KR20220097910A - 세포 선택 방법 - Google Patents

Abstract

본원에는 생산 세포, 및 기능적 N-말단 조절 도메인이 결여된 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)를 암호화하는 서열, 및 GTP 사이클로하이드롤라제 1(GCH1)을 암호화하는 서열의 조합에 기반하여, 티로신 영양요구성 선택 마커 시스템을 포함하는 생산 세포를 식별, 선택, 또는 배양하는 방법이 기재된다. 또한 생산 세포를 만드는 방법 및 상기 생산 세포로 생성물을 만드는 방법이 기재된다.

Description

세포 선택 방법

본 개시내용은 대상 핵산 서열을 포함하는 세포를 식별, 선택, 또는 배양하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

세포 발현 시스템은 치료 생물제제와 같은 재조합 생물학적 생성물의 생산을 위해 통상적으로 사용된다. 생산 라인 세포의 개발은 관심 재조합 생성물을 암호화하는 핵산 작제물을 숙주 세포 내로 도입하고 이러한 핵산 작제물을 함유하는 세포를 선택하는 것을 수반한다. 이는 일반적으로 외래 핵산을 취한 세포를 선호하도록 세포에 선택 압력을 가하는 것을 수반한다. 초기 선택가능한 마커 시스템은 항생제 내성 마커를 사용하였지만 이러한 시스템의 사용으로부터 멀어지는 경향이 있다. 일부 대체 시스템은 대사 결핍을 보완하는 것 예를 들어 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 및 글루타민 합성효소(GS)에 기반한다. 그러나 재조합 생물학적 생성물을 생산하는 데 사용되는 세포를 선택하는 데 사용될 수 있는 새로운 선택 시스템에 대한 필요성이 남아있다. 추가로, 생산 숙주 세포 조작 전략이 점점 더 사용되고 있으므로, 숙주 세포 특성을 변형시키는 새로운 서열의 도입을 수반하는 이러한 전략은 생물학적 생성물을 암호화하는 서열의 도입을 위해 사용되는 기존 또는 향후 선택 시스템으로부터 분리된 선택 시스템으로부터 이익을 얻을 것이다.

본 발명은 티로신 영양요구성-기반 선택 시스템 및 배지에 티로신을 포함할 필요가 없는 재조합 생성물의 제조에 관한 것이다. 본 발명자들은 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH - 이는 페닐알라닌의 티로신으로의 전환을 촉매함) 단독에 기반한 시스템이 효과적이지 않고 티로신 생합성과 관련된 두번째 효소, 즉 GTP 사이클로하이드롤라제 1(GCH1)을 포함할 필요가 있음을 밝혀내었다. 추가로 본 발명자들은 N-말단 조절 도메인을 제거하는 절두가 있는 PAH의 사용이 전장 효소와 비교하여 유의한 이점을 제공함을 밝혀내었다. 전장 CHO PAH의 사용은 형질감염 후 티로신-무함유 배지에서 회수되지 않거나 또는 훨씬 더 느린 회수 시간을 초래한 반면, 분자의 절두된(tPAH) 버전은 우수한 회수를 허용하였다. PAH와 GCH1의 조합은 세포가 이들 효소를 발현하지 않는 유사한 세포보다 더 낮은 수준의 티로신(예를 들어, 이의 부재)에서 성장하게 한다.

따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 하나 이상의 핵산 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 제공한다:

a) 숙주 세포에서 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)의 발현을 가능하게 하는 제1 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 기능적 N-말단 조절 도메인이 결여된 PAH를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 핵산 서열;

b) 숙주 세포에서 GTP 사이클로하이드롤라제 1(GCH1)의 발현을 가능하게 하는 제2 제어 서열에 작동가능하게 연결된 GCH1을 암호화하는 서열을 포함하는 제2 핵산 서열; 및

c) 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제3 제어 서열에 작동가능하게 연결된 관심 생성물을 암호화하는 하나 이상의 서열을 삽입하기 위한 다중 클로닝 부위.

관련된 측면에서 본 발명은 또한 다음을 포함하는 하나 이상의 핵산 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 제공한다:

a) 숙주 세포에서 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)의 발현을 가능하게 하는 제1 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 기능적 N-말단 조절 도메인이 결여된 PAH를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 핵산 서열;

b) 숙주 세포에서 GTP 사이클로하이드롤라제　1(GCH1)의 발현을 가능하게 하는 제2 제어 서열에 작동가능하게 연결된 GCH1을 암호화하는 서열을 포함하는 제2 핵산 서열; 및

c) 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제3 제어 서열에 작동가능하게 연결된 관심 생성물을 암호화하는 서열을 포함하는 제3 핵산 서열.

이러한 벡터는 숙주 세포, 및 형질전환되지 않은 세포의 효율적인 성장을 허용하지 않는 티로신-제한 조건 하에 선택된 벡터를 함유하는 그러한 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서 제2 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 숙주 세포를 제공한다:

a) 숙주 세포에서 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)의 발현은 가능하게 하는 제1 제어 서열에 작동가능하게 연결된 PAH를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 외인성 핵산; 및

b) 숙주 세포에서 GTP 사이클로하이드롤라제 1(GCH1)의 발현을 가능하게 하는 제2 제어 서열에 작동가능하게 연결된 GCH1을 암호화하는 제2 외인성 핵산; 및

c) 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제3 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 관심 생성물을 암호화하는 제3 외인성 핵산.

일 구현예에서 제1, 제2 및 제3 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다.

일 구현예에서, 숙주 세포는 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.

본 발명의 다양한 측면에서, PAH에서 기능적 N-말단 조절 도메인의 결여는 예를 들어 절두된 PAH를 형성하기 위한 결실로 인한 것일 수 있다. 인간 및 CHO PAH 아미노산 서열에 기반하여 이는 전형적으로 약 처음 116 개 아미노산의 결실이다.

일 구현예에서, PAH는 CHO PAH 또는 인간 PAH이다.

일 구현예에서 제1 및/또는 제2 제어 서열은 SV40 프로모터를 포함한다.

본 발명의 벡터 시스템은 전형적으로 재조합 폴리펩티드와 같은 관심 생성물을 암호화하는 핵산으로 성공적으로 형질전환된 세포를 선택하는 데 사용된다. 따라서 제3 측면에서, 본 발명은 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

a) 티로신의 부재 하에 생존 또는 성장할 수 없는 세포 집단을 세포에 의해 벡터 시스템의 흡수를 허용하는 조건 하에 본 발명의 벡터 시스템과 접촉시키는 단계;

b) 티로신 수준이 벡터 시스템에 의해 암호화된 PAH 및 GCH1 효소를 발현하지 않는 세포의 생존 또는 성장에 필요한 수준보다 더 낮은 조건 하에 세포를 배양하는 단계; 및

c) 이러한 조건 하에 성장할 수 있는 하나 이상의 세포를 선택하여 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 하나 이상의 세포를 수득하는 단계를 포함한다.

티로신 수준은 엄격한 선택을 보장하도록 선택되고 임의적으로 페닐알라닌이 보충된다. 일 구현예에서 배양 배지는 첨가된 티로신을 포함하지 않는다.

관련된 측면에서 본 발명은 세포 내로 도입된 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 세포를 세포 집단으로부터 선택하기 위한 본 발명의 벡터 시스템의 용도를 제공한다.

본 발명의 선택 방법에 의해 수득되는 선택된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 형성한다. 따라서, 제4 측면에서 본 발명은 다음을 포함하는 숙주 세포를 제공한다:

a) 숙주 세포에서 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)의 발현은 가능하게 하는 제1 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 기능적 N-말단 조절 도메인이 결여된 PAH를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 외인성 핵산 서열; 및

b) 숙주 세포에서 GTP 사이클로하이드롤라제 1(GCH1)의 발현을 가능하게 하는 제2 제어 서열에 작동가능하게 연결된 GCH1을 암호화하는 제2 외인성 핵산; 및

c) 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제3 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 관심 생성물을 암호화하는 제3 외인성 핵산.

본 발명의 숙주 세포는 임의의 내인성 PAH 및/또는 GCH1 활성을 억제 또는 폐지하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 일 구현예에서 이는 내인성 PAH 및/또는 GCH1의 발현을 암호화 및/또는 조절하는 게놈 서열에서의 돌연변이(삽입, 결실 및/또는 치환)에 의해 달성될 수 있다.

관심 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 선택된 숙주 세포는 전형적으로 해당 생성물의 제조에 사용될 것이다. 따라서 제5 측면에서, 본 발명은 생성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 생성물을 발현하는 데 적합한 조건 하에 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 생성물을 회수하는 단계, 및 임의적으로 회수된 생성물을 하나 이상의 처리 또는 정제 단계에 적용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 숙주 세포 및 선택 공정을 사용하여 개발된 세포주가 대규모 제조에 사용되는 경우, 배양 단계 동안 티로신을 생략함으로써 선택 압력을 가하는 것은 더 이상 필수적이지 않을 수 있다. 그러나, 필수 아미노산으로 간주되는 티로신은 임의의 아미노산의 물에서의 용해도가 시스테인 다음으로 두번째로 낮다. 티로신의 낮은 용해도는 예를 들어, 생물반응기에서 예를 들어 유가식(fed-batch) 생물공정에서 생물제조 조건 하에 세포 배양을 지원하기에 충분한 농도의 공급 용액을 생성하기 위한 도전과제일 수 있다.

본 발명의 숙주 세포는 낮은 수준의 티로신(부재 포함)에서 효율적으로 성장될 수 있고 고농도 티로신 공급 용액에 대한 필요성을 줄일 수 있다. 페닐알라닌은 티로신을 생산하기 위해 세포에 의해 소비되므로, 일 구현예에서, 배양 배지는 페닐알라닌이 보충된다.

본 발명은 또한 적어도 3 또는 4 개의 아미노산과 같은 복수의 아미노산을 포함하는 공급물과 같은 배양 배지를 제공하며, 여기서 수용액 중 0.01 g/L 미만의 티로신, 예컨대 50, 20 또는 10 μM 미만의 티로신(예를 들어, 티로신 없음) 및 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, mM 페닐알라닌이 있다. 전형적으로 배양 배지는 10 mM 미만의 페닐알라닌을 포함한다. 본 발명은 또한 적어도 3 또는 4 개의 아미노산과 같은 복수의 아미노산을 포함하는 실질적으로 건조 형태의 배양 배지 혼합물(예를 들어, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만의 물을 포함하며, 예를 들어, 현저하게 물을 포함하지 않음)을 적절한 부피의 물을 첨가함으로써 상기 배양 배지가 제조되도록 티로신 및 페닐알라닌의 수준으로 제공한다.

본 발명은 벡터 시스템에 의해 암호화된 관심 생성물의 발현에서와 같이, 본 발명의 벡터 시스템으로 형질전환된 세포를 선택 및/또는 성장시키기 위한 배양 배지 및 배양 배지 혼합물의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 숙주 세포 및 본 발명의 배양 배지를 포함하는 혼합물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포 집단을 포함하는 생물반응기를 특징으로 한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 배양 배지 및 본 발명의 생산 세포 집단을 포함하는 생물반응기를 특징으로 한다.

도 1은 PAH 효소의 도메인 구조를 개략적으로 도시한다.
도 2는 (a) 동일한 CHO 세포 풀의 3 주 동안의 형질감염 및 회수 후 세포 집단으로부터의 평균 형광의 유세포 분석을 사용하여 수득된 히스토그램 및 (b) 형광 데이터의 표를 도시한다.
도 3은 qRT-PCR에 의해 측정된 바와 같은 대조군에 비해 PAH mRNA 양의 그래프를 도시한다.
도 4는 (a) 18 일에 걸쳐 티로신 또는 글루타민의 부재 하에 임의적으로 페닐알라닌이 보충되며 일부는 과발현 절두된 PAH인 다양한 세포 풀의 생존가능한 세포 농도에 의한 세포 성장 그래프; 및 (b) 동일한 조건 하에 동일한 세포 풀의 배양 생존력 그래프를 도시한다.
도 5는 다양한 페닐알라닌 보충에 따른 티로신 기본영양 세포 풀의 성장 특성을 도시한다.
도 6: 6 mM 페닐알라닌이 있는 CD CHO 티로신 부재에서 티로신 기본영양 세포 풀의 성장 특성 그래프를 도시한다. (a) 티로신이 없고 임의적으로 페닐알라닌이 보충된 다양한 세포 풀의 생존가능한 세포 농도 및 (b) 동일한 풀의 배양 생존력 그래프를 도시한다.
도 7은 페닐알라닌 보충이 세포 성장 평가 전에 발생한 사전-적응된 티로신 기본영양 세포 풀의 성장 특성 그래프를 도시한다. (a) 세포 풀의 생존가능한 세포 농도 및 (b) 동일한 조건에서 동일한 세포 풀의 배양 생존력 그래프를 도시한다.
도 8은 대조군 세포에 비해 다양한 세포 풀에서 PAH mRNA 양의 그래프(상단) 및 대조군 세포에 비해 다양한 세포 풀에서 GCH1 mRNA 양의 그래프(하단)를 도시한다.
도 9는 티로신 및 글루타민 동시-발현 영양요구성 세포 풀의 성장 특성 그래프를 도시한다. (a) 생존가능한 세포 농도 (b) 생존력 및 (c) 세포 직경.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 숙력자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들와 유사하거나 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스팅에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재되어 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 또한, 물질, 방법, 및 예는 단지 예시이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 제목, 부제목 또는 번호가 붙거나 또는 글자가 붙은 요소, 예를 들어, (a), (b), (i) 등은 단지 읽기 쉽도록 제시된다. 이 문서에서 제목 또는 번호가 붙거나 또는 글자가 붙은 요소의 사용은 단계 또는 요소를 알파벳 순서로 수행하거나 또는 단계 또는 요소가 반드시 서로 별개의 것이어야 함을 요구하지 않는다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다. 또한 본원에 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적을 위한 것이며, 제한하려는 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다.

하나 이상의 관심 값에 적용된 본원에 사용되는 약" 또는 "대략적으로"라는 용어는 명시된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 달리 명시되지 않는 한 또는 달리 문맥상 분명하지 않는 한 명시된 참조 값의 어느 한 방향으로 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하(초과 또는 미만) 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(이러한 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외).

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제어 요소"는 코딩 서열, 예를 들어, 생성물 또는 효소 분자를 암호화하는 유전자 또는 서열의 발현을 조절(예를 들어, 증가 또는 감소)하는 데 적합한 핵산을 지칭한다. 제어 요소는 프로모터 서열, 인핸서 서열, 또는 프로모터 및 인핸서 서열 둘 다를 포함할 수 있다. 제어 요소는 연속 핵산 서열, 비연속 핵산 서열(다른 코딩 또는 비코딩 핵산 서열에 의해 중단된 서열), 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 단일 제어 요소는 단일 핵산 또는 하나 초과의 핵산에 포함될 수 있다. 구현예에서, 제어 요소는 코딩 서열, 예를 들어, 재조합, 치료, 또는 억제자 폴리펩티드의 코딩 서열의 서열 5' 또는 3'을 포함할 수 있다. 구현예에서, 제어 요소는 유전자, 예를 들어, 재조합, 치료, 또는 억제자 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 하나 이상의 인트론 내에 서열을 포함할 수 있다. 구현예에서, 제어 요소는 코딩 서열, 예를 들어, 재조합, 치료, 또는 억제자 폴리펩티드의 코팅 서열의 서열 5' 또는 3' 내에 부분적으로 또는 전체적으로 포함될 수 있다. 구현예에서, 제어 요소는 코딩 서열, 예를 들어, 재조합, 치료, 또는 억제자 폴리펩티드의 코딩 서열 내에 부분적으로 또는 전체적으로 포함될 수 있다. 구현예에서, 제어 요소는 유전자, 예를 들어, 재조합, 치료, 또는 억제자 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 하나 이상의 인트론 내에 부분적으로 또는 전체적으로 포함될 수 있다. 구현예에서, 단일 제어 요소는 i) 유전자, 예를 들어, 재조합, 치료, 또는 억제자 폴리펩티드를 암호화하는 유전자에 근위인(예를 들어, 이에 인접하거나 또는 내에 함유됨), 또는 ii) 유전자, 예를 들어, 재조합, 치료, 또는 억제자 폴리펩티드를 암호화하는 유전자에 원위인(예를 들어, 10 개 이상, 100 개 이상, 1000 개 이상, 또는 10,000 개 이상의 염기에 의해 분리되거나, 또는 별개 및 개별 핵산 상에 배치됨) 핵산 서열을 포함할 수 있다.

용어 "약"은 양, 시간적 지속기간 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때, 명시된 값에서 ±5%, 또는 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 변동을 포괄하는 것을 의미하는 데, 이러한 변동이 개시된 방법을 수행하는 데 적절하기 때문이다.

본원에 사용되는 용어 '생물반응기'는 생물학적 반응 또는 공정이 수행되는 장치를 지칭한다. 공정은 마이크로 및 나노규모를 포함한 산업용, 파일럿 및 실험실 규모에서 수행될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 또는 그 내부에서 자연적으로 생산되는 임의의 물질을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템에 도입되거나 또는 이의 외부에서 생산되는 임의의 물질을 지칭한다. 따라서, "외인성 핵산"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템에 도입되거나 또는 이의 외부에서 생산되는 핵산을 지칭한다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산의 서열은 외인성 핵산이 도입되는 유기체, 세포, 조직, 또는 시스템 내부에서 자연적으로 생산되지 않거나, 또는 자연적으로 발견되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산의 서열은 비자연 발생 서열이거나, 또는 비자연 발생 생성물을 암호화한다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산의 서열은 또한 외인성 핵산이 도입되는 유기체, 세포, 조직, 또는 시스템에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 구성적으로 활성 프로모터의 제어 하에 효소를 암호화할 수 있으며, 여기서 외인성 핵산이 도입되는 세포는 상기 효소를 암호화하는 내인성 핵산 서열을 함유한다(예를 들어, 내인성 프로모터의 제어 하에).

