KR20120034715A - 고생산성 세포의 수립을 위한 발현 벡터 및 고생산성 세포 - Google Patents

고생산성 세포의 수립을 위한 발현 벡터 및 고생산성 세포 Download PDF

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Abstract

본 발명은 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 형질 전환 세포를 효율적으로 수립하는 데 효과적인 발현 벡터를 제공한다. 구체적으로는, mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트, 적어도 1개의 유전자 발현 안정화 엘리먼트, 및 목적 단백질의 유전자 발현 카세트를 갖는 발현 벡터이다. 바람직하게는 mRNA 불안정화 서열은 사이토카인, 인터루킨 또는 암원 유전자의 3' 비번역 영역에 존재하는 AT 리치 서열에서 유래하고, 유전자 발현 안정화 엘리먼트는 차이니즈 햄스터 게놈에서 유래한다.

Description

고생산성 세포의 수립을 위한 발현 벡터 및 고생산성 세포{EXPRESSION VECTOR FOR ESTABLISHING HYPER-PRODUCING CELLS, AND HYPER-PRODUCING CELLS}
본 발명은 유전자 재조합 기술에 의해 목적으로 하는 단백질의 유전자를 삽입한 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 얻어진 형질 전환 세포 중에서 목적으로 하는 단백질의 유전자를 고레벨로 발현하는 세포를 효율적으로 수립하기 위한 발현 벡터, 및 형질 전환된 고생산성 세포에 관한 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 유전자 공학적 수법에 의해 동물 세포, 특히 포유류 동물 세포에서 의약품 등의 유용 단백질을 생산하기 위해서 유용하다.
재조합 단백질을 생산하는 발현 시스템의 개발은 연구 또는 치료에 이용되는 단백질의 공급원을 제공하는 데 있어서 중요하다. 발현 시스템으로서는 대장균 등의 원핵 세포에 기초하는 것, 및 효모(Saccharomyces속, Pichia속, Kluyveromyces속 등) 및 포유류 세포 등의 동물 세포를 포함하는 진핵 세포에 기초하는 것의 양자가 이용되고 있다. 이들 중에서도 동물 세포, 특히 포유류 세포에 기초하는 발현 시스템이 치료용 단백질의 제조에는 바람직하다. 왜냐하면, 인간을 비롯한 포유류 동물에서 발생하는 단백질의 번역후 수식은 때로 그 생물 활성에 깊게 기여하기 때문에, 단백질의 투여 대상과 유사한 번역후 수식이 가능한 포유류 세포에 기초하는 발현 시스템을 이용한 쪽이 치료용 단백질의 유효성을 증강할 수 있기 때문이다.
재조합 단백질을 생산하는 세포를 수립하는 방법으로서는 일반적으로 목적 단백질의 유전자를 발현하는 유전자 구축물을 숙주 세포에 유전자 도입하고, 얻어진 형질 전환 세포 중에서 이 유전자 구축물이 숙주 세포의 게놈 상에 안정 도입된 세포를 선별한다. 이때, 상기 유전자 구축물에 약제 선택 마커가 되는 약제 내성 유전자를 목적 단백질의 유전자와 동일 프로모터 하 또는 별개의 프로모터 하에서 발현하도록 삽입해 두고, 약제 선택에 의해 살아남은 세포를 목적 단백질의 유전자가 안정 도입된 세포로서 선별한다. 목적 단백질의 발현 레벨은 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 숙주 세포 게놈 내의 어떤 영역에 도입되는가에 따라 크게 변동하지만, 도입 영역의 제어는 통상 불가능하다. 따라서, 유전자 도입하더라도 대부분의 세포는 목적 단백질 유전자를 발현하지 않거나 또는 발현량이 낮다. 이 때문에, 종래 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 형질 전환 세포의 취득에는 1000 내지 수천의 세포 샘플로부터 1 내지 2개의 세포주를 선별하는 작업을 수개월 내지 1년에 걸쳐 반복해서 행하고 있고, 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 형질 전환 세포의 선별에 방대한 노동력과 시간을 요하고 있었다.
따라서, 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 형질 전환 세포를 효율적으로 선별하기 위해서, 약제 선택 마커의 발현이나 기능을 감약화하는 것에 기초하는 방법이 개발되어 왔다. 약제 선택 마커의 발현이나 기능을 감약화하면, 약제 선택 마커 유전자가 숙주 세포 게놈 내의 저발현 영역에 도입된 형질 전환 세포는 약제 선택 마커(약제 내성 유전자)를 충분히 발현할 수 없기 때문에 사멸하고, 고발현 영역에 도입된 형질 전환 세포만이 약제 선택에 의해 살아남는다. 이 살아남은 형질 전환 세포에서는 약제 선택 마커 유전자에 인접하여 목적 단백질 유전자를 가질 가능성이 높기 때문에, 목적 단백질 유전자도 숙주 세포 게놈 내의 고발현 부위에 도입되어 있고, 목적 단백질 유전자가 고레벨로 발현되어 있을 가능성이 높다. 이를 이용하여 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 형질 전환 세포를 효율 좋게 선별할 수 있다고 생각된다.
약제 선택 마커의 발현이나 기능을 감약화하는 하나의 방법으로서는, 약제 선택 마커의 발현에 이용하는 프로모터로서 전사 활성이 약한 프로모터인 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제(Herpes simplex virus thymidine kinase; HSV-tk) 프로모터를 이용하는 방법(비특허문헌 1)이나, 야생형 전사 활성 레벨보다도 감약화된 변이형 프로모터를 이용하여 약제 선택 마커의 발현을 억제하는 방법(특허문헌 1, 2)을 들 수 있다. 그러나, 본 발명자들이 이들 방법을 추시한 결과, 어느 쪽의 방법도 약제 선택 마커의 발현을 감약화한다고 하는 면에서 효과가 거의 보이지 않았다. 이 점에서 이들 방법을 이용하여 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 형질 전환 세포를 효율적으로 선별한다는 것은 어렵다고 생각되었다.
약제 선택 마커의 발현이나 기능을 감약화하는 별도의 방법으로서는, 네오마이신포스포트랜스페라제 등의 약제 선택 마커 유전자의 코드 서열에 변이를 도입하여 약제 선택 마커 자체의 기능을 감약화하는 방법(특허문헌 3, 4)을 들 수 있다. 본 발명자들이 이 방법을 추시한 결과, 이 방법을 이용함으로써 약제 선택 마커의 기능을 다소 감약화할 수 있고, 약제 선택의 결과로서 소량의 발현량이 향상된 세포주를 취득할 수 있었다. 그러나, 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 형질 전환 세포를 선별하는 점에서의 효율은 좋지 않고, 이 방법에 의한 현저한 효과는 보이지 않았다.
고생산성 세포의 수립에는 세포 선택 기술의 개량 외에 목적 유전자의 발현을 안정적으로 유지하기 위해서 숙주 세포 게놈 상의 목적 유전자 도입 부위의 주위의 게놈 환경으로부터의 영향을 배제하는 고안이 필요하다. 재조합 단백질의 발현은 재조합 단백질을 코딩하는 유전자가 숙주 세포 게놈 내의 어떤 부위에 도입되는지에 따라 크게 변동하지만, 도입 부위의 제어는 통상 불가능하다. 따라서, 스크리닝시에는 충분한 발현을 하고 있었던 세포라도 배양을 계속해 가는 중에 점차 발현이 저하되는 경우도 있다. 이러한 위치 효과를 극복하기 위해서 도입 유전자에 대한 인접하는 염색체나 조절 엘리먼트의 영향을 완화하는 염색체 엘리먼트(시스 작용성 DNA 엘리먼트)가 재조합 단백질의 제조에 이용되고 있다. 이러한 기능을 가진 핵산 서열의 하나가 인슐레이터라고 불리는 서열로, 닭의 β-글로빈 LCR의 1.2kb 길이의 DNaseI Hypersensitive 부위(cHS4) 등이 자주 기능 해석되어 재조합 단백질의 발현에 이용되고 있지만(비특허문헌 2), CHO-K1 세포에서의 단백질 발현의 증가는 그다지 큰 것은 아닌 것으로 되어 있다(비특허문헌 3).
US5,627,033 WO2005/024015 WO2001/032901 WO2004/050884 일본 특허 공개 제2001-37478호 공보
Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J.(1991) Gene 108:193-200 Pikaart MJ, Recillas-Targa F, Felsenfeld G.(1998) Genes Dev 12:2852-62 Izumi M, Gilbert DM.(1999) J Cell Biochem 76:280-289 Bakheet T, Frevel M, Williams B.R.G, Greer W, Khabar K.S.A.(2001) Nucleic Acids Research 29:246-254 Lagnado C.A, Brown C.L, Goodall G.J.(1994) Molecular and Cellular Biology 14:7984-7995 Zubiaga A.M, Belasco J.G, Greenberg M.E.(1995) Molecular and Cellular Biology 15:2219-2230 Blasco MA(2007) Nat Rev Genet 8:299-309 Gonzalo S, Jaco I, Fraga MF, Chen T, Li E, Esteller M, Blasco MA(2006) Nat Cell Biol 8:416-424 Perrod S, Gasser SM(2003) Cell Mol Life Sci 60:2303-2318 Wakimoto BT(1998) Cell 93:321-324 Bao L, Zhou M, Cui Y(2008) Nucleic Acids Research, 36, D83-D87
본 발명의 목적은 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 형질 전환 세포를 효율적으로 수립하는 데 효과적인 발현 벡터 및 고생산성 세포를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 mRNA 불안정화 서열을 도입한 약제 선택 마커 발현 카세트 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 발명하였다. 그리고, mRNA 불안정화 서열을 갖는 여러 가지 약제 선택 마커 발현 카세트와 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 구비한 도입 유전자의 발현 벡터를 구축하고, 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포의 유전자 발현을 자세히 해석한 결과, 목적 단백질의 고생산성 세포의 비율이 비약적으로 상승하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명에 따르면, 이하가 제공된다:
(1) mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트, 적어도 1개의 유전자 발현 안정화 엘리먼트, 및 목적 단백질의 유전자 발현 카세트를 갖는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
(2) mRNA 불안정화 서열이 사이토카인, 인터루킨 또는 암원 유전자의 3' 비번역 영역에 존재하는 AT 리치 서열에서 유래하는 것을 특징으로 하는 (1)에 기재된 발현 벡터.
(3) mRNA 불안정화 서열이 TTATTTA(A/T)(A/T)의 모티프 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 (1)에 기재된 발현 벡터.
(4) 모티프 서열이 2회 이상 반복되어 있는 것을 특징으로 하는 (3)에 기재된 발현 벡터.
(5) 모티프 서열의 반복 사이에 1 염기 이상의 스페이서 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (4)에 기재된 발현 벡터.
(6) mRNA 불안정화 서열 중에 1 내지 수 염기의 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 (2) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 발현 벡터.
(7) 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 차이니즈 햄스터 게놈 유래인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 기재된 발현 벡터.
(8) 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 이하의 (a) 내지 (h) 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (7) 중 어느 한 항에 기재된 발현 벡터.
(a) 서열 번호 26으로 나타내는 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41820번째부터 41839번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 포함하는 DNA;
(c) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41821번째부터 41840번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 포함하는 DNA;
(d) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 45182번째부터 45200번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 포함하는 DNA;
(e) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 91094번째부터 91113번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 포함하는 DNA;
(f) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 숙주 세포 중에서 외래 유전자 발현 카세트와 근접하도록 배치되었을 때에 외래 유전자 발현 카세트에 포함되는 외래 유전자로부터의 목적 재조합 단백질의 발현을 증대 또는 안정화시킬 수 있는 DNA; 및
(g) 상기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 유전자 발현 안정화 기능을 갖는 DNA
(h) 상기 (a) 내지 (g) 중 어느 하나의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA
(9) 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 이하의 (i) 내지 (k) 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (8)에 기재된 발현 벡터.
(i) 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41601번째부터 46746번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 포함하는 DNA;
(j) (i)의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 유전자 발현 안정화 기능을 갖는 DNA; 및
(k) 상기 (i) 또는 (j)의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA
(10) 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 이하의 (l) 내지 (n) 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (9)에 기재된 발현 벡터.
(l) 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41601번째부터 42700번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 포함하는 DNA;
(m) (l)의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 유전자 발현 안정화 기능을 갖는 DNA; 및
(n) (l) 또는 (m)의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA
(11) 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 상류에 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 발현 벡터.
(12) 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 발현 벡터.
(13) 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 목적 단백질의 유전자 발현 카세트 및 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 발현 벡터.
(14) 약제 선택 마커 유전자가 단백질 합성 저해계 항생 물질 내성 유전자인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (13) 중 어느 한 항에 기재된 발현 벡터.
(15) 약제 선택 마커 유전자가 퓨로마이신-N-아세틸트랜스페라제, 하이그로마이신-B-포스포트랜스페라제 및 네오마이신포스포트랜스페라제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 (14)에 기재된 발현 벡터.
(16) 목적 단백질의 유전자 발현 카세트가 원하는 목적 단백질 유전자를 삽입하기 위한 멀티 클로닝 사이트를 구비하는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (15) 중 어느 한 항에 기재된 발현 벡터.
(17) 목적 단백질이 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (16) 중 어느 한 항에 기재된 발현 벡터.
(18) 목적 단백질의 유전자 발현 카세트가 항체의 경쇄의 정상 영역 유전자를 포함하는 항체 유전자 발현 카세트 및/또는 항체의 중쇄의 정상 영역 유전자를 포함하는 항체 유전자 발현 카세트인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (17) 중 어느 한 항에 기재된 발현 벡터.
(19) (1) 내지 (18) 중 어느 한 항에 기재된 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 형질 전환 세포.
(20) 숙주 세포가 동물 세포인 것을 특징으로 하는 (19)에 기재된 형질 전환 세포.
(21) 동물 세포가 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 (20)에 기재된 형질 전환 세포.
(22) 포유류 세포가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인 것을 특징으로 하는 (21)에 기재된 형질 전환 세포.
(23) 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포가 무혈청 순화되어 있는 것을 특징으로 하는 (22)에 기재된 형질 전환 세포.
(24) (19) 내지 (23) 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환 세포를 약제 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 세포군을 선별하는 방법.
(25) (19) 내지 (23) 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환 세포로 이루어지는 세포군이며, 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포군.
(26) (19) 내지 (23) 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 단백질을 생산하는 방법.
(27) 단백질이 항체인 것을 특징으로 하는 (26)에 기재된 방법.
(28) 단백질이 백신인 것을 특징으로 하는 (26)에 기재된 방법.
본 발명의 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트는 mRNA 불안정화 서열이 삽입되어 있기 때문에, mRNA 불안정화 서열을 갖지 않는 종래의 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트에 비해 약제 선택 마커의 발현이 감약화되어 있고, 숙주 세포 게놈 내의 고발현 영역에 삽입되지 않으면, 약제 존재하에서 형질 전환 세포의 생존이 어려워진다. 이 때문에, 약제 선택 마커 유전자 및 목적 단백질 유전자가 숙주 세포 게놈 내의 고발현 영역에 삽입된 형질 전환 세포만이 약제 선택에 의해 살아남을 수 있다. 그 결과, 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 고발현 세포를 효율적으로 선별할 수 있다.
또한, 본 발명의 유전자 발현 안정화 엘리먼트는 세포 게놈에서의 재조합 단백질 유전자에 대한 인접 염색체나 조절 엘리먼트의 영향을 감소시켜 재조합 단백질 유전자의 유전자 발현을 안정화하고, 고발현을 장기간 유지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 약화된 약제 선택 마커 발현 카세트와 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 병용함으로써, 그 상승 효과에 의해, 약제 선택에 의해 선택된 세포에 있어서 목적 유전자를 매우 고도로 발현하는 세포를 농축하고, 또한 이들 고발현 세포에서의 발현의 안정적인 유지를 할 수 있다. 본 발명에 의해, 이들 매우 높은 레벨의 단백질 생산성을 나타내는 고생산 세포주를 신속, 용이 또한 효율적으로 수립할 수 있다.
도 1은 pBS-CMV-SNAPm2의 구축을 나타내는 도면이다.
도 2는 pPUR?N4의 구축을 나타내는 도면이다. 이하, 도면 중 Pur란 퓨로마이신 내성 유전자를 말한다. 또한, 도면 중 iPCR이란 Inverse PCR을 말한다.
도 3은 pBS-CMV-SNAPm-Pur, pBS-CMV-SNAPm-Pur?N4의 구축을 나타내는 도면이다.
도 4는 pBS-CMV-SNAPm-Pur 및 pBS-CMV-SNAPm-Pur?N4로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 pBS-CMV-SNAPm-Pur 및 pBS-CMV-SNAPm-Pur?N4로 형질 전환된 세포 집단 중 SNAPm을 고발현하는 세포의 비율을 플롯팅한 그래프이다.
도 6은 pBS-CMV-SNAPm-Pur 및 pBS-CMV-SNAPm-Pur?N4로 형질 전환된 세포 집단을 약제 선택하였을 때의 명시야상이다.
도 7은 pBS-CMV-SNAPm-Pur의 콜로니를 단리하여, FACS 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 pBS-CMV-SNAPm-Pur?N4의 콜로니를 단리하여, FACS 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 pEF1α-KOD3G8HC-RE2의 구축을 나타내는 도면이다. 이하, 도면 중 Neo란 네오마이신 내성 유전자를 말한다.
