JP2023502916A - 細胞の選択方法 - Google Patents

Abstract

生産細胞、および機能的Ｎ末端調節ドメインを欠くフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードする配列と、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）をコードする配列との組み合わせに基づいて、チロシン栄養要求性選択マーカー系を含む生産細胞を特定、選択、または培養するための方法が本明細書に記載される。生産細胞を作製し、当該生産細胞で産物を作製する方法も記載される。

Description

本開示は、主題の核酸配列を含む細胞を特定、選択、または培養するための方法および組成物に関する。

細胞発現系は、治療用生物製剤などの組換え生物学的産物の産生に一般的に使用される。生産ライン細胞の開発は、目的の組換え産物をコードする核酸構築物を宿主細胞に導入し、これらの核酸構築物を含有する細胞を選択することを伴う。これは、概して、外来核酸を取り込んだ細胞が優先されるように、細胞を選択圧にさらすことを伴う。初期の選択可能なマーカー系は、抗生物質耐性マーカーを使用したが、そのような系の使用から離れる傾向にあった。いくつかの代替の系は、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびグルタミン合成酵素（ＧＳ）の代謝欠損の補完に基づいている。しかしながら、組換え生物学的産物を産生するために使用される細胞を選択するために使用することができる新しい選択系の必要性が依然として存在する。さらに、生産宿主細胞工学戦略がますます使用されているため、宿主細胞の特徴を修飾する新しい配列の導入を伴うそれらの戦略は、生物学的産物をコードする配列の導入に使用される既存のまたは今後の選択系とは別の選択系から利益を得るであろう。

本発明は、チロシン栄養要求性に基づく選択系、および培地中にチロシンを含む必要がない組換え産物の製造に関する。フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ－フェニルアラニンのチロシンへの変換を触媒する）のみに基づく系は効果的ではなく、チロシン生合成に関連する第２の酵素、すなわち、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）を含むことが必要であることが分かった。さらに、Ｎ末端調節ドメインを除去する切断とともにＰＡＨを使用することは、完全長酵素と比較して顕著な利点を提供することが分かった。完全長ＣＨＯ ＰＡＨを使用すると、トランスフェクション後にチロシン不含培地で回復しなかったか、または回復時間がはるかに遅かったかのいずれかであったが、分子の切断（ｔＰＡＨ）型は、良好な回復を可能にした。ＰＡＨおよびＧＣＨ１の組み合わせにより、細胞は、これらの酵素を発現しない類似の細胞よりも低いレベルのチロシン（例えば、チロシンの不在下）で増殖することができる。

したがって、第１の態様では、本発明は、１つ以上の核酸ベクターを含むベクター系を提供し、核酸ベクター系は、
ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、機能的Ｎ末端調節ドメインを欠くＰＡＨをコードする配列を含む、第１の核酸配列と、
ｂ）宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、ＧＣＨ１をコードする配列を含む、第２の核酸配列と、
ｃ）宿主細胞における目的の産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、産物をコードする１つ以上の配列を挿入するための複数のクローニング部位と、を含む。

関連する態様では、本発明はまた、１つ以上の核酸ベクターを含むベクター系を提供し、核酸ベクター系は、
ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、機能的Ｎ末端調節ドメインを欠くＰＡＨをコードする配列を含む、第１の核酸配列と、
ｂ）宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、ＧＣＨ１をコードする配列を含む、第２の核酸配列と、
ｃ）宿主細胞における目的の産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、産物をコードする配列を含む、第３の核酸配列と、を含む。

そのようなベクターは、宿主細胞に導入されてもよく、それらの細胞は、非形質転換細胞の効率的な増殖を可能にしないチロシン制限条件下で選択されたベクターを含有する。したがって、第２の態様では、本発明は、宿主細胞を提供し、宿主細胞は、
ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、ＰＡＨをコードする配列を含む、第１の外因性核酸と、
ｂ）宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、ＧＣＨ１をコードする、第２の外因性核酸と、
ｃ）宿主細胞における目的の産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、産物をコードする第３の外因性核酸と、を含む。

一実施形態では、第１、第２、および第３の核酸分子は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。

一実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

本発明の様々な態様では、ＰＡＨにおける機能的Ｎ末端調節ドメインの欠如は、例えば、切断ＰＡＨを形成するための欠失に起因し得る。ヒトおよびＣＨＯ ＰＡＨアミノ酸配列に基づいて、これは典型的には、最初の約１１６個のアミノ酸の欠失である。

一実施形態では、ＰＡＨは、ＣＨＯ ＰＡＨまたはヒトＰＡＨである。

一実施形態では、第１および／または第２の制御配列は、ＳＶ４０プロモーターを含む。

本発明のベクター系は、典型的には、組換えポリペプチドなどの目的の産物をコードする核酸で良好に形質転換された細胞を選択するために使用される。したがって、第３の態様では、本発明は、産物をコードする核酸配列を含む細胞を選択する方法を提供し、本方法は、
ａ）チロシンの不在下で生存または増殖することができない細胞の集団を、細胞によるベクター系の取り込みを可能にする条件下で、本発明のベクター系と接触させることと、
ｂ）チロシンのレベルがベクター系によってコードされるＰＡＨおよびＧＣＨ１酵素を発現しない細胞の生存または増殖に必要なレベルよりも低い条件下で、細胞を培養することと、
ｃ）そのような条件下で増殖することができる１つ以上の細胞を選択して、産物をコードする核酸配列を含有する１つ以上の細胞を得ることと、を含む。

チロシンのレベルは、厳密な選択を確実にするように選択され、任意選択で、フェニルアラニンで補充される。一実施形態では、培養培地は、添加されたチロシンを含まない。

関連する態様では、本発明は、細胞の集団から、細胞に導入された核酸配列を含む１つ以上の細胞を選択するための、本発明のベクター系の使用を提供する。

本発明の選択方法によって得られた選択された宿主細胞は、本発明の別の態様を形成する。したがって、第４の態様では、本発明は、宿主細胞を提供し、宿主細胞は、
ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、機能的Ｎ末端調節ドメインを欠くＰＡＨをコードする配列を含む、第１の外因性核酸と、
ｂ）宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、ＧＣＨ１をコードする、第２の外因性核酸と、
ｃ）宿主細胞における目的の産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、産物をコードする第３の外因性核酸と、を含む。

本発明の宿主細胞は、任意の内因性ＰＡＨおよび／またはＧＣＨ１活性を阻害または消失するように遺伝子修飾され得る。一実施形態では、これは、内因性ＰＡＨおよび／またはＧＣＨ１の発現をコードおよび／または調節するゲノム配列における変異（挿入、欠失、および／または置換）によって達成することができる。

目的の産物をコードする核酸配列を含む本発明の選択された宿主細胞は、典型的には、その産物を製造する際に使用される。したがって、第５の態様では、本発明は、産物を作製する方法を提供し、本方法は、産物を発現するのに好適な条件下で、産物をコードする核酸配列を含む本発明の宿主細胞を培養することと、産物を回収することと、任意選択で、回収された産物を１つ以上の処理または精製ステップに供することと、を含む。

本発明の宿主細胞および選択プロセスを使用して開発された細胞株を大規模な製造に使用する場合、培養ステップ中にチロシンを省略することにより選択圧をかけることはもはや必須でなくてもよい。しかしながら、必須アミノ酸とみなされるチロシンは、アミノ酸のうちのいずれかの水への溶解度がシステインに次いで２番目に低い。チロシンの低溶解度は、バイオ製造条件下、例えば、供給バッチバイオプロセス中、例えば、バイオリアクター中で、細胞の培養を支持するのに十分な濃度の供給溶液の生成にとって課題であり得る。

本発明の宿主細胞は、低レベルのチロシン（チロシンの不在下を含む）で効率的に増殖させることができ、高濃度チロシン供給液の必要性を低減させることができる。フェニルアラニンは細胞によって消費されてチロシンを産生するため、一実施形態では、培地はフェニルアラニンで補充される。

本発明はまた、少なくとも３個または４個のアミノ酸などの複数のアミノ酸を含む、供給物などの培養培地を提供し、水溶液中に、５０、２０、または１０μＭ未満のチロシン（例えば、チロシンなし）などの０．０１ｇ／Ｌ未満のチロシン、および少なくとも２、好ましくは少なくとも３、４、５、６、７、８、９ｍＭのフェニルアラニンが存在する。典型的には、培養培地は、１０ｍＭ未満のフェニルアラニンを含む。本発明はまた、少なくとも３個または４個のアミノ酸などの複数のアミノ酸を含む、実質的に乾燥形態（例えば、５、４、３、２、または１％未満の水を含み、例えば、顕著には水を含まない）の培養培地混合物を提供し、適切な容積の水を添加することによって上記培養培地が調製されるような、チロシンおよびフェニルアラニンのレベルを有する。

本発明は、例えば、ベクター系によってコードされる目的の産物の発現において、本発明のベクター系で形質転換された細胞を選択および／または増殖させるための培養培地および培養培地混合物の使用をさらに提供する。

本発明はまた、本発明の宿主細胞を含む混合物および本発明の培養培地も提供する。

別の態様では、本発明は、本発明の宿主細胞の集団を含むバイオリアクターを特徴とする。別の態様では、本発明は、培地および本発明の生産細胞の集団を含むバイオリアクターを特徴とする。

ＰＡＨ酵素のドメイン構造の概略を示す。 （Ａ）フローサイトメトリーを使用して得られた、同じＣＨＯ細胞プールのトランスフェクションおよび３週間の回復後の細胞集団からの平均蛍光のヒストグラム、ならびに（Ｂ）蛍光データの表を示す。 図２－１の続き。 ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定された、対照に対するＰＡＨ ｍＲＮＡ量のグラフを示す。 （Ａ）１８日間にわたる、任意選択でフェニルアラニンで補充された、チロシンまたはグルタミンの不在下での、一部が切断ＰＡＨを過剰発現する、様々な細胞プールの生細胞濃度による細胞増殖のグラフ、および（Ｂ）同じ条件下での同じ細胞プールの培養生存率のグラフを示す。 様々なフェニルアラニン補充を伴うチロシン原栄養性細胞プールの増殖特徴を示す。 ６ｍＭのフェニルアラニンを有するＣＤ ＣＨＯチロシンなしでのチロシン原栄養性細胞プールの増殖特徴のグラフを示す。（Ａ）チロシンを含まず、任意選択でフェニルアラニンで補充された、様々な細胞プールの生細胞濃度、および（Ｂ）同じプールの培養生存率のグラフを示す。 細胞増殖評価前にフェニルアラニン補充が生じた、事前適応されたチロシン原栄養性細胞プールの増殖特徴のグラフを示す。（Ａ）細胞プールの生細胞濃度、および（Ｂ）同じ条件下での同じ細胞プールの培養生存率のグラフを示す。 対照細胞に対する様々な細胞プールにおけるＰＡＨ ｍＲＮＡ量のグラフ（上）、および対照細胞に対する様々な細胞プールにおけるＧＣＨ１ ｍＲＮＡ量のグラフ（下）を示す。 共発現チロシンおよびグルタミン栄養要求性細胞プールの増殖特徴のグラフを示す。（Ａ）生細胞濃度、（Ｂ）生存率、および（Ｃ）細胞径。 図９－１の続き。

定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示であり、限定することを意図するものではない。見出し、副題、または番号付けされたもしくは文字を記した要素、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などは、単に読みやすさのために提示される。この文書では、見出しまたは番号付けされたもしくは文字を記した要素を使用することにより、ステップもしくは要素がアルファベット順に行われるか、またはステップもしくは要素が必ず互いに別個である必要がない。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、および特許請求の範囲から明らかであろう。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。

「約」または「およそ」は、本明細書でその用語が使用される場合、１つ以上の目的の値に適用され、記載される参照値に類似する値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、またはさもなければ文脈から明らかでない限り、記載される参照値のいずれかの方向（それより大きいまたはそれより小さい）の５％、４％、３％、２％、１％未満に入る値（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）の範囲を指す。

本明細書で使用される場合、「制御要素」という用語は、コード配列、例えば、産物または酵素分子をコードする遺伝子または配列の発現を調節する（例えば、増加または減少させる）のに好適な核酸を指す。制御要素は、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはプロモーター配列およびエンハンサー配列の両方を含み得る。制御要素は、連続核酸配列、不連続核酸配列（他のコードまたは非コード核酸配列によって中断される配列）、またはその両方を含み得る。単一の制御要素は、単一の核酸または１つを超える核酸上に含まれ得る。実施形態では、制御要素は、コード配列、例えば、組換え、治療用、またはリプレッサーポリペプチドのコード配列の配列５’または３’を含み得る。実施形態では、制御要素は、遺伝子、例えば、組換え、治療用、またはリプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の１つ以上のイントロン内の配列を含み得る。実施形態では、制御要素は、一部またはその全体が、コード配列、例えば、組換え、治療用、またはリプレッサーポリペプチドのコード配列の配列５’または３’内に含まれ得る。実施形態では、制御要素は、一部またはその全体が、コード配列、例えば、組換え、治療用、またはリプレッサーポリペプチドのコード配列内に含まれ得る。実施形態では、制御要素は、一部またはその全体が、遺伝子、例えば、組換え、治療用、またはリプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の１つ以上のイントロン内に含まれ得る。実施形態では、単一の制御要素は、ｉ）遺伝子、例えば、組換え、治療用、もしくはリプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子に近位（例えば、それに隣接するか、またはその中に含まれる）、またはｉｉ）遺伝子、例えば、組換え、治療用、もしくはリプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子に遠位（例えば、１０以上、１００以上、１０００以上、もしくは１０，０００以上の塩基によって分離されるか、または異なる別個の核酸上に配置される）の核酸配列を含み得る。

量、時間的持続時間などの測定可能な値を指すときの「約」という用語は、開示された方法を行うためにそのような変動が適切である場合、指定された値から±５％、またはいくつかの場合では±１％、またはいくつかの場合では±０．１％の変動を包含することを意味する。

本明細書で使用される「バイオリアクター」という用語は、生物学的反応またはプロセスが行われる装置を指す。プロセスは、微小およびナノ規模を含む、工業、パイロット、および実験室規模で行われ得る。

本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、生物、細胞、組織、または系に由来するか、またはその内に天然に産生される任意の材料を指す。

本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織、または系の外に導入されるか、または産生される任意の材料を指す。したがって、「外因性核酸」とは、生物、細胞、組織、または系の外に導入されるか、または産生される核酸を指す。いくつかの実施形態では、外因性核酸の配列は、外因性核酸が導入される生物、細胞、組織、または系内で天然に産生されないか、または天然に見出すことができない。いくつかの実施形態では、外因性核酸の配列は、非自然発生の配列であるか、または非自然発生の産物をコードする。いくつかの実施形態では、外因性核酸の配列は、外因性核酸が導入される生物、細胞、組織、または系にも見出すことができる。例えば、外因性核酸は、構成的に活性なプロモーターの制御下で酵素をコードしてもよく、外因性核酸が導入される細胞は、当該酵素をコードする（例えば、内因性プロモーターの制御下で）内因性核酸配列を含有する。

本明細書で使用される場合、「酵素分子」という用語は、目的の酵素活性を有するポリペプチドを指す。酵素分子は、目的の酵素活性を有する自然発生の酵素と構造的類似性（例えば、配列相同性）を共有し得る。いくつかの場合では、酵素分子は、目的の酵素活性を有する自然発生の酵素に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する。いくつかの実施形態では、酵素分子は、自然発生の酵素のバリアント（例えば、自然発生の酵素のアミノ酸配列に対して１つ以上のアミノ酸配列改変（例えば、置換、欠失、または挿入）を含むバリアント）である。いくつかの場合では、「分子」という用語は、酵素（例えば、ＰＡＨまたはＧＣＨ１）の識別子とともに使用される場合、特定された酵素の酵素活性を有するポリペプチドを指す。例として、「ＰＡＨ分子」または「ＰＡＨ酵素分子」という用語は、本明細書で使用される場合、ＰＡＨの酵素活性を有するポリペプチドを指す。さらなる例として、「ＧＣＨ１分子」または「ＧＣＨ１酵素分子」という用語は、本明細書で使用される場合、ＧＣＨ１の酵素活性を有するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、酵素分子は、単一のポリペプチド鎖であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、酵素分子は、多ポリペプチド複合体、例えば、オリゴマー（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、八量体、十量体、または十二量体）であるか、またはそれらを含む。

本明細書で使用される場合、「酵素的に活性な断片」という用語は、酵素または酵素分子の目的の酵素活性を有する酵素または酵素分子の部分を指す。いくつかの実施形態では、酵素的に活性な断片は、酵素または酵素分子に対して欠失（例えば、切断）を含む酵素または酵素分子のバリアントである。いくつかの実施形態では、酵素的に活性な断片の目的の酵素活性は、酵素的に活性な断片が由来する酵素または酵素分子に対して、５０、４０、３０、２０、または１０％以下低減される。

