続くベクターによる適切な宿主細胞の形質転換は、上記のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの生成を可能にする。

ポリヌクレオチド配列の「増幅」は、特定の核酸配列の複数のコピーのインビトロ生成である。増幅された配列は通常、ＤＮＡの形態である。そのような増幅を実施するための種々の技術は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、以下の総説に記載される：Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ １９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８（４）：２９１−２９４；及びＧｉｌｌ ａｎｄ Ｇｈａｅｍｉ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２００８ Ｍａｒ；２７（３）：２２４−４３。ポリメラーゼ連鎖反応またはＰＣＲは、核酸増幅の典型であり、本明細書でのＰＣＲの使用は、他の好適な増幅技術を例示するものと見なされるべきである。

ほとんどの脊椎動物（哺乳動物を含む）における抗体の全体構造が、ここでよく理解される（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９０：５（１９７１））。従来の抗体は、分子量が約２３，０００ダルトン（「軽鎖」）の２つの同一の軽ポリペプチド鎖、及び分子量が５３，０００〜７０，０００（「重鎖」）の２つの同一の重鎖からなる。４つの鎖は、「Ｙ」構成においてジスルフィド結合によって結合され、軽鎖は、「Ｙ」構成の開口部から開始し、重鎖を囲む。「Ｙ」構成の「分岐」部分は、Ｆ_ａｂ領域に指定され、「Ｙ」構成のステム部分は、Ｆ_Ｃ領域に指定される。アミノ酸配列配向は、「Ｙ」構成の最上部のＮ末端から各鎖の底部のＣ末端に達する。Ｎ末端は、それを誘発した抗原に対する特異性を有する可変領域有し、長さが約１００のアミノ酸であり、軽鎖と重鎖との間、及び抗体間でわずかな変動がある。

可変領域は、鎖の残りの長さに延在し、特定の種類の抗体（すなわち、それを誘発する抗原）内で、抗体の特異性によって変化しない定常領域に、各鎖中で結合される。免疫グロブリン分子の種類を決定する、５つの既知の主な種類の定常領域がある（γ、μ、α、δ、及びε重鎖定常領域に対応する、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）。定常領域または種類が、相補体の活性化（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｐ．４１３−４３６，Ｈｏｌｔ，Ｒｉｎｅｈａｒｔ，Ｗｉｎｓｔｏｎ（１９７６））、及び他の細胞応答（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ １−１８，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ（１９８０）；Ｋｏｈｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４８：１８７（１９８３））を含む、抗体の後続のエフェクター機能を決定する一方で、可変領域は、それが反応する抗原を決定する。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。各重鎖の種類は、κまたはλ軽鎖のいずれかと対になり得る。軽鎖及び重鎖は、互いに共有結合し、２つの重鎖の「尾」部分は、免疫グロブリンがハイブリドーマまたはＢ細胞のいずれかによって生成される場合、共有ジスフィルド結合によって互いに結合する。

「可変領域」または「ＶＲ」という表現は、抗原への抗体の結合に直接関与する、抗体中の軽鎖及び重鎖の各対内のドメインを指す。各重鎖は一端に、多くの定常ドメインが後に続く可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）、及びそのもう一端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は、重鎖の第１の定常ドメインと整合し、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整合する。

「相補性決定領域」、「超可変領域」、または「ＣＤＲ」という表現は、抗体の軽鎖または重鎖の可変領域において見られる超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ以上を指す（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，（１９８７）を参照されたい）。これらの表現は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって定義されるような超可変領域（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）、または抗体の三次元構造中の超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６ ９０１−９１７（１９８７））を含む。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によってごく接近して保持され、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲ内には、抗体−抗原相互作用においてＣＤＲによって使用される重要な接触残基を表す選択的決定領域（ＳＤＲ）として記載されている選択アミノ酸がある（Ｋａｓｈｍｉｒｉ，Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：２５−３４（２００５））。

「フレームワーク領域」または「ＦＲ」という表現は、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域内のフレームワーク領域のうちの１つ以上を指す（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，（１９８７）を参照されたい）。これらの表現は、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域内のＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列領域を含む。

「安定したコピー数」という表現は、長期間にわたって（例えば、少なくとも１日、少なくとも１週間、もしくは少なくとも１ヶ月、もしくはそれ以上）、または長期にわたる増殖世代数にわたって（例えば、少なくとも３０、４０、５０、７５、１００、２００、５００、もしくは１０００世代、もしくはそれ以上）、遺伝子（抗体鎖遺伝子など）のコピー数を実質的に維持する宿主細胞を指す。例えば、所与の時点または世代数において、培養物中の少なくとも５０％、及び好ましくは少なくとも７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の細胞が、開始細胞中と同じ遺伝子のコピー数を維持し得る。好ましい実施形態では、宿主細胞は、所望のタンパク質をコードする、または所望のマルチサブユニット複合体の各サブユニット（例えば、抗体）をコードする遺伝子の安定したコピー数を含有する。

「安定発現する」という表現は、長期間にわたって（例えば、少なくとも１日、少なくとも１週間、もしくは少なくとも１ヶ月、もしくはそれ以上）、または長期にわたる増殖世代数にわたって（例えば、少なくとも３０、４０、５０、７５、１００、２００、５００、もしくは１０００世代、もしくはそれ以上）、遺伝子またはタンパク質（抗体など）の同様の発現レベルを維持する宿主細胞を指す。例えば、所与の時点または世代数において、遺伝子またはタンパク質の生成または収率の速度が、初期の生成速度の少なくとも５０％、及び好ましくは少なくとも７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上であり得る。好ましい実施形態では、宿主細胞は、所望のタンパク質またはマルチサブユニット複合体（例えば、抗体）を安定発現する。
実施例

以下の実施例は、本発明の作製及び使用方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示され、本発明と見なされる範囲を制限することを目的としていない。使用される数値（例えば、量、温度、濃度など）に関する正確さを確実にするための努力が行われてきたが、一部の実験誤差及び偏差は認められるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は、大気または大気付近である。

