JPWO2005054467A1 - 哺乳類βアクチンプロモーターを利用した発現系 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕 エンハンサーに哺乳類βアクチンプロモーターが機能的に結合したDNA構築物。
〔2〕 エンハンサーがサイトメガロウイルス(CMV)である〔1〕に記載のDNA構築物。
〔3〕 エンハンサーがWoodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element(WPRE)である〔1〕に記載のDNA構築物。
〔4〕 哺乳類βアクチンプロモーターがげっ歯類βアクチンプロモーターである、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載のDNA構築物。
〔5〕 CMVエンハンサーが配列番号:4に記載の塩基配列からなり、哺乳類βアクチンプロモーターが配列番号:2に記載の塩基配列からなる、〔2〕に記載のDNA構築物。
〔6〕 Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element(WPRE)が配列番号:3に記載の塩基配列からなり、哺乳類βアクチンプロモーターが配列番号:2に記載の塩基配列からなる、〔3〕に記載のDNA構築物。
〔7〕 〔1〕から〔6〕のいずれかに記載のDNA構築物を含むベクター。
〔8〕 哺乳類βアクチンプロモーターの下流に所望のDNAが機能的に結合されたDNAを有する〔7〕に記載のベクター。
〔9〕 トランスアクティベーターをコードするDNAを発現可能に保持する、〔7〕または〔8〕に記載のベクター。
〔10〕 トランスアクティベーターが癌遺伝子産物である〔9〕に記載のベクター。
〔11〕 癌遺伝子産物がRasである、〔10〕に記載のベクター。
〔12〕 所望のDNAが、所望のタンパク質をコードするDNAである、〔8〕から〔11〕のいずれかに記載のベクター。
〔13〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターを保持する細胞。
〔14〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターを保持し、癌遺伝子が活性化している細胞。
〔15〕 癌遺伝子が活性化している細胞が、トランスアクティベーターをコードする遺伝子を含むベクターが導入された細胞である〔14〕記載の細胞。
〔16〕 癌遺伝子が活性化している細胞が、癌化している細胞である〔14〕記載の細胞。
〔17〕 哺乳動物細胞である、〔13〕から〔16〕のいずれかに記載の細胞。
〔18〕 げっ歯類細胞である、〔17〕に記載の細胞。
〔19〕 βアクチンプロモーターと同じ動物目であることを特徴とする〔13〕から〔18〕のいずれかに記載の細胞。
〔20〕 βアクチンプロモーターと同じ動物種であることを特徴とする〔19〕に記載の細胞。
〔21〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターが導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
〔22〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターが導入された全能性細胞。
〔23〕 〔12〕に記載のベクターを保持する細胞を培養し、培養した細胞又は培地から発現させたタンパク質を回収することを含む、所望のタンパク質の製造方法。
〔24〕 培地にトランスアクティベーターを添加することを含む、〔23〕に記載の方法。
〔25〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターを、ベクター上のβアクチンプロモーターと同じ動物目由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において所望のDNAを発現させる方法。
〔26〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターを、ベクター上のβアクチンプロモーターと同じ動物種由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において所望のDNAを発現させる方法。
〔27〕 〔8〕に記載のベクターおよびトランスアクティベーターをコードするDNAを発現可能に保持するベクターを、〔8〕に記載のベクター上のβアクチンプロモーターと同種由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞における所望のDNAを発現させる方法。
〔28〕 宿主細胞が哺乳動物細胞である、〔25〕から〔27〕のいずれかに記載の方法。
〔29〕 宿主細胞がげっ歯類細胞である、〔25〕から〔27〕のいずれかに記載の方法。
〔30〕 宿主細胞と同じ動物目由来のβアクチンプロモーターを所望のDNAの上流に組み込むことを特徴とする、所望のDNAの発現量を増加させる方法。
〔31〕 宿主細胞と同じ動物種由来のβアクチンプロモーターを所望のDNAの上流に組み込むことを特徴とする、所望のDNAの発現量を増加させる方法。
〔32〕 エンハンサーをさらに組み込むことを特徴とする〔30〕もしくは〔31〕に記載の方法。
〔33〕 エンハンサーがWoodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element(WPRE)である〔32〕に記載の方法。
〔34〕 エンハンサーがCMVエンハンサーである〔32〕に記載の方法。
〔35〕 トランスアクティベーターをコードする遺伝子を組み込むことを特徴とする〔30〕から〔34〕のいずれかに記載の方法。
