CN108728446A

CN108728446A - 玉米耐盐基因ZmHKT2;1及其应用

Info

Publication number: CN108728446A
Application number: CN201710274446.7A
Authority: CN
Inventors: 李毅丹; 姜志磊; 韦正乙; 刘艳芝; 姜昱; 金峰学
Original assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2018-11-02

Abstract

本发明涉及一种玉米耐盐基因ZmHKT2;1，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。发明还提供了有所述基因编码的玉米HKT转运蛋白及所述基因ZmHKT2;1在转化植物中的应用。本发明所获得的有益效果在于：提供了一种能够在植物中稳定高效表达玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKT2;1及重组载体，本发明所提供的基因ZmHKT2;1可以应用于提高转基因作物的耐盐能力。

Description

玉米耐盐基因ZmHKT2;1及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种玉米耐盐基因ZmHKT2;1和其编码蛋白及其在植物中的应用。

背景技术

盐胁迫是影响作物生长发育和产量形成的主要非生物胁迫因素之一。据统计，世界上盐渍化土壤面积约9.5×10⁸公顷，约占全球陆地面积的十分之一。我国也是盐渍土分布最广泛的国家之一，盐渍化土壤面积高达3.4×10⁷公顷，约占耕地面积的三分之一，而且由于全球气候的不断变化以及不合理的施肥灌溉等原因，土壤盐渍化的范围也在不断扩大，这将严重地制约我国的经济和社会的发展。因此，除了利用一些传统的手段和方法来改善土壤外，培育耐盐农作物新品种已成为当务之急。由于植物耐盐性状自身的复杂性，使得采用传统的育种方法很难获得具有耐盐特性的优良品种。随着生物技术的发展，通过导入外源基因来提高农作物的耐盐性已成为现代作物育种的主要技术手段。

利用基因工程技术将具有优良性状的基因转入植物，以此来开发高效的转基因作物新品种是一项具有广阔应用前景的技术。就目前的研究情况而言，利用转基因技术在提高作物耐盐性方面已经取得了较大的进展，已有的大量研究表明，将耐盐基因转入受体植物中进行过表达，其异源转录产物和翻译产物可以提高转基因植物的耐盐性。

HKT转运蛋白属于质膜离子运输蛋白，是一类非常重要的蛋白质。根据其第一个孔环结构(pore domain，PD) 氨基酸组成的不同，可介导Na⁺特定传输或Na⁺/ K⁺联合运输，根据此功能上的差异可将HKT转运蛋白分成两大类：HKT1类和HKT2类。近年来，有关高粱、小麦、水稻、拟南芥等植物的HKT转运蛋白在植物耐盐过程中发挥的作用已经被先后报道，但是关于玉米中的HKT转运蛋白，特别是HKT2类蛋白在玉米耐盐过程中的作用尚未见报道。

因此，有必要对玉米HKT转运蛋白的基因序列及编码蛋白进行分离，从而为后期利用玉米HKT基因对植物进行提高耐盐性的定向改造奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够在植物中稳定高效表达玉米HKT转运蛋白的玉米耐盐基因及重组载体和应用。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供一种编码玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKT2;1，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的发明人在对玉米的耐盐机制进行研究的过程中，对进行提取玉米叶片总DNA后PCR得到了如SEQ ID NO:1 所示的DNA序列。

具体的，所述基因ZmHKT2;1是按照以下方式获得的：

玉米材料B73出苗15天左右剪取嫩叶，利用CTAB法提取基因组DNA。

用分光光度计检测DNA浓度；并用琼脂糖凝胶电泳的方法检测DNA质量。通过同源比对MaizeGDB数据库中B73的基因组获得ZmHKT2;1序列。分别在其5’UTR和3’UTR设计引物进行PCR反应。上游引物为：ZmHKT2;1F：(SEQ ID NO：3)，下游引物为ZmHKT2;1R：(SEQID NO：4)。PCR产物使用Easy⁃Pure Quick Gel Extraction Kit 进行胶回收测序获得SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种玉米HKT转运蛋白，其特征在于：由SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列组成。

应当理解的是，本领域技术人员可以根据SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列在不影响其活性的条件下，对该序列进行取代、缺失或插入一个或几个氨基酸以获得具有同等活性的蛋白质。