上記の開示は概して、本発明を記載する。本明細書に開示される全ての参考文献は、参照により明示的に組み込まれる。例示目的のみで本明細書に提供され、本発明の範囲を制限するよう意図しない、以下の特定の実施例を参照することによって、より完全な理解が得られ得る。

実施例１

実施例１〜１０は、４つの異なるヒト化モノクローナル抗体の生成に対する方法の適用性を示す。各抗体は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）プロモータ系を使用して、ピキア・パストリス中で生成される。

我々は、抗体Ｍａｂ２の好気及び低酸素培養の間の力価の差を発見した。発酵槽中の撹拌速度を減少させることによる培養物への酸素可用性の制限は、産物形成の有意な増加をもたらした。これは、低酸素条件が、完全長抗体の生成に適用されるとき、完全に集合した、適切にジスルフィド結合した、ヒト化モノクローナル抗体に対する産物形成の有意な増加をもたらすことの、我々の最初の確認である。図３７を参照されたい。

実施例２

エタノール濃度が毒性レベルに達しないことを確実にするために、制御された方法で低酸素条件の混合代謝を促進するために、それぞれが異なるコピー数を有する、抗体Ｍａｂ１の３つの異なる菌株を、ＲＱ制御戦略（ＲＱを所望のレベル（この場合、１．１２の値）で維持するために撹拌速度を調整するフィードバック制御を使用した、撹拌の調整）を使用して、２０リットルの発酵槽中で増殖させた。それぞれの場合において、フィードバック制御機構のロバストな性質が、エタノールの毒性レベルの蓄積（典型的には２０ｇ／Ｌを超える）なしで混合代謝を可能にする。（図１〜５を参照されたい）。

実施例３

Ｍａｂ１は、ＲＱに対する３つの異なる制御設定値でのＲＱ制御戦略を使用して、低酸素条件下で培養される。この場合、ＲＱ設定値の増加は、エタノール蓄積のレベルを増加させ、細胞の蓄積を減少させるが、産物蓄積全体には有意な影響を有しない。これは、１．０９〜１．３５の範囲の設定値における、ＲＱ方法の利用を示す（図６〜１０を参照されたい）。

実施例４

我々は、Ｍａｂ１に関して、好気条件下での同じ過程に対して、ＲＱ制御によって達成されるような低酸素成長の効果を比較した。好気過程は、より低いエタノール生成（予想通り）、及び著しく低い産物形成をもたらす。（図１１〜１６を参照されたい）。

実施例５

各重鎖及び軽鎖のコピー数が異なる生成菌株を有するＭａｂ２の発酵に対して、ＲＱ制御戦略を実施した。この研究は、エタノールの蓄積を制御すると同時に、混合代謝のための低酸素環境を提供する上での、ＲＱ戦略のロバストな性質を示す（図１７〜２１を参照されたい）。

実施例６

各重鎖及び軽鎖のコピー数が異なる生成菌株を有するＭａｂ３の発酵に対して、ＲＱ制御戦略を実施した。この研究は、エタノールの蓄積を制御すると同時に、混合代謝のための低酸素環境を提供する上での、ＲＱ戦略のロバストな性質を示す（図２２〜２６を参照されたい）。

実施例７

重鎖及び軽鎖の異なるコピーを含有するＭａｂ３の菌株は、ＲＱ制御戦略を使用するが、異なるグルコース供給速度を取り入れ、増殖される。この場合も同様に、ＲＱ戦略は、エタノール濃度の効果的な制御を可能にし、非常に似た産物蓄積速度をもたらす。これは、種々の発酵条件に対するＲＱ戦略のロバスト性のさらなる証拠を提供する。（図２７〜３１を参照されたい）。

実施例８

ＲＱ戦略は、ＭＡｂ１と同じ標的に結合するが、ＭＡｂ１とは異なるそのＣＤＲにおける配列を有する、ＭＡｂ４に関して立証される。我々は、グルコース供給の２つの異なる速度を比較した。この場合も、戦略は、安定したエタノール濃度及び同様の抗体蓄積速度を可能にした。（図３２〜３６を参照されたい）。

実施例９

この実施例は、抗体または抗原結合発酵培地の生成のための発酵過程を記載する。

接種培地は、以下の表１に記載される。

表１．接種培地

^＊同じモル濃度を維持しながら、任意の化学物質（Ｘ ｎＨ_２Ｏ；ｎ≧０）は、同じ活性成分を含有するが種々の量の水を含有する、別の化学物質（Ｘ ｋＨ_２Ｏ；ｋ≠ｎ）によって置き換えられ得る。

種発酵培地

培地は、以下の表２に記載される。

組成種発酵培地

^＊同じモル濃度を維持しながら、任意の化学物質（Ｘ ｎＨ_２Ｏ；ｎ≧０）は、同じ活性成分を含有するが種々の量の水を含有する、別の化学物質（Ｘ ｋＨ_２Ｏ；ｋ≠ｎ）によって置き換えられ得る。

微量ミネラル溶液は、以下の表３に記載される。

表３．微量ミネラル溶液（ＰＴＭ１）

^＊同じモル濃度を維持しながら、任意の化学物質（Ｘ ｎＨ_２Ｏ；ｎ≧０）は、同じ活性成分を含有するが種々の量の水を含有する、別の化学物質（Ｘ ｋＨ_２Ｏ；ｋ≠ｎ）によって置き換えられ得る。

全ての成分が完全にＤＩ水に溶解されると、滅菌０．２μｍフィルタを通して濾過滅菌する。

生成培養バッチ培地は、以下の表４に記載される。

表４．生成培養バッチ培地

^＊同じモル濃度を維持しながら、任意の化学物質（Ｘ ｎＨ２Ｏ；ｎ≧０）は、同じ活性成分を含有するが種々の量の水を含有する、別の化学物質（Ｘ ｋＨ２Ｏ；ｋ≠ｎ）によって置き換えられ得る。

