CN112481418A - 一种实时荧光定量pcr引物及其应用 - Google Patents

一种实时荧光定量pcr引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种实时荧光定量PCR引物及其应用，所述引物包括根据慢病毒载体感染元件WPRE设计的荧光定量PCR引物和根据内参基因GAPDH设计的荧光定量PCR引物。本发明方法可用于绝对定量QPCR检测慢病毒滴度，操作简便，能够快速、准确、低成本地检测各类慢病毒滴度，尤其是不带荧光慢病毒的滴度。

Description

一种实时荧光定量PCR引物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种实时荧光定量PCR(Real-timeQuantitative PCR Detecting System，QPCR)引物及其应用。
背景技术
慢病毒载体(Lentiviral veCtor，LVs)是基于HIV病毒改造而成的病毒载体，能高效地将目标基因片段导入各类组织与细胞系。慢病毒载体主要用于一些难转染地细胞，由于目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂，慢病毒载体介导的基因表达作用持续且稳定。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有独特的优势。目前，慢病毒广泛运用于各类组织或细胞的研究中，如脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。
基于不同的用途，慢病毒有不同的版本，不同的架构。无论何种目的，何种骨架，慢病毒在使用时都必须准确地检测病毒滴度。目前，慢病毒滴度常用的检测方法包括荧光报告基因检测法(如GFP、RFP等)、基于慢病毒外壳蛋白进行的抗原抗体检测法(如P24)、检测逆转录酶活性的酶活法等。这些方法各有优劣势：抗原抗体检测法试剂盒昂贵，检测成本高；酶活法检测耗时费力，病毒用量多；荧光报告基因法简单实用，是目前使用最广泛的方法。但是很多载体不带荧光，以及在特定条件下不能使用荧光标记，因此，需要建立一种快速、简便、准确的慢病毒滴度检测方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种实时荧光定量PCR引物，能够快速、简便、准确的检测慢病毒滴度。
本发明还提出上述引物筛选的方法。
本发明还提出上述引物的应用。
根据本发明的第一方面实施方式的实时荧光定量PCR引物，所述引物包括根据慢病毒载体感染元件WPRE设计的实时荧光定量PCR引物和根据内参基因GAPDH设计的实时荧光定量PCR引物。
根据本发明的一些实施方式，利用Primer Premier5.0软件，并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则，对慢病毒载体感染元件WPRE设计出5对荧光定量特异引物，所述慢病毒载体感染元件WPRE的荧光定量特异引物为：
WPRE-QPCR1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
WPRE-QPCR1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
或
WPRE-QPCR2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
WPRE-QPCR2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
或
WPRE-QPCR3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
WPRE-QPCR3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
或
WPRE-QPCR4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
WPRE-QPCR4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
或
WPRE-QPCR5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
WPRE-QPCR5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
据本发明的一些实施方式，所述慢病毒载体感染元件WPRE的荧光定量引物为WPRE-QPCR1-F和WPRE-QPCR1-R或WPRE-QPCR2-F和WPRE-QPCR2-R。
据本发明的一些实施方式，所述慢病毒载体感染元件WPRE的荧光定量引物为WPRE-QPCR1-F和WPRE-QPCR1-R。
根据本发明的一些实施方式，利用Primer Premier5.0软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则，对内参基因GAPDH设计3对荧光定量特异引物，所述内参基因GAPDH的荧光定量引物为：
GAPDH-QPCR1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