本明細書で使用される場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸分子」という用語は、交換可能に使用され、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態で、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、またはそれらのＤＮＡもしくはＲＮＡ、およびそれらのポリマーの組み合わせを指す。「核酸」という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ配列（例えば、ｍＲＮＡ）を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、核酸分子は、合成（例えば、化学的に合成されるか、または人工）または組換えである。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ自然発生または非自然発生のヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然ヌクレオチドの類似体または誘導体を含有する分子を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、保守的に修飾されたそのバリアント（例えば、縮退コドン置換）、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ、および相補配列、ならびに明示的に示される配列を暗黙的に包含する。具体的には、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって、縮退コドン置換が達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。本明細書で使用される場合、「主題の核酸」とは、本明細書に記載される細胞内に望ましくは導入されるか、または存在し得る、例えば、本明細書に記載される産物をコードする配列、または本明細書に記載される生産因子（例えば、ＳＣＤ１および／もしくはＳＲＥＢＦ－１などの脂質代謝修飾因子（ＬＭＭ））をコードする配列を含む、目的の任意の核酸を意味する。

本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、交換可能に使用され、ペプチド結合によって、またはペプチド結合以外の手段によって共有結合されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に制限はない。一実施形態では、タンパク質は、１つを超える、例えば、２、３、４、５以上のポリペプチドで構成され得、各ポリペプチドは、共有結合または非共有結合／相互作用のいずれかによって互いに関連付けられる。ポリペプチドには、ペプチド結合によって、またはペプチド結合以外の手段によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で使用される場合、本用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも称される短鎖と、多くの種類が存在する、当技術分野で一般にタンパク質と称される長鎖との両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。

本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、物品の文法的目的語の２つ以上（例えば、２つまたはそれ以上）を指す。例として、「複数の細胞」は、２つの細胞または２つを超える細胞を意味し得る。

「産物」は、その用語が本明細書で使用される場合、例えば、細胞、例えば、産物、例えば、生産細胞を産生するように修飾または操作された細胞によって産生される、例えば、発現される、実体、例えば、化合物（例えば、ポリペプチド（例えば、糖タンパク質）、核酸、脂質、糖、多糖、またはそれらの任意のハイブリッド）、小胞、エクソソーム、またはウイルスを指す。いくつかの実施形態では、産物は、タンパク質またはポリペプチド産物である。いくつかの実施形態では、産物は、自然発生の産物を含む。いくつかの実施形態では、産物は、非自然発生の産物を含む。いくつかの実施形態では、産物の一部は自然発生であるが、産物の別の部分は非自然発生である。いくつかの実施形態では、産物は、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドである。いくつかの実施形態では、産物は、診断または前臨床の使用に好適である。いくつかの実施形態では、産物は、治療用途、例えば、疾患の治療に好適である。いくつかの実施形態では、産物は、本明細書、例えば、「ポリペプチド」と題される下記のセクションに記載される組換えまたは治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、ウイルスは、自然発生のウイルス、組換えウイルス、組換えウイルス粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ウイルスベクター、不活性化（例えば、死んでいる、または感染できない）ウイルス、複数のウイルスタンパク質、ウイルスカプシド、またはそれらの任意の断片、構成要素のサブセット、もしくはバリアントを含む。

本明細書で使用される場合、「生産細胞」は、産物、例えば、組換えポリペプチドを産生することができる細胞を指す。いくつかの実施形態では、生産細胞は、例えば、生産細胞における産物の発現を調節する制御要素に作動可能に連結された、産物（例えば、組換えポリペプチド）をコードする外因性核酸を含む。適切な条件、例えば、本明細書に開示される条件、例えば、バイオリアクターおよび適切な培地で培養した場合、生産細胞は、産物を産生し、例えば、分泌する。

本明細書で使用される場合、「生産因子」は、組換え産物の発現に関して生産細胞の特性に影響を与えるポリペプチドまたは核酸を指す。例えば、生産因子は、量（例えば、細胞または産物の力価当たりの特定の生産性）または産物の品質（例えば、正しい折り畳みおよび組み立て、溶解度など）を改善し得る。生産因子は、例えば、脂質代謝（例えば、ＳＣＤ１および／またはＳＲＥＢＦ－１などの脂質代謝修飾因子）、タンパク質合成、タンパク質折り畳み、翻訳後修飾、タンパク質輸送、および／またはタンパク質分泌に関与するタンパク質であってもよい。内因性タンパク質の発現または活性を阻害するポリペプチドまたは核酸であってもよい。例えば、生産因子は、細胞の生産能力を改善するために、高度に発現および分泌される非必須内因性タンパク質の発現を阻害し得る。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、コード配列をプロモーターに作動可能に連結することによりコード配列の発現がもたらされるように、例えば、自然発生のまたは操作されたプロモーターからの十分な配列を有する配列を指す。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターは、ＣＭＶプロモーターのすべてまたは活性断片、例えば、任意選択で、イントロンＡおよび／またはＵＴＲ配列を含むＣＭＶプロモーターのすべてまたは活性断片を含む。実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、自然発生のまたは操作されたバリアントＣＭＶプロモーターと５、１０、２０、３０、５０、または１００ヌクレオチド以下で異なる。実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、自然発生のまたは操作されたバリアントＣＭＶプロモーターとそのヌクレオチドの１、５、１０、または５０％以下で異なる。本明細書で使用される場合、プロモーターは、プロモーターが含むプロモーター配列の構成的、調節された、抑制可能な、誘導可能な、強い、弱い、または他の特性であり得る。実施形態では、プロモーターは、コード配列、例えば、組換え、治療用、またはリプレッサーポリペプチドのコード配列の配列５’または３’を含み得る。実施形態では、プロモーターは、遺伝子、例えば、組換え、治療用、またはリプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の１つ以上のイントロン内の配列を含み得る。実施形態では、プロモーターは、一部またはその全体が、コード配列、例えば、組換え、治療用、またはリプレッサーポリペプチドのコード配列の配列５’または３’内に含まれ得る。実施形態では、プロモーターは、一部またはその全体が、コード配列、例えば、組換え、治療用、またはリプレッサーポリペプチドのコード配列内に含まれ得る。実施形態では、プロモーターは、一部またはその全体が、遺伝子、例えば、組換え、治療用、またはリプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の１つ以上のイントロン内に含まれ得る。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、産物（例えば、ポリペプチド）または酵素分子をコードする核酸配列と制御要素との間の関係を指し、産物または酵素分子をコードする配列および制御要素は、それらが、産物または酵素分子をコードする配列の発現を調節するために制御要素に好適な方法で配置されている場合、作動可能に連結されている。したがって、異なる制御要素に関して、作動可能に連結されたものは、制御要素に対して産物または酵素分子をコードする配列の異なる配置を構成する。例えば、プロモーター要素および産物（例えば、ポリペプチド）をコードする配列が互いに近位に、かつ同じ核酸上に配置されている場合、産物（例えば、ポリペプチド）をコードする配列は、プロモーター要素を含む制御要素に作動可能に連結され得る。別の例では、エンハンサー配列および産物（例えば、ポリペプチド）をコードする配列が、同じ核酸上に、またはさらには異なる別個の核酸上に、好適な数の塩基を離れて配置されている場合、産物（例えば、ポリペプチド）をコードする配列は、遠位に作動するエンハンサー配列を含む制御要素に作動可能に連結され得る。

本明細書で使用される場合、選択マーカーは、１つ以上の核酸配列を含む細胞を選択するために使用され得る表現型を付与する１つ以上の核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸配列は、ポリペプチド（例えば、および当該ポリペプチドの発現のための好適な制御要素）をコードする配列を含む。例えば、選択マーカーは、抗生物質耐性表現型を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。そのような選択マーカーは、抗生物質選択マーカーと称され得る。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、低下したレベル（例えば、不在）の必須栄養素、例えば、選択マーカーなしで細胞が生存するのに不十分なレベルを含む条件で生存する（例えば、その間に増殖および分裂する）能力を伝達する１つ以上の核酸配列を含む。例えば、選択マーカーは、ＰＡＨ酵素分子をコードする第１の核酸と、ＧＣＨ１酵素分子をコードする第２の核酸と、を含み得、選択マーカーは、培養培地中で低下したレベル（例えば、不在）のチロシンを生存する能力を伝達する。そのような選択マーカーは、栄養要求性マーカーまたは栄養要求性選択マーカーと称され得る。栄養要求性マーカーまたは栄養要求性選択マーカーに化合物名、例えばアミノ酸名を付加することにより、選択マーカーが、低下したレベルまたは不在を生存する能力を伝達する栄養素を特定する。

ベクターおよびベクター系
本発明は、形質転換された宿主細胞が、細胞にとって必須アミノ酸であり、その不在が細胞死および／または増殖不良をもたらすであろう低レベルのチロシンおよびチロシンの不在下で、組換えポリペプチドなどの目的の産物を発現し、増殖することを可能にする構成要素をコードするベクターを使用する。

ベクターは、３つの構成要素を含む。典型的には機能的Ｎ末端調節ドメインを典型的に欠くフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）酵素分子をコードする第１の核酸配列、およびＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）酵素分子をコードする第２の核酸配列。これらの配列は、好適な宿主細胞における酵素の発現を可能にする制御配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、制御配列は、ＣＭＶプロモーターまたはＳＶ４０プロモーターを含み、例えば、ヒトＰＡＨ配列をコードする配列は、ＳＶ４０プロモーターを含む制御配列に作動可能に連結され得、かつ／またはＧＣＨ１をコードする配列は、ＳＶ４０プロモーターを含む制御配列に作動可能に連結され得る。

第３の配列は、目的の産物をコードする核酸配列をクローニングすることができる挿入部位、例えば、複数のクローニング部位を含む。この部位は、所望の配列が導入された場合、好適な宿主細胞において発現され得るように、配列を制御するように位置付けられ、作動可能に並べられている。一実施形態では、発現カセットとみなすことができる３つの配列は、同じベクター中に存在する。別の実施形態では、第１および第２の核酸配列は、別個のベクター上にあってもよいが、但し、第３の核酸配列が、目的の配列の選択が選択可能なマーカーの存在に連結されることを確実にするために、それらのうちの１つと同じベクター上にあることを条件とする。

ベクターは、目的の産物のための追加の発現カセットを含んでもよい、すなわち、ベクター系は、それぞれ、目的の産物をコードする核酸配列がクローニングされ得る挿入部位、例えば、複数のクローニング部位を含む、第４、および任意選択で、第５、および任意選択で、第６の核酸配列などを含んでもよい。第３の核酸配列に関して、これらの部位は、所望の配列が導入された場合、好適な宿主細胞において発現され得るように、配列を制御するように位置付けられ、作動可能に並べられている。例えば、二重特異性抗体は、少なくとも３つの異なる、通常は少なくとも４つの異なる鎖を有する。これらの発現カセットは、目的の配列の挿入のために準備されており、様々な方法で構成され得る。ＰＡＨおよびＧＣＨ１配列が異なるベクター上にある場合、各ベクターは、複数のクローニング部位を有する１つ以上の発現カセットを含有し得、例えば、それぞれが２つのそのような発現カセットを含有し得る。いくつかの実施形態では、それぞれが複数のクローニング部位を有する発現カセットは、選択マーカーのうちの１つのみを有する単一のベクター中に存在し得る。したがって、１つのベクターは、それぞれ、二重特異性抗体産生のための重鎖または軽鎖などの目的の配列の導入のための複数のクローニング部位を有する、３つまたは４つの発現カセットを有し得る。

一実施形態では、および同じステップで複数の配列を導入する能力を十分に利用するために、すべてのベクター系の構成要素を同時に宿主細胞に導入することができる。

別の実施形態では、好適な宿主細胞は、第１または第２の核酸配列のうちの１つを含むようにすでに操作されていてもよい。したがって、本発明は、選択系をさらに提供し、選択系は、
ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、機能的Ｎ末端調節ドメインを欠くＰＡＨをコードする配列を含む、第１の核酸と、
ｂ）宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、ＧＣＨ１をコードする、第２の核酸と、
ｃ）（ｉ）宿主細胞での産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された目的の産物をコードする配列を挿入するための複数のクローニング部位、または（ｉｉ）宿主細胞での産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された目的の産物をコードする第３の核酸と、
ｄ）宿主細胞と、を含み、
（ａ）および（ｃ）はベクター中に存在し、（ｂ）は宿主細胞に存在する（典型的には、宿主細胞ゲノムに組み込まれる）か、または（ｂ）および（ｃ）はベクター中に存在し、（ａ）は、宿主細胞に存在する（典型的には、宿主細胞ゲノムに組み込まれる）。

組換え産物およびＰＡＨ、ＧＣＨ１酵素をコードする核酸配列は、いくつかの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に関心のあるベクターとしては、発現ベクターおよび複製ベクターが挙げられる。実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）、ならびに他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスとしては、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点（したがって、ベクターは自己複製であり得る）、プロモーター要素および任意選択でエンハンサー要素を含む制御要素、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、ならびに１つ以上の選択可能なマーカー（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、および米国特許第６，３２６，１９３号）を含有する。ウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的な安定した組み込みおよび娘細胞におけるその伝播を可能にするため、長期的な遺伝子移入を達成するのに好適なツールである。

ベクターはまた、例えば、分泌を促進するシグナル配列、ポリアデニル化シグナル、および転写終結因子（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子由来）、エピソーム複製および原核生物（例えば、ＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１もしくは当該技術分野で既知の他のもの）における複製を可能にする要素、ならびに／または選択を可能にする要素、例えば、選択マーカーもしくはレポーター遺伝子を含んでもよい。

企図されるベクターは、ポリペプチド、例えば、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列を挿入するのに好適な挿入部位を含み得る。挿入部位は、制限エンドヌクレアーゼ部位を含み得る。

目的の産物をコードする配列（組換え産物と題される以下のセクションに記載される）は、当該技術分野で周知のクローニング技法を使用して、本明細書に記載のベクター系に導入することができる。次いで、得られるベクター系は、第１および第２の核酸配列に加えて、宿主細胞における産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、目的の産物をコードする配列を含む少なくとも第３の核酸配列を含み、この第３の配列は、第１の核酸配列および／または第２の核酸配列と同じベクター中に存在する（選択マーカーが第３の核酸配列を含む細胞について選択するように機能することを確実にする）。

上述のように、本発明のベクター系は、例えば、抗体（標準および二重特異性抗体）を含む複数のサブ単位を有するタンパク質に対して、目的の複数の配列を発現するために使用され得る。したがって、ベクターは、目的の産物の追加の発現カセットを含み得、目的の複数の配列は、複数のクローニング部位に導入されて、目的の複数の産物を発現することができる宿主細胞に導入される準備ができたベクターを産生することができる。したがって、目的の配列の導入後、宿主細胞における産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された目的の産物をコードする配列を含む第３の核酸配列に加えて、ベクター系は、それぞれ、宿主細胞における産物の発現を可能にする制御配列に作動可能に連結された目的の産物をコードする配列を含む、第４、および任意選択で第５、および任意選択で第６の核酸配列などを含んでもよい。これらの配列は、第１および／または第２の核酸配列と同じベクター中に存在する（選択可能なマーカーと関連付けられた結果として、それらが選択されることを確実にするため）。

再び、上述のように、これらの発現カセットは、様々な方法で構成され得る。ＰＡＨおよびＧＣＨ１配列が異なるベクター上にある場合、各ベクターは、それぞれ、目的の産物をコードする１つ以上の発現カセットを含有し得、例えば、それぞれが２つのそのような発現カセットを含有し得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、選択マーカーのうちの１つのみを有する単一のベクター中に存在し得る。したがって、１つのベクターは、それぞれ、二重特異性抗体産生のための重鎖または軽鎖などの目的の産物をコードする配列を有する、３つまたは４つの発現カセットを有し得る。

ベクターはまた、ベクターの両端に位置する逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を使用するＰｉｇｇｙＢａｃ（商標）系などの、無作為にまたは部位特異的な方法のいずれかで宿主細胞ゲノムへの組み込みを補助する配列を含有し得る。トランスフェクションプロセス中に含まれる配列特異的トランスポザーゼ、部位特異的組み込み方法、および配列もまた、ＷＯ２０１３／１９００３２およびＷＯ２０１８／１５０２６９に記載されている。

いくつかの実施形態では、産物をコードする核酸配列を含むベクターは、以下に記載されるように、グルタミン合成酵素などのさらなる選択マーカーを含む。典型的には、ベクター系は、以下に記載されるさらなる選択マーカーを含む別個のベクターと、宿主細胞における産物の発現を可能にする制御配列に作動可能に連結された目的の産物（複数可）をコードする１つ以上の配列を挿入するための複数のクローニング部位と、を含む。目的の配列が複数のクローニング部位にクローニングされると、ベクターは、以下に記載されるように、さらなる選択マーカーと、宿主細胞における産物の発現を可能にする制御配列に作動可能に連結された目的の産物をコードする配列を含む核酸配列と、を含む。そのようなベクターは一般に、ＰＡＨまたはＧＣＨ１配列を含まない。

ベクター（複数可）は、使用説明書、および任意選択でトランスフェクション試薬などを含むキットとして提供され得る。

本明細書に記載の産物、例えば、組換えポリペプチドをコードする核酸、例えば、主題の核酸もまた、本明細書で提供される。所望の組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、当該技術分野で既知の組換え方法を使用して、例えば、所望の核酸配列、例えば、遺伝子を発現する細胞からのライブラリをスクリーニングすることによって、核酸配列を、それを含むことが既知のベクターから誘導することによって、または標準技法を使用して、それを含有する細胞および組織から直接単離することなどによって得ることができる。あるいは、組換えポリペプチドをコードする核酸は、クローニングされるのではなく、合成的に産生され得る。組換えＤＮＡ技法および技術は、当該技術分野で高度に進んでおり、十分に確立されている。したがって、本明細書に記載の組換えポリペプチドのアミノ酸配列の知識を有する当業者は、組換えポリペプチドをコードする核酸配列を容易に想定または生成することができる。