〔36〕 宿主細胞が哺乳動物細胞である〔30〕から〔35〕いずれかに記載の方法。
〔37〕 宿主細胞がげっ歯類細胞である〔30〕から〔35〕いずれかに記載の方法。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
(1)マウスβアクチンプロモーターのクローニング
NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、及びJackson laboratory(http://www.jax.org/)で公開されているマウスゲノム情報より、マウスβアクチンのシーケンス情報を得た。以下に示す配列のプライマーmAct5−F1(5’−GGGAGTGACTCTCTGTCCATTCAATCC−3’/配列番号:9)およびmAcr5−R1(5’−TTGTCGACGACCAGCGCAGCGATATCG−3’/配列番号:10)を合成し(エスペックオリゴ社)、PCRによってマウスβアクチンのプロモーター領域(1,577bp)を増幅した。試薬としてはタカラバイオ社のTaKaRa LA Taq with GC Buffer(cat.RR02AG)、鋳型DNAにはクロンテック社のMouse Genomic DNA(cat.6650−1)を使用してPCRを行った。PCR反応溶液の組成は、鋳型DNA(100ng/ml)1.0μl、2×GC buffer I 25.0μl、dNTP Mixture 8.0μl、mAct5−F1(10μM)2.0μl、mAcr5−R1(10μM)2.0μl、H2O 11.5μl、LA Taq(5U/μl)0.5μlである。またPCRの条件は、95℃で1分、「95℃で30秒、60℃で30秒、72℃で90秒」を35サイクル、72℃で7分にて終結させる条件である。PCRにはGene Amp PCR System 2400(アプライドバイオシステム社)を用いた。増幅したPCR産物は1% アガロースゲルに電気泳動した後に、1,577bpのバンドを切り出し、Mag Extractor(東洋紡社、cat.NPK−601)で精製した。これをpGEM−T−Easy vector(プロメガ社、cat.A1360)にクローニングし、シーケンスすることによって塩基配列を確認した。クローニングしたマウスβアクチン5’領域を配列番号:1に示す。
Woodchuck hepatitis virusゲノム配列(GenBank Accession No.J04514)の1093番目から1684番目の592塩基が転写後調節領域(WPRE)は、以下のようにAssemble PCR法を用いて増幅し、クローニングした。タカラバイオ社のTaKaRa Ex Taq(cat.RR001B)を使用して、以下のような二つの条件系でPCRを行った。
まず、反応溶液の組成:合成DNA(WP−1〜WP−6,各10uM,各1uL)6.0μl、10x Ex Taq buffer 5.0μl、dNTP Mixture 8.0μl、H2O 28.5μl、Ex Taq(5U/μl)0.5μl、反応条件:94℃で5分、「94℃で2分、55℃で2分、72℃で2分」を2サイクル、によりPCR反応を行った。さらに、プライマーWP−f(10uM)1.0μl、WP−r2(10uM)1.0μlを添加し総量を50,0μlとし、反応条件:「94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分」で30サイクル、72℃で5分、によりPCR反応を行った。
まず、反応溶液の組成:合成DNA(WP−5〜WP−17,各10uM,各1uL)13.0μl、10x Ex Taq buffer 5.0μl、dNTP Mixture 8.0μl、H2O 21.5μl、Ex Taq(5U/μl)0.5μl、反応条件:94℃で5分、「94℃で2分、55℃で2分、72℃で2分」を2サイクル、によりPCR反応を行った。さらに、プライマーWP−f2(10uM)1.0μl、WP−r(10uM)1.0uLを添加し総量を50,0μlとし、反応条件:「94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分」で30サイクル、72℃ 5分、によりPCR反応を行った。
<使用した合成DNA>
WP−1:
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAA(配列番号:13)
WP−2:GCGTATCCACATAGCGTAAAAGGAG
CAACATAGTTAAGAATACCAGTCAA(配列番号:14)
WP−3:
ACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTC(配列番号:15)
WP−4:
TTATACAAGGAGGAGAAAATGAAAGCCATACGGGAAGCAATAGCATGATA(配列番号:16)
WP−5:
TTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTG(配列番号:17)
WP−6:
GTGCACACCACGCCACGTTGCCTGACAACGGGCCACAACTCCTCATAAAG(配列番号:18)
WP−7:
CGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGG(配列番号:19)
WP−8:
GTCCCGGAAAGGAGCTGACAGGTGGTGGCAATGCCCCAACCAGTGGGGGT(配列番号:20)
WP−9:
CAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGA(配列番号:21)
WP−10:
TGTCCAGCAGCGGGCAAGGCAGGCGGCGATGAGTTCCGCCGTGGCAATAG(配列番号:22)
