CN108707611A

CN108707611A - 一种三七类逆渗透蛋白基因PnOLP1及应用

Info

Publication number: CN108707611A
Application number: CN201810418978.8A
Authority: CN
Inventors: 刘迪秋; 赵秦; 李欣; 普丽梅; 曲媛; 葛锋
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2018-10-26
Anticipated expiration: 2038-05-04
Also published as: CN108707611B

Abstract

本发明公开了一种三七类逆渗透蛋白基因PnOLP1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质，本发明通过功能基因组学相关技术研究证实PnOLP1基因具有提高植物抗真菌的功能，将本发明抗真菌PnOLP1基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，结果转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性，实验结果显示超表达PnOLP1的转基因烟草对胶胞炭疽菌、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、稻黑孢菌等四种真菌的生长具有显著的抑制作用。

Description

一种三七类逆渗透蛋白基因PnOLP1及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种三七类逆渗透蛋白基因PnOLP1及应用。

背景技术

植物在生长发育过程中，会受到不良环境因素的影响，比如病害、昆虫、干旱、淹水等，从而导致其生长发育不良、产量减少，甚至绝收。植物病害是农业生产中一个非常棘手的问题，尤其是由真菌、细菌、病毒等生物因素引起的病害，具有传染性、危害大、持续时间长等特点。其中真菌病害约占到植物总病害的80％，严重影响农作物的产量和品质。由于化学农药具有效率高、速度快、抗菌谱广、成本低、使用简单等优点，成为农作物病害防治的主要手段。但是长期大量使用化学农药，容易使土质退化、环境污染、病原菌产生抗药性。此外，依靠传统育种方法培育抗性品种也能有效控制病害的发生，但其时间长、见效慢、投入巨大、抗病资源难以获得。因而，上述这两种方法都不能很好地解决植物病害问题。随着重组DNA技术的创立和发展，利用基因工程技术来培育抗病植物新品种已取得初步成效，快速、安全、便捷，且有望从根本上解决植物病害问题。

植物在受到外界生物因素如真菌、病毒、昆虫，或不良环境因素如干旱、盐渍、低温等非生物因子引起的胁迫时会作出适宜的应答，并诱导一些防御相关基因的表达。蛋白质原来的合成途径受到抑制，同时产生许多新的蛋白。这些蛋白分为两大类：一类是功能蛋白，主要包括离子通道蛋白、逆渗透调节蛋白（osmotin）、脱毒酶等；另一类是调节蛋白，主要包括转录因子、蛋白激酶和一些信号分子等（何宝坤，李德全. 植物渗调蛋白的研究进展. 生物技术通报. 2002, 2: 6-10）。Osmotin蛋白最初是在渗透胁迫下从烟草（Nicotiana tabacum）细胞中分离出来的，是一种24-26kDa的蛋白质，属于病程相关蛋白（Pathogenesis-related，PR）PR-5家族，与thaumatin具有相似性。PR-5蛋白在体内针对多种植物病原体具有抗菌特性。