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "효소 분자"는 관심 효소적 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 효소 분자는 관심 효소적 활성을 갖는 자연 발생 효소와 구조적 유사성(예를 들어, 서열 상동성)을 공유할 수 있다. 일부 경우에, 효소 분자는 관심 효소적 활성을 갖는 자연 발생 효소에 대해 적어도 80% 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 효소 분자는 자연 발생 효소의 변이체(예를 들어, 자연 발생 효소의 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 서열 변경(예를 들어, 치환, 결실, 또는 삽입)을 포함하는 변이체)이다. 일부 경우에, 용어 "분자"는 효소(예를 들어, PAH 또는 GCH1)에 대한 식별자와 함께 사용될 때, 식별된 효소의 효소적 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 예로서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "PAH 분자" 또는 "PAH 효소 분자"는 PAH의 효소적 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 추가 예로서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "GCH1 분자" 또는 "GCH1 효소 분자"는 GCH1의 효소적 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 효소 분자는 단일 폴리펩티드 쇄이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 효소 분자는 다중-폴리펩티드 복합체, 예를 들어, 올리고머(예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 팔량체, 십량체, 또는 십이량체)이거나 또는 이를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "효소적으로 활성 단편"은 효소 또는 효소 분자의 관심 효소적 활성을 갖는 효소 또는 효소 분자의 일부를 지칭한다. 일부 구현예에서, 효소적으로 활성 단편은 효소 또는 효소 분자에 비해 결실(예를 들어, 절두)을 포함하는 효소 또는 효소 분자의 변이체이다. 일부 구현예에서, 효소적으로 활성 단편의 관심 효소적 활성은 효소적으로 활성 단편이 유래된 효소 또는 효소 분자에 비해 50, 40, 30, 20, 또는 10% 이하로 감소된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산," "폴리뉴클레오티드," 또는 "핵산 분자"는 상호교환가능하게 사용되고 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 또는 이의 DNA 또는 RNA의 조합, 및 단일 또는 이중 가닥 형태의 이의 중합체를 지칭한다. 용어 "핵산"은 유전자, cDNA, 또는 RNA 서열(예를 들어, mRNA)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 합성(예를 들어, 화학적으로 합성 또는 인공) 또는 재조합이다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오티드의 유사체 또는 유도체를 함유하는 분자를 포함하며 자연 또는 비자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사된다. 달리 표시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환), 대립유전자, 오솔로그, SNP, 및 상보적 서열뿐만 아니라 명시적으로 표시된 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer 등, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka 등, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini 등, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 본원에 사용된 바와 같은 "대상 핵산"이란 예를 들어, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 세포 내로 도입되거나 또는 세포 내에 존재할 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 생성물을 암호화하는 서열 또는 본원에 기재된 바와 같은 생산 인자(예를 들어, SCD1 및/또는 SREBF-1과 같은 지질 대사 변형자(LMM))를 암호화하는 서열을 포함하는 임의의 관심 핵산을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드," "폴리펩티드," 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해, 또는 펩티드 결합 이외의 수단에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2 개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한을 두지 않는다. 일 구현예에서, 단백질은 하나 초과, 예를 들어, 2, 3, 4, 5 개, 또는 그 이상의 폴리펩티드로 구성될 수 있으며, 여기서 각각의 폴리펩티드는 공유 또는 비공유 결합/상호작용에 의해 서로 회합된다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 또는 펩티드 결합 이외의 수단에 의해 서로 연결된 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어는 예를 들어, 통상적으로 당업계에서 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 지칭되는 짧은 쇄, 및 일반적으로 당업계에서 단백질로서 지칭되는 더 긴 쇄 둘 다를 지칭하며, 이들 중에는 많은 유형이 있다. "폴리펩티드"는 예를 들어, 생물학적으로 활성 단편, 실질적으로 상동인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "복수"는 관사의 문법적 목적으로 하나 초과(예를 들어, 2 개 이상)를 지칭한다. 예로서, "복수의 세포"는 2 개의 세포 또는 2 개 초과의 세포를 의미할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "생성물"은 세포, 예를 들어, 생성물을 생산하도록 변형되거나 또는 조작된 세포, 예를 들어, 생산 세포에 의해 생산된, 예를 들어, 발현된 독립체, 예를 들어, 화합물(예를 들어, 폴리펩티드(예를 들어, 당단백질), 핵산, 지질, 당류, 다당류, 또는 이의 임의의 하이브리드), 소포, 엑소좀, 또는 바이러스를 지칭한다. 일부 구현예에서, 생성물은 단백질 또는 폴리펩티드 생성물이다. 일부 구현예에서, 생성물은 자연 발생 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서 생성물은 비자연 발생 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 생성물의 일부는 자연 발생하는 반면, 생성물의 또 다른 부분은 비자연적으로 발생한다. 일부 구현예에서, 생성물은 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 생성물은 진단 또는 전임상 용도에 적합하다. 일부 구현예에서, 생성물은 치료 용도, 예를 들어, 질환의 치료에 적합하다. 일부 구현예에서, 생성물은 본원, 예를 들어, '폴리펩티드'라는 제목의 하기 섹션에 기재된 재조합 또는 치료 단백질이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 자연 발생 바이러스, 재조합 바이러스, 재조합 바이러스 입자, 바이러스-유사 입자(VLP), 바이러스 벡터, 불활성화된(예를 들어, 사멸되거나 또는 감염될 수 없는) 바이러스, 복수의 바이러스 단백질, 바이러스 캡시드, 또는 이의 임의의 단편, 구성요소의 하위집합, 또는 변이체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "생산 세포"는 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 생산할 수 있는 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 생산 세포는 예를 들어, 생산 세포에서 생성물의 발현을 조절하는 제어 요소에 작동가능하게 연결된 생성물(예를 들어, 재조합 폴리펩티드)을 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다. 예를 들어, 생물반응기 및 적절한 배지에서 적절한 조건, 예를 들어, 본원에 개시된 조건 하에 배양되는 경우, 생산 세포는 예를 들어 생성물을 생산하고 분비한다.

본원에 사용된 바와 같이, "생산 인자"는 재조합 생성물의 발현과 관련하여 생산 세포의 특성에 영향을 미치는 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭한다. 예를 들어 생산 인자는 양(예를 들어 세포 당 특이적 생산성 또는 생성물 역가) 또는 생산물 품질(예를 들어 정확한 접힘 및 조립, 용해도 등)을 개선시킬 수 있다. 생산 인자는 예를 들어 지질 대사(예를 들어, SCD1 및/또는 SREBF-1과 같은 지질 대사 변형자), 단백질 합성, 단백질 접힘, 번역후 변형, 단백질 수송 및/또는 단백질 분비에 수반되는 단백질일 수 있다. 또한 내인성 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 폴리펩티드 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 생산 인자는 고도로 발현 및 분비되는 비필수 내인성 단백질의 발현을 억제하여 세포의 생산 능력을 개선시킬 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 예를 들어, 코딩 서열을 프로모터에 작동가능하게 연결하여 코딩 서열의 발현을 초래하도록 자연 발생하거나 또는 조작된 프로모터로부터 충분한 서열을 갖는 서열을 지칭한다. 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터는 CMV 프로모터의 모든 또는 활성 단편, 예를 들어, 임의적으로 인트론 A 및/또는 UTR 서열을 포함하는 CMV 프로모터의 모든 또는 활성 단편을 포함한다. 구현예에서, CMV 프로모터는 자연 발생하거나 또는 조작된 변이체 CMV 프로모터와 5, 10, 20, 30, 50, 또는 100 개 이하의 뉴클레오티드에서 상이하다. 구현예에서, CMV 프로모터는 자연 발생하거나 또는 조작된 변이체 CMV 프로모터와 그의 뉴클레오티드의 1, 5, 10, 또는 50% 이하에서 상이하다. 본원에 사용된 바와 같은 프로모터는 프로모터가 포함하는 프로모터 서열의 구성적, 조절, 억제성, 유도성, 강성, 약성, 또는 다른 특성일 수 있다. 구현예에서, 프로모터는 코딩 서열, 예를 들어, 재조합, 치료, 또는 억제자 폴리펩티드의 코딩 서열의 서열 5' 또는 3'을 포함할 수 있다. 구현예에서, 프로모터는 유전자, 예를 들어, 재조합, 치료, 또는 억제자 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 하나 이상의 인트론 내에 서열을 포함할 수 있다. 구현예에서, 프로모터는 코딩 서열, 예를 들어, 재조합, 치료, 또는 억제자 폴리펩티드의 코딩 서열의 서열 5' 또는 3' 내에 부분적으로 또는 전체적으로 포함될 수 있다. 구현예에서, 프로모터는 코딩 서열, 예를 들어, 재조합, 치료, 또는 억제자 폴리펩티드의 코딩 서열 내에 부분적으로 또는 전체적으로 포함될 수 있다. 구현예에서, 프로모터는 유전자, 예를 들어, 재조합, 치료, 또는 억제자 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 하나 이상의 인트론 내에 부분적으로 또는 전체적으로 포함될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 생성물(예를 들어, 폴리펩티드) 또는 효소 분자를 암호화하는 핵산 서열과 제어 요소 사이의 관계를 지칭하며, 여기서 생성물 또는 효소 분자를 암호화하는 서열 및 제어 요소는 제어 요소가 생성물 또는 효소 분자를 암호화하는 서열의 발현을 조절하는 데 적합한 방식으로 배치되는 경우 작동가능하게 연결된다. 따라서 상이한 제어 요소에 대해, 작동가능하게 연결된은 제어 요소에 비해 생성물 또는 효소 분자를 암호화하는 서열의 상이한 배치를 구성할 것이다. 예를 들어, 생성물(예를 들어, 폴리펩티드)을 암호화하는 서열은 프로모터 효소 및 생성물(예를 들어, 폴리펩티드)을 암호화하는 서열이 서로 근접하여 동일한 핵산 상에 배치되는 경우 프로모터 요소를 포함하는 제어 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 또 다른 예에서, 생성물(예를 들어, 폴리펩티드)을 암호화하는 서열은 인핸서 서열 및 생성물(예를 들어, 폴리펩티드)을 암호화하는 서열이 동일한 핵산, 또는 심지어 별개 및 개별 핵산 상에서 적합한 수의 염기로 떨어져 배치되는 경우 원위로 작동하는 인핸서 서열을 포함하는 제어 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 선택 마커는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 세포를 선택하는 데 사용될 수 있는 표현형을 부여하는 하나 이상의 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 서열(예를 들어, 그리고 상기 폴리펩티드의 발현에 적합한 제어 요소)를 포함한다. 예를 들어, 선택 마커는 항생제 내성 표현형을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 선택 마커는 항생제 선택 마커로서 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 필수 영양소의 감소된 수준(예를 들어, 이의 부재), 예를 들어, 세포가 선택 마커 없이 생존하기에 불충분한 수준을 포함하는 조건 동안 생존(예를 들어, 성장 및 분열)하는 능력을 전달하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 선택 마커는 PAH 효소 분자를 암호화하는 제1 핵산 및 GCH1 효소 분자를 암호화하는 제2 핵산을 포함할 수 있으며, 여기서 선택 마커는 배양 배지에서 감소된 수준의 티로신(예를 들어, 이의 부재)에서 생존하는 능력을 전달한다. 이러한 선택 마커는 영양요구성 마커 또는 영양요구성 선택 마커로서 지칭될 수 있다. 영양요구성 마커 또는 영양요구성 선택 마커에 화합물 이름, 예를 들어, 아미노산 이름을 첨부하는 것은 선택 마커가 감소된 수준 또는 부재에서 생존하는 능력을 전달하는 영양소를 명시한다.

벡터 및 벡터 시스템

본 발명은 형질전환된 숙주 세포가 재조합 폴리펩티드와 같은 관심 생성물을 발현하게 하고, 티로신의 부재 및 낮은 수준에서 성장하게 하는 구성요소를 암호화하는 벡터를 사용하며, 이는 달리 세포에 대한 필수 아미노산이 되고 이의 부재는 세포 사멸 및/또는 성장 불량으로 이어질 것이다.

벡터는 3 개의 구성요소를 포함한다. 전형적으로 기능적 N-말단 조절 도메인이 결여된 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 효소 분자를 암호화하는 제1 핵산 서열; 및 GTP 사이클로하이드롤라제 1(GCH1) 효소 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열. 이들 서열은 적합한 숙주 세포에서 효소의 발현을 가능하게 하는 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 일 구현예에서, 제어 서열은 CMV 프로모터 또는 SV40 프로모터를 포함하며, 예를 들어 인간 PAH 서열을 암호화하는 서열은 SV40 프로모터를 포함하는 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고/있거나 GCH1을 암호화하는 서열은 SV40 프로모터를 포함하는 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

제3 서열은 관심 생성물을 암호화하는 핵산 서열이 클로닝될 수 있는 삽입 부위, 예를 들어 다중 클로닝 부위를 포함한다. 이 부위는 원하는 서열이 도입된 경우 적합한 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 제어 서열에 배치되고 작동가능하게 정렬된다. 일 구현예에서, 발현 카세트로서 간주될 수 있는 3 개의 서열은 동일한 벡터에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 관심 서열의 선택이 선택가능한 마커의 존재에 연결되는 것을 보장하기 위한 것 중 하나로서 제3 핵산 서열이 동일한 벡터 상에 있다면 제1 및 제2 핵산 서열은 개별 벡터 상에 있을 수 있다.

벡터는 관심 생성물에 대한 추가의 발현 카세트를 포함할 수 있으며, 즉 벡터 시스템은 제4, 및 임의적으로 제5 및 임의적으로 제6 핵산 서열 등을 포함할 수 있으며, 각각은 관심 생성물을 암호화하는 핵산 서열이 클로닝될 수 있는 삽입 부위, 예를 들어 다중 클로닝 부위를 포함한다. 제3 핵산 서열의 경우, 이들 부위는 원하는 서열이 도입된 경우 적합한 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 제어 서열에 배치되고 작동가능하게 정렬된다. 예를 들어 이중특이적 항체는 적어도 3 개의 상이한 쇄 및 일반적으로 적어도 4 개의 상이한 쇄를 갖는다. 관심 서열을 삽입할 준비가 된 이러한 발현 카세트는 다양한 방식으로 구성될 수 있다. PAH 및 GCH1 서열이 상이한 벡터 상에 있다면 각각의 벡터는 다중 클로닝 부위가 있는 하나 이상의 발현 카세트를 함유할 수 있으며 예를 들어 각각은 2 개의 이러한 발현 카세트를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서 각각 다중 클로닝 부위가 있는 발현 카세트는 선택 마커 중 하나만 있는 단일 벡터에 존재할 수 있다. 따라서 하나의 벡터는 각각이 이중특이적 항체 생산을 위한 중쇄 또는 경쇄와 같은 관심 서열의 도입을 위한 다중 클로닝 부위를 갖는 3 또는 4 개의 발현 카세트를 가질 수 있다.

일 구현예에서, 그리고 동일한 단계에서 다중 서열을 도입하는 능력의 이점을 완전히 취하기 위해, 모든 벡터 시스템 구성요소는 동시에 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 적합한 숙주 세포는 제1 또는 제2 핵산 서열 중 하나를 포함하도록 이미 조작될 수 있다. 따라서 본 발명은 다음을 포함하는 선택 시스템을 추가로 제공하며:

a) 숙주 세포에서 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)의 발현을 가능하게 하는 제1 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 기능적 N-말단 조절 도메인이 결여된 PAH를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 핵산;

b) 숙주 세포에서 GTP 사이클로하이드롤라제 1(GCH1)의 발현을 가능하게 하는 제2 제어 서열에 작동가능하게 연결된, GCH1을 암호화하는 제2 핵산; 및

c) (i) 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제3 제어 서열에 작동가능하게 연결된 관심 생성물을 암호화하는 서열을 삽입하기 위한 다중 클로닝 부위 또는 (ii) 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제3 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 관심 생성물을 암호화하는 제3 핵산; 및

d) 숙주 세포,

여기서 (a) 및 (c)는 벡터에 존재하고 (b)는 숙주 세포에 존재하거나(전형적으로 숙주 세포 게놈 내로 통합됨); 또는 (b) 및 (c)는 벡터에 존재하고 (a)는 숙주 세포에 존재한다(전형적으로 숙주 세포 게놈 내로 통합됨).

재조합 생성물을 암호화하는 핵산 서열 및 PAH, GCH1 효소는 여러 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 포함하나 이에 제한되지 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특정 관심 벡터는 발현 벡터 및 복제 벡터를 포함한다. 구현예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Sambrook 등, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY), 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노- 연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능하는 복제 기점(따라서 벡터는 자기 복제할 수 있음), 프로모터 요소 및 임의적으로 인핸서 요소를 포함하는 제어 요소, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다(예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 제6,326,193호). 바이러스로부터 유래된 벡터는 이식유전자의 장기간 안정한 통합 및 딸 세포에서 이의 전파를 허용하므로 장기간 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다.

벡터는 또한 예를 들어, 분비를 용이하게 하는 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자(예를 들어, 소 성장 호르몬(BGH) 유전자로부터 유래), 에피솜 복제 및 원핵생물에서의 복제를 허용하는 요소(예를 들어 SV40 기원 및 ColE1 또는 당업계에 알려진 다른 것) 및/또는 선택을 허용하는 요소, 예를 들어, 선택 마커 또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다.

고려되는 벡터는 폴리펩티드, 예를 들어, 외인성 치료 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 삽입하기에 적합한 삽입 부위를 포함할 수 있다. 삽입 부위는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함할 수 있다.

관심 생성물을 암호화하는 서열(재조합 생성물이라는 제목의 하기 섹션에 기재된 바와 같음)은 당업계에 잘 알려진 클로닝 기술을 사용하여 여기에 기재된 벡터 시스템 내로 도입될 수 있다. 그런 다음 생성된 벡터 시스템은 제1 및 제2 핵산 서열 이외에 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제3 제어 서열에 작동가능하게 연결된 관심 생성물을 암호화하는 서열을 포함하는 적어도 제3 핵산 서열을 포함할 것이며, 제3 서열은 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열과 동일한 벡터에 존재한다(선택 마커가 제3 핵산 서열을 포함하는 세포를 선택하는 기능을 보장하기 위해).

상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 벡터 시스템을 사용하여 예를 들어, 항체(표준 및 이중특이적 항체)를 포함한 다중 하위단위를 갖는 단백질에 대한 다중 관심 서열을 발현할 수 있다. 따라서 벡터는 관심 생성물에 대한 추가의 발현 카세트를 포함할 수 있고 다중 관심 서열은 다중 클로닝 부위 내로 도입되어 복수의 관심 생성물을 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 도입될 준비가 된 벡터를 생산할 수 있다. 따라서 관심 서열의 도입 후, 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제3 제어 서열에 작동가능하게 연결된 관심 생성물을 암호화하는 서열을 포함하는 제3 핵산 서열 이외에, 벡터 시스템은 제4, 및 임의적으로 제5 및 임의적으로 제6 핵산 서열 등을 포함할 수 있으며 각각은숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제어 서열에 작동가능하게 연결된 관심 생성물을 암호화하는 서열을 포함한다. 이들 서열은 제1 및/또는 제2 핵산 서열과 동일한 벡터에 존재할 것이다(이들이 선택가능한 마커와 연관되어 있는 결과로서 선택되는 것을 보장하기 위해).

다시 상기 논의된 바와 같이 이들 발현 카세트는 다양한 방식으로 구성될 수 있다. PAH 및 GCH1 서열이 상이한 벡터 상에 있다면 각각의 벡터는 각각이 관심 생성물을 암호화하는 하나 이상의 발현 카세트를 함유할 수 있으며 예를 들어 각각은 2 개의 이러한 발현 카세트를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서 발현 카세트는 선택 마커 중 하나만 있는 단일 벡터에 존재할 수 있다. 따라서 하나의 벡터는 각각이 이중특이적 항체 생산을 위한 중쇄 또는 경쇄와 같은 관심 생성물을 암호화하는 서열을 갖는 3 또는 4 개의 발현 카세트를 가질 수 있다.