本发明还提供了所述基因的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为pCAMBIA3301-ZmHKT2;1。

本发明还提供了含有所述基因的工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

可选的，所述基因工程菌内含有重组载体pCAMBIA3301-ZmHKT2;1的核苷酸片段。

本发明还提供了玉米HKT转运蛋白的编码基因ZmHKT2;1在转化植物中的应用。

进一步地，所述植物包括玉米、烟草、水稻、棉花、大豆、高粱。优选的，当所述植物为烟草时，能够取得最好的提高耐盐能力的效果。

进一步地，所述应用是在烟草内转化所述基因ZmHKT2;1，从而使得玉米表达具有SEQ ID NO ：2 所示的氨基酸序列的蛋白，提高烟草的耐盐能力。

本发明所获得的有益效果在于：提供了一种能够在植物中稳定高效表达玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKT2;1及重组载体，本发明所提供的基因ZmHKT2;1可以应用于提高转基因作物的耐盐能力。

附图说明

图1为植物重组表达载体pCAMBIA3301-ZmHKT2;1片段图谱。其中，ZmHKT2;1代表玉米HKT转运蛋白的编码基因。

图2为Bar基因在转ZmHKT2;1基因烟草植株T2代中的PCR鉴定结果。其中，1-10为不同转基因株系；H2O为水；ck为野生型烟草；Plasmid为含有ZmHKT2;1基因的质粒；M为100bpMaker；Bar基因扩增产物大小为242bp。

图3为ZmHKT2;1基因在转ZmHKT2;1基因烟草植株T2代中的PCR鉴定结果。其中，1-5、7、9和10分别为Bar基因PCR检测阳性的转基因烟草株系；H2O为水；ck为野生型烟草；Plasmid为含有ZmHKT2;1基因的质粒；M为D2000 Maker；ZmHKT2;1基因扩增产物大小为1650bp。

图4为T2代转基因材料和野生型材料150mM NaCl处理后生长状况的比较。其中，Wild Type表示野生型烟草；ZmHKT2;1表示转基因烟草；上半部分为处理0天后生长的状况；下半部分处理15天后生长状况。

图5为转基因材料与野生型材料在在200mM NaCl处理0和24小时后丙二醛、过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的变化情况。其中，MDA为丙二醛；CAT为过氧化氢酶；POD为过氧化物酶；SOD为超氧化物歧化酶；WT表示野生型烟草；GM表示转基因烟草。0h表示处理0小时；24h表示处理24小时；** 表示有极显著差异(p<0.01)。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1 玉米HKT转运蛋白编码基因ZmHKT2;1的获得以及植物表达载体pCAMBIA3301-ZmHKT2;1的构建。

玉米材料B73出苗15天后剪取嫩叶，利用CTAB法提取基因组DNA。用Nanodrop2000c型分光光度计检测DNA浓度和质量；并用琼脂糖凝胶电泳方法进一步检测DNA质量和完整性。

利用同源比对的方法，以高粱、水稻、小麦、拟南芥等植物中的HKT2类基因序列为基础，从MaizeGDB数据库中B73的基因组序列中调取获得玉米中HKT2类基因序列，命名为ZmHKT2;1。分别在其5’UTR和3’UTR设计引物进行PCR扩增。上游引物为：ZmHKT2;1F：(SEQ IDNO：3)，下游引物为ZmHKT2;1R：(SEQID NO：4)。PCR扩增体系为：2×TransStartFastPfuPCRSuperMix10μL，上下游引物(10μM)各0.5 μL，水8μL，DNA 模板(100ng/μL) 1μL。

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸90sec，共进行35个循环；72℃延伸8min；最后4℃保存。扩增实验需进行3次重复。PCR产物经1.5%琼脂糖电泳检测，切取目的片段扩增条带，使用Easy⁃Pure Quick Gel Extraction Kit 进行胶回收。胶回收产物利用pEASY-Blunt Zero Cloning Kit进行连接，并转化大肠杆菌，经摇菌和抗性平板培养后，挑取阳性单菌落，送由华大公司完成测序。测序后获得SEQ ID NO：1所示的ZmHKT2;1核苷酸序列。