WP−11:
TTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTG(配列番号:23)
WP−12:
CCATGGAAAGGACGTCAGCTTCCCCGACAACACCACGGAATTGTCAGTGC(配列番号:24)
WP−13:
TGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGC(配列番号:25)
WP−14:
GAGGGCCGAAGGGACGTAGCAGAAGGACGTCCCGCGCAGAATCCAGGTGG(配列番号:26)
WP−15:
ACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTG(配列番号:27)
WP−16:
GAGGGCGAAGGCGAAGACGCGGAAGAGGCCGCAGAGCCGGCAGCAGGCCGCGGGAAG(配列番号:28)
WP−17:
GTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(配列番号:29)
WP−f:TCTAGAAATCAACCTCTGGATTACAAAATT(配列番号:30)
WP−r:TCTAGAAGGCGGGGAGGCGGCCCAAA(配列番号:31)
WP−f2:ATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAG(配列番号:32)
WP−r2:GTGCACACCACGCCACGTTGCC(配列番号:33)
CMVエンハンサー領域(配列番号:4)をpmAct−Luc−neoベクターのEcoR Iサイトにクローニングし、phCMV−mAct−Luc−neoを完成させた(図1)。
ヒトEF1αプロモーターはDHFR−ΔE−RVh−PM1−f(参考文献 WO92/19759)よりCMVエンハンサーと共にpGLNベクターのMCSに組み込むことで、pCEF−Luc−neoを作製した(図1)。実験に用いた全てのベクターは、キアゲン社のEndoFree Plasmid Maxi Kit(cat.12362)によって精製した。
(1)ベクターのCHO細胞への導入
2μgのベクターをそれぞれ20μlのPLUS(tm)Reagent(インビトロジェン社、Cat.No.11514−015)と混合し、OPTI−MEM I Reduced−Serum Medium(インビトロジェン社、Cat.No.11058−021)で容量を200μlに調整し、室温で15分間保温した。ここに、LipofectAMINE(インビトロジェン社、Cat.No.18324−012)を20μl、OPTI−MEM I Reduced−Serum Mediumを180μl加え、室温でさらに15分間保温した。CHO細胞は96well Cell Culture Cluster(コーニング社、Cat.No.3595)で1ウェルあたり2×104cells、50μlのOPTI−MEM I Reduced−Serum Mediumで調整した。上記で作製したDNA溶液20μlをCHO細胞に添加し、37℃、3時間、CO2インキュベーター内で培養することで、ベクターをCHO細胞に導入した。その後、培養上清を静かに除き、CHO用の培地を加えた。CHO用の培地は、CHO−S−SFMII培地(インビトロジェン社、Cat.No.12052−098)に1/100量のHT Supplement(100×),liquid(インビトロジェン社、Cat.No.11067−030)と、1/100量のPenicillin−Streptomycin(インビトロジェン社製、Cat.No.15140−122)を添加することで作製したものを使用した。この状態のまま、37℃、CO2インキュベーター内で2日間培養した。
ルシフェラーゼ活性は、Luciferase Assay System(プロメガ社、Cat.No.E1501)を用いて測定した。培地を除き、1ウェルあたりキットに添付されている5×Passive lysis bufferを5倍に薄めたものを100μl加え、振とうすることで細胞を溶解した。その細胞溶解液をAssay Plate Tissue Culture Treated White with Clear Bottom(コーニング社、Cat No.437842)に10μlずつ移した。測定はMicroLuMAT(バートホールド社)を用いて行い、データはソフトWinGlow−Control Program LB96PV ver.1.24を用いて取り込んだ。
(1)マウスc−H−ras遺伝子のクローニング
ヒト活性型H−Rasがヒトβアクチンプロモーターを組み込んだ発現ベクターの発現効率を亢進することは既に報告されている(Cytotechnology,Vol.16,p.167−178,1994)。しかし、マウスβアクチンプロモーターに対する活性型H−Ras、あるいは野生型のH−Ras、活性型K−Rasの効果に関する報告は無いことから、マウスH−Ras(活性型、野生型)、ヒト活性型K−Rasのマウスβアクチンプロモーターに対する効果について検討を行った。
CHO細胞で効率よくマウスc−H−Rasを発現させるために、プライマーRAS−ATG(5’−GCCACCATGACAGAATACAAGCTT−3’/配列番号:36)およびRAS−R2(5’−TCAGGACAGCACACATTTGC−3’/配列番号:37)を用いたPCRによって、開始コドンの上流の配列をKozak rule(Nicleic Acids Research,Vol.15(20),p.8125−8148,1987)に従った配列に変換するとともに、タンパク質がコードされている3’UTRを除去した。試薬としてはタカラバイオ社のTaKaRa LA Taq(cat.RR002A)、鋳型cDNAには先にpGEM−T−Easyベクターにクローニングしたマウスc−H−rasを鋳型に用いて以下のような条件系でPCRを行った。