ＧＣＨ１酵素分子
自然発生のＧＣＨ１酵素は、ＧＴＰの７，８－ジヒドロネオプテリン３’－三リン酸への変換（２つの水分子を消費し、酢酸も産生する）を触媒し、これは、ＢＨ４の産生において最初のステップである。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、自然発生のＧＣＨ１酵素と同じまたは類似の活性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、自然発生のＧＣＨ１酵素対して増加または減少した活性を有する。

いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、自然発生のＧＣＨ１酵素である。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、完全長（例えば、非切断）ＧＣＨ１酵素を含む。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１分子は、哺乳類ＧＣＨ１酵素に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する。

いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、自然発生のＧＣＨ１酵素または非自然発生の（例えば、合成の）ＧＣＨ１酵素のバリアント（例えば、自然発生のまたは非自然発生の酵素のアミノ酸配列に対して、１つ以上のアミノ酸配列の改変（例えば、置換、欠失、または挿入）を含むバリアント）である。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、自然発生のＧＣＨ１酵素に対して、欠失変異、例えば、切断、例えば、Ｎ末端領域の切断であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、自然発生のＧＣＨ１酵素の少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、または９９％のアミノ酸配列（および任意選択で、最大１００、９９、９５、９０、８５、８０、７９、７８、７７、７６、または７５％のアミノ酸配列）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、自然発生のＧＣＨ１酵素の９９、９５、９０、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、または７５％以下のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、単量体であり、例えば、単量体としての活性酵素である。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、多量体を形成し（例えば、酵素活性のための適切な条件下で、例えば、細胞または生理学的条件下で、例えば、バイオ製造プロセス中に）、例えば、多量体としての活性酵素である。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体、例えば、十量体である。

本開示のＧＣＨ１酵素分子で使用するための配列は、任意の既知のＧＣＨ１酵素配列から得ることができる。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、ヒトＧＣＨ１酵素、そのバリアント、またはその酵素的に活性な断片を含む。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、ＣＨＯ ＧＣＨ１酵素、そのバリアント、またはその酵素的に活性な断片を含む。

いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、配列番号１によってコードされるアミノ酸配列、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１０２４０２４（例えば、２０１９年１０月６日現在）によってコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子は、配列番号１によってコードされるアミノ酸配列、例えば、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＣＨ１酵素分子をコードする外因性核酸は、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である核酸配列を含む。
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１０２４０２４
ＡＣＧＣＧＴＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＡＧＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＧＴＴＣＣＣＣＧＡＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＣＧＣＧＧＡＣＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＣＣＴＡＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＡＣＴＣＧＴＣＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧＡＣＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＡＴＧＴＣＣＴＡＡＡＣＧＡＴＧＣＴＡＴＡＴＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＴＧＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＣＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＧＧＡＡＡＧＧＴＣＣＡＴＡＴＴＧＧＴＴＡＴＣＴＴＣＣＴＡＡＣＡＡＧＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＧＣＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＴＴＧＣＧＡＧＧＡＴＴＧＴＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴＡＧＴＡＧＡＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＣＧＣＣＴＴＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＡＡＴＣＡＣＧＧＡＡＧＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＣＧＧＧＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＧＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＧＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＴＧＴＡＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＴＣＣＧＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＧＡＣＴＣＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＣＡＴＴＡＧＧＡＧＣＴＧＡＣＧＴＡＣＧＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣ（配列番号１）
ＭＥＫＧＰＶＲＡＰＡＥＫＰＲＧＡＲＣＳＮＧＦＰＥＲＤＰＰＲＰＧＰＳＲＰＡＥＫＰＰＲＰＥＡＫＳＡＱＰＡＤＧＷＫＧＥＲＰＲＳＥＥＤＮＥＬＮＬＰＮＬＡＡＡＹＳＳＩＬＳＳＬＧＥＮＰＱＲＱＧＬＬＫＴＰＷＲＡＡＳＡＭＱＦＦＴＫＧＹＱＥＴＩＳＤＶＬＮＤＡＩＦＤＥＤＨＤＥＭＶＩＶＫＤＩＤＭＦＳＭＣＥＨＨＬＶＰＦＶＧＫＶＨＩＧＹＬＰＮＫＱＶＬＧＬＳＫＬＡＲＩＶＥＩＹＳＲＲＬＱＶＱＥＲＬＴＫＱＩＡＶＡＩＴＥＡＬＲＰＡＧＶＧＶＶＶＥＡＴＨＭＣＭＶＭＲＧＶＱＫＭＮＳＫＴＶＴＳＴＭＬＧＶＦＲＥＤＰＫＴＲＥＥＦＬＴＬＩＲＳ（配列番号２）

ＰＡＨ酵素分子
自然発生のＰＡＨ酵素は、分子酸素およびテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）を使用して、フェニルアラニンのチロシンへの変換を触媒する。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、自然発生のＰＡＨ酵素と同じまたは類似の活性を有する。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、自然発生のＰＡＨ酵素に対して増加または減少した活性を有する。

いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、自然発生のＰＡＨ酵素である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、完全長（例えば、非切断）ＰＡＨ酵素を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、自然発生のＰＡＨ酵素または非自然発生の（例えば、合成の）ＰＡＨ酵素のバリアント（例えば、自然発生のまたは非自然発生の酵素のアミノ酸配列に対して、１つ以上のアミノ酸配列の改変（例えば、置換、欠失、または挿入）を含むバリアント）である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、自然発生のＰＡＨ酵素に対して、欠失変異、例えば、切断、例えば、Ｎ末端領域の切断であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、自然発生のＰＡＨ酵素の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のアミノ酸配列（および任意選択で、最大１００％、９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、または７５％のアミノ酸配列）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、自然発生のＰＡＨ酵素の９９、９５、９０、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、または７５％以下のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、自然発生のＰＡＨ酵素分子の少なくとも２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３３５、または３３６個のアミノ酸（および任意選択で、４５０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、または３３６個以下のアミノ酸）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、自然発生のＰＡＨ酵素分子の４５０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、または３３６個以下のアミノ酸（および任意選択で、少なくとも２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３３５、または３３６個のアミノ酸）であるか、またはそれを含む。例えば、ＰＡＨ酵素分子は、アミノ酸１５～３７の欠失を含む、最初の１～１４および３７以降のアミノ酸を含み得る。さらなる例として、ＰＡＨ酵素分子は、アミノ酸１～１１６の欠失を含み得る。さらなる例として、ＰＡＨ酵素分子は、アミノ酸１～１０および３０～４０の欠失を含み得る。さらなる例として、ＰＡＨ酵素分子は、自然発生のＰＡＨ酵素の３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、または３５０個のＣ末端アミノ酸、例えば、３４３個のＣ末端アミノ酸を含み得る。

好ましい実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、例えば、ＰＡＨ酵素分子が自然発生のＰＡＨ酵素に対して構成的に活性であるように、自然発生のＰＡＨ酵素の調節ドメインの一部または全部を欠く。理論に拘束されることを望まないが、ＰＡＨ酵素は、例えば、酵素活性部位へのアクセスを調節することによって、ＰＡＨの酵素活性を調節する１つ以上の調節ドメインを含むＮ末端領域を含むと理解される。調節領域は、代謝酵素のアロステリック調節を可能にすることが知られているＡＣＴドメイン、および／または酵素活性部位へのアクセスを条件付きで遮断することができる活性部位の蓋（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｌｉｄ）を含み得る。我々は、調節ドメインの一部または全部を欠くＰＡＨ酵素分子は、生産細胞、例えば、本明細書に記載される選択マーカーに有用であると考えている。なぜなら、そのようなＰＡＨ酵素分子は、完全長ＰＡＨ酵素、例えば、調節ドメインのアロステリック調節の対象となるＰＡＨ酵素分子を含むＰＡＨ酵素分子よりも活性（例えば、構成的に活性）であり得るからである。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、活性部位の蓋を欠く。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、ＡＣＴドメインを欠く。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、Ｎ末端調節領域（例えば、活性部位の蓋および／またはＡＣＴドメイン）の調節（例えば、阻害）機能を消失する改変（例えば、置換、欠失、または挿入）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、フェニルアラニンの存在によってはっきりと阻害されない（例えば、阻害されない）。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、ヒトＰＡＨのアミノ酸１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、１～１００、１～１１０、もしくは１～１１６（例えば、１～１１６）の欠失、またはアミノ酸１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、１～１００、１～１１０、もしくは１～１１６（例えば、１～１１６）に対応する残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、自然発生のＰＡＨ酵素（例えば、自然発生のヒトＰＡＨ酵素）のＮ末端の１１６個のアミノ酸、または異なる自然発生のＰＡＨ酵素の対応するアミノ酸を欠く。Ｄａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ ３４８（２）：２９５（調節ドメイン（最初の１１６個のアミノ酸）を欠く切断ＰＡＨを記載する）を参照されたい。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたこの切断ＰＡＨは、より安定であり、より可溶性であり、活性となるのにフェニルアラニンとの事前インキュベーションを必要とせず、基質に対してより高い親和性を有した）。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、自然発生のＰＡＨ酵素のＣ末端領域、例えば、ＰＡＨ酵素の触媒部分および多量体化部分を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、単量体であり、例えば、単量体としての活性酵素である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、多量体を形成し（例えば、酵素活性のための適切な条件下で、例えば、細胞または生理学的条件下で、例えば、バイオ製造プロセス中に）、例えば、多量体としての活性酵素である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、または八量体、例えば、四量体である。

本開示のＰＡＨ酵素分子で使用するための配列は、任意の既知のＰＡＨ酵素配列から得ることができる。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、ヒトＰＡＨ酵素、そのバリアント、またはその酵素的に活性な断片を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ分子は、ヒトＰＡＨ酵素に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、ＣＨＯ ＰＡＨ酵素、そのバリアント、またはその酵素的に活性な断片を含む。いくつかの場合では、ＰＡＨ分子は、ＣＨＯ ＰＡＨ酵素に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する。

いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、配列番号３または４のうちのいずれかによってコードされるアミノ酸配列、例えば、配列番号５または６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子は、配列番号３または４のうちのいずれかによってコードされるアミノ酸配列、例えば、配列番号５または６のうちのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＨ酵素分子をコードする外因性核酸は、配列番号３または４のうちのいずれかの核酸配列と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である核酸配列を含む。
例示的なＣＨＯ ＰＡＨ核酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＸＭ＿０２７４３４７２６．１）
ＡＴＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＴＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＡＡＡＧＡＴＣＣＴＧＴＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＣＣＴＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＧＧＡＡＣＡＧＴＧＴＴＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＡＣＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＣＡＣＡＡＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＧＴＡＣＴＧＣＧＧＧＴＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＣＡＡＣＡＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＴＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＣＧＡＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＧＣＴＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＣＡＡＴＡＣＡＴＣＡＧＧＣＡＴＧＧＧＴＣＴＡＡＧＣＣＣＡＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＣＡＴＴＴＧＴＣＡＴＧＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＣＡＴＧＴＧＣＣＣＴＴＧＴＴＴＴＣＡＧＡＴＣＧＣＡＧＣＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣＧＧＡＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＧＡＡＴＡＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＴＴＧＧＣＣＡＣＡＡＴＴＴＡＣＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＴＴＣＣＡＴＣＡＡＧＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＴＴＡＴＣＡＧＡＣＡＡＧＣＣＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＧＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧＴＴＴＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＧＧＣＣＴＴＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＣＣＣＣＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＧＧＴＴＣＧＣＴＡＴＧＡＴＣＣＣＴＡＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＧＴＴＧＡＧＧＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＣＴＧＡＣＴＣＣＡＴＣＡＡＣＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＧＡＡＴＣＣＴＴＴＧＣＡＧＴＧＣＣＣＴＧＣＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＣＡＴＧＡ（配列番号３）
例示的なＣＨＯ ＰＡＨアミノ酸配列
ＭＶＰＷＦＰＲＴＩＱＥＬＤＲＦＡＮＱＩＬＳＹＧＡＥＬＤＡＤＨＰＧＦＫＤＰＶＹＲＡＲＲＫＱＦＡＤＩＡＹＮＹＲＨＧＱＰＩＰＲＶＥＹＴＥＥＥＫＫＴＷＧＴＶＦＫＴＬＫＡＬＹＫＴＨＡＣＹＥＨＮＨＩＦＰＬＬＥＫＹＣＧＦＲＥＤＮＩＰＱＬＥＤＶＳＱＦＬＱＴＣＴＧＦＲＬＲＰＶＡＧＬＬＳＳＲＤＦＬＧＧＬＡＦＲＶＦＨＣＴＱＹＩＲＨＧＳＫＰＭＹＴＰＥＰＤＩＣＨＥＬＬＧＨＶＰＬＦＳＤＲＳＦＡＱＦＳＱＥＩＧＬＡＳＬＧＡＰＤＥＹＩＥＫＬＡＴＩＹＷＦＴＶＥＦＧＬＣＫＥＧＤＳＩＫＡＹＧＡＧＬＬＳＳＦＧＥＬＱＹＣＬＳＤＫＰＫＬＬＰＬＤＬＥＫＴＡＳＱＥＹＮＶＴＥＦＱＰＬＹＹＶＡＥＳＦＮＤＡＫＥＫＶＲＡＦＡＡＴＩＰＲＰＦＳＶＲＹＤＰＹＴＱＲＶＥＶＬＤＮＴＱＱＬＫＩＬＡＤＳＩＮＳＥＶＧＩＬＣＳＡＬＨＫＩＫＳ（配列番号５）
例示的なヒトＰＡＨ核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｋ０３０２０．１）
ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＧＡＴＣＣＴＧＴＧＴＡＣＣＧＴＧＣＡＡＧＡＣＧＧＡＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＡＴＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＴＴＣＡＡＧＡＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＡＣＣＣＡＴＧＣＴＴＧＣＴＡＴＧＡＧＴＡＣＡＡＴＣＡＣＡＴＴＴＴＴＣＣＡＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＧＴＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＡＡＣＡＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＴＴＴＣＴＣＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＣＴＴＧＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＣＧＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＧＧＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＣＣＡＴＧＴＡＴＡＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＧＡＣＡＴＧＴＧＣＣＣＴＴＧＴＴＴＴＣＡＧＡＴＣＧＣＡＧＣＴＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＧＡＡＡＴＴＧＧＣＣＴＴＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＴＧＡＡＴＡＣＡＴＴＧＡＡＡＡＧＣＴＣＧＣＣＡＣＡＡＴＴＴＡＣＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＣＴＣＣＡＴＡＡＡＧＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＴＧＴＣＡＣＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＡＴＴＡＣＧＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＡＣＴＴＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＣＴＡＣＧＡＣＣＣＡＴＡＣＡＣＣＣＡＡＡＧＧＡＴＴＧＡＧＧＴＣＴＴＧＧＡＣＡＡＴＡＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＣＴＧＡＴＴＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＣＴＴＴＧＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＡＡＡＧＡＴＣＴ（配列番号４）
例示的なヒトＰＡＨアミノ酸配列
ＭＶＰＷＦＰＲＴＩＱＥＬＤＲＦＡＮＱＩＬＳＹＧＡＥＬＤＡＤＨＰＧＦＫＤＰＶＹＲＡＲＲＫＱＦＡＤＩＡＹＮＹＲＨＧＱＰＩＰＲＶＥＹＭＥＥＥＫＫＴＷＧＴＶＦＫＴＬＫＳＬＹＫＴＨＡＣＹＥＹＮＨＩＦＰＬＬＥＫＹＣＧＦＨＥＤＮＩＰＱＬＥＤＶＳＱＦＬＱＴＣＴＧＦＲＬＲＰＶＡＧＬＬＳＳＲＤＦＬＧＧＬＡＦＲＶＦＨＣＴＱＹＩＲＨＧＳＫＰＭＹＴＰＥＰＤＩＣＨＥＬＬＧＨＶＰＬＦＳＤＲＳＦＡＱＦＳＱＥＩＧＬＡＳＬＧＡＰＤＥＹＩＥＫＬＡＴＩＹＷＦＴＶＥＦＧＬＣＫＱＧＤＳＩＫＡＹＧＡＧＬＬＳＳＦＧＥＬＱＹＣＬＳＥＫＰＫＬＬＰＬＥＬＥＫＴＡＩＱＮＹＴＶＴＥＦＱＰＬＹＹＶＡＥＳＦＮＤＡＫＥＫＶＲＮＦＡＡＴＩＰＲＰＦＳＶＲＹＤＰＹＴＱＲＩＥＶＬＤＮＴＱＱＬＫＩＬＡＤＳＩＮＳＥＩＧＩＬＣＳＡＬＱＫＩＫ（配列番号６）