도 10은 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4 및 pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2의 구축을 나타내는 도면이다.
도 11은 pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4로 형질 전환된 세포 집단 중 SNAPm을 고발현하는 세포의 비율을 플롯팅한 그래프이다.
도 13은 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2의 구축을 나타내는 도면이다. 이하, 도면 중 Hyg란 하이그로마이신 내성 유전자를 말한다.
도 14는 pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2 및 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4의 구축을 나타내는 도면이다.
도 15는 pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2 및 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 16은 pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2 및 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4로 형질 전환된 세포 집단 중 SNAPm을 고발현하는 세포의 비율을 플롯팅한 그래프이다.
도 17은 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4의 구축을 나타내는 도면이다.
도 18은 pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2 및 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 19는 pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2 및 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4로 형질 전환된 세포 집단 중 SNAPm을 고발현하는 세포의 비율을 플롯팅한 그래프이다.
도 20은 pEF1α-SNAP26m-Pur?N2, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8의 구축을 나타내는 도면이다.
도 21은 pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur?N2, pEF1α-SNAP26m-Pur?N4, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 22는 pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur?N2, pEF1α-SNAP26m-Pur?N4, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8로 형질 전환된 세포 집단 중 SNAPm을 고발현하는 세포의 비율을 플롯팅한 그래프이다.
도 23은 서열 번호 26의 서열과 CTCF의 결합 서열의 예측 부위를 나타내는 도면이다.
도 24는 핵산 서열 단편의 유전자 발현 안정화 효과의 확인에 이용한 기본 구축물 pBS-CMV-SNAPm의 구축을 나타내는 도면이다.
도 25는 서열 번호 26의 서열, CTCFBS, 피검 서열의 핵산 단편의 위치 관계를 나타내는 도면이다.
도 26은 각 핵산 서열의 단편을 포함하는 SNAPm 발현 구축물을 안정 도입시킨 CHO 세포를 FACS 해석하여 얻어진 SNAPm 발현 강도와 세포 수의 분포를 나타내는 그래프이다.
도 27은 각 핵산 서열의 단편을 포함하는 SNAPm 발현 구축물을 안정 도입시킨 CHO 세포의 FACS 해석에 의해, 10 이상의 SNAPm의 형광 시그널을 나타낸 세포의 비율(%)을 플롯팅한 그래프이다.
도 28은 CHO5의 딜리션 구축물 구축과 서열 번호 26의 당해 피검 서열의 위치 관계를 나타내는 도면이다.
도 29는 CHO5 및 CHO5 딜리션 구축물을 안정 도입하여 얻어진 CHO 세포의 FACS 해석의 결과, 10 이상의 SNAPm의 형광 시그널을 나타낸 세포의 비율(%)을 플롯팅한 그래프이다.
도 30은 CHO5Δ3의 3' 딜리션 구축물 구축을 위한 Inverse PCR법에 이용한 프라이머의 위치 관계와 딜리션에 의해 얻어진 피검 삽입 서열을 나타내는 도면이다.
도 31은 CHO5Δ3 및 CHO5Δ3의 3' 딜리션 구축물을 안정 도입하여 얻어진 CHO 세포의 FACS 해석의 결과, 10 이상의 SNAPm의 형광 시그널을 나타낸 세포의 비율(%)을 플롯팅한 그래프이다.
도 32는 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k의 구축을 나타내는 도면이다.
도 33은 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k의 구축을 나타내는 도면이다.
도 34는 pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N4 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 35는 pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N4 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k로 형질 전환된 세포 집단 중 SNAPm을 고발현하는 세포의 비율을 플롯팅한 그래프이다.
도 36은 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k/1.1k의 구축을 나타내는 도면이다.
도 37은 pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2, pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4 및 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4-1.1k/1.1k로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 38은 pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2, pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4 및 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4-1.1k/1.1k로 형질 전환된 세포 집단 중 SNAPm을 고발현하는 세포의 비율을 플롯팅한 그래프이다.
도 39는 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k/1.1k의 구축을 나타내는 도면이다.
도 40은 pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2, pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Neo?N4 및 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4-1.1k/1.1k로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 41은 pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2, pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Neo?N4 및 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4-1.1k/1.1k로 형질 전환된 세포 집단 중 SNAPm을 고발현하는 세포의 비율을 플롯팅한 그래프이다.
도 42는 pEF1α-SNAP26m-Pur?N2-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N8-1.1k/1.1k의 구축을 나타내는 도면이다.
도 43은 pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N2-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6-1.1k/1.1k 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8-1.1k/1.1k로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 44는 pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N2-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6-1.1k/1.1k 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8-1.1k/1.1k로 형질 전환된 세포 집단 중 SNAPm을 고발현하는 세포의 비율을 플롯팅한 그래프이다.
도 45는 pEF1α-KOD3G8HC-Neo?N4-1.1k/1.1k의 구축을 나타내는 도면이다.
도 46은 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k/1.1k의 구축을 나타내는 도면이다.
도 47은 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg?N4-1.1k/1.1k의 구축을 나타내는 도면이다.
도 48은 pEF1α-KOD3G8HC-Pur?N4-1.1k/1.1k의 구축을 나타내는 도면이다.
도 49는 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 포함하지 않는 것(-/Neo, -/Hyg), 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k/Neo, 1.1k/Hyg), 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(H쇄:Neo, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Neo?N4, 1.1k/Hyg?N4), 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(H쇄:Pur, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Pur?N4, 1.1k/Hyg?N4)에 대하여 폴리클론의 배양 상청을 이용하여 ELISA를 행하여 산출한 항체 생산량을 플롯팅한 그래프이다.
도 50은 6웰 플레이트의 배양 상청을 이용하여 ELISA를 행하여 산출한 각 클론의 항체 생산량을 플롯팅한 그래프이다. 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 포함하지 않는 것(-/Neo, -/Hyg)과 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k/Neo, 1.1k/Hyg), 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 포함하지 않는 것(-/Neo, -/Hyg)과 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(H쇄:Neo, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Neo?N4, 1.1k/Hyg?N4), 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 포함하지 않는 것(-/Neo, -/Hyg)과 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(H쇄:Pur, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Pur?N4, 1.1k/Hyg?N4)에 대하여 각각 생산량 상위 5 클론을 동일 그래프 상에 플롯팅하고 있다.
도 51은 유전자 안정화 엘리먼트와 mRNA 불안정화 서열을 포함하지 않는 것(-/Neo, -/Hyg), 및 유전자 안정화 엘리먼트와 mRNA 불안정화 서열을 부가하고, 높은 항체 생산성이 인정된 것(1.1k/Pur?N4, 1.1k/Hyg?N4)에 대하여 96웰 플레이트에서의 2주간 배양에서의 항체 생산성의 도수 분포를 플롯팅한 그래프이다.
도 52는 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k/Neo, 1.1k/Hyg), 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(H쇄:Pur, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Pur?N4, 1.1k/Hyg?N4)에 대하여 무혈청 순화된 CHO-K1 세포에 유전자 도입하고, 약제 선택 후에 폴리클론의 배양 상청을 이용하여 ELISA를 행하여 산출한 항체 생산량을 플롯팅한 그래프이다.
도 53은 pEF1α-KOD3G8LC, HC-Pur?N4-1.1k/1.1k의 구축을 나타내는 도면이다.
도 54는 2 구축물 항체 발현계, 싱글 벡터 항체 발현계에 대하여 폴리클론의 배양 상청을 이용하여 ELISA를 행하여 산출한 항체 생산량을 플롯팅한 그래프이다.
도 55는 6웰 플레이트의 배양 상청을 이용하여 ELISA를 행하여 산출한 각 클론의 항체 생산량을 플롯팅한 그래프이다. 2 구축물 항체 발현계, 싱글 벡터 항체 발현계, 각각 생산량 상위 5 클론을 동일 그래프 상에 플롯팅하고 있다.
도 56은 pEHX의 벡터 맵을 나타내는 도면이다.
도 57은 pEH(M-SNAP26m-N), pEH(B-SNAP26m-N)의 구축을 나타내는 도면이다.
도 58은 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k, pEH(M-SNAP26m-N), pEH(B-SNAP26m-N)으로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 59는 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k, pEH(M-SNAP26m-N), pEH(B-SNAP26m-N)으로 형질 전환된 세포 중 SNAPm을 고발현하는 세포의 비율을 플롯팅한 그래프이다.
도 60은 pELX의 벡터 맵을 나타내는 도면이다.
도 61은 pELH(KOD3G8)의 구축을 나타내는 도면이다.
도 62는 제한 효소 인식 서열을 삭제하지 않은 유전자 발현 안정화 서열 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k), 및 유전자 발현 안정화 서열로부터 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k-ΔRE)에 대하여 폴리클론의 배양 상청을 이용하여 ELISA를 행하여 산출한 항체 생산량을 플롯팅한 그래프이다.
도 63은 6웰 플레이트의 배양 상청을 이용하여 ELISA를 행하여 산출한 각 클론의 항체 생산량을 플롯팅한 그래프이다. 제한 효소 인식 서열을 삭제하지 않은 유전자 발현 안정화 서열 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k), 및 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k-ΔRE)에 대하여 각각 생산량 상위 5 클론을 동일 그래프 상에 플롯팅하고 있다.
도 64는 pELX2의 벡터 맵을 나타내는 도면이다.
도 65는 pELH2(KOD3G8)의 구축을 나타내는 도면이다.
도 66은 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(pELH(KOD3G8)), 및 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류, 하류, 및 L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트 사이의 합계 3개소에 삽입한 것(pELH2(KOD3G8))에 대하여 폴리클론의 배양 상청을 이용하여 ELISA를 행하여 산출한 항체 생산량을 플롯팅한 그래프이다.
도 67은 6웰 플레이트의 배양 상청을 이용하여 ELISA를 행하여 산출한 각 클론의 항체 생산량을 플롯팅한 그래프이다. 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(pELH(KOD3G8)), 및 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류, 하류, 및 L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트 사이의 합계 3개소에 삽입한 것(pELH2(KOD3G8)에 대하여 각각 생산량 상위 5 클론을 동일 그래프 상에 플롯팅하고 있다.
도 68은 pELH3(KOD3G8)의 구축을 나타내는 도면이다.
도 69는 pELH4(KOD3G8)의 구축을 나타내는 도면이다.
도 70은 항KOD 항체의 H쇄 발현 카세트, L쇄 발현 카세트 및 Pur 내성 유전자 발현 카세트를 각각 1카피씩 코딩하는 것(pELH(KOD3G8)), 항KOD 항체의 H쇄 발현 카세트, L쇄 발현 카세트 및 Pur 내성 유전자 발현 카세트를 각각 2카피씩 코딩하는 것(pELH3(KOD3G8)), 및 항KOD 항체의 H쇄 및 L쇄 발현 카세트 및 Pur 내성 유전자 발현 카세트를 각각 2카피씩 코딩하고, L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에도 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 코딩하는 것(pELH4(KOD3G8))에 대하여 폴리클론의 배양 상청을 이용하여 ELISA를 행하여 산출한 항체 생산량을 플롯팅한 그래프이다.
도 71은 6웰 플레이트의 배양 상청을 이용하여 ELISA를 행하여 산출한 모노클론에 있어서의 각 세포주의 항체 생산량을 플롯팅한 그래프이다. 항KOD 항체의 H쇄 발현 카세트, L쇄 발현 카세트 및 Pur 내성 유전자 발현 카세트를 각각 1카피씩 코딩하는 것(pELH(KOD3G8)), 항KOD 항체의 H쇄 발현 카세트, L쇄 발현 카세트 및 Pur 내성 유전자 발현 카세트를 각각 2카피씩 코딩하는 것(pELH3(KOD3G8)), 및 항KOD 항체의 H쇄 및 L쇄 발현 카세트 및 Pur 내성 유전자 발현 카세트를 각각 2카피씩 코딩하고, L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에도 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 코딩하는 것(pELH4(KOD3G8))에 대하여 각각 생산량 상위 5 클론을 동일 그래프 상에 플롯팅하고 있다.
도 72는 pEHγX의 벡터 맵을 나타내는 도면이다.
도 73은 pELκX의 벡터 맵을 나타내는 도면이다.
도 74는 pELκHγ(KOD3G8)의 구축을 나타내는 도면이다.
도 75는 pcHγX의 벡터 맵을 나타내는 도면이다.
도 76은 pcLκHγ(KOD3G8)의 구축을 나타내는 도면이다.
도 77은 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 포함하지 않고, 또한 Pur 내성 유전자에 mRNA 불안정화 서열을 부가하지 않은 것(pcLκHγ(KOD3G8)), 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 또한 Pur 내성 유전자에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(pELκHγ(KOD3G8))에 대하여 폴리클론의 배양 상청을 이용하여 ELISA를 행하여 산출한 항체 생산량을 플롯팅한 그래프이다.
이하에 본 발명을 상세히 설명한다.
단백질의 기능 해석이나 유용 단백질의 생산을 위해서 유전자 재조합 기술을 이용하여 세포, 특히 동물 세포에 목적으로 하는 단백질의 유전자를 도입하여, 재조합 단백질로서 발현시키는 방법이 널리 이용되고 있다. 구체적으로는 플라스미드 벡터로 대표되는 벡터에 목적 단백질 유전자를 삽입하고, 세포에 벡터를 취입하게 한 후, 재조합에 의해 목적 단백질 유전자를 세포 게놈에 조립하여 세포를 형질 전환시키는 방법이 자주 이용되고 있다.
세포의 게놈은 염색체 상에 존재하지만, 염색체는 히스톤의 아세틸화나 고도한 응집(헤테로크로마틴) 등에 의해 유전자의 발현이 제어되어 있고, 삽입되는 염색체의 장소에 따라 유전자의 발현량은 크게 다르다. 벡터를 이용하여 세포를 형질 전환하는 방법에 있어서는 세포 게놈의 어떤 장소에 목적 단백질 유전자가 도입되는지를 제어할 수는 없고, 그 때문에 형질 전환 세포에서의 목적 단백질 유전자의 발현량, 나아가서는 목적 단백질의 생산량은 세포주에 따라 크게 달라지게 된다.
또한, 유전자 재조합이 잘 되지 않아 목적 단백질 유전자가 세포 게놈에 조립되어 있지 않은 경우도 많다.
따라서, 종전에는 미리 발현 벡터에 약제 내성(약제 선택 마커) 유전자를 삽입해 두고, 세포에 이 벡터를 유전자 도입한 후, 배지 중에 약제를 투여하고(약제 선택), 형질 전환이 성공한 세포를 선택하고, 그 후 만들어낸 세포군으로부터 높은 발현을 나타내는 세포주를 반복해서 선별하는 작업이 행해져 왔다. 그러나, 이 방법에서는 다수의 세포주를 준비할 필요가 있고, 또한 장기간의 배양을 필요로 하는 세포의 선별 작업을 반복해서 행하기 때문에, 다대한 노동력과 시간을 요하여 왔다. 또한 약제 내성 유전자는 대부분의 경우, 소량의 발현이라도 약제에 대한 내성을 나타내기 때문에, 생존한 세포 중에는 약제 내성 유전자 및 목적 단백질 유전자가 세포 게놈 내의 저발현 영역에 조립되어 있어 목적 단백질 유전자의 발현량이 적은 세포주도 혼재하고 있어 노동력과 시간에 더욱 박차를 가해 왔다.
또한, 선별시에는 충분한 발현을 하고 있었던 세포라도 배양을 계속해 가는 중에 점차 발현이 저하되는 것이 많이 보인다. 이는 유전자 사일런싱에 의해 발현이 억제되기 때문이라고 생각된다. 목적으로 하는 단백질 유전자의 게놈 도입 위치의 제어가 통상 불가능하기 때문에, 유전자 사일런싱의 효과에 의한 발현량 저하를 예측하는 것은 매우 어렵다. 따라서, 이러한 위치 효과를 완화하고, 발현을 고레벨로 안정적으로 유지하는 기술이 필요로 되어 왔다.
따라서, 본 발명은 이들 문제를 해결하기 위해서 약제 선택을 이용하여 고발현을 나타내는 세포를 취득할 수 있도록 하고, 또한 유전자 발현 안정화 엘리먼트에 의해 유전자의 도입 부위에 좌우되지 않고 높은 발현의 레벨을 유지할 수 있도록 함으로써, 신속?간편하고 또한 효율적으로 목적 단백질 생산성이 높은 세포주를 취득할 수 있는 점에서 매우 현저한 효과를 갖는 것이다.