从烟草中获得的osmotin蛋白对马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、白色念珠菌(Candida albicans)、粗燥脉孢霉(Neurospora crassa)和里氏木霉(Richoderma reesei)等多种病原菌有抑制作用（Vigers AJ, Roberts W K, Selitrennikof CP. A newfamily of plant antifungal proteins. Molecular Plant-Microbe Interaction.1991,4:315-323）。从牛角瓜（Calotropis procer）中纯化的逆渗透蛋白CpOsm相对热稳定，并且在很宽的pH范围内保持其抗真菌活性，因此，它可能有助于开发新型的抗真菌转基因作物（Ramos MV, de Oliveira RS, Pereira HM, et a1. Crystal structure of anantifungal osmotin-like protein from Calotropis procera and its effects onFusarium solani spores, as revealed by atomic force microscopy: Insights intothe mechanism of action. Phytochemistry. 2015, 119:5-18.）。以CpOsm产生的多克隆抗体的免疫交叉反应性来检测巨大隐花线虫（Cryptostegia grandiflora）和鸡蛋花（Plumeria rubra）中的两种潜在的逆渗透蛋白，与CpOsm蛋白不同，它们不表现出对抗镰刀菌(F. solani)和炭疽菌(C. gloeosporioides)的抗真菌活性（Freitas CD, Silva MZ,Bruno-Moreno F, et al. New constitutive latex osmotin-like proteins lackingantifungal activity. Plant Physiol Biochem. 2015, 96:45-52.）。来源于可可树（Theobroma cacao）的逆渗透蛋白TcOsm1及其两种衍生肽具有抗菌特性，其N端有五个氨基酸残基差异（Loeni L, Falcao, Joseilde O, Silva-Werneck, et a1. Antimicrobialproperties of two novel peptides derived from Theobroma cacao osmotin.Peptides. 2016, 79:75-82.）。抗菌试验表明，大肠杆菌中表达的TcOsm1在体外抑制巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）的生长。从甜罗勒（Ocimum basilicum）中分离出的类逆渗透蛋白（osmotin like protein）ObOLP具有675个核苷酸组成的完整开放阅读框，其成熟蛋白质长度为225个氨基酸，并含有16个可能形成8个二硫键的半胱氨酸残基（Rather IA,Awasthi P, Mahajan V, et al. Molecular cloning and functionalcharacterization of an antifungal PR-5protein from Ocimum basilicum. Gene.2015, 558:143-151.）。茉莉酸甲酯和机械创伤明显诱导了ObOLP基因的表达，将ObOLP的编码序列克隆并在细菌宿主中表达，产生25kDa重组-HIS标记的蛋白质，显示出对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母、白色念珠菌的抗菌活性。

本发明中类逆渗透蛋白基因PnOLP1来自三七(Panax notoginseng)。三七，又名田七、山漆和金不换等，是五加科(Araliaceae)人参属(Panax)的一种多年生阴生草本植物，是我国的传统名贵中药材，主要分布在中国云南省文山州和广西百色地区。三七中含有大量三七皂苷，具有消肿镇痛、抗炎、抗衰老的作用，能调节人体免疫功能、消除疲劳、延缓衰老。三七总皂苷还能够有效改善记忆力，是历史悠久的药食两用天然资源，传统用于活血化瘀，跌打损伤以及滋补强壮等。然而三七生长周期长，性喜温暖阴湿，病害严重，主要由茄腐镰刀菌等真菌引起的根腐病是三七栽培过程危害最为严重的一类病害，严重影响三七产量和药材的品质。目前尚无有效环保的防治方法，大量使用化学农药是唯一防治手段，因而在一定程度上导致了三七药材的农残和重金属含量超标。因此，对于三七抗病相关基因的克隆、功能分析和应用研究尤为迫切。

发明内容

本发明的目的是提供一种三七类逆渗透蛋白基因PnOLP1，其是从三七中克隆获得的具有抗真菌活性的类逆渗透蛋白基因，PnOLP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因全长为1098bp，包含一个744bp的开放阅读框、43bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR)及311bp的3′UTR，编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明分离克隆三七的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中过量表达，并通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础；发明人将这个基因命名为PnOLP1。

本发明所述类逆渗透蛋白基因PnOLP1的编码区是序列表SEQ ID NO:1中第44-787位所示的核苷酸序列。

本发明涉及分离包含PnOLP1的DNA片段并鉴定其功能，其中所述DNA片段如序列表SEQ ID NO:1所示，对该基因进行序列分析，发现PnOLP1全长cDNA为1098bp，包含一个744bp的开放阅读框(ORF)、43bp的5’非翻译区(untranslated region，UTR)、311 bp的3’UTR，其中ORF编码一个具有247个氨基酸的蛋白质。BLAST分析结果显示三七PnOLP1部分序列与醉蝶花( Tarenaya hassleriana)OLP基因(XM_010524831)具有88%的相似性，与赤藓类植物（Erythranthe guttatu）OLP基因(XM_012971908)具有81%的相似性，与巨桉(Eucalyptus grandis) OLP基因(XM_010034840)具有80%的相似性，与油棕(Elaeis guineensis) OLP基因(XM_010920087 )具有77%的相似性。蛋白质同源性分析表明PnOLP1编码的蛋白质序列与栓皮槠(Quercus suber)的OLP具有85%的相似性，与紫花风铃(Handroanthus impetiginosus)与虾衣花（Erythranthe guttata）的OLPs都具有83%的相似性。超表达序列表SEQ ID NO:1所示序列可以增强烟草对胶胞炭疽菌、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌以及稻黑孢菌的抗性。

