CN109912721A - 创建抗虫融合基因的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种创建抗虫融合基因的方法及其应用。本发明提供了一种创建抗虫融合蛋白的方法，包括如下步骤：将抗虫蛋白A位于氨基酸的Endotoxin_N结构域、Endotoxin_M结构域与抗虫蛋白B位于羧基端的delta_endotoxin_C结构域连接起来，得到抗虫融合蛋白。将利用本发明方法创建得到的抗虫融合基因(cry1A.172、cry1F.148或cry1A.207)导入玉米自交系B73，所得转基因玉米对鳞翅目昆虫(如玉米螟)有很强毒性，且并未影响受体植物原有的农艺性状。本发明对于创建对靶标害虫具有杀虫效果的Bt基因，增加Bt蛋白的多样性，拓宽Bt蛋白针对靶标害虫的结合位点具有重要意义。

Description

创建抗虫融合基因的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种创建抗虫融合基因的方法及其应用。

背景技术

当前玉米虫害严重，造成玉米大量减产，由此对我国玉米生产造成巨大的经济损失。欧洲玉米螟在欧美每年估计可造成玉米生产减产5％-20％，农民收益损失严重。生产上造成玉米减产的主要虫害是玉米螟，因此采取有效措施控制其危害对提供玉米产量、增加农民收入是我们亟待解决的问题。长期以来因没有合适的抗虫品种，目前解决虫害的主要方法是在生长过程中喷施化学杀虫剂。但是化学杀虫剂不但杀死害虫，还杀死了害虫的天敌，造成生态平衡破坏和环境污染。通过转基因技术，可以将抗虫基因导入玉米品种中，进而提高转基因玉米的抗虫性，同时由于转基因玉米的每株植株都具有相当程度的抗性，因而其抗虫效果比喷洒农药防治效果显著要好且稳定，还能够节省人力和物力的投入，有效的节约社会资源。

目前已分离到大量的抗虫基因，美国等国家生产中主要应用的抗虫基因有：Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry3等，通过转基因手段，把抗虫基因转入生产中普遍应用的骨干自交系当中，为解决玉米生产中的虫害提供了一条行之有效途径。此外，利用转基因的手段培育出的抗虫转基因玉米不但减少虫害，同时也通过减少化学药剂的施用量，降低成本，保护环境。在我国目前青壮年劳动力大部分进城打工，老弱妇留守种田的背景下，培养和推广抗玉米螟品种在我国有着广阔的应用前景，为玉米生产和农民增收带来巨大的经济效益，从而实现积极的社会和生态效益。

Bt蛋白主要含有3个功能域，分别为Endotoxin_N、Endotoxin_M和delta_endotoxin_C。不同Bt蛋白针对的靶标害虫不同，并且与靶标害虫体内的结合位点存在差异。自然界发现的Bt蛋白数量有限，通过人为改造，融合能够拓宽Bt蛋白的结合位点，增加Bt蛋白的多样性。目前构建融合蛋白的方法多采用在已有蛋白的N端或C端增加另外一种蛋白，如构建GFP、RFP等带有荧光信号的蛋白。从而达到具有两种蛋白的功能。沈志成等人将Cry1Ab和cry2Aj蛋白融合，达到了两种蛋白的效果，但并未改变每种蛋白的结合位点。

发明内容

本发明的目的是提供一种创建抗虫融合基因的方法及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种创建抗虫融合蛋白的方法。

本发明所提供的创建抗虫融合蛋白的方法，可包括如下步骤：将抗虫蛋白A位于氨基端的Endotoxin_N结构域、Endotoxin_M结构域与抗虫蛋白B位于羧基端的delta_endotoxin_C结构域连接起来，得到抗虫融合蛋白。

通过蛋白结构分析，以cry1Ab为例，融合位点选择在保守结构域ITQIPL位置与TKS位点作为融合位点，不影响蛋白结构，转基因结果表明，融合蛋白具有较好的抗虫性。

第二方面，本发明要求保护一种创建抗虫融合基因的方法。

本发明所提供的创建抗虫融合基因的方法，可包括如下步骤：将抗虫蛋白A位于氨基端的Endotoxin_N结构域和Endotoxin_M结构域的编码基因与抗虫蛋白B位于羧基端的delta_endotoxin_C结构域的编码基因连接起来，得到抗虫融合基因。

在上述两方面中，所述抗虫蛋白A和所述抗虫蛋白B均可为Bt毒蛋白。

进一步地，所述Bt毒蛋白可为cry1F蛋白(SEQ ID No.8)、cry1Ab蛋白(SEQ IDNo.9)、cry1Ah蛋白(SEQ ID No.10)或cry1Ie蛋白(SEQ ID No.11)。

在本发明的第一个实施例中，所述抗虫蛋白A具体为cry1Ab蛋白；所述抗虫蛋白B具体为cry1Ah蛋白。

在本发明的第二个实施例中，所述抗虫蛋白A具体为cry1F蛋白；所述抗虫蛋白B具体为cry1Ab蛋白。

在本发明的第三个实施例中，所述抗虫蛋白A具体为cry1Ab蛋白；所述抗虫蛋白B具体为cry1Ie蛋白。

更进一步地，在前文第一方面中，所述构建抗虫融合蛋白的方法具体可包括如下步骤：将cry1F蛋白、cry1Ab蛋白、cry1Ah蛋白和cry1Ie蛋白的氨基酸序列一起进行序列对比，得到氨基酸比对序列矩阵(如图1所示)；然后将所要融合的所述抗虫蛋白A在所述氨基酸比对序列矩阵中位于前523位的氨基酸序列与所要融合的所述抗虫蛋白B在所述氨基酸比对序列矩阵中位于第524位及以后的氨基酸序列进行融合(即融合的位置选择在相对保守的结构域IPL和V(T)K之间)，得到所述抗虫融合蛋白。

所述氨基酸比对序列矩阵具体可为采用序列比对软件(如DNAMAN等)将cry1F蛋白、cry1Ab蛋白、cry1Ah蛋白和cry1Ie蛋白的氨基酸序列放在一起进行比对，软件直接输出的比对结果图谱(图谱上所标注的位置信息即为在氨基酸比对序列矩阵中的位置，如图1)。