ストラタジーン社のQuikChangeTM Site−Directe Mutagenesis Kit(cat.#200518)を用いて、上記のマウスc−H−rasに点変異(上の配列の下線を引いたGをTに変換)を入れることによって12番目のアミノ酸をバリンに変換することで活性型H−Rasを作製した。
使用したプライマーは、mRasV12−F(5’−GTGGTGGGCGCTGTAGGCGTGGGAAAG−3’/配列番号:38)および、mRasV12−R(5’−CTTTCCCACGCCTACAGCGCCCACCAC−3’/配列番号:39)であり、反応溶液の組成:鋳型DNA、H−Ras/pGEM−T−Easy(10ng/μl)2.0μl、10×reaction buffer 5.0μl、dNTP Mix 1.0μl、mRasV12−F(100ng/μl)1.25μl、mRasV12−R(100ng/μl)1.25μl、H2O 38.5μl、Pfu Turbo DNA polymerase(2.5U/μl)1.0μl、反応条件:95℃で30秒、「95℃で30秒、55℃で1分、68℃で7分20秒」で12サイクルにてPCR反応を行った。PCRにはGene Amp PCR System 2400を用いた。増幅したPCR産物をキットのマニュアルに従って、Dpn I処理した後に大腸菌にトランスフォームした。そして、得られた大腸菌からプラスミドを回収してシーケンスすることによって変異が導入されていることを確認した。マウス活性型H−Rasのアミノ酸配列を配列番号:7に示す。
これらの遺伝子は、すべてpCXNベクター(Gene,Vol.108,p.193−200,1991)に組み込んで、それぞれをpCXN−H−Ras(マウスc−H−ras)、pCXN−A−H−Ras(マウス活性型c−H−ras)、及びpCXN−A−K−Ras(ヒト活性型K−ras)とした。
(1)ベクターのCHO細胞への導入
CHO細胞に導入する2μgのベクターは、以下のように2種類、あるいは3種類のベクターを、様々な割合で混合することで調整した(表1)。実施例2と同じ方法でCHO細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
〔1〕 エンハンサーに哺乳類βアクチンプロモーターが機能的に結合したDNA構築物。
〔2〕 エンハンサーがサイトメガロウイルス(CMV)に由来する〔1〕に記載のDNA構築物。
〔3〕 エンハンサーがWoodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element(WPRE)である〔1〕に記載のDNA構築物。
〔4〕 哺乳類βアクチンプロモーターがげっ歯類βアクチンプロモーターである、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載のDNA構築物。
〔5〕 CMVエンハンサーが配列番号:4に記載の塩基配列からなり、哺乳類βアクチンプロモーターが配列番号:2に記載の塩基配列からなる、〔2〕に記載のDNA構築物。
〔6〕 Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element(WPRE)が配列番号:3に記載の塩基配列からなり、哺乳類βアクチンプロモーターが配列番号:2に記載の塩基配列からなる、〔3〕に記載のDNA構築物。
〔7〕 〔1〕から〔6〕のいずれかに記載のDNA構築物を含むベクター。
〔8〕 哺乳類βアクチンプロモーターの下流に所望のDNAが機能的に結合されたDNAを有する〔7〕に記載のベクター。
〔9〕 トランスアクティベーターをコードするDNAを発現可能に保持する、〔7〕または〔8〕に記載のベクター。
〔10〕 トランスアクティベーターが癌遺伝子産物である〔9〕に記載のベクター。
〔11〕 癌遺伝子産物がRasである、〔10〕に記載のベクター。
〔12〕 所望のDNAが、所望のタンパク質をコードするDNAである、〔8〕から〔11〕のいずれかに記載のベクター。
〔13〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターを保持する細胞。
〔14〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターを保持し、癌遺伝子が活性化している細胞。
〔15〕 癌遺伝子が活性化している細胞が、トランスアクティベーターをコードする遺伝子を含むベクターが導入された細胞である〔14〕記載の細胞。
〔16〕 癌遺伝子が活性化している細胞が、癌化している細胞である〔14〕記載の細胞。
〔17〕 哺乳動物細胞である、〔13〕から〔16〕のいずれかに記載の細胞。
〔18〕 げっ歯類細胞である、〔17〕に記載の細胞。
〔19〕 βアクチンプロモーターと同じ動物目であることを特徴とする〔13〕から〔18〕のいずれかに記載の細胞。
〔20〕 βアクチンプロモーターと同じ動物種であることを特徴とする〔19〕に記載の細胞。
〔21〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターが導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
〔22〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターが導入された全能性細胞。
〔23〕 〔12〕に記載のベクターを保持する細胞を培養し、培養した細胞又は培地から発現させたタンパク質を回収することを含む、所望のタンパク質の製造方法。
〔24〕 培地にトランスアクティベーターを添加することを含む、〔23〕に記載の方法。