본 발명에서는, 우선 종래 공지된 약제 내성(약제 선택 마커) 유전자를 사용한 선별에 있어서, mRNA 불안정화 서열을 이용함으로써 약제 내성 유전자의 발현량을 크게 억제하고, 숙주 세포 게놈 내의 고발현 영역에 약제 내성 유전자가 조립된 형질 전환 세포만이 약제 선택 후에 살아남도록 하고 있다. 약제 내성 유전자의 근린에는 목적 단백질의 유전자가 조립되어 있기 때문에, 살아남은 세포에서는 목적 단백질 유전자도 고발현 영역에 조립되어 있을 가능성이 높다. 따라서, 본 발명에 따르면, (ⅰ) 유전자 재조합이 잘 되지 않아 목적 단백질 유전자가 세포 게놈에 삽입되어 있지 않은 세포, (ⅱ) 유전자 재조합에 성공했지만, 약제 내성 유전자 및 목적 단백질 유전자가 숙주 세포 게놈의 저발현 영역에 조립되어 있는 세포, 및 (ⅲ) 유전자 재조합에 성공하고, 게다가 약제 내성 유전자 및 목적 단백질 유전자가 숙주 세포 게놈의 고발현 영역에 조립되어 있는 세포 중에서, (ⅲ)의 유전자 재조합에 성공하고, 게다가 약제 내성 유전자 및 목적 단백질 유전자가 숙주 세포 게놈의 고발현 영역에 조립되어 있는 세포만을 약제 선택에 의해 효율적으로 선별할 수 있다. 종래 공지된 선별 방법에서는 (ⅰ) 내지 (ⅲ)의 세포에서 (ⅱ) 및 (ⅲ)의 세포를 약제 선택에 의해 선별할 수 있지만, (ⅱ) 및 (ⅲ)의 세포에서 (ⅲ)의 세포만을 약제 선택에 의해 선별할 수는 없고, 약제 선택 후에 살아남은 형질 전환 세포에 대하여 목적 단백질 유전자의 발현 레벨을 별도 확인하여 (ⅲ)의 고발현 세포를 선별하였다. 본 발명의 방법은 약제 선택만으로 (ⅰ) 내지 (ⅲ)의 세포에서 (ⅲ)의 고발현 세포를 한번에 선별할 수 있기 때문에 효율적이고, 결과적으로 고발현 세포를 신속히 선별할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 이용함으로써 선별한 세포의 계속 배양시의 유전자 발현량의 저하를 방지하고 있다. 본 발명에 의한 유전자 발현 안정화 엘리먼트는 목적 단백질의 발현의 안정적 유지뿐만 아니라, 약제 내성 유전자에 효과를 나타내는 경우에는 약제 내성 유전자의 발현에 대한 인접 염색체나 조절 엘리먼트의 영향을 감소시키고, 약제 내성 유전자 본래의 기능을 발휘하는 데 도움이 되고, 약제 선택과의 상승 효과를 나타내는 것으로도 된다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트, 적어도 1개의 유전자 발현 안정화 엘리먼트, 및 목적 단백질의 유전자 발현 카세트를 갖는 것을 특징으로 하는 발현 벡터가 제공된다.
본 발명에 있어서, 발현 카세트란 프로모터에서부터 유전자 코드 서열, 터미네이터 서열(폴리아데닐레이션 시그널)까지의 유전자 발현의 단위를 말한다. 또한, 인트론, 스페이서 서열, 번역 증강 영역 등을 포함하는 경우도 있다. 따라서, 예를 들면 「약제 선택 마커 발현 카세트」라고 하는 경우, 상기 발현 카세트의 유전자 코드 서열이 약제 선택 마커 유전자의 코드 서열인 것을 말한다. 또한, 「목적 단백질의 유전자 발현 카세트」라고 하는 경우, 상기 발현 카세트의 유전자 코드 서열이 목적으로 하는 단백질의 유전자의 코드 서열인 것을 말한다.
(약제 선택 마커 발현 카세트)
본 발명에서 사용하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트는, mRNA 불안정화 서열을 갖는 것을 제외하고는 종래 공지된 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트와 마찬가지의 구성을 갖는다. 따라서, 우선 mRNA 불안정화 서열에 대하여 설명한다.
본 발명은 mRNA 불안정화 서열이 매우 효과적으로 약제 내성 유전자의 발현을 감약화할 수 있는 것을 발견한 것에 기초한 것이다. 본 발명의 mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트를 탑재한 발현 벡터를 숙주 세포에 유전자 도입한 경우, mRNA 불안정화 서열을 포함하지 않는 경우와 비교하여 약제 선택 후의 생존 세포 수 또는 그의 콜로니는 1/10 내지 1/100로 감소한다. 이는 mRNA 불안정 서열의 존재에 의해 약제 선택 마커의 mRNA가 불안정화하고, 약제 선택 마커의 발현량이 내려가기 때문에, 숙주 세포의 게놈 중에서 전사 활성이 높은 고발현 영역에 당해 발현 카세트가 조립된 세포가 아니면 약제 선택하에서의 생존이 어려워지기 때문이라고 생각된다.
「mRNA 불안정화 서열」이란, 이 서열을 갖는 DNA로부터 전사된 mRNA의 세포내 반감기를 감소시키는 기능을 갖는 뉴클레오티드 서열을 말하고, 자연계에서는 초기 응답 유전자 등에 존재하는 것이 발견되어 있다.
mRNA 불안정화 서열은, 몇 개의 유전자에서는 코드 서열 중에 또는 5' UTR(비번역 영역)에 존재하는 것도 있지만, 대부분은 3'UTR에 존재한다. 3'UTR에 존재하는 mRNA 불안정화 서열로서는 AU-풍부 엘리먼트(AU-rich element; ARE), 히스톤 mRNA 3'-터미널 스템-루프(histone mRNA 3'-terminal stem-loop), 철-반응성 엘리먼트(iron-responsive element; IRE), 인슐린-유사 성장 인자 II(insulin-like growth factor Ⅱ; IGF-Ⅱ), 롱 스템-루프(long stem-loop) 등이 알려져 있다. 이들 중에서도 ARE는 항상적으로 mRNA를 불안정화할 수 있는 점에서 본 발명에 이용하는 mRNA 불안정화 서열로서 바람직하다.
ARE란 mRNA에서의 「AU가 풍부한 엘리먼트」, 즉 아데닌(A) 및 우라실(U)을 높은 비율로 포함하는 서열 또는 영역을 의미한다. 또한, ARE는 상기 엘리먼트를 코딩하는 DNA에서의 「AT가 풍부한 엘리먼트」, 즉 아데닌(A) 및 티민(T)을 높은 비율로 포함하는 서열 또는 영역을 가리키기 위해서도 이용된다.
ARE는 조혈 세포 증식 인자 유전자, 성장 인자 유전자, 인터루킨 유전자, 인터페론 등의 사이토카인 유전자, 및 몇 개의 암원 유전자(프로토옹코진) 등에 보인다(비특허문헌 4). 본 발명의 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트에서는 이들 유전자 중의 ARE에 상당하는 핵산 서열을 그대로 이용하여도 되지만, ARE 중의 모티프 서열로서 알려진 TATTTAT(비특허문헌 5)나 TTATTTA(T/A)(T/A)(비특허문헌 6) 등을 이용하는 편이 불필요한 제한 효소 인식 서열을 발현 벡터에 삽입하는 것을 피할 수 있어 편리성이 높다.
ARE를 갖는 유전자의 예로서는, 조혈 세포 증식 인자에 대해서는 과립구-단핵구 콜로니 자극 인자(Granulocyte-monocyte colony sitimulationg factor; GM-CSF), 인터루킨에 대해서는 Interleukin-1β, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 11, 인터페론에 대해서는 Interferon-α, 암원 유전자에 대해서는 c-fos, c-myc, c-jun, c-myb, Pim-1 등이 예시된다. 이외에도 종양 괴사 인자(Tumor necrosis factor), 사이클린 D1(Cyclin D1), 시클로옥시게나제(Cyclooxygenase), 플라스미노겐 활성인자 억제제 타입2(Plasminogen activator inhibitor type2) 등 많은 유전자가 ARE를 갖는 것이 알려져 있으며, 예시된 유전자에 한정되지 않는다.
본 발명의 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트에서 사용할 수 있는 mRNA 불안정화 서열로서는 하기의 것이 예시된다.
ATTT의 모티프 서열의 1 내지 2회 이상의 반복.
ATTTA의 모티프 서열의 1 내지 2회 이상의 반복.
TATTTAT의 모티프 서열의 1 내지 2회 이상의 반복.
TTATTTA(T/A)(T/A)의 모티프 서열의 1 내지 2회 이상의 반복. (T/A)는 T 또는 A 중 어느 하나이다.
이들 서열은 1 내지 수 염기의 치환/삽입/결실을 포함할 수도 있고, DNA의 복제의 오류나 돌연 변이 등의 자연 변이에 의한 것, 인위적인 변이 도입에 의한 것 등이 상정된다. 또한, 모티프 서열의 반복 동안에는 1 내지 100 염기 정도의 스페이서 서열 또는 링커 서열을 포함할 수도 있다. 또한, 모티프 서열의 역위를 포함할 수도 있다.
이들 모티프 서열의 반복 수는 1회이어도 되지만, 2회 이상, 보다 바람직하게는 4회 이상으로 함으로써, mRNA가 불안정화 효과를 한층 높일 수 있고, 선별 효율을 현저히 증대시킬 수 있다.
반복 횟수의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 세포에 대한 벡터의 취입의 관점에서 발현 벡터가 최대 10kbp 내지 25kbp 길이가 되도록 한 것이 바람직하다. 단, 반복 서열 수가 증가함에 따라 mRNA의 불안정화의 효과는 포화를 향하고, 일정한 반복 수를 초과하면 그 이상의 현저한 효과를 바랄 수 없게 된다. 상한치를 정하는 것은 아니지만, 10회 이상의 반복 서열은 실용상 의미가 없다.
본 발명의 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트에 있어서의 프로모터로서는 동물 세포, 특히 포유류 세포로 발현 가능한 프로모터이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 인간이나 마우스의 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 원숭이 바이러스 40(SV40) 프로모터, 인간 헤르페스 단순 바이러스의 티미딘 키나제 유전자(HSV-tk) 프로모터 등의 바이러스에서 유래하는 것이나, 마우스 포스포글리세레이트-키나제1(phosphoglycerate-kinase1) 유전자(PGK) 프로모터 등의 비바이러스성 세포 유전자에서 유래하는 프로모터, 및 유래가 상이한 프로모터의 혼성을 들 수 있다. 여기서, 프로모터는 프로모터의 코어 영역에 한하는 것이 아니고, 인핸서 영역을 포함하는 경우도 있다. 약제 선택 마커의 발현을 감약화하기 때문에 전사 활성이 낮은 것이 보다 바람직하다. 전사 활성이 낮은 프로모터로서 변이형 프로모터 등을 이용할 수도 있고, 코작 서열을 치환할 수도 있다. 또한, mRNA 불안정화 서열의 모티프 서열의 반복 횟수를 적게 하고, 전사 활성이 약한 프로모터를 병용하는 것도 하나의 상정되는 실시 양태이다.
본 발명의 약제 선택 마커 발현 카세트를 이용한 약제 선택에 사용되는 약제로서는, 단백질 합성 저해계 항생 물질로서 블라스티사이딘(Blasticidin), 게네티신(Geneticin)(G418), 하이그로마이신(Hygromycin; Hyg), 퓨로마이신(Puromycin; Pur)이 예시된다. 그 밖의 선택용 약제로서 메토트렉세이트(Methotrexate; MTX), MSX(methionine sulphoximine; 메티오닌 술폭시민) 등이 예시된다. 또한, 본 발명의 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트에 있어서의 약제 선택 마커 유전자로서는, 약제 선택에 일반적으로 사용되는 약제에 대하여 내성을 나타내는 유전자가 바람직하게 이용된다. 단백질 합성 저해계 항생 물질을 약제로서 이용하는 경우에는 단백질 합성 저해계 항생 물질 내성 유전자를 이용하는 것이 바람직하다. 특별히 한정되는 것은 아니지만, 네오마이신 내성 유전자(게네티신 내성 유전자로서의 기능도 가짐)로서 Tn5 유래 네오마이신포스포트랜스페라제(aminoglycoside 3'-phosphotransferase)(Neo), 하이그로마이신 내성 유전자로서 E.coli 유래 하이그로마이신-B-포스포트랜스페라제(Hph, 실시예 및 도면에서는 Hyg라고 기재), 퓨로마이신 내성 유전자로서 스트렙토마이세스(Streptomyces) 유래 퓨로마이신-N-아세틸트랜스페라제 유전자(pac, 실시예 및 도면에서는 Pur이라고 기재), 블라스티사이딘 내성 유전자로서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 유래 블라스티사이딘 내성 유전자(bsr) 등이 예시된다. 이들 중에서도 퓨로마이신-N-아세틸트랜스페라제, 하이그로마이신-B-포스포트랜스페라제, 네오마이신포스포트랜스페라제가 바람직하고, 보다 바람직하게는 퓨로마이신N-아세틸트랜스페라제, 하이그로마이신-B-포스포트랜스페라제이고, 더욱 바람직하게는 퓨로마이신-N-아세틸트랜스페라제이다.
본 발명의 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트에 있어서의 폴리아데닐레이션 시그널(터미네이터 서열)로서는 SV40 바이러스 유래 late polyA 시그널, early polyA 시그널, HSV-tk 유래 polyA 시그널, 소 성장 인자 유전자 유래 polyA 시그널, 토끼 β-글로빈 유전자 유래 polyA 시그널 등이 예시되지만, 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트 중에서의 프로모터, 약제 선택 마커 유전자, mRNA 불안정화 서열, 및 폴리아데닐레이션 시그널의 배치 순서는 약제 선택 마커 유전자의 발현이 가능한 한 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로 프로모터, 약제 선택 마커 유전자, mRNA 불안정화 서열, 및 폴리아데닐레이션 시그널을 이 순서로 상류로부터 하류로 향하여 배치한다. 이들 4개의 요소는 서로 직접 연결되어 있을 필요는 없고, 원하는 바에 따라 인트론, 스페이서 서열, 번역 증강 영역 등을 사이에 가질 수도 있다.
(유전자 발현 안정화 엘리먼트 )
본 발명에서의 「유전자 발현 안정화 엘리먼트」란, 목적 단백질의 생산성을 높이기 위해서 목적 유전자 발현 카세트가 숙주 게놈에 삽입된 부위 근방의 게놈의 전사의 활성화의 상황에 영향을 받는다는 위치 효과를 해소하고, 유전자 발현을 안정화하는 기능을 갖는 핵산 영역을 의미한다.
유전자 발현을 안정화하는 기능을 갖는 핵산 서열로서는 인슐레이터, 스캐폴드/매트릭스 결합 영역(S/MAR), 유전자 자리 조절 영역(LCR), 편재 작용성 크로마틴 오프닝 엘리먼트(UCOE) 등을 이용할 수 있다.
인슐레이터로서는 닭 β-글로빈 LCR에서 유래하는 1.2kb DNaseI Hypersensitive site(cHS4), 말똥성게 유래 UR1 등이 예시된다. S/MAR로서는 닭 리소자임 5' MAR 엘리먼트, 인간 β-글로빈 MAR 엘리먼트나 인간 인터페론 βSAR 엘리먼트 등이 예시된다.
본 발명의 발현 벡터는 적어도 하나의 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 갖는다. 이들 유전자 발현을 안정화하는 기능을 갖는 핵산 서열을 목적 단백질의 발현 카세트의 상류 또는 하류, 또는 상류 및 하류에 배치함으로써 유전자 발현의 안정적 유지 및 목적 단백질의 생산성을 향상시키는 것이 가능하다.
목적 유전자를 숙주 세포 게놈에 도입하기 위한 유전자 구축물로서 플라스미드 벡터가 일반적으로 이용되지만, 플라스미드 벡터의 길이는 최대 10 내지 25kbp인 점에서 유전자 발현 안정화 엘리먼트의 쇄 길이는 될 수 있는 한 짧은 쪽이 바람직하다. 바람직한 길이로서는 5kbp 이하, 보다 바람직하게는 1kbp 정도이다.
본 발명의 바람직한 실시 양태에 있어서의 유전자 발현 안정화 엘리먼트는 특허문헌 5에 기재된 CHO 세포 DR1000L-4N주(CHO 세포-4N주)로부터 본 발명자들에 의해 동정된 핵산 분자이다. 당해 주는 외래 유전자로서 인간 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(hGM-CSF) 유전자를, DHFR 유전자를 갖는 발현 벡터에 도입하고, 이 벡터를 DHFR 유전자를 결손한 CHO 세포 DG44주에 도입하고, 도입주를 IMDM 배지(핵산 함유)에 10% 소 태아 혈청을 첨가한 배지에서 배양하여 형질 전환체를 얻고, 이 형질 전환체를 이어서 IMDM 배지(핵산 불포함), 10% 투석 소 태아 혈청을 첨가한 배지에서 선택하고, 또한 50nM, 100nM의 메토트렉세이트(MTX)를 포함하고, 핵산을 포함하지 않는 IMDM 배지를 이용하여 10 내지 100배 정도로 증가할 때까지 배양하고, MTX 농도를 상승시킴으로써 얻어진 텔로미어 타입의 클론 세포이다.
진핵 세포의 게놈은 진정 염색질과 이질 염색질의 2개의 클래스의 염색질로 나누어진다. 센트로미어와 텔로미어의 서열은 구성적인 이질 염색질의 주요한 부분이다. 특히, 텔로미어는 TTAGGG의 반복 서열과 서브 텔로미어 영역으로 이루어지며, 눈에 띄는 이질 염색질의 입체 구조를 취하는, 유전자가 부족한 영역이다(비특허문헌 7, 8). 텔로미어는 게놈의 안정성에 대한 그 기여나 보호적인 역할 외에 텔로미어 위치 효과로서 알려지는 현상에 의해 근처에 도입된 유전자의 발현에도 영향을 준다(비특허문헌 9, 10).