GAPDH-QPCR1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
或
GAPDH-QPCR2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
GAPDH-QPCR2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
或
GAPDH-QPCR3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
GAPDH-QPCR3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
据本发明的一些实施方式，所述慢病毒载体感染元件WPRE的荧光定量引物为GAPDH-QPCR2-F和GAPDH-QPCR2-R。
根据本发明的第二方面实施方式的一种实时荧光定量引物的筛选方法，所述方法包括以下步骤：将合成的QPCR引物，通过荧光定量PCR进行筛选，根据QPCR熔解曲线和扩增曲线确定最优引物对。
根据本发明的第三方面实施方式的应用，所述应用为将上述引物用于检测慢病毒滴度。
根据本发明的一些实施方式，所述慢病毒包括荧光慢病毒载体包装病毒和/或不带荧光慢病毒载体包装病毒。
一种无荧光慢病毒滴度的检测方法，包括如下步骤：
S1、用待测样品感染靶细胞，并提取感染后所述靶细胞中的基因组DNA，其中所述待测样品中含有重组慢病毒；
S2、测定所述基因组DNA中WPRE元件的拷贝数以及GAPDH基因的拷贝数；
S3、根据所述WPRE元件的拷贝数和所述GAPDH基因的拷贝数计算平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数；
S4、分别使用带荧光及不带荧光的慢病毒载体包装病毒，收集并纯化上清病毒颗粒；
S5、根据所述靶细胞的总数和所述平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数计算单位体积的所述待测样品中含重组慢病毒的颗粒数，得到所述待测样品中重组慢病毒的滴度。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S2中，上述基因组DNA中WPRE元件的拷贝数以及GAPDH基因的拷贝数测定步骤包括：将所述基因DNA中WPRE元件引物混合进行实时定量PCR扩增反应，获取所述WPRE元件的Ct值；将所述基因DNA中GAPDH基因引物混合进行实时定量PCR扩增反应，获取所述GAPDH元件的Ct值；将所述WPRE元件和GAPDH基因Ct值代入对应标准曲线中，获得基因组中所述WPRE元件和GAPDH基因的含量；根据所述WPRE元件的含量计算所述基因组DNA中所述WPRE元件的拷贝数，以及根据所述GAPDH基因的含量计算所述基因组DNA中所述GAPDH基因的拷贝数。
根据本发明的一些实施方式，上述WPRE元件标准曲线的制备包括以下步骤：将WPRE元件标准品进行梯度稀释，获得梯度浓度的所述WPRE元件标准品；将每一个浓度的所述WPRE元件标准品分别与所述WPRE元件上游引物以及所述WPRE元件下游引物混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，获取扩增每一个浓度的所述WPRE元件标准品的Ct值；根据所述WPRE元件标准品的Ct值与浓度的对应关系建立所述WPRE元件的标准曲线。
根据本发明的一些实施方式，上述GAPDH基因标准曲线的制备包括以下步骤：将GAPDH基因标准品进行梯度稀释，获得梯度浓度的所述GAPDH基因标准品；将每一个浓度的所述GAPDH基因标准品分别与所述GAPDH基因上游引物以及所述GAPDH基因下游引物混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，获取扩增每一个浓度的所述GAPDH基因标准品的Ct值；根据所述GAPDH基因标准品的Ct值与浓度的对应关系建立所述GAPDH基因的标准曲线。
根据本发明的一些实施方式，所述WPRE元件标准品通过如下操作得到：将WPRE元件模板与WPRE元件模板的上游引物以及WPRE元件模板的下游引物混合进行PCR扩增反应，收集所述PCR扩增反应的产物，得到所述WPRE元件标准品，其中，所述WPRE元件模板的上游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述WPRE元件模板的下游引物的碱基序列如SEQ IDNo.3所示；及/或，所述GAPDH基因标准品通过如下操作得到：将GAPDH基因模板与GAPDH基因模板的上游引物以及GAPDH基因模板的下游引物混合进行PCR扩增反应，收集所述PCR扩增反应的产物，得到所述GAPDH基因标准品，其中，所述GAPDH基因模板的上游引物的碱基序列如SEQ ID No.5所示，所述GAPDH基因模板的下游引物的碱基序列如SEQ ID No.6所示。
根据本发明的一些实施方式，所述WPRE元件的含量计算所述基因组DNA中所述WPRE元件的拷贝数，以及所述GAPDH基因的含量计算所述基因组DNA中所述GAPDH基因的拷贝数的步骤中：
WPRE元件拷贝数(拷贝/μl)＝(NA×DNA浓度(ng/μl)×10-9)/(DNA碱基数×660g/mol)；