〔25〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターを、ベクター上のβアクチンプロモーターと同じ動物目由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において所望のDNAを発現させる方法。
〔26〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターを、ベクター上のβアクチンプロモーターと同じ動物種由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において所望のDNAを発現させる方法。
〔27〕 〔8〕に記載のベクターおよびトランスアクティベーターをコードするDNAを発現可能に保持するベクターを、〔8〕に記載のベクター上のβアクチンプロモーターと同種由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞における所望のDNAを発現させる方法。
〔28〕 宿主細胞が哺乳動物細胞である、〔25〕から〔27〕のいずれかに記載の方法。
〔29〕 宿主細胞がげっ歯類細胞である、〔25〕から〔27〕のいずれかに記載の方法。
〔30〕 宿主細胞と同じ動物目由来のβアクチンプロモーターを所望のDNAの上流に組み込むことを特徴とする、宿主細胞において所望のDNAの発現量を増加させる方法。
〔31〕 宿主細胞と同じ動物種由来のβアクチンプロモーターを所望のDNAの上流に組み込むことを特徴とする、宿主細胞において所望のDNAの発現量を増加させる方法。
〔32〕 エンハンサーをさらに組み込むことを特徴とする〔30〕もしくは〔31〕に記載の方法。
〔33〕 エンハンサーがWoodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element(WPRE)である〔32〕に記載の方法。
〔34〕 エンハンサーがCMVエンハンサーである〔32〕に記載の方法。
〔35〕 トランスアクティベーターをコードする遺伝子を組み込むことを特徴とする〔30〕から〔34〕のいずれかに記載の方法。
〔36〕 宿主細胞が哺乳動物細胞である〔30〕から〔35〕いずれかに記載の方法。
〔37〕 宿主細胞がげっ歯類細胞である〔30〕から〔35〕いずれかに記載の方法。
具体的には、哺乳動物由来のベクター(例えば、pcDNA3 (インビトロジェン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res., 18(17), p.5322, 1990)、pEF 、pCDM8、pCXN、昆虫細胞由来のベクター(例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(インビトロジェン社製)、pBacPAK8)、植物由来の発現ベクター(例えばpMH1、pMH2)、動物ウィルス由来のベクター(例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw)、レトロウィルス由来のベクター(例えば、pZIPneo)、酵母由来のベクター(例えば、「Pichia Expression Kit」(インビトロジェン社製)、pNV11 、SP-Q01)、枯草菌由来のベクター(例えば、pPL608、pKTH50)、大腸菌ベクター(M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script)、などが挙げることができる。本発明においては、哺乳動物細胞内で発現可能なベクターを用いることが好ましく、又、発現ベクターを用いることが好ましい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
(1)マウスβアクチンプロモーターのクローニング
NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、及びJackson laboratory(http://www.jax.org/)で公開されているマウスゲノム情報より、マウスβアクチンのシーケンス情報を得た。以下に示す配列のプライマーmAct5-F1(5'- GGGAGTGACTCTCTGTCCATTCAATCC -3'/配列番号:9)およびmAcr5-R1(5'- TTGTCGACGACCAGCGCAGCGATATCG -3'/配列番号:10)を合成し(エスペックオリゴ社)、PCRによってマウスβアクチンのプロモーター領域(1,577 bp)を増幅した。試薬としてはタカラバイオ社のTaKaRa LA Taq with GC Buffer(cat. RR02AG)、鋳型DNAにはクロンテック社のMouse Genomic DNA(cat. 6650-1)を使用してPCRを行った。PCR反応溶液の組成は、鋳型DNA(100ng/ml) 1.0μl、2×GC buffer I 25.0μl、dNTP Mixture 8.0μl、mAct5-F1(10μM)2.0μl、mAcr5-R1(10μM)2.0μl、H2O 11.5μl、LA Taq(5U/μl)0.5μlである。またPCRの条件は、95℃で1分、「95℃で30秒、60℃で30秒、72℃で90秒」を35サイクル、72℃で7分にて終結させる条件である。PCRにはGene Amp PCR System 2400(アプライドバイオシステム社)を用いた。増幅したPCR産物は1% アガロースゲルに電気泳動した後に、1,577bpのバンドを切り出し、Mag Extractor(東洋紡社、cat.NPK-601)で精製した。これをpGEM-T-Easy vector(プロメガ社、cat.A1360)にクローニングし、シーケンスすることによって塩基配列を確認した。クローニングしたマウスβアクチン5'領域を配列番号:1に示す。