그런데, DR1000L-4N주는 텔로미어 타입의 클론 세포임에도 불구하고, 도입된 외래 유전자는 도입 부위 부근의 이질 염색체로부터의 불활성화의 영향을 받는 일 없이, 장기간의 배양에서 안정된 hGM-CSF의 높은 생산을 유지하였다. 이는 외래 유전자의 도입된 부위의 근방에 불활성화의 진행을 강력히 차단하도록 하는 경계 엘리먼트가 존재하여, 유전자 발현을 안정화하고 있는 것을 시사한다.
본 발명자들은 DR1000L-4N주에 있어서 외래 유전자 도입 부위의 근방의 서열을 분석한 결과, 서열 목록의 서열 번호 26으로 나타내는 약 91kbp의 서열로 이루어지는 DNA가 유전자 발현의 안정화에 관여하고 있음을 발견하였다.
본 발명의 발현 벡터에 포함되는 유전자 발현 안정화 엘리먼트의 길이는 짧은 쪽이 바람직하다. 따라서, 보다 작은 크기라도 유전자 발현 안정화 기능을 갖는 영역을 압축하기 위해서 발명자들은 한층 더 연구를 행하였다.
서열 번호 26으로 나타내는 약 91kbp의 서열을 추가로 분석하는 데 있어서, 통상 쇼트건법에 의한 약 3kbp 정도의 단편의 라이브러리를 제조하여, 각 단편을 1개씩 어세이하는 방법이 취해진다. 그러나, 각 단편이 유전자 안정화 기능을 갖는지의 여부를 해석할 때에 세포의 형질 전환이나 배양에 시간이 걸리기 때문에, 1 어세이당 수주일 내지 수개월의 기간을 요한다. 따라서, 전체 어세이를 행하기 위해서는 방대한 시간과 노동력을 요하게 된다.
따라서, 본 발명자들은 서열 번호 26의 서열 중 유전자 발현 서열의 경계 엘리먼트가 존재하는 것이 기대되는 부위를 중심으로 해석하는 방법을 발견하였다. 그리고, 서열 번호 26으로 이루어지는 DNA 중 42kbp, 45kbp 및 91kbp 부근의 영역이 유전자 발현 안정화 기능을 갖는 것을 발견하기에 이르렀다.
이 서열을 더 상세히 분석한 결과, 이 서열 중에서도 (ⅰ) 41820번째부터 41839번째까지의 염기로 나타내는 영역, (ⅱ) 41821번째부터 41840번째까지의 염기로 나타내는 영역, (ⅲ) 45182번째부터 45200번째까지의 염기로 나타내는 영역, 및 (ⅳ) 91094번째부터 91113번째까지의 염기로 나타내는 영역의 4개의 영역이 인슐레이터 결합 단백질 CTCF의 결합 서열 모티프에 상당하는 것을 발견하였다. 따라서, 이들 4개의 영역의 적어도 어느 하나를 포함하는, 이들 영역의 근방이 특히 유전자 발현의 안정화에 관여하고 있다고 생각되었다.
본 발명에서의 실시 양태에서는 유전자 발현 안정화 엘리먼트로서 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나 또는 그 조합을 사용할 수 있다.
(a) 서열 번호 26으로 나타내는 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41820번째부터 41839번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 적어도 포함하는 DNA;
(c) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41821번째부터 41840번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 적어도 포함하는 DNA;
(d) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 45182번째부터 45200번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 적어도 포함하는 DNA; 및
(e) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 91094번째부터 91113번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 적어도 포함하는 DNA.
이들 엘리먼트는 CHO 게놈으로부터 단리 동정된 것이지만, 이들 엘리먼트와 상동인 엘리먼트는 다른 포유류 세포 게놈에도 존재하는 것이 예상된다. 따라서, (f) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 숙주 세포 중에서 외래 유전자 발현 카세트와 근접하도록 배치되었을 때에 외래 유전자 발현 카세트에 포함되는 외래 유전자로부터의 목적 재조합 단백질의 발현을 증대 또는 안정화시킬 수 있는 DNA도, 유전자 발현 안정화 엘리먼트로서 사용할 수 있다. 이러한 상동 엘리먼트는 이 기술 분야의 주지의 기술, 예를 들면 종간 혼성화 또는 PCR 등에 의해 용이하게 단리 동정될 수 있다.
또한, (g) 상기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건으로 혼성화하며, 유전자 발현 안정화 기능을 갖는 DNA도 당연히 유전자 발현 안정화 엘리먼트로서 사용할 수 있다. 본 발명의 유전자 발현 안정화 엘리먼트는 이들 (a) 내지 (g) 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진다. 또한, (h) 상기 (a) 내지 (g) 중 어느 하나의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA도 유전자 발현 안정화 기능을 갖고, 유전자 발현 안정화 엘리먼트로서 사용할 수 있기 때문에 본 발명에 포함된다.
엄격한 조건이란, 이용되는 프로브?표지 방법에 따라서도 다르지만, 예를 들면 0.1% SDS를 포함하는 0.2×SSC 중 40 내지 50℃ 또는 0.1% SDS를 포함하는 2×SSC 중 55 내지 65℃의 조건하 혼성화하는 염기 서열이다. 또한, 엄격한 조건은 결합하는 핵산의 융해 온도(Tm값)에 기초하여 결정할 수 있다. 또한, 혼성화 후의 세정 조건으로서 「6×SSC, 0.1% SDS, Tm값보다도 약 15 내지 30℃ 낮은 온도」 정도의 조건을 들 수 있다. 보다 높은 엄격한 조건으로서는 「2×SSC, 0.1% SDS, Tm값보다도 약 5 내지 15℃ 낮은 온도」 정도, 더욱 높은 엄격한 조건으로서는 「1×SSC, 0.1% SDS, Tm값보다도 약 5 내지 15℃ 낮은 온도」 정도의 세정 조건을 들 수 있다. 더욱 높은 엄격한 조건으로서는 「0.1×SSC, 0.1% SDS」 정도의 세정 조건이 예시된다.
본 발명의 유전자 발현 안정화 엘리먼트의 바람직한 양태에서는, 상기 (b) 또는 (c)의 DNA는 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41601번째부터 46746번째까지의 염기로 나타내는 영역, 또는 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41601번째부터 46746번째까지의 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건으로 혼성화하며, 유전자 발현 안정화 기능을 갖는 염기 서열 영역이다. 또한, 이들 영역으로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열도 포함된다. 본 발명의 유전자 발현 안정화 엘리먼트의 더욱 바람직한 양태에서는, 상기 (b) 또는 (c)의 DNA는 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41601번째부터 42700번째까지의 염기로 나타내는 영역, 또는 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41601번째부터 42700번째까지의 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건으로 혼성화하며, 유전자 발현 안정화 기능을 갖는 염기 서열 영역이거나, 또는 이들 영역으로 이루어지는 DNA와 상보적인 염기 서열이다.
본 기술 분야에서는 여러 가지 목적 단백질 유전자를 발현 벡터에 효율적으로 삽입하기 위해서 멀티 클로닝 사이트를 구비한 발현 벡터가 자주 이용된다. 유전자 발현 안정화 엘리먼트의 서열 중에 멀티 클로닝 사이트에 사용되는 제한 효소의 인식 서열이 존재하는 경우, 당해 서열을 멀티 클로닝 사이트에 이용할 수 없다. 따라서, 유전자 발현 안정화의 기능을 손상하지 않도록 유전자 발현 안정화 엘리먼트의 서열로부터 제한 효소 인식 서열을 삭제함으로써, 당해 서열을 멀티 클로닝 사이트에 사용하는 것이 가능하게 된다.
바이오 의약품 제조에 있어서 최근에 특히 공급이 요구되는 것은 항체 분자이고, 멀티 클로닝 사이트에는 항체 유전자의 클로닝을 위해서 항체 유전자 내에 인식 서열이 존재하지 않는 제한 효소를 이용하는 것이 바람직하다. 의약품용 항체로서는 IgG가 대부분을 차지한다는 점에서, 본 발명자들은 Immunoglobulin Heavy Chain γ1 유전자(예로서 GeneBank Acc. No.AK057754), γ2 유전자(예로서 GeneBank Acc. No.BC062335), γ3 유전자(예로서 GeneBank Acc. No.BX538126), γ4 유전자(예로서 GeneBank Acc. No.BX640824), Immunoglobulin Light Chain κ 유전자(예로서 GeneBank Acc. No.AY894991), λ1 유전자(예로서 GeneBank Acc. No.BC007782), λ2 유전자(예로서 GeneBank Acc. No.X57809), 및 발현 벡터 구축의 베이스에 이용되는 pUC18 벡터(멀티 클로닝 사이트를 제외함)의 염기 서열을 해석하였다. 어느 유전자 서열에도 인식 서열이 존재하지 않고, 돌출 말단을 생성하는 제한 효소를 추출한 결과, AscI, BsiWI, BssHII, BstBI(Csp45I, NspV), CpoI, CspI(RsrII), FseI, HindIII, MfeI, MluI, NotI, PacI, PaeR71, SgrA1, SphI, XbaI, XhoI라는 제한 효소를 들 수 있었다. 또한, 1 내지 2개의 유전자를 절단하지만, 유전자 재조합에 비교적 이용하기 쉬운 효소로서 BclI, BglII, BlpI, EcoRI, SalI, SpeI를 들 수 있다.
한편, 평활 말단을 생성하도록 하는 제한 효소는 목적 단백질 유전자의 말단을 평활화해 둠으로써, 서열을 막론하고 연결하는 것이 가능하기 때문에 멀티 클로닝 사이트에 포함되는 1개의 인식 서열로서 바람직하다. 이러한 평활 말단을 생성하도록 하는 제한 효소로서는 EcoR105I(SnaBI), EcoRV, NruI, PsiI, SmaI, SrfI를 들 수 있다.
따라서, 본 발명에서의 유전자 발현 안정화 엘리먼트의 별도의 바람직한 양태는, 유전자 발현 안정화 기능을 갖는 서열로서 AscI, BsiWI, BssHII, BstBI(또는 Csp45I, NspV라고도 함), CpoI, CspI(또는 RsrII라고도 함), FseI, HindIII, MfeI, MluI, NotI, PacI, PaeR71, SgrA1, SphI, XbaI, XhoI, BclI, BglII, BlpI, EcoRI, SalI, SpeI, EcoR105I(또는 SnaBI라고도 함), EcoRV, NruI, PsiI, SmaI 및 SrfI로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1개의 제한 효소의 인식 서열을 삭제하도록 변이된 서열이다.
본 발명의 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 그 발현 안정화 효과를 발휘하기 위해서는, 엘리먼트가 숙주 세포 게놈 중에서 외래 유전자 발현 카세트의 도입 부위에 근접하는 위치에 배치되는 것이 필요하다. 본 발명에 있어서, 용어 「근접하는」이란 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 본 발명의 유전자 발현 안정화 엘리먼트와 외래 유전자 발현 카세트의 사이의 거리가 5000bp 이하, 더욱 바람직하게는 500bp 이하인 것을 의미한다.
이러한 근접 배치는 본 발명의 엘리먼트를 포함하는 핵산 서열 단편과, 외래 유전자의 발현 카세트를 포함하는 핵산 서열 단편의 혼합물을 전기 천공이나 트랜스펙션 등에 의해 숙주 세포 내에 도입하고, 외래 유전자의 발현량이 높은 숙주 세포 클론을 선택함으로써 실현할 수도 있지만, 근접 배치를 확실하게 달성시키기 위해서는 본 발명의 유전자 발현 안정화 엘리먼트 및 그에 근접하여 배치된 외래 유전자 발현 카세트를 포함하는 외래 유전자 발현 벡터를 미리 제조해 두고, 이 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환시키는 것이 바람직하다.
(목적 단백질의 유전자 발현 카세트)
본 발명에서의 목적 단백질 유전자의 발현 카세트는 프로모터, 유전자 코드 서열 및 터미네이터 서열(폴리아데닐레이션 시그널)로 이루어진다. 또한, 인트론이나 스페이서 서열, 번역 증강 영역을 포함하는 경우도 있다. 목적 단백질 유전자의 발현 프로모터로서는 될 수 있는 한 전사 활성이 높은 것이 바람직하고, 인간이나 마우스의 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 원숭이 바이러스 40(SV40) 프로모터 등의 바이러스에서 유래하는 것이나, 인간이나 마우스, 나아가 CHO 유래의 Elongation Factor 1(EF1α) 유전자, 유비퀴틴 유전자, β-액틴 유전자 등, 비바이러스성 세포 유전자에서 유래하는 프로모터, 및 유래가 상이한 프로모터/인핸서의 혼성, 예를 들면 CAG 프로모터 등을 들 수 있다.
본 발명에서는 목적 단백질의 유전자 발현 카세트는 약제 선택 마커 발현 카세트와 독립한 형태로 주어진다. 진핵 세포의 경우, 목적 단백질 유전자와 약제 선택 마커 유전자를 내재성 리보솜 엔트리 부위(Internal ribosome entry sites, IRES)로 연결하는 폴리시스트론성 발현을 행하는 방법도 있지만, 목적 단백질 유전자와 약제 선택 마커 유전자의 코드 서열이 1개의 mRNA로서 합성되기 때문에, 상기 mRNA 불안정화 서열을 삽입하면, 목적 단백질 유전자의 mRNA가 감소하여 고발현 세포를 얻을 수 없다. 그 때문에, 본 발명에서는 목적 단백질의 유전자 발현 카세트는 약제 선택 마커 발현 카세트와 독립적으로 배치되는 것이 바람직하다. 목적 단백질의 유전자 발현 카세트와 약제 선택 마커 발현 카세트는 별개의 벡터의 형태로 이용될 수도 있지만, 목적 단백질의 유전자 발현 카세트와 약제 선택 마커 발현 카세트가 동일한 벡터 상에 배치되는 것이 보다 바람직하다.
목적 단백질의 유전자 발현 카세트에는 상기 단백질 유전자의 코드 서열 대신에 복수의 제한 효소 인식 서열로 이루어지는 멀티 클로닝 사이트를 배치할 수 있다. 외래 유전자의 cDNA나 코드 서열을 도입할 때에 클로닝 작업이 간편하여 바람직하다.
다른 실시 양태로서는 목적 단백질이 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 폴리펩티드인, 목적 단백질의 유전자 발현 카세트이다. 이 경우, 목적 단백질의 발현 카세트는 복수 배치할 수도 있고 또는 복수의 폴리펩티드 유전자를 IRES로 연결하고, 폴리시스트론성의 1개의 발현 카세트의 형태일 수도 있다.
항체의 생산에 있어서 채택할 수 있는 본 발명의 특정한 실시 양태는, mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트, 적어도 1개의 유전자 발현 안정화 엘리먼트, 및 항체의 경쇄의 정상 영역 유전자를 포함하는 항체 유전자 발현 카세트 및/또는 항체의 중쇄의 정상 영역 유전자를 포함하는 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 것을 특징으로 하는 발현 벡터이다.
본 발명에서의 항체 유전자 발현 카세트란, 항체 분자의 경쇄 폴리펩티드 유전자 또는 중쇄 폴리펩티드 유전자, 또는 항체 분자를 발현시키기 위한 발현 카세트를 의미한다. 「정상 영역 유전자를 포함한다」란, 발현 카세트의 유전자 코드 서열로서, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 정상 영역의 유전자가 삽입되어 있는 것을 말한다. 이 발현 카세트의 제어가 미치는 위치에 원하는 항체의 가변 영역의 유전자를 삽입함으로써 완전한 항체 분자를 발현시킬 수 있다.
항체는 경쇄 및 중쇄로 이루어지고, 또한 경쇄 및 중쇄는 각각 정상 영역(「C 영역」 또는 「정상부」라고도 불림) 및 가변 영역(「V 영역」 또는 「가변부」라고도 불림)으로 이루어진다. 경쇄의 정상 영역은 κ과 λ의 2개의 타입이 있고, 중쇄의 정상 영역은 면역 글로불린의 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM에 대응하여 각각 α, δ, ε, γ, μ의 타입으로 나누어진다. 또한, γ는 IgG의 서브 클래스에 대응하고, 예를 들면 γ1, γ2, γ3, γ4로 다시 나누어진다. 삽입되는 정상 영역의 타입은 특별히 한정되지 않지만, IgG를 생산하는 관점에서 경쇄의 정상 영역이 κ 또는 λ이고, 중쇄의 정상 영역이 γ인 것이 바람직하고, 또한 중쇄의 정상 영역이 γ1인 것이 보다 바람직하다. 항체 유전자 발현 카세트에는 프로모터의 하류이며 항체의 정상 영역 유전자의 상류에 리더 펩티드의 유전자를 코딩하는 서열을 삽입해 둘 수 있다. 리더 펩티드는 15 내지 20 아미노산의 소수성 펩티드이고, 번역되어 합성된 지 얼마 안 된 경쇄 또는 중쇄가 조면 소포체의 막을 빠져나가기 위해서 작용하고, 그때 분리된다.