GAPDH元件拷贝数(拷贝/μl)＝(NA×DNA浓度(ng/μl)×10-9)/(DNA碱基数×660g/mol)；
其中，NA表示阿伏伽德罗常数6.02×1023/mol，质粒浓度已经调整为1ng/ul。
根据本发明的一些实施方式，所述靶细胞的总数和所述平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数计算单位体积的所述待测样品中含重组慢病毒的颗粒数的步骤中：
单位体积的所述待测样品中含重组慢病毒的颗粒数＝(即待测样本中重组慢病毒滴度，titer，TU/ml)＝(靶细胞总数×平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数)/待测样本的体积。
根据本发明的一些实施方式，步骤S5中所述的靶细胞为293T细胞。
一种慢病毒滴度检测试剂盒，包括上述的慢病毒载体感染元件WPRE的特异性荧光定量引物和内参基因GAPDH的特异性荧光定量引物。
根据本发明实施方式的实时荧光定量PCR引物，至少具有如下有益效果：本发明方案根据慢病毒载体感染元件WPRE设计的荧光定量PCR引物和根据内参基因GAPDH设计的荧光定量PCR引物，有效的用于绝对定量QPCR检测各类慢病毒；本发明方法可用于绝对定量QPCR检测慢病毒滴度，操作简便，能够快速、准确、低成本地检测各类慢病毒滴度，尤其是不带荧光慢病毒的滴度。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例一的WPRE和GAPDH扩增片段电泳图；
图2为本发明实施例二的WPRE引物1熔解曲线图；
图3为本发明实施例二的WPRE引物2熔解曲线图；
图4为本发明实施例二的WPRE引物3熔解曲线图；
图5为本发明实施例二的WPRE引物4熔解曲线图；
图6为本发明实施例二的WPRE引物5熔解曲线图；
图7为本发明实施例二的GAPDH引物1熔解曲线图；
图8为本发明实施例二的GAPDH引物2熔解曲线图；
图9为本发明实施例二的GAPDH引物3熔解曲线图；
图10为本发明实施例二的GAPDH引物1扩增曲线图；
图11为本发明实施例二的GAPDH引物2扩增曲线图；
图12为本发明实施例二的GAPDH引物3扩增曲线图；
图13为本发明实施例三的WPRE引物1熔解曲线图；
图14为本发明实施例三的WPRE引物1扩增曲线图；
图15为本发明实施例三的WPRE引物2熔解曲线图；
图16为本发明实施例三的WPRE引物2扩增曲线图；
图17为本发明实施例三的WPRE引物1的标准曲线图；
图18为本发明实施例三的WPRE引物2的标准曲线图；
图19为本发明实施例三的GAPDH熔解曲线图；
图20为本发明实施例三的GAPDH扩增曲线图；
图21为本发明实施例三的GAPDH标准曲线图；
图22为本发明实施例四的带荧光质粒图谱图；
图23为本发明实施例四的不带荧光质粒图谱图；
图24为本发明实施例四的病毒包装质粒电泳图；
图25为本发明实施例五的流式分析仪分析各组病毒滴度数据统计；
图26为本发明实施例五的带荧光病毒滴度数据统计与对比图；
图27为本发明实施例六的不带荧光病毒滴度数据统计与对比图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1制备WPRE元件和GAPDH基因的标准品
WPRE元件是重组慢病毒中最常见的调控元件，在正常情况下不存在于动物细胞内，可以作为重组慢病毒插入靶细胞基因组后的一个定量检测检测标志区域。GAPDH是最常见的管家基因，一般用于QPCR的内参基因使用。
1、WPRE元件标准品的制备
WPRE元件标准品的制备步骤如下：
(1)扩增慢病毒感染元件WPRE序列
慢病毒感染元件WPRE的基因序列如SEQ ID NO.1所示，根据WPRE的基因序列设计引物。其中，WPRE上游扩增引物WPRE-FP：AATCAACCTCTGGATTACAA(如SEQ ID NO.2所示)所示，WPRE下游扩增引物序列WPRE-RP：GCCCAAAGGGAGATCCGACTC(如SEQ ID NO.3所示)。使用慢病毒质粒作为模板，通过PCR扩增，获得WPRE条带，电泳图如图1所示，从图中可以看出，WPRE基因成功被克隆，条带为578bp；
(2)将扩增获得的片段进行胶回收，然后用Thermo Nanodrop 2000分光光度计测定回收产物的浓度，再将其稀释至1ng/μl，得到WPRE元件标准品；
(3)根据公式计算WPRE标准品的拷贝数：
WPRE元件拷贝数(拷贝/μl)＝(NA×DNA浓度(ng/μl)×10-9)/(DNA碱基数×660g/mol)；
其中，NA表示阿伏伽德罗常数6.02×1023/mol，质粒浓度已经调整为1ng/ul，DNA碱基数为578bp，因此WPRE元件的拷贝数(拷贝/μl)＝(6.02×1023×1×10-9)/(578×660)＝1.58×109/ul；
(4)以10为倍数梯度稀释1ng/μl WPRE标准品备用，浓度分别为：103、104、105、106、107、108拷贝/μl。
2、GAPDH基因的标准品的制备
GAPDH基因的标准品的制备步骤如下：
(1)扩增内参基因GAPDH序列