第三方面，本发明要求保护采用第一方面所述方法制备得到的抗虫融合蛋白。

第四方面，本发明要求保护采用第二方面所述方法制备得到的抗虫融合基因。

在本发明中，所述抗虫融合蛋白的氨基酸序列具体为如下任一：

(A1)SEQ ID No.1(抗虫融合蛋白cry1A.172)；

(A2)SEQ ID No.3(抗虫融合蛋白cry1F.148)；

(A3)SEQ ID No.5(抗虫融合蛋白cry1A.207)。

其中，所述抗虫融合基因可为编码前文所述抗虫融合蛋白的基因。

进一步地，在本发明中，所述抗虫融合基因的核苷酸序列具体为如下任一：

(B1)SEQ ID No.2(抗虫融合基因cry1A.172)；

(B2)SEQ ID No.4(抗虫融合基因cry1F.148)；

(B3)SEQ ID No.6(抗虫融合基因cry1A.207)。

抗虫融合基因cry1A.172是通过对cry1Ab抗虫基因的Endotoxin_N、Endotoxin_M结构域的编码基因和cry1Ah抗虫基因的delta_endotoxin_C结构域的编码基因融合的基础上进行密码子改造，按照单子叶植物编码特征获得的密码子优化的抗虫基因。

抗虫融合基因cry1F.148是通过对cry1F抗虫基因的Endotoxin_N、Endotoxin_M结构域的编码基因和cry1Ab抗虫基因的delta_endotoxin_C结构域的编码基因融合的基础上进行密码子改造，按照单子叶植物编码特征获得的密码子优化的抗虫基因。

抗虫融合基因cry1A.207是通过对cry1Ab抗虫基因的Endotoxin_N、Endotoxin_M结构域的编码基因和cry1Ie抗虫基因的delta_endotoxin_C结构域的编码基因融合的基础上进行密码子改造，按照单子叶植物编码特征获得的密码子优化的抗虫基因。

第五方面，本发明要求保护前文第一方面或第二方面所述的方法或第三方面所述的抗虫融合蛋白或第四方面所述的抗虫融合基因在培育抗虫植物品种中的应用。

第六方面，本发明要求保护一种培育抗虫植物品种的方法。

本发明所提供的培育抗虫植物品种的方法，可包括如下步骤：在受体植物中表达前文所述的抗虫融合蛋白。

进一步地，所述方法可包括如下步骤：

(A)制备得到前文所述的抗虫融合基因；

(B)将所述抗虫融合基因导入所述受体植物，得到抗虫转基因植物。

更进一步地，所述抗虫融合基因具体可通过重组表达载体的形式导入所述受体植物中。

另外，导入所述受体植物中的除了所述抗虫融合基因外，还有用于筛选的标记基因，如Bar基因。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述抗虫融合基因转录的启动子为玉米Gly启动子。所述玉米Gly启动子的序列如SEQ ID No.7所示。所述重组表达载体中终止所述抗虫融合基因转录的终止序列为NOS终止序列。

更加具体的，所述重组表达载体具体为将所述抗虫融合基因插入到pCAMBIA3301+Gly promoter载体的酶切位点HindIII和PmlI之间后得到的重组质粒。所述pCAMBIA3301+Gly promoter载体为将所述玉米Gly启动子序列插入到pCAMBIA3301的酶切位点EcoRI和HindIII之间后得到的重组质粒。所述重组表达载体上携带与Bar基因表达盒。

在第五方面和第六方面中，所述植物均可为单子叶植物。

进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物；

更进一步地，所述禾本科植物可为玉米，具体如玉米自交系B73。

在本发明中，所述虫可为鳞翅目昆虫(如玉米螟、棉铃虫或黏虫等)。

实验证明，将利用本发明方法创建得到的抗虫融合基因(cry1A.172、cry1F.148或cry1A.207)导入玉米自交系B73，所得转基因玉米对鳞翅目昆虫(如玉米螟)有很强的毒性，且并未影响转基因受体植物原有的农艺性状。本发明对于创建对靶标害虫具有杀虫效果的Bt基因，增加Bt蛋白的多样性，拓宽Bt蛋白针对靶标害虫的结合位点具有重要意义。

附图说明

图1为本发明供试Bt蛋白以及三个抗虫融合蛋白的氨基酸比对序列矩阵。图中箭头(位于氨基酸比对序列矩阵的523和524位之间)处即表示两个Bt蛋白的融合位点。

图2为本发明三个抗虫融合蛋白的三维结构预测结果。A为Cry1A.172。B为Cry1A.207。C为Cry1F.148。

图3为本发明三个重组载体的质粒图谱。A为pCAMBIA3301+cry1A.172。B为pCAMBIA3301+cry1A.207。C为pCAMBIA3301+cry1A.148。

图4为本发明三种转入抗虫融合基因的转基因玉米的PCR鉴定结果。A为cry1A.172转基因玉米(1-20：T2代cry1A.172转基因玉米；21和22：空白对照和负对照；23：以质粒为模板扩增的正对照；M：DNA marker)。B为cry1A.207转基因玉米(1-20：T2代cry1A.172转基因玉米；21和22：空白对照和负对照；23：以质粒为模板扩增的正对照；M：DNA marker)。C为cry1F.148转基因玉米(1-20：T2代cry1A.172转基因玉米；21和22：空白对照和负对照；23：以质粒为模板扩增的正对照；M：DNA marker)。

图5为本发明三种转入抗虫融合基因的阳性转基因玉米对玉米螟的抗性鉴定结果。A为T2代cry1A.172转基因玉米。B为T2代cry1A.207转基因玉米。C为T2代cry1F.148转基因玉米。A-C中，均是上图为转基因材料，下图为未转基因对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、三个抗虫融合蛋白的创建及结构分析

Bt蛋白主要含有3个功能域，分别为Endotoxin_N、Endotoxin_M和delta_endotoxin_C。不同Bt蛋白针对的靶标害虫不同，并且与靶标害虫体内的结合位点存在差异。自然界发现的Bt蛋白数量有限，通过人为改造，融合能够拓宽Bt蛋白的结合位点，增加Bt蛋白的多样性。

一、三个抗虫融合蛋白的创建

本发明创建抗虫融合基因的思路如下：将Bt蛋白A位于氨基端的Endotoxin_N结构域、Endotoxin_M结构域与Bt蛋白B位于羧基端的delta_endotoxin_C结构域连接起来，得到抗虫融合蛋白。

供试Bt蛋白有cry1F蛋白(SEQ ID No.8)、cry1Ab蛋白(SEQ ID No.9)、cry1Ah蛋白(SEQ ID No.10)和cry1Ie蛋白(SEQ ID No.11)。