항체의 가변 영역 유전자는 항체 유전자 발현 카세트 내에서 정상 영역 유전자의 상류에 삽입되는 것이 바람직하고, 항체 유전자 발현 카세트에 리더 펩티드 유전자가 삽입되어 있는 경우, 리더 펩티드 유전자의 하류에 삽입되는 것이 바람직하다. 발현 벡터가 리더 펩티드를 갖고 있지 않은 경우에는 가변 영역 유전자와 함께 리더 펩티드를 삽입하는 것이 바람직하다. 프로모터와 가변 영역 유전자의 사이 및 가변 영역 유전자와 정상 영역 유전자의 사이의 거리는 특별히 정해지는 것은 아니지만, 프로모터와 가변 영역 유전자의 사이는 1.2kbp 이하가 바람직하고, 500bp 이하가 보다 바람직하다. 또한, 가변 영역 유전자와 정상 영역 유전자는 바로 근접하고 있는 쪽이 바람직하다.
(발현 벡터)
본 발명에 있어서 발현 벡터란 유전자 공학에 이용되는 벡터이다. 발현 벡터는 플라스미드 벡터일 수 있다. 그러나, 이것에 한하지 않고, 예를 들면 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 및 다른 비플라스미드 벡터도 사용할 수 있다.
본 발명에서의 발현 벡터의 실시 양태의 하나는, 목적 단백질 유전자 발현 카세트와 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 상류 또는 하류에 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 배치된 발현 벡터이다. 바람직하게는 목적 단백질 유전자 발현 카세트와 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 상류에 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 배치된 발현 벡터이다. 이 경우, 목적 단백질 유전자 발현 카세트와 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 어느 쪽이 상류이어도 되지만, 바람직하게는 목적 단백질 유전자 발현 카세트가 상류에 배치된 것이다.
본 발명에서의 별도의 실시 양태는, 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트와 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 사이에 유전자 안정화 엘리먼트가 배치된 벡터이다. 구체적인 양태로서는, 목적 단백질 유전자 발현 카세트의 하류이며 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 상류, 또는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 하류이며 목적 단백질 유전자 발현 카세트의 상류의 어느 양태나 생각할 수 있지만, 바람직하게는 목적 단백질 유전자 발현 카세트의 하류이며 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 상류에 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 배치된 벡터이다.
본 발명에서의 발현 벡터의 바람직한 실시 양태는, 목적 단백질 유전자 발현 카세트와 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 상류 및 하류에 이들 발현 카세트를 끼우도록 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 배치된 벡터이다. 목적 단백질 유전자 발현 카세트와 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 순서는 상관없지만, 목적 단백질 유전자 발현 카세트가 상류에 배치되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 목적 단백질 유전자 발현 카세트와 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트 각각의 상류 및 하류에 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 배치되어 있어도 된다.
본 발명에서의 바람직한 별도의 실시 양태는, 목적 단백질 유전자 발현 카세트의 상류 및 하류에 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 배치되고, 또한 그 하류에 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트가 배치된 벡터이다.
나아가서는, 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 하류에 목적 단백질의 유전자 발현 카세트가 배치되고, 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트와 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 사이 및 목적 단백질 유전자 발현 카세트의 하류에 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 배치되어 있는 발현 벡터도 실시할 수 있다.
유전자 발현 안정화 엘리먼트와 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트 또는 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 사이는 인접하고 있을 수도 있고, 스페이서 서열 등이 삽입되어 있을 수도 있다.
상기 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트와 목적 유전자 단백질의 발현 카세트가 동일한 벡터 상에 배치되는 경우, 양자는 인접할 수도 있고, 사이에 스페이서 서열이 삽입되어 있을 수도 있다. 목적 단백질 유전자의 발현 카세트는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 상류, 하류 중 어디에 배치되어도 되지만, 인접하여 삽입될 때에는 목적 단백질 유전자의 발현 카세트가 상류가 되도록 배치되는 쪽이 바람직하다. 또한, 스페이서 서열로서 인접하는 발현 카세트의 전사 간섭을 억제하기 위한 인슐레이터 서열이 삽입되어 있을 수도 있다.
약제 선택 마커 유전자 발현 카세트는 1개의 벡터에 2개 이상 포함되고 있을 수도 있다. 이 경우, 동일한 약제 선택 마커가 선택되는 경우도 있고, 각각 상이한 약제 선택 마커가 선택되는 경우도 있다. 또한, 각 약제 선택 마커는 인접하여 배치될 수도 있고, 떨어져 배치되어 있을 수도 있다.
목적의 단백질이 항체의 중쇄, 경쇄와 같이 복수의 폴리펩티드로 이루어지는 경우, 목적 단백질의 발현 카세트를 복수 배치할 수도 있거나, 또는 복수의 폴리펩티드 유전자를 IRES로 연결하여 폴리시스트론성의 1개의 발현 카세트의 형태로 할 수도 있다.
또한, 복수의 폴리펩티드 발현 카세트를 각각 상이한 벡터에 삽입하고, 각각의 벡터를 1개의 숙주 세포에 도입하여 형질 전환 세포를 제작하고, 목적 단백질을 생산할 수 있다. 이 경우, 각 벡터에 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트를 배치할 수 있고, 각각 동일한 약제 선택 마커를 이용할 수 있지만, 상이한 약제 선택 마커를 이용하는 쪽이 각 폴리펩티드가 전부 고발현을 나타내는 세포를 효율적으로 취득하는 점에서 유리하여 바람직하다.
항체의 중쇄 폴리펩티드 유전자와 경쇄 폴리펩티드 유전자를 각각 다른 벡터에 삽입하여 발현시켜 항체를 생산한 경우와, 항체의 중쇄 폴리펩티드 유전자와 경쇄 폴리펩티드 유전자를 동일한 벡터에 삽입하여 발현시켜 항체를 생산한 경우의 비교에 있어서, 항체의 생산성은 어느 쪽이나 변함이 없다. 따라서, 어느 방법을 이용하더라도 높은 생산성을 나타내는 세포주를 취득할 수 있지만, 항체의 중쇄 폴리펩티드 유전자와 경쇄 폴리펩티드 유전자를 동일한 벡터에 삽입하여 발현시킨 쪽이 동일 벡터 상의 1종류의 약제 내성 유전자를 사용하게 되어 도입 유전자 수의 차이를 경감할 수 있고, 항체의 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드의 생산 균형이 얻어지고, 중쇄?경쇄의 2개의 폴리펩티드가 2개씩으로 이루어지는 항체로서의 생산성이 안정되기 때문에 바람직하다.
본 발명에서의 발현 벡터의 특정한 실시 양태의 하나는, mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트, 3개 이상의 유전자 발현 안정화 엘리먼트, 및 2개 이상의 목적 단백질의 유전자 발현 카세트를 갖는 것을 특징으로 하는 발현 벡터이다.
이 경우, 3개 이상의 유전자 발현 안정화 엘리먼트 중 적어도 1개는, 2개 이상의 목적 단백질의 유전자 발현 카세트 중 어느 하나의 사이에 배치되어 있는 것이 바람직하다. 즉, 목적 단백질의 유전자 발현 카세트가 2개이면, 각 발현 카세트의 사이에 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 배치되어 있다. 목적 단백질의 유전자 발현 카세트가 3개이면, 1번째와 2번째 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 사이, 또는 2번째와 3번째 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 사이에 배치되어 있거나, 또는 그 양쪽에 배치되어 있다. 목적 단백질의 유전자 발현 카세트가 4개 이상인 경우도 마찬가지이다.
발현 벡터가 3개 이상인 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 갖는 본 발명의 이 실시 양태에서는, 예를 들면 면역 글로불린과 같은 2개 이상의 폴리펩티드로 이루어지는 단백질을 발현하는 발현 벡터를 제조하는 경우, 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 사이에 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 배치하게 되기 때문에, 유전자 사일런싱에 대한 한층 더 억제 효과를 얻을 수 있다. 그 결과, 상승 작용에 의해 목적 단백질 생산량이 매우 유의하게 상승한 세포주를 취득할 수 있다.
본 발명에서의 발현 벡터의 별도의 특정한 실시 양태의 하나는, [(유전자 발현 안정화 엘리먼트)-(목적 단백질의 유전자 발현 카세트)n-(mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트)](n은 1 내지 4의 정수를 나타냄)로서 위치하도록 배치된 구성을 2개 이상 포함하는 발현 벡터이다.
또한, (목적 단백질의 유전자 발현 카세트)n이란, (목적 단백질의 유전자 발현 카세트)가 n개 연속해서 배치되어 있고, 그 사이에 유전자 발현 안정화 엘리먼트나 mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트가 배치되어 있지 않은 것을 의미한다. (목적 단백질의 유전자 발현 카세트)m, (목적 단백질의 유전자 발현 카세트)p, (목적 단백질의 유전자 발현 카세트)q에서도 마찬가지이다.
본 발명의 또 다른 특정한 실시 양태는, [(유전자 발현 안정화 엘리먼트)-(목적 단백질의 유전자 발현 카세트)m-(유전자 발현 안정화 엘리먼트)-(목적 단백질의 유전자 발현 카세트)p-(mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트)](m은 1 내지 4의 정수를 나타내고, p는 1 내지 4의 정수를 나타냄)로서 위치하도록 배치된 구성을 2개 이상 포함하는 발현 벡터이다.
본 발명의 또 다른 특정한 실시 양태는, [(유전자 발현 안정화 엘리먼트)-(목적 단백질의 유전자 발현 카세트)q](q는 1 내지 4의 정수를 나타냄)로서 위치하 도록 배치된 구성을 2개 이상 포함하고, 그 하류에 mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트가 배치된 발현 벡터이다.
본 발명의 이들 실시 양태에서는, 발현 벡터가 이들 구성 이외의 구성 요소를 포함하지 않을 것을 의도하고 있는 것은 아니다. 예를 들면, 이들에 더하여 mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 하류에 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 더 배치할 수도 있다.
또한 이들 실시 양태에 있어서, 목적 단백질의 유전자 발현 카세트가 2개 이상 연속해서 배치되는 경우, 목적 단백질의 유전자 발현 카세트 중 어느 하나의 사이에 적어도 1개의 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 추가하여 배치되어 있을 수도 있다. 즉, 목적 단백질의 유전자 발현 카세트를 2개 연속해서 배치시키는 것이면, 각 발현 카세트의 사이에 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 배치할 수 있다. 목적 단백질의 유전자 발현 카세트가 3개 연속해서 배치되는 것이면, 1번째와 2번째 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 사이 또는 2번째와 3번째 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 사이에 배치할 수 있거나, 또는 그 양쪽에 배치할 수 있다. 목적 단백질의 유전자 발현 카세트가 4개인 경우도 마찬가지이다.
구성 요소를 복수개 배치한 (콘카테머화한) 본 발명의 이들 실시 양태의 발현 벡터는, 복수의 목적 단백질의 유전자 발현 카세트를 구비하기 때문에 한번에 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 복수의 카피를 세포 게놈 상에 삽입할 수 있고, 단백질의 발현량의 증대를 기대할 수 있다. 또한, 유전자 발현 안정화 엘리먼트나 mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트도 복수의 카피가 세포 게놈에 삽입되기 때문에, 그 상승 효과에 의해 고생산 세포주의 수립에 한층 더 큰 기여를 가져온다.
본 발명의 제2 측면에 따르면, 본 발명의 제1 측면에 의한 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 형질 전환 세포가 제공된다.
본 발명의 형질 전환 세포에 있어서의 숙주 세포로서는 재조합 단백질의 생산에 일반적으로 이용되는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 외에 마우스 미엘로마 세포(NSO), 베이비 햄스터 키드니 세포(BHK), 인간 섬유육종 세포(HT1080), COS 세포 등의 포유류 유래의 세포가 예시되지만, 이들에 한정되는 것이 아니고, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 개, 소, 말, 양, 원숭이, 돼지 등의 동물 유래의 세포 등을 넓게 도입 대상으로 할 수 있다. 또한, 대장균 등의 세균 세포나 효모, 곤충 세포 등을 이용한 단백질 생산 시스템에도 응용할 수 있다.
일반적으로 바이오 의약품 등의 공업 생산에는 바이러스 등의 유해 성분의 혼입을 배제하기 위해서, 동물 성분을 포함하지 않는 배지, 보다 바람직하게는 화학적으로 조성이 분명한(Chemically Defined) 배지로 생산 세포를 배양할 것이 요구된다. 이 때문에, 일반적으로 사용되는 소 태아 혈청 등을 함유한 배지로 고생산 세포를 스크리닝한 후, 1 내지 2개월 정도에 걸쳐 동물 성분 비함유 배지나 화학적으로 조성이 분명한 배지에 세포를 적응시키는 것(무혈청 순화)이 필요로 된다. 그러나, 모처럼 취득한 고생산성 세포도 잘 순화할 수 없는 케이스도 있다. 따라서, 미리 무혈청 순화된 세포에 유전자 도입하는 것은 무혈청 순화 공정을 생략하여 생산 세포의 수립 시간을 단축할 수 있어 매우 유효하다. 이러한 과제 달성을 위해서 본 발명에 이용되는 숙주 세포로서는 CHO 세포 등에서의 무혈청 순화가 끝난 세포가 추가로 예시된다.
숙주 세포의 형질 전환 방법은 당업자이면 적절하게 선택할 수 있지만, 예를 들면 리포펙션법, 인산칼슘법, 전기천공법, DEAE 덱스트란법, 마이크로인젝션 등을 들 수 있다.
본 발명의 제3 측면에 따르면, 본 발명의 제2 측면에 의한 형질 전환 세포를 약제 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 세포군을 선별하는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명의 제4 측면에 따르면, 본 발명의 제2 측면에 의한 형질 전환 세포로 이루어지는 세포군이며, 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포군이 제공된다.
약제 선택에 사용하는 약제는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트 중의 약제 선택 마커 유전자의 종류에 따라 결정된다. 또한, 사용하는 약제의 농도로서는 일반적으로 사용되는 농도의 범위에서 고발현 세포의 농축이 가능하지만, 조금 높은 쪽의 농도가 바람직하다. 최적인 농도는 숙주 세포나 이용하는 배지의 종류에 따라 변화한다. 이들 농도의 설정 방법은 당업자에게는 공지이고, 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 산업용 생산 세포로서 이용되는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 10% 소 태아 혈청을 포함하는 Ham's F12 배지에서 배양하고, 퓨로마이신 내성 유전자 발현 카세트를 이용한 경우의 퓨로마이신의 농도로서는 5μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 7.5μg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 10μg/ml 이상이다. 마찬가지의 배양 조건으로 하이그로마이신 내성 유전자 발현 카세트를 이용한 경우의 하이그로마이신 B의 농도로서는 200μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 600μg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 800μg/ml 이상이다. 마찬가지의 배양 조건으로 네오마이신 내성 유전자 발현 카세트를 이용한 경우의 G418의 농도로서는 바람직하게는 400μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 800μg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 1,000μg/ml 이상이다.
본 발명의 선별 방법에서는, 약제 선택에 의해, mRNA의 불안정화를 수반하지 않는 종래의 약제 선택을 행한 세포군에 비해 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 세포의 비율이 유의하게 높아진다. 따라서, 종래에는 약제 선택 후의 방대한 샘플로부터 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 세포주를 선별하는 작업을 반복해서 행해야만 했지만, 본 발명에 따르면 약제 선택 마커의 mRNA 불안정화를 포함하는 약제 선택만으로 선별의 후보가 되는 샘플 수를 대폭 줄일 수 있다. 본 발명의 선별 방법을 이용하면, 약제 선택 후에도 생존하는 세포군(폴리클론)의 상태로 목적 단백질 생산량이 유의하게 상승하고 있어, 이들 세포군으로부터 세포를 단리하고, 배양함으로써, 용이하게 고발현을 나타내는 세포주(모노클론)를 취득할 수 있다. 본 발명의 실시 양태의 일례로서 4.0×105개의 세포에 본 발명의 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트가 삽입된 벡터를 유전자 도입한 후, 약제 선택을 행하여 생긴 세포군으로부터 100의 세포주를 랜덤하게 선택하여 개개의 세포주의 발현량을 조사함으로써 목적 단백질의 고발현주를 용이하게 취득할 수 있다.
세포의 발현 레벨은 리포터 유전자의 발현량에 의해 조사할 수 있지만, 일례로서 SNAP26m 유전자(Covalys사)나 GFP(Green Fluorescent Protein; 녹색 형광 단백질) 유전자 등의 형광 단백질 유전자를 포함하는 발현 카세트를 본 발명의 발현 벡터에 도입하고, FACS(fluorescence activated cell sorting; 형광 활성화 세포 분석기) 등의 유세포 분석기를 이용하여 형광 강도를 해석함으로써 조사할 수 있다. 별도의 예로서 루시페라제 유전자를 포함하는 발현 카세트를 본 발명에 의한 발현 벡터에 도입후, 세포 용해액에 D-루시페린을 첨가하여 루미노미터로 발광량을 측정함으로써 조사할 수 있다. 또한, 리포터 유전자에 한하지 않고, ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; 효소 결합 면역흡착 측정법), 효소 면역 측정법(EIA) 등을 이용함으로써 항체 등의 목적 단백질의 발현을 조사할 수도 있다.