内参基因GAPDH的基因序列如SEQ ID NO.4所示，根据GAPDH的基因序列设计引物，其中，GAPDH上游扩增引物序列GAPDH-FP：ACCACAGTCCATGCCATCACTGC(如SEQ ID NO.5所示)，GAPDH下游扩增引物序列GAPDH-RP：CAGGAAATGAGCTTGACAAAGTG(如SEQ ID NO.6所示)。通过PCR扩增，获得GAPDH条带，电泳图如图1所示，从图中可以看出，GAPDH基因成功被克隆，条带为413bp；
(2)将扩增获得的片段进行胶回收，然后用Thermo Nanodrop 2000分光光度计测定回收产物的浓度，再将其稀释至1ng/μl，得到GAPDH基因标准品；
(3)根据公式计算GAPDH的拷贝数：
GAPDH基因拷贝数(拷贝/μl)＝(NA×DNA浓度(ng/μl)×10-9)/(DNA碱基数×660g/mol)；
其中，NA表示阿伏伽德罗常数6.02×1023/mol，质粒浓度已经调整为1ng/ul，DNA碱基数为578bp，因此WPRE元件的拷贝数(拷贝/μl)＝(6.02×1023×1×10-9)/(413×660)＝2.21×109/ul；
(4)以10为倍数梯度稀释1ng/μl GAPDH基因标准品，稀释后的标准品浓度分别为：103、104、105、106、107、108拷贝/μl。
WPRE元件基因序列(SEQ ID No.1)具体如下：
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGC。
GAPDH基因序列(SEQ ID No.4)具体如下：
ACCACAGTCCATGCCATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAACTGTGGCGTGATGGCCGCGGGGCTCTCCAGAACATCATCCCTGCCTCTACTGGCGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTCATCCCTGAGCTGAACGGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCCGTGTCCCCACTGCCAACGTGTCAGTGGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGAAAAACCTGCCAAATATGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCGGAGGGCCCCCTCAAGGGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACACCCACTCCTCCACCTTTGACGCTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATTTCCTG。
实施例2检测慢病毒滴度检测的QPCR引物的筛选
1、慢病毒感染元件WPRE的QPCR引物的筛选
(1)根据QPCR引物设计原则，设计5对候选引物，引物序列见表1。
表1WPREQPCR引物序列表
Figure BDA0002861806320000051
Figure BDA0002861806320000061
(2)QPCR扩增
将实施例1中获得的WPRE片段作为模板，分别加入表1所示的WPRE元件上游引物和下游引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，反应条件为：95℃30s，进入循环；95℃5s，60℃30s，终点读板，共40个循环，获得的熔解曲线如图2-6所示。
(3)QPCR结果分析
通过引物熔解曲线确定该引物是否可用的标准为：熔解曲线是否为单一清晰的峰。WPRE的5对引物的熔解曲线如图2-6所示，从图中可以看出，引物1和2熔解曲线是单一清晰的峰，引物3、4、5熔解曲线存在杂峰，非单一清晰的峰，因此引物1和2均可作为慢病毒感染元件WPRE的QPCR引物。
2、检测内参基因GAPDH的QPCR引物的筛选
(1)根据QPCR引物设计原则，设计3对候选引物，引物序列见表2。
表2GAPDH引物序列表
Figure BDA0002861806320000062
(2)QPCR扩增。
将实施例1获得的GAPDH DNA作为模板，分别加入表2所示的GAPDH元件上游引物和下游引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，反应条件为：95℃30s，进入循环；95℃5s，60℃30s，终点读板，共40个循环，终点读板，共40个循环。
(3)QPCR结果分析
通过引物熔解曲线确定该引物是否可用的标准为：熔解曲线是否为单一清晰的峰。GAPDH引物的扩增曲线和熔解曲线如图7-12所示，从图中可以看出，引物1、3熔解曲线存在杂峰，非单一清晰的峰，引物2熔解曲线是单一清晰的峰，因此选择引物2进行后续实验。
实施例3标准曲线的制备
1、慢病毒感染元件WPRE标准品的标准曲线
以实施例1获得的6个不同浓度的WPRE元件标准品为模板，分别加入WPRE引物对1和WPRE引物对2进行实时荧光定量PCR扩增反应，反应条件为：95℃30s，进入循环；95℃5s，60℃30s，终点读板，共40个循环，终点读板，共40个循环。得到如图13-16所示的扩增曲线和熔解曲线。根据图13-16所示的扩增曲线获取扩增每一个含量的WPRE元件标准品的Ct值。根据WPRE元件标准品的Ct值与含量的对应关系建立WPRE元件标准品的标准曲线如图17-18所示。引物对1：曲线方程y＝-1.294ln(x)+40.464，R2＝0.9969；引物对2：曲线方程y＝-1.167ln(x)+36.048，R2＝0.9923，其中横坐标为WPRE元件的标准品含量(拷贝数)，纵坐标为WPRE元件标准品的Ct值。