上記は、最小で２０分間、１２１℃で加熱滅菌することによって滅菌される。滅菌及び冷却後、４．３５ｍＬ／Ｌの微量ミネラル溶液（ＰＴＭ１）が生成培養バッチ培地に添加される。発酵槽への接種前に、４．３５ｍＬ／ＬのＰＴＭ１を含有する生成培養バッチ培地は、２４〜３０％のＮＨ_４ＯＨでｐＨ６．０に調節されるべきである。上記の値は、培地及び接種培養の両方を含む、発酵開始総容積に基づくべきである。

グルコース／酵母抽出供給液は、以下の表５に記載される。

^＊同じモル濃度を維持しながら、任意の化学物質（Ｘ ｎＨ_２Ｏ；ｎ≧０）は、同じ活性成分を含有するが種々の量の水を含有する、別の化学物質（Ｘ ｋＨ_２Ｏ；ｋ≠ｎ）によって置き換えられ得る。

エタノールボーラス組成は、以下の表６に記載される。

^＊任意に、同じ最終濃度を達成するために、エタノールのより希薄な溶液が使用され得る。

発酵過程

抗体または抗原結合フラグメントの生成のための発酵過程は、ピキア・パストリスなどの酵母によって達成される。発酵は、ワーキングセルバンクの冷凍バイアルの解凍から開始される。次いで、解凍された細胞は、振とうフラスコ中で増殖される。次いで、振とうフラスコからの培養物は、接種ステップ、それに続いて抗体の生成のためのフェドバッチ過程に使用される。任意に、接種材料は、種バッチ発酵中で細胞を増殖させるために使用され得、それは次いで、生成発酵槽に接種するために使用される。

１．接種ステップ

ワーキングセルバンクの解凍された細胞は、フラスコ接種培地の作業容積の８〜２０％を含有する、バッフル振とうフラスコ（１〜４バッフル）に移される。解凍されたワーキングセルバンクは、接種培地の容積の０．１〜１．０％で振とうフラスコに添加される。接種培養物は、２２０〜２６０ｒｐｍの撹拌速度で２９〜３１℃でインキュベートされる。種培養物は、いったん１５〜３０（最適には２０〜３０）の６００ｎｍ（ＯＤ_６００）の吸光度に相関する細胞密度に達すると、採取される。培養時間は、通常２０〜２６時間（最適には２３〜２５時間）である。

２．種発酵バッチ発酵（任意）

発酵槽は、「接種ステップ」からの接種材料が接種される。

接種材料＝種発酵培地容積の０．３％

温度：３０℃

％ＤＯ：３０％

ｐＨ：６．０

撹拌：１００〜４９０ＲＰＭのカスケード戦略

空気流：１ｖｖｍ（（空気の体積／開始発酵培地の体積）／分）

圧力：０．２バール

酸素補充は、３０％の所望の％ＤＯ設定値を維持するために、一定のｖｖｍを維持するために、空気流の対応する減少と共に最大撹拌が達成されたときに生じる

ＤＯスパイクの連続的監視

撹拌の減少及びＤＯの増加によって示される、ＤＯスパイクが生じており、炭素源（グリセロールまたはグルコース）が完全に利用され、測定された光学的濃度ＯＤ_６００が、２０よりも大きいことを示すとき、生成発酵槽開始バッチ容積の１．０〜１０％に等しい種バッチ発酵または接種培養の容積を移す。

３．バッチ培養相

バッチ培養は、発酵槽への種培養物の接種によって開始され、グリセロールの枯渇で終了する。発酵槽は、最大作業容積の３０〜４０％の調製された生成培養バッチ培地を含有する。発酵槽内で１〜１０％の接種材料を生成するために、種培養物が使用される。初期の操作パラメータは、以下の通りに設定される。

温度：２７〜２９℃

撹拌（Ｐ／Ｖ）：２〜１６ＫＷ／ｍ^３

ヘッドスペース圧力：０．７〜０．９バール

空気流：０．９〜１．４ＶＶＭ（開始体積に基づく、空気の体積／培養物の体積／分）

ＤＯ：制御なし

ｐＨ：５．９〜６．１、２４〜３０％ＮＨ_４ＯＨによって制御される

開始撹拌速度及び空気流は、初期電力／体積（Ｐ／Ｖ）及び体積／体積／分（ＶＶＭ）要件を満たすために、バッチ培養相中に一定に保たれる。バッチ培養相は、グリセロールが枯渇したときに供給を開始することによって終了する。グリセロールの枯渇は、溶存酸素（ＤＯ）値スパイクで示される。ＤＯスパイクは、ＤＯの値が数分以内に３０％超増加するときとして定義される。バッチ培養相は通常、１０〜１５時間（最適には１１〜１３時間）続く。

４．エタノールボーラス添加（任意）

上記のようなＤＯスパイクの観察後、ボーラスとして２００度の８〜１６ｇ／Ｌのエタノールが、発酵槽に添加される。これは通常、バッチ培養相の１２〜１４時間以内に生じる。

５．フェドバッチ培養相

発酵槽へのグルコース／酵母抽出供給液の供給は、ＤＯスパイク後、及びエタノールボーラス添加後、バッチ培養相内の約１２〜１４時間に開始され、発酵の終了まで続く。グルコース／酵母抽出供給液の供給速度は、１時間当たりの６〜１１ｇのグルコース／Ｌの開始体積を可能にするように設定される。グルコース／酵母抽出供給液の開始は、フェドバッチ培養相を開始する。

６．ＲＱ制御開始

呼吸商（ＲＱ）制御は、フェドバッチ培養相の開始の８時間後に開始する。初期ＲＱ設定値は、１．０９〜１．３５の範囲内である。撹拌は、ＲＱを制御するために使用される。撹拌は、ＲＱ制御設定値からカスケードされる。ＲＱ制御は、バッチ培養相の開始から約２０〜２２時間で開始され、発酵の終了まで続く。ＲＱ制御の継続時間は、約６０〜９０時間続く。