본 발명에 의해, 세포 선별의 공정 및 시간을 대폭 단축할 수 있음과 함께 고발현을 나타내는 세포의 비율이 상승함으로써 단시간에 효율적으로 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 세포를 취득할 수 있고, 종래 기술과 비교하여 매우 현저한 효과를 나타낸다.
예를 들면, FACS Calibur(벡톤 디킨슨사 제조)에 의해 형광 강도 FL1로 SNAP26m의 발현량을 측정한 경우, FL1이 200 이상 또는 1000 이상을 나타내는 세포의 비율은 본 발명의 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트를 갖지 않는 세포에 비해 본 발명에 의한 세포에서는 1.1배 이상, 또한 대부분의 경우 1.5배 내지 2배 이상 커지는 효과가 인정되었다. 또한, FL1이 200 이상을 나타내는 세포의 비율의 증가율보다도 FL1이 1000 이상을 나타내는 세포의 비율의 증가율 쪽이 높은 경향이 보이고 있어, 본 발명에 의해 선별되는 세포군이 본 발명의 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트를 갖지 않는 세포에 비해 높은 발현을 나타낸다고 하는 효과를 뒷받침하고 있다.
또한, 본 발명에서의 mRNA 불안정화 서열 및 유전자 안정화 엘리먼트를 갖는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 세포에서는, mRNA 불안정화 서열 및 유전자 안정화 엘리먼트를 갖지 않는 발현 벡터를 사용한 경우에 비해 고생산성을 나타내는 세포의 비율이 7 내지 8배 향상된다. 유전자 발현 안정화 엘리먼트만을 갖는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 세포에서는, 고생산성을 나타내는 세포의 비율이 2배 정도 향상되어 우수한 효과를 갖고 있지만, 본 발명은 mRNA 불안정화 서열 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트의 상승 효과에 의해 더욱 현저한 효과를 갖는다.
본 발명의 제5 측면에 따르면, 본 발명의 제2 측면에 의한 형질 전환 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 단백질을 생산하는 방법이 제공된다.
하나의 실시 양태에서는 생산되는 단백질은 항체이다. 이 경우, 항체의 중쇄 폴리펩티드 유전자와 경쇄 폴리펩티드 유전자는 동일한 벡터(싱글 벡터)에 삽입되어 있을 수도 있고, 각각 상이한 벡터에 삽입되어 2 구축물로 되어 있을 수도 있다.
포유류의 항체에는 IgM, IgD, IgG, IgA, IgE의 5종류의 클래스가 존재하는 것이 분명해져 있지만, 인간의 각종 질환의 진단, 예방 및 치료에는 혈중 반감기가 길고, 각종 이펙터 기능을 갖는 등의 기능 특성으로부터 인간 IgG 클래스의 항체가 주로 이용되고 있다. 항체는 형질 전환 세포의 배양 상청으로부터 프로테인 A 칼럼을 이용하여 정제할 수 있다. 또한, 그 외에 통상 단백질의 정제에서 이용되는 정제 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등을 조합하여 행하여 정제할 수 있다. 정제한 인간화 항체의 H쇄, L쇄 또는 항체 분자 전체의 분자량은 이차원 전기 영동 등에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 항체는 의약으로서 사용할 수 있다. 이러한 의약은 치료약으로서 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하고, 제제학의 기술 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공되는 것이 바람직하다.
투여 경로는 치료시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구 투여, 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 및 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 항체 제제의 경우, 바람직하게는 정맥내 투여를 들 수 있다. 투여 형태로서는 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고, 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제로서는 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다. 유제 및 시럽제와 같은 액체 제조물은 물, 자당, 소르비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 호마유, 올리브유, 대두유 등의 오일류, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제, 스트로베리 플레이버, 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 이용하여 제조할 수 있다. 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은 젖당, 포도당, 자당, 만니톨 등의 부형제, 전분, 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 이용하여 제조할 수 있다.
비경구 투여에 적당한 제제로서는 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다. 주사제는 염 용액, 포도당 용액 또는 양자의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 이용하여 제조된다. 또는 인간화 항체를 통상법에 따라 동결 건조하고, 이것에 염화나트륨을 첨가함으로써 분말 주사제를 제조할 수도 있다. 좌제는 카카오지, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 이용하여 제조된다. 또한, 분무제는 상기 화합물 그 자체 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 또한 상기 화합물을 미세한 입자로서 분산시켜 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 이용하여 제조된다.
담체로서 구체적으로는 젖당, 글리세린 등이 예시된다. 상기 화합물 및 이용하는 담체의 성질에 따라 에어로졸, 드라이 파우더 등의 제제가 가능하다. 또한, 이들 비경구제에 있어서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
별도의 실시 양태에서는 생산되는 단백질은 백신이다.
백신으로서는 병원체의 에피토프의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 백신으로서 사용할 수 있다. 또한, 바이러스체의 구성 단백질 전부를 생산할 뿐만 아니라 엔벨로프 단백질 등을 생산하여 백신으로서 사용할 수 있다.
백신은 임의의 경로의 투여를 위한 제제로 할 수 있다. 점막형 투여, 예를 들면 경구 경로, 경비 경로, 경기도 경로, 경질 경로, 경직장 경로 외에 비점막 경로에 의한 투여, 예를 들면 피하, 정맥내 또는 근육내 투여를 위한 백신 제제를 들 수 있다.
본 발명의 제6 측면에 따르면, 본 발명의 제2 측면에 의한 형질 전환 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 아미노산을 생산하는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명의 제7 측면에 따르면, 본 발명의 제2 측면에 의한 형질 전환 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드를 생산하는 방법이 제공된다.
아미노산의 생산은 우선 형질 전환 세포에 폴리펩티드를 생산시키고, 그 폴리펩티드를 가수분해함으로써 행할 수 있다. 또한, 아미노산의 생체외 합성에 필요한 효소 등을 형질 전환 세포에 생산시킴으로써 행할 수도 있다. 뉴클레오티드의 생산도 뉴클레오티드의 생체외 합성에 필요한 효소 등을 형질 전환 세포에 생산시킴으로써 행할 수 있다.
<실시예>
이하, 실시예를 예시함으로써 본 발명의 효과를 한층 더 명확한 것으로 한다.
실시예 1
퓨로마이신 내성 유전자에 있어서의 mRNA 불안정화 서열의 효과
(1) pBS - CMV - SNAPm - Pur 및 pBS - CMV - SNAPm - Pur ? N4 의 구축
도 1에 나타내는 반응식에 따라 플라스미드 pBS-CMV-SNAPm2를 구축하였다. 즉, 우선 Emerald Luc 벡터(pELuc-test)(도요보세키사 제조)의 제한 효소 ClaI, EcoRI 사이트에 CMV 프로모터(서열 번호 1)가 도입된 pELuc-CMV 플라스미드로부터 제한 효소 EcoRI, NotI로 Emerald Luc(ELuc) 유전자를 잘라내었다. 한편, SNAPm 발현 플라스미드 pSNAPm(Covalys사 제조)으로부터 SNAP26m 유전자를 서열 번호 2, 3의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, pELuc-CMV 플라스미드의 제한 효소 EcoRI, NotI 사이트에 도입하여 pSNAP26m-CMV를 구축하였다. 계속해서, pSNAP26m-CMV보다 CMV 프로모터/SNAP26m/SV40 polyA를 서열 번호 4, 5의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, 부분 소화에 의해 플라스미드 pBluescript II KS(-)(스트라타진사 제조)의 제한 효소 ClaI, BamHI 사이트에 도입하여 플라스미드 pBS-CMV-SNAPm2를 구축하였다.
계속해서, 도 2에 나타내는 반응식에 따라 pPUR(클론테크사 제조)의 Puromycin 내성 유전자의 코드 서열의 3' 말단에 서열 번호 6, 7의 프라이머와 KOD -Plus- Mutagenesis Kit(도요보세키사 제조)를 이용한 Inverse PCR법에 의해 ARE 서열 모티프 TTATTTATT의 4회 반복 서열(N4)을 삽입하여 pPUR?N4를 구축하였다.
계속해서, pPUR, pPUR?N4를 주형으로 하여 서열 번호 8, 9의 프라이머와 KOD -Plus- ver.2(도요보세키사 제조)를 이용한 PCR에 의해 SV40 프로모터-Pur-SV40 polyA, SV40 프로모터-Pur?N4-SV40 polyA의 약제 발현 카세트 단편을 증폭하였다. pBS-CMV-SNAPm2와 상기 증폭 단편을 각각 제한 효소 BamHI, SacI로 부분 소화하여 연결하여 pBS-CMV-SNAPm-Pur, pBS-CMV-SNAPm-Pur?N4를 구축하였다(도 3).
실시예 2
(2) pBS - CMV - SNAPm - Pur 및 pBS - CMV - SNAPm - Pur ? N4 의 세포 도입 (1)
CHO-K1 세포(리켄바이오리소스센터, No.RCB0285)를 1×105세포/ml로 조정하고, 12웰 플레이트에 2ml씩 전일에 파종하고, 밤새 배양하여 트랜스펙션용 CHO-K1 세포를 준비하였다. 이때, 배지로서 10% 소 태아 혈청을 첨가한 Ham's F12 배지(닛스이세이야쿠사 제조)를 사용하였다.
트랜스펙션은 3μl Gene Juice Transfection Reagent(머크사 제조)를 100μl Opti-MEM I Reduced-Serum Medium(GIBCO사 제조)으로 희석하고, 1μg의 플라스미드로서 pBS-CMV-SNAPm-Pur 또는 pBS-CMV-SNAPm-Pur?N4에 이 희석액 103μl을 첨가하고, 10분간 방치한 후, 이 혼합액을 상기 CHO-K1 세포에 첨가하여 24시간 인큐베이션함으로써 행하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution(나카라이테스크사 제조)으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 6μg/ml Puromycin(InvivoGen사 제조)를 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 3주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 3주간의 선택 배양 종료 후, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 1웰당 2×105 세포를 12웰 플레이트에 뿌리고, 다음날 0.5ml의 Ham's F12 배지에 2μM SNAP-Cell-505(Covalys사 제조)를 첨가하고, 60분간, 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, Ham's F12 배지에서 3회 린스하고, 배지 교환을 하면서 10분간의 인큐베이션을 3회 행하고, 미반응의 형광 색소를 제거하였다. 이 세포를 2.5g/l-Trypsin/1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, D-PBS(-)(나카라이테스크사 제조)에 세포를 현탁하고, 유세포 분석기 BD FACS Calibur(Becton, Dickinson사 제조)로 SNAP26m의 발현 강도를 해석하였다.
도 4는 약제 선택 후의 pBS-CMV-SNAPm-Pur 및 pBS-CMV-SNAPm-Pur?N4로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타낸다. 횡축이 형광 강도(FL1), 종축이 카운트 수이다. 또한, 도 5에 형광 강도 FL1이 각각 200 이상, 1000 이상인 세포의 비율의 플롯을 나타낸다. 이 결과, mRNA 불안정화 인자인 N4가 삽입된 pBS-CMV-SNAPm-Pur?N4로 형질 전환된 세포 집단에는 약제 선택 후, SNAPm의 고발현을 나타내는 세포가 유의하게 농축되어 있음을 알 수 있다.
실시예 3
세포주에서의 퓨로마이신 내성 유전자에 있어서의 mRNA 불안정화 서열의 효과
(1) pBS - CMV - SNAPm - Pur 및 pBS - CMV - SNAPm - Pur ? N4 의 세포 도입 (2)
계속해서, 실시예 2와 마찬가지로 유전자 도입을 행하고, 9μg/ml Puromycin을 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 2주간 선택 배양을 행하였다. 여기서 형성된 콜로니를 현미경 하에서 피펫의 끝으로 pBS-CMV-SNAPm-Pur에 대해서는 48 클론, pBS-CMV-SNAPm-Pur?N4에 대해서는 20 클론을 긁어내고, 12웰 플레이트에 파종하였다. 증식이 인정된 각각 36 클론, 10 클론에 대하여 실시예 2와 마찬가지로 SNAP-Cell-505로 표지 처리를 하고, FACS 해석을 실시하였다.
도 6에 약제 선택 후의 세포의 명시야상을 나타낸다. 이 결과, pBS-CMV-SNAPm-Pur에 비해 pBS-CMV-SNAPm-Pur?N4에 대해서는 생존 세포 수, 콜로니 수가 현저히 감소하여, 선택 효과가 높은 것이 시사된다.
도 7에 pBS-CMV-SNAPm-Pur 형질 전환 세포 클론에 있어서의 피크 강도가 1000을 초과하는, 특히 SNAPm 발현이 높은 클론의 FACS 해석의 결과를 나타낸다. 도 8에 pBS-CMV-SNAPm-Pur?N4 형질 전환 세포 클론에 있어서의 피크 강도가 1000을 초과하는, 특히 SNAPm 발현이 높은 클론의 FACS 해석의 결과를 나타낸다. 이 결과, pBS-CMV-SNAPm-Pur에서는 고발현 클론은 36 클론 중 1 클론(2.8%)만 인정되었다. 그러나, pBS-CMV-SNAPm-Pur?N4는 취득된 클론은 적지만, SNAPm 고발현 클론의 히트율이 40%(10 클론 중 4 클론)으로 매우 선택 효과가 높은 것이 확인되었다. 또한, 이 결과로부터 실시예 2에서 인정된 바와 같이 약제 선택 후의 세포 집단을 FACS 해석함으로써 고발현 세포의 비율이 상승하고 있는 것과, 고발현 클론의 취득이 효율화되어 있는 것에 상관이 확인된 점에서, 이후의 해석은 세포 집단의 FACS 해석에 의해 효과의 확인을 실시하였다.
실시예 4
EF1 α 프로모터 사용하에서의 퓨로마이신 내성 유전자에 있어서의 mRNA 불안정화 서열의 효과
(1) pEF1 α- SNAP26m - Pur ? N4 및 pEF1 α- SNAP26m - Pur - RE2 의 구축
다음에, 목적 유전자 발현 카세트의 프로모터를 EF1α 프로모터에 치환한 경우에도 상술과 마찬이지의 효과가 인정되는지 검토하기 위해서 플라스미드를 구축하였다. 본 실험에서는 도 9에 나타내는 반응식에 따라 구축된 플라스미드 pEF1α-KOD3G8HC-RE2를 이용하였다. 즉, 우선, CMV 프로모터를 EF-1α 프로모터에 치환한 pCI-neo 플라스미드(프로메가사 제조)의 제한 효소 XbaI-NotI 사이트에 항KOD 항체의 중쇄를 삽입한 플라스미드의 pEF1α-KOD3G8HC를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해, 서열 번호 10, 11의 프라이머를 사용하여 발현 카세트 상류에 제한 효소 SalI 및 NheI 사이트를 부가한 pEF1α-KOD3G8HC-RE를 구축하였다. 또한, 항KOD 항체의 중쇄로서는 Thermococcus kodakaraensis KOD1주 유래의 DNA 폴리메라제에 특이적인 항체를 생산하는 마우스 하이브리도마 세포계 3G8(입수처:독립행정법인산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁 번호:FERM BP-6056)로부터 얻어진 항체의 것을 사용하였다. 또한 본 플라스미드를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해, 서열 번호 12, 13의 프라이머를 사용하여 발현 카세트 하류에 제한 효소 BsiWI 및 XhoI 사이트를 부가하여 구축된 플라스미드가 pEF1α-KOD3G8HC-RE2이다.
이 pEF1α-KOD3G8HC-RE2를 이용하여 도 10에 나타내는 반응식에 따라 플라스미드 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4 및 pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2를 구축하였다. 즉, 플라스미드 pEF1α-KOD3G8HC-RE2로부터 제한 효소 EcoRI, NotI로 항KOD 항체의 중쇄 유전자를 잘라내었다. 한편, SNAPm 발현 플라스미드 pSNAPm으로부터 SNAP26m 유전자를 서열 번호 2, 3의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, pEF1α-KOD3G8HC-RE2 플라스미드의 제한 효소 EcoRI, NotI 사이트에 도입하여 pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2를 구축하였다. 본 플라스미드로부터 제한 효소 AflII, BstBI로 네오마이신 내성 유전자를 잘라내었다. 한편, pPUR?N4로부터 하류에 N4 서열을 부가한 Puromycin 내성 유전자를 서열 번호 14, 15의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, pEF1α-SNAP26m-RE2 플라스미드의 제한 효소 AflII, BstBI 사이트에 도입하여 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4를 구축하였다. 계속해서, 본 플라스미드를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해, 서열 번호 16, 17의 프라이머를 사용하여 Puromycin 내성 유전자 하류의 N4 서열을 삭제한 플라스미드 pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2를 구축하였다.
실시예 5
(2) pEF1 α- SNAP26m - Pur - RE2 및 pEF1 α- SNAP26m - Pur ? N4 의 세포 도입
실시예 2에 기재된 방법으로 트랜스펙션용 CHO-K1 세포를 준비하였다. 한편, 실시예 4에서 구축한 SNAP26m 발현 구축물을 제한 효소 AhdI(New England Biolabs사 제조)로 리니어라이즈(직쇄상화)하였다. 트랜스펙션은 3μl Gene Juice Transfection Reagent를 100μl Opti-MEM I Reduced-Serum Medium으로 희석한 후, 상기 선형화한 플라스미드 1μg을 첨가하여 10분간 방치한 후, 이 혼합액을 상기 CHO-K1 세포에 첨가하고, 24시간 인큐베이션함으로써 행하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 5, 7.5, 또는 10μg/ml Puromycin을 각각 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 1주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 실시예 2에 기재된 방법으로 세포 집단의 SNAP26m의 발현 강도를 해석하였다.