具体操作：将SEQ ID No.8、9、10和11所示的四个供试Bt蛋白的氨基酸序列一起进行序列对比，得到“氨基酸比对序列矩阵”(如图1所示，图1中所标注的位置为在“氨基酸比对序列矩阵”中的位置)。根据上述设计思路，本发明两两Bt蛋白融合的具体位置选择在相对保守的功能域523和524两个氨基酸中间(523和524即为在图1所示的“氨基酸比对序列矩阵”中的位置)，即融合的位置选择在相对保守的结构域IPL和V(T)K之间。

按照上述方法，最终获得三个抗虫融合蛋白cry1A.172、cry1F.148和cry1A.207。

抗虫融合蛋白cry1A.172的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1的第1-476位来自于cry1Ab蛋白序列，第477-647位来自于cry1Ah蛋白序列。SEQ ID No.2编码SEQID No.1所示的抗虫融合蛋白。

抗虫融合蛋白cry1F.148的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，SEQ ID No.3的第1-469位来自于cry1F蛋白序列，第470-617位来自于cry1Ab蛋白序列。SEQ ID No.4编码SEQID No.3所示的抗虫融合蛋白。

抗虫融合蛋白cry1A.207的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，SEQ ID No.5的第1-476位来自于cry1Ab蛋白序列，第477-683位来自于cry1Ie蛋白序列。SEQ ID No.6编码SEQID No.5所示的抗虫融合蛋白。

二、三个抗虫融合蛋白的结构分析

通过https://swissmodel.expasy.org/网站对蛋白结构分析，判断步骤一创建的三个抗虫融合蛋白是否具有Bt蛋白类似的三维结构。

三个抗虫融合蛋白的三维结构预测结果如图2所示，从图可以看出，融合的三个蛋白红色部分(图中标注1)的α螺旋结构均有差异，蓝色的α螺旋(图中标注2)和浅绿色的β折叠片(图中标注3)角度也存在一定差异，这些结构的变化会改变Bt蛋白与害虫体内蛋白的结合位点。

实施例2、cry1A.172转基因玉米的获得及功能鉴定

一、重组表达载体pCAMBIA3301+cry1A.172的构建

以SEQ ID No.7所示的Gly启动子序列为模板，以Gly-F和Gly-R为引物进行PCR扩增，得到两端分别带有酶切位点EcoRI和HindIII的DNA片段。用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切扩增片段，胶回收后与经过同样双酶切的pCAMBIA3301载体骨架大片段相连，得到重组载体pCAMBIA3301+Gly promoter。重组载体pCAMBIA3301+Gly promoter的结构描述为：在pCAMBIA3301载体的酶切位点EcoRI和HindIII之间插入SEQ ID No.7所示DNA片段后得到的重组质粒。

Gly-F：5’-GAATTCAGATTACAAGGTAGTGAATT-3’；

Gly-R：5’-AAGCTTCTCGATCCGCTCACCCACGAAC-3’。

以SEQ ID No.2所示的cry1A.172基因序列为模板，以cry1A.172-F和cry1A.172-R为引物进行PCR扩增，得到两端分别带有酶切位点HindIII和EcoRV的DNA片段。用限制性内切酶HindIII和EcoRV双酶切扩增片段，胶回收后与经过HindIII和PmlI(PmlI与EcoRV为同尾酶)双酶切的pCAMBIA3301+Gly promoter载体骨架大片段相连，得到重组载体pCAMBIA3301+cry1A.172。重组载体pCAMBIA3301+cry1A.172的结构描述为：在pCAMBIA3301+Gly promoter载体的酶切位点HindIII和PmlI之间插入SEQ ID No.2所示DNA片段后得到的重组质粒。

cry1A.172-F：5’-AAGCTTATGGACAACAATCCCAACATCA-3’；

cry1A.172-R：5’-GATATCCTATTAATCAATGTGGTAGTC-3’。

重组载体pCAMBIA3301+cry1A.172中启动cry1A.172基因转录的启动子为Gly启动子(SEQ ID No.7)，终止cry1A.172基因转录的终止序列为NOS终止序列。重组载体pCAMBIA3301+cry1A.172中还含有筛选标记基因Bar的表达盒，选择标记基因bar由CaMV35S启动子启动表达。重组载体pCAMBIA3301+cry1A.172的质粒图谱如图3中A所示。

二、cry1A.172转基因玉米的获得

本发明通过农杆菌侵染玉米幼胚的方法获得转基因植株。将cry1A.172基因植物转化载体pCAMBIA3301+cry1A.172转化农杆菌EHA105，再用含有目的基因的农杆菌侵染玉米幼胚，具体的转基因方法如下：

在转基因过程中所用受体为自交系B73。首先在田间种植自交系B73，到自交系散粉时套袋；然后准备授粉，授粉后9-11天，取授粉果穗籽粒上的未成熟幼胚，然后在室内进行农杆菌侵染，将被农杆菌侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤，将抗性愈伤再生成苗，得到转基因T0代植株。获得转基因T0代以后，用T0代转基因植株的花粉自交。

采用农杆菌侵染法将插入序列导入受体植株的幼胚，经除草剂双丙胺磷筛选后获得转基因植株。具体方法为：

1、农杆菌要在YEP(含Kana33mg/L和Str100mg/L抗生素)培养基上提前一周培养，并在4℃冰箱保存一个月左右，长期保存要在-80℃甘油保存；

2、农杆菌要在YEP培养基上在19℃培养3天，同时加Kana(33mg/L),Str(50mg/L)；

3、3天以后，挑取农杆菌放入含有5mL浸染培养基的50ml离心管中，同时加100μMAS(inf+AS)，在室温(25℃)转速75rpm摇菌2-4个小时；

4、浸染幼胚，把刚剥离的幼胚放入含有inf+AS液体培养基(2ml)的离心管中，每管约20-100个幼胚，用该培养基洗涤2次，然后加入1-1.5ml特定浓度(OD₅₅₀＝0.3-0.4)的农杆菌，轻轻颠倒离心管20次，然后直立放置在暗箱里5分钟，确保幼胚全部浸泡在农杆菌液体里，整个过程避免旋涡振荡。

5、浸染以后，把浸染过的幼胚转移到共培养培养基(co-cultivation medium)，使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时驱除培养基表面多余的农杆菌；

6、用封口膜封住培养皿，在20℃条件下暗培养3天。

7、共培养3天后，把幼胚转移到resting medium上面，同时用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天。

8、7天后，把所有的幼胚转移到选择培养基上面(35per plate)，培养两周，选择培养基含有bialaphos 1.5mg/L，两周后再进行亚培养bialaphos的浓度可以上升到3mg/L；