撹拌は、ＲＱの設定レベルを維持するために調節される。ＲＱ制御戦略は、以下の通りに詳述される。

ＲＱ高制御設定値：１．３５

ＲＱ低制御設定値：１．０８

最大撹拌設定値：２５５〜９５０ｒｐｍ

最小撹拌設定値：１５０〜３００ｒｐｍ

撹拌ステップ変更（各待ち時間間隔における変更）：３〜２５ｒｐｍ

待ち時間（評価間の時間）：３〜１０分

エタノール／ＲＱ制御戦略

この戦略は、エタノール濃度が細胞に対して毒性であり得る最大値を超えず、産物発現を低減し得る最小値を超えないことを確実にするために組み込まれている。

実施例１０

図３８は、低酸素及び好気条件の両方の下で生成される、Ｍａｂ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。非還元ゲルに対して、１５０ｋＤでの主なバンドに加えて、主なバンドよりも低い追加のバンドが、鎖間ジスルフィド架橋のレベルに対する産物の不均一性を示す。これらのゲルは、不均一性のレベルが低酸素条件の使用によって低減されることを示す。完全長の完全に架橋した産物の増加した均一性は、存在する他のタンパク質に対して、増加した純度、すなわち、増加した所望の産物を示す。

図３８はまた、同一試料に対する還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。この場合、２５ｋＤ及び５０ｋＤの予想されるバンドは、抗体の重鎖及び軽鎖を表す。追加のバンド、特に約５５ｋＤの重鎖よりも上のバンドは、抗体の変異体種の存在を表す。これらのゲルは、好気培養と比較して、細胞が低酸素条件下で増殖されるとき、この変異体の存在の劇的な減少を示す。

実施例１１

本実施例は、ピキア・パストリスから発現された抗体の収率及び純度に対する温度シフトの効果を試験する。抗体収率は、培養中にもたらされた上方温度シフトによって、最大で約３０％増加した。加えて、純度は、産物関連変異体及び異常な複合体の存在度の減少によって示されるように、温度シフトによって増加した。

方法

Ａｂ−Ａを、重鎖遺伝子の４つの組み込まれたコピー及び軽鎖遺伝子の３つの組み込まれたコピー（それぞれ配列番号１及び２）を含有する、ピキア・パストリス菌株から発現させた。接種材料を以下の栄養素（％ｗ／ｖ）を含む培地を使用して膨張させた：酵母抽出物３％、グリセロール２％、ＹＮＢ１．３４％、ビオチン０．００４％、及び２７．２ｇ／Ｌのリン酸一カリウム。発酵槽のための接種材料を生成するために、細胞を３０℃及び３００ｒｐｍで、シェーカーインキュベータ中で約２４〜２８時間増殖させた。

Ａｂ−Ａ配列は、以下の通りである。

Ａｂ−Ａ重鎖ポリヌクレオチド配列：

Ａｂ−Ａ軽鎖ポリヌクレオチド配列：

次いで、６Ｌ滅菌成長培地を含有するＡｐｐｌｉｋｏｎの１７Ｌの作業容積の容器に、１０％の接種材料を添加した。成長培地は、以下の栄養素を含んだ：硫酸カリウム１８．２ｇ／Ｌ、リン酸一アンモニウム３５．６ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム１２．８ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物３．７２ｇ／Ｌ、クエン酸ナトリウム二水和物１０ｇ／Ｌ、グリセロール４０ｇ／Ｌ、酵母抽出物３０ｇ／Ｌ、ＰＴＭ１微量金属４．３５ｍＬ／Ｌ、及び消泡剤２０４ １．６７ｍＬ／Ｌ。ＰＴＭ１微量金属溶液は、以下の成分を含んだ：硫酸銅五水和物６ｇ／Ｌ、ヨウ化ナトリウム０．０８ｇ／Ｌ、硫酸マンガン水和物３ｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム二水和物（ｓｏｄｉｕｍ ｍｏｌｙｂｄａｔｅ ｄｉｈｙｒａｔｅ）０．２ｇ／Ｌ、ホウ酸０．０２ｇ／Ｌ、塩化コバルト０．５ｇ／Ｌ、塩化亜鉛２０ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物６５ｇ／Ｌ、ビオチン０．２ｇ／Ｌ、及び硫酸５ｍＬ／Ｌ。バイオリアクタ過程制御パラメータを以下：撹拌９５０ｒｐｍ、空気流１．３５標準リットル／分、温度２８℃、のように設定し、ｐＨを、水酸化アンモニウムを使用して制御した（６で）。酸素補充は提供しなかった。

ＤＯスパイクと称される、溶存酸素の濃度の急速な増加によって検出した、初期グリセロールの消費まで、発酵培養を２８℃で約１２〜１６時間増殖させた。ＤＯスパイクを検出した直後、約１．１％エタノール（重量／体積）の最終濃度を達成するために、１リットルの培養物当たり１１グラムの１００％エタノールのボーラスを反応器に添加した。発酵培養を２０分間平衡化した。次いで、発酵の継続時間にわたって、供給物添加を１１ｇのグルコース／Ｌ／時間の一定速度で開始した。供給物添加を開始した約８時間後、５００ｒｐｍの最小撹拌速度及び９５０ｒｐｍの最大撹拌速度での撹拌フィードバック制御を使用して、ＲＱ制御を開始し、それにより発酵の残りの間、１．１２のＲＱ設定値を維持した。供給物は、以下の成分からなった：酵母抽出物５０ｇ／Ｌ、デキストロース無水５００ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物３ｇ／Ｌ、及びＰＴＭ１微量金属１２ｍＬ／Ｌ。任意に、クエン酸ナトリウム二水和物（１．６６ｇ／Ｌ）も供給物に添加した。供給ｐＨは、６．０であった。

供給開始５分後、培養温度を５つの異なる温度（２５℃、２９．５℃、３１℃、３２．５℃、及び３４℃）のうちの１つまで急速にシフトした。加えて、対照培養を２８℃、すなわち、温度シフトなしで維持した。発酵総時間は、約８６〜８７時間であった。