本发明将三七类逆渗透蛋白基因PnOLP1应用在提高烟草对胶胞炭疽菌、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌以及稻黑孢菌的抗性中，具体操作如下：

(1)采用扩增PnOLP1的特异引物，从接种茄腐镰刀菌后的三七根中提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增出PnOLP1的全长编码区，然后将其连接到pGEM-T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

(2)用限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切pGEM-T-PnOLP1载体和植物表达载体pCAMBIA2300S，通过胶回收得到目的基因片段和载体大片段；再将所获得PnOLP1基因片段与pCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物超表达载体；之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；

(3)重组载体T-DNA上具有卡那霉素抗性基因，用添加卡那霉素的分化培养基筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到真正的转基因植株，分析转基因植株对于植物病原真菌的抗性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明来自三七的PnOLP1基因能增强植物对几种病原真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料；利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性；它不仅可以为大规模生产作物、花卉、药用植物等提供方便，大量减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减小环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中部分PnOLP1转基因烟草基因组DNA的PCR分析结果，其中Marker：DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；阳性对照：质粒pGEM-T-PnOLP1为模板的PCR反应；WT：非转基因烟草(野生型)总DNA为模板进行的PCR；

图2是本发明中部分阳性PnOLP1转基因烟草中PnOLP1转录水平的表达分析结果图，其中Marker：DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；WT：非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；阳性对照：质粒pGEM-T-PnOLP1为模板的PCR产物；

图3是本发明中PnOLP1转基因烟草体外抗真菌活性的抑菌效果图；其中a、b、c、d图示中的真菌分别是尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、稻黑孢菌、胶孢炭疽菌；WT为野生型烟草的总蛋白；Buffer为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：PnOLP1全长基因克隆以及序列分析

用茄腐镰刀菌接种三七的根，用接种后12 h的根提取总RNA，用液氮将处理过的三七的根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA；采用M-MLV逆转录酶(promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5μg Total RNA，依次加入50 ng oligo (dT)、2 μL dNTP Mix (2.5 mM each)，用DEPC水将反应体积补齐至14.5 μL；混匀后，70℃加热变性5 min后迅速在冰上冷却5 min，然后依次加入4 μL 5×First-stand buffer、0.5 μL RNasin (200U)、1 μL M-MLV (200U)，混匀并简短离心，42℃温浴1.5 h，取出后70℃加热10 min，终止反应；cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板扩增目的基因PnOLP1，所用上下游引物序列分别为5’CTCCATTTTCCCTCTCATCTCTACA3’及5’CGTACTACTTTCGATGCCTCTTGTA3’。采用Advantage^TM 2PCR Enzyme (Clontech)扩增出目的基因。PCR反应条件：95℃ 1min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 50s，32个循环；72℃ 5min。反应体系(20 μL)为1 μL cDNA、2 μL 10×Advantage 2PCR Buffer、1.8 μL dNTP Mix (10mM each)、0.2 μL 正向引物(10 μM)、0.2 μL 反向引物(10 μM)、0.2 μL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、14.6 μL PCR-Grade water。PCR结束后，取8μL进行琼脂糖凝胶电泳，用以检测扩增产物的特异性以及大小。

所得到PCR产物只有一条DNA带，直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pGEM-T vector kit（Promega），反应体系和操作过程为：取1.5 μL PCR产物，依次加入1 μLpGEM-T vector（50 ng/μL）和2.5 μL 2×Ligation solution I，混匀后置于16 ℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中；使用含有氨苄青霉素（ampicillin，Amp）的LB固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增PnOLP1的特异引物鉴定出多克隆位点插入PnOLP1的克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的PnOLP1全长cDNA为1098bp，通过NCBI ORF finder （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析发现其包含一个744bp的开放读码框（见序列表），PnOLP1编码一个含247个氨基酸的蛋白质PnOLP1，其分子量约为26.4 KDa，等电点约为7.21；借助生物信息学软件SignalP 4.1分析PnOLP1编码的蛋白序列，检测其是否具有N端信号肽；结果显示在PnOLP1中有检测到信号肽的存在，表明PnOLP1是一种分泌蛋白。