9、浸染大约5周左右，含有转化子的细胞会长成可以看见的Ⅱ型愈伤。

10、将抗性Ⅱ型愈伤在再生培养基I上面长3周，然后在再生培养基II上面发芽(在光照培养室)(Frame et al,2000)；

11、待再生苗生长出3-4片叶时，将其转移到温室，并进行检查，阳性植株保留，待其生长至吐丝散粉期时，对其进行授粉。

实验同时设置向自交系B73中导入pCAMBIA3301+Gly promoter载体的空载转基因对照。

三、cry1A.172转基因玉米的鉴定

PCR检测T2代cry1A.172转基因玉米中目的基因cry1A.172的整合情况。从供试玉米的新鲜叶片中提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，PCR检测目的基因cry1A.172的整合情况。

用于检测目的基因cry1A.172的引物为172F和172R。扩增条带长度：444bp。PCR条件：95℃预变性5min；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸0.5min，32个循环；72℃延伸10min，10℃保存。反应体系：DNA 2μl，上下游引物0.5μl，Taq DNA聚合酶0.3μl，10×buffer2μl，dNTP 1.6μl，ddH₂O补足至20μl。

172F：5'-GCCCTTCAACATCGGTATCAAC-3'；

172R：5'-GGAACTTCAATGTACCCTCTATTCTG-3'。

结果如图4中A所示。可见，T2代cry1A.172转基因玉米中均能检测到目的基因cry1A.172；而未转基因的受体玉米自交系B73中未检测到目的基因cry1A.172。空载转基因对照株系中未检测到目的基因cry1A.172。

四、cry1A.172转基因玉米的功能检测

通过对T2代室内生测试验，明确cry1A.172转基因玉米表现性状的稳定性，室内对靶标生物玉米螟、粘虫和棉铃虫抗性鉴定具体方案如下：

(一)供试昆虫

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis：玉米螟初孵幼虫(孵化时间2～12h)为室内人工饲养的亚洲玉米螟种群；

(二)检测方法

室内心叶离体生测：取生长至5～8叶期玉米植株地上部分带回室内，取未展开的幼嫩心叶，用消毒剪刀剪成2～3cm大小，放在24孔细胞培养板中，每孔接1头初孵幼虫。每板为1个重复，每个处理重复4次。放置在温度28℃、光周期16h:8h(L:D)、相对湿度70～80％RH的人工气候培养箱中培养。隔天更换相同来源的新鲜组织，并记录存活幼虫数。实验设定至少两次生物学重复，即不同时间(日期)重复上述测定。

(四)结果分析

结果如图5中A所示，可见转基因材料(上部的24个孔)叶片没有受到玉米螟虫的危害，而对照(下部的24个孔)受到玉米螟的严重危害，说明转化通过本发明创建的融合基因cry1A.172获得的转基因玉米能够有效杀死玉米螟虫。

实施例3、cry1F.148转基因玉米的获得及功能鉴定

一、重组表达载体pCAMBIA3301+cry1F.148的构建

以SEQ ID No.4所示的cry1F.148基因序列为模板，以cry1F.148-F和cry1F.148-R为引物进行PCR扩增，得到两端分别带有酶切位点HindIII和EcoRV的DNA片段。用限制性内切酶HindIII和EcoRV双酶切扩增片段，胶回收后与经过HindIII和PmlI(PmlI与EcoRV为同尾酶)双酶切的pCAMBIA3301+Gly promoter载体(见实施例2)骨架大片段相连，得到重组载体pCAMBIA3301+cry1F.148。重组载体pCAMBIA3301+cry1F.148的结构描述为：在pCAMBIA3301+Gly promoter载体的酶切位点HindIII和PmlI之间插入SEQ ID No.4所示DNA片段后得到的重组质粒。

cry1F.148-F：5’-AAGCTTATGGAGAACAACATCCAGAACCAG-3’；

cry1F.148-R：5’-GATATCTCACACGGCCTTCTGAGCCCTCT-3’。

重组载体pCAMBIA3301+cry1F.148中启动cry1F.148基因转录的启动子为Gly启动子(SEQ ID No.7)，终止cry1F.148基因转录的终止序列为NOS终止序列。重组载体pCAMBIA3301+cry1F.148中还含有筛选标记基因Bar的表达盒，选择标记基因bar由CaMV35S启动子启动表达。重组载体pCAMBIA3301+cry1F.148的质粒图谱如图3中C所示。

二、cry1F.148转基因玉米的获得

本发明通过农杆菌侵染玉米幼胚的方法获得转基因植株。将cry1F.148基因植物转化载体pCAMBIA3301+cry1F.148转化农杆菌EHA105，再用含有目的基因的农杆菌侵染玉米幼胚，具体的转基因方法参见实施例2相关步骤。

实验同时设置向自交系B73中导入pCAMBIA3301+Gly promoter载体的空载转基因对照。

三、cry1F.148转基因玉米的鉴定

PCR检测T2代cry1F.148转基因玉米中目的基因cry1F.148的整合情况。从供试玉米的新鲜叶片中提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，PCR检测目的基因cry1F.148的整合情况。

用于检测目的基因cry1F.148的引物为148F和148R。扩增条带长度：406bp。PCR条件：95℃预变性5min；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸0.5min，32个循环；72℃延伸10min，10℃保存。反应体系：DNA 2μl，上下游引物0.5μl，Taq DNA聚合酶0.3μl，10×buffer2μl，dNTP 1.6μl，ddH₂O补足至20μl。

148F：5'-ACTACAACCGCCTCATCAACCTC-3'；

148R：5'-TTGCGGGAGGAGACGAGGT-3'。

结果如图4中C所示。可见，T2代cry1F.148转基因玉米中均检测到目的基因cry1F.148；而未转基因的受体玉米自交系B73中未检测到目的基因cry1F.148。空载转基因对照株系中未检测到目的基因cry1F.148。

四、cry1F.148转基因玉米的功能检测

通过对T2代室内生测试验，明确cry1F.148转基因玉米表现性状的稳定性，室内对靶标生物玉米螟抗性鉴定具体方案参见实施例2相关部分。

结果如图5中C所示，可见转基因材料(上部的24个孔)叶片没有受到玉米螟虫的危害，而对照(下部的24个孔)受到玉米螟的严重危害，说明转化通过本发明创建的融合基因cry1F.148获得的转基因玉米能够有效杀死玉米螟虫。