벡터는 또한 벡터의 양 끝에 위치한 도립된 말단 반복 서열(ITR)을 사용하는 PiggyBac^TM 시스템과 같은 부위 특이적 방식으로 또는 무작위로 숙주 세포 게놈 내로의 통합을 돕는 서열을 함유할 수 있다. 형질감염 과정 동안 포함되는 서열 특이적 트랜스포사제, 부위 특이적 통합 방법 및 서열은 또한 WO2013/190032 및 WO2018/150269에 기재되어 있다.

일부 구현예에서, 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 하기 기재된 바와 같이, 글루타민 합성효소와 같은 추가 선택 마커를 포함한다. 전형적으로 벡터 시스템은 하기 기재된 바와 같이, 추가 선택 마커를 포함하는 개별 벡터, 및 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제어 서열에 작동가능하게 연결된 관심 생성물 또는 생성물들을 암호화하는 하나 이상의 서열을 삽입하기 위한 다중 클로닝 부위를 포함한다. 관심 서열이 다중 클로닝 부위 내로 클로닝되면 벡터는 하기 기재된 바와 같이, 추가 선택 마커 및 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제어 서열에 작동가능하게 연결된 관심 생성물을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함할 것이다. 이러한 벡터는 일반적으로 PAH 또는 GCH1 서열을 포함하지 않는다.

벡터 또는 벡터들은 사용 설명서, 및 임의적으로 형질감염 시약 등을 포함하는 키트로서 제공될 수 있다.

또한 본원에는 핵산, 예를 들어, 본원에 기재된 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 대상 핵산이 제공된다. 원하는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 예를 들어 원하는 핵산 서열, 예를 들어, 유전자를 발현하는 세포로부터의 라이브러리를 스크리닝하거나, 이를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 핵산 서열을 유도하거나, 또는 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리하는 것과 같이 당업계에 알려진 재조합 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 대안적으로, 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 클로닝되기 보다는 합성적으로 생산될 수 있다. 재조합 DNA 기술들 및 기술은 고도로 진화되어 있고 당업계에서 잘 확립되어 있다. 따라서, 본원에 기재된 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대한 지식을 가진 통상의 숙련자는 재조합 폴리펩티드를 암호화할 핵산 서열을 용이하게 구상 또는 생성할 수 있다.

GCH1 효소 분자

자연 발생 GCH1 효소는 BH4 생산의 첫번째 단계인 GTP의 7,8-디하이드로네오프테린 3'-트리포스페이트(2 개의 물 분자를 소비하고 또한 아세트산을 생산함)로의 형질전환을 촉매한다. 일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 자연 발생 GCH1 효소와 동일하거나 또는 유사한 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 자연 발생 GCH1 효소에 비해 증가되거나 또는 감소된 활성을 갖는다.

일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 자연 발생 GCH1 효소이다. 일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 전장(예를 들어, 비-절두된) GCH1 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, GCH1 분자는 포유류 GCH1 효소에 대해 적어도 50% 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는다.

일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 자연 발생 GCH1 효소 또는 비자연 발생(예를 들어, 합성) GCH1 효소의 변이체(예를 들어, 자연 발생 또는 비자연 발생 효소의 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 서열 변경(예를 들어, 치환, 결실, 또는 삽입)을 포함하는 변이체)이다. 일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 자연 발생 GCH1 효소에 비해 결실 돌연변이, 예를 들어, 절두, 예를 들어, N-말단 영역의 절두이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 자연 발생 GCH1 효소의 아미노산 서열의 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99%(및 임의적으로, 아미노산 서열의 최대 100, 99, 95, 90, 85, 80, 79, 78, 77, 76, 또는 75%)이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 자연 발생 GCH1 효소의 아미노산 서열의 99, 95, 90, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 또는 75% 이하를 포함한다.

일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 단량체이며, 예를 들어, 단량체로서의 활성 효소이다. 일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 다량체를 형성하며(예를 들어, 효소적 활성에 적절한 조건 하에, 예를 들어, 세포 또는 생리학적 조건, 예를 들어, 생물제조 공정 동안), 예를 들어, 다량체로서의 활성 효소이다. 일부 구현예에서, GCH1 효소 분자 다량체는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 또는 십량체, 예를 들어, 십량체이다.

본 개시내용의 GCH1 효소 분자에 사용하기 위한 서열은 임의의 알려진 GCH1 효소 서열로부터 도출될 수 있다. 일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 인간 GCH1 효소, 이의 변이체, 또는 이의 효소적으로 활성 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 CHO GCH1 효소, 이의 변이체, 또는 이의 효소적으로 활성 단편을 포함한다.

일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 서열번호: 1에 의해 암호화된 아미노산 서열, 예를 들어, 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 NCBI 참조 서열: NM_001024024(예를 들어, 2019년 10월 6일 기준)에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, GCH1 효소 분자는 서열번호: 1에 의해 암호화된 아미노산 서열, 예를 들어, 서열번호: 2의 아미노산 서열과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, GCH1 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산은 서열번호: 1의 핵산 서열과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다.

NCBI 참조 서열: NM_001024024

PAH 효소 분자

자연 발생 PAH 효소는 분자 산소 및 테트라하이드로비오프테린(BH4)을 사용하여 페닐알라닌의 티로신으로의 형질전환을 촉매한다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 자연 발생 PAH 효소와 동일하거나 또는 유사한 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 자연 발생 PAH 효소에 비해 증가되거나 또는 감소된 활성을 갖는다.

일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 자연 발생 PAH 효소이다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 전장(예를 들어, 비-절두된) PAH 효소를 포함한다.

일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 자연 발생 PAH 효소 또는 비자연 발생(예를 들어, 합성) PAH 효소의 변이체(예를 들어, 자연 발생 또는 비자연 발생 효소의 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 서열 변경(예를 들어, 치환, 결실, 또는 삽입)을 포함하는 변이체)이다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 자연 발생 PAH 효소에 비해 결실 돌연변이, 예를 들어, 절두, 예를 들어, N-말단 영역의 절두이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 자연 발생 PAH 효소의 아미노산 서열의 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99%(및 임의적으로, 아미노산 서열의 최대 100, 99, 95, 90, 85, 80, 79, 78, 77, 76, 또는 75%)이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 자연 발생 PAH 효소의 아미노산 서열의 99, 95, 90, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 또는 75% 이하를 포함한다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 자연 발생 PAH 효소 분자의 적어도 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 335, 또는 336 개의 아미노산(및 임의적으로, 450, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 또는 336 개 이하의 아미노산)이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 자연 발생 PAH 효소 분자의 450, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 또는 336 개 이하의 아미노산(및 임의적으로, 적어도 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 335, 또는 336 개의 아미노산)이거나 또는 이를 포함한다. 예를 들어, PAH 효소 분자는 아미노산 15-37의 결실을 포함하는 처음 1-14 및 37 및 이후 아미노산을 포함할 수 있다. 추가 예로서, PAH 효소 분자는 아미노산 1-116의 결실을 포함할 수 있다. 추가 예로서, PAH 효소 분자는 아미노산 1-10 및 30-40의 결실을 포함할 수 있다. 추가 예로서, PAH 효소 분자는 자연 발생 PAH 효소의 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 또는 350 C-말단 아미노산, 예를 들어, 343 C-말단 아미노산을 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, PAH 효소 분자는 예를 들어, PAH 효소 분자가 자연 발생 PAH 효소에 비해 구성적으로 활성이도록 자연 발생 PAH 효소의 조절 도메인의 일부 또는 전부가 결여되어 있다. 이론에 얽매이길 바라지 않고, PAH 효소는 예를 들어, 효소 활성 부위에 대한 접근을 조절함으로써, PAH의 효소적 활성을 조절하는 하나 이상의 조절 도메인을 포함하는 N-말단 영역을 포함하는 것으로 이해된다. 조절 영역은 대사 효소의 알로스테릭 조절을 허용하는 것으로 알려진 ACT 도메인, 및/또는 효소 활성 부위에 대한 접근을 조건부로 차단할 수 있는 활성 부위 리드를 포함할 수 있다. 본 발명자들은 조절 도메인의 일부 또는 전부가 결여되어 있는 PAH 효소 분자가 본원에 기재된 생산 세포, 예를 들어, 선택 마커에 유용한 것으로 여기는 데, 이러한 PAH 효소 분자가 전장 PAH 효소를 포함하는 PAH 효소 분자, 예를 들어, 조절 도메인의 알로스테릭 조절에 적용되는 PAH 효소 분자보다 더 활성(예를 들어, 구성적으로 활성)일 수 있기 때문이다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 활성 부위 리드가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 ACT 도메인이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 N-말단 조절 영역(예를 들어, 활성 부위 리드 및/또는 ACT 도메인)의 조절(예를 들어, 억제) 기능을 폐지하는 변경(예를 들어, 치환, 결실, 또는 삽입)을 포함한다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 페닐알라닌의 존재에 의해 현저하게 억제되지 않는다(예를 들어, 억제되지 않음). 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 아미노산 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 1-70, 1-80, 1-90, 1-100, 1-110, 또는 1-116(예를 들어, 1-116)의 결실 또는 인간 PAH의 아미노산 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 1-70, 1-80, 1-90, 1-100, 1-110, 또는 1-116(예를 들어, 1-116)에 상응하는 잔기의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 자연 발생 PAH 효소(예를 들어, 자연 발생 인간 PAH 효소)의 N-말단 116 아미노산 또는 상이한 자연 발생 PAH 효소의 상응하는 아미노산이 결여되어 있다. 조절 도메인(처음 116 개 아미노산)이 결여되어 있는 절두된 PAH를 기재하는 Daubner 등, 1997, Arch. Biochem. Biophys 348(2): 295 참조. 이. 콜라이(E.coli)에서 발현된 이 절두된 PAH는 더 안정하고, 더 가용성이고, 활성이 되기 위해 페닐알라닌과의 사전 인큐베이션이 필요하지 않고, 기질에 대한 친화도가 더 높았다). 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 자연 발생 PAH 효소의 C-말단 영역, 예를 들어, PAH 효소의 촉매 및 다량체화 부분을 포함한다.

일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 단량체이며, 예를 들어, 단량체로서의 활성 효소이다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 다량체를 형성하며(예를 들어, 효소적 활성에 적절한 조건 하에, 예를 들어, 세포 또는 생리학적 조건, 예를 들어, 생물제조 공정 동안), 예를 들어, 다량체로서의 활성 효소이다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자 다량체는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 또는 팔량체, 예를 들어, 사량체이다.

본 개시내용의 PAH 효소 분자에서 사용하기 위한 서열은 임의의 알려진 PAH 효소 서열로부터 도출될 수 있다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 인간 PAH 효소, 이의 변이체, 또는 이의 효소적으로 활성 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, PAH 분자는 인간 PAH 효소에 대해 적어도 50% 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 CHO PAH 효소, 이의 변이체, 또는 이의 효소적으로 활성 단편을 포함한다. 일부 경우에, PAH 분자는 CHO PAH 효소에 대해 적어도 50% 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는다.

일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 서열번호: 3 또는 4 중 임의의 것에 의해 암호화된 아미노산 서열, 예를 들어, 서열번호: 5 또는 6 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자는 서열번호: 3 또는 4 중 임의의 것에 의해 암호화된 아미노산 서열, 예를 들어, 서열번호: 5 또는 6 중 임의의 것의 아미노산 서열과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PAH 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산은 서열번호: 3 또는 4 중 임의의 것의 핵산 서열과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다.

예시적인 CHO PAH 핵산 서열 (NCBI 참조 서열: XM_027434726.1)

예시적인 CHO PAH 아미노산 서열

예시적인 인간 PAH 핵산 서열 (GenBank: K03020.1)

예시적인 인간 PAH 아미노산 서열

숙주 세포

본 개시내용은 부분적으로 티로신 영양요구성 선택 마커, 예를 들어, 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 효소 분자를 암호화하는 제1 핵산; 및 GTP 사이클로하이드롤라제 1(GCH1) 효소 분자를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 이들 서열 중 적어도 하나는 숙주 세포에 대해 외인성이며, 즉 자연적으로 존재하지 않는다. 두 서열은 숙주 세포에 대해 외인성일 수 있다.

벡터와 관련하여 상기 섹션에 기재된 바와 같이, 핵산 서열은 동일하거나 또는 상이한 벡터에 있을 수 있으므로, 이들은 동일하거나 또는 상이한 핵산 분자/벡터에서 숙주 세포에 존재할 수 있다. 이들 벡터는 특히 염색체외에서 유지되는 경우 자기 복제 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서 제1 및/또는 제2 핵산은 생산 세포의 게놈 내로 통합된다.

벡터 시스템의 도입 후 숙주 세포는 또한 전형적으로 관심 생성물을 암호화하는 제3 외인성 핵산 서열을 포함할 것이며, 이들 세포는 또한 본원에서 '생산 세포'로 명명되고 있다. 생성물 예를 들어 생물치료 단백질은 전형적으로 비변형된 숙주 세포에 자연적으로 존재하지 않는다. 제3 핵산 서열은 세포를 생산하는 데 얼마나 많은 벡터가 사용되었는지에 따라, 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열과 동일한 핵산에 존재한다. 일부 구현예에서, 제3 외인성 핵산은 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 본 발명의 벡터 시스템을 사용하여 도입된 추가의 외인성 핵산이 또한 존재할 수 있다.

제1, 제2, 및/또는 제3 등의 외인성 핵산은 하나 이상의 제어 요소를 포함할 수 있다. 제어 요소, 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서는 PAH 효소 분자를 암호화하는 서열, GCH1 분자를 암호화하는 서열, 또는 생성물을 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 외인성 핵산은 생산 세포에서 PAH 효소 분자 및 GCH1 효소 분자를 발현하기에 충분한 하나 이상의 제어 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 외인성 핵산은 생산 세포에서 생성물, 예를 들어, 폴리펩티드 생성물을 발현하기에 충분한 하나 이상의 제어 요소를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 제어 요소는 당업자에게 알려져 있으며, 이의 예가 또한 본원에 기재되어 있다.

숙주 세포 유형

일 측면에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 본원에 기재된 임의의 세포 유형, 균주, 또는 세포주일 수 있거나, 이로부터 만들어질 수 있거나, 또는 이로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 본원의 방법은 숙주 세포, 예를 들어 (i) 관심 생성물을 암호화하는 대상 핵산 서열 및 (ii) 아미노산의 생합성 경로에 참여하는 하나 이상의 효소 분자(들)를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열(들)을 포함하는 핵산 작제물(예를 들어, 게놈 내로 통합된 벡터 또는 이종 핵산)을 포함하는 세포 또는 세포주를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 세포 또는 세포주는 효소 분자(들)를 내인성으로 발현하지 않는다.

숙주 세포는 유전적으로 조작되고 성장할 수 있는 임의의 적합한 세포일 수 있다. 전형적으로 세포는 관심 생성물을 생산하기 위한 대규모 배양에 적합한 것이다.

본 발명의 벡터 시스템의 도입 전의 숙주 세포는 티로신의 부재 하에 세포 성장을 지원하기에 충분한 수준의 티로신을 생산할 수 없다. 이는 자연적으로 티로신 생합성에 필요한 효소 중 하나 이상을 충분한 수준으로 발현하지 않거나 또는 관련 유전자를 녹아웃(knock out)하도록 조작되었기 때문일 수 있다. 따라서, 일 구현예에서 본 발명의 숙주 세포는 임의의 내인성 PAH 및/또는 GCH1 활성을 억제 또는 폐지하도록 유전적으로 변형되었다. 이는 예를 들어 내인성 PAH 및/또는 GCH1의 발현을 암호화 및/또는 조절하는 게놈 서열에서 돌연변이(삽입, 결실 및/또는 치환)에 의해 달성될 수 있다.

일부 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어 포유류, 효모 또는 곤충 세포이다.

일 구현예에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 숙주 세포가 유래될 수 있는 예시적인 종은 인간, 마우스, 래트, 중국 햄스터, 시리아 햄스터, 원숭이, 유인원, 개, 말, 흰 족제비, 및 고양이를 포함한다.

구현예에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 CHO-K1 세포, CHOK1SV^® 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHO-S, CHO GS 녹아웃 세포(글루타티온 합성효소(GS) 유전자의 모든 내인성 카피가 불활성화된 CHO 세포), CHOK1SV^® FUT8 녹아웃 세포, CHOZN, 또는 CHO-유래 세포이다. CHO GS 녹아웃 세포(예를 들어, GS-KO 세포)는 예를 들어, CHOK1SV^® GS 녹아웃 세포(예컨대 GS Xceed^® 세포 - CHOK1SV GS-KO^®, Lonza Biologics, Inc.)이다. CHO FUT8 녹아웃 세포는 예를 들어, Potelligent^® CHOK1SV^® FUT8 녹아웃(Lonza Biologics, Inc.)이다.

구현예에서, 숙주 세포는 HeLa, MDCK, Sf9, Sf21, Tn5, HT1080, NB324K, FLYRD18, HEK293, HEK293T, HT1080, H9, HepG2, MCF7, Jurkat, NIH3T3, PC12, PER.C6, BHK(새끼 햄스터 신장), VERO, SP2/0, NS0, YB2/0, Y0, EB66, C127, L 세포, COS(예를 들어, COS1 및 COS7), QC1-3, CHOK1, CHOK1SV, Potelligent^®(CHOK1SV FUT8-KO), CHO GS 녹아웃, GS Xceed^™(CHOK1SV GS-KO), CHOS, CHO DG44, CHO DXB11, 또는 CHOZN 세포, 또는 그로부터 유래된 임의의 세포이다.

다른 구현예에서, 숙주 세포는 조류, 어류, 곤충, 식물, 균류, 또는 효모 세포와 같은 포유류 세포 이외의 세포이다.

일부 구현예에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 세포주는 복수의 세포의 융합(예를 들어, 동일한 유형(예를 들어, 2 개의 CHO 세포) 또는 상이한 유형(예를 들어, 상이한 종)의 2 개 세포의 융합)을 포함하는 과정에 의해 형성된다. 복수의 세포의 융합을 포함하는 과정에 의해 형성된 숙주 세포 또는 세포주의 예는 하이브리도마(hybridoma), 트리오마(trioma), 및 쿼드로마(quadroma)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 그로부터 유래된 것은 돌연변이(예를 들어, 치환, 결실, 또는 삽입) 또는 핵산(예를 들어, 벡터)의 첨가와 같은 변경(예를 들어, 유전자의 녹인(knock-in), 유전자의 녹아웃, 또는 유전자의 다중도)을 추가로 포함하는 본원에 기재된 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 그로부터 유래된 것은 유도 진화를 거친 본원에 기재된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 그로부터 유래된 것은 본원에 기재된 이러한 예시적인 변형의 조합을 포함한다.

진핵생물 세포는 줄기 세포를 포함한다. 줄기 세포는 예를 들어, 배아 줄기 세포(ESC), 성체 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC), 조직 특이적 줄기 세포(예를 들어, 조혈 줄기 세포) 및 중간엽 줄기 세포(MSC)를 포함하는 다능성 줄기 세포일 수 있다.

구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 세포 중 임의의 것의 분화된 형태이다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 배양물 중 임의의 1차 세포로부터 유래된 세포이다.