도 11은 약제 선택 후의 pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타낸다. 또한, 도 12에 형광 강도 FL1이 200 이상, 1000 이상인 세포의 비율의 플롯을 나타낸다. 이 결과, 약제 선택 중의 Puromycin 농도에 상관없이 mRNA 불안정화 인자인 N4가 삽입된 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4로 형질 전환된 세포 집단에는 약제 선택 후, SNAPm의 고발현을 나타내는 세포가 유의하게 농축되어 있음을 알 수 있다.
실시예 6
하이그로마이신 내성 유전자에 있어서의 mRNA 불안정화 서열의 효과
(1) pEF1 α- SNAP26m - Hyg ？ RE2 및 pEF1 α- SNAP26m - Hyg ? N4 의 구축
하이글로마이신 내성 유전자를 이용한 경우에도 mRNA 불안정화 인자의 효과가 인정되는지 검토하기 위해서 플라스미드를 구축하였다. 이 구축에는 도 13에 나타내는 반응식에 따라 구축된 플라스미드 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2를 이용하였다. 즉, 우선 CMV 프로모터를 EF1α 프로모터에 변경한 pCI-neo 플라스미드의 제한 효소 XbaI-NotI 사이트에 항KOD 항체의 경쇄를 삽입한 플라스미드의 pEF1α-KOD3G8LC를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해, 서열 번호 10, 11의 프라이머를 사용하여 발현 카세트 상류에 제한 효소 SalI 및 NheI 사이트를 부가한 pEF1α-KOD3G8LC-RE를 구축하였다. 또한, 항KOD 항체의 경쇄로서는 Thermococcus kodakaraensis KOD1주 유래의 DNA 폴리메라제에 특이적인 항체를 생산하는 마우스 하이브리도마 세포계 3G8(입수처:독립행정법인산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁 번호:FERM BP-6056)로부터 얻어진 항체의 것을 사용하였다. 또한 본 플라스미드를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해, 서열 번호 12, 13의 프라이머를 사용하여 발현 카세트 하류에 제한 효소 BsiWI 및 XhoI 사이트를 부가하여 구축된 플라스미드가 pEF1α-KOD3G8LC-RE2이다.
이 pEF1α-KOD3G8LC-RE2를 AflII, BstBI로 처리하고, 네오마이신 내성 유전자를 잘라내었다. 한편, pTK-Hyg(클론테크사 제조)로부터 하이그로마이신 내성 유전자를 서열 번호 18, 19의 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하고, pEF1α-KOD3G8LC-RE2의 제한 효소 AflII, BstBI 사이트에 도입하여 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2를 구축하였다. 계속해서, 도 14에 나타내는 반응식에 따라 플라스미드 pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2 및 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4을 구축하였다. 즉, 플라스미드 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2로부터 제한 효소 MluI, NotI로 항KOD 항체의 경쇄 유전자를 잘라내었다. 한편, SNAPm 발현 플라스미드 pSNAPm로부터 SNAP26m 유전자를 서열 번호 3, 20의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2 플라스미드의 제한 효소 MluI, NotI 사이트에 도입하여 pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2를 구축하였다. 계속해서, 본 플라스미드를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해, 서열 번호 21, 22의 프라이머를 사용하여 Hygromycin 내성 유전자 하류에 N4 서열을 부가한 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4를 구축하였다.
실시예 7
(2) pEF1 α- SNAP26m - Hyg - RE2 및 pEF1 α- SNAP26m - Hyg ? N4 의 세포 도입
실시예 2에 기재된 방법으로 트랜스펙션용 CHO-K1 세포를 준비하였다. 한편, 실시예 6에서 구축한 SNAP26m 발현 구축물을 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈하였다. 트랜스펙션은 실시예 5에 기재된 방법으로 행하고, 트랜스펙션의 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 800μg/ml 하이그로마이신 HygroGold(InvivoGen사 제조)를 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 1주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 실시예 2에 기재된 방법으로 세포 집단의 SNAP26m의 발현 강도를 해석하였다.
도 15는 약제 선택 후의 pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2 및 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타낸다. 또한, 도 16에 형광 강도 FL1이 200 이상, 1000 이상인 세포의 비율의 플롯을 나타낸다. 이 결과, mRNA 불안정화 인자인 N4가 삽입된 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4로 형질 전환된 세포 집단에는 약제 선택 후, SNAPm의 고발현을 나타내는 세포가 유의하게 농축되어 있음을 알 수 있다.
실시예 8
네오마이신 내성 유전자에 있어서의 mRNA 불안정화 서열의 효과
(1) pEF1 α- SNAP26m - Neo ? N4 의 구축
네오마이신 내성 유전자를 이용한 경우에도 mRNA 불안정화 인자의 효과가 인정되는지 검토하기 위해서 도 17에 나타내는 반응식에 따라 플라스미드 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4를 구축하였다. 즉, 실시예 4에 기재된 pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해, 서열 번호 21, 23의 프라이머를 사용하여 네오마이신 내성 유전자 하류에 N4 서열을 부가한 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4를 구축하였다.
실시예 9
(2) pEF1 α- SNAP26m - Neo - RE2 및 pEF1 α- SNAP26m - Neo ? N4 의 세포 도입
실시예 2에 기재된 방법으로 트랜스펙션용 CHO-K1 세포를 준비하였다. 한편, pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2 및 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4를 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈하였다. 트랜스펙션은 실시예 5에 기재된 방법으로 행하고, 트랜스펙션의 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 1mg/ml 게네티신 G418(나카라이테스크사 제조)를 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 1주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 실시예 2에 기재된 방법으로 세포 집단의 SNAP26m의 발현 강도를 해석하였다.
도 18은 약제 선택 후의 pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2 및 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타낸다. 또한, 도 19에 형광 강도 FL1이 200 이상, 1000 이상인 세포의 비율의 플롯을 나타낸다. 이 결과, mRNA 불안정화 인자인 N4가 삽입된 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4로 형질 전환된 세포 집단에는 약제 선택 후, SNAPm의 고발현을 나타내는 세포가 유의하게 농축되어 있음을 알 수 있다.
실시예 10
ARE 서열 모티프의 반복 서열 수의 검토
도 20에 나타내는 반응식에 따라 플라스미드 pEF1α-SNAP26m-Pur?N2, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8을 구축하였다. 실시예 4에 기재된 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4을 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해, 서열 번호 16, 24의 프라이머를 사용하여 Puromycin 내성 유전자의 하류에 N2 서열(ARE 서열 모티프 TTATTTATT의 2회 반복 서열)을 부가한 플라스미드 pEF1α-SNAP26m-Pur?N2를 구축하였다. 또한, 마찬가지의 방법으로 서열 번호 7, 24의 프라이머를 사용하여 Puromycin 내성 유전자의 하류에 N6 서열(ARE 서열 모티프 TTATTTATT의 6회 반복 서열)을 부가한 플라스미드 pEF1α-SNAP26m-Pur?N6을 구축하고, 서열 번호 7, 25의 프라이머를 사용하여 Puromycin 내성 유전자의 하류에 N8 서열(ARE 서열 모티프 TTATTTATT의 8회 반복 서열)을 부가한 플라스미드 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8를 구축하였다.
실시예 2에 기재된 방법으로 트랜스펙션용 CHO-K1 세포를 준비하였다. 한편, pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur?N2, pEF1α-SNAP26m-Pur?N4, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8의 각 SNAP26m 발현 구축물을 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈하였다. 트랜스펙션은 실시예 5에 기재된 방법으로 행하고, 트랜스펙션의 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 7.5μg/ml Puromycin을 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 1주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 실시예 2에 기재된 방법으로 세포 집단의 SNAP26m의 발현 강도를 해석하였다.
도 21은 약제 선택 후의 pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur?N2, pEF1α-SNAP26m-Pur?N4, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타낸다. 또한, 도 22에 형광 강도 FL1이 200 이상, 1000 이상인 세포의 비율의 플롯을 나타낸다. 이 결과, 반복 서열 수가 많은 N6 또는 N8이 삽입된 플라스미드의 pEF1α-SNAP26m-Pur?N6 또는 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8로 형질 전환하였을 때, pEF1α-SNAP26m-Pur?N4와 비교하여 SNAPm 고발현 세포의 비율이 더욱 많고, 고발현 세포의 선택 효율이 높다는 결과였다.
실시예 11
핵산 서열의 결정
CHO 세포 DR1000L-4N주(CHO 세포-4N주)로 제조된 BAC 라이브러리 중 hGM-CSF 발현 카세트를 포함하는 클론 Cg0031N14를 단리하였다. 이 클론 Cg0031N14에서 유래하는 BAC로 제조한 쇼트건 클론의 5', 3' 원패스 시퀀스를 실시하고, Phred/Phrap/Consed에 의한 서열 정보의 어셈블을 행하고, hGM-CSF 발현 카세트가 도입된 CHO 세포의 근방의 게놈 서열 약 91kbp의 서열을 결정하였다. 이 서열을 서열 목록의 서열 번호 26에 나타낸다.
실시예 12
핵산 서열의 해석
상기 결정된 핵산 서열 중에 인슐레이터 서열이 존재하는지의 여부를 인슐레이터 결합 단백질 CTCF의 결합 서열 모티프를 검색함으로써 조사하였다. 해석 툴로서 In silico CTCFBS prediction tool(http://insulatordb.utmem.edu/)(비특허문헌 11)을 사용하였다. 상기 툴로 추출된 모티프 서열을 표 1 및 도 23에 나타낸다.
Figure pct00001
실시예 13
도입 유전자 발현의 안정화 효과의 확인
실시예 1의 도중에서 구축된 pSNAP26m-CMV로부터 CMV 프로모터/SNAP26m/SV40 polyA를 서열 번호 27, 28의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, 부분 소화에 의해 플라스미드 pBluescript II SK(-)의 제한 효소 BamHI, SacI 사이트에 도입하여 플라스미드 pBS-CMV-SNAPm을 구축하였다(도 24).
다음에, 실시예 11에서 제조한 쇼트건 라이브러리의 클론 중 41820 위치, 45182 위치의 CTCF의 결합 서열 모티프의 부근의 CHO 게놈 서열을 포함하는 클론을 추출하고, CHO 게놈에서 유래하는 도입 서열(도 25 참조)을 PCR로 증폭하고, pBS-CMV-SNAP26m의 제한 효소 KpnI, XhoI 또는 XhoI, ClaI 사이트에 도입하였다. 쇼트건 라이브러리 클론과 당해 도입 서열이 조립된 SNAPm 발현 구축물의 대응 관계를 표 2에 나타낸다. 또한, 표 2 중의 SNAPm 발현 구축물 란의 (-)는 CHO의 게놈 서열이 도입되어 있지 않은 pBS-CMV-SNAPm이다.
Figure pct00002
이들 SNAPm 발현 구축물과 pPUR을 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈한 후, 각각 중량비가 9:1이 되도록 혼합하여 혼합 플라스미드를 제조하였다.
한편, 1×105세포/ml로 조정한 CHO-K1 세포를 12웰 플레이트에 2ml씩 전일에 파종하고, 밤새 배양하여 트랜스펙션용 CHO-K1 세포를 준비하였다. 이때, 배지로서 10% 소 태아 혈청을 첨가한 Ham's F12 배지를 사용하였다.
트랜스펙션은 3μl Gene Juice Transfection Reagent를 100μl Opti-MEM I Reduced-Serum Medium으로 희석하고, 상기 혼합 플라스미드 1μg에 이 희석액 103μl를 첨가하고, 10분간 방치한 후, 이 혼합액을 상기 CHO-K1 세포에 첨가하여 24시간 인큐베이션함으로써 행하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 6μg/ml Puromycin을 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 3주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 1웰당 2×105 세포를 12웰 플레이트에 뿌리고, 다음날 0.5ml의 Ham's F12 배지에 2μM SNAP-Cell-505를 첨가하고, 60분간 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, Ham's F12 배지에서 3회 린스하고, 배지 교환을 하면서 10분간의 인큐베이션을 3회 행하여 미반응의 형광 색소를 제거하였다. 이 세포를 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, D-PBS(-)에 세포를 현탁하고, 유세포 분석기 BD FACS Calibur로 SNAPm의 발현 강도를 해석하였다.
도 26은 피검 서열 CHO1 내지 CHO6가 각각 도입된 SNAPm 발현 구축물로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타낸다. 또한, 도 27은 미처리의 CHO 세포(도 26 좌측 위의 (-))의 해석 결과로부터 10 이상의 시그널(도 26 중의 M2)을 나타내는 세포를 SNAPm의 발현 세포로 하고, 그 세포의 비율을 플롯팅한 그래프이다. 도 26, 27로부터 분명한 바와 같이 CHO 세포 게놈의 일부를 도입한 구축물, 특히 서열 번호 26의 41601 내지 46746 위치를 도입한 CHO4 및 5에 있어서 유의한 발현의 상승이 인정되었다. CHO4와 CHO5의 차이는 샘플 사이의 변동의 범위 내라고 생각되지만, 만약을 위해 이후의 최적 영역의 압축은 CHO5에 기초하여 실시하였다.
실시예 14
유전자 발현 안정화능을 갖는 서열 영역의 압축 (1)
상기에서 발현의 상승이 가장 높았던 구축물 CHO5를 바탕으로 KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해, 서열 번호 39, 40의 프라이머를 사용하여 피검 서열 41601-42902 위치를 딜리션한 CHO5Δ5를, 서열 번호 41, 42의 프라이머를 사용하여 42903-44200 위치를 딜리션한 CHO5ΔM을, 서열 번호 43, 44의 프라이머를 사용하여 44201-46746 위치를 딜리션한 CHO5Δ3을 구축하였다(도 28).
이들 SNAPm 발현 구축물과 pPUR을 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈한 후, 각각 중량비가 9:1이 되도록 혼합하여 혼합 플라스미드를 제조하였다.
상기 혼합 플라스미드 1μg을 전날 12웰 플레이트에 파종한 CHO-K1 세포에 트랜스펙션하고, 24시간 인큐베이션하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 6μg/ml Puromycin을 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 3주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 2.5g/l-Trypsin?1mmol?l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 1웰당 2×105 세포를 12웰 플레이트에 뿌리고, 다음날 0.5ml의 Ham's F12 배지에 2μM SNAP-Cell-505를 첨가하고, 60분간, 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, Ham's F12 배지에서 3회 린스하고, 배지 교환을 하면서, 10분간의 인큐베이션을 3회 행하여 미반응의 형광 색소를 제거하였다. 이 세포를 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, D-PBS(-)에 세포를 현탁하고, 유세포 분석기 BD FACS Calibur로 SNAPm의 발현 강도를 해석하였다.
도 29는 피검 서열 CHO5Δ5, ΔM, Δ3이 각각 도입된 SNAPm 발현 구축물로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과, 시그널값 10 이상을 나타낸 세포의 비율을 플롯팅한 것이다. 도 29로부터 분명한 바와 같이 CHO5Δ3에 대해서는 딜리션 전과 거의 같은 정도의 SNAPm의 발현 강도가 인정된 데 대하여 CHOΔM, Δ3에서는 발현 상승의 효과가 분명히 감소하였다. 이 점에서 발현의 안정화에는 서열 번호 26의 서열의 41601 내지 46746 위치 중의 5'측 내지 전반 부분이 주로 기여하고 있다고 생각된다.
실시예 15
유전자 발현 안정화능을 갖는 서열 영역의 압축 (2)
서열 번호 44 내지 49의 프라이머를 사용하고, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해, CHO5Δ3의 피검 서열의 3'가 더 딜리션된 SNAPm 발현 구축물을 구축하였다(도 30 및 표 3).
Figure pct00003
이들 SNAP26m 발현 구축물을 실시예 14와 마찬가지로 처리하여 SNAP26m의 발현 강도를 해석하였다.
도 31은 피검 서열 CHO5Δ3, CHO5Δ3-1 내지 5의 SNAPm 발현 구축물로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과, 시그널값 10 이상을 나타낸 세포의 비율을 플롯팅한 것이다. 도 31로부터 분명한 바와 같이 서열 번호 26의 서열의 41601 내지 42700 위치를 포함하는 CHO5Δ3-1부터 CHO5Δ3-3까지 대해서는 샘플 사이의 변동은 있지만, 딜리션 전과 거의 동일한 정도의 SNAPm의 발현 강도가 인정된 것에 대하여, 이러한 영역의 3'측이 결실한 CHO5Δ3-4 및 CHO5Δ3-5에서는 발현의 상승 효과가 분명히 감소하였다.