实施例4、cry1A.207转基因玉米的获得及功能鉴定

一、重组表达载体pCAMBIA3301+cry1A.207的构建

以SEQ ID No.6所示的cry1A.207基因序列为模板，以cry1A.207-F和cry1A.207-R为引物进行PCR扩增，得到两端分别带有酶切位点HindIII和EcoRV的DNA片段。用限制性内切酶HindIII和EcoRV双酶切扩增片段，胶回收后与经过HindIII和PmlI(PmlI与EcoRV为同尾酶)双酶切的pCAMBIA3301+Gly promoter载体(见实施例2)骨架大片段相连，得到重组载体pCAMBIA3301+cry1A.207。重组载体pCAMBIA3301+cry1A.207的结构描述为：在pCAMBIA3301+Gly promoter载体的酶切位点HindIII和PmlI之间插入SEQ ID No.6所示DNA片段后得到的重组质粒。

cry1A.207-F：5’-AAGCTTATGGACAACAATCCCAACATCAAC-3’；

cry1A.207-R：5’-GATATCCTACATGTTGCGCTCGATGTGGATC-3’。

重组载体pCAMBIA3301+cry1A.207中启动cry1A.207基因转录的启动子为Gly启动子(SEQ ID No.7)，终止cry1A.207基因转录的终止序列为NOS终止序列。重组载体pCAMBIA3301+cry1A.207中还含有筛选标记基因Bar的表达盒，选择标记基因bar由CaMV35S启动子启动表达。重组载体pCAMBIA3301+cry1A.207的质粒图谱如图3中B所示。

二、cry1A.207转基因玉米的获得

本发明通过农杆菌侵染玉米幼胚的方法获得转基因植株。将cry1A.207基因植物转化载体pCAMBIA3301+cry1A.207转化农杆菌EHA105，再用含有目的基因的农杆菌侵染玉米幼胚，具体的转基因方法参见实施例2相关步骤。

实验同时设置向自交系B73中导入pCAMBIA3301+Gly promoter载体的空载转基因对照。

三、cry1A.207转基因玉米的鉴定

1、T2代植物基因组DNA检测

PCR检测T2代cry1A.207转基因玉米中目的基因cry1A.207的整合情况。从供试玉米的新鲜叶片中提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，PCR检测目的基因cry1A.207的整合情况。

用于检测目的基因cry1A.207的引物为207F和207R。扩增条带长度：826bp。PCR条件：95℃预变性5min；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸0.5min，32个循环；72℃延伸10min，10℃保存。反应体系：DNA 2μl，上下游引物0.5μl，Taq DNA聚合酶0.3μl，10×buffer2μl，dNTP 1.6μl，ddH₂O补足至20μl。

207F：5'-GTGGGACGCCTTCCTTGTGC-3'；

207R：5'-CTGTGGAGCGGCGTTACCC-3'。

结果如图4中B所示。可见，T2代cry1A.207转基因玉米中能够检测到目的基因cry1A.207；而未转基因的受体玉米自交系B73中未检测到目的基因cry1A.207。空载转基因对照株系中未检测到目的基因cry1A.207。

四、cry1A.207转基因玉米的功能检测

通过对T2代室内生测试验，明确cry1A.207转基因玉米表现性状的稳定性，室内对靶标生物玉米螟抗性鉴定具体方案参见实施例2相关部分。

结果如图5中B所示，可见转基因材料(上部的24个孔)叶片没有受到玉米螟虫的危害，而对照(下部的24个孔)受到玉米螟的严重危害，说明转化通过本发明创建的融合基因cry1A.207获得的转基因玉米能够有效杀死玉米螟虫。

<110> 中国农业大学

<120> 创建抗虫融合基因的方法及其应用

<130> GNCLN190566

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 647

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly

20 25 30

Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser

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Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile

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Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala

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Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu

100 105 110

Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu

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Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val

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Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser

165 170 175

Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

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Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val

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Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg

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Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

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Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro

245 250 255

Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val

260 265 270

Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu

275 280 285

Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr

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Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln

305 310 315 320

Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro

325 330 335

Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala

340 345 350

Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg

355 360 365

Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val

385 390 395 400

Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln

405 410 415

Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His

420 425 430

Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile

435 440 445

Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn

450 455 460

Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Asn

465 470 475 480

Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly

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Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg Gly

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Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Arg

515 520 525

Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu Asn Val Asn

530 535 540

Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr

545 550 555 560

Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly Tyr Phe Glu Ser Ala

565 570 575

Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile Val Gly Val Arg Asn Phe

580 585 590

Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val

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Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr Asn Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala

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Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asn

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Val Thr Asp Tyr His Ile Asp

645

<210> 2

<211> 1947

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

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gtggaggtgc ttggtggtga gaggatcgag accggttaca ctcccatcga catctccctt 120