구현예에서, 숙주 세포는 인간 간세포, 동물 간세포, 또는 비-실질 세포와 같은 간세포이다. 예를 들어, 숙주 세포는 도말성 대사 적격 인간 간세포, 도말성 유도 적격 인간 간세포, 도말성 Qualyst Transporter Certified^TM 인간 간세포, 현탁 적격 인간 간세포(10-공여자 및 20-공여자 풀링된 간세포 포함), 인간 간 쿠퍼(Kupffer) 세포, 인간 간 성상 세포, 개 간세포(단일 및 풀링된 비글 간세포 포함), 마우스 간세포(CD-1 및 C57BI/6 간세포 포함), 래트 간세포(스프라그-다울리, 위스타 한, 및 위스타 간세포 포함), 원숭이 간세포(시노몰구스 또는 레서스 원숭이 간세포 포함), 고양이 간세포(도메스틱 쇼트헤어 간세포 포함), 및 토끼 간세포(뉴질랜드 흰토끼 간세포 포함)일 수 있다. 예시적인 간세포는 미국 2779 노쓰 캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크 데이비스 드라이브 6 소재의 Triangle Research Labs, LLC로부터 상업적으로 입수가능하다.　

일부 구현예에서, 숙주 세포는 글루타민 합성효소(GS)의 녹아웃을 포함한다. 구현예에서, 숙주 세포는 기능적 GS 유전자를 포함하지 않는다. 구현예에서, 숙주 세포는 GS 유전자를 포함하지 않는다. 구현예에서, 숙주 세포에서 GS 유전자는 기능적 GS 단백질을 암호화할 수 없는 유전자를 제시하는 돌연변이를 포함한다.

구현예에서, 진핵생물 세포는 예를 들어 효모 세포(예를 들어, 피키아(Pichia) 속(예를 들어 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 클루이베리(Pichia kluyveri), 및 피키아 앵구스타(Pichia angusta)), 코마가타엘라(Komagataella) 속(예를 들어 코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris), 코마가타엘라 슈도파스토리스(Komagataella pseudopastoris) 또는 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii)), 사카로마이세스(Saccharomyces) 속(예를 들어 사카로마이세스 세레비재(Saccharomyces cerevisae), 세레비지애(cerevisiae), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum)), 글루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속(예를 들어 글루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 글루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)), 칸디다(Candida) 속(예를 들어 칸디다 우틸리스(Candida utilis), 칸디다 카카오이(Candida cacaoi), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii),), 게오트리쿰(Geotrichum) 속(예를 들어 게오트리쿰 페르멘탄스(Geotrichum fermentans)), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 저급 진핵생물 세포이다. 일부 구현예에서, 진핵생물 세포는 종 피키아 파스토리스의 것이다. 피키아 파스토리스 균주에 대한 예는 X33, GS115, KM71, KM71H, 및 CBS7435를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

구현예에서, 진핵생물 세포는 진균 세포(예를 들어 아스페르길루스(Aspergillus) 종 (예컨대 에이. 니거(A. niger), 에이. 푸미가투스(A. fumigatus), 에이. 오르지애(A. orzyae), 에이. 니둘라(A. nidula)), 아크레모니움(Acremonium) 종(예컨대 에이. 써모필룸(A. thermophilum)), 캐토미움(Chaetomium) 종(예컨대 씨. 써모필룸(C. thermophilum)), 크리소스포리움(Chrysosporium) 종(예컨대 씨. 써모필레(C. thermophile)), 코르디셉스(Cordyceps) 종(예컨대 씨. 밀리타리스(C. militaris)), 코리나스쿠스(Corynascus) 종, 크테노마이세스(Ctenomyces) 종, 푸사리움(Fusarium) 종(예컨대 에프. 옥시스포룸(F. oxysporum)), 글로메렐라(Glomerella) 종(예컨대 지. 그라미니콜라(G. graminicola)), 하이포크레아(Hypocrea) 종(예컨대 에이치. 제코리아(H. jecorina)), 마그나포르데(Magnaporthe) 종(예컨대 엠. 오리지애(M. orzyae)), 마이셀리오프토라(Myceliophthora) 종(예컨대 엠. 써모필레(M. thermophile)), 네크트리아(Nectria) 종(예컨대 엔. 헤마토코카(N. heamatococca)), 뉴로스포라(Neurospora) 종(예컨대 엔. 크라싸(N. crassa)), 페니실리움(Penicillium) 종, 스포로트리쿰(Sporotrichum) 종(예컨대 에스. 써포필레(S. thermophile)), 티엘라비아(Thielavia) 종(예컨대 티. 테레스트리스(T. terrestris), 티. 헤테로탈리카(T. heterothallica)), 트리코더마(Trichoderma) 종(예컨대 티. 레세이(T. reesei)), 또는 베르티실리움(Verticillium) 종(예컨대 브이. 다흘리아(V. dahlia)))이다.

구현예에서, 진핵생물 세포는 곤충 세포(예를 들어, Sf9, Mimic™ Sf9, Sf21, High Five^TM(BT1-TN-5B1-4), 또는 BT1-Ea88 세포), 조류 세포(예를 들어, 속 암포라 종(Amphora), 바실라리오피세애(Bacillariophyceae) 종, 두날리엘라(Dunaliella) 종, 클로렐라(Chlorella) 종, 클라마이도모나스(Chlamydomonas) 종, 시아노파이타(Cyanophyta) 종(시아노박테리아), 난노클로롭시스(Nannochloropsis) 종, 스피룰리나(Spirulina) 종, 또는 오크로모나스(Ochromonas) 종의 것), 또는 식물 세포(예를 들어, 단자엽 식물(예를 들어, 옥수수, 벼, 밀, 또는 세타리아(Setaria) 종), 또는 쌍자엽 식물(예를 들어, 카사바, 감자, 대두, 토마토, 담배, 알팔파, 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens) 또는 아라비돕시스(Arabidopsis) 종으로부터의 세포)이다.

구현예에서, 숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵생물 세포이다.

구현예에서, 원핵생물 세포는 바실루스(Bacillus)종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종, 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 종, 또는 락토바실루스(Lactobacillus) 종과 같은 그람 양성 세포이다. 사용될 수 있는 바실루스(Bacillus) 종은 예를 들어 비. 서브틸리스(B. subtilis), 비. 아밀로리퀴파시엔스(B. amyloliquefaciens), 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 비. 나토(B. natto), 또는 비. 메가테리움(B. megaterium)이다. 구현예에서, 세포는 비. 서브틸리스 3NA 및 비. 서브틸리스 168과 같은 비. 서브틸리스이다. 바실루스 종은 예를 들어, 오하이오주 43210-1214 콜럼버스 웨스트 12번가 484 바이올로지칼 사이언시스 556 소재의 Bacillus Genetic Stock Center에서 수득가능하다.

구현예에서, 원핵생물 세포는 그람-음성 세포, 예컨대 살모넬라(Salmonella) 종 또는 예를 들어, TG1, TG2, W3110, DH1, DHB4, DH5a, HMS 174, HMS174 (DE3), NM533, C600, HB101, JM109, MC4100, XL1-Blue 및 오리가미(Origami)와 같은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 뿐만 아니라 예를 들어 BL-21 또는 BL21(DE3), 또는 BL21(DE3) pLysS와 같은 이. 콜라이 B-균주로부터 유래된 것들이며, 이들 모두 상업적으로 입수가능하다.　

일부 구현예에서, 원핵생물 세포는 시아노박테리아 세포이다. 일부 구현예에서, 시아노박테리아 세포는 남조류, 예를 들어, 시네코시스티스 세포이다.

적합한 숙주 세포는 예를 들어, DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH, 독일 브라운슈바이크 소재) 또는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)과 같은 배양 컬렉션으로부터 상업적으로 입수가능하다.

추가의 선택 마커

일부 구현예에서, 숙주 세포는 티로신 영양요구성 선택 마커 이외에 하나 이상의 선택 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 선택 마커는 상이한 아미노산 영양요구성 선택 마커와 같은 상이한 영양요구성 선택 마커이다. 일 구현예에서, 아미노산은 프롤린 또는 글루타민이다. 이러한 선택 마커에 필요한 핵산 서열의 예는 글루타민 합성효소(글루타민의 경우) 및 피롤린-5-카르복실레이트 합성효소(P5CS)(프롤린의 경우)를 암호화하는 서열이다.

또 다른 선택 마커는 예를 들어, 메토트렉세이트(MTX)에 대한 내성을 부여하는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 예를 들어, DHFR 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산이다. 일부 구현예에서, DHFR 선택 마커는 또한 티미딘 영양요구성 선택 마커 및/또는 하이포크산틴 영양요구성 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 내인성 기능적 DHFR 유전자를 포함하며, 예를 들어, 내인성 DHFR 유전자가 기능적 DHFR 효소를 암호화할 수 없게 하는 돌연변이를 포함한다.

추가 선택 마커는 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT) 선택 마커, 예를 들어, HPRT 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 생산 세포는 HPRT(예를 들어, 외인성 핵산에 의해 암호화된 보충 HPRT) 및 보충 퓨린, 예를 들어, 하이포크산틴 없이 아미노프테린의 존재 하에 성장 및/또는 분열할 수 없다. 일부 구현예에서, HPRT 선택 마커는 또한 퓨린(예를 들어, 하이포크산틴 또는 구아닌) 영양요구성 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 생산 세포는 내인성 기능적 HPRT 유전자를 포함하지 않으며, 예를 들어, 내인성 HPRT 유전자가 기능적 HPRT 효소를 암호화할 수 없게 하는 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 선택 마커는 Selexis 선택 시스템(예를 들어, SUREtechnology Platform ™ 및 Selexis Genetic Elements™, Selexis SA에서 상업적으로 입수가능) 또는 Catalent GPEx^® 선택 시스템과 호환가능하다.

생산 세포에서 사용하기 위한 선택 마커는 대상 핵산과 연관될 수 있다. 선택 마커와 대상 핵산 사이의 관계와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같은 연관된은 생산 세포에서 선택 마커의 존재가 대상 핵산의 존재와 상관관계가 있는 관계를 지칭한다. 선택 마커는 생산 세포에서 선택 마커의 존재에 대한 선택(예를 들어, 요구)이 대상 핵산의 존재를 선택하도록 대상 핵산과 연관된다. 일부 구현예에서, 선택 마커, 예를 들어, 선택 마커의 적어도 하나의 구성요소는 대상 핵산과 동일한 핵산 분자, 예를 들어, 대상 핵산과 동일한 벡터 상에 위치한다. 예를 들어, PAH 효소 분자를 암호화하는 제1 외인성 핵산 및 GCH1 효소 분자를 암호화하는 제2 외인성 핵산을 포함하는 티로신 영양요구성 선택 마커를 포함하는 생산 세포는 제1 외인성 핵산 또는 제2 외인성 핵산과 동일한 벡터 상에 위치하는 대상 핵산을 포함할 수 있다. 하나 초과의 선택 마커를 포함하는 생산 세포에서, 각각의 선택 마커는 상이한 대상 핵산과 연관될 수 있다. 일부 구현예에서, 생산 세포는 제1 대상 핵산과 연관된 제1 선택 마커(예를 들어, 생성물 암호화) 및 제2 대상 핵산과 연관된 제2 선택 마커(예를 들어, 생산 인자, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 WO2017/191165 및 WO2019/152876에 기재된 바와 같은 SCD1 및/또는 SREBF-1과 같은 지질 대사 조절자(LMM) 암호화)를 포함한다. 따라서 추가 선택 마커는 숙주 세포에서 도입된 외인성 생산 인자를 유지하는 데 사용된다(안정한 세포주를 생산하는 이전 경우 포함). 일부 구현예에서, 생산 세포는 제1 대상 핵산과 연관된 제1 선택 마커(예를 들어, 제1 생성물 암호화) 및 제2 대상 핵산과 연관된 제2 선택 마커(예를 들어, 제2 생성물 암호화)를 포함한다. 일부 구현예에서, 생산 세포는 제1 대상 핵산와 연관된 제1 선택 마커(예를 들어, 다중-폴리펩티드 생성물의 제1 폴리펩티드 암호화) 및 제2 대상 핵산과 연관된 제2 선택 마커(예를 들어, 다중-폴리펩티드 생성물의 제2 폴리펩티드 암호화)를 포함한다. 상이한 마커 또는 동일한 마커와 연관될 수 있는 추가의 대상 핵산이 포함될 수 있음이 이해될 것이다.

억제제

숙주 세포 및/또는 숙주 세포를 포함하는 배양물은 하나 이상의 효소 분자 억제제(본원에서 억제제로도 지칭됨)를 포함할 수 있다. 효소 분자 억제제는 예를 들어, 효소 분자를 암호화하는(예를 들어, 그리고 대상 핵산 서열을 포함하는) 외인성 핵산을 취하지 않는 세포가 감소 또는 검출불가능한 수준의 내인성 효소 분자 활성을 나타내도록, 내인성 효소 분자 활성을 감소시키거나 또는 방지함으로써 본원에 기재된 선택 공정의 엄격성을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 감소 또는 검출불가능한 수준의 내인성 효소 분자 활성을 나타내는 세포는 합성이 효소 분자의 활성을 필요로 하는 경우 아미노산(예를 들어, 프롤린, 티로신 또는 글루타민)의 외부 공급 부재 하에 성장 및/또는 생존할 수 없다. 일부 구현예에서, 억제제는 효소 분자에 결합하며, 예를 들어, 효소 분자에 결합하여 억제한다. 구현예에서, 억제제는 효소 분자의 알로스테릭 억제제이다. 구현예에서, 억제제는 효소 분자의 경쟁적 억제제이다.

본원에 기재된 생산 세포는 일부 구현예에서, 세포 내로 도입된 외인성 핵산에 의해 발현되고 있는 효소 분자(예를 들어, PAH 또는 GCH1)의 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포에서 억제제의 수준은 내인성 효소 분자 활성을 억제제가 결여되어 있는 세포에서 관찰된 것의 약 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 또는 10% 미만으로 감소시키기에 충분하다. 일부 구현예에서, 아미노산이 결여되어 있는 배지에서의 성장에 기초하여 선택된 세포의 약 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 또는 10% 미만은 대상 핵산을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포에서 효소 분자 및 억제제 분자의 비는 약 1:1000, 1:500, 1:250, 1:200, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 250:1, 500:1, 또는 1000:1이다.

억제제는 예를 들어, 아미노산 또는 이의 유사체, 폴리펩티드, 핵산, 또는 소분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 억제제는 효소 분자가 참여하는 생합성 경로에 의해 생산된 아미노산의 유사체이다. 일부 구현예에서, 억제제는 효소 분자의 기질 유사체이다. 일부 구현예에서, 억제제는 항체 분자(예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음), 융합 단백질, 호르몬, 사이토카인, 성장 인자, 효소, 당단백질, 지단백질, 리포터 단백질, 치료 펩티드, 압타머, 또는 이들 중 임의의 것의 구조적 및/또는 기능적 단편 또는 하이브리드이다. 일부 구현예에서, 억제제는 안티센스 RNA, siRNA, tRNA, 리보솜 RNA, microRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, RNA 압타머, 또는 긴 비코딩 RNA이다.

일부 구현예에서, 억제제는 프롤린, 티로신, 또는 글루타민에 대한 생합성 경로에서 효소 분자를 억제한다. 일 구현예에서, 억제제는 PAH(예를 들어 페닐알라닌 유사체) 또는 GCH1의 활성을 억제한다. 구현예에서, 억제제는 테트라하이드로비오프테린(BH4) 유사체이다. 일부 구현예에서, 억제제는 GTP 유사체이다. 일 구현예에서 억제제는 α-메틸 티로신(예를 들어, 50-100 μM에서), α-메틸 페닐알라닌 및 2,4-아미노-6-하이드록시 피리미딘으로부터 선택된다.

구현예에서, 억제제는 사용되는 경우 피롤린-5-카르복실레이트 합성효소(P5CS) 분자와 같은 추가의 선택 마커 중 하나의 기초를 형성하는 효소의 활성을 억제한다. 구현예에서, 억제제는 P5CS의 활성을 억제한다. 구현예에서, 억제제는 프롤린 유사체이다. 구현예에서, 억제제는 L-아제티딘-2-카르복실산, 3,4-데하이드로-L-프롤린, 또는 L-4-티아졸리딘카르복실산이다. 일부 구현예에서, 억제제는 DHFR의 활성을 억제하며, 예를 들어, 메토트렉세이트이다. 일부 구현예에서, 억제제는 글루타민 합성효소, 예를 들어, 글루타민 유사체, 메티오닌 술폭시민(MSX) 또는 이의 유사체(예를 들어, 알파-메틸 또는 알파-에틸 MSX)를 억제한다. 일부 구현예에서, 생산 세포는 하나 초과의 선택 마커를 포함하고 각각의 선택 마커에 대한 효소 분자 억제제를 포함한다.

핵산의 숙주 세포 내로의 도입 및 선택 단계

외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 많은 적합한 방법은 당업계에 알려져 있고 예를 들어, 세포 내로 핵산, 예를 들어, 벡터의 형질감염, 형질도입(예를 들어, 바이러스 형질도입), 또는 전기천공을 포함한다. 핵산, 예를 들어, 본원에 기재된 이종 핵산 또는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법의 예는 제한 없이, 칼슘 포스페이트 침전, 입자 충돌, 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook 등, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY) 참조. 핵산, 예를 들어, 본원에 기재된 이종 핵산 또는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 화학적 수단의 예는 제한 없이, 리포펙션, 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대 매크로분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셸, 혼합 미셸, 및 리포솜을 포함한 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포)이다. 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 하위-미크론 크기의 전달 시스템으로 폴리뉴클레오티드를 전달하는 것과 같은 핵산의 최신 표적화된 다른 전달 방법이 이용가능하다.

숙주 세포는 핵산으로 일시적으로 형질감염되거나 또는 안정하게 형질감염될 수 있다.

도입된 핵산을 함유하는 숙주 세포의 선택은 본 발명의 티로신 영양요구성 선택 시스템(및 도입될 수 있는 임의의 다른 추가의 선택 마커)에 기반하여, 형질전환되지 않은 세포가 성장하는 능력을 제한하면서 도입된 핵산을 함유하는 세포가 성장하는 것을 허용하는 엄격한 선택 조건 하에 세포를 배양함으로써 달성될 수 있다.

형질감염/형질전환된 세포 집단은 티로신 수준이 도입된 핵산을 함유하는 세포의 선택을 용이하게 허용하는 조건 하에 배양된다. 따라서 세포는 세포 조건의 생존 또는 성장에 필요한 수준보다 더 낮은 티로신 수준의 존재 하에 배양된다. 전형적으로, 이는 티로신이 결여되어 있는 배지의 사용을 수반하여 세포가 티로신의 부재 하에 배양되도록 할 것이다. 그럼에도 불구하고, 0.01 g/L 미만의 티로신, 또는 50, 20, 또는 10 μM 미만의 티로신을 포함하는 배양 배지와 같이, 선택 조건이 충분히 엄격하는 한 낮은 수준의 티로신이 허용될 수 있다. 당업자는 만족스러운 선택 엄격도를 수득하기 위해 원하는 티로신 수준 용이하게 결정할 수 있을 것이다.