発酵全体を通して、各培養から試料を回収し、全培養液力価を決定し、本願の図面の間で一貫している任意単位で表示した。加えて、試験の終了時に、ＵＶ検出器具を有するＡｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）１２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣを使用して、還元及び非還元試料に対して実施されるサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって、抗体純度を決定した（タンパク質Ａ精製後）。試料分離には、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）からのＴＳＫｇｅｌ Ｇｕａｒｄ ＳＷｘ１ ６ｘ４０ｍＭと接続したＴＳＫｇｅｌ ＧＳ３０００ＳＷｘ１７．８ｘ３００ｍＭカラムを使用した。イソクラティックモードで、０．５ｍＬ／分の流速を有する移動相として、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５を使用し、ＵＶ２１５ｎｍでの吸光度を監視した。試料の注入前に、安定したベースラインが達成されるまで、カラムを平衡化した。移動相を使用して、試料を１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、３０μＬの体積を注入した。カラム性能を監視するために、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）ゲル濾過標準を使用した。

結果

Ａｂ−Ａを発現させるように操作されたピキア・パストリスを、炭素源としてグリセロールを用いた初期成長相中に、２８℃で維持された培養中で増殖させた。グリセロールの枯渇後、連続グルコース供給を開始し、培養温度を、２５℃〜３４℃の新しい設定温度まで上方または下方に急速にシフトし、それを培養の継続時間にわたって維持した。１つの培養を対照として２８℃で維持した。

抗体生成を監視するために、（分泌シグナルを含むことによって、抗体が分泌された）培養培地を、８６〜８７時間の最終時点まで定期的にサンプリングした。全培養液抗体力価（任意単位）が決定され、図４０に、各培養温度に対してグラフで示される。図示されるように、３１℃で維持された培養に対して、最高の最終力価が達成された。３２．５℃で維持された培養に対して、わずかに高い力価が最初に達成されたが、全培養液力価は横ばい状態になり、６５〜７０時間の間に減少し始め、最終力価は、非シフト培養に対して観察されたものよりも低かった。２９．５℃で維持された培養で、２番目に高い最終力価が観察された。３４℃まで上方にシフトされた培養及び２５℃まで下方にシフトされた培養の両方が、２８℃で維持された培養よりも低い力価を生成した。

加えて、培養の終了時（すなわち、８６〜８７時間）での抗体純度を決定した。具体的に、各培養からのタンパク質Ａ精製抗体を、排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）及びクマシー染色を用いたゲル電気泳動によって評価し（図４２〜４７）、それらを還元及び非還元試料の両方に対して実施した。非還元試料のＳＥＣ分析は、単一の重鎖及び単一の軽鎖を含有する７５ｋＤＡ「半抗体」種、ならびに２つの重鎖及び単一の軽鎖を含有する「ＨＨＬ」複合体を含む、異常な化学量論を有する複合体の相対存在量を検出した。還元試料のＳＥＣ分析は、無傷重鎖及び軽鎖、ならびに約９．８、１０．１５、及び１０．８分の溶出時間を有する異常なサブユニット（抗体重鎖のグリコシル化形態に対応すると考えられる）の相対存在量を検出した。

ＳＥＣ結果は、図４１Ａ〜Ｂに要約される。非還元ＳＥＣ分析は、総タンパク質の同様の割合が、非シフト培養（すなわち、２８℃で維持された）及び２９．５℃及び３１℃までシフトされた培養に対する主な抗体ピークに含まれたことを実証し、全ての３つの条件は、完全抗体ピーク内で総タンパク質の８８〜８９％を維持した（図４１Ａ）。したがって、誤って集合した複合体に対して、２９．５℃及び３１℃への上方シフトは、純度に悪影響を及ぼさなかった。さらに、還元ＳＥＣ分析は、非シフト培養と比較して、重鎖及び軽鎖ピーク中に含まれる総タンパク質の割合が、２９．５℃にシフトされた培養に対して同様のままであり、より高い温度シフトに対して、約４％増加したことを実証した。

それに基づき、２９．５℃または３１℃への上方温度シフト（すなわち、１．５℃〜３℃）が、最終抗体収率を増加させたことが結論付けられる。加えて、純度は、３１℃にシフトされた培養中で増加したが、純度は、２９．５℃にシフトされた培養に対しては悪影響を受けなかった。

実施例１２

本実施例は、ピキア・パストリスから発現された抗体の収率及び純度に対する温度シフトの効果を試験する。低及び高生産菌株の２つの異なる菌株を試験した。高生産菌株に対して、抗体収率は、培養中にもたらされた上方温度シフトによって、約２８％増加した。それに基づき、すでに高度に最適化された菌株からの生成は、温度シフトによって実質的に利益を得たことが結論付けられる。加えて、純度は、ほとんどの場合における産物関連変異体の存在度の減少によって示されるように、温度シフトによって増加した。

方法

Ａｂ−Ｂを、重鎖遺伝子の３または４つの組み込まれたコピー及び軽鎖遺伝子の３つの組み込まれたコピー（それぞれ配列番号３及び４）を含有する、ピキア・パストリス菌株から発現させた。接種材料を以下の栄養素（％ｗ／ｖ）を含む培地を使用して膨張させた：酵母抽出物３％、グリセロール２％、ＹＮＢ１．３４％、ビオチン０．００４％、及び２７．２ｇ／Ｌのリン酸一カリウム。発酵槽のための接種材料を生成するために、細胞を３０℃及び３００ｒｐｍで、シェーカーインキュベータ中で約２４〜２８時間増殖させた。