宿主細胞
本開示は、一部、チロシン栄養要求性選択マーカー、例えば、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）酵素分子をコードする第１の核酸と、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）酵素分子をコードする第２の核酸と、を含む、宿主細胞を対象とする。これらの配列のうちの少なくとも１つは、宿主細胞に対して外因性であり、すなわち、天然に存在しない。両方の配列は、宿主細胞に対して外因性であり得る。

ベクターに関する上記のセクションに記載されるように、核酸配列は同じまたは異なるベクター中に存在し得るため、それらは同じまたは異なる核酸分子／ベクター中で宿主細胞に存在し得る。これらのベクターは、特に染色体外で維持される場合、自己複製ベクターであり得る。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の核酸は、生産細胞のゲノムに組み込まれる。

ベクター系の導入後の宿主細胞は、典型的には、目的の産物をコードする第３の外因性核酸配列も含み、これらの細胞も本明細書では「生産細胞」と称される。産物は、典型的には、未修飾宿主細胞、例えば、生体治療用タンパク質に天然に存在しない。第３の核酸配列は、細胞を産生するために使用されたベクターの数に応じて、第１の核酸配列および／または第２の核酸配列と同じ核酸に存在する。いくつかの実施形態では、第３の外因性核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。本発明のベクター系を使用して導入された追加の外因性核酸も存在し得る。

第１、第２、および／または第３などの外因性核酸は、１つ以上の制御要素を含み得る。制御要素、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、ＰＡＨ酵素分子をコードする配列、ＧＣＨ１分子をコードする配列、または産物をコードする配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、第１および第２の外因性核酸は、生産細胞においてＰＡＨ酵素分子およびＧＣＨ１酵素分子を発現するのに十分な１つ以上の制御要素を含む。いくつかの実施形態では、第３の外因性核酸は、生産細胞において産物、例えば、ポリペプチド産物を発現するのに十分な１つ以上の制御要素を含む。本発明での使用に好適な制御要素は、当業者に既知であり、その例も本明細書に記載される。

宿主細胞型
一態様では、本開示の宿主細胞は、本明細書に記載の任意の細胞型、株、または細胞株であるか、それから作製されるか、またはそれに由来してもよい。一般に、本明細書における方法は、宿主細胞、例えば、（ｉ）目的の産物をコードする主題の核酸配列、および（ｉｉ）アミノ酸の生合成経路に関与する１つ以上の酵素分子をコードする１つ以上の外因性核酸配列を含む核酸構築物（例えば、ゲノムに組み込まれたベクターまたは異種核酸）を含む細胞または細胞株を産生するために使用することができ、細胞または細胞株は、酵素分子を内因的に発現しない。

宿主細胞は、遺伝子操作および増殖することができる任意の好適な細胞であり得る。典型的には、細胞は、目的の産物を産生するための大規模培養に好適なものである。

本発明のベクター系の導入前の宿主細胞は、チロシンの不在下で細胞増殖を支持するのに十分なレベルのチロシンを産生することができない。これは、チロシン生合成に必要な酵素のうちの１つ以上を十分なレベルまで発現しないか、または関連する遺伝子をノックアウトするように操作されているためであり得る。したがって、一実施形態では、本発明の宿主細胞は、任意の内因性ＰＡＨおよび／またはＧＣＨ１活性を阻害または消失するように遺伝子修飾されている。これは、例えば、内因性ＰＡＨおよび／またはＧＣＨ１の発現をコードおよび／または調節するゲノム配列における変異（挿入、欠失、および／または置換）によって達成することができる。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、哺乳類、酵母、または昆虫細胞である。

一実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞である。宿主細胞が由来し得る種の例としては、ヒト、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、サル、類人猿、イヌ、ウマ、フェレット、およびネコが挙げられる。

実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ（登録商標）細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（グルタチオン合成酵素（ＧＳ）遺伝子のすべての内因性コピーが不活性化されているＣＨＯ細胞）、ＣＨＯＫ１ＳＶ（登録商標）ＦＵＴ ８ノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、またはＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳ－ＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ（登録商標）ＧＳノックアウト細胞（ＧＳ Ｘｃｅｅｄ（登録商標）細胞－ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ（登録商標）、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ）である。ＣＨＯ ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ（登録商標）ＦＵＴ８ノックアウト（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。

実施形態では、宿主細胞は、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５、ＨＴ１０８０、ＮＢ３２４Ｋ、ＦＬＹＲＤ１８、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０、Ｙ０、ＥＢ６６、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１およびＣＯＳ７）、ＱＣ１－３、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）（ＣＨＯＫ１ＳＶ ＦＵＴ８－ＫＯ）、ＣＨＯ ＧＳノックアウト、ＧＳ Ｘｃｅｅｄ（商標）（ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ）、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ ＤＸＢ１１、もしくはＣＨＯＺＮ細胞、またはそれらに由来する任意の細胞である。

他の実施形態では、宿主細胞は、鳥類、魚類、昆虫、植物、真菌、または酵母細胞などの哺乳類細胞以外の細胞である。

いくつかの実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の細胞株は、複数の細胞の融合（例えば、同じ種類の２つの細胞（例えば、２つのＣＨＯ細胞）または異なる種類（例えば、異なる種）の２つの細胞の融合）を含むプロセスによって形成された。複数の細胞の融合を含むプロセスによって形成された宿主細胞または細胞株の例としては、ハイブリドーマ、トリオーマ、およびクアドローマが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、それに由来するものには、変異（例えば、置換、欠失、または挿入）または核酸（例えば、ベクター）の付加などの改変（例えば、遺伝子のノックイン、遺伝子のノックアウト、または遺伝子の多重度）をさらに含む、本明細書に記載の細胞が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、それに由来するものには、定向進化を受ける本明細書に記載の細胞を含む。いくつかの実施形態では、それに由来するものには、本明細書に記載のこれらの例示的な修飾の組み合わせが含まれる。

真核細胞には、幹細胞が含まれる。幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）、および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む多能性幹細胞であってもよい。

実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の細胞のうちのいずれかの分化形態である。一実施形態では、宿主細胞は、培養物中の任意の初代細胞に由来する細胞である。

実施形態では、宿主細胞は、ヒト肝細胞、動物肝細胞、または非実質細胞などの肝細胞である。例えば、宿主細胞は、プレーティング可能な代謝限定ヒト肝細胞、プレーティング可能な誘導限定ヒト肝細胞、プレーティング可能なＱｕａｌｙｓｔ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ（商標）ヒト肝細胞、懸濁限定ヒト肝細胞（１０ドナーおよび２０ドナープールされた肝細胞を含む）、ヒト肝臓クッパー細胞、ヒト肝星細胞、イヌ肝細胞（単一およびプールされたビーグル肝細胞を含む）、マウス肝細胞（ＣＤ－１およびＣ５７ＢＩ／６肝細胞を含む）、ラット肝細胞（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ、およびＷｉｓｔａｒ肝細胞を含む）、サル肝細胞（カニクイザルまたはアカゲザル肝細胞を含む）、ネコ肝細胞（Ｄｏｍｅｓｔｉｃ Ｓｈｏｒｔｈａｉｒ肝細胞を含む）、およびウサギ肝細胞（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ肝細胞を含む）であり得る。 例示的な肝細胞は、Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，ＬＬＣ，６ Ｄａｖｉｓ Ｄｒｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ ２７７０９から市販されている。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）のノックアウトを含む。実施形態では、宿主細胞は、機能的ＧＳ遺伝子を含まない。実施形態では、宿主細胞は、ＧＳ遺伝子を含まない。実施形態では、宿主細胞におけるＧＳ遺伝子は、遺伝子が機能的ＧＳタンパク質をコードすることができなくなる変異を含む。

実施形態では、真核細胞は、例えば、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ属（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、およびＰｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属（例えば、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、またはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｃａｎｄｉｄａ属（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｃａｏｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属（例えば、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅなどの下等真核細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、種Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのものである。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株の例としては、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ、およびＣＢＳ７４３５が挙げられるが、これらに限定されない。

実施形態では、真核細胞は、真菌細胞（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．（Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｏｒｚｙａｅ、Ａ．ｎｉｄｕｌａなど）、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．（Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍなど）、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ．（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍなど）、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅなど）、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｐ．（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓなど）、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ ｓｐ．、Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍなど）、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｓｐ．（Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａなど）、Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐ．（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａなど）、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｓｐ．（Ｍ．ｏｒｚｙａｅなど）、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐ．（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅなど）、Ｎｅｃｔｒｉａ ｓｐ．（Ｎ．ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａなど）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐ．（Ｎ．ｃｒａｓｓａなど）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅなど）、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｐ．（Ｔ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｔ．ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａなど）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉなど）、またはＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．（Ｖ．ｄａｈｌｉａなど））である。

実施形態では、真核細胞は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｍｉｍｉｃ（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）（ＢＴ１－ＴＮ－５Ｂ１－４）、またはＢＴ１－Ｅａ８８細胞）、藻類細胞（例えば、属Ａｍｐｈｏｒａ ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ ｓｐ．、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ ｓｐ．（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｐ．、またはＯｃｈｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．の）、または植物細胞（例えば、単子葉植物（例えば、トウモロコシ、米、小麦、もしくはＳｅｔａｒｉａ ｓｐ．）、または双子葉植物（例えば、キャッサバ、ジャガイモ、大豆、トマト、タバコ、アルファルファ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ、もしくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｐ．）由来の細胞）である。

実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞である。

実施形態では、原核細胞は、グラム陽性細胞、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．である。使用することができるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．は、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｎａｔｔｏ、またはＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍである。実施形態では、細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ３ＮＡおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５６，４８４ Ｗｅｓｔ １２^ｔｈ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ ＯＨ ４３２１０－１２１４から入手可能である。

実施形態では、原核細胞は、グラム陰性細胞、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、例えば、ＴＧ１、ＴＧ２、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨＢ４、ＤＨ５ａ、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、およびＯｒｉｇａｍｉなど、ならびに例えば、ＢＬ－２１もしくはＢＬ２１（ＤＥ３）、またはＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳなどのＥ．ｃｏｌｉ Ｂ株に由来するものなどであり、これらはすべて市販されている。

いくつかの実施形態では、原核細胞は、ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ細胞である。いくつかの実施形態では、ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ細胞は、青緑藻、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ細胞である。

好適な宿主細胞は、例えば、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ａｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの培養コレクションから市販されている。

追加の選択マーカー
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、チロシン栄養要求性選択マーカーに加えて、１つ以上の選択マーカーを含む。いくつかの実施形態では、第２の選択マーカーは、異なるアミノ酸栄養要求性選択マーカーなどの異なる栄養要求性選択マーカーである。一実施形態では、アミノ酸は、プロリンまたはグルタミンである。そのような選択マーカーに必要な核酸配列の例は、グルタミン合成酵素（グルタミンの場合）およびピロリン－５－カルボキシレート合成酵素（Ｐ５ＣＳ）（プロリンの場合）をコードする配列である。

別の選択マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）に対する耐性を付与する、例えば、ＤＨＦＲ酵素分子をコードする外因性核酸である。いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲ選択マーカーはまた、チミジン栄養要求性選択マーカーおよび／またはヒポキサンチン栄養要求性選択マーカーである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、内因性機能的ＤＨＦＲ遺伝子を含まず、例えば、内因性ＤＨＦＲ遺伝子が機能的ＤＨＦＲ酵素をコードすることができなくなる変異を含まない。

さらなる選択マーカーは、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）選択マーカー、例えば、ＨＰＲＴ酵素分子をコードする外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、生産細胞は、ＨＰＲＴ（例えば、外因性核酸によってコードされる補足的ＨＰＲＴ）および補足的プリン、例えば、ヒポキサンチンなしで、アミノプテリンの存在下で増殖および／または分裂することができない。いくつかの実施形態では、ＨＰＲＴ選択マーカーはまた、プリン（例えば、ヒポキサンチンまたはグアニン）栄養要求性選択マーカーである。いくつかの実施形態では、生産細胞は、内因性機能的ＨＰＲＴ遺伝子を含まず、例えば、内因性ＨＰＲＴ遺伝子が機能的ＨＰＲＴ酵素をコードすることができなくなる変異を含まない。

一実施形態では、選択マーカーは、Ｓｅｌｅｘｉｓ選択系（例えば、ＳＵＲＥｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（商標）およびＳｅｌｅｘｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（商標）、Ｓｅｌｅｘｉｓ ＳＡから市販されている）またはＣａｔａｌｅｎｔ ＧＰＥｘ（登録商標）選択系と適合性がある。

生産細胞で使用するための選択マーカーは、主題の核酸と関連付けられ得る。選択マーカーと主題の核酸との関係に関して本明細書で使用される場合、と関連付けられるとは、生産細胞における選択マーカーの存在が主題の核酸の存在と相関する関係を指す。選択マーカーは、生産細胞における選択マーカーの存在について選択する（例えば、必要とする）ことが、主題の核酸の存在について選択するように、主題の核酸と関連付けられる。いくつかの実施形態では、選択マーカー、例えば、選択マーカーの少なくとも１つの構成要素は、主題の核酸と同じ核酸分子上、例えば、主題の核酸と同じベクター上に位置する。例えば、ＰＡＨ酵素分子をコードする第１の外因性核酸およびＧＣＨ１酵素分子をコードする第２の外因性核酸を含むチロシン栄養要求性選択マーカーを含む生産細胞は、第１の外因性核酸または第２の外因性核酸のいずれかと同じベクター上に位置する主題の核酸を含み得る。２つ以上の選択マーカーを含む生産細胞では、各選択マーカーは、異なる主題の核酸と関連付けられ得る。いくつかの実施形態では、生産細胞は、第１の主題の核酸と関連付けられた（例えば、産物をコードする）第１の選択マーカーと、第２の主題の核酸と関連付けられる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１９１１６５およびＷＯ２０１９／１５２８７６に記載される、生産因子、例えば、ＳＣＤ１および／またはＳＲＥＢＦ－１などの脂質代謝調節物質（ＬＭＭ）をコードする）第２の選択マーカーと、を含む。したがって、さらなる選択マーカーは、宿主細胞に導入された外因性生産因子を維持するために使用される（安定した細胞株を産生するための以前の場合を含む）。いくつかの実施形態では、生産細胞は、第１の主題の核酸と関連付けられた第１の選択マーカー（例えば、第１の産物をコードする）と、第２の主題の核酸と関連付けられた第２の選択マーカー（例えば、第２の産物をコードする）と、を含む。いくつかの実施形態では、生産細胞は、第１の主題の核酸と関連付けられた第１の選択マーカー（例えば、多ポリペプチド産物の第１の産物をコードする）と、第２の主題の核酸と関連付けられた第２の選択マーカー（例えば、多ポリペプチド産物の第２の産物をコードする）と、を含む。異なるマーカーまたは同じマーカーと関連付けられ得る追加の主題の核酸が含まれ得ることが理解される。

阻害剤
宿主細胞および／または宿主細胞を含む培養物は、１つ以上の酵素分子阻害剤（本明細書では阻害剤とも称される）を含み得る。酵素分子阻害剤は、例えば、酵素分子をコードする（例えば、および主題の核酸配列を含む）外因性核酸を取り込まない細胞が、低下したまたは検出不能なレベルの内因性酵素分子活性を示すように、内因性酵素分子活性を低下または防止することによって、本明細書に記載の選択プロセスの厳密性を増加させるために使用され得る。低下したまたは検出不能なレベルの内因性酵素分子活性を示す細胞は、合成が酵素分子の活性を必要とするアミノ酸（例えば、プロリン、チロシン、またはグルタミン）の外部供給の不在下で増殖および／または生存することができない場合がある。いくつかの実施形態では、阻害剤は、酵素分子に結合し、例えば、酵素分子に結合し、阻害する。実施形態では、阻害剤は、酵素分子のアロステリック阻害剤である。実施形態では、阻害剤は、酵素分子の競合的阻害剤である。

本明細書に記載の生産細胞は、いくつかの実施形態では、細胞に導入された外因性核酸によって発現されている酵素分子（例えば、ＰＡＨまたはＧＣＨ１）の阻害剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、細胞における阻害剤のレベルは、阻害剤を欠く細胞で観察される活性の約０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、または１０％未満に内因性酵素分子活性を低下させるのに十分である。いくつかの実施形態では、アミノ酸を欠く培地中の増殖に基づいて選択される約０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、５％、または１０％未満の細胞は、主題の核酸を含まない。いくつかの実施形態では、細胞における酵素分子および阻害剤分子の比は、約：１：１０００、１：５００、１：２５０、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、２５０：１、５００：１、または１０００：１である。

阻害剤は、例えば、アミノ酸またはその類似体、ポリペプチド、核酸、または小分子であり得る。いくつかの実施形態では、阻害剤は、酵素分子が関与する生合成経路によって産生されるアミノ酸の類似体である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、酵素分子の基質の類似体である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、抗体分子（例えば、本明細書に記載される、例えば、抗体または抗体断片）、融合タンパク質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、酵素、糖タンパク質、リポタンパク質、レポータータンパク質、治療用ペプチド、アプタマー、またはこれらのうちのいずれかの構造的および／もしくは機能的断片もしくはハイブリッドである。いくつかの実施形態では、阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、または長い非コードＲＮＡである。