实施例2：植物超表达载体构建

采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（上海生工）提取插入PnOLP1的大肠杆菌质粒pGEM-T-PnOLP1以及植物表达载体pCAMBIA2300S的质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶BamHI和EcoRI分别对质粒pGEM-T-PnOLP1和pCAMBIA2300S进行双酶切(100 μL体系)，反应体系和操作过程为：分别取20 μLpGEM-T-PnOLP1和pCAMBIA2300S质粒、依次加入10μL 10×H buffer、5μL EcoRI、5 μLBamHI、60 μL ddH₂O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用试剂盒对PnOLP1片段和pCAMBIA2300S载体大片段分别进行胶回收，取1μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。

利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，将回收的PnOLP1DNA片段和pCAMBIA2300S载体片段连接起来，反应体系(20 μL)和操作过程为：取10μL PnOLP1DNA片段依次加入2μLpCAMBIA2300S载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μLddH₂O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50 mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增PnOLP1的特异引物进行PCR，挑选出PnOLP1与pCAMBIA2300S成功连接的克隆，在得到的阳性菌株中加入甘油并置于-80℃保存备用。

采用试剂盒提取并纯化上述大肠杆菌DH5α中的pCAMBIA2300S-PnOLP1质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300S-PnOLP1转入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取0.2 μg pCAMBIA2300S-PnOLP1，质粒加入含有200 μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，随后转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5min，再冰浴2min，之后加入500μL LB液体培养基于28℃振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50mg/L Km的LB固体培养基上，28℃倒置培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增PnOLP1的特异性引物进行PCR反应，检测pCAMBIA2300S-PnOLP1是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草(Nicotiana tabacum)，将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1 %的HgCl₂浸泡8 min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28℃暗培养5-8d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16h/d光照），以后每月用MS培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300s-PnOLP1质粒的农杆菌LBA4404菌种，取20 μL接种于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1 mL浑浊的菌液至含有50mg/L Km的LB固体培养基上，28℃培养48 h；随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃振荡培养5-8 h以活化农杆菌。

取烟草无菌苗叶片切成1 cm²左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，浸染时间为15 min，用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/Lsucrose+6 g/L琼脂，22℃无光条件下共培养2天。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L sucrose+6g/L琼脂+50mg/L Km+200 mg/L 头孢霉素（cefotaxime sodium salt，Cef）；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16h/d光照，8h/d黑暗），待烟草长出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/L Cef的MS培养基继代培养。

采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，将提取的基因组DNA取1μL通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组DNA为模板用扩增PnOLP1的特异引物进行PCR，PCR结束后，取8μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，PnOLP1转基因烟草共筛选到49株阳性转基因植株。

实施例4：转基因烟草中PnOLP1的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

取阳性转基因单株以及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDNA第一链，并以此为模板用扩增PnOLP1的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基因单株中PnOLP1转录水平的表达，总RNA提取以及RT-PCR的方法与实施例1中相同，PCR结束之后，取5μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到27个转基因单株中PnOLP1在转录水平大量表达，这些单株的编号为1～27。

将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基（200 g/L马铃薯、15 g/L琼脂、20g/L葡萄糖）上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作，首先取0.5 g转基因烟草单株（编号分别为4、6、9、11）及野生型叶片放入研钵中，加入1mL蛋白提取液（1M NaCl，0.1M 乙酸钠，1% PVP，pH6），充分研磨；转入1.5 mL离心管中，混匀后4℃静置过夜，4℃离心30 min（12,000 g/min），取上清于新的1.5 mL离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2 μg/μL，然后分别取20 μL滴于各真菌培养基的无菌滤纸上，在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照（提取蛋白所用的溶液），28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价PnOLP1转基因烟草的体外抗真菌活性，结果如图3所示，PnOLP1转基因烟草蛋白对尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、稻黑孢菌、胶孢炭疽菌的生长具有很强的抑制作用。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种三七类逆渗透蛋白基因PnOLP1及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1098

<212> DNA

<213> 三七(Panax notoginseng)