Ａｂ−Ｂ配列は、以下の通りである。

Ａｂ−Ｂ重鎖ポリヌクレオチド配列：

Ａｂ−Ｂ軽鎖ポリヌクレオチド配列：

次いで、６Ｌ滅菌成長培地を含有するＡｐｐｌｉｋｏｎの１７Ｌの作業容積の容器に、１０％の接種材料を添加した。成長培地は、以下の栄養素を含んだ：硫酸カリウム１８．２ｇ／Ｌ、リン酸一アンモニウム３５．６ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム１２．８ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物３．７２ｇ／Ｌ、クエン酸ナトリウム二水和物１０ｇ／Ｌ、グリセロール４０ｇ／Ｌ、酵母抽出物３０ｇ／Ｌ、ＰＴＭ１微量金属４．３５ｍＬ／Ｌ、及び消泡剤２０４ １．６７ｍＬ／Ｌ。ＰＴＭ１微量金属溶液は、以下の成分を含んだ：硫酸銅五水和物６ｇ／Ｌ、ヨウ化ナトリウム０．０８ｇ／Ｌ、硫酸マンガン水和物３ｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム二水和物（ｓｏｄｉｕｍ ｍｏｌｙｂｄａｔｅ ｄｉｈｙｒａｔｅ）０．２ｇ／Ｌ、ホウ酸０．０２ｇ／Ｌ、塩化コバルト０．５ｇ／Ｌ、塩化亜鉛２０ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物６５ｇ／Ｌ、ビオチン０．２ｇ／Ｌ、及び硫酸５ｍＬ／Ｌ。バイオリアクタ過程制御パラメータを以下：撹拌９５０ｒｐｍ、空気流１．３５標準リットル／分、温度２８℃、のように設定し、ｐＨを、水酸化アンモニウムを使用して制御した（６で）。酸素補充は提供しなかった。

ＤＯスパイクと称される、溶存酸素の濃度の急速な増加によって検出した、初期グリセロールの消費まで、発酵培養を２８℃で約１２〜１６時間増殖させた。次いで、８時間にわたって、供給物添加を１５ｇのグルコース／Ｌ／時間の速度で開始した。供給物添加を開始した約８時間後、供給物添加速度を、発酵の継続時間にわたって、１３ｇのグルコース／Ｌ／時間まで減少させた。また、１．１２のＲＱ設定値を維持するために、５００ｒｐｍの最小撹拌及び９５０ｒｐｍの最大撹拌での撹拌フィードバック制御を使用して、この時点でＲＱ制御を開始した。供給物は、以下の成分を含んだ：酵母抽出物５０ｇ／Ｌ、デキストロース無水５００ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物３ｇ／Ｌ、及びＰＴＭ１微量金属１２ｍＬ／Ｌ。任意に、クエン酸ナトリウム二水和物（１．６６ｇ／Ｌ）も供給物に添加した。

供給開始後、２つの発現菌株のそれぞれの１つの培養に対して、３０℃まで急速に培養温度をシフトした。加えて、２つの菌株のそれぞれの２つの培養に対して、対照培養を２８℃、すなわち、温度シフトなしで維持した。発酵総時間は、約８６時間であった。

発酵全体を通して、各培養から試料を回収し、全培養液力価を決定し、本願の図面の間で一貫している任意単位で表示した。加えて、試験の終了時に、実施例１１に記載される方法を使用して、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって、抗体純度を決定した（タンパク質Ａ精製後）。

結果

Ａｂ−Ｂを、軽鎖コード遺伝子の３つのコピー及び重鎖コード遺伝子の３つのコピー（Ｈ３／Ｌ３）、または軽鎖コード遺伝子の３つのコピー及び重鎖コード遺伝子の４つのコピー（Ｈ４／Ｌ３）を含有する、操作されたピキア・パストリス菌株から発現させた。炭素源としてグリセロールを用いて、培養を２８℃で最初に増殖させた。グリセロールの枯渇後、連続グルコース供給を開始し、培養温度を、３０℃まで上方に急速にシフトし、それを培養の継続時間にわたって維持したか、または対照として２８℃で維持した。

ベースラインにおいて、Ｈ４／Ｌ３菌株（図４８Ａ）は、Ｈ３／Ｌ３菌株（図４８Ｂ）よりも高い抗体力価を発現し、非シフト培養（すなわち、２８℃で維持された）に対する平均最終全培養液力価は、Ｈ４／Ｌ３菌株に対するものよりも１２％高かった。

３０℃までシフトされたＨ４／Ｌ３培養は、最終力価のさらなる２８％の増加を示した（２８℃で維持された、すなわち、シフトなしの２つのＨ４／Ｌ３培養からの平均力価に対して）。Ｈ３／Ｌ３菌株に対して、観察された最終収率の増加は、幾分顕著ではなかったが、３０℃までシフトされたＨ３／Ｌ３菌株からの収率は、２８℃で維持された（すなわち、シフトなしの）２つのＨ３／Ｌ３培養からの平均最終収率に対して、約５％増加した。

図５２は、培養中の時間に対して表示される、各培養物の温度を示す。予想通り、温度シフト後、細胞は、３０℃の新しい設定温度に迅速に達し、シフト及び非シフト培養の両方が、培養全体にわたってそれらの設定温度を維持した。

ＳＥ−ＨＰＬＣを使用して、各培養から抗体純度も評価した。実施例１１に記載されるように、非還元試料は、異常な複合体（１つの重鎖及び１つの軽鎖を含有する７５ｋＤａ「半抗体」、ならびに２つの重鎖だが１つの軽鎖のみを含有するＨＨＬ複合体）の存在度の検出を可能にした。完全抗体（「主ピークＩｇＧ」）に含まれるタンパク質の分画は、３０℃までシフトされた２つの試料に関して、それらのそれぞれの非シフト対照の平均と比較して増加し、それは、非シフト試料の平均に対して、シフトされた試料中の７５ｋＤＡ ＨＬ種及びピーク前ＨＨＬ種の両方の減少に起因した。具体的には、シフトされたＨ４／Ｌ３試料に関する８３．４４％、４．７５％、及び６．１５％のそれぞれと比較して、非シフトＨ４／Ｌ３試料に関して、完全抗体ピークに含まれるタンパク質の平均分画は、７４．３９％であり、ピーク前ＨＨＬにおいて、４．２６％であり、７５ｋＤ ＨＬは１２．６５％であった。非シフトＨ３／Ｌ３試料に関して同様に、９１．６３％、２．９４％、及び１．４４％のそれぞれと比較して、完全抗体ピークに含まれるタンパク質の平均分画は、８２．８０％であり、ピーク前ＨＨＬにおいて、５．３１％であり、７５ｋＤ ＨＬは４．７６％であった。結論として、非還元ＳＥＣ分析は、温度シフトが、（１）完全抗体ピークに含まれる抗体の平均量を増加し、（２）４つの事例のうち３つにおいて、異常な複合体の平均量を減少させたことを実証した。