いくつかの実施形態では、阻害剤は、プロリン、チロシン、またはグルタミンの生合成経路における酵素分子を阻害する。一実施形態では、阻害剤は、ＰＡＨ（例えば、フェニルアラニン類似体）またはＧＣＨ１の活性を阻害する。実施形態では、阻害剤は、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）類似体である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＧＴＰ類似体である。一実施形態では、阻害剤は、α－メチルチロシン（例えば、５０～１００μＭで）、α－メチルフェニルアラニン、および２，４－アミノ－６－ヒドロキシピリミジンから選択される。

実施形態では、阻害剤は、使用される場合、ピロリン－５－カルボキシレート合成酵素（Ｐ５ＣＳ）分子などの追加の選択マーカーのうちの１つの基礎を形成する酵素の活性を阻害する。実施形態では、阻害剤は、Ｐ５ＣＳの活性を阻害する。実施形態では、阻害剤は、プロリン類似体である。実施形態では、阻害剤は、Ｌ－アゼチジン－２－カルボン酸、３，４－デヒドロ－Ｌ－プロリン、またはＬ－４－チアゾリジンカルボン酸である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＤＨＦＲの活性を阻害し、例えば、メトトレキサートである。いくつかの実施形態では、阻害剤は、グルタミン合成酵素（例えば、グルタミン類似体、メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）またはその類似体（例えば、アルファ－メチルまたはアルファ－エチルＭＳＸ））を阻害する。いくつかの実施形態では、生産細胞は、１つを超える選択マーカーを含み、各選択マーカーの酵素分子阻害剤を含む。

核酸の宿主細胞への導入および選択ステップ
外因性核酸を宿主細胞に導入するための多くの好適な方法は当該技術分野において既知であり、例えば、核酸、例えば、ベクターの細胞内への、トランスフェクション、形質導入（例えば、ウイルス形質導入）、またはエレクトロポレーションを含む。核酸、例えば、本明細書に記載の異種核酸またはベクターを宿主細胞に導入するための物理的な方法の例としては、リン酸カルシウム沈殿、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）を参照されたい。核酸、例えば、本明細書に記載の異種核酸またはベクターを宿主細胞に導入するための化学的手段の例としては、リポフェクション、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系が挙げられるが、これらに限定されない。インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。核酸の標的化送達の他の最先端の方法、例えば、標的化ナノ粒子でのポリヌクレオチドまたは他の好適なサブミクロンサイズの送達系の送達が利用可能である。

宿主細胞は、核酸で一過性にトランスフェクトされるか、または安定してトランスフェクトされ得る。

導入された核酸を含有する宿主細胞の選択は、本発明のチロシン栄養要求性選択系（および含まれていた可能性のある任意の他の追加の選択マーカー）に基づいて、非形質転換細胞の増殖能力を制限しながら、導入された核酸を含有する細胞が増殖することを可能にする厳密な選択条件下で細胞を培養することによって達成することができる。

チロシンのレベルが導入された核酸を含有する細胞の選択を容易に可能にする条件下で、トランスフェクト／形質転換された細胞の集団を培養する。したがって、細胞は、細胞条件の生存または増殖に必要なレベルよりも低いレベルのチロシンの存在下で培養される。典型的には、これは、細胞がチロシンの不在下で培養されるように、チロシンを欠く培地の使用を伴う。それにもかかわらず、０．０１ｇ／Ｌ未満のチロシン、または５０、２０、もしくは１０μＭ未満のチロシンを含む培養培地などの選択条件が十分に厳密である限り、低レベルのチロシンが許容され得る。当業者は、十分な選択厳密性を得るために、所望のチロシンレベルを容易に決定することができるであろう。

１つ以上の外因性核酸によって供給される酵素分子は、フェニルアラニンをチロシンに変換する活性を提供するため、フェニルアラニンに対する宿主細胞の正常な要件を満たすように、追加のフェニルアラニンで培養培地を補充し、チロシン産生のための前駆体を提供することが望ましい場合がある。したがって、細胞の集団は、生存または増殖に必要なレベルのチロシンの存在下で培養される生産細胞の生存または増殖に必要なレベルよりも高いレベルのフェニルアラニンの存在下で培養され得る。したがって、いくつかの実施形態では、フェニルアラニンは、少なくとも０．０３５ｇ／Ｌのレベルで（例えば、培養の一部として、および／または培養培地の構成要素として）提供される。したがって、細胞は、少なくとも２、３、または４ｍＭのレベルのフェニルアラニンの存在下で培養され得る。高レベルのフェニルアラニンは細胞増殖を阻害することができるため、典型的には、フェニルアラニンのレベルは、１０ｍＭ未満、例えば、９、８、７、または６ｍＭ未満である。

ＣＨＯ ＰＡＨ酵素の場合、一実施形態では、培養培地におけるフェニルアラニンレベルは、２～９ｍＭ、例えば、２または３ｍＭ～６または７ｍＭのフェニルアラニンであることが好ましいが、ヒトＰＡＨ酵素の場合、一実施形態では、好ましい範囲は、４～９ｍＭのフェニルアラニンである。

細胞は、より高いレベルのフェニルアラニンに調整することができるように、適応ステップに供され得る。このステップは、細胞培養培地におけるフェニルアラニンの１つ以上の次第に高くなる濃度で、例えば、１回または２回の継代には３ｍＭ、次いで最終的な所望の濃度、例えば、６ｍＭで細胞を継代することを伴い得る。これは、例えば、細胞が増殖期の前に回復しているように、トランスフェクションの前またはトランスフェクションの後に行うことができる。

いくつかの実施形態では、フェニルアラニンのレベルは、培養物におけるフェニルアラニンのレベルを検出および／または監視し、検出されたレベルが閾値未満であることに応答して、フェニルアラニンを提供する（例えば、検出されたレベルが閾値以上になるまで）自動調整システムを使用して確立および／または維持される。いくつかの実施形態では、そのような自動調整システムは、分光法（例えば、ラマン分光法）を利用して、フェニルアラニンのレベルを検出および／または監視する。同様の考慮事項は、追加の選択マーカーが使用される場合にも適用される。

２つの選択マーカー（例えば、本発明の選択系およびＧＳ選択系）が使用される場合、関連するベクターを同時に導入してもよく、細胞培養培地は、例えば、上述のように、両方の種類のマーカーに対して厳密な選択、すなわち、チロシンおよびグルタミンを欠き、任意選択でフェニルアラニンで補充された培地を提供するように調合されてもよい。あるいは、選択は、第１のマーカーの厳密な条件下で、１つのベクター系を導入および選択し、次いで、得られる選択細胞を、第２のマーカー、および任意選択で第１のマーカーの厳密な条件下で、例えば、チロシンおよびグルタミンを欠き、任意選択でフェニルアラニンで補充された培地でトランスフェクト／形質転換する、２ステッププロセスであってもよい。あるいは、第２のマーカーについて後で選択する場合、第１のマーカーに対してあまり厳密でない条件が使用され得る。上述の培養条件は、この２つの選択マーカー手順（および追加のマーカーを使用する場合）に準用される。

導入された核酸配列を含有する生産細胞の機能的特徴
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、チロシン栄養要求性選択マーカー（例えば、ＰＡＨ酵素分子をコードする第１の外因性核酸およびＧＣＨ１酵素分子をコードする第２の外因性核酸）を含み、低下したレベルのチロシンを含む（例えば、チロシンの不在下の）培養培地において増殖および／または分裂することができる。そのような細胞は、本明細書では生産細胞とも称される。増殖および／または分裂する能力は、当業者に既知であり、本明細書に記載の方法によって評価することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、０．０１ｇ／Ｌ未満、または５０、２０、または１０μＭ未満のチロシンを含む、例えば、チロシンの不在下の培養培地において増殖および／または分裂することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、チロシンを欠く培養培地で増殖および／または分裂することができる。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、選択マーカー（例えば、ＰＡＨ酵素分子をコードする第１の外因性核酸およびＧＣＨ１酵素分子をコードする第２の外因性核酸を含む、チロシン栄養要求性選択マーカー）と関連付けられた主題の核酸を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、主題の核酸の少なくとも閾値のコピー数（例えば、産物を効率的に産生するのに十分なコピー数）、例えば、主題の核酸の少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、または５００のコピーを含む。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＰＡＨ酵素分子をコードする第１の外因性核酸と、ＧＣＨ１酵素分子をコードする第２の外因性核酸と、を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、第１の外因性核酸の少なくとも閾値のコピー数（例えば、宿主細胞が、低下したレベルで（例えば、チロシンの不在下で）増殖および／または分裂するのに十分なコピー数、例えば、第１の外因性核酸の少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、または５００のコピー）を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、第２の外因性核酸の少なくとも閾値のコピー数（例えば、宿主細胞が、低下したレベルで（例えば、チロシンの不在下で）増殖および／または分裂するのに十分なコピー数）、例えば、第２の外因性核酸の少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、または１０，０００のコピーを含む。

いくつかの実施形態では、主題の核酸は、例えば、選択マーカー（例えば、ＰＡＨ酵素分子をコードする第１の外因性核酸と、ＧＣＨ１酵素分子をコードする第２の外因性核酸と、を含む、チロシン栄養要求性マーカー）とのその関連に起因して、指定された間隔にわたって宿主細胞（例えば、またはその娘細胞もしくは子孫）に存続する。いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸は、宿主細胞（例えば、またはその娘細胞、子孫、世代、もしくは集団倍加）に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月間存続する（および任意選択で、無期限に存続する）。いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸は、宿主細胞（例えば、またはその娘細胞もしくは子孫）に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、または３００の細胞分裂の間、存続する（および任意選択で、無期限に存続する）。いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸は、宿主細胞（例えば、またはその娘細胞、子孫、世代、もしくは集団倍加）に、例えば、本明細書に記載のバイオリアクターの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、または３００の宿主サイクル、集団倍加、または世代数の間、存続する（および任意選択で、無期限に存続する）。いくつかの実施形態では、第２の外因性核酸は、宿主細胞（例えば、またはその娘細胞、子孫、世代、または集団倍加）に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月間存続する（および任意選択で無期限に存続する）。いくつかの実施形態では、第２の外因性核酸は、宿主細胞（例えば、またはその娘細胞、子孫、世代、もしくは集団倍加）に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、または３００の細胞分裂の間、存続する（および任意選択で、無期限に存続する）。いくつかの実施形態では、第２の外因性核酸は、宿主細胞（例えば、またはその娘細胞、子孫、世代、もしくは集団倍加）に、例えば、本明細書に記載のバイオリアクターの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０の宿主サイクル、集団倍加、または世代数の間、存続する（および任意選択で、無期限に存続する）。いくつかの実施形態では、第１の外因性核酸は、宿主細胞が低下したレベルのチロシンを含む（例えば、チロシンを含まない）培地中で維持される限り、宿主細胞（例えば、またはその娘細胞、子孫、世代、もしくは集団倍加）に存続する。いくつかの実施形態では、第２の外因性核酸は、宿主細胞が低下したレベルのチロシンを含む（例えば、チロシンを含まない）培地中で維持される限り、宿主細胞（例えば、またはその娘細胞、子孫、世代、もしくは集団倍加）に存続する。いくつかの実施形態では、宿主細胞における第１、第２、または第１および第２の外因性核酸の存続は、機能的に、例えば、宿主細胞が低下したレベルのチロシンを含む（例えば、チロシンを含まない）培地中で増殖し、産物を産生するかどうかによって評価される。いくつかの実施形態では、宿主細胞における第１、第２、または第１および第２の外因性核酸の存続は、ＲＴ－ＰＣＲを使用することによって評価される（例えば、確認される）。

いくつかの実施形態では、チロシン栄養要求性選択マーカー（例えば、ＰＡＨ酵素分子をコードする第１の外因性核酸、およびＧＣＨ１酵素分子をコードする第２の外因性核酸）を含む宿主細胞は、低下したレベルのチロシンを含む（例えば、チロシンの不在下の）培養培地中で、チロシン栄養要求性選択マーカーを含まない他の類似の細胞よりも速く増殖および／または分裂する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、低下したレベルのチロシンを含む（例えば、チロシン不在下の）培養培地中で、チロシン栄養要求性選択マーカーを含まない類似の細胞よりも、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００％速く、または１０倍、１０^２倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、または１０^６倍速く増殖および／または分裂する。

いくつかの実施形態では、酵素分子をコードする外因性核酸（例えば、ＰＡＨ酵素分子をコードする第１の外因性核酸およびＧＣＨ１酵素分子をコードする第２の外因性核酸）（および任意選択で、当該外因性核酸と関連付けられる主題の核酸）を含む選択マーカーを含む宿主細胞は、外因性核酸および／または主題の核酸を欠く細胞と比較して、上昇した酵素分子活性を示す。いくつかの実施形態では、酵素分子活性のレベルは、酵素分子および／または関連付けられた主題の核酸をコードする外因性核酸を欠く細胞において検出可能な酵素分子活性に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、５００％、１０００％以上増加する。いくつかの実施形態では、活性が上昇した細胞は、酵素分子および／または関連付けられた主題の核酸をコードする外因性核酸を欠く細胞よりも速く増殖し得る。いくつかの実施形態では、細胞増殖および／または分裂の速度は、酵素分子および／または関連付けられた主題の核酸をコードする外因性核酸を欠く類似の培地条件下の類似の細胞に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、５００％、１０００％以上増加する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、主題の核酸および／または酵素分子をコードする外因性核酸を欠く類似の細胞よりも、アミノ酸を欠く培地上で少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、５０００、または１０，０００倍速く増殖する。

宿主（生産）細胞を使用して組換え産物を作製する方法
本発明の宿主細胞は、生産細胞とも称され、導入された核酸によってコードされる産物を発現するために使用され得る。これらの生産細胞は、典型的には、第１、第２、および／または第３の外因性核酸（および任意選択で、複数のサブユニット産物を含む、２つ以上の目的の産物が産生される、本明細書に記載されるさらなる外因性核酸）で細胞内に安定的にトランスフェクトされ、生産細胞を作製する。代替的な実施形態では、宿主細胞は、第１、第２、および／または第３の外因性核酸で適切な細胞に一過性にトランスフェクトされてもよい。

組換え産物は、以下に記載の方法を考慮して、産物の産生に好適な当該技術分野で既知の任意の方法により、本発明の生産細胞を培養することによって発現され得る。いくつかの実施形態では、培養培地は、チロシンを欠くか、または０．０１ｇ／Ｌ以下または５０、２０、もしくは１０μＭ以下のレベルのチロシン（例えば、１つ以上の酵素分子および／または主題の核酸をコードする１つ以上の外因性核酸を含まない類似の細胞を培養するのに不十分なレベルのチロシン）を含む。いくつかの実施形態では、培養は、１つ以上の外因性核酸を含まない細胞（例えば、生産細胞と類似の細胞）の生存または増殖に必要なレベルよりも低いレベルのチロシンの存在下で、例えば、チロシンの不在下で、生産細胞を培養することを含む。組換え産物の発現中に生産細胞株に選択的圧力を加える必要がなくてもよいため、培養培地は、増殖期および産生期の間の様々な段階でチロシンを含有し得る。しかしながら、チロシンは溶解度が低いことに起因して細胞培養培地での取り扱いが困難であるため、細胞培養培地から完全に省略することが有利であり得る。

一方、チロシンが不在（または低レベル）の場合、細胞はより多くのフェニルアラニンを消費するため、供給溶液などの使用される様々な培地は、フェニルアラニンで補充され得る。例えば、フェニルアラニンは、少なくとも０．０３５ｇ／Ｌのレベルで含まれ得る。したがって、いくつかの実施形態では、フェニルアラニンは、少なくとも０．０３５ｇ／Ｌのレベルで（例えば、培養の一部として、および／または培養培地の構成要素として）提供される。したがって、細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９ｍＭのレベルのフェニルアラニンの存在下で培養され得る。高レベルのフェニルアラニンは細胞増殖を阻害することができるため、典型的には、フェニルアラニンのレベルは、１０ｍＭ未満、例えば、９、８、７、または６ｍＭ未満である。

ＣＨＯ ＰＡＨ酵素の場合、一実施形態では、培養培地におけるフェニルアラニンレベルは、２～９ｍＭ、例えば、２または３ｍＭ～６または７ｍＭのフェニルアラニンであることが好ましいが、ヒトＰＡＨ酵素の場合、一実施形態では、好ましい範囲は、４～９ｍＭのフェニルアラニンである。我々の結果は、切断ヒトＰＡＨ酵素が、細胞培養培地にフェニルアラニンを補充すると、優れた細胞性能を提供することを示す。

細胞は、より高いレベルのフェニルアラニンに調整することができるように、適応ステップに供され得る。一実施形態では、細胞は、フェニルアラニン補充培地で増殖するように、選択段階中にすでに適応されている。あるいは、これは、例えば、Ｎバイオリアクターへの接種材料を産生するＮ－１バイオリアクターにおける産生段階または産生前段階で行われ得る。再び、適応はフェニルアラニンの濃度が増加した状態で他の期間行われ得るか、または細胞はすでに補充の最終レベルで細胞培養培地に播種され得る。

いくつかの実施形態では、フェニルアラニンのレベルは、培養物におけるフェニルアラニンのレベルを検出および／または監視し、検出されたレベルが閾値未満であることに応答して、フェニルアラニンを提供する（例えば、検出されたレベルが閾値以上になるまで）自動調整システムを使用して確立および／または維持される。いくつかの実施形態では、そのような自動調整システムは、分光法（例えば、ラマン分光法）を利用して、フェニルアラニンのレベルを検出および／または監視する。同様の考慮事項は、追加の選択マーカーが使用される場合にも適用される。