提取植物表达载体pCAMBIA3301质粒DNA并用NcoI和BstEII双酶切，20μL酶切体系为：10×NEB Buffer3 12μL，NcoI 1μL，BstEII 1μL，质粒DNA 4μL，ddH2O 12μL，37℃水浴酶切1h。将pCAMBIA3301线性化质粒大片段用Easy⁃Pure Quick Gel Extraction Kit回收纯化。然后将上述PCR产物与pCAMBIA3301酶切纯化产物进行In-fusion HD反应，5μL反应体系：5×In-fusion HD Enzyme premix 1μL，PCR产物2μL，pCAMBIA3301酶切纯化产物2μL，50℃水浴反应20min。然后取2.5μL 反应产物转化Trans5α感受态细胞，提取阳性质粒，获得如图1所示结构的植物重组表达载体pCAMBIA3301-ZmHKT2;1，进行酶切电泳检测和测序验证，获得如SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列。

实施例2农杆菌介导的烟草遗传转化

载体pCAMBIA3301-ZmHKT2;1通过液氮冻融法转入农杆菌EHA105中。在含有50μg/mL卡那霉素、pH7.0的液体LB培养基中，振荡培养至OD600值在0.6-1.0之间，4000rpm离心10min收集菌体，用侵染培养基（MS培养基附加2g/L MES，pH5.8）重悬菌体至OD600为1.0，28℃温浴2-4h左右备用。将烟草无菌苗叶片切成5mm×5mm的小块（即外植体）备用。

将切好的烟草叶片小块浸入上述制备好的农杆菌悬液中，浸泡10min，期间轻轻晃动2-3次。烟草叶片用无菌滤纸吸干，接种到共培养培养基（MS培养基附加2g/L MES）上，25℃暗光或弱光条件下共培养。烟草叶片共培养3天后转入抑菌培养基（MS培养基附加2mg/L6-BA、0.2mg/L NAA、500mg/L头孢霉素）上进行抑菌培养。抑菌培养7天后，再转移至筛选培养基（MS培养基附加2mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、2 mg/L Basta、250mg/L头孢霉素）中。转化材料每2周用筛选培养基继代一次。筛选继代过程中会有不定芽产生，在不定芽长出3-4片小叶后，可转入生根培养基（MS培养基附加5mg/L Basta、250mg/L头孢霉素）中，培养10天左右不定芽生根，获得再生植株。

实施例3 ZmHKT2;1 转基因植株的分子鉴定

取T2 代转基因植株嫩叶及野生型嫩叶，采取CTAB 法提取基因组DNA。根据重组表达载体pCAMBIA3301-ZmHKT2;1序列合成扩增引物，Bar基因扩增产物大小为242bp，HKT基因扩增产物大小为1650bp.引物序列为： ZmHKT2;1-FF：CTGTCCGTGAAAGCATTTGAG(SEQ ID NO：5)；ZmHKT2;1-FR：CTGTCCGTGAAAGCATTTGAG(SEQ ID NO：6)；Bar-F1：agtcgaccgtgtacgtctcc(SEQ ID NO：7)；Bar-R1：gaagtccagctgccagaaac(SEQ ID NO：8)。分别以ZmHKT2;1转基因植株、野生型植株DNA(ck)、水和质粒为模板，进行PCR检测。扩增体系为：2×TaqPCRMasterMix(+dye)10μL，引物各0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O7μL。反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸50sec，共进行35个循环；72℃延伸7min；最后4℃保存。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析(图2和图3)。图2中可以看出，10个ZmHKT2;1转基因材料中有8个材料扩增出Bar基因检测特异性条带，而水和野生型植株(ck)中均没有扩增出该条带，质粒也扩增出Bar基因检测特异性条带。图3中可以看出，8个Bar基因检测阳性的ZmHKT2;1转基因材料中均扩增出ZmHKT2;1基因检测特异性条带，而水和野生型植株(ck)中均没有扩增出该条带，质粒也扩增出ZmHKT2;1基因检测特异性条带。由此证明ZmHKT2;1基因已经转入烟草基因组中。