2、内参基因GAPDH标准品的标准曲线
以实施例1获得的6个不同浓度的GAPDH基因标准品为模板，加入GAPDH基因引物对2进行实时荧光定量PCR扩增反应，反应条件为：95℃30秒，进入循环；95℃5秒，60℃30秒，终点读板，共40个循环。得到如图19-20所示的扩增曲线和熔解曲线。根据图19-20所示的扩增曲线获取扩增每一个含量的GAPDH元件标准品的Ct值。根据GAPDH元件标准品的Ct值与含量的对应关系建立GAPDH元件标准品的标准曲线如图21所示。曲线方程为y＝-1.534ln(x)+37.153，R2＝0.9997，其中横坐标为GAPDH元件的标准品含量(拷贝数)，纵坐标为GAPDH元件标准品的CT值。
图13和图15所示的WPRE的熔解曲线和图19所示的GAPDH的熔解曲线均只有一个单峰，说明扩增产物特异性良好，而扩增曲线分布均匀，说明扩增线性程度较好。从图17、18和图21所示的标准曲线，慢病毒感染元件WPRE引物对1与内参基因GAPDH建立的标准曲线的R2均大于0.995，说明这两对QPCR引物进行扩增时线性扩增程度良好，而慢病毒感染元件WPRE引物对2建立的标准曲线的R2小于0.995，说明这对引物的扩增性不如引物对1，因此选择引物对1进行后续验证。
3、计算QPCR扩增反应扩增慢病毒感染元件WPRE和内参基因GAPDH的效率
慢病毒感染元件WPRE引物对1的扩增效率为10(-1/slope)-1x100％＝91.933％，内参基因GAPDH引物对2扩增效率为10(-1/slope)-1x100％＝109.708％。其中，slope表示标准曲线的斜率。两者均落在80％～120％之间，说明这两对引物能用于后续的重组慢病毒滴度测定的检测。
实施例4：慢病毒包装及制样
分别使用带荧光的慢病毒载体(载体图谱见图22)和不带荧光的慢病毒载体(载体图谱见图23)进行慢病毒包装。
(1)分别使用无内毒素质粒提取试剂盒进行慢病毒载体、不带荧光的慢病毒载体、包装质粒PSPAX2与PMD2G的质粒提取，质粒电泳图如图24所示，从图中可以看出，慢病毒载体、不带荧光的慢病毒载体、包装质粒PSPAX2与PMD2G的质粒均成功被提取；
(2)使用生长状态良好的293T细胞，同时分别进行带荧光慢病毒载体和不带荧光慢病毒载体的慢病毒包装，并在转染后48小时于荧光显微镜下观察带荧光慢病毒载体的转染效率；
(3)转染后72h分别收取转染了带荧光慢病毒载体和不带荧光慢病毒载体的细胞上清，进行慢病毒浓缩纯化，并将纯化好的病毒分装放到-80℃冰箱备用。
实施例5荧光慢病毒滴度检测及对比
1、病毒感染样本制备
(1)使用生长状态良好的293T细胞，进行96孔板铺板，每孔铺板1×104个细胞。
(2)将实施例4中浓缩纯化的带荧光和不带荧光慢病毒通过10倍稀释法进行稀释：准备10个无菌的EP管，每个EP管中加入90ul的培养基，取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中，混匀后标记为标记(10-1)，取10μL加入到第二个管中，继续相同的操作稀释至最后一管为10-7。
(3)选取铺板的细胞孔，吸去孔板中培养液，加入梯度稀释为10-3至10-7稀释好的病毒溶液90μL到孔板中，轻轻混匀，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
(4)病毒感染24小时后更换新鲜完全培养基，病毒感染48小时后进行慢病毒滴度检测。
2、利用流式细胞分析法检测慢病毒滴度
(1)收集上述慢病毒感染的各组细胞，进行流式细胞仪分析，收集各组流式细胞仪记录的数据如表3(N1为流式细胞仪记录的所有活细胞数，N2为流式细胞仪记录的所有带荧光的活细胞数)。
(2)将表3的数据带入慢病毒滴度计算公式TU/mL＝(N2/N1×N×D)/V)×1000，获得基于带荧光慢病毒感染的每组细胞获得的慢病毒滴度数据(数据见表3)。
表3利用流式细胞分析法检测的带荧光慢病毒的滴度
Figure BDA0002861806320000071
Figure BDA0002861806320000081
(3)经过统计学分析，实施例4获得的病毒滴度数据各组不存在统计学差异(见图25)，说明基于流式细胞分选法获得的带荧光慢病毒滴度数据可信，取其平均值作为对比参考值。
3、利用慢病毒滴度卡测定慢病毒滴度
(1)实施例3中获得的慢病毒，使用Clontech的Lenti-X GoStix Plus试剂盒，进行慢病毒滴度检测(此试剂盒的原理是利用抗原抗体反应，检测慢病毒中P24蛋白含量)。
(2)根据Lenti-X GoStix Plus APP检测慢病毒滴度，经检测获得的数据如表4所示。
表4利用慢病毒滴度卡测定的带荧光的慢病毒滴度
Figure BDA0002861806320000082
4、利用绝对定量QPCR法检测慢病毒滴度
(1)感染病毒的细胞基因组提取：收集实施例5中带荧光慢病毒感染的各组细胞，用基因组提取试剂盒提取各组细胞基因组。并将浓度调整为100ng/ul。