하나 이상의 외인성 핵산에 의해 공급되는 효소 분자(들)는 페닐알라닌을 티로신으로 형질전환하는 활성을 제공하므로, 페닐알라닌에 대한 숙주 세포 정상 요건, 뿐만 아니라 티로신 생산을 위한 전구체의 제공을 충족하도록 배양 배지를 추가의 페닐알라닌으로 보충하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서 세포 집단은 생존 또는 성장에 필요한 티로신 수준의 존재 하에 배양된 생산 세포의 생존 또는 성장에 필요한 수준보다 더 높은 페닐 알라닌 수준의 존재 하에 배양될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 페닐알라닌은 적어도 0.035 g/L의 수준에서 제공된다(예를 들어, 배양의 일부로서 및/또는 배양 배지의 구성요소로서). 따라서 세포는 적어도 2, 3 또는 4 mM인 페닐알라닌 수준의 존재 하에 배양될 수 있다. 높은 수준의 페닐알라닌은 세포 성장을 억제할 수 있으므로, 전형적으로 페닐알라닌의 수준은 10 mM 미만, 예컨대 9, 8, 7 또는 6 mM 미만이다.

CHO PAH 효소의 경우, 일 구현예에서 배양 배지에서 페닐알라닌 수준이 2 내지 9 mM, 예컨대 2 또는 3 mM 내지 6 또는 7 mM 페닐알라닌인 것이 바람직한 반면 인간 PAH 효소의 경우 일 구현예에서 바람직한 범위는 4 내지 9 mM 페닐알라닌이다.

세포는 더 높은 수준의 페닐알라닌으로 조정할 수 있도록 적응 단계를 거칠 수 있다. 이 단계는 세포 배양 배지에서 하나 이상의 점점 더 높은 농도의 페닐알라닌, 예컨대 1 또는 2 개의 계대를 위한 3 mM 및 이어서 최종 원하는 농도, 예를 들어 6 mM에서 세포를 계대하는 것을 수반할 수 있다. 이는 예를 들어 세포가 성장 단계에 앞서 회수됨에 따라 형질감염 전에 또는 형질감염 후에 수행될 수 있다.

일부 구현예에서, 페닐알라닌 수준은 배양물에서 페닐알라닌 수준을 검출 및/또는 모니터링하고, 임계값 미만인 검출된 수준에 반응하여, 페닐알라닌을 제공하는(예를 들어, 검출된 수준이 임계값보다 크거나 또는 동일할 때까지) 자동-조정 시. 일부 구현예에서, 이러한 자동-조정 시스템은 페닐알라닌 수준을 검출 및/또는 모니터링하기 위해 분광법(예를 들어, 라만 분광법)을 활용한다. 추가의 선택 마커가 사용되는 경우 유사한 고려사항을 적용한다.

2 개의 선택 마커, 예를 들어 본 발명의 선택 시스템 및 GS 선택 시스템이 사용되는 경우, 관련 벡터는 동시에 도입될 수 있고 두 유형의 마커에 대한 엄격한 선택을 제공하도록 세포 배양 배지, 즉 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 티로신 및 글루타민이 결여되어 있으며 임의적으로 페닐알라닌이 보충된 배지가 제형화될 수 있다. 대안적으로, 선택은 하나의 벡터 시스템이 제1 마커에 대한 엄격한 조건 하에 도입 및 선택된 다음, 결과로 초래된 제2 마커, 및 임의적으로 제1 마커에 대한 엄격한 조건, 예를 들어 티로신 및 글루타민이 결여되어 있으며 임의적으로 페닐알라닌이 보충된 배지 하에 형질감염/형질도입된 세포를 선택하는 2-단계 과정일 수 있다. 대안적으로, 덜 엄격한 조건은 후속적으로 제2 마커를 선택할 때 제1 마커에 대해 사용될 수 있다. 상기 기재된 배양 조건은 이 2 가지 선택 마커 절차(및 추가의 마커가 사용되는 경우)에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용한다.

도입된 핵산 서열을 함유하는 생산 세포의 기능적 특성

일부 구현예에서, 티로신 영양요구성 선택 마커(예를 들어,　PAH 효소 분자를 암호화하는 제1 외인성 핵산 및 GCH1 효소 분자를 암호화하는 제2 외인성 핵산)를 포함하는 숙주 세포는 감소된 수준의 티로신(예를 들어, 티로신의 부재)을 포함하는 배양 배지에서 성장 및/또는 분열할 수 있다. 이러한 세포는 또한 본원에서 생산 세포로 명명된다. 성장 및/또는 분열하는 능력은 당업자에게 알려져 있고 본원에 기재된 방법에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 0.01　g/L 미만의 티로신, 또는 50, 20, 또는 10 μM 미만의 티로신을 포함하는, 예를 들어, 티로신의 부재 하에 배양 배지에서 성장 및/또는 분열할 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 티로신이 결여되어 있는 배양 배지에서 성장 및/또는 분열할 수 있다.

일부 구현예에서, 숙주 세포는 선택 마커와 연관된 대상 핵산(예를 들어, PAH 효소 분자를 암호화하는 제1 외인성 핵산 및 GCH1 효소 분자를 암호화하는 제2 외인성 핵산을 포함하는 예를 들어, 티로신 영양요구성 선택 마커)을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 대상 핵산의 적어도 임계 카피 수(예를 들어, 생성물을 효율적으로 생산하기에 충분한 카피 수), 예를 들어, 대상 핵산의 적어도 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개 카피를 포함한다.

일부 구현예에서, 숙주 세포는 PAH 효소 분자를 암호화하는 제1 외인성 핵산 및 GCH1 효소 분자를 암호화하는 제2 외인성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 제1 외인성 핵산의 적어도 임계 카피 수(예를 들어, 감소된 수준(예를 들어, 티로신의 부재)에서 숙주 세포를 성장 및/또는 분열시키는 데 충분한 카피 수, 예를 들어, 제1 외인성 핵산의 적어도 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 제2 외인성 핵산의 적어도 임계 카피 수(예를 들어, 감소된 수준의 티로신(예를 들어, 이의 부재)에서 숙주세포를 성장 및/또는 분열시키는 데 충분한 카피 수), 예를 들어, 제2 외인성 핵산의 적어도 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 또는 10,000 개 카피를 포함한다.

일부 구현예에서, 대상 핵산은, 예를 들어, 선택 마커(예를 들어, PAH 효소 분자를 암호화하는 제1 외인성 핵산 및 GCH1 효소 분자를 암호화하는 제2 외인성 핵산을 포함하는 티로신 영양요구성 마커)와의 연관성으로 인해, 지정된 간격에 걸쳐 숙주 세포(예를 들어, 그의 딸 세포 또는 후손)에서 지속된다. 일부 구현예에서, 제1 외인성 핵산은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14 일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 동안 숙주 세포(예를 들어, 또는 그의 딸 세포, 후손, 세대, 또는 집단 배가수)에서 지속된다(임의적으로 무기한으로 지속된다). 일부 구현예에서, 제1 외인성 핵산은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 또는 300 회의 세포 분열 동안 숙주 세포(예를 들어, 또는 그의 딸 세포 또는 자손)에서 지속된다(임의적으로 무기한으로 지속된다). 일부 구현예에서, 제1 외인성 핵산은 예를 들어, 본원에 기재된 생물반응기의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 또는 300 회의 숙주 주기, 집단 배가수, 또는 세대 수 동안 숙주 세포(예를 들어, 또는 그의 딸 세포, 후손, 세대, 또는 집단 배가수)에서 지속된다(임의적으로 무기한으로 지속된다). 일부 구현예에서, 제2 외인성 핵산은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14 일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 동안 숙주 세포(예를 들어, 또는 그의 딸 세포, 후손, 세대, 또는 집단 배가수)에서 지속된다(임의적으로 무기한으로 지속된다). 일부 구현예에서, 제2 외인성 핵산은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 또는 300 회의 세포 분열 동안 숙주 세포(예를 들어, 또는 그의 딸 세포, 후손, 세대, 또는 집단 배가수)에서 지속된다(임의적으로 무기한으로 지속된다). 일부 구현예에서, 제2 외인성 핵산은 예를 들어, 본원에 기재된 생물반응기의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 회의 숙주 주기, 집단 배가수, 또는 세대 수 동안 숙주 세포(예를 들어, 또는 그의 딸 세포, 후손, 세대, 또는 집단 배가수)에서 지속된다(임의적으로 무기한으로 지속된다). 일부 구현예에서, 제1 외인성 핵산은 숙주 세포가 감소된 수준의 티로신을 포함하는(예를 들어, 티로신을 포함하지 않는) 배지에서 유지되는 한 숙주 세포(예를 들어, 또는 그의 딸 세포, 후손, 세대, 또는 집단 배가수)에서 지속된다. 일부 구현예에서, 제2 외인성 핵산은 숙주 세포가 감소된 수준의 티로신을 포함하는(예를 들어, 티로신을 포함하지 않는) 배지에서 유지되는 한 숙주 세포(예를 들어, 또는 그의 딸 세포, 후손, 세대, 또는 집단 배가수)에서 유지된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포에서 제1, 제2, 또는 제1 및 제2 외인성 핵산의 지속성은 예를 들어, 숙주 세포가 감소된 수준의 티로신을 포함하는(예를 들어, 티로신을 포함하지 않는) 배지에서 생성물을 성장 및 생산하는지에 의해 기능적으로 평가된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포에서 제1, 제2, 또는 제1 및 제2 외인성 핵산의 지속성은 RT-PCR을 사용함으로서 평가(예를 들어, 확인)된다.

일부 구현예에서, 티로신 영양요구성 선택 마커(예를 들어, PAH 효소 분자를 암호화하는 제1 외인성 핵산 및 GCH1 효소 분자를 암호화하는 제2 외인성 핵산)를 포함하는 숙주 세포는 감소된 수준의 티로신을 포함하는(예를 들어, 티로신 부재 하에) 배양 배지에서 티로신 영양요구성 선택 마커를 포함하지 않는 달리 유사한 세포보다 더 빠르게 성장 및/또는 분열한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 감소된 수준의 티로신을 포함하는(예를 들어, 티로신 부재 하에) 배양 배지에서 티로산 영양요구성 선택 마커를 포함하지 않는 유사한 세포보다 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100% 더 빠르게, 또는 10 배, 10² 배, 10³ 배, 10⁴ 배, 10⁵ 배, 또는 10⁶ 배 더 빠르게 성장 및/또는 분열한다.

일부 구현예에서, 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산(예를 들어, PAH 효소 분자를 암호화하는 제1 외인성 핵산 및 GCH1 효소 분자를 암호화하는 제2 외인성 핵산)(및 임의적으로 상기 외인성 핵산과 연관된 대상 핵산)을 포함하는 선택 마커를 포함하는 숙주 세포는 외인성 핵산 및/또는 대상 핵산이 결여되어 있는 세포와 비교하여 상승된 효소 분자 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 효소 분자 활성 수준은 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산 및/또는 연관된 대상 핵산이 결여되어 있는 세포에서 검출가능한 효소 분자 활성에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 500%, 1000%, 또는 그 이상까지 증가된다. 일부 구현예에서, 활성이 상승된 세포는 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산 및/또는 연관된 대상 핵산이 결여되어 있는 세포보다 더 빠르게 성장할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 성장 및/또는 분열 속도는 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산 및/또는 연관된 대상 핵산이 결여되어 있는 유사한 배지 조건에서 유사한 세포에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 500%, 1000%, 또는 그 이상까지 증가된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 대상 핵산 및/또는 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산이 결여되어 있는 유사한 세포보다 아미노산이 결여되어 있는 배지에서 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 5000, 또는 10,000 배 더 빠르게 성장한다.

숙주(생산) 세포를 사용하여 재조합 생성물을 제조하는 방법

생산 세포로도 지칭될 수 있는 본 발명의 숙주 세포는 도입된 핵산(들)에 의해 암호화된 생성물을 발현하는 데 사용될 수 있다. 이들 생산 세포는 전형적으로 생산 세포를 만들기 위해 세포 내로 제1, 제2, 및/또는 제3 외인성 핵산(및 임의적으로 다중 하위단위 생성물을 포함하여, 하나 초과의 관심 생성물이 생산될 경우 본원에 기재된 바와 같은 추가 외인성 핵산)으로 안정하게 형질감염된다. 대안적 구현예에서 숙주 세포는 적합한 세포 내로 제1, 제2, 및/또는 제3 외인성 핵산으로 일시적으로 형질감염될 수 있다.

재조합 생성물은 하기 기재된 방법을 고려하여, 생성물을 생산하는 데 적합한 당업계에 알려진 임의의 방법에 따라 본 발명의 생산 세포를 배양함으로써 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 티로신이 결여되어 있거나 또는 0.01 g/L 이하 또는 50, 20, 또는 10 μM 이하인 티로신 수준(예를 들어, 하나 이상의 효소 분자(들)를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산(들) 및/또는 대상 핵산을 포함하지 않는 유사한 세포를 배양하기에 충분하지 않은 티로신 수준)을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양은 예를 들어, 티로신의 부재 하에 하나 이상의 외인성 핵산(들)을 포함하지 않는 세포(예를 들어, 생산 세포와 유사한 세포)의 생존 또는 성장에 필요한 수준보다 더 낮은 티로신 수준의 존재 하에 생산 세포를 배양하는 것을 포함한다. 재조합 생성물 발현 동안 생산자 세포주에 선택적 압력을 가할 필요가 없을 수 있으므로, 배양 배지는 성장 단계 및 생산 단계 동안 다양한 단계에서 티로신을 함유할 수 있다. 그러나 티로신은 낮은 용해도로 인해 세포 배양 배지에서 다루기가 더 어려우므로, 세포 배양 배지로부터 완전히 생략하는 것이 유리할 수 있다.

다른 한편으로, 티로신의 부재 하에(또는 낮은 수준 하에), 세포는 더 많은 페닐알라닌을 소비할 것이므로, 공급 용액과 같은 사용되는 다양한 배지는 페닐알라닌이 보충될 수 있다. 예를 들어 페닐알라닌은 적어도 0.035 g/L의 수준으로 포함될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 페닐알라닌은 적어도 0.035 g/L의 수준으로 제공된다(예를 들어, 배양의 일부로서 및/또는 배양 배지의 구성요소로서). 따라서 세포는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 mM인 페닐알라닌 수준의 존재 하에 배양될 수 있다. 높은 수준의 페닐알라닌은 세포 성장을 억제할 수 있으므로, 전형적으로 페닐알라닌 수준은 10 mM 미만, 예컨대 9, 8, 7 또는 6 mM 미만이다.

CHO PAH 효소의 경우, 일 구현예에서 배양 배지에서 페닐알라닌 수준은 2 내지 9 mM, 예컨대 2 또는 3 mM 내지 6 또는 7 mM 페닐알라닌인 것이 바람직한 반면, 인간 PAH 효소의 경우 일 구현예에서 바람직한 범위는 4 내지 9 mM 페닐알라닌이다. 본 발명의 결과는 세포 배양 배지에 페닐알라닌이 보충된 경우 절두된 인간 PAH 효소가 뛰어난 세포 성능을 제공함을 나타낸다.

세포는 더 높은 수준의 페닐알라닌을 조정할 수 있도록 적응 단계를 거칠 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 페닐알라닌-보충된 배지에서 성장하기 위한 선택 단계 동안 이미 적응되었다. 대안적으로 이는 예를 들어 N 생물반응기에 대한 접종물을 생산하는 N-1 생물반응기에서 생산 또는 사전 생산 단계에서 발생할 수 있다. 다시 말하면, 적응은 페닐알라닌의 농도가 증가함에 따라 다른 기간 동안 수행될 수 있거나, 또는 세포는 최종 보충 수준에서 이미 세포 배양 배지 내로 시딩될 수 있다.

일부 구현예에서, 페닐알라닌 수준은 배양물에서 페닐알라닌 수준을 검출 및/또는 모니터링하고, 검출된 수준이 임계값 미만인 것에 반응하여 페닐알라닌을 제공하는(예를 들어, 검출된 수준이 임계값보다 더 크거나 또는 동일할 때까지) 자동-조정 시스템을 사용하여 확립 및/또는 유지된다. 일부 구현예에서, 이러한 자동-조정 시스템은 페닐알라닌 수준을 검출 및/또는 모니터링하기 위해 분광법(예를 들어, 라만 분광법)을 활용한다. 추가의 선택 마커가 사용되는 경우 유사한 고려사항을 적용한다.

구현예에서, 세포 배양물은 회분식(batch) 배양물, 유가식 배양물, 단축된 유가식 과성장(aFOG), 배출 및 유입 배양물, 연속 배양물, 또는 관류 배양물을 포함한 반-연속 배양물로 수행된다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 연속으로 또는 반연속으로 작동할 수 있거나 또는 작동하도록 구성된다. 구현예에서, 세포 배양물은 현탁 배양물이다. 일 구현예에서, 세포 또는 세포 배양물은 재조합 폴리펩티드의 발현을 위해 생체내에서 배치되며, 예를 들어, 모델 유기체 또는 인간 대상체에 배치된다. 일부 구현예에서, 세포 배양물은 고형 미세담체(예를 들어, 고형 미세담체의 표면 상에서 성장), 다공성 미세담체(예를 들어, 미세담체 상에서 및/또는 내에서 성장), 또는 지지 매트릭스(예를 들어, 매트릭스 상에서 및/또는 내에서 성장)를 활용한다. 일부 구현예에서, 세포 배양물은 관류 배양물이다. 일부 구현예에서, 세포 배양물은 진탕된다. 일부 구현예에서, 세포 배양물은 미세유체 배양물이다.

일 구현예에서, 배양 배지는 혈청이 없다. 무혈청, 무단백질, 및 화학적으로 정의된 동물 구성요소-무함유(CDACF) 배지는 예를 들어, Lonza Bioscience에서 상업적으로 입수가능하다.

일부 구현예에서, 지질 첨가제(예를 들어, 콜레스테롤, 올레산, 리놀레산, 또는 이의 조합 포함)가 배양 배지에 첨가될 수 있다.