実施形態では、細胞培養は、バッチ培養、供給バッチ培養、短縮供給バッチ過増殖（ａＦＯＧ）、ドローアンドフィル培養、連続培養、または灌流培養を含む半連続培養として実施される。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、連続的または半連続的に動作することが可能であるか、または動作するように構成される。一実施形態では、細胞培養は、懸濁培養である。一実施形態では、細胞または細胞培養は、組換えポリペプチドの発現のためにインビボに配置され、例えば、モデル生物またはヒト対象に配置される。いくつかの実施形態では、細胞培養は、固体マイクロキャリア（例えば、固体マイクロキャリアの表面上での増殖）、多孔質マイクロキャリア（例えば、マイクロキャリア上および／またはマイクロキャリア内での増殖）、または支持基質（例えば、マトリクス上および／またはマトリクス内での増殖）を利用する。いくつかの実施形態では、細胞培養は、灌流培養である。いくつかの実施形態では、細胞培養は、振盪される。いくつかの実施形態では、細胞培養は、マイクロ流体培養である。

一実施形態では、培養培地は、血清を含まない。血清不含、タンパク質不含、および化学的に定義された動物構成要素不含（ＣＤＡＣＦ）培地は、例えば、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販されている。

いくつかの実施形態では、脂質添加剤（例えば、コレステロール、オレイン酸、リノール酸、またはそれらの組み合わせを含む）を培養培地に添加することができる。

哺乳類細胞株に好適な培地および培養方法は、例えば、米国特許第５，６３３，１６２号に記載されているように、当該技術分野において周知である。実験用フラスコまたは低密度細胞培養のための、および特定の細胞型のニーズに適応されている標準的な細胞培養培地の例は、例えば、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地（Ｍｏｒｒｅ，Ｇ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，ｐ．５１９ ｆ．１９６７）、Ｌ－１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ，７８，１ｐ．１７３ ｆｆ，１９６３）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．５３，ｐ２８８ ｆｆ．１９６５）、またはアルブミン、トランスフェリン、およびレシチンを欠くイスコフ改変ＤＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．ｍｅｄ．１，ｐ．９２３ ｆｆ．，１９７８）である。例えば、ハムＦ１０またはＦ１２培地は、ＣＨＯ細胞培養のために特別に設計された。ＣＨＯ細胞培養に特別に適応された他の培地は、ＥＰ４８１ ７９１に記載されている。そのような培養培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、胎仔血清ＦＣＳとも呼ばれる）で補充されてもよく、後者は、多数のホルモンおよび増殖因子の天然の供給源を提供することが知られている。現在、哺乳類細胞の細胞培養は、科学教科書およびマニュアルに十分に記載されている日常的な操作であり、例えば、Ｒ．Ｉａｎ Ｆｒｅｓｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ，ａ ｍａｎｕａｌ，４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ／Ｎ．Ｙ．，２０００に詳細に網羅されている。本明細書に記載される細胞培養培地のいずれかは、特定のアミノ酸、例えば、細胞がチロシンなどの主題の核酸を取り込んだ場合に生合成が救済され得るアミノ酸を欠くように調合することができる。

他の好適な培養方法は、当業者に既知であり、組換えポリペプチド産物および利用される宿主細胞に依存し得る。細胞によって発現される組換えまたは治療用ポリペプチドの発現および産生に好適な条件を決定または最適化することは、当業者の技術の範囲内である。

一態様では、本開示は、ポリペプチド産物を作製または製造する方法を対象とし、方法は、ポリペプチド産物を採取することを含む。いくつかの実施形態では、採取は、例えば、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野で既知の方法によって、ポリペプチド産物を生産細胞および／または培養培地から分離することを含む。

培養は、異なる培養ステップを含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、培養ステップは、生産細胞を、第１の培養培地中、次いで第２の培養培地中で培養すること（すなわち、例えば、異なるレベルのチロシンおよび／またはフェニルアラニンを有し得る異なる培地を使用すること）を含む。

生産細胞は、様々な規模で任意の好適な容器中で培養され得る。工業生産のために、バイオリアクター、例えば、少なくとも１０リットル、例えば、少なくとも５０リットル、５０～８００リットル、または８００～２００，０００リットルの容積を有するバイオリアクターが使用され得る。バイオリアクターは、単回使用バイオリアクターであり得る。実施形態では、バイオリアクターは、バイオプロセス容器、シェル、少なくとも１つの撹拌器、少なくとも１つのスパージャ、スパージャおよびヘッドスペースの上敷きのための少なくとも１つのガスフィルタ入口ポート、少なくとも１つの充填ポート、少なくとも１つの採取ポート、少なくとも１つの試料ポート、および少なくとも１つのプローブを備える。バイオリアクターはまた、１つ以上のパラメータ、例えば、ｐＨ、溶存酸素分圧（ＤＯＴ）、フェニルアラニンレベル、および／または温度を監視および維持するためのプロセスおよびプローブを備え得る。バイオリアクターは、採取容器に動作可能に結合され得る。さらなる詳細および実施形態を以下の「用途」のセクションに提供する。

生産細胞による産物の生合成が十分な点に進むと、産物が採取され得、例えば、培養培地を取り出し、上清を細胞および細胞片から分離する。産物は、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、および／またはウイルス不活性化などの精製産物を得るために、１つ以上の精製／処理ステップに供されてもよい。産物はまた、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせて、例えば、緩衝液、界面活性剤、安定剤（トレハロース、スクロース、グリセロールなど）、アミノ酸（グリシン、ヒスチジン、アルギニンなど）、金属イオン／キレート剤、塩、および／または防腐剤のうちの１つ以上を含む調合された薬学的組成物などの組成物を産生し得る。

組換え産物
本明細書では、高収率の産物、例えば、ポリペプチド、例えば、治療用ポリペプチドを産生することができる生産細胞または細胞株を特定、選択、または培養するための組成物および方法、ならびに当該産物を産生するための方法が提供される。本開示に包含される産物には、例えば、細胞において発現されることによって産生され得る、分子、核酸（例えば、非コード核酸、例えば、非コードＲＮＡ分子、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、または長い非コードＲＮＡ、例えば、ＸｉｓｔまたはＨＯＴＡＩＲ）、ポリペプチド（例えば、組換えポリペプチドおよび／または治療用ポリペプチド）、またはそれらのハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は、操作または修飾されて、産物を産生する。そのような修飾は、産物の産生を制御するか、またはそれをもたらす分子を導入することを含む。例えば、細胞は、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を導入することによって修飾され、細胞は、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドの産生、例えば、発現および分泌に好適な条件下で培養される。別の例では、細胞が、例えば、未修飾細胞において、内因的に産生されるレベルまたは量よりも高いレベルまたは量のポリペプチドを産生するように、細胞は、細胞によって内因的に発現されるポリペプチドの発現を制御する、例えば、増加させる外因性核酸を導入することによって修飾される。実施形態では、本明細書に記載の方法によって特定、選択、または生成された細胞または細胞株は、医学的状態、障害、または疾患の治療に有用な産物、例えば、組換えポリペプチドを産生する。

ポリペプチド
いくつかの実施形態では、目的の産物は、１つ以上のポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドを含み、これは典型的には、異種ポリペプチド、すなわち、細胞によって天然に発現されない産物である。産物は、例えば、薬物スクリーニングに有用な治療用タンパク質または診断用タンパク質であり得る。治療用または診断用タンパク質は、抗体分子、例えば、抗体または抗体断片、融合タンパク質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、酵素、糖タンパク質、リポタンパク質、レポータータンパク質、治療用ペプチド、アプタマー、またはこれらのうちのいずれかの構造的および／もしくは機能的断片もしくはハイブリッドであり得る。一実施形態では、産物は、複数のポリペプチド鎖、例えば、重鎖および軽鎖を含む抗体または抗体断片を含む。

いくつかの実施形態では、産物は、抗体分子である。本明細書に包含される産物は、撮像技法に有用な診断用抗体分子、例えば、モノクローナル抗体またはその抗体断片、および対象への投与に好適な、例えば、疾患または障害の治療に有用な治療用抗体分子である。抗体分子は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列である。実施形態では、抗体分子は、完全長抗体または抗体断片である。抗体およびマルチフォーマットタンパク質は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、多鎖もしくは単鎖、または無傷の免疫グロブリンであり得、天然源または組換え源に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子の多量体、例えば、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であり得る。一実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、抗体分子は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性、三重特異性、または四重特異性抗体、例えば、ＢｉＴＥであるか、またはそれを含む。

「抗体断片」は、無傷の抗体、またはその組換えバリアントの少なくとも１つの部分を指し、抗原結合ドメイン、例えば、無傷の抗体の抗原決定可変領域を指し、これは、抗体断片の、抗原などの標的への認識および特異的結合を付与するのに十分である。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、線状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）などの単一ドメイン抗体、ラクダ科ＶＨＨドメイン、およびヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片などの抗体断片から形成された多重特異性抗体、ならびに抗体の単離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されない。抗原結合断片は、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ、およびビス－ｓｃＦｖに組み込むこともできる（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６，２００５を参照されたい）。抗原結合断片はまた、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づいて足場に移植され得る（フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号を参照されたい）。

目的のポリペプチドの例としては、以下に列挙されるものが挙げられるが、これらに限定されない：
ホルモン：エリスロポエチン、エポエイン－α、ダルベポエチン－α、成長ホルモン（ＧＨ）、ソマトトロピン、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ルトロピン－α、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、インスリン。
血餅／凝固因子：第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ－ＩＩＩ）、プロテインＣ濃縮物
サイトカイン／増殖因子：Ｉ型アルファ－インターフェロン、インターフェロン－αｎ３（ＩＦＮαｎ３）、インターフェロン－β１ａ（ｒＩＦＮ－β）、インターフェロン－β１ｂ（ｒＩＦＮ－β）、インターフェロン－γ１ｂ（ＩＦＮγ）、アルデスロイキン（インターロイキン２（ＩＬ２）、表皮胸腺細胞活性化因子；ＥＴＡＦ、パリフェルミン（角化細胞増殖因子；ＫＧＦ）、ベカプルミン（血小板由来増殖因子；ＰＤＧＦ）、アナキンラ（組換えＩＬ１アンタゴニスト）。

抗体：ベバシズマブ（ＶＥＧＦＡ ｍＡｂ）、セツキシマブ（ＥＧＦＲ ｍＡｂ）、パニツムマブ（ＥＧＦＲ ＭＡｂ）、アレムツズマブ（ＣＤ５２ ｍＡｂ）、リツキシマブ（ＣＤ２０キメラＡｂ）、トラスツズマブ、アダリムマブ、インフリキシマブ、トシツモマブ、アクリツモマブ、ラニビズマブ、アブシキシマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ナタリズマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、エクリズマブ。

ワクチン抗原：Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＰＶ抗原、ＨＩＶ抗原、インフルエンザ抗原。

その他：アルブミン、抗アカゲザル（Ｒｈ）免疫グロブリンＧ、エンフビルチド、クモ絹タンパク質、例えば、フィブリオン、ボツリヌス毒素Ａ型、アルグルセラーゼ、イミグルセラーゼ、組換えヒトヒアルロニダーゼ、パリフェルミン、アナキンラ、ドルナーゼアルファ、合成ブタセクレチン。

目的の組換えポリペプチドは、多重特異性タンパク質、例えば、二重特異性抗体であってもよく、ＢｓＩｇＧ（Ｔｒｉｏｍａｂ）、ＢｉＴＥ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＢなどのその多くの形式が利用可能である。

いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、細胞によって、および／または本明細書に記載の方法により産生される）は、がん細胞によって発現される抗原である。いくつかの実施形態では、組換えまたは治療用ポリペプチドは、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原である。いくつかの実施形態では、組換えまたは治療用ポリペプチドは、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、９－Ｏ－アセチル－ＧＤ３、βｈＣＧ、Ａ３３抗原、ＣＡ１９－９マーカー、ＣＡ－１２５マーカー、カルレティキュリン、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ６３、ＣＤ７０、ＣＣ１２３、ＣＤ１３８、がん胚抗原（ＣＥＡ；ＣＤ６６ｅ）、デスモグレイン４、Ｅ－カドヘリンネオエピトープ、エンドシアリン、エフリンＡ２（ＥｐｈＡ２）、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥｒｂＢ２、胎児アセチルコリン受容体、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ガングロシドＧＤ３、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、糖タンパク質１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、インスリン様増殖因子受容体１、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、ＬＧ、Ｌｙ－６、黒色腫特異的コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＣＰ）、メソセリン、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５_ＡＣ、ＭＵＣ５_Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管阻害性物質（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、形質細胞抗原、ポリＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＳＡＳ、ＳＴＥＡＰ、ｓＴｎ抗原、ＴＮＦ－アルファ前駆体、およびそれらの組み合わせから選択される。

いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、細胞によって、および／または本明細書に記載の方法により産生される）は、活性化受容体であり、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、α_４β_１インテグリン、β_２インテグリン、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ９６、ＣＤｌＯＯ、ＣＤ１６０、ＣＤ１３７、ＣＥＡＣＡＭｌ（ＣＤ６６）、ＣＲＴＡＭ、ＣＳｌ（ＣＤ３１９）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＫＩＲの活性化形態、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、１つ以上の天然の細胞傷害性受容体、ＮＴＢ－Ａ、ＰＥＮ－５、およびそれらの組み合わせから選択され、任意選択で、β_２インテグリンは、ＣＤ１１ａ－ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ－ＣＤ１８、またはＣＤ１１ｃ－ＣＤ１８を含み、任意選択で、ＫＩＲの活性化形態は、ＫｌＲ２ＤＳｌ、ＫＩＲ２ＤＳ４、またはＫＩＲ－Ｓを含み、任意選択で、天然の細胞傷害性受容体は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、またはＮＫｐ８０を含む。

いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、細胞によって、および／または本明細書に記載される方法により産生される）は、阻害性受容体であり、ＫＩＲ、ＩＬＴ２／ＬＩＲ－ｌ／ＣＤ８５ｊ、ＫＩＲの阻害形態、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ－１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＲ－Ｐ１Ａ、Ｓｉｇｌｅｃ－３、Ｓｉｇｌｅｃ－７、Ｓｉｇｌｅｃ－９、およびそれらの組み合わせから選択され、任意選択で、ＫＩＲの阻害形態は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、またはＫＩＲ－Ｌを含む。

いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、細胞によって、および／または本明細書に記載の方法により産生される）は、活性化受容体であり、ＣＤ３、ＣＤ２（ＬＦＡ２、ＯＸ３４）、ＣＤ５、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２２６、ＣＤ２２９（Ｌｙ９、ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（２Ｂ４、ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ３１９（ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ）、ＣＤ３５２（Ｌｙｌ０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＲＴＡＭ（ＣＤ３５５）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴβＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０、ＳＬＡＭＦ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδγ、ＴＩＭ１（ＨＡＶＣＲ、ＫＩＭ１）、およびそれらの組み合わせから選択される。

いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えば、細胞によって、および／または本明細書に記載の方法により産生される）は、阻害性受容体であり、ＰＤ－１（ＣＤ２７９）、２Ｂ４（ＣＤ２４４、ＳＬＡＭＦ４）、Ｂ７１（ＣＤ８０）、Ｂ７Ｈｌ（ＣＤ２７４、ＰＤ－Ｌ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５、ＮＫ２８）、ＣＤ３５２（Ｌｙ１０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５８（ＤＲ６）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、ＰＤ－１Ｈ（ＶＩＳＴＡ）、ＴＩＧＩＴ（ＶＳＩＧ９、ＶＳＴＭ３）、ＴＩＭ２（ＴＩＭＤ２）、ＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２、ＫＩＭ３）、およびそれらの組み合わせから選択される。

他の組換えタンパク質産物（例えば、細胞によって、および／または本明細書に記載の方法により産生される）としては、非抗体足場または代替的なタンパク質足場、例えば、限定されないが、ＤＡＲＰｉｎｓ、アフィボディ、およびアドネクチンが挙げられる。そのような非抗体足場または代替的なタンパク質足場は、１つまたは２つ以上、例えば、１、２、３、４、または５以上の異なる標的または抗原を認識または結合するように操作され得る。

用途
本開示は、とりわけ、生産細胞、生産細胞を使用してポリペプチド産物を作製または製造する方法、細胞（例えば、生産細胞）を特定、選択、および／または培養する方法、ならびに生産細胞を作製または産生する方法を特徴とする。本明細書に開示される細胞を特定、選択、および／または培養する方法を使用して、様々な産物を産生するのに有用な細胞、例えば、生産細胞を生成する、様々な細胞株を評価する、あるいはバイオリアクターまたは処理容器もしくは槽で、より一般的には任意の供給源とともに使用するための様々な細胞株の産生を評価することができる。本明細書に記載の組成物および方法は、例えば、原核および／または真核細胞株を含む任意の所望の細胞株を培養するのに好適である。さらに、実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、浮遊細胞または足場依存性（接着）細胞の培養に好適であり、ポリペプチド産物、核酸産物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、エクソソーム、小胞、または細胞および／もしくはウイルス（細胞および／またはウイルス療法で、またはワクチンとして使用されるものなど）などの医薬品および生物医薬品の産生のために構成される産生作業に好適である。