(2)感染带荧光慢病毒细胞的WPRE的拷贝数：将实施例5获得的基因组作为模板，使用经WPRE的引物对1作为引物，进行QPCR，记录所得的Ct如表5；将Ct值代入图9的标准曲线，计算基因组中DNA的慢病毒感染元件WPRE元件的含量(见表5)。
(3)感染带荧光慢病毒细胞的内参基因GAPDH的拷贝数：将实施例5获得的基因组作为模板，使用经GAPDH的引物对2作为引物，进行QPCR，记录所得的Ct如表5；将Ct值代入图21的标准曲线，计算基因组中DNA的慢病毒感染元件GAPDH元件的含量(见表5)。
(4)计算平均每个293T的重组慢病毒颗粒数＝(WPRE元件的拷贝数/GAPDH的拷贝数)×2(见表5)。
(5)计算单位体积的待测样本中含重组慢病毒的颗粒数(即待测样本中重组慢病毒滴度，titer，TU/ml)＝(靶细胞总数×平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数)/待测样本的体积(见表5)。
表5利用绝对定量QPCR法检测的带荧光慢病毒滴度
Figure BDA0002861806320000083
Figure BDA0002861806320000091
(6)对比经流式细胞仪分析获得的慢病毒滴度、慢病毒滴度卡测定的慢病毒滴度和绝对定量QPCR分析获得的慢病毒滴度如图26所示，从图中可以看出三者无统计学差异，说明选择的慢病毒感染元件WPRE的引物和内参基因GAPDH的引物能有效用于检测带荧光慢病毒滴度。
实施例6不带荧光慢病毒滴度检测
1、利用慢病毒滴度卡测定慢病毒滴度
(1)使用实施例4中获得的无荧光的慢病毒，使用Clontech的Lenti-X GoStixPlus试剂盒，进行慢病毒滴度检测(此试剂盒的原理是利用抗原抗体反应，检测慢病毒中P24蛋白含量)。
(2)根据Lenti-X GoStix Plus APP检测慢病毒滴度，经检测获得的滴度如表6所示。
表6利用慢病毒滴度卡测定的不带荧光的慢病毒滴度
Figure BDA0002861806320000092
2、利用绝对定量QPCR法检测慢病毒滴度
绝对定量QPCR法检测慢病毒滴度的步骤如下：
(1)感染病毒的细胞基因组提取：收集实施例5中不带荧光慢病毒感染的各组细胞，用基因组提取试剂盒提取各组细胞基因组。并将浓度调整为100ng/ul；
(2)感染带荧光慢病毒细胞的WPRE的拷贝数：将步骤(1)获得的基因组作为模板，使用经WPRE的引物对1作为引物，进行QPCR，将Ct值代入图17所示的标准曲线，计算基因组中DNA的慢病毒感染元件WPRE元件的含量，记录所得的Ct如表7所示；
(3)感染带荧光慢病毒细胞的内参基因GAPDH的拷贝数：将实施例5获得的基因组作为模板，使用经GAPDH的引物对2作为引物，进行QPCR，记录所得的Ct如表7；将Ct值代入图21的标准曲线，计算基因组中DNA的慢病毒感染元件GAPDH元件的含量(见表7)；
(4)计算平均每个293T的重组慢病毒颗粒数＝(WPRE元件的拷贝数/GAPDH的拷贝数)X2(见表7)；
(5)计算单位体积的待测样本中含重组慢病毒的颗粒数(即待测样本中重组慢病毒滴度，titer，TU/ml)＝(靶细胞总数×平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数)/待测样本的体积(见表7)；
表7利用绝对定量QPCR法检测的不带荧光慢病毒滴度
Figure BDA0002861806320000101
(6)对比经慢病毒滴度卡测定的慢病毒滴度和经绝对定量QPCR分析获得的慢病毒滴度如图27所示，从图中可以看出，二者无统计学差异，说明选择的慢病毒感染元件WPRE的引物和内参基因GAPDH的引物能有效用于检测无荧光慢病毒滴度。
实施例仅阐述了本发明专利慢病毒感染元件WPRE的引物对1和内参基因GAPDH的引物对2用于检测带荧光和不带荧光慢病毒滴度的具体实施方式，其描述较为具体与详细。同时，由于本发明专利所述的慢病毒感染元件WPRE是各类慢病毒载体感染细胞所必须的元件，因此本专利所述的引物可以用于各类慢病毒，尤其是不带荧光慢病毒的滴度测定。基于本发明专利所述的引物对进行的绝对定量QPCR检测慢病毒滴度的方法操作简便，能检测各类慢病毒，尤其是不带荧光慢病毒的滴度。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 湖南丰晖生物科技有限公司
<120> 一种实时荧光定量PCR引物及其应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 578
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggc 578
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatcaacctc tggattacaa 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcccaaaggg agatccgact c 21
<210> 4
<211> 413
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accacagtcc atgccatcac tgccacccag aagactgtgg atggcccctc cgggaaactg 60