포유류 세포주에 적합한 배지 및 배양 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,633,162호에 기재된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 실험실 플라스크 또는 저밀도 세포 배양물에 대한 표준 세포 배양 배지 및 특정 세포 유형의 필요성에 대해 적응되는 것의 예는 예를 들면 다음과 같다: Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지(Morre, G., The Journal of the American Medical Association, 199, p. 519 f. 1967), L-15 배지(Leibovitz, A. 등, Amer. J. of Hygiene, 78, 1p. 173 ff, 1963), Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM), Eagle의 최소 필수 배지(MEM), Ham의 F12 배지(Ham, R. 등, Proc. Natl. Acad. Sc.53, p288 ff. 1965) 또는 알부민, 트랜스페린 및 레시틴이 결여되어 있는 Iscoves의 변형된 DMEM(Iscoves 등, J. Exp. med. 1, p. 923 ff., 1978). 예를 들면, Ham의 F10 또는 F12 배지는 CHO 세포 배양물에 대해 특별하게 설계되었다. CHO 세포 배양물에 특별히 적응된 다른 배지는 EP481 791에 기재되어 있다. 이러한 배양 배지는 소 태아 혈청(FBS, 송아지 태아 혈청 FCS라고도 불림)이 보충될 수 있는 것으로 알려져 있으며, 후자는 과잉 호르몬 및 성장 인자의 천연 공급원을 제공한다. 포유류 세포의 세포 배양은 오늘날 과학 텍스트북 및 매뉴얼에 잘 설명된 일상적인 작업이며, 예를 들어 R. Ian Fresney, Culture of Animal Cell, a manual, 4^th edition, Wiley-Liss/N.Y., 2000에서 상세하게 다루고 있다. 본원에 기재된 세포 배양 배지 중 임의의 것은 특정 아미노산, 예를 들어, 세포가 대상 핵산을 취한 경우 생합성이 구제될 수 있는 아미노산, 예컨대 티로신이 결여되도록 제형화될 수 있다.

다른 적합한 배양 방법은 당업자에게 알려져 있고 활용되는 재조합 폴리펩티드 생성물 및 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다. 세포에 의해 발현될 재조합 또는 치료 폴리펩티드의 발현 및 생산에 적합한 조건을 결정 또는 최적화하는 것은 통상의 숙련자의 기술 내에 있다.

일 측면에서, 본 개시내용은 폴리펩티드 생성물을 만들거나 또는 제조하는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은 폴리펩티드 생성물을 수확하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 수확은 예를 들어, 본원에 기재되거나 또는 당업계에 알려진 방법에 의해 생산 세포 및/또는 배양 배지로부터 폴리펩티드 생성물을 분리하는 것을 포함한다.

배양은 상이한 배양 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 배양 단계는 제1 배양 배지 이어서 제2 배양 배지에서 생산 세포를 배양하는 것을 포함한다(즉 예를 들어 상이한 수준의 티로신 및/또는 페닐알라닌을 가질 수 있는 상이한 배지 사용).

생산 세포는 다양한 규모로 임의의 적합한 용기에서 배양될 수 있다. 산업용 생산을 위해 생물반응기, 예컨대 적어도 10 리터, 예컨대 적어도 50 리터, 50 내지 800 리터, 또는 800-200,000 리터의 부피를 갖는 생물반응기가 사용될 수 있다. 생물반응기는 일회용 생물반응기일 수 있다. 구현예에서, 생물반응기는 생물공정 용기, 쉘, 적어도 하나의 교반기, 적어도 하나의 살포기, 살포기(들) 및 헤드스페이스 오버레이용 적어도 하나의 가스 필터 유입 포트, 적어도 하나의 충전 포트, 적어도 하나의 수확 포트, 적어도 하나의 샘플 포트, 및 적어도 하나의 프로브를 포함한다. 생물반응기는 또한 하나 이상의 매개변수, 예를 들어, pH, 용존 산소 분압(DOT), 페닐알라닌 수준 및/또는 온도를 모니터링 및 유지하기 위한 공정 및 프로브를 포함할 수 있다. 생물반응기는 수확 용기에 작동가능하게 연결될 수 있다. 추가의 상세한 내용 및 구현예는 하기 '적용' 섹션에 제공되어 있다.

생산 세포에 의한 생성물의 생합성이 만족하는 지점까지 진행되면, 생성물은 예를 들어 배양 배지를 회수하고 세포 및 세포 파편으로부터 상청액을 분리하여 수확될 수 있다. 생성물은 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과 및/또는 바이러스 불활성화와 같은 정제된 생성물을 수득하기 위한 하나 이상의 정제/처리 단계에 적용될 수 있다. 생성물은 또한 제형화된 약제학적 조성물과 같은 조성물을 생성하기 위해 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제, 예를 들어, 완충제, 계면활성제, 안정화제(예컨대 트레할로스, 수크로스, 글리세롤), 아미노산(예컨대 글리신, 히스티딘, 아르기닌), 금속 이온/킬레이트제, 염 및/또는 보존제 중 하나 이상과 조합될 수 있다.

재조합 생성물

본원에는 생성물, 예를 들어, 폴리펩티드, 예를 들어, 치료 폴리펩티드를 고수율로 생성할 수 있는 생산 세포 또는 세포주를 식별, 선택, 또는 배양하기 위한 조성물 및 방법, 뿐만 아니라 상기 생성물을 생산하기 위한 방법이 제공된다. 본 개시내용에 의해 포함된 생성물은 예를 들어, 세포에서 발현됨으로써 생산될 수 있는 분자, 핵산(예를 들어, 비코딩 핵산, 예를 들어, 비코딩 RNA 분자, 예를 들어, 안티센스 RNA, siRNA, tRNA, 리보솜 RNA, microRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, 또는 긴 비코딩 RNA, 예를 들어, Xist 또는 HOTAIR), 폴리펩티드(예를 들어, 재조합 및/또는 치료 폴리펩티드), 또는 이의 하이브리드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 생성물을 생산하도록 조작 또는 변형된다. 이러한 변형은 생성물의 생산을 제어 또는 초래하는 분자를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 세포는 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 핵산을 도입함으로써 변형되고, 세포는 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드의 생산, 예를 들어, 발현 및 분비에 적합한 조건 하에 배양된다. 또 다른 예에서, 세포는 세포에 의해 내인성으로 발현되는 폴리펩티드의 발현을 제어, 예를 들어 증가시키는 외인성 핵산을 도입함으로써 변형되어, 세포가 예를 들어, 비변형된 세포에서 내인성으로 생산된 수준 또는 양보다 더 높은 수준 또는 양의 폴리펩티드를 생산하도록 한다. 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 식별, 선택, 또는 생성된 세포 또는 세포주는 의학적 병태, 장애 또는 질환의 치료에 유용한 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 생산한다.

폴리펩티드

일부 구현예에서, 관심 생성물은 하나 이상의 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 포함하며, 이는 전형적으로 이종 폴리펩티드, 즉 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않는 생성물이다. 생성물은 예를 들어, 약물 스크리닝에 유용한 치료 단백질 또는 진단 단백질일 수 있다. 치료 또는 진단 단백질은 항체 분자, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 융합 단백질, 호르몬, 사이토카인, 성장 인자, 효소, 당단백질, 지단백질, 리포터 단백질, 치료 펩티드, 압타머, 또는 이들 중 임의의 것의 구조적 및/또는 기능적 단편 또는 하이브리드일 수 있다. 일 구현예에서, 생성물은 다중 폴리펩티드 쇄, 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.

일부 구현예에서, 생성물은 항체 분자이다. 본원에 포함된 생성물은 영상화 기술에 유용한 진단 항체 분자, 예를 들어, 단클론 항체 또는 이의 항체 단편, 및 대상체에게 투여하기에 적합한, 예를 들어, 질환 또는 장애의 치료에 유용한 치료 항체 분자이다. 항체 분자는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열이다. 구현예에서, 항체 분자는 전장 항체 또는 항체 단편이다. 항체 및 다중포맷 단백질은 다클론 또는 단클론, 다중 또는 단일 쇄, 또는 온전한 면역글로불린일 수 있고, 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 면역글로불린 분자의 다량체, 예를 들어, 면역글로불린 분자의 사량체일 수 있다. 구현예에서, 항체는 단클론 항체이다. 항체는 인간 또는 인간화 항체일 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 IgA, IgG, IgD, IgM, 또는 IgE 항체이다. 일 구현예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중-, 삼중-, 또는 사중-특이적 항체, 예를 들어, BiTE이거나 또는 이를 포함한다.

"항체 단편"은 온전한 항체의 적어도 하나의 부분, 또는 이의 재조합 변이체를 지칭하고, 항원과 같은 표적에 대한 항체 단편의 인식 및 특이적 결합을 부여하기에 충분한 항원 결합 도메인, 예를 들어, 온전한 항체의 항원성 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편, scFv 항체 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체 예컨대 sdAb(VL 또는 VH), 낙타과 VHH 도메인, 및 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편과 같은 항체 단편, 및 단리된 CDR 또는 항체의 다른 에피토프 결합 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 나노바디(nanobody), 인트라바디(intrabody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), v-NAR 및 비스-scFv 내로 혼입될 수 있다(예를 들어, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005 참조). 항원 결합 단편은 또한 피브로넥틴 유형 III(Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기반하여 스캐폴드 내로 이식될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 설명하는 미국 특허 번호 제6,703,199호 참조).

관심 폴리펩티드의 예는 하기에 나열될 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다:

호르몬: 에리트로포이에틴, 에포인-α, 다르베포에틴-α, 성장 호르몬(GH), 소마토트로핀, 인간 난포-자극 호르몬(FSH), 인간 융모성 고나도트로핀, 루트로핀-α, 글루카곤, 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH), 인슐린.

혈액 응혈/응고 인자: 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 항트롬빈 III(AT-III), 단백질 C 농축물

사이토카인/성장 인자: 유형 I 알파-인터페론, 인터페론-αn3(IFNαn3), 인터페론-β1a(rIFN-β), 인터페론-β1b(rIFN-β), 인터페론-γ1b(IFNγ), 알데스류킨(Aldesleukin)(인터류킨 2(IL2), 상피 흉선세포 활성화 인자; ETAF, 팔리퍼민(Palifermin)(각질세포 성장 인자; KGF), 베카플레민(Becaplemin)(혈소판 유래 성장 인자; PDGF), 아나킨라(Anakinra)(재조합 IL1 길항제).

항체: 베바시주맙(Bevacizumab)(VEGFA mAb), 세툭시맙(Cetuximab)(EGFR mAb), 파니투무맙(Panitumumab)(EGFR MAb), 알림투주맙(Alemtuzumab)(CD52 mAb), 리툭시맙(Rituximab)(CD20 키메라 Ab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 아달리무맙(Adalimumab), 인플릭시맙(infliximab), 토시투모맙(Tositumomab), 아크리투모맙(Acritumomab), 라니비주납(Ranibizumab), 압식시맙(Abciximab), 오말리주맙(Omalizumab), 팔리비주맙(Palivizumab), 나탈리주맙(Natalizumab), 다클리주맙(Daclizumab), 바실릭시맙(Basiliximab), 에쿨리주맙(Eculizumab).

백신 항원: B형 간염 표면 항원(HBsAg), HPV 항원, HIV 항원, 인플루엔자 항원.

기타: 알부민, 항-레서스(Rh) 면역글로불린 G, 엔푸비르티드(Enfuvirtide), 거미줄 단백질 예를 들어, 피브리온, 보툴리눔 독소 유형 A, 알글루세라제, 이미글루세라제, 재조합 인간 히알루로니다제, 팔리퍼민, 아나킨라, 도르나제 알파, 합성 돼지 세크레틴.

관심 재조합 폴리펩티드는 BsIgG(트리오맙(Triomab)), BiTE, DART, TandB와 같은 다양한 형식이 이용가능한 다중특이적 단백질, 예를 들어, 이중특이적 항체일 수 있다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드(예를 들어, 세포에 의해 및/또는 본원에 기재된 방법에 따라 생산됨)는 암 세포에 의해 발현된 항원이다. 일부 구현예에서 재조합 또는 치료 폴리펩티드는 종양-연관 항원 또는 종양-특이적 항원이다. 일부 구현예에서, 재조합 또는 치료 폴리펩티드는 HER2, CD20, 9-O-아세틸-GD3, βhCG, A33 항원, CA19-9 마커, CA-125 마커, 칼레티쿨린, 카르보안하이드라제 IX(MN/CA IX), CCR5, CCR8, CD19, CD22, CD25, CD27, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD63, CD70, CC123, CD138, 암종 배아 항원(CEA; CD66e), 데스모글레인 4, E-카드헤린 네오에피토프, 엔도시알린, 에프린 A2(EphA2), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 상피 세포 접착 분자(EpCAM), ErbB2, 태아 아세틸콜린 수용체, 섬유아세포 활성화 항원(FAP), 푸코실 GM1, GD2, GD3, GM2, 강글리오시드 GD3, 글로보 H, 당단백질 100, HER2/neu, HER3, HER4, 인슐린-유사 성장 인자 수용체 1, 루이스-Y, LG, Ly-6, 흑색종-특이적 콘드로이틴-술페이트 프로테오글리칸(MCSCP), 메소텔린, MUCl, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5_AC, MUC5_B, MUC7, MUC16, 뮐러관 억제 물질(MIS) 수용체 유형 II, 형질 세포 항원, 폴리 SA, PSCA, PSMA, 소닉 헤지호그(SHH), SAS, STEAP, sTn 항원, TNF-알파 전구체, 및 이의 조합으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드(예를 들어, 세포에 의해 및/또는 본원에 기재된 방법에 따라 생산됨)는 활성화 수용체이고 2B4(CD244), α₄β₁ 인테그린, β₂ 인테그린, CD2, CD16, CD27, CD38, CD96, CDlOO, CD160, CD137, CEACAMl(CD66), CRTAM, CSl(CD319), DNAM-1(CD226), GITR(TNFRSF18), 활성화 형태의 KIR, NKG2C, NKG2D, NKG2E, 하나 이상의 천연 세포독성 수용체, NTB-A, PEN-5, 및 이의 조합으로부터 선택되며, 임의적으로 여기서 β₂ 인테그린은 CD11a-CD 18, CD11 b-CD 18, 또는 CD11c-CD 18을 포함하고, 임의적으로 여기서 활성화 형태의 KIR은 KlR2DSl, KIR2DS4, 또는 KIR-S를 포함하고, 임의적으로 여기서 천연 세포독성 수용체는 NKp30, NKp44, NKp46, 또는 NKp80을 포함한다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드(예를 들어, 세포에 의해 및/또는 본원에 기재된 방법에 따라 생산됨)는 억제 수용체이고 KIR, ILT2/LIR-l/CD85j, 억제 형태의 KIR, KLRG1, LAIR-1, NKG2A, NKR-P1A, Siglec-3, Siglec-7, Siglec-9, 및 이의 조합으로부터 선택되며, 임의적으로 여기서 억제 형태의 KIR은 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, 또는 KIR-L을 포함한다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드(예를 들어, 세포에 의해 및/또는 본원에 기재된 방법에 따라 생산됨)는 활성화 수용체이고 CD3, CD2(LFA2, OX34), CD5, CD27(TNFRSF7), CD28, CD30(TNFRSF8), CD40L, CD84(SLAMF5), CD137(4-1BB), CD226, CD229(Ly9, SLAMF3), CD244(2B4, SLAMF4), CD319(CRACC, BLAME), CD352(Lyl08, NTBA, SLAMF6), CRTAM(CD355), DR3(TNFRSF25), GITR(CD357), HVEM(CD270), ICOS, LIGHT, LTβR(TNFRSF3), OX40(CD134), NKG2D, SLAM(CD150, SLAMF1), TCRα, TCRβ, TCRδγ, TIM1(HAVCR, KIM1), 및 이의 조합으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드(예를 들어, 세포에 의해 및/또는 본원에 기재된 방법에 따라 생산됨)는 억제 수용체이고 PD-1(CD279), 2B4(CD244, SLAMF4), B71(CD80), B7Hl(CD274, PD-L1), BTLA(CD272), CD160(BY55, NK28), CD352(Ly108, NTBA, SLAMF6), CD358(DR6), CTLA-4(CD152), LAG3, LAIR1, PD-1H(VISTA), TIGIT(VSIG9, VSTM3), TIM2(TIMD2), TIM3(HAVCR2, KIM3), 및 이의 조합으로부터 선택된다.

다른 재조합 단백질 생성물(예를 들어, 세포에 의해 및/또는 본원에 기재된 방법에 따라 생산됨)은 DARPin, 아피바디(affibody) 및 애드넥틴과 같으나 이에 제한되지 않는 비-항체 스캐폴드 또는 대체 단백질 스캐폴드를 포함한다. 이러한 비-항체 스캐폴드 또는 대체 단백질 스캐폴드는 1 또는 2 개, 또는 그 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 또는 그 이상의 상이한 표적 또는 항원을 인식하거나 또는 이에 결합하도록 조작될 수 있다.

적용

본 개시내용은 그 중에서도, 생산 세포, 생산 세포를 사용하여 폴리펩티드 생성물을 만들거나 또는 제조하는 방법, 세포(예를 들어, 생산 세포)를 식별, 선택, 및/또는 배양하는 방법, 및 생산 세포를 만들거나 또는 생산하는 방법을 특징으로 한다. 본원에 개시된 바와 같은 세포를 식별, 선택, 및/또는 배양하는 방법은 다양한 생성물을 생산하는 데 유용한 세포, 예를 들어, 생산 세포를 생성하거나, 다양한 세포주를 평가하거나, 또는 생물반응기 또는 처리 용기 또는 탱크에서 사용하거나, 또는, 보다 일반적으로 임의의 공급물 공급원과 함께 사용하기 위해 다양한 세포주의 생산을 평가하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 예를 들어, 원핵생물 및/또는 진핵생물 세포주를 포함한 임의의 원하는 세포주를 배양하는 데 적합하다. 추가로, 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 현탁 세포 또는 흡착-의존(부착) 세포를 배양하는 데 적합하고 폴리펩티드 생성물, 핵산 생성물(예를 들어 DNA 또는 RNA), 엑소좀, 소포, 또는 세포와 같은 약제학적 및 생물약제학적 생성물 및/또는 세포 및/또는 바이러스 요법에서 또는 백신으로서 사용되는 것들과 같은 바이러스의 생산을 위해 구성된 생산 작업에 적합하다.

구현예에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포는 재조합 치료 또는 진단 생성물과 같은 생성물을 발현하거나 또는 생산한다. 하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 세포에 의해 생산된 생성물의 예는 항체 분자(예를 들어, 단클론 항체, 이중특이적 항체), 항체 모방체(항원에 특이적으로 결합하지만 예를 들어 DARPin, 아피바디, 애드넥틴, 또는 IgNAR과 같은 항체와 구조적으로 관련되지 않은 폴리펩티드 분자), 융합 단백질(예를 들어, Fc 융합 단백질, 키메라 사이토카인), 다른 재조합 단백질(예를 들어, 글리코실화 단백질, 효소, 호르몬), 바이러스 치료제(예를 들어, 항암 종양용해성 바이러스, 유전자 요법 및 바이러스 면역요법을 위한 바이러스 벡터), 세포 치료제(예를 들어, 다능성 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 성체 줄기 세포), 백신 또는 지질-캡슐화 입자(예를 들어, 엑소좀, 바이러스-유사 입자), RNA(예컨대 예를 들어 siRNA) 또는 DNA(예컨대 예를 들어 플라스미드 DNA), 항생제 또는 아미노산을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 바이오시밀러를 생산하는 데 사용될 수 있다.