<400> 1

gccgggacac acaaacctct ccattttccc tctcatctct acaatggctt ccactcttct 60

agtctctttc tctctcctcc tcgttttatg cactctctcc gccgctaccc aaccgggcct 120

cattctaacc gtagttaaca actgcccctt caccgtttgg cccgccattc agcccaactc 180

cggccaccct gtcctcgagc gcggcggctt cgccctccat accctcaccc atcgctcctt 240

ccccgccccc ccggcccact ggtccggtcg cctctgggcc cgcaccggct gcacctattc 300

ccacaaccgc ttcacctgca ccaccggcga ctgcggcggc cgcctcgagt gcgacggcaa 360

cggcggcgcc ccccccgcaa ccctcgccca gttctccctc caccacggcc acactgatct 420

ctcctcctac gccgtcagcc tagtcgacgg cttcaacctc cccatgaccg tcactcctca 480

cgagggccac ggcacgtgcc ccgtagtcgg ctgccgggcc gacctccttg ccacttgtcc 540

cgttagcttg cagctccgtt caccctccgg ccacgtggtg gggtgcaaga gcgcgtgtgt 600

tgcatttggg accgacgagc tttgttgtag gaatcattac aatagccctc agagttgcaa 660

ggcttccaac tattcggatt ttttcaaaca cgcgtgtccg gccacgttca cctacgccca 720

tgatagtcct tctctgacgc acgactgctc tgcgccacgt gagctcaagg tcattttctg 780

tcactaattg tacaagaggc atcgaaagta gtacgggagt agaacttagc catgtgttat 840

ggattagtct taaataattg ggggggggga ttaaggggtt gttaggcttt aatgtccgct 900

gatgggtggg tctgggtgtt ctttaattca gaggtttaag cttattagtt aatactagta 960

tgtttgtgtc attaagattt aagcttagtg ttgtgttgtt ttatctattt atagtaaaag 1020

aatatgtgtt tggcaactta gtgagcttat aatgctctgt tttaatgacg gacaaaaaaa 1080

aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1098

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> 三七(Panax notoginseng)

<400> 2

Met Ala Ser Thr Leu Leu Val Ser Phe Ser Leu Leu Leu Val Leu Cys

1 5 10 15

Thr Leu Ser Ala Ala Thr Gln Pro Gly Leu Ile Leu Thr Val Val Asn

20 25 30

Asn Cys Pro Phe Thr Val Trp Pro Ala Ile Gln Pro Asn Ser Gly His

35 40 45

Pro Val Leu Glu Arg Gly Gly Phe Ala Leu His Thr Leu Thr His Arg

50 55 60

Ser Phe Pro Ala Pro Pro Ala His Trp Ser Gly Arg Leu Trp Ala Arg

65 70 75 80

Thr Gly Cys Thr Tyr Ser His Asn Arg Phe Thr Cys Thr Thr Gly Asp

85 90 95

Cys Gly Gly Arg Leu Glu Cys Asp Gly Asn Gly Gly Ala Pro Pro Ala

100 105 110

Thr Leu Ala Gln Phe Ser Leu His His Gly His Thr Asp Leu Ser Ser

115 120 125

Tyr Ala Val Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn Leu Pro Met Thr Val Thr

130 135 140

Pro His Glu Gly His Gly Thr Cys Pro Val Val Gly Cys Arg Ala Asp

145 150 155 160

Leu Leu Ala Thr Cys Pro Val Ser Leu Gln Leu Arg Ser Pro Ser Gly

165 170 175

His Val Val Gly Cys Lys Ser Ala Cys Val Ala Phe Gly Thr Asp Glu

180 185 190

Leu Cys Cys Arg Asn His Tyr Asn Ser Pro Gln Ser Cys Lys Ala Ser

195 200 205

Asn Tyr Ser Asp Phe Phe Lys His Ala Cys Pro Ala Thr Phe Thr Tyr

210 215 220

Ala His Asp Ser Pro Ser Leu Thr His Asp Cys Ser Ala Pro Arg Glu

225 230 235 240

Leu Lys Val Ile Phe Cys His

245

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ctccattttc cctctcatct ctaca 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

cgtactactt tcgatgcctc ttgta 25

Claims

1.一种三七类逆渗透蛋白基因PnOLP1，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质。

2.权利要求1所述的三七类逆渗透蛋白基因PnOLP1在提高烟草对胶胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)抗性中的应用。