tggcgtgatg gccgcggggc tctccagaac atcatccctg cctctactgg cgctgccaag 120
gctgtgggca aggtcatccc tgagctgaac gggaagctca ctggcatggc cttccgtgtc 180
cccactgcca acgtgtcagt ggtggacctg acctgccgtc tagaaaaacc tgccaaatat 240
gatgacatca agaaggtggt gaagcaggcg tcggagggcc ccctcaaggg catcctgggc 300
tacactgagc accaggtggt ctcctctgac ttcaacagcg acacccactc ctccaccttt 360
gacgctgggg ctggcattgc cctcaacgac cactttgtca agctcatttc ctg 413
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accacagtcc atgccatcac tgc 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggaaatga gcttgacaaa gtg 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgcttcccg tatggctttc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaaggagctg acaggtggtg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggatacgctg ctttaatgcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aacgggccac aactcctcat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cactggttgg ggcattgcca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaggacgtcc cgcgcagaat 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctgttgggca ctgacaattc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaggaaggt ccgctggatt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttctgctacg tcccttcggc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tccccccttt ttctggagac 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttgcttcccg tatggctttc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaaggagctg acaggtggtg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggatacgctg ctttaatgcc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aacgggccac aactcctcat 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cactggttgg ggcattgcca 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aaggacgtcc cgcgcagaat 20

Claims (10)

1.一种实时荧光定量PCR引物，其特征在于；所述引物包括根据慢病毒载体感染元件WPRE设计的实时荧光定量PCR引物和根据内参基因GAPDH设计的实时荧光定量PCR引物。
2.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR引物，其特征在于；所述慢病毒载体感染元件WPRE的荧光定量特异引物为：
WPRE-QPCR1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
WPRE-QPCR1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
或
WPRE-QPCR2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
WPRE-QPCR2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
或
WPRE-QPCR3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
WPRE-QPCR3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