언급된 바와 같이, 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 대규모 방식으로 진핵생물 세포에 의해 합성된 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유류 세포 또는 예를 들어 효모 세포 또는 사상성 진균 세포와 같은 저급 진핵생물 세포, 또는 그람-양성 또는 그람-음성 세포와 같은 원핵생물 세포 및/또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포의 생성물, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 항생제, 아미노산, 핵산(예컨대 DNA 또는 RNA)의 생산을 허용한다. 본원에 달리 언급되지 않는 한, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 벤치 규모, 파일롯 규모, 및 전체 생산 규모 용량을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 원하는 부피 또는 생산 용량을 포함할 수 있다.

더욱이 및 본원에 달리 언급되지 않는 한, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 고체 또는 다공성 미세담체 또는 지지체를 사용하거나 또는 사용하지 않는 교반 탱크, 에어리프트, 섬유, 미세섬유, 중공 섬유, 세라믹 매트릭스, 유동층, 고정층, 및/또는 분류층 생물반응기를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 반응기(들)와 함께 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "반응기"는 발효기 또는 발효 장치, 또는 임의의 다른 반응 용기를 포함할 수 있고 용어 "반응기"는 "발효기"와 상호교환가능하게 사용된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 생물반응기 장치는 다음 중 하나 이상, 또는 모두를 수행할 수 있다: 영양소 및/또는 탄소원의 공급, 적합한 가스(예를 들어, 산소)의 주입, 발효 또는 세포 배양 배지의 유입구 및 유출구 흐름, 기체 및 액체 상 분리, 온도 유지, 산소 및 CO₂ 수준 유지, pH 수준 유지, 교반(예를 들어, 젓기), 및/또는 세정/멸균. 발효 장치와 같은 예시적인 반응기 장치는 장치 내에 다중 반응기를 함유할 수 있으며, 예를 들어 장치는 각각의 장치에 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 개, 또는 그 이상의 생물반응기를 가질 수 있고/있거나 시설은 시설 내에 단일 또는 다중 반응기를 갖는 다중 장치를 함유할 수 있다. 다양한 구현예에서, 생물반응기는 회분식, 반유가식, 유가식, 관류, 및/또는 연속 발효 공정에 적합할 수 있다. 임의의 적합한 반응기 직경이 사용될 수 있다. 구현예에서, 생물반응기는 약 100 ml 내지 약 50,000 L의 부피를 가질 수 있다. 비제한적인 예는 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 750 ml, 1 리터, 2 리터, 10 리터, 50 리터, 100 리터, 500 리터, 1000 리터, 2000 리터, 5000 리터, 10,000 리터, 15,000 리터, 20,000 리터, 및/또는 50,000 리터의 부피, 또는 대략적으로 그러한 부피를 포함한다. 임상 또는 상업 용도에 충분한 생성물을 만드는 데 필요한 산업용 규모 제조의 맥락에서, 부피는 전형적으로 적어도 10 리터이다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 미세유체 배양물을 성장시키도록 구성된다. 추가적으로, 적합한 반응기는 다중 용도, 단일 용도, 일회용, 또는 비일회용일 수 있고 스테인리스 강(예를 들어, 316 L 또는 임의의 다른 적합한 스테인리스 강) 및 인코넬과 같은 금속 합금, 플라스틱, 및/또는 유리를 포함하는 임의의 적합한 물질로 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 반응기는 원형, 예를 들어, 원통형일 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 반응기는 사각형, 예를 들어, 직사각형일 수 있다. 사각형 반응기는 일부 경우에 원형 반응기에 비해 사용 용이성(예를 들어, 숙련자에 의한 로딩 및 설정), 반응기 내용물의 더 큰 혼합 및 균질성, 및 더 낮은 바닥 공간과 같은 이익을 제공할 수 있다.

구현예에서 및 본원에 달리 언급되지 않는 한, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 이러한 생성물의 분리, 정제, 및 단리를 위한 작업 및/또는 장비와 같이, 달리 언급되지 않은 임의의 적합한 장치 작업 및/또는 장비와 함께 사용될 수 있다. 전통적인 스틱-조립(stick-built) 시설, 모듈식, 이동식 및 임시 시설, 또는 임의의 다른 적합한 건설, 시설, 및/또는 레이아웃과 같은 임의의 적합한 시설 및 환경이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 모듈식 청정실이 사용될 수 있다. 추가적으로 및 달리 명시되지 않는 한, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 단일 위치 또는 시설에서 수용 및/또는 수행될 수 있거나 또는 대안적으로 별개 또는 다중 위치 및/또는 시설에서 수용 및/또는 수행될 수 있다.

비제한적인 예로서 및 제한 없이, 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 공개 번호 제2013/0280797호; 제2012/0077429호; 제2011/0280797호; 제2009/0305626호; 및 미국 특허 번호 제8,298,054호; 제7,629,167호; 및 제5,656,491호는 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합할 수 있는 예시적인 시설, 장비, 및/또는 시스템을 기재한다.

본원에 기재된 조성물 및 방법은 숙주 세포와 관련하여 상기 섹션에 기재된 바와 같은 광범위한 스펙트럼의 세포를 활용할 수 있다. 바람직한 구현예에서 포유류 세포는 CHO-세포주이다. 예는 CHO-K1 세포, CHO-K1 SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHOS, CHO GS 녹아웃 세포, CHO FUT8 GS 녹아웃 세포, CHOZN, 및 CHO-유래 세포를 포함한다. CHO GS 녹아웃 세포(예를 들어, GSKO 세포)는 예를 들어, CHOK1SV^® GS 녹아웃 세포이다. CHO FUT8 녹아웃 세포는 예를 들어, Potelligent® CHOK1SV^®(Lonza Biologics, Inc.)이다.

일 구현예에서, 진핵생물 세포는 예를 들어 효모 세포(예를 들어, 피키아 속 (예를 들어 피키아 파스토리스, 피키아 메타놀리카, 피키아 클루이베리, 및 피키아 앵구스타), 코마가타엘라 속(예를 들어 코마가타엘라 파스토리스, 코마가타엘라 슈도파스토리스 또는 코마가타엘라 파피이), 사카로마이세스 속(예를 들어 사카로마이세스 세레비재, 사카로마이세스 클루이베리, 사카로마이세스 우바룸), 글루이베로마이세스 속(예를 들어 글루이베로마이세스 락티스, 글루이베로마이세스 마르시아누스), 칸디다 속(예를 들어 칸디다 우틸리스, 칸디다 카카오이, 칸디다 보이디니이), 게오트리쿰 속(예를 들어 게오트리쿰 페르멘탄스), 한세눌라 폴리모르파, 야로위아 리폴리티카, 또는 스키조사카로마이세스 폼베와 같은 저급 진핵생물 세포이다. 종 피키아 파스토리스가 바람직하다. 피키아 파스토리스 균주에 대한 예는 X33, GS115, KM71, KM71H; 및 CBS7435이다.

구현예에서, 배양된 세포는 치료 용도를 위한 단백질 예를 들어, 항체, 예를 들어, 단클론 항체, 및/또는 재조합 단백질을 생산하는 데 사용된다. 구현예에서, 배양된 세포는 펩티드, 아미노산, 지방산 또는 다른 유용한 생화학적 중간체 또는 대사산물을 생산한다. 예를 들어, 구현예에서, 약 4000 달톤 내지 약 140,000 달톤 초과의 분자량을 갖는 분자가 생산될 수 있다. 구현예에서, 이들 분자는 복잡성 범위를 가질 수 있고 글리코실화를 포함한 번역후 변형을 포함할 수 있다.

본 발명은 비제한적인 하기 실시예를 참조하여 추가로 예시될 것이다.

실시예

실시예 1: 재료 및 방법

세포 배양물

현탁 Lonza CHOK1SV^® GS-KO^® 세포를 6 mM L-글루타민(Sigma G8540)이 보충된 CD-CHO 배지(Gibco 10743-029)에서 유지하였다. 이들을 5% CO₂ 대기에서 140 rpm으로 37℃에서 배양하였다. 세포를 20 ml의 125 ml 에를렌마이어 플라스크에서 0.2 x 10⁶ 개의 생존가능한 세포/ml로 시딩하고, 이들을 3-4 일마다 계대하였다.

복귀 검정

Lonza CHOK1SV^® GS-KO^® 세포를 96 웰 플레이트에서 200 μl 배지 중 웰 당 5000 개의 생존가능한 세포로 시딩하고 11 일 및 3 주 후 결과물에 대해 분석하였다. 티로신이 없는 CD CHO 및 티로신이 없지만 6 mM L-글루타민이 보충된 Lonza CM76(Lonza Biologics plc)을 테스트 배지로서 사용하였다. 7.2x10⁶ 개의 생존가능한 세포를 티로신이 없는 CM76 배지에서 테스트하고 2.4 x10⁶ 개의 세포를 티로신이 없는 CD CHO 배지에서 테스트하였다. 완전 배지(CD-CHO + L-glut)를 양성 대조군으로서 사용하였고 L-글루타민이 없는 배지(CD-CHO 단독)를 음성 대조군으로서 사용하였다.

안정한 세포주를 만들기 위한 플라스미드 및 형질감염

표 1 - 벡터 작제물

절두된 PAH 서열은 조절 도메인을 함유하는 N-말단 116 개 아미노산의 결실을 갖는다(Daubner SC 등, 1997, ibid). PAH의 다양한 도메인은 표 1에 제시되어 있다.

플라스미드를 PvuI(NEB, R3150L)로 선형화하고 에탄올 침전 프로토콜을 사용하여 정제하였다. 전기천공을 Biorad Genepulser Xcell 전기천공기에서 수행하였다. 100 μl TE 완충액 중 선형화된 플라스미드 20 μg 및 1x10⁷ 개의 생존가능한 Lonza CHOK1SV GS-KO 세포/ 티로신이 없는 CM76(+6 mM L-glut) 배지 700 μl를 전기천공 큐벳에 첨가하였다. DNA 세포 믹스를 0.4 mm의 큐벳 직경으로 300 V 및 900 μF에서 전기천공하였다. 가온된 배지 1 ml를 전기천공 직후 큐벳에 첨가하였다. 그런 다음 세포를 T25 플라스크에서 티로신이 없는 CM76(+6 mM L-glut) 배지 2 x 5 ml로 옮겼다. 플라스크를 5% CO₂ 가스 환경의 정적 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 24 시간 후, 추가의 CM76 티로신 부재(+6 mM L-glut) 배지 5 ml를 T25 플라스크에 첨가하였다. 형질감염 성공을 평가하기 위해 형질감염 후 21 일째에 ViCell 기기를 사용하여 세포 카운트를 수행하였다. eGFP 발현을 위해 현미경(GFP2 필터가 있는 Leica MZFLIII, x100 배율) 아래에 T25 플라스크에서 성장하는 세포를 시각화함으로써 형질감염이 성공적이었다는 추가의 확인을 수행하였다.

성장 곡선 프로파일 및 배양 생존력

세포를 125 ml 에를렌마이어 플라스크에서 20 ml 중 0.2 x 10⁶ 개의 세포/ml로 시딩하고 5% CO₂ 환경에서 140 rpm, 37℃에서 진탕하였다. 판독값은 ViCell(Beckman Coulter) 기기를 사용하여 예시 도면에서 표시된 일 수 동안 48 시간마다 기록하였으며, 여기서 샘플 0.2 ml와 가온된 PBS 0.8 ml를 사용하여 생존가능한 세포 농도 및 세포 직경을 결정하였다.

FACS

1 x 10⁵ 개의 세포를 5 분 동안 1,000 rpm에서 원심분리기에서 펠릿화하고 350 μl PBS에 재현탁하였다. 그런 다음 샘플을 FACScalibur™(BD biosciences)의 프로브 위에 로딩하고 세포 카운트와 관련하여 형광 강도를 측정하였다. 전방 산란(FSC)은 E-1 증폭기를 사용하여 측정하였고 측면 산란(SSC)은 465로 설정하고 FL1은 473에서 세포를 기록하였으며; 모든 설정은 로그 스케일로 변환되었다.

SDS-PAGE, 웨스턴 블롯

1x10⁶ 개의 세포를 1000 rpm으로 5 분 동안 원심분리기에서 펠릿화하고 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.2, 100 mM NaCl, 10 mM Na β-글리세로포스페이트, 50 mM NaF를 함유하는 0.5% Nonidet-P40, 1 mM 활성화 Na₃ VO₄, 10 μg/ml 류펩틴, 2 μg/ml 펩스타틴 및 사용 직전에 첨가된 0.2 mM PMSF로 이루어진 100 μl의 빙냉 용해 완충액에서 용해시켰다.

10 μg의 환원 단백질 샘플 또는 10 μl의 비환원 상청액 샘플을 10% SDS-PAGE 아크릴아미드 겔 상에서 실행하였고 니트로셀룰로스로의 웨스턴 트랜스퍼를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Roobol, Carden 등, 2009, FEBS J. 276: 286-302). 항체는 Sigma(항-GCH1, SAB1405858-50μg, 항-PAH, HPA031642, 항-GS G2781, 항-B-액틴 A5441, 항-인간 IgG(γ-쇄 특이적) I9764) 및 CRUK(eGFP 3E1)로부터 수득하였다. 항-튜불린(Woods, Sherwin 등, 1989, J. Cell Sci. 93: 491-500)은 영국 옥스포드 대학교의 Keith Gull 교수의 친절한 선물이었던 반면 항-L7a는 인간 L7a의 N-말단 서열에 대해 생성되었다(Roobol 및 Carden, 1999, Eur. J. Cell Biol. 78(1): 21-32). 세포 용해물 단백질의 면역블롯 검출을 위한 2차 항체는 항-전체 IgG(마우스 또는 토끼)-HRP 접합체(Sigma) 이어서 ECL(GE Healthcare) 검출이었다.

qRTPCR

1x10⁶ 개의 생존가능한 세포를 RNA 추출로 수확하고 mRNA 양을 Eppendorf RealPlex 사이클러 기기에서 다음 프라이머 세트와 함께 Qiagen Quantifast 키트를 사용하여 qRTPCR에 의해 결정하였다: PAH(qrtPAHtotfwd CATCAAGGCATATGGTGCTG(서열번호: 7) 및 qrtPAHtotrvs GGGCTGGAACTCTGTGACAT((서열번호: 8)), GCH1(GCH1fwd: CTTCACCAAGGGCTACCAGG((서열번호: 9); GCH1 rev: AGGCCAAGGACTTGCTTGTT(서열번호: 10)) 및 β-액틴(CHObactqF AGCTGAGAGGGAAATTGTGCG(서열번호: 11) 및 CHObactqR GCAACGGAACCGCTC ATT(서열번호: 12)).

실시예 2: 티로신은 없지만 6mM L-글루타민이 보충된 CM76 또는 CD CHO 배지에서 성장시킨 GSKO 세포의 복귀 검정

이 실시예는 티로신의 부재 하에 성장할 수 없는 예시적인 세포를 성장시킬 때 관찰된 낮은 복귀율을 입증한다.

CHOK1SV GS-KO^® 숙주 세포를 티로신이 결여되어 있지만 6 mM 글루타민이 보충된 배지에서 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 양성 대조군은 6 mM 글루타민이 보충된 배지에서 성장시킨 CHOK1SV GS-KO^® 숙주 세포였고 음성 대조군은 글루타민이 결여되어 있는 배지였다. 결과는 하기 표 2에 제시되어 있다. 티로신이 결여되어 있는 배지에서, 복귀 콜로니/세포 성장은 관찰되지 않았고 플레이트는 음성 대조군과 유사하게 보였다. 이는 티로신 영양요구성 마커가 생산 세포에서 유용한 선택 마커가 될 것임을 시사한다.

표 2

실시예 3: 티로신의 부재 하에 예시적인 생산 세포의 성장

이 실시예는 PAH 및 GCH1 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산이 결여되어 있는 세포가 티로신의 부재 하에 성장하지 않는 반면, PAH 및 GCH1 효소 분자를 둘 다 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 벡터 LMM172 또는 LMM173을 함유하는 예시적인 생산 세포가 티로신의 부재 하에 성장하고 리포터 분자 eGFP를 발현하는 것으로 관찰됨을 입증한다. 그러나, 본 발명자들이 처음에 GCH1과 함께 전장 CHO PAH를 테스트하였을 때, 본 발명자들은 티로신-무함유 배지에서 형질감염된 세포의 회수가 매우 느리거나(CD CHO), 또는 CM76 배지가 사용된 경우, 회수가 전혀 없었음(데이터는 제시되지 않음)을 발견하였다. 따라서 본 발명자들은 조절 도메인을 암호화하는 N-말단 116 개의 아미노산이 제거된 PAH의 절두된 버전을 시도하였다.

이들 풀을 생성하는 데 사용된 벡터는 PAH(카세트 1, CHO 세포 또는 인간에서 유래되고 SV40 프로모터에 의해 구동된 서열이 결실된 처음 116 개 아미노산이 있는 tPAH), GCH1(카세트 3 SV40 프로모터에 의해 구동됨) 및 eGFP(카세트 2, CMV 프로모터에 의해 구동됨)의 절두된 버전을 함유하였다. 첫번째 카세트에 SV40 프로모터(벡터 LMM170)에 의해 구동된 글루타민 합성효소(GS) 유전자가 함유된 2 개의 대조군을 포함하였다. 형질감염된 대조군을 티로신의 부재(음성 대조군) 또는 티로신의 존재(양성 대조군) 하에 성장시켰다.

CHOK1SV GS-KO^® 숙주 세포를 선형화된 벡터로 전기천공을 통해 형질감염시키고 후속적으로 티로신이 없지만 6 mM 글루타민이 보충된 배지에서 3 주 동안 배양하였다(티로신도 포함된 양성 대조군 제외).

CHOK1SV GS-KO^® 숙주 조작된 세포는 절두된 PAH 및 GCH1이 동시 발현된 경우에만 티로신 무함유 배지에서 성공적으로 성장하는 것으로 나타났다. 게다가, 이들 구성요소가 개별적으로 형질감염되었을 때, 세포는 형질감염에서 생존하지 않았고 Tyr-무함유 배지에서 성장하였다(데이터는 제시되지 않음). 따라서, 절두된 PAH를 포함하는 PAH 효소 분자 및 GCH1 효소 분자는 둘 다 티로신의 부재 하에 예시적인 CHO 생산 세포 성장을 지원하는 데 필요하다.

도 2는 3 주 동안 형질감염 및 회수 후 세포 집단으로부터 평균 형광의 유세포 분석을 사용하여 수득된 히스토그램을 나타내며 티로신 무함유 배지에서 성장하는 세포의 eGFP 발현을 확인한다. 절두된 CHO 세포 유래된 PAH 서열 및 GCH1(벡터 LMM172)을 포함하는 예시적인 생산 세포의 평균 형광은 GS 양성 대조군(벡터 LMM170 +ve)으로부터의 것과 유사하였다. CHO 절두된 PAH 서열(LMM172)을 함유하는 생산 세포는 인간 절두된 PAH 서열(LMM173)과 비교하여 더 높은 GFP 발현을 나타내었다. 이는 PAH 및 GCH1 조합된 시스템이 선택 마커로서 사용되는 경우 재조합 단백질이 eGFP를 대체할 수 있는 모델이다.