실시예 16
퓨로마이신 내성 유전자에 있어서의 mRNA 불안정화 서열과 유전자 발현 안정화 엘리먼트의 조합의 효과
(1) pEF1 α- SNAP26m - Pur -1.1k/1.1k 및 pEF1 α- SNAP26m - Pur ? N4 -1.1k/1.1k의 구축
다음에, 퓨로마이신 내성 유전자로 N4 서열과 실시예 15에서 유전자 발현 안정화능이 인정된 CHO5Δ3-3의 조합 효과를 검토하기 위해서 플라스미드를 구축하였다. 본 실험에서는 도 32에 기재된 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k를 이용하였다. 즉, 우선 실시예 4의 도중에서 구축된 pEF1α-KOD3G8HC-RE2의 발현 카세트 상류의 제한 효소 NheI, BglII 사이트에 서열 번호 50, 51의 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭한 피검 서열 CHO5Δ3-3(이하, 구축물 중에서는 1.1k라고 표기)을 삽입하여 플라스미드 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k를 구축하였다. 또한 플라스미드 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k의 발현 카세트 하류의 제한 효소 BsiWI, XhoI 사이트에 서열 번호 52, 53의 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭한 피검 서열 CHO5Δ3-3을 삽입하여 구축된 플라스미드가 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k이다.
한편, 실시예 4에서 구축한 플라스미드 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4 및 pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해, 서열 번호 54, 55의 프라이머를 사용하여 Puromycin 내성 유전자 내에 존재하는 제한 효소 BsiWI 사이트를 삭제한 플라스미드 pEF1α-SNAP26m-Pur2?N4 및 pEF1α-SNAP26m-Pur2-RE2를 구축하였다.
계속해서, 도 33에 나타내는 반응식에 따라 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k 및 pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k를 구축하였다. 즉, pEF1α-SNAP26m-Pur2?N4, pEF1α-SNAP26m-Pur2-RE2로부터 제한 효소 EcoRI, BsiWI로 SNAPm-pA-SV40 Promoter-Pur2?N4-pA, SNAPm-pA-SV40 Promoter-Pur2-pA를 잘라내고, pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k의 제한 효소 EcoRI, BsiWI 사이트에 도입하여 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k를 구축하였다.
실시예 17
(2) 퓨로마이신 내성 유전자에서의 N4 서열과 CHO5 Δ3-3의 조합 효과의 검토
실시예 2에 기재된 방법으로 트랜스펙션용 CHO-K1 세포를 준비하였다. 한편, 실시예 4 및 16에서 구축한 SNAP26m 발현 구축물을 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈하였다. 트랜스펙션은 실시예 5에 기재된 방법으로 행하고, 트랜스펙션의 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 각각 5, 7.5, 10μg/ml Puromycin을 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 1주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 실시예 2에 기재된 방법으로 세포 집단의 SNAP26m의 발현 강도를 해석하였다.
도 34는 약제 선택 후의 pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2, pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N4 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타낸다. 또한, 도 35에 형광 강도 FL1이 200 이상, 1000 이상인 세포의 비율의 플롯을 나타낸다. 이 결과, N4 서열 또는 CHO5Δ3-3의 유무에 상관없이 약제 선택 중의 Puromycin 농도가 높을수록 SNAPm 고발현 세포의 비율이 많은 것을 알 수 있다. 그러나, CHO5Δ3-3 또는 N4 서열을 이용함으로써 SNAPm 고발현 세포의 비율이 증대하고, 또한 이들을 병용함으로써 그 상승 효과에 의해 고발현 세포의 비율은 최대치가 되는 것을 알 수 있다.
실시예 18
하이그로마이신 내성 유전자에 있어서의 mRNA 불안정화 서열 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트와의 조합의 효과
(1) pEF1 α- SNAP26m - Hyg -1.1k/1.1k 및 pEF1 α- SNAP26m - Hyg ? N4 -1.1k/1.1k의 구축
다음에, 하이그로마이신 내성 유전자로 N4 서열과 실시예 15에서 유전자 발현 안정화능이 인정된 CHO5Δ3-3의 조합 효과를 검토하기 위해서 도 36에 나타내는 반응식에 따라 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4-1.1k/1.1k 및 pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k/1.1k를 구축하였다. 즉, pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4, pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2로부터 제한 효소 MluI, BsiWI로 SNAPm-pA-SV40 프로모터-Hyg?N4-pA, SNAP26m-pA-SV40 프로모터-Hyg-pA를 잘라내고, pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k의 제한 효소 MluI, BsiWI 사이트에 도입하여 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k/1.1k를 구축하였다.
실시예 19
(2) 하이그로마이신 내성 유전자에서의 N4 서열과 CHO5 Δ3-3의 조합 효과의 검토
실시예 2에 기재된 방법으로 트랜스펙션용 CHO-K1 세포를 준비하였다. 한편, 실시예 6 및 18에서 구축한 SNAP26m 발현 구축물을 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈하였다. 트랜스펙션은 실시예 5에 기재된 방법으로 행하고, 트랜스펙션의 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 800μg/ml HygroGold를 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 1주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 실시예 2에 기재된 방법으로 세포 집단의 SNAP26m의 발현 강도를 해석하였다.
도 37은 약제 선택 후의 pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2, pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4 및 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4-1.1k/1.1k로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타낸다. 또한, 도 38에 형광 강도 FL1이 200 이상, 1000 이상인 세포의 비율의 플롯을 나타낸다. 이 결과, mRNA 불안정화 인자인 N4 서열과 유전자 발현 안정화 효과를 갖는 CHO5Δ3-3을 조합함으로써 N4 서열 또는 CHO5Δ3-3을 단독으로 이용한 경우와 비교하여 SNAPm 고발현 세포의 비율이 더욱 증대하고 있어 고생산성 세포의 선택 효율이 향상되는 것을 알 수 있다.
실시예 20
네오마이신 내성 유전자에 있어서의 mRNA 불안정화 서열과 유전자 발현 안정화 엘리먼트의 조합의 효과
(1) pEF1 α- SNAP26m - Neo -1.1k/1.1k 및 pEF1 α- SNAP26m - Neo ? N4 -1.1k/1.1k의 구축
다음에, 네오마이신 내성 유전자로 N4 서열과 실시예 15에서 유전자 발현 안정화능이 인정된 CHO5Δ3-3의 조합 효과를 검토하기 위해서 도 39에 나타내는 반응식에 따라 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4-1.1k/1.1k 및 pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k/1.1k를 구축하였다. 즉, pEF1α-SNAP26m-Neo?N4, pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2로부터 제한 효소 EcoRI, BsiWI로 SNAP26m-pA-SV40 프로모터-Neo?N4-pA, SNAP26m-pA-SV40 프로모터-Neo-pA를 잘라내고, pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k의 제한 효소 coRI, BsiWI 사이트에 도입하여 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k/1.1k를 구축하였다.
실시예 21
(2) 네오마이신 내성 유전자에서의 N4 서열과 CHO5 Δ3-3의 조합 효과의 검토
실시예 2에 기재된 방법으로 트랜스펙션용 CHO-K1 세포를 준비하였다. 한편, 실시예 8 및 20에서 구축한 SNAP26m 발현 구축물을 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈하였다. 트랜스펙션은 실시예 5에 기재된 방법으로 행하고, 트랜스펙션의 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 1mg/ml 게네티신 G418을 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 1주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 실시예 2에 기재된 방법으로 세포 집단의 SNAP26m의 발현 강도를 해석하였다.
도 40은 약제 선택 후의 pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2, pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Neo?N4 및 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4-1.1k/1.1k로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타낸다. 또한, 도 41에 형광 강도 FL1이 200 이상, 1000 이상인 세포의 비율의 플롯을 나타낸다. 이 결과, mRNA 불안정화 인자인 N4 서열과 유전자 발현 안정화 효과를 갖는 CHO5Δ3-3을 조합함으로써 N4 서열 또는 CHO5Δ3-3을 단독으로 이용한 경우와 비교하여 SNAPm 고발현 세포의 비율이 더욱 증대하고 있어 고생산성 세포의 선택 효율이 향상되는 것을 알 수 있다.
실시예 22
CHO5 Δ3-3 존재하에서의 ARE 서열 모티프의 반복 서열 수의 검토
도 42에 나타내는 반응식에 따라 플라스미드 pEF1α-SNAP26m-Pur?N2-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6-1.1k/1.1k 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8-1.1k/1.1k를 구축하였다. 우선, 실시예 10에서 구축한 플라스미드 pEF1α-SNAP26m-Pur?N2, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8을 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해, 서열 번호 54, 55의 프라이머를 사용하여 Puromycin 내성 유전자 내에 존재하는 제한 효소 BsiWI 사이트를 삭제한 플라스미드 pEF1α-SNAP26m-Pur2?N2, pEF1α-SNAP26m-Pur2?N6 및 pEF1α-SNAP26m-Pur2?N8을 구축하였다. 계속해서, pEF1α-SNAP26m-Pur2?N2, pEF1α-SNAP26m-Pur2?N6 및 pEF1α-SNAP26m-Pur2?N8로부터 제한 효소 EcoRI, BsiWI로 SNAP26m-pA-SV40 프로모터-Pur2?N2-pA, SNAP26m-pA-SV40 프로모터-Pur2?N6-pA, SNAP26m-pA-SV40 프로모터-Pur2?N8-pA를 잘라내고, pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k의 제한 효소 EcoRI, BsiWI 사이트에 도입하여 pEF1α-SNAP26m-Pur?N2-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N8-1.1k/1.1k를 구축하였다.
실시예 2에 기재된 방법으로 트랜스펙션용 CHO-K1 세포를 준비하였다. 한편, pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N2-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6-1.1k/1.1k 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8-1.1k/1.1k의 각 SNAP26m 발현 구축물을 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈하였다. 트랜스펙션은 실시예 5에 기재된 방법으로 행하고, 트랜스펙션의 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 10μg/ml Puromycin을 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 1주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 실시예 2에 기재된 방법으로 세포 집단의 SNAP26m의 발현 강도를 해석하였다.
도 43은 약제 선택 후의 pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N2-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k, pEF1α-SNAP26m-Pur?N6-1.1k/1.1k 및 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8-1.1k/1.1k로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타낸다. 또한, 실시예 19까지의 조건으로 FACS 해석에 제공한 결과, 세포의 형광 강도 FL1이 지나치게 강해서 고발현 세포의 비율을 정확하게 산출할 수 없었다. 그 때문에, 유세포 분석기의 형광 감도를 내려 재검토한 결과를 도 43에 나타내고 있다. 또한, 도 44에 형광 강도 FL1이 1000 이상인 세포의 비율의 플롯을 나타낸다. 이 결과, CHO5Δ3-3으로 발현 카세트를 끼운 경우라도 반복 서열 수가 많은 N6 또는 N8이 삽입된 플라스미드의 pEF1α-SNAP26m-Pur?N6-1.1k/1.1k 또는 pEF1α-SNAP26m-Pur?N8-1.1k/1.1k로 형질 전환하였을 때, pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k의 경우와 비교하여 SNAPm 고발현 세포의 비율이 더욱 많고, 고생산성 세포의 선택 효율이 비약적으로 향상되는 것이 확인되었다.
실시예 23
항체 생산계에서의 mRNA 불안정화 서열과 유전자 발현 안정화 엘리먼트의 조합의 효과
(1) pEF1 α- KOD3G8HC - Neo ? N4 -1.1k/1.1k의 구축
항체 생산계에서의 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)과 실시예 15에서 유전자 발현 안정화능이 인정된 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3의 조합 효과의 검토에 이용하기 위해서, 도 45에 나타내는 반응식에 따라 pEF1α-KOD3G8HC-Neo?N4-1.1k/1.1k를 구축하였다. 항체 유전자는 써모코커스?코다카라엔시스(Thermococcus kodakaraensis) KOD1주 유래의 DNA 폴리메라제에 특이적인 항체를 생산하는 마우스 하이브리도마 세포계 3G8(입수처:산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁 번호:FERM BP-6056)로부터 얻어지는 항체(항KOD 항체)의 유전자를 이용하였다.
즉, 실시예 20에 기재된 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4-1.1k/1.1k를 제한 효소 EcoRI, NotI로 처리하여 SNAP26m 유전자를 잘라내었다. 한편, 실시예 4에 기재된 pEF1α-KOD3G8HC로부터 서열 번호 56, 57의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, 제한 효소 EcoRI, NotI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 중쇄 유전자를 pEF1α-SNAP26m-Neo?N4-1.1k/1.1k의 EcoRI, NotI 사이트에 도입하여 pEF1α-KOD3G8HC-Neo?N4-1.1k/1.1k를 구축하였다.
실시예 24
(2) pEF1 α- KOD3G8LC - Hyg -1.1k/1.1k의 구축
항체 생산계에서의 N4 서열과 실시예 15에서 유전자 발현 안정화능이 인정된 CHO5Δ3-3의 조합 효과의 검토에 이용하기 위해서 도 46에 나타내는 반응식에 따라 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k/1.1k를 구축하였다. 즉, 우선 실시예 6의 도중에서 구축된 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2의 발현 카세트 상류의 제한 효소 NheI, BglII 사이트에 서열 번호 50, 51의 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭한 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3(이하, 구축물 중에서는 1.1k라고 표기)을 삽입하여 플라스미드 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k를 구축하였다. 또한 플라스미드 pEF1α-KOD3G8LC-1.1k의 발현 카세트 하류의 제한 효소 BsiWI, XhoI 사이트에 서열 번호 52, 53의 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 증폭한 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 삽입하여 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k/1.1k를 구축하였다.
실시예 25
(3) pEF1 α- KOD3G8LC - Hyg ? N4 -1.1k/1.1k의 구축
항체 생산계에서의 N4 서열과 실시예 15에서 유전자 발현 안정화능이 인정된 CHO5Δ3-3의 조합 효과의 검토에 이용하기 위해서 도 47에 나타내는 반응식에 따라 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg?N4-1.1k/1.1k를 구축하였다. 즉, 실시예 18에 기재된 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4-1.1k/1.1k를 제한 효소 MluI, NotI로 처리하여 SNAP26m 유전자를 잘라내었다. 한편, 실시예 6에 기재된 pEF1α-KOD3G8LC로 서열 번호 56, 57의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, 제한 효소 MluI, NotI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 경쇄 유전자를 pEF1α-SNAP26m-Hyg?N4-1.1k/1.1k의 제한 효소 MluI, NotI 사이트에 도입하여 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg?N4-1.1k/1.1k를 구축하였다.
실시예 26
(4) pEF1 α- KOD3G8HC - Pur ? N4 -1.1k/1.1k의 구축
항체 생산계에서의 N4 서열과 실시예 15에서 유전자 발현 안정화능이 인정된 CHO5Δ3-3의 조합 효과의 검토에 이용하기 위해서 도 48에 나타내는 반응식에 따라 pEF1α-KOD3G8HC-Pur?N4-1.1k/1.1k를 구축하였다. 즉, 실시예 16에 기재된 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k를 제한 효소 EcoRI, NotI로 처리하여 SNAP26m 유전자를 잘라내었다. 한편, 실시예 4에 기재된 pEF1α-KOD3G8HC로부터 서열 번호 56, 57의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, 제한 효소 EcoRI, NotI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 중쇄 유전자를 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k의 제한 효소 EcoRI, NotI 사이트에 도입하여 pEF1α-KOD3G8HC-Pur?N4-1.1k/1.1k를 구축하였다.
실시예 27
(5) 항 KOD 항체 발현계에서의 N4 서열과 CHO5 Δ3-3의 조합 효과의 폴리클론 에 있어서의 검토
항KOD 항체의 중쇄(HC) 발현 구축물인 pEF1α-KOD3G8HC-RE2(이하, -/Neo라고 기재), pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k(이하, 1.1k/Neo라고 기재), pEF1α-KOD3G8HC-Neo?N4-1.1k/1.1k(이하, 1.1k/Neo?N4라고 기재), pEF1α-KOD3G8HC-Pur?N4-1.1k/1.1k(이하, 1.1k/Pur?N4라고 기재), 및 항KOD 항체의 경쇄(LC) 발현 구축물인 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2(이하, -/Hyg라고 기재), pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k/1.1k(이하, 1.1k/Hyg라고 기재), pEF1α-KOD3G8LC-Hyg?N4-1.1k/1.1k(이하, 1.1k/Hyg?N4라고 기재)를 각각 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈(직쇄상화)하였다. 그리고, 중쇄 및 경쇄 발현 구축물을 (1) 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 포함하지 않는 것(-/Neo와-/Hyg), (2) 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 항체 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k/Neo와 1.1k/Hyg), (3) 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 항체 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(중쇄:Neo, 경쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Neo?N4와 1.1k/Hyg?N4), (4) 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 항체 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(중쇄:Pur, 경쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Pur?N4와 1.1k/Hyg?N4)의 각각에 대하여 항체의 중쇄 발현 구축물과 경쇄 발현 구축물의 중량비가 1:1이 되도록 혼합하여 혼합 플라스미드를 제조하였다.
상기 혼합 플라스미드 2μg을 전일에 6웰 플레이트에 파종해 둔 CHO-K1 세포에 트랜스펙션하고, 24시간 인큐베이션하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 게네티신 G418 및 HygroGold 또는 Puromycin 및 HygroGold를 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 2주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 포함하지 않는 것(-/Neo, -/Hyg) 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k/Neo, 1.1k/Hyg)에서는 600μg/ml 게네티신 G418?400μg/ml HygroGold로 선택 배양을 하였다. 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(H쇄:Neo, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Neo?N4, 1.