Woodchuck hepatitis virusゲノム配列(GenBank Accession No. J04514)の1093番目から1684番目の 592塩基が転写後調節領域(WPRE)は、以下のようにAssemble PCR法を用いて増幅し、クローニングした。タカラバイオ社のTaKaRa Ex Taq (cat. RR001B) を使用して、以下のような二つの条件系でPCRを行った。
まず、反応溶液の組成:合成DNA(WP-1〜WP-6,各10uM, 各1uL) 6.0μl、10x Ex Taq buffer 5.0μl、dNTP Mixture 8.0μl、H2O 28.5μl、Ex Taq(5U/μl) 0.5μl、反応条件:94℃で5分、「94℃で2分、55℃で2分、72℃で2分」を2サイクル、によりPCR反応を行った。さらに、プライマーWP-f (10uM) 1.0μl、WP-r2 (10uM) 1.0μlを添加し総量を50,0μlとし、反応条件:「94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分」で30サイクル、72℃ で5分、によりPCR反応を行った。
まず、反応溶液の組成:合成DNA(WP-5〜WP-17,各10uM, 各1uL) 13.0μl、10x Ex Taq buffer 5.0μl、dNTP Mixture 8.0μl、H2O 21.5μl、Ex Taq(5U/μl) 0.5μl、反応条件:94℃で5分、「94℃で2分、55℃で2分、72℃で2分」を2サイクル、によりPCR反応を行った。さらに、プライマーWP-f2 (10uM) 1.0μl、WP-r (10uM) 1.0uLを添加し総量を50,0μlとし、反応条件:「94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分」で30サイクル、72℃ 5分、によりPCR反応を行った。
<使用した合成DNA>
WP-1: AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAA(配列番号:13)
WP-2: GCGTATCCACATAGCGTAAAAGGAGCAACATAGTTAAGAATACCAGTCAA(配列番号:14)
WP-3: ACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTC(配列番号:15)
WP-4: TTATACAAGGAGGAGAAAATGAAAGCCATACGGGAAGCAATAGCATGATA(配列番号:16)
WP-5: TTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTG(配列番号:17)
WP-6: GTGCACACCACGCCACGTTGCCTGACAACGGGCCACAACTCCTCATAAAG(配列番号:18)
WP-7: CGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGG(配列番号:19)
WP-8: GTCCCGGAAAGGAGCTGACAGGTGGTGGCAATGCCCCAACCAGTGGGGGT(配列番号:20)
WP-9: CAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGA(配列番号:21)
WP-10: TGTCCAGCAGCGGGCAAGGCAGGCGGCGATGAGTTCCGCCGTGGCAATAG(配列番号:22)
WP-11: TTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTG(配列番号:23)
WP-12: CCATGGAAAGGACGTCAGCTTCCCCGACAACACCACGGAATTGTCAGTGC(配列番号:24)
WP-13: TGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGC(配列番号:25)
WP-14: GAGGGCCGAAGGGACGTAGCAGAAGGACGTCCCGCGCAGAATCCAGGTGG(配列番号:26)
WP-15: ACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTG(配列番号:27)
WP-16: GAGGGCGAAGGCGAAGACGCGGAAGAGGCCGCAGAGCCGGCAGCAGGCCGCGGGAAG(配列番号:28)
WP-17: GTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(配列番号:29)
WP-f: TCTAGAAATCAACCTCTGGATTACAAAATT(配列番号:30)
WP-r: TCTAGAAGGCGGGGAGGCGGCCCAAA(配列番号:31)
WP-f2: ATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAG(配列番号:32)
WP-r2: GTGCACACCACGCCACGTTGCC(配列番号:33)
CMVエンハンサー領域(配列番号:4)をpmAct-Luc-neoベクターの EcoR Iサイトにクローニングし、phCMV-mAct-Luc-neoを完成させた(図1)。
ヒトEF1αプロモーターはDHFR-ΔE-RVh-PM1-f(参考文献 WO92/19759)よりCMVエンハンサーと共にpGLNベクターのMCSに組み込むことで、pCEF-Luc-neoを作製した(図1)。実験に用いた全てのベクターは、キアゲン社のEndoFree Plasmid Maxi Kit (cat.12362)によって精製した。