tcccttaccc agttccttct ttccgagttc gtgcccggtg ccggtttcgt gcttggtctt 180

gtggacatca tctggggcat cttcggtccc tcccagtggg acgccttcct tgtgcagatc 240

gagcagctta tcaaccagag gatcgaggag ttcgccagga accaggccat ctccaggctt 300

gagggtcttt ccaaccttta ccagatctac gccgagtcct tcagggagtg ggaggccgat 360

cccaccaatc ccgcccttag ggaggagatg aggatccagt tcaacgacat gaactccgcc 420

cttaccaccg ccatcccact gttcgccgtg cagaactacc aggtgccact gctgtccgtg 480

tacgtgcagg ccgccaacct tcacctttcc gtgcttaggg acgtgtccgt gttcggtcag 540

aggtggggtt tcgacgccgc caccatcaac tccaggtaca acgaccttac caggcttatc 600

ggtaactaca ccgaccacgc cgtgaggtgg tacaacaccg gtcttgagag ggtgtggggt 660

cccgactcca gggactggat caggtacaac cagttcagga gggagcttac ccttaccgtg 720

cttgacatcg tgtccctgtt ccctaactac gactccagga cgtaccctat caggaccgtg 780

tcccagctta ccagggagat ctacaccaac ccagtgcttg agaacttcga cggttccttc 840

cgcggttccg cccagggtat cgaggggtcc atcaggagcc cacaccttat ggacatcctt 900

aactccatca ccatctacac cgacgcccac cgcggtgagt actactggtc cggccaccag 960

atcatggcca gcccagtggg tttctccggt cccgagttca ccttcccact ttacggtacc 1020

atgggtaacg ccgctccaca gcagaggatc gtggcccagc ttggtcaggg tgtgtacagg 1080

accctttcct ccacccttta caggaggccc ttcaacatcg gtatcaacaa ccagcagctt 1140

tccgtgcttg acggtaccga gttcgcctac ggtacctcct ccaaccttcc ctccgccgtg 1200

tacaggaagt ccggtaccgt ggactccctt gacgagattc caccacagaa caacaacgtg 1260

ccaccaaggc agggtttctc ccacaggctt tcccacgtgt ccatgttcag gtccggtttc 1320

tccaactcct ccgtgtccat catcagggct ccaatgttct cctggatcca caggtccgcc 1380

gagttcaaca acatcatccc cagcagccag atcacccaga tccccctggt gaagggaaac 1440

ttccttttca atggttctgt catttcagga ccaggattca ctggtgggga cttagttaga 1500

ttgaacagca gtggaaataa cattcagaat agagggtaca ttgaagttcc cattcacttt 1560

ccatccacat ctaccagata ccgagttcgt gttcggtacg cctctgttac cccgattcac 1620

ctcaacgtca actggggtaa ttcctccatt ttctccaaca cagttccagc tactgctacc 1680

tcccttgaca acctacaatc tagcgacttc ggttacttcg agagcgccaa cgccttcaca 1740

tcttcacttg gtaatatcgt tggtgttaga aatttcagtg ggactgctgg agtgatcata 1800

gacagattcg agttcattcc cgttactgca acacttgagg ctgagtacaa cctggaaaga 1860

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gtcactgact accacattga ttaatag 1947

<210> 3

<211> 617

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

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1 5 10 15

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Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln

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Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr

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Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val

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Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn

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Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe

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Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn

180 185 190

Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr

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Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln

245 250 255

Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu

260 265 270

Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu

275 280 285

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Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu

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Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr

325 330 335

Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro

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Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly

355 360 365

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Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile

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Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp

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Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro

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Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp

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Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile

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Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser

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Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr

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Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu

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Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu

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Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe

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Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg

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Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val

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Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile

580 585 590

Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr

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Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val

610 615

<210> 4

<211> 1854

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atggagaaca acatccagaa ccagtgcgtc ccctacaact gcctcaacaa ccccgaggtc 60

gagatcctca acgaggagcg ctccaccggc cgcctccccc tcgacatctc cctctccctc 120

acccgcttcc tcctctccga gttcgtcccc ggcgtcggcg tcgccttcgg cctcttcgac 180

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ctcatcgagc agcgcatcga gaccctcgag cgcaaccgcg ccatcaccac cctccgcggc 300

ctcgccgact cctacgagat ttacatcgag gccctccgcg agtgggaggc caaccccaac 360

aacgcccagc tccgcgagga cgtccgcatc cgcttcgcca acaccgacga cgccctcatc 420

accgccatca acaacttcac cctcacctcc ttcgagatcc ccctcctctc cgtctacgtc 480

caggccgcca acctccacct ctccctcctc cgcgacgccg tctccttcgg ccagggctgg 540

ggcctcgaca tcgccaccgt caacaaccac tacaaccgcc tcatcaacct catccaccgc 600

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acccgccagt gggcccgctt caaccagttc cgccgcgacc tcaccctcac cgtcctcgac 720

atcgtcgccc tcttccccaa ctacgacgtc cgcacctacc ccatccagac ctcctcccag 780

ctcacccgcg agatttacac ctcctccgtc atcgaggact cccccgtctc cgccaacatc 840

cccaacggct tcaaccgcgc cgagttcggc gtccgccccc cccacctcat ggacttcatg 900

aactccctct tcgtcaccgc cgagaccgtc cgctcccaga ccgtctgggg cggccacctc 960

gtctcctccc gcaacaccgc cggcaaccgc atcaacttcc cctcctacgg cgtcttcaac 1020

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gtcgccttcc agcagaccgg caccaaccac acccgcacct tccgcaactc cggcaccatc 1200

gactccctcg acgagatccc cccccaggac aactccggcg ccccctggaa cgactactcc 1260

cacgtcctca accacgtcac cttcgtccgc tggcccggcg agatttccgg ctccgactcc 1320

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cccgagcgca tcacccagat ccccctcacc aagagcacca acctgggcag cggcaccagc 1440

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<210> 5

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<212> PRT

<213> Artificial sequence

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Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly

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Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser

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Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

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Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala

85 90 95

Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu

100 105 110

Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu

115 120 125

Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala

130 135 140

Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val

145 150 155 160

Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser

165 170 175

Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

180 185 190

Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val

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Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg

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Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro

245 250 255

Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val

260 265 270

Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu

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Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr

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Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln

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Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg

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Asn Leu Ser Ser Gly Ala Ala Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly

485 490 495

Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Asn Thr Gly Thr Phe Gly Asp Ile Arg

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Ala Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Asn Arg Gly Glu Asp

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Leu Asp Tyr Lys Thr Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Ser

565 570 575

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580 585 590

Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Val Glu

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<400> 7

agattacaag gtagtgaatt gtgacatgta ttcgttccta tccgatccgt cgtttttgag 60

cactaggtgc ggtcactgtg acgcgtggac ttggcttcgc ccactgccat cgtggaccca 120

cgtcatcagc aagtgtccat atccaccacc cgacccgacg accgcttgcc gtccgatccg 180

tgtgctcccg agggcaagga tggcatttcg ccacgcgaga tatttttcgg tggcctgcac 240

aggccggcag tgcagcggcc aaaacgaggt caggtcagtc acgctgggcc ccgcctcacg 300

ctcccgtcct gctccgggtc ccaacaaagc cgtccccggg aggtgctcgt gtgctcgtag 360

cgcggtggcg accccgatgc cccgcatatt ccactgggcg tccgcgccgt cggatgggat 420

caggacggcc gcggcggccc cgcgctcggc tataaagacg ctgcggggga cgcattccct 480

ctccgtgctt tcttagaggt gggttggctt ctcctccccc tccggttcgg gttcgggttc 540

gtgaggttct ccggggttcg ggttcgtggg tgagcggatc gag 583

<210> 8

<211> 600

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 8

Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn

1 5 10 15

Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu

20 25 30

Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe

35 40 45

Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly

50 55 60

Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln

65 70 75 80

Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr

85 90 95

Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu

100 105 110

Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val

115 120 125

Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn

130 135 140

Asn Phe Thr Leu Thr Ser Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val

145 150 155 160

Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe

165 170 175

Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn

180 185 190

Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr

195 200 205

Tyr Asn Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp

210 215 220

Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp

225 230 235 240

Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln

245 250 255

Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu

260 265 270

Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu

275 280 285

Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe

290 295 300

Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu

305 310 315 320

Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr

325 330 335

Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro

340 345 350

Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly

355 360 365

Phe Gly Asn Pro His Tyr Val Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln

370 375 380

Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile

385 390 395 400

Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp

405 410 415

Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro

420 425 430

Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp

435 440 445

Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile

450 455 460

Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr

465 470 475 480

Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr

485 490 495

Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu

500 505 510

Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu

515 520 525

Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe

530 535 540

Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser

545 550 555 560

Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser

565 570 575

Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile

580 585 590

Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val

595 600

<210> 9

<211> 624

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 9

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly

20 25 30

Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser

35 40 45

Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile

50 55 60

Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala

85 90 95

Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu

100 105 110

Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu

115 120 125

Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala

130 135 140

Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val

145 150 155 160

Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser

165 170 175

Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

180 185 190

Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val

195 200 205

Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg

210 215 220

Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro

245 250 255

Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val

260 265 270

Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu

275 280 285

Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr

290 295 300

Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln

305 310 315 320

Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro

325 330 335

Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala

340 345 350

Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg

355 360 365

Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val

385 390 395 400

Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln

405 410 415

Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His

420 425 430

Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile

435 440 445

Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn

450 455 460

Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr

465 470 475 480

Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly

485 490 495

Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg

500 505 510

Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg

515 520 525

Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg

530 535 540

Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn

545 550 555 560

Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn

565 570 575

Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn

580 585 590

Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu

595 600 605

Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val

610 615 620

<210> 10

<211> 668

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 10

Met Gly Lys Asn Ser Ile Lys Leu Ser Glu Leu Trp Tyr Phe Asn Glu

1 5 10 15

Arg Lys Trp Arg Tyr Phe Met Glu Ile Val Asn Asn Gln Asn Gln Cys

20 25 30

Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn Asn Pro Glu Ile Glu Ile Leu Glu Gly

35 40 45

Gly Arg Ile Ser Val Gly Asn Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu

50 55 60

Thr Gln Phe Leu Leu Ser Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu

65 70 75 80

Gly Leu Ile Asp Leu Ile Trp Gly Phe Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp

85 90 95

Ala Phe Leu Ala Gln Val Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Ala Glu

100 105 110

Ala Val Arg Asn Thr Ala Ile Gln Glu Leu Glu Gly Met Ala Arg Val

115 120 125

Tyr Arg Thr Tyr Ala Thr Ala Phe Ala Glu Trp Glu Lys Ala Pro Asp

130 135 140

Asp Pro Glu Leu Arg Glu Ala Leu Arg Thr Gln Phe Thr Ala Thr Glu

145 150 155 160

Thr Tyr Ile Ser Gly Arg Ile Ser Val Leu Lys Ile Gln Thr Phe Glu

165 170 175

Val Gln Leu Leu Ser Val Phe Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser

180 185 190

Leu Leu Arg Asp Val Val Phe Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Ser Thr

195 200 205

Thr Thr Val Asn Asn Tyr Tyr Asn Asp Leu Thr Glu Gly Ile Ser Thr

210 215 220

Tyr Thr Asp Tyr Ala Val Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val

225 230 235 240

Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg

245 250 255

Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr

260 265 270

Asp Ser Arg Arg Tyr Pro Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu

275 280 285

Ile Tyr Thr Asn Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly

290 295 300

Ser Ala Gln Gly Ile Glu Arg Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp

305 310 315 320

Ile Leu Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Tyr Tyr

325 330 335

Tyr Trp Ser Gly His Gln Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly

340 345 350

Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro

355 360 365

Gln Gln Arg Ile Val Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu

370 375 380

Ser Ser Thr Phe Tyr Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln

385 390 395 400

Gln Leu Ser Val Leu Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser

405 410 415

Asn Leu Pro Ser Ala Val Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu

420 425 430

Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe

435 440 445

Ser His Arg Leu Ser His Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Ser Ser Ser

450 455 460

Ser Val Ser Ile Ile Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser

465 470 475 480

Ala Glu Phe Asn Asn Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro

485 490 495

Ala Val Lys Gly Asn Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro

500 505 510

Gly Phe Thr Gly Gly Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn

515 520 525

Ile Gln Asn Arg Gly Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr

530 535 540

Ser Thr Arg Tyr Arg Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile

545 550 555 560

His Leu Asn Val Asn Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val

565 570 575

Pro Ala Thr Ala Thr Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly

580 585 590

Tyr Phe Glu Ser Ala Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile Val

595 600 605

Gly Val Arg Asn Phe Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe

610 615 620

Glu Phe Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr Asn Leu Glu

625 630 635 640

Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu

645 650 655

Gly Leu Lys Thr Asn Val Thr Asp Tyr His Ile Asp

660 665

<210> 11

<211> 719

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 11

Met Lys Leu Lys Asn Pro Asp Lys His Gln Ser Leu Ser Ser Asn Ala

1 5 10 15

Lys Val Asp Lys Ile Ala Thr Asp Ser Leu Lys Asn Glu Thr Asp Ile

20 25 30

Glu Leu Lys Asn Ile Asn His Glu Asp Phe Leu Arg Met Ser Glu His

35 40 45

Glu Ser Ile Asp Pro Phe Val Ser Ala Ser Thr Ile Gln Thr Gly Ile

50 55 60

Gly Ile Ala Gly Lys Ile Leu Gly Thr Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly

65 70 75 80

Gln Ile Ala Ser Leu Tyr Ser Phe Ile Leu Gly Glu Leu Trp Pro Lys

85 90 95

Gly Lys Ser Gln Trp Glu Ile Phe Met Glu His Val Glu Glu Leu Ile

100 105 110

Asp Gln Lys Ile Ser Thr Tyr Ala Arg Asn Ile Ala Leu Ala Asp Leu

115 120 125

Lys Gly Leu Gly Asp Ala Leu Ala Val Tyr His Glu Ser Leu Glu Ser

130 135 140

Trp Ile Lys Asn Arg Asn Asn Ala Arg Ala Thr Ser Val Val Lys Ser

145 150 155 160

Gln Tyr Ile Ala Leu Glu Leu Leu Phe Val Gln Lys Leu Pro Ser Phe

165 170 175

Ala Val Ser Gly Glu Glu Val Pro Leu Leu Pro Ile Tyr Ala Gln Ala

180 185 190

Ala Asn Leu His Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Ser Val Phe Gly Lys