また、実施例１１に記載されるように、還元された試料は、完全長重鎖及び軽鎖に含まれるタンパク質、ならびに３つの異なる溶出ピークにおいて観察された産物関連変異体の相対存在量の検出を可能にする。非還元分析で観察された異常な複合体の観察された減少とは異なり、還元された試料は、完全長重鎖及び軽鎖に含まれる抗体の量の一貫した改善を示さなかった。全体として、２つの菌株に関して、重鎖の平均相対存在量は、非シフト培養の平均と比較して、シフトされた培養において約１〜３％増加し、軽鎖の平均相対存在量は、２つの菌株に関して、変化しなかったか、または約０．９％減少した。

実施例１３

本実施例は、ピキア・パストリスから発現された抗体の収率及び純度に対する温度シフトの効果を試験する。抗体収率は、培養中にもたらされた上方温度シフトによって、平均で４７％増加した。

方法

５つの培養を２８℃で維持し（すなわち、非シフト）、４つの培養を３０℃までシフトしたことを除いて、実施例１１に記載されるように、Ａｂ−Ａを、重鎖遺伝子の４つの組み込まれたコピー及び軽鎖遺伝子の３つの組み込まれたコピーを含有する、ピキア・パストリス菌株から発現させた。実施例１１にあるように、供給開始５分後に、一度に温度シフトをもたらした。発酵総時間は、約８７時間であった。

実施例１１に記載される方法を使用して、発酵全体を通して、各培養から試料を回収し、全培養液力価を決定し、本願の図面の間で一貫している任意単位で表示し、還元及び非還元試料に対して実施されるサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって、最終時点（タンパク質Ａ精製後）において、抗体純度を各培養に対して決定した。

結果

Ａｂ−Ａを発現させるように操作されたピキア・パストリスを、炭素源としてグリセロールを用いた初期成長相中に、２８℃で維持された培養中で増殖させた。グリセロールの枯渇後、連続グルコース供給を開始し、培養温度を、２８℃の新しい設定値まで上方に急速にシフトし、それを培養の継続時間にわたって維持した（Ｎ＝４）。５つの対照培養を２８℃で維持した（すなわち、非シフト）。

全培養液抗体力価を定期的にサンプリングすることによって決定し、図５０にグラフで示される（任意単位）。図示されるように、３０℃にシフトされた４つの培養のそれぞれは、２８℃で維持された非シフト培養の全てよりも高い最終力価を生成した。平均で、最終力価は、非シフト培養よりもシフトされた培養に関して４７％高かった。

加えて、ＳＥ−ＨＬＰＣによって純度を評価し、シフト及び非シフト培養に対して比較した。非還元試料は、平均で、主な抗体ピークに含まれるタンパク質の相対量の約２％の増加を明らかにし、ピーク前ＨＨＬは、平均で約２１％減少し、７５ｋＤａ ＨＬピークは、５７％増加した。還元された試料は、純度の全体的な改善、及び３つの不純物ピーク全ての平均相対存在量の減少を明らかにした。具体的に、非シフト試料に対して、シフトされた試料は、ＲＴ９．８０ピークの２６％の減少、ＲＴ１０．１６ピークの７４％の減少、及びＲＴ１０．８０ピークの７０％の減少を示した。結論として、非還元ＳＥＣ分析は、温度シフトが、（１）完全抗体ピークに含まれる抗体の平均量を増加し、（２）３つの異常な複合体のうち２つの平均量を減少させたことを実証した。還元ＳＥＣ分析は、３つの検出された不純物ピークのそれぞれの相対存在量の大幅な減少を明らかにした。

それに基づき、２８℃または３０℃からの上方温度シフト（すなわち、２℃）が、最終抗体収率を再生可能な方法で、平均で２５〜３０％増加させたことが結論付けられる。さらに、キャピラリー電気泳動法分析によって反映されるような抗体の純度はまた、還元比較においてより顕著な、非シフト培養と比較したときの温度シフトされた培養中の純度の増加を反映した。

本発明の種々の例示された実施形態の上記の記載は、包括的であること、または本発明を開示された正確な形態に限定することを意図していない。本発明の特定の実施形態及び実施例は、例示目的で本明細書に記載されるが、種々の同等の修正が、当業者が認識するように、本発明の範囲内で可能である。本発明の本明細書に提供される教示は、上記の実施例以外の他の目的にも適用され得る。

本発明は、上記の説明及び実施例に具体的に記載されるもの以外の方法で実施されてもよい。本発明の多数の修正及び変更が上記の教示を考慮して可能であり、したがって添付の特許請求の範囲内である。

上記の詳述を考慮して、これら及び他の変更が本発明に行われ得る。概して、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、本発明を、本明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。したがって、本発明は、本開示によって限定されず、むしろ本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって完全に決定されるものである。

抗原特異的Ｂ細胞のクローン集団を得るための方法に関する、ある特定の教示は、２００６年５月１９日出願の米国仮特許出願第６０／８０１，４１２号、及び米国特許出願第２０１２／０１４１９８２号に開示され、それらのそれぞれの開示の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

ウサギ由来モノクローナル抗体のヒト化、及び抗原結合親和性を維持するための好ましい配列修飾に関する、ある特定の教示は、２００８年５月２１日出願の「Ｎｏｖｅｌ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」と題する、ＷＯ／２００８／１４４７５７に対応する、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４４２１に開示され、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。

接合コンピテント酵母を使用した抗体またはそのフラグメントの生成、及び対応する方法に関する、ある特定の教示は、２００６年５月８日出願の米国特許出願第１１／４２９，０５３号（米国特許出願公開ＵＳ２００６／０２７００４５）に開示され、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。