(1)ベクターのCHO細胞への導入
2μgのベクターをそれぞれ20μlのPLUS(tm) Reagent (インビトロジェン社、Cat. No. 11514-015 )と混合し、OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium (インビトロジェン社、Cat. No. 11058-021)で容量を200μlに調整し、室温で15分間保温した。ここに、LipofectAMINE (インビトロジェン社、Cat. No. 18324-012 )を20μl、OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium を180μl加え、室温でさらに15分間保温した。CHO細胞は96well Cell Culture Cluster (コーニング社、Cat. No. 3595)で1ウェルあたり2×104 cells、50μlのOPTI-MEM I Reduced-Serum Mediumで調整した。上記で作製したDNA溶液20μlをCHO細胞に添加し、37℃、3時間、CO2インキュベーター内で培養することで、ベクターをCHO細胞に導入した。その後、培養上清を静かに除き、CHO用の培地を加えた。CHO用の培地は、CHO-S-SFMII培地(インビトロジェン社、Cat. No. 12052-098)に1/100量のHT Supplement (100×), liquid(インビトロジェン社、Cat. No. 11067-030)と、1/100量のPenicillin-Streptomycin (インビトロジェン社製、Cat. No. 15140-122)を添加することで作製したものを使用した。この状態のまま、37℃、CO2インキュベーター内で2日間培養した。
ルシフェラーゼ活性は、Luciferase Assay System (プロメガ社、Cat. No. E1501)を用いて測定した。培地を除き、1ウェルあたりキットに添付されている5× Passive lysis bufferを5倍に薄めたものを100 μl加え、振とうすることで細胞を溶解した。その細胞溶解液をAssay Plate Tissue Culture Treated White with Clear Bottom(コーニング社、Cat No. 437842)に10μlずつ移した。測定はMicroLuMAT(バートホールド社)を用いて行い、データはソフトWinGlow-Control Program LB96PV ver.1.24を用いて取り込んだ。
(1)マウスc-H-ras遺伝子のクローニング
ヒト活性型H-Rasがヒトβアクチンプロモーターを組み込んだ発現ベクターの発現効率を亢進することは既に報告されている(Cytotechnology, Vol. 16, p.167-178, 1994)。しかし、マウスβアクチンプロモーターに対する活性型H-Ras、あるいは野生型のH-Ras、活性型K-Rasの効果に関する報告は無いことから、マウスH-Ras(活性型、野生型)、ヒト活性型K-Rasのマウスβアクチンプロモーターに対する効果について検討を行った。
CHO細胞で効率よくマウスc-H-Rasを発現させるために、プライマーRAS-ATG(5'- GCCACCATGACAGAATACAAGCTT -3'/配列番号:36)およびRAS-R2(5'- TCAGGACAGCACACATTTGC -3'/配列番号:37)を用いたPCRによって、開始コドンの上流の配列をKozak rule(Nicleic Acids Research, Vol.15(20), p.8125-8148, 1987)に従った配列に変換するとともに、タンパク質がコードされていない3'UTRを除去した。試薬としてはタカラバイオ社のTaKaRa LA Taq(cat. RR002A)、鋳型cDNAには先にpGEM-T-Easyベクターにクローニングしたマウスc-H-rasを鋳型に用いて以下のような条件系でPCRを行った。
ストラタジーン社のQuikChangeTM Site-Directe Mutagenesis Kit(cat.#200518)を用いて、上記のマウスc-H-rasに点変異(上の配列の下線を引いたGをTに変換)を入れることによって12番目のアミノ酸をバリンに変換することで活性型H-Rasを作製した。
使用したプライマーは、mRasV12-F(5'- GTGGTGGGCGCTGTAGGCGTGGGA AAG-3'/配列番号:38)および、mRasV12-R(5'- CTTTCCCACGCCTACAGCGCCCACCAC-3'/配列番号:39)であり、反応溶液の組成:鋳型DNA、H-Ras/pGEM-T-Easy(10ng/μl) 2.0μl、10×reaction buffer 5.0μl、dNTP Mix 1.0μl、mRasV12-F(100ng/μl) 1.25μl、mRasV12-R(100ng/μl) 1.25μl、H2O 38.5μl、PfuTurbo DNA polymerase(2.5U/μl) 1.0μl、反応条件:95℃で30秒、「95℃で30秒、55℃で1分、68℃で7分20秒」で12サイクルにてPCR反応を行った。PCRにはGene Amp PCR System 2400を用いた。増幅したPCR産物をキットのマニュアルに従って、Dpn I処理した後に大腸菌にトランスフォームした。そして、得られた大腸菌からプラスミドを回収してシーケンスすることによって変異が導入されていることを確認した。マウス活性型H-Rasのアミノ酸配列を配列番号:7に示す。
これらの遺伝子は、すべてpCXNベクター(Gene, Vol.108, p.193-200, 1991)に組み込んで、それぞれをpCXN-H-Ras(マウスc-H-ras)、pCXN-A-H-Ras(マウス活性型c-H-ras)、及びpCXN-A-K-Ras(ヒト活性型K-ras)とした。