实施例4转基因株系的幼苗耐盐性的鉴定

将筛选出的阳性转基因烟草株系和野生型烟草的种子，分别播种于不同的营养钵中。置于22℃/20℃（昼/夜），相对湿度60%，昼夜节律为14h/10h，光照强度为450 l mol m^-2 s^-1的条件下进行培养。待种子萌发后，生长至15d龄时，每隔2天使用150mM NaCl溶液进行透灌处理，处理持续共15天。处理15天后比较转基因材料与野生型材料间的差异。图4中可以看出，野生型材料和转基因材料在正常供水条件下，植株生长没有明显的差异；单在盐胁迫条件下野生型材料几乎全部死亡，而转基因材料则保持了较好的生长态势，只有少部分植株出现了叶片失绿的情况。结果证明过表达ZmHTK2;1基因提高了转基因烟草材料在幼苗阶段的耐盐能力。

实施例5转ZmHKT2;1基因的烟草中MDA（丙二醛)含量以及CAT (过氧化氢酶)、POD（过氧化物酶）和SOD（超氧化物歧化酶）活性检测

转基因材料在200mM NaCl处理0和24小时后分别进行MDA含量以及CAT、POD和SOD活性检测（图5）。

由图5可以看出，野生型材料中MDA含量在盐胁迫后相较转基因材料发生了更为明显的上升。说明在胁迫后，野生型材料体内产生了更多的氧自由基，最终导致MDA含量的大幅上升。MDA的上升会对植物材料产生毒害作用，影响植物的生长。而转基因材料中MDA值上升较小，分析其原因是由于转基因材料中以CAT、POD和SOD类为代表的氧自由基清除酶类在胁迫后其活性发生了较野生型材料更为显著的上升，导致清除氧自由基的效率升高，减少了氧自由基对植物的毒害作用，提高了植物在盐胁迫下的存活几率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林省农业科学院