実施形態では、細胞、例えば、生産細胞は、治療用または診断用組換え産物などの産物を発現または産生する。以下でより詳細に記載されるように、細胞によって産生される産物の例としては、抗体分子（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体）、抗体模倣物（抗原に特異的に結合するが、例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アドネクチン、またはＩｇＮＡＲなどの抗体と構造的に関連しないポリペプチド分子）、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の組換えタンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質、酵素、ホルモン）、ウイルス治療薬（例えば、抗がん腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子療法およびウイルス免疫療法のためのウイルスベクター）、細胞治療薬（例えば、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、および成体幹細胞）、ワクチンもしくは脂質被包性（ｌｉｐｉｄ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）粒子（例えば、エクソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡなど）もしくはＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡなど）、抗生物質、またはアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、バイオシミラーを産生するために使用され得る。

言及されるように、実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、真核細胞、例えば、哺乳類細胞もしくは下等真核細胞、例えば、酵母細胞もしくは糸状菌細胞、または原核細胞、例えば、グラム陽性細胞もしくはグラム陰性細胞、および／または真核細胞もしくは原核細胞の産物、例えば、タンパク質、ペプチド、抗生物質、アミノ酸、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡなど）の産生を可能にし、これらは、真核細胞によって大規模な方法で合成される。本明細書に別段の記載がない限り、本明細書に記載の組成物および方法は、ベンチ規模、パイロット規模、および完全生産規模能力を含むがこれらに限定されない、任意の所望の容積または生産能力を含むことができる。

さらに、および本明細書に別段の記載がない限り、本明細書に記載の組成物および方法は、撹拌槽、気泡ポンプ、ファイバー、マイクロファイバー、ホローファイバー、セラミックマトリクス、流動床、固定床、および／または噴流床（ｓｐｏｕｔｅｄ ｂｅｄ）バイオリアクターを含むが、これらに限定されない任意の好適な反応器とともに、固体または多孔質のマイクロキャリアまたは支持体を使用するか、または使用しないで使用することができる。本明細書で使用する場合、「反応器」は、発酵器もしくは発酵ユニット、または任意の他の反応容器を含むことができ、「反応器」という用語は、「発酵器」と同義に使用される。例えば、いくつかの態様では、バイオリアクターユニットは、以下：栄養素および／または炭素源の供給、好適な気体（例えば、酸素）の注入、発酵または細胞培養培地の流入量および流出量、気体相および液体相の分離、温度の維持、酸素およびＣＯ_２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）（例えば、撹拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ））、ならびに／または洗浄／滅菌のうちの１つ以上またはすべてを行うことができる。発酵ユニット等の例示的な反応器ユニットは、ユニット内に複数の反応器を含んでもよく、例えば、ユニットは、各ユニット内に１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、もしくは１００個、またはそれ以上のバイオリアクターを有してもよく、および／または施設は、施設内に単一または複数の反応器を有する複数のユニットを含んでもよい。様々な実施形態では、バイオリアクターは、バッチ、半供給バッチ、供給バッチ、灌流、および／または連続発酵プロセスに好適であり得る。任意の好適な反応器直径が使用され得る。実施形態では、バイオリアクターは、約１００ｍｌ～約５０，０００Ｌの容積を有し得る。非限定的な例としては、１０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２５０ｍｌ、５００ｍｌ、７５０ｍｌ、１リットル、２リットル、１０リットル、５０リットル、１００リットル、５００リットル、１０００リットル、２０００リットル、５０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、および／または５０，０００リットルの容積、またはおよそのそれらの容積が挙げられる。臨床的または商業的使用のために十分な製品を作製するために必要とされる工業規模の製造の文脈において、容積は、典型的には、少なくとも１０リットルである。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、マイクロ流体培養物を増殖させるように構成される。さらに、好適な反応器は、複数使用、単一使用、使い捨て、または廃棄不要であり得、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌまたは任意の他の好適なステンレス鋼）およびＩｎｃｏｎｅｌなどの金属合金、プラスチック、ならびに／またはガラスを含む任意の好適な材料で形成することができる。いくつかの実施形態では、好適な反応器は、円形、例えば、円筒形であり得る。いくつかの実施形態では、好適な反応器は、正方形、例えば、長方形であり得る。正方形の反応器は、いくつかの場合では、使用の容易さ（例えば、当業者による充填および設定）、反応器内容物のより良い混合および均質性、ならびに低い床設置面積など、円形反応器よりも利点をもたらし得る。

実施形態では、および本明細書に別段の記載がない限り、本明細書に記載の組成物および方法は、特に言及されていない任意の好適なユニット操作および／または機器、例えば、そのような産物の分離、精製、および単離のための操作および／または機器とともに使用することができる。従来の現場組み立て（ｓｔｉｃｋ－ｂｕｉｌｔ）設備、モジュール式、移動式、および仮設の設備、または任意の他の好適な建設、設備、および／もしくはレイアウト等、任意の好適な設備および環境を使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、モジュール式クリーンルームを使用することができる。加えて、および別段の記載がない限り、本明細書に記載の組成物および方法は、単一の場所または設備において収容および／もしくは行うことができるか、または代替的に別個のもしくは複数の場所および／もしくは設備で収容および／もしくは行うことができる。

非限定的な例として、および限定されないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１３／０２８０７９７号、第２０１２／００７７４２９号、第２０１１／０２８０７９７号、第２００９／０３０５６２６号、ならびに米国特許第８，２９８，０５４号、第７，６２９，１６７号、および第５，６５６，４９１号は、本明細書に記載の組成物および方法との使用に好適であり得る例示的な設備、機器、および／またはシステムを記載する。

本明細書に記載の組成物および方法は、宿主細胞に関する上記のセクションに記載される広範囲の細胞を利用することができる。好ましい実施形態では、哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞株である。例としては、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ ＦＵＴ８ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、およびＣＨＯ由来細胞が挙げられる。ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ（登録商標）ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）ある。

一実施形態では、真核細胞は、例えば、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ属（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、およびＰｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属（例えば、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ、またはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｃａｎｄｉｄａ属（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｃａｏｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属（例えば、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅなどの下等真核細胞である。種Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株の例は、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ、およびＣＢＳ７４３５である。

実施形態では、培養された細胞は、治療的使用のために、タンパク質、例えば、抗体、例えば、モノクローナル抗体、および／または組換えタンパク質を産生するために使用される。実施形態では、培養された細胞は、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸、または他の有用な生化学中間体もしくは代謝産物を産生する。例えば、実施形態では、約４０００ダルトン～約１４０，０００ダルトンを超える分子量を有する分子を生成することができる。実施形態では、これらの分子は、様々な複雑さを有し得、グリコシル化を含む翻訳後修飾を含み得る。

本発明は、非限定的である以下の例を参照して、さらに例示される。

実施例１：材料および方法
細胞培養
懸濁液Ｌｏｎｚａ ＣＨＯＫ１ＳＶ（登録商標）ＧＳ－ＫＯ（登録商標）細胞を、６ｍＭのＬ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｇ８５４０）で補充されたＣＤ－ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ １０７４３－０２９）中で維持した。これらを、３７℃、１４０ｒｐｍで、５％ＣＯ_２雰囲気中でインキュベートした。細胞を、１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中に２０ｍｌ中０．２×１０^６生細胞／ｍｌで播種し、これらを３～４日ごとに継代した。

復帰アッセイ
Ｌｏｎｚａ ＣＨＯＫ１ＳＶ（登録商標）ＧＳ－ＫＯ（登録商標）細胞を、９６ウェルプレート中の２００μｌ培地に、ウェル当たり５０００個の生細胞で播種し、１１日後および３週間後に増殖について分析した。チロシンなしのＣＤ ＣＨＯ、およびチロシンなしだが、６ｍＭのＬ－グルタミンで補充されたＬｏｎｚａ ＣＭ７６（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｐｌｃ）を、試験培地として使用した。７．２×１０^６生細胞を、ＣＭ７６チロシンなし培地で試験し、２．４×１０^６細胞を、ＣＤ ＣＨＯチロシンなし培地で試験した。完全培地（ＣＤ－ＣＨＯ＋Ｌ－ｇｌｕｔ）を陽性対照として使用し、一方、Ｌ－グルタミンなしの培地（ＣＤ－ＣＨＯのみ）を陰性対照として使用した。

安定した細胞株を作製するためのプラスミドおよびトランスフェクション

切断ＰＡＨ配列は、調節ドメインを含有するＮ末端の１１６個のアミノ酸の欠失を有する（Ｄａｕｂｎｅｒ ＳＣ ｅｔ ａｌ．，１９９７、同書）。ＰＡＨの様々なドメインを図１に示す。

プラスミドを、ＰｖｕＩ（ＮＥＢ、Ｒ３１５０Ｌ）で線状化し、エタノール沈殿プロトコルを使用して精製した。エレクトロポレーションは、Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌエレクトロポレーターで実施した。１００μｌのＴＥ緩衝液および１×１０^７生Ｌｏｎｚａ ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ細胞／７００μｌのＣＭ７６チロシンなし（＋６ｍＭのＬ－ｇｌｕｔ）培地中の２０μｇの線状化プラスミドをエレクトロポレーションキュベットに添加した。ＤＮＡ細胞ミックスを、０．４ｍｍのキュベット直径で、３００Ｖおよび９００μＦでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直後に、１ｍｌの予熱培地をキュベットに添加した。次いで、細胞を、Ｔ２５フラスコ中の２×５ｍｌのＣＭ７６チロシンなし（＋６ｍＭのＬ－ｇｌｕｔ）培地に移した。フラスコを、５％ＣＯ_２ガス環境で静的インキュベーター内で、３７℃でインキュベートした。２４時間後、追加の５ｍｌのＣＭ７６チロシンなし（＋６ｍＭのＬ－ｇｌｕｔ）培地を、Ｔ２５フラスコに添加した。細胞数は、トランスフェクションの成功を評価するために、トランスフェクションの２１日後にＶｉＣｅｌｌ機器を使用して実施した。トランスフェクションが成功したことのさらなる確認は、ｅＧＦＰ発現について、顕微鏡下（ＧＦＰ２フィルタを備えたＬｅｉｃａ ＭＺＦＬＩＩＩ、×１００倍率）で、Ｔ２５フラスコ内で増殖する細胞を可視化することによって行った。

増殖曲線プロファイルおよび培養生存率
細胞を、１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに２０ｍｌ中０．２×１０^６細胞／ｍｌで播種し、５％ＣＯ_２環境で、１４０ｒｐｍ、３７℃で振盪した。０．２ｍｌの試料と０．８ｍｌの予熱ＰＢＳを使用して、生細胞濃度および細胞直径を決定したＶｉＣｅｌｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）機器を使用して、実施例の図に示される日数にわたって４８時間ごとに読み取り値を記録した。

ＦＡＣＳ
１×１０^５細胞を、１，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離機でペレット化し、３５０μｌのＰＢＳに再懸濁した。次いで、試料を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプローブにロードし、細胞数との関連で蛍光強度を測定した。前方散乱（ＦＳＣ）を、Ｅ－１増幅器を使用して測定し、側方散乱（ＳＳＣ）を４６５に設定したが、ＦＬ１は細胞を４７３で記録し、すべての設定を対数スケールに変換した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット
１×１０^６細胞を、１０００ｒｐｍで５分間、遠心分離機でペレット化し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、ｐＨ７．２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａ β－グリセロリン酸、５０ｍＭのＮａＦを含む０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ－Ｐ４０、１ｍＭの活性化されたＮａ_３ ＶＯ_４、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、２μｇ／ｍｌのペプスタチン、および使用直前に添加される０．２ｍＭのＰＭＳＦからなる１００μｌの氷冷溶解緩衝液中で溶解した。

１０μｇの還元されたタンパク質試料または１０μｌの非還元上清試料を、１０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥアクリルアミドゲル上で実行し、ニトロセルロース上へのウエスタン転移を、以前に記載されているように行った（Ｒｏｏｂｏｌ，Ｃａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，ＦＥＢＳ Ｊ．２７６：２８６－３０２）。抗体は、Ｓｉｇｍａ（抗ＧＣＨ１、ＳＡＢ１４０５８５８－５０μｇ、抗ＰＡＨ、ＨＰＡ０３１６４２、抗ＧＳ Ｇ２７８１、抗Ｂ－アクチンＡ５４４１、抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）Ｉ９７６４）、およびＣＲＵＫ（ｅＧＦＰ ３Ｅ１）から供給された。抗チューブリン（Ｗｏｏｄｓ，Ｓｈｅｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．９３：４９１－５００）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫのＫｅｉｔｈ Ｇｕｌｌ教授からの寄与であったが、抗Ｌ７ａは、ヒトＬ７ａのＮ末端配列に対して生成された（Ｒｏｏｂｏｌ ａｎｄ Ｃａｒｄｅｎ，１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７８（１）：２１－３２）。細胞溶解物タンパク質の免疫ブロット検出のための二次抗体は、抗全ＩｇＧ（マウスまたはウサギ）－ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）、続いてＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）検出であった。

ｑＲＴＰＣＲ
ＲＮＡ抽出のために１×１０^６の生細胞を採取し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＲｅａｌＰｌｅｘサイクラー機器で、以下のプライマーセットを有するＱｉａｇｅｎ Ｑｕａｎｔｉｆａｓｔキットを使用して、ｍＲＮＡ量をｑＲＴＰＣＲにより決定した；ＰＡＨ（ｑｒｔＰＡＨｔｏｔｆｗｄ ＣＡＴＣＡＡＧＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧ（配列番号７）およびｑｒｔＰＡＨｔｏｔｒｖｓ ＧＧＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＴＧＡＣＡＴ（（配列番号８））、ＧＣＨ１（ＧＣＨ１フォワード：ＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＧＧ（配列番号９）；ＧＣＨ１リバース：ＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＣＴＴＧＣＴＴＧＴＴ（配列番号１０））、およびβ－アクチン（ＣＨＯｂａｃｔｑＦ ａｇｃｔｇａｇａｇｇｇａａａｔｔｇｔｇｃｇ（配列番号１１）およびＣＨＯｂａｃｔｑＲ ＧＣＡＡＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＣ ＡＴＴ（配列番号１２）。

実施例２：チロシンを含まないが、６ｍＭのＬ－グルタミンを補充されたＣＭ７６またはＣＤ ＣＨＯ培地のいずれかで増殖させたＧＳＫＯ細胞の復帰アッセイ
この実施例は、チロシンの不在下で増殖することができない例示的な細胞を増殖させる場合に観察される低い復帰率を示す。

ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ（登録商標）宿主細胞を、チロシンを欠くが、６ｍＭのグルタミンで補充された培地中の９６ウェルプレートに播種した。陽性対照は、６ｍＭのグルタミンで補充された培地中で増殖するＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ（登録商標）宿主細胞であり、陰性対照はグルタミンを欠く培地であった。結果を以下の表２に示す。チロシンを欠く培地では、復帰コロニー／細胞増殖は観察されず、プレートは陰性対照と同様に見えた。これは、チロシン栄養要求性マーカーが、生産細胞における有用な選択マーカーであることを示唆する。

実施例３：チロシンの不在下での例示的な生産細胞の増殖
この実施例は、ＰＡＨおよびＧＣＨ １酵素分子をコードする外因性核酸を欠く細胞がチロシンの不在下で増殖しないことを示すが、ＰＡＨおよびＧＣＨ１酵素分子の両方をコードする外因性核酸を含むベクターＬＭＭ１７２またはＬＭＭ１７３を含有する例示的な生産細胞は、チロシンの不在下で増殖し、レポーター分子ｅＧＦＰを発現することが観察される。しかしながら、ＧＣＨ１とともに全長ＣＨＯ ＰＡＨを最初に試験したところ、チロシン不含培地におけるトランスフェクトされた細胞の回復が非常に遅かった（ＣＤ ＣＨＯ）か、またはＣＭ７６培地を使用した場合、まったく回復しなかった（データ示さず）ことが分かった。したがって、調節ドメインをコードするＮ末端の１１６個のアミノ酸が除去されたＰＡＨの切断型を試みた。

これらのプールを生成するために使用されるベクターは、ＰＡＨの切断型（カセット１、ＣＨＯ細胞またはヒトのいずれかに由来し、ＳＶ４０プロモーターによって駆動される配列を伴う最初の１１６個のアミノ酸が欠失したｔＰＡＨ）、ＧＣＨ１（ＳＶ４０プロモーターによって駆動されるカセット３）、およびｅＧＦＰ（ＣＭＶプロモーターによって駆動されるカセット２）を含有した。第１のカセットが、ＳＶ４０プロモーター（ベクターＬＭＭ１７０）によって駆動されるグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子を含有する２つの対照が含まれた。トランスフェクトされた対照を、チロシンの不在下（陰性対照）またはチロシンの存在下（陽性対照）のいずれかで増殖させた。

ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ（登録商標）宿主細胞を、線状化ベクターによるエレクトロポレーションを介してトランスフェクトし、その後、チロシンを含まないが、６ｍＭのグルタミンで補充された培地（チロシンも含んだ陽性対照を除く）で３週間培養した。

ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ（登録商標）宿主操作された細胞は、切断ＰＡＨおよびＧＣＨ １が共発現されたときにのみ、チロシン不含培地中で良好に増殖することが示された。加えて、これらの構成要素が個別にトランスフェクトされた場合、細胞はトランスフェクションを生存せず、チロシン不含培地で増殖しなかった（データ示さず）。したがって、切断ＰＡＨおよびＧＣＨ１酵素分子を含むＰＡＨ酵素分子の両方が、チロシンの不在下での例示的なＣＨＯ生産細胞の増殖を支持するために必要である。