실시예 4: PAH 단백질 및 mRNA 양

이 실시예는 인간 PAH 및 GCH1 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 벡터 LMM173을 함유하는 예시적인 생산 세포가 PAH 단백질 및 mRNA 발현 및 eGFP 단백질 발현을 나타냄을 입증하며; 실시예는 CHO PAH 및 GCH1 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 벡터 LMM172를 함유하는 예시적인 생산 세포가 PAH mRNA 발현 및 eGFP 단백질 발현을 나타냄을 추가로 입증한다.

도 2의 세포 풀로부터의 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 대조군을 6 mM 글루타민 및 티로신을 함유하는 배지에서 성장시켰고, LMM170 세포를 티로신을 함유하지만 글루타민이 없는 배지에서 성장시켰다. LMM172 및 LMM173을 6 mM 글루타민이 보충된 티로신 무함유 배지에서 성장시켰다. 튜불린 및 L7a를 로딩 대조군으로서 사용하였다. PAH 항체는 인간 절두된 PAH(대략적으로 37 및 50 kDa에서의 밴드)만 검출하였고 CHO 절두된 PAH(LMM172)는 검출하지 않았다(데이터는 제시되지 않음). eGFP는 형질감염된 벡터가 카세트 2에서 eGFP 유전자를 함유하는 세포 풀에서 발현되는 것으로 확인되었다.

도 3은 절두된 CHO PAH의 발현 및 절두된 인간 PAH mRNA 발현이 검출된 qRT-PCR 데이터를 나타낸다. 절두된 CHO PAH mRNA는 절두된 인간 PAH보다 훨씬 더 많은 양으로 발현하였다. 둘 다 대조군에 비해 증가하였으며 예시적인 생산 세포에서 외인성 PAH mRNA 발현을 확인하였다.

실시예 5: 티로신의 부재 하에 성장 프로파일 및 배양 생존력

이 실시예는 CHO PAH 및 GCH1 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 벡터 LMM172를 함유하는 예시적인 생산 세포가 더 높은 생존가능한 세포 농도로 성장할 수 있고 티로신의 부재 하에 외인성 핵산을 포함하지 않는 유사한 세포보다 연장된 배양 생존력을 가짐을 입증한다.

도 4는 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 생성된 예시적인 생산 세포 풀의 성장 데이터를 나타낸다. 세포 풀을 티로신 또는 글루타민의 부재 하에 18 일 동안 125 ml 에를렌마이어 플라스크에서 배양하였다. 2 일마다, 세포를 샘플링하고 생존가능한 세포의 수 및 배양 생존력을 ViCell 기기를 사용하여 평가하였으며; 추가 공급물은 도입하지 않았다. 도 4는 (a) 생존가능한 세포 농도 및 (b) 배양 생존력을 나타낸다. CHO 세포 절두된 PAH 세포 풀(LMM 172)은 인간 절두된 PAH 세포 풀(LMM 173)보다 더 많은 세포 수로 성장하고 더 긴 배양 생존력을 가졌다

실시예 6: 티로신의 부재 하에 성장시켰지만 추가의 페닐알라닌이 보충된 경우 예시적인 생산 세포의 성장 프로파일 및 생존가능한 세포 농도

이 실시예는 PAH 및 GCH1 효소 분자를 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 예시적인 생산 세포의 성장 및 배양 생존력 특성을 입증한다.

도 5는 예시적인 생산 세포 풀의 성장 데이터를 나타낸다 배양물을 18 일 동안 125 ml 에를렌마이어 플라스크에서 성장시키고 표시된 곳에 페닐알라닌(Sigma P5482)을 보충하였다. 세포를 2 일마다 샘플링하고 추가 공급물을 도입하지 않았다. 이들 세포를 세포 성장 및 배양 생존력에 대해 분석하였다. 절두된 인간 PAH를 발현하는 예시적인 생상 세포는 더 높은 생존가능한 세포 농도로 성장하였고 이들은 6 mM 페닐알라닌이 공급된 경우 절두된 CHO PAH를 발현하는 예시적인 생산 세포보다 더 짧은 시간으로 도달하였다. 이 실험은 또한 세포주가 GSKO 대조군이 사멸하였을 때 진정한 기본영양성임을 입증하였다

실시예 7: 티로신이 부재하지만 추가의 페닐알라닌이 보충된 상업용 CD-CHO 배지에서 성장시킨 경우 예시적인 생산 세포의 성장 프로파일 및 생존가능한 세포 농도

이 실시예는 세포 성장 및 배양 생존력을 평가한다. 도 6은 티로신이 결여되어 있지만 6 mM 글루타민이 보충된 상업용 CD-CHO(ThermoFisher Scientific) 배지에서 형질감염 및 성장시킨 예시적인 생산 세포의 성장 데이터를 나타낸다. 형질감염된 CHOK1SV GS-KO™ 숙주 세포는 CM76 배지와 비교하여 CD CHO 배지에서 형질감염 후 더 빠르게 회수되었다. 회수율은 세포를 형질감염 후 진탕 플라스크로 옮길 준비가 된 경우 21 일에서 18 일로 감소되었다. 추가적으로, 절두된 인간 PAH를 함유하는 플라스미드 DNA 작제물로 형질감염된 세포는 형질감염 후 절두된 CHO PAH 세포를 함유하는 벡터를 사용한 경우 관찰된 것과 유사한 시간에 유사한 생존가능한 세포 수로 회수되었다. 이는 CD CHO가 이 시스템에 더 나은 형질감염 배지임을 나타내었다.

CD CHO 배지에서 성장에 대해 평가된 세포를 2 일마다 샘플링하였고 추가 공급물은 도입하지 않았다. 배양물을 세포 성장 및 배양 생존력에 대해 분석하였다. 티로신 기본영양 세포 풀을 CD CHO 배지에서 성장시킨 경우(도 6) 절두된 인간 PAH 세포 풀은 추가의 6 mM 페닐알라닌으로부터 가장 이익을 얻었다.

실시예 8: 페닐알라닌 보충에 대한 세포의 사전 적응은 성장 적응기를 감소시킨다.

이 실시예는 예시적인 생산 세포 풀을 회분식 배양을 수행하기 전에 추가로 보충된 페닐알라닌에 사전 적응시킴으로써 성장이 개선됨을 나타낸다(도 7). 인간 절두된 PAH 발현 세포는 CHO 버전보다 페닐알라닌 보충에 더 잘 반응한다. 세포를 성장 곡선을 시작하기 전에 6 mM 페닐알라닌과 계대함으로써 인간 절두된 PAH 발현 세포(LMM173)를 사전 적응시켰다. 세포를 16 일 동안 125 ml 에를렌마이어 플라스크에서 배양하였다. 이들 세포를 생존가능한 세포 농도 및 배양 생존력에 의해 측정된 바와 같이 세포 성장에 대해 분석하였다. 세포 성장은 페닐알라닌의 첨가에 의해 향상되었지만 성장 적응기는 세포가 티로신이 없지만 6 mM L-글루타민 및 6 mM 페닐알라닌(Sigma P5482)이 보충된 CD CHO에서 성장하도록 사전 적응된 경우 추가로 감소하였다. GS-KO 숙주 세포는 6 mM 페닐알라닌이 보충되거나 또는 보충되지 않은 CD CHO 배지에서 성장할 수 없었다.

실시예 9: 이중 대사 선택 마커와 재조합 단백질 생산.

이 실시예는 절두된 PAH/GCH1 조합 선택이 글루타민 합성효소 선택 하에 재조합 단백질을 생산하는 세포주와 조합된 경우 어떻게 이용가능한지를 평가한다. 프로모터 강도는 GCH1 발현을 구동시켜 이것이 성장 프로파일 관점에서 생겨난 후속 세포에 영향을 미쳤는지 여부를 결정하기 위해 달라졌다. 프로모터 및 절두된 PAH와 GCH1의 조합인 상이한 플라스미드는 최대 성장(가장 높은 생존가능한 세포 농도)을 달성하기 위한 최상의 조합이었다. 이들 풀을 생성하는 데 사용된 벡터는 CHO 또는 인간 PAH(카세트 1, SV40 프로모터), GCH1(카세트 3 PGK, SV40 또는 mCMV 프로모터에 의해 구동됨) 및 eGFP (카세트 2, CMV 프로모터에 의해 구동됨)의 절두된 버전을 함유하였다 - 표 1 참조.

이들을 선형화하고 GS 선택 하에 모델 단클론 항체 cB72.3을 발현하는 세포주 내로 형질감염시켰다. 형질감염을 T25 고정 플라스크 내로 글루타민 및 티로신이 없는 CD-CHO에서 수행하였다. 세포가 형질감염 및 선택 후 회수 및 성장시키면, 이들을 글루타민 및 티로신이 없는 CM76의 진탕 플라스크로 옮겼다.

도 8은 생성된 세포 풀에서 절두된 CHO PAH의 발현 및 절두된 인간 PAH mRNA 발현의 qRT-PCR 데이터를 나타내며, 실시예 4의 결과와 필적할만 하였다. GCH1 발현을 또한 검출하였고 수준은 카세트를 구동하고 있었던 프로모터의 강도를 반영하였다. 분석은 절두된 PAH 세포 풀에서 PAH의 mRNA 과발현을 확인한다. 이전에 관찰된 바와 같이 절두된 CHO PAH는 인간 PAH보다 훨씬 더 높은 수준에서 발현되었다. GCH1 mRNA 발현 수준은 유전자를 구동하는 프로모터 강도와 상관관계가 있었다.

상기 기재된 세포풀로부터의 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 모든 이중 선택 세포 풀을 글루타민 및 티로신이 없는 CM76에서 성장시켰다. CHOK1SV GS-KO™ 대조군 샘플을 완전 배지(글루타민 및 티로신 함유)에서 성장시킨 세포로부터 수확하였다. 실시예 4에 따라 항체가 CHO PAH를 검출하지 않으므로(데이터는 제시되지 않음) 이를 제외하고, 절두된 PAH, GCH1 및 GS는 모두 세포주를 발현하는 이중 선택 마커에서 검출하였다. 또한 중쇄 항체를 사용하여 재조합 단백질(cB72.3)이 상청액 내로 분비되어 있었음(데이터는 제시되지 않음)을 확인하였다. 튜불린, β-액틴 및 L7a는 로딩 대조군으로서 역할을 하였다.

도 9는 예시적인 생산 세포 풀의 성장 데이터를 나타낸다. 세포 풀을 티로신 및 글루타민의 부재 하에 18 일 동안 125 ml 에를렌마이어 플라스크에서 배양하였고 표시된 바와 같이 추가의 페닐알라닌으로 보충하였다. 2 일마다, 세포를 샘플링하고 생존가능한 세포 수 및 배양 생존력을 ViCell 기기를 사용하여 평가하였으며; 추가 공급물을 도입하지 않았다. 추가의 6 mM 페닐알라닌 보충된 배지에 사전 적응시킨 경우 LMM186(SV40 인간 PAH, SV40 GCH1)으로 최대 성장(가장 높은 생존가능한 세포 농도 달성)이 관찰되었다.

2 개의 선택 마커가 동시에 사용되고 있었으므로 세포를 티로신 또는 글루타민이 없는 CM76에서 배양하였다. 6mM 페닐알라닌이 보충된 경우 LMM186(SV40 PAH 인간 및 SV40 GCH1)으로부터 가장 잘 성장하는 세포 풀을 생성하였다.

이들 결과는 2 가지 상이한 아미노산-기반 선택 시스템이 세포주 성능에 어떠한 부정적인 영향을 미치지 않고 조합될 수 있음을 입증하며: 생성된 세포는 뛰어난 성장 특성을 입증한다. 이는 예를 들어, 하나의 선택 시스템이 세포주 성능을 변형시키는 유전자 생성물로 조작된 안정한 세포주를 만들고 유지하는 데 사용될 수 있는 반면, 다른 선택 시스템이 제조하기에 바람직한 생성물을 암호화하는 서열(들)을 도입하고 유지하는 데 사용될 수 있으므로 발현을 위한 더 큰 유연성을 제공할 것이다.

결과는 또한 페닐알라닌 보충과 함께 인간 PAH를 사용하여 우수한 성능을 달성한다는 실시예 7의 발견을 뒷받침한다.

본원에 인용된 각각 및 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 발명은 특정 측면을 참조하여 개시되었지만, 본 발명의 다른 측면 및 변경이 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 당업자에 의해 고려될 수 있음이 명백하다. 상이한 섹션의 특징 및 구현예는 필요한 부분만 약간 수정하여 조합될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Lonza Ltd <120> METHODS OF CELL SELECTION <130> LZA23077EP <140> EP19209232.8 <141> 2019-11-14 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 906 <212> DNA <213> H. sapiens <400> 1 acgcgtatgg agaagggccc tgtgcgggca ccggcggaga agccgcgggg cgccaggtgc 60 agcaatgggt tccccgagcg ggatccgccg cggcccgggc ccagcaggcc ggcggagaag 120 cccccgcggc ccgaggccaa gagcgcgcag cccgcggacg gctggaaggg cgagcggccc 180 cgcagcgagg aggataacga gctgaacctc cctaacctgg cagccgccta ctcgtccatc 240 ctgagctcgc tgggcgagaa cccccagcgg caagggctgc tcaagacgcc ctggagggcg 300 gcctcggcca tgcagttctt caccaagggc taccaggaga ccatctcaga tgtcctaaac 360 gatgctatat ttgatgaaga tcatgatgag atggtgattg tgaaggacat agacatgttt 420 tccatgtgtg agcatcactt ggttccattt gttggaaagg tccatattgg ttatcttcct 480 aacaagcaag tccttggcct cagcaaactt gcgaggattg tagaaatcta tagtagaaga 540 ctacaagttc aggagcgcct tacaaaacaa attgctgtag caatcacgga agccttgcgg 600 cctgctggag tcggggtagt ggttgaagca acacacatgt gtatggtaat gcgaggtgta 660 cagaaaatga acagcaaaac 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Claims (16)

1. 관심 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 진핵생물 세포를 선택하는 방법으로서,
   i) 티로신의 부재 하에 생존 또는 성장할 수 없는 세포 집단을 다음을 포함하는 벡터 시스템과 접촉시키는 단계:
   a) 숙주 세포에서 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)의 발현을 가능하게 하는 제1 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 기능적 N-말단 조절 도메인이 결여된 PAH를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 핵산 서열;
   (b) 숙주 세포에서 GTP 사이클로하이드롤라제 1(GCH1)의 발현을 가능하게 하는 제2 제어 서열에 작동가능하게 연결된 GCH1을 암호화하는 서열을 포함하는 제2 핵산 서열; 및
   (c) 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제3 제어 서열에 작동가능하게 연결된 관심 생성물을 암호화하는 서열을 포함하되, 세포에 의해 벡터 시스템을 취하는 조건 하에, (a) 및/또는 (b)와 동일한 벡터에 존재하는 것인 제3 핵산 서열;
   ii) 티로신 수준이 벡터 시스템에 의해 암호화된 PAH 및 GCH1 효소를 발현하지 않는 세포의 생존 또는 성장에 필요한 수준보다 더 낮은 조건 하에 세포를 배양하는 단계; 및
   iii) 이러한 조건 하에 성장할 수 있는 하나 이상의 세포를 선택하여 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 하나 이상의 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 (a), (b) 및 (c)가 동일한 벡터에 존재하는 것인, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2 개의 벡터를 포함하되, 상기 (c)가 (a) 또는 (b)와 동일한 벡터에 존재하는 것인, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진핵생물 세포가 포유류 세포, 예를 들어 CHO 세포인, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PAH가 N-말단 조절 도메인의 결실을 갖는 것인, 숙주 세포.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지에 티로신이 결여되어 있고 임의적으로 페닐알라닌이 보충되어 있는 것인, 방법.
7. 진핵생물 숙주 세포로서,
   a) 숙주 세포에서 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)의 발현은 가능하게 하는 제1 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 기능적 N-말단 조절 도메인이 결여된 PAH를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 외인성 핵산; 및
   b) 숙주 세포에서 GTP 사이클로하이드롤라제 1(GCH1)의 발현을 가능하게 하는 제2 제어 서열에 작동가능하게 연결된, GCH1을 암호화하는 제2 외인성 핵산; 및
   c) 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제3 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 관심 생성물을 암호화하되, 제1 및/또는 제2 외인성 핵산과 동일한 외인성 핵산 서열에 존재하는 것인 제3 외인성 핵산을 포함하는, 숙주 세포.
8. 제7항에 있어서, 상기 PAH가 N-말단 조절 도메인의 결실을 갖는 것인, 숙주 세포.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 PAH가 CHO 또는 인간 PAH인, 숙주 세포.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 세포, 예를 들어 CHO 세포인, 숙주 세포.
11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 핵산 분자가 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 것인, 숙주 세포.
12. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PAH 및/또는 GCH1을 암호화하는 세포의 내인성 유전자의 활성이 감소되거나 또는 폐지된 것인, 숙주 세포.
13. 다음을 포함하는 하나 이상의 핵산 벡터를 포함하는 벡터 시스템:
    a) 숙주 세포에서 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)의 발현을 가능하게 하는 제1 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 기능적 N-말단 조절 도메인이 결여된 PAH를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 핵산 서열;
    b) 숙주 세포에서 GTP 사이클로하이드롤라제 1(GCH1)의 발현을 가능하게 하는 제2 제어 서열에 작동가능하게 연결된 GCH1을 암호화하는 서열을 포함하는 제2 핵산 서열; 및
    c) 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제3 제어 서열에 작동가능하게 연결된 관심 생성물을 암호화하는 서열을 삽입하기 위한 다중 클로닝 부위이되, 상기 다중 클로닝 부위 및 제3 제어 서열은 (a) 및/또는 (b)와 동일한 벡터에 존재하는 것.
14. 다음을 포함하는 하나 이상의 핵산 벡터를 포함하는 벡터 시스템:
    a) 숙주 세포에서 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)의 발현을 가능하게 하는 제1 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 기능적 N-말단 조절 도메인이 결여된 PAH를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 핵산 서열;
    b) 숙주 세포에서 GTP 사이클로하이드롤라제　1(GCH1)의 발현을 가능하게 하는 제2 제어 서열에 작동가능하게 연결된 GCH1을 암호화하는 서열을 포함하는 제2 핵산 서열; 및
    c) 숙주 세포에서 생성물의 발현을 가능하게 하는 제3 제어 서열에 작동가능하게 연결된 관심 생성물을 암호화하는 서열을 포함하되, (a) 및/또는 (b)와 동일한 벡터에 존재하는 것인 제3 핵산 서열.
15. 생성물을 제조하는 방법으로서, 생성물을 발현하기에 적합한 조건 하에 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 생성물을 회수하고, 임의적으로 회수된 생성물을 하나 이상의 처리 또는 정제 단계에 적용하는 것을 포함하는, 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 티로신 수준이 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 벡터 시스템에 의해 암호화된 PAH 및 GCH1 효소를 발현하지 않는 세포의 생존 또는 성장에 필요한 수준보다 더 낮은 조건 하에 세포를 배양하는 것인, 방법.

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