背景技術、発明の概要、発明を実施するための形態、及び実施例に列挙される各文書を含む、本明細書に列挙される各文書の全開示（特許、特許出願、学術論文、要約、マニュアル、書籍、または他の開示を含む）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (15)

1. ピキア属において所望の抗体タンパク質を生成する方法であって、
   （ａ）初めに、２７℃〜２８．５℃である第１の温度で、前記所望の抗体タンパク質の発現を提供する、１つ以上の遺伝子を含む、ピキア細胞を培養すること、および
   （ｂ）次いで、３０℃〜３２℃である第２の温度で前記ピキア細胞を培養し、前記ピキア細胞が前記所望の抗体タンパク質を生成することを可能にすること、を含む、前記方法。
2. 第１の温度が２７．５℃〜２８．５℃である、請求項１に記載の方法。
3. 第２の温度が３０℃〜３１．５℃である、請求項１に記載の方法。
4. 第１の温度が２７．５℃〜２８．５℃であり、かつ第２の温度が３０℃〜３１．５℃である、請求項１に記載の方法。
5. 前記所望の抗体タンパク質が、ヒト化またはヒト抗体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 以下の利益：
   （ｉ）前記方法は、前記所望の抗体タンパク質の収率を増加させる；
   （ｉｉ）前記方法は、前記第１の温度および前記第２の温度における培養なしで達成される同じ方法に対して、１つ以上の抗体関連変異体の相対存在量を減少させる；
   （ｉｉｉ）前記方法は、前記第１の温度および前記第２の温度における培養なしで達成される同じ方法に対して、サイズ排除クロマトグラフィまたはゲル電気泳動によって検出されるような、前記所望の抗体タンパク質よりも高いまたは低い見かけの分子量を有する、抗体関連変異体の相対存在量を減少させる；
   （ｉｖ）前記方法は、前記第１の温度および前記第２の温度における培養なしで達成される同じ方法に対して、異常なジスルフィド結合を有する抗体タンパク質複合体の相対存在量を減少させる；
   （ｖ）前記方法は、前記第１の温度および前記第２の温度における培養なしで達成される同じ方法に対して、減少したシステインを有する抗体タンパク質複合体の相対存在量を減少させる；
   （ｖｉ）前記方法は、前記第１の温度および前記第２の温度における培養なしで達成される同じ方法に対して、異常なグリコシル化を有する抗体タンパク質複合体の相対存在量を減少させる；
   （ｖｉｉ）前記方法は、前記第１の温度および前記第２の温度における培養なしで達成される同じ方法に対して、１つ以上の抗体関連変異体の相対存在量を減少させる；
   （ｖｉｉｉ）前記ピキア細胞は、ピキア・アンガスタ、ピキア・ギリエルモンディイ、ピキア・メタノリカ、及びピキア・イノシトベラからなる群より選択される；
   （ｉｘ）前記所望の抗体タンパク質の発現を提供する前記遺伝子は、前記ピキア細胞における１つ以上のゲノム遺伝子座に組み込まれる；
   （ｘ）前記所望の抗体タンパク質の発現を提供する前記遺伝子は、前記ピキア細胞における１つ以上のゲノム遺伝子座に組み込まれ、前記ゲノム遺伝子座のうちの少なくとも１つは、ｐＧＡＰ遺伝子座、３’ＡＯＸ ＴＴ遺伝子座；ＰｐＵＲＡ５；ＯＣＨ１；ＡＯＸ１；ＨＩＳ４；ＧＡＰ；ｐＧＡＰ；３’ＡＯＸ ＴＴ；ＡＲＧ；及びＨＩＳ４ ＴＴ遺伝子座からなる群より選択される；
   （ｘｉ）前記所望の抗体タンパク質のサブユニットをコードする遺伝子のうちの少なくとも１つは、誘導性または構成的プロモータの制御下で発現される；および
   （ｘｉｉ）前記所望の抗体タンパク質のサブユニットをコードする遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＡＯＸ１、ＣＵＰ１、テトラサイクリン誘導性、チアミン誘導性、及びＦＬＤ１プロモータからなる群より選択される誘導性プロモータの制御下で発現される；
   の１つまたはそれより多くを提供する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. ステップ（ａ）は、グリセロールが枯渇するまで、前記グリセロールを炭素源として含む培養培地中で、前記ピキア細胞を培養することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記所望の抗体タンパク質が、酵母プロモータ、哺乳類プロモータ、昆虫プロモータ、植物プロモータ、爬虫類プロモータ、両生類プロモータ、ウイルスプロモータ、および鳥類プロモータより選択されるプロモータの制御下で発現される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記所望の抗体タンパク質は、ＣＵＰ１、ＡＯＸ１、ＩＣＬ１、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、ＦＬＤ１、ＡＤＨ１、アルコールデヒドロゲナーゼＩＩ、ＧＡＬ４、ＰＨＯ３、ＰＨＯ５、及びＰｙｋプロモータ、テトラサイクリン誘導性プロモータ、およびチアミン誘導性プロモータからなる群より選択される、プロモータの制御下で発現される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記ピキア細胞は、１倍体、２倍体、４倍体細胞、または倍数体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記ピキア細胞から、またはピキア培養培地から前記所望の抗体タンパク質を精製することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記所望の抗体タンパク質は、前記ピキア細胞の細胞内成分、細胞質、核質、または膜から精製される、請求項１１に記載の前記方法。
13. 前記ピキア細胞は、前記所望の抗体タンパク質を培養培地中に分泌する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の前記方法。
14. 以下：
    （ｉ）ステップ（ａ）は、バッチ相を含み、任意に前記バッチ相は、炭素源を含む培地中で前記ピキア細胞を培養することを含み、任意に前記バッチ相の終了は、前記培養培地中の前記炭素源の枯渇によって決定される；
    （ｉｉ）ステップ（ｂ）は、フェドバッチ相を含む；
    の１つまたはそれより多くを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記所望のタンパク質をコードする前記遺伝子または複数の遺伝子の転写を調節する、前記プロモータまたは複数のプロモータは、温度誘導性ではない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。