図２は、フローサイトメトリーを使用して得られた、トランスフェクションおよび３週間の回復後の細胞集団からの平均蛍光のヒストグラムを示し、チロシン不含培地で増殖する細胞におけるｅＧＦＰの発現を確認する。切断ＣＨＯ細胞由来のＰＡＨ配列およびＧＣＨ１（ベクターＬＭＭ１７２）を含む例示的な生産細胞からの平均蛍光は、ＧＳ陽性対照（ベクターＬＭＭ１７０＋ｖｅ）からのものと同様であった。ＣＨＯ切断ＰＡＨ配列（ＬＭＭ１７２）を含有する生産細胞は、ヒト切断ＰＡＨ配列（ＬＭＭ１７３）と比較して、より高いＧＦＰ発現を示した。これは、ＰＡＨとＧＣＨ１との組み合わせ系を選択マーカーとして使用した場合、組換えタンパク質がｅＧＦＰを置き換えることができるモデルである。

実施例４：ＰＡＨタンパク質およびｍＲＮＡ量
この実施例は、ヒトＰＡＨおよびＧＣＨ１酵素分子をコードする外因性核酸を含むベクターＬＭＭ１７３を含有する例示的な生産細胞が、ＰＡＨタンパク質およびｍＲＮＡ発現ならびにｅＧＦＰタンパク質発現を示すことを示し、本実施例は、ＣＨＯ ＰＡＨおよびＧＣＨ１酵素分子をコードする外因性核酸を含むベクターＬＭＭ１７２を含有する例示的な生産細胞が、ＰＡＨ ｍＲＮＡ発現およびｅＧＦＰタンパク質発現を示すことをさらに示す。

図２の細胞プールからの溶解物のウエスタンブロット分析を行った。対照を、６ｍＭのグルタミンおよびチロシンを含有する培地で増殖させ、ＬＭＭ１７０細胞を、チロシンを含有するがグルタミンを含有しない培地で増殖させた。ＬＭＭ１７２およびＬＭＭ１７３を、６ｍＭのグルタミンで補充されたチロシン不含培地で増殖させた。チューブリンおよびＬ７ａを、ローディング対照として使用した。ＰＡＨ抗体は、ヒト切断ＰＡＨ（およそ３７および５０ｋＤａでのバンド）のみを検出し、ＣＨＯ切断ＰＡＨ（ＬＭＭ１７２）は検出されなかった（データ示さず）。ｅＧＦＰは、トランスフェクトされたベクターがカセット２にｅＧＦＰ遺伝子を含有した細胞プールにおいて発現されていることが確認された。

図３は、切断ＣＨＯ ＰＡＨの発現および切断ヒトＰＡＨ ｍＲＮＡの発現を検出したｑＲＴ－ＰＣＲデータを示す。切断ＣＨＯ ＰＡＨ ｍＲＮＡは、切断ヒトＰＡＨよりもはるかに多い量まで発現された。両方とも、対照よりも増加し、例示的な生産細胞における外因性ＰＡＨ ｍＲＮＡ発現を確認した。

実施例５：チロシン不在下での増殖プロファイルおよび培養生存率
この実施例は、ＣＨＯ ＰＡＨおよびＧＣＨ１酵素分子をコードする外因性核酸を含むベクターＬＭＭ１７２を含有する例示的な生産細胞が、チロシンの不在下で外因性核酸を含まない類似の細胞よりも高い生細胞濃度に増殖することが可能であり、培養生存期間が延長されることを示す。

図４は、実施例３および４に記載されるように生成された例示的な生産細胞プールの増殖データを示す。細胞プールを、チロシンまたはグルタミンの不在下で１８日間、１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコで培養した。２日ごとに細胞をサンプリングし、生細胞の数および培養生存率を、ＶｉＣｅｌｌ機器を使用して評価した。さらなる供給は導入しなかった。図４は、（Ａ）生細胞濃度、および（Ｂ）培養生存率を示す。ＣＨＯ細胞切断ＰＡＨ細胞プール（ＬＭＭ１７２）は、ヒト切断ＰＡＨ細胞プール（ＬＭＭ１７３）よりも高い細胞数に増殖し、より長い培養生存期間を有した。

実施例６：チロシンの不在下だが、追加のフェニルアラニンで補充された増殖の場合の例示的な生産細胞の増殖プロファイルおよび生細胞濃度
この実施例は、ＰＡＨおよびＧＣＨ１酵素分子をコードする外因性核酸を含む例示的な生産細胞の増殖および培養生存率の特徴を示す。

図５は、例示的な生産細胞プールの増殖データを示す。培養物を、１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコで１８日間増殖させ、示される場合、フェニルアラニン（Ｓｉｇｍａ Ｐ５４８２）で補充された。細胞を２日ごとにサンプリングし、さらなる供給は導入されなかった。これらの細胞を、細胞増殖および培養生存率について分析した。切断ヒトＰＡＨを発現する例示的な生産細胞は、６ｍＭのフェニルアラニンで補充された場合、切断ＣＨＯ ＰＡＨを発現する例示的な生産細胞よりも短い時間で、より高い生細胞濃度に増殖し、これらに達した。この実験はまた、ＧＳＫＯ対照が死んだとき、細胞株が本当に原栄養性であることを示した。

実施例７：チロシンは存在しないが、追加のフェニルアラニンで補充された市販のＣＤ－ＣＨＯ培地で増殖させた場合の例示的な生産細胞の増殖プロファイルおよび生細胞濃度
この実施例は、細胞増殖および培養生存率を評価する。図６は、チロシンを欠いているが、６ｍＭのグルタミンで補充された市販のＣＤ－ＣＨＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地でトランスフェクトし、増殖させた例示的な生産細胞の増殖データを示す。トランスフェクトされたＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ（商標）宿主細胞は、ＣＭ７６培地と比較して、ＣＤ ＣＨＯ培地においてトランスフェクト後に早く回復した。トランスフェクション後に細胞を振盪フラスコに移す準備ができた場合の回復率を２１日から１８日に低下させた。加えて、切断ヒトＰＡＨを含有するプラスミドＤＮＡ構築物でトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクト後に切断ＣＨＯ ＰＡＨ細胞を含有するベクターを使用する場合に観察されるのと同様の時間で、および同様の生細胞数まで回復した。これは、ＣＤ ＣＨＯがこの系に対してより良いトランスフェクション培地であることを示した。

ＣＤ ＣＨＯ培地での増殖について評価された細胞を、２日ごとにサンプリングし、さらなる供給は導入されなかった。培養物を、細胞増殖および培養生存率について分析した。ＣＤ ＣＨＯ培地でチロシン原栄養性細胞プールを増殖させた場合（図６）、切断ヒトＰＡＨ細胞プールは、追加の６ｍＭフェニルアラニンから最も恩恵を受けた。

実施例８：細胞をフェニルアラニン補充に事前適応させると、増殖遅滞期が低減される。
この実施例は、バッチ培養を実施する前に、例示的な生産細胞プールを追加の補充フェニルアラニンに事前適応させることによって、増殖が改善されることを示す（図７）。ヒト切断ＰＡＨ発現細胞は、ＣＨＯ型よりもフェニルアラニン補充に良好に応答する。ヒト切断ＰＡＨ発現細胞（ＬＭＭ１７３）を、増殖曲線を開始する前に、６ｍＭのフェニルアラニンを用いて細胞を継代することによって、事前適応させた。細胞を、１６日間、１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおいて培養した。これらの細胞を、生細胞濃度および培養生存率によって測定される細胞増殖について分析した。細胞増殖はフェニルアラニンの添加によって増強されたが、細胞が６ｍＭのＬ－グルタミンおよび６ｍＭのフェニルアラニン（Ｓｉｇｍａ Ｐ５４８２）で補充されたＣＤ ＣＨＯチロシンなしでの増殖に事前適応された場合、増殖遅滞期はさらに低減された。ＧＳ－ＫＯ宿主細胞は、６ｍＭのフェニルアラニンで補充された、または補充されないＣＤ ＣＨＯ培地中で増殖長することができなかった。

実施例９：組換えタンパク質産生を伴う二重代謝選択マーカー
この実施例は、グルタミン合成酵素選択下で組換えタンパク質を産生する細胞株と組み合わせた場合、切断ＰＡＨ／ＧＣＨ１の組み合わせ選択がどのように利用可能であるかを評価する。プロモーターの強度を変化させ、ＧＣＨ１発現を駆動させて、これが増殖プロファイルに関して出現した後続細胞に影響を与えたかを決定した。最大増殖（最高生細胞濃度）を達成するために、プロモーターおよび切断ＰＡＨとＧＣＨ１との組み合わせが最良の組み合わせであった異なるプラスミド。これらのプールを生成するために使用されたベクターは、ＣＨＯまたはヒトＰＡＨ（カセット１、ＳＶ４０プロモーター）、ＧＣＨ１（ＰＧＫ、ＳＶ４０、またはｍＣＭＶプロモーターのいずれかによって駆動されるカセット３）、およびｅＧＦＰ （ＣＭＶプロモーターによって駆動されるカセット２）のいずれかの切断型を含有した。表１を参照されたい。

これらを線状化し、ＧＳ選択下でモデルモノクローナル抗体ｃＢ７２．３を発現する細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクションは、Ｔ２５静的フラスコに、グルタミンなし、およびチロシンなしのＣＤ－ＣＨＯで実施された。トランスフェクションおよび選択後、細胞が回復し、増殖したら、これらを、グルタミンなし、およびチロシンなしのＣＭ７６中の振盪フラスコに移した。

図８は、得られる細胞プールにおける切断ＣＨＯ ＰＡＨの発現および切断ヒトＰＡＨ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ－ＰＣＲデータを示し、実施例４の所見と同等であった。ＧＣＨ１の発現も検出され、レベルはカセットを駆動していたプロモーターの強度を反映した。解析は、切断ＰＡＨ細胞プールにおけるＰＡＨのｍＲＮＡ過剰発現を確認する。以前に観察されたように、切断ＣＨＯ ＰＡＨは、ヒトＰＡＨよりもはるかに高いレベルで発現された。ＧＣＨ１ ｍＲＮＡ発現レベルは、遺伝子を駆動するプロモーター強度と相関した。

上述の細胞プールからの溶解物のウエスタンブロット分析を行った。すべての二重選択細胞プールを、グルタミンなし、およびチロシンなしのＣＭ７６で増殖させた。ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ（商標）対照試料を、完全培地（グルタミンおよびチロシンを含有する）で増殖させた細胞から採取した。切断ＰＡＨ、ＧＣＨ１、およびＧＳは、実施例４に従い、抗体がそれを検出しないため（データ示さず）、ＣＨＯ ＰＡＨを除き、すべて細胞株を発現する二重選択マーカーにおいて検出された。重鎖抗体を使用して、組換えタンパク質（ｃＢ７２．３）が上清に分泌されていることも確認した（データ示さず）。チューブリン、β－アクチン、およびＬ７ａは、ローディング対照として機能した。

図９は、例示的な生産細胞プールの増殖データを示す。細胞プールを、チロシンおよびグルタミンの不在下で１８日間、１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコで培養し、示されるように追加のフェニルアラニンで補充された。２日ごとに細胞をサンプリングし、生細胞の数および培養生存率を、ＶｉＣｅｌｌ機器を使用して評価した。さらなる供給は導入しなかった。追加の６ｍＭフェニルアラニン補充培地に事前適応された場合、最大増殖（最高生細胞濃度を達成）が、ＬＭＭ１８６（ＳＶ４０ヒトＰＡＨ、ＳＶ４０ ＧＣＨ１）で観察された。

２つの選択マーカーが同時に利用されているため、細胞は、チロシンまたはグルタミンなしのＣＭ７６で培養された。最良の増殖細胞プールは、６ｍＭのフェニルアラニン（ＳＶ４０ ＰＡＨヒトおよびＳＶ４０ ＧＣＨ１）で補充された場合、ＬＭＭ１８６から生成された。

これらの結果は、細胞株の性能にいかなる悪影響を与えることなく、２つの異なるアミノ酸ベースの選択系を組み合わせることができることを示す。得られる細胞は、優れた増殖特徴を示す。これは、例えば、１つの選択系を使用して、細胞株の性能を修飾する遺伝子産物を有する操作された安定した細胞株を作製および維持することができる一方で、他の選択系を使用して、それを製造することが望ましい産物をコードする配列を導入および維持することができるため、発現のためのより大きな柔軟性を提供する。

結果はまた、ヒトＰＡＨをフェニルアラニン補充とともに使用することで優れた性能を達成するという実施例７の知見を支持する。

本明細書で引用されるあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の態様を参照して開示されているが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変形形態が当業者によって考案され得ることは明らかである。異なるセクションにおける特徴および実施形態が、準用して組み合わせられ得る。

Claims (16)

1. 目的の産物をコードする核酸配列を含む真核細胞を選択する方法であって、
   ｉ）チロシンの不在下で生存または増殖することができない細胞集団を、ベクター系と接触させることであって、前記ベクター系が、
   ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、機能的Ｎ末端調節ドメインを欠く前記ＰＡＨをコードする配列を含む、第１の核酸配列と、
   （ｂ）宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、前記ＧＣＨ１をコードする配列を含む、第２の核酸配列と、
   （ｃ）宿主細胞における目的の産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、前記産物をコードする配列を含む、第３の核酸配列と、を含み、前記第３の配列が、（ａ）および／または（ｂ）と同じベクター中に、前記細胞による前記ベクター系の取り込みを可能にする条件下で存在することと、
   ｉｉ）前記チロシンのレベルが前記ベクター系によってコードされる前記ＰＡＨおよびＧＣＨ１酵素を発現しない細胞の生存または増殖に必要なレベルよりも低い条件下で、前記細胞を培養することと、
   ｉｉｉ）そのような条件下で増殖することができる１つ以上の細胞を選択して、前記産物をコードする前記核酸配列を含有する１つ以上の細胞を得ることと、を含む、方法。
2. （ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、同じベクター中に存在する、請求項１に記載の方法。
3. （ｃ）が、（ａ）または（ｂ）と同じベクター中に存在する、２つのベクターを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記真核細胞が、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記ＰＡＨが、前記Ｎ末端調節ドメインの欠失を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の宿主細胞。
6. 前記細胞培養培地が、チロシンを欠き、任意選択で、フェニルアラニンを補充される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
7. 真核宿主細胞であって、
   ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、機能的Ｎ末端調節ドメインを欠く前記ＰＡＨをコードする配列を含む、第１の外因性核酸と、
   ｂ）前記宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、前記ＧＣＨ１をコードする、第２の外因性核酸と、
   ｃ）前記宿主細胞における目的の産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、前記産物をコードする第３の外因性核酸と、を含み、前記第３の外因性核酸が、前記第１および／または第２の外因性核酸と同じ外因性核酸配列中に存在する、真核宿主細胞。
8. 前記ＰＡＨが、前記Ｎ末端調節ドメインの欠失を有する、請求項７に記載の宿主細胞。
9. 前記ＰＡＨが、ＣＨＯまたはヒトＰＡＨである、請求項７または８に記載の宿主細胞。
10. 哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞である、請求項７～９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
11. 前記第１、第２、および第３の核酸分子が、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれる、請求項７～１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
12. 前記細胞のＰＡＨおよび／またはＧＣＨ１をコードする内因性遺伝子の活性が、低減または消失している、請求項７～１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
13. １つ以上の核酸ベクターを含むベクター系であって、
    ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、機能的Ｎ末端調節ドメインを欠く前記ＰＡＨをコードする配列を含む、第１の核酸配列と、
    ｂ）宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、前記ＧＣＨ１をコードする配列を含む、第２の核酸配列と、
    ｃ）宿主細胞における目的の産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、前記産物をコードする配列を挿入するための複数のクローニング部位と、を含み、前記複数のクローニング部位および第３の制御配列が、（ａ）および／または（ｂ）と同じベクター中に存在する、ベクター系。
14. １つ以上の核酸ベクターを含むベクター系であって、
    ａ）宿主細胞におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の発現を可能にする第１の制御配列に作動可能に連結された、機能的Ｎ末端調節ドメインを欠く前記ＰＡＨをコードする配列を含む、第１の核酸配列と、
    ｂ）宿主細胞におけるＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）の発現を可能にする第２の制御配列に作動可能に連結された、前記ＧＣＨ１をコードする配列を含む、第２の核酸配列と、
    ｃ）宿主細胞における目的の産物の発現を可能にする第３の制御配列に作動可能に連結された、前記産物をコードする配列を含む、第３の核酸配列と、を含み、前記第３の核酸配列が、（ａ）および／または（ｂ）と同じベクター中に存在する、ベクター系。
15. 産物を作製する方法であって、前記方法が、前記産物を発現するのに好適な条件下で、請求項７～１０のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することと、前記産物を回収することと、任意選択で、前記回収された産物を１つ以上の処理または精製ステップに供することと、を含む、方法。
16. 前記チロシンのレベルが請求項１～５のいずれか一項に記載のベクター系によってコードされる前記ＰＡＨおよびＧＣＨ１酵素を発現しない細胞の生存または増殖に必要なレベルよりも低い条件下で、前記細胞が培養される、請求項１５に記載の方法。

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