195 200 205

Glu Trp Gly Leu Ser Asn Ser Gln Ile Ser Thr Phe Tyr Asn Arg Gln

210 215 220

Val Glu Arg Thr Ser Asp Tyr Ser Asp His Cys Val Lys Trp Tyr Ser

225 230 235 240

Thr Gly Leu Asn Asn Leu Arg Gly Thr Asn Ala Glu Ser Trp Val Arg

245 250 255

Tyr Asn Gln Phe Arg Lys Asp Met Thr Leu Met Val Leu Asp Leu Ile

260 265 270

Ala Leu Phe Pro Ser Tyr Asp Thr Leu Val Tyr Pro Ile Lys Thr Thr

275 280 285

Ser Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Ala Ile Gly Thr Val His

290 295 300

Pro Asn Ala Ser Phe Ala Ser Thr Thr Trp Tyr Asn Asn Asn Ala Pro

305 310 315 320

Ser Phe Ser Ala Ile Glu Ser Ala Val Val Arg Asn Pro His Leu Leu

325 330 335

Asp Phe Leu Glu Gln Val Thr Ile Tyr Ser Leu Leu Ser Arg Trp Ser

340 345 350

Asn Thr Gln Tyr Met Asn Met Trp Gly Gly His Arg Leu Glu Phe Arg

355 360 365

Thr Ile Gly Gly Val Leu Asn Thr Ser Thr Gln Gly Ser Thr Asn Thr

370 375 380

Ser Ile Asn Pro Val Thr Leu Pro Phe Thr Ser Arg Asp Val Tyr Arg

385 390 395 400

Thr Glu Ser Leu Ala Gly Leu Asn Leu Phe Leu Thr Gln Pro Val Asn

405 410 415

Gly Val Pro Arg Val Asp Phe His Trp Lys Phe Ala Thr Leu Pro Ile

420 425 430

Ala Ser Asp Asn Phe Tyr Tyr Leu Gly Tyr Ala Gly Val Gly Thr Gln

435 440 445

Leu Gln Asp Ser Glu Asn Glu Leu Pro Pro Glu Thr Thr Gly Gln Pro

450 455 460

Asn Tyr Glu Ser Tyr Ser His Arg Leu Ser His Ile Gly Leu Ile Ser

465 470 475 480

Ala Ser His Val Lys Ala Leu Val Tyr Ser Trp Thr His Arg Ser Ala

485 490 495

Asp Arg Thr Asn Thr Ile Glu Pro Asn Ser Ile Thr Gln Ile Pro Leu

500 505 510

Val Lys Ala Phe Asn Leu Ser Ser Gly Ala Ala Val Val Arg Gly Pro

515 520 525

Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Asn Thr Gly Thr Phe

530 535 540

Gly Asp Ile Arg Val Asn Ile Asn Pro Pro Phe Ala Gln Arg Tyr Arg

545 550 555 560

Val Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Leu Gln Phe His Thr Ser

565 570 575

Ile Asn Gly Lys Ala Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Asn

580 585 590

Arg Gly Glu Asp Leu Asp Tyr Lys Thr Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr

595 600 605

Thr Pro Phe Ser Phe Ser Asp Val Gln Ser Thr Phe Thr Ile Gly Ala

610 615 620

Trp Asn Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe

625 630 635 640

Val Pro Val Glu Val Thr Tyr Glu Ala Glu Tyr Asp Phe Glu Lys Ala

645 650 655

Gln Glu Lys Val Thr Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Pro Arg Gly Leu

660 665 670

Lys Thr Asp Val Lys Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val

675 680 685

Glu Ser Leu Ser Asp Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Phe

690 695 700

Glu Ile Val Lys Tyr Ala Lys Gln Ile His Ile Glu Arg Asn Met

705 710 715

Claims (10)

1.一种创建抗虫融合蛋白的方法，包括如下步骤：将抗虫蛋白A位于氨基酸的Endotoxin_N结构域、Endotoxin_M结构域与抗虫蛋白B位于羧基端的delta_endotoxin_C结构域连接起来，得到抗虫融合蛋白。

2.一种创建抗虫融合基因的方法，包括如下步骤：将抗虫蛋白A位于氨基酸的Endotoxin_N结构域和Endotoxin_M结构域的编码基因与抗虫蛋白B位于羧基端的delta_endotoxin_C结构域的编码基因连接起来，得到抗虫融合基因。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述抗虫蛋白A和所述抗虫蛋白B均为Bt毒蛋白；

进一步地，所述Bt毒蛋白为cry1F蛋白、cry1Ab蛋白、cry1Ah蛋白或cry1Ie蛋白；

更进一步地，所述抗虫蛋白A为cry1Ab蛋白；所述抗虫蛋白B为cry1Ah蛋白；或

更进一步地，所述抗虫蛋白A为cry1F蛋白；所述抗虫蛋白B为cry1Ab蛋白；或

更进一步地，所述抗虫蛋白A为cry1Ab蛋白；所述抗虫蛋白B为cry1Ie蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述创建抗虫融合蛋白的方法，包括如下步骤：将cry1F蛋白、cry1Ab蛋白、cry1Ah蛋白和cry1Ie蛋白的氨基酸序列一起进行序列对比，得到氨基酸比对序列矩阵；然后将所要融合的所述抗虫蛋白A在所述氨基酸比对序列矩阵中位于前523位的氨基酸序列与所要融合的所述抗虫蛋白B在所述氨基酸比对序列矩阵中位于第524位及以后的氨基酸序列进行融合，得到所述抗虫融合蛋白。

5.采用权利要求1-4中任一所述方法制备得到的抗虫融合蛋白或抗虫融合基因。

6.根据权利要求5所述的抗虫融合蛋白，其特征在于：所述抗虫融合蛋白的氨基酸序列为如下任一：

(A1)SEQ ID No.1；

(A2)SEQ ID No.3；

(A3)SEQ ID No.5。

7.根据权利要求5所述的抗虫融合基因，其特征在于：所述抗虫融合基因为编码权利要求5或6所述抗虫融合蛋白的基因；

进一步地，所述抗虫融合基因的核苷酸序列为如下任一：

(B1)SEQ ID No.2；

(B2)SEQ ID No.4；(B3)SEQ ID No.6。

8.权利要求1-7中任一所述的方法或抗虫融合蛋白或抗虫融合基因在培育抗虫植物品种中的应用。

9.一种培育抗虫植物品种的方法，包括如下步骤：在受体植物中表达权利要求4或6所述的抗虫融合蛋白；

进一步地，所述方法包括如下步骤：

(A)制备得到权利要求5或7所述的抗虫融合基因；

(B)将所述抗虫融合基因导入所述受体植物，得到抗虫转基因植物。

10.根据权利要求8所述的应用或权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物；

进一步地，所述单子叶植物为禾本科植物；

更进一步地，所述禾本科植物为玉米。