(1)ベクターのCHO細胞への導入
CHO細胞に導入する2μgのベクターは、以下のように2種類、あるいは3種類のベクターを、様々な割合で混合することで調整した(表1)。実施例2と同じ方法でCHO細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
Claims (37)
- エンハンサーに哺乳類βアクチンプロモーターが機能的に結合したDNA構築物。
- エンハンサーがサイトメガロウイルス(CMV)である請求項1に記載のDNA構築物。
- エンハンサーがWoodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element(WPRE)である請求項1に記載のDNA構築物。
- 哺乳類βアクチンプロモーターがげっ歯類βアクチンプロモーターである、請求項1から3のいずれかに記載のDNA構築物。
- CMVエンハンサーが配列番号:4に記載の塩基配列からなり、哺乳類βアクチンプロモーターが配列番号:2に記載の塩基配列からなる、請求項2に記載のDNA構築物。
- Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element(WPRE)が配列番号:3に記載の塩基配列からなり、哺乳類βアクチンプロモーターが配列番号:2に記載の塩基配列からなる、請求項3に記載のDNA構築物。
- 請求項1から6のいずれかに記載のDNA構築物を含むベクター。
- 哺乳類βアクチンプロモーターの下流に所望のDNAが機能的に結合されたDNAを有する請求項7に記載のベクター。
- トランスアクティベーターをコードするDNAを発現可能に保持する、請求項7または8に記載のベクター。
- トランスアクティベーターが癌遺伝子産物である請求項9に記載のベクター。
- 癌遺伝子産物がRasである、請求項10に記載のベクター。
- 所望のDNAが、所望のタンパク質をコードするDNAである、請求項8から11のいずれかに記載のベクター。
- 請求項8から12のいずれかに記載のベクターを保持する細胞。
- 請求項8から12のいずれかに記載のベクターを保持し、癌遺伝子が活性化している細胞。
- 癌遺伝子が活性化している細胞が、トランスアクティベーターをコードする遺伝子を含むベクターが導入された細胞である請求項14に記載の細胞。
- 癌遺伝子が活性化している細胞が、癌化している細胞である請求項14に記載の細胞。
- 哺乳動物細胞である、請求項13から16のいずれかに記載の細胞。
- げっ歯類細胞である、請求項17に記載の細胞。
- βアクチンプロモーターと同じ動物目であることを特徴とする請求項13から18のいずれかに記載の細胞。
- βアクチンプロモーターと同じ動物種であることを特徴とする請求項19に記載の細胞。
- 請求項8から12のいずれかに記載のベクターが導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
- 請求項8から12のいずれかに記載のベクターが導入された全能性細胞。
- 請求項12に記載のベクターを保持する細胞を培養し、培養した細胞又は培地から発現させたタンパク質を回収することを含む、所望のタンパク質の製造方法。
- 培地にトランスアクティベーターを添加することを含む、請求項23に記載の方法。
- 請求項8から12のいずれかに記載のベクターを、ベクター上のβアクチンプロモーターと同じ動物目由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において所望のDNAを発現させる方法。
- 請求項8から12のいずれかに記載のベクターを、ベクター上のβアクチンプロモーターと同じ動物種由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において所望のDNAを発現させる方法。
- 請求項8に記載のベクターおよびトランスアクティベーターをコードするDNAを発現可能に保持するベクターを、請求項8に記載のベクター上のβアクチンプロモーターと同種由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞における所望のDNAを発現させる方法。
- 宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項25から27のいずれかに記載の方法。
- 宿主細胞がげっ歯類細胞である、請求項25から27のいずれかに記載の方法。
- 宿主細胞と同じ動物目由来のβアクチンプロモーターを所望のDNAの上流に組み込むことを特徴とする、所望のDNAの発現量を増加させる方法。
- 宿主細胞と同じ動物種由来のβアクチンプロモーターを所望のDNAの上流に組み込むことを特徴とする、所望のDNAの発現量を増加させる方法。
- エンハンサーをさらに組み込むことを特徴とする請求項30もしくは31に記載の方法。
- エンハンサーがWoodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element(WPRE)である請求項32記載の方法。
- エンハンサーがCMVエンハンサーである請求項32に記載の方法。
- トランスアクティベーターをコードする遺伝子を組み込むことを特徴とする請求項30から34のいずれかに記載の方法。
- 宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項30から35のいずれかに記載の方法。
- 宿主細胞がげっ歯類細胞である請求項30から35のいずれかに記載の方法。
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