<120> 玉米耐盐基因ZmHKT2;1及其应用

<130> 2017.04.20

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1668

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 1

atgcctgtcc ggctccatgt cttggccagc accgcgaggc acgccgccag ctcgtcagcg 60

ctcgtcttcc ggctcgtcgc cttccgcctc accccgcttc tgctccacct gtcctacttc 120

ctcgccatcg acctgctcgg cttcctcgcc ctggtgctgc tcaggcgaag cagccccgcc 180

gcgggggcgt accgtccgcg ctacgtcgac gtgctcttca tgtccacgtc cgcggtcacg 240

gtcaccgggc tggccaccgt cgagatggag gacctgtccg cctcccagct cgtcgtcctc 300

accctcctca tgctcctggg cagcgaggtg ttcgtctccg tgctcggcct cgtcctcgag 360

tcgtcgcgcc agcagcgaca gcagcgcggt cagtctcgtc gtcaggatca cgccggcagg 420

gtaataaggc cgtcgtcggt cacggccgcc gtccgcgacg agccggacct cgaagaggcg 480

ggtaataata ttaatagcca ggcgcctccg tcgtcgtctg aggactcgtc cggcgacggt 540

gacaaccaca aagagagatg ccgcgccgtc agaagcctag cgctcgtgct ctcggcctac 600

atggccgcgg tcctcgtcgc cggctccgtg ctggtcttcg cgtacgtggc caccgtcccg 660

gccgcgcgcg acgtgctggc gaggaagcgc ctcggcgccg cgctcttctc ggtgtccgcc 720

accgtgtcgt ccttcaccaa cggcggcctg ctcccgacga acgagagcat ggcggtgttc 780

gccgcgaacc ggggcctgct gctgttgctc gcggggcaga tcctggcagg ctgcacgctg 840

ctgccggtgt tcctcaggct ggcggtaggc gccacgagat gggtggcgag agcggtgtcc 900

gcggggcgag gagggcacga cgaggagctc gagcccgtga gcgtggaccg gagcgccgcc 960

gccgcgggct tcggccacct gctgccgtcc gtcccgcggg cggcgtccct cgccgccacg 1020

gtggtcgccg tcgcggccgc cgccgcggcg ctcctctgct gcatgaactg gaactccgcg 1080

gtgttcgcgg ggctcacgcc cggcgagaag gtcaccaacg ccgtgttcat ggccgtcaac 1140

gtgcggcagg ccggggagaa ctccgtcgac tgctccctcg tcgcgccggc cgtgctggtg 1200

ctgttcctcg ccatgatgtg catcccggcg tcagcgacat tgctgtccgt gcacgacagc 1260

ggcagcgaca ggaagaggag cggcgctgga gaagcagaac gcaaggatgg gacggagaag 1320

aagagaagac tgtcgctgaa cagcatgctg ctgtcgccgc tggcctgcaa cgccgcagcg 1380

gtgatgctcg cctgcgtcac cgagaggcga tcgatcgccg gcgacccgct caacttctcc 1440

acgttcaacg tgatcttcga ggtggtcagt gcttatggca acgtggggct gtccactggc 1500

tacgcctgct cgaggctgct gcccgcggcg gcggaggcga ccaccgcttg ccatgacaag 1560

ccgtacagct tctctgggtg gtggagcgac caggggaagc tgctcctggt tctcctcatg 1620

ctctacggga ggctcaaatg ctttcacgga cagcgacgca gggggtga 1668

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<120> 玉米耐盐基因ZmHKT2;1及其应用

<130> 2017.04.20

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 555

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 1

Met Pro Val Arg Leu His Val Leu Ala Ser Thr Ala Arg His Ala Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ser Ala Leu Val Phe Arg Leu Val Ala Phe Arg Leu Thr Pro

20 25 30

Leu Leu Leu His Leu Ser Tyr Phe Leu Ala Ile Asp Leu Leu Gly Phe

35 40 45

Leu Ala Leu Val Leu Leu Arg Arg Ser Ser Pro Ala Ala Gly Ala Tyr

50 55 60

Arg Pro Arg Tyr Val Asp Val Leu Phe Met Ser Thr Ser Ala Val Thr

65 70 75 80

Val Thr Gly Leu Ala Thr Val Glu Met Glu Asp Leu Ser Ala Ser Gln

85 90 95

Leu Val Val Leu Thr Leu Leu Met Leu Leu Gly Ser Glu Val Phe Val

100 105 110

Ser Val Leu Gly Leu Val Leu Glu Ser Ser Arg Gln Gln Arg Gln Gln

115 120 125

Arg Gly Gln Ser Arg Arg Gln Asp His Ala Gly Arg Val Ile Arg Pro

130 135 140

Ser Ser Val Thr Ala Ala Val Arg Asp Glu Pro Asp Leu Glu Glu Ala

145 150 155 160

Gly Asn Asn Ile Asn Ser Gln Ala Pro Pro Ser Ser Ser Glu Asp Ser

165 170 175

Ser Gly Asp Gly Asp Asn His Lys Glu Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser

180 185 190

Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Tyr Met Ala Ala Val Leu Val Ala Gly

195 200 205

Ser Val Leu Val Phe Ala Tyr Val Ala Thr Val Pro Ala Ala Arg Asp

210 215 220

Val Leu Ala Arg Lys Arg Leu Gly Ala Ala Leu Phe Ser Val Ser Ala

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser Phe Thr Asn Gly Gly Leu Leu Pro Thr Asn Glu Ser

245 250 255

Met Ala Val Phe Ala Ala Asn Arg Gly Leu Leu Leu Leu Leu Ala Gly

260 265 270

Gln Ile Leu Ala Gly Cys Thr Leu Leu Pro Val Phe Leu Arg Leu Ala

275 280 285

Val Gly Ala Thr Arg Trp Val Ala Arg Ala Val Ser Ala Gly Arg Gly

290 295 300

Gly His Asp Glu Glu Leu Glu Pro Val Ser Val Asp Arg Ser Ala Ala

305 310 315 320

Ala Ala Gly Phe Gly His Leu Leu Pro Ser Val Pro Arg Ala Ala Ser

325 330 335

Leu Ala Ala Thr Val Val Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu

340 345 350

Cys Cys Met Asn Trp Asn Ser Ala Val Phe Ala Gly Leu Thr Pro Gly

355 360 365

Glu Lys Val Thr Asn Ala Val Phe Met Ala Val Asn Val Arg Gln Ala

370 375 380

Gly Glu Asn Ser Val Asp Cys Ser Leu Val Ala Pro Ala Val Leu Val

385 390 395 400

Leu Phe Leu Ala Met Met Cys Ile Pro Ala Ser Ala Thr Leu Leu Ser

405 410 415

Val His Asp Ser Gly Ser Asp Arg Lys Arg Ser Gly Ala Gly Glu Ala

420 425 430

Glu Arg Lys Asp Gly Thr Glu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Ser