或
WPRE-QPCR4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
WPRE-QPCR4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
或
WPRE-QPCR5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
WPRE-QPCR5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
3.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR引物，其特征在于；所述内参基因GAPDH的荧光定量引物为：
GAPDH-QPCR1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
GAPDH-QPCR1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
或
GAPDH-QPCR2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
GAPDH-QPCR2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
或
GAPDH-QPCR3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
GAPDH-QPCR3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
4.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR引物的应用，其特征在于：所述应用为将所述引物用于检测慢病毒滴度。
5.如权利要求4的应用，其特征在于：所述慢病毒包括荧光慢病毒载体包装病毒和/或不带荧光慢病毒载体包装病毒。
6.一种无荧光慢病毒滴度的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、用待测样品感染靶细胞，并提取感染后所述靶细胞中的基因组DNA，其中所述待测样品中含有重组慢病毒；
S2、测定所述基因组DNA中WPRE元件的拷贝数以及GAPDH基因的拷贝数；
S3、根据所述WPRE元件的拷贝数和所述GAPDH基因的拷贝数计算平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数；
S4、分别使用带荧光及不带荧光的慢病毒载体包装病毒，收集并纯化上清病毒颗粒；
S5、根据所述靶细胞的总数和所述平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数计算单位体积的所述待测样品中含重组慢病毒的颗粒数，得到所述待测样品中重组慢病毒的滴度。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述基因组DNA中WPRE元件的拷贝数以及GAPDH基因的拷贝数测定步骤包括：将所述基因DNA中WPRE元件引物混合进行实时定量PCR扩增反应，获取所述WPRE元件的Ct值；将所述基因DNA中GAPDH基因引物混合进行实时定量PCR扩增反应，获取所述WPRE元件的Ct值；将所述WPRE元件和GAPDH基因Ct值代入对应标准曲线中，获得基因组中所述WPRE元件和GAPDH基因的含量；根据所述WPRE元件的含量计算所述基因组DNA中所述WPRE元件的拷贝数，以及根据所述GAPDH基因的含量计算所述基因组DNA中所述GAPDH基因的拷贝数。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述WPRE元件标准曲线的制备包括以下步骤：将WPRE元件标准品进行梯度稀释，获得梯度浓度的所述WPRE元件标准品；将每一个浓度的所述WPRE元件标准品分别与所述WPRE元件上游引物以及所述WPRE元件下游引物混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，获取扩增每一个浓度的所述WPRE元件标准品的Ct值；根据所述WPRE元件标准品的Ct值与浓度的对应关系建立所述WPRE元件的标准曲线。
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述GAPDH基因标准曲线的制备包括以下步骤：将GAPDH基因标准品进行梯度稀释，获得梯度浓度的所述GAPDH基因标准品；将每一个浓度的所述GAPDH基因标准品分别与所述GAPDH基因上游引物以及所述GAPDH基因下游引物混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，获取扩增每一个浓度的所述GAPDH基因标准品的Ct值；根据所述GAPDH基因标准品的Ct值与浓度的对应关系建立所述GAPDH基因的标准曲线。
10.一种慢病毒滴度检测试剂盒，其特征在于：包括如要求1至3任一项所述的实时荧光定量PCR引物。
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