435 440 445

Met Leu Leu Ser Pro Leu Ala Cys Asn Ala Ala Ala Val Met Leu Ala

450 455 460

Cys Val Thr Glu Arg Arg Ser Ile Ala Gly Asp Pro Leu Asn Phe Ser

465 470 475 480

Thr Phe Asn Val Ile Phe Glu Val Val Ser Ala Tyr Gly Asn Val Gly

485 490 495

Leu Ser Thr Gly Tyr Ala Cys Ser Arg Leu Leu Pro Ala Ala Ala Glu

500 505 510

Ala Thr Thr Ala Cys His Asp Lys Pro Tyr Ser Phe Ser Gly Trp Trp

515 520 525

Ser Asp Gln Gly Lys Leu Leu Leu Val Leu Leu Met Leu Tyr Gly Arg

530 535 540

Leu Lys Cys Phe His Gly Gln Arg Arg Arg Gly

545 550 555

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<110> 吉林省农业科学院

<120> 玉米耐盐基因ZmHKT2;1及其应用

<130> 2017.04.20

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

catgccatgg catgatgcct gtccggctcc atgt 34

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<110> 吉林省农业科学院

<120> 玉米耐盐基因ZmHKT2;1及其应用

<130> 2017.04.20

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gggtaaccct caccccctgc gtcgctgtc 29

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<120> 玉米耐盐基因ZmHKT2;1及其应用

<130> 2017.04.20

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ctgtccgtga aagcatttga g 21

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<110> 吉林省农业科学院

<120> 玉米耐盐基因ZmHKT2;1及其应用

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ctgtccgtga aagcatttga g 21

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<120> 玉米耐盐基因ZmHKT2;1及其应用

<130> 2017.04.20

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agtcgaccgt gtacgtctcc 20

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<110> 吉林省农业科学院

<120> 玉米耐盐基因ZmHKT2;1及其应用

<130> 2017.04.20

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gaagtccagc tgccagaaac 20

Claims

1.一种编码玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKT2;1，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种玉米HKT转运蛋白，其特征在于：

1) 由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，或

2) 在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或插入一个或几个氨基酸所获得的具有同等活性的蛋白质。

3.含有权利要求1所述基因ZmHKT2;1的重组表达载体pCAMBIA3301-ZmHKT2;1。

4.含有权利要求1所述基因ZmHKT2;1的工程菌。

5.权利要求1所述的基因ZmHKT2;1在转化植物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是在烟草内转化所述基因ZmHKT2;1，提高烟草的耐盐能力。

7.根据权利要求5 或6 所述的应用，其特征在于，所述应用的步骤包括：

载体pCAMBIA3301-ZmHKT2;1通过液氮冻融法转入农杆菌EHA105中；在含有50μg/mL卡那霉素、pH7.0的液体LB培养基中，振荡培养至OD600值在0.6-1.0之间，4000rpm离心10min收集菌体，用侵染培养基（MS培养基附加2g/L MES，pH5.8）重悬菌体至OD600为1.0，28℃温浴2-4h左右备用；将烟草无菌苗叶片切成5mm×5mm的小块（即外植体）备用；将切好的烟草叶片小块浸入上述制备好的农杆菌悬液中，浸泡10min，期间轻轻晃动2-3次；烟草叶片用无菌滤纸吸干，接种到共培养培养基（MS培养基附加2g/L MES）上，25℃暗光或弱光条件下共培养；烟草叶片共培养3天后转入抑菌培养基（MS培养基附加2mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、500mg/L头孢霉素）上进行抑菌培养；抑菌培养7天后，再转移至筛选培养基（MS培养基附加2mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、2 mg/L Basta、250mg/L头孢霉素）中；转化材料每2周用筛选培养基继代一次；筛选继代过程中会有不定芽产生，在不定芽长出3-4片小叶后，可转入生根培养基（MS培养基附加5mg/L Basta、250mg/L头孢霉素）中，培养10天左右不定芽生根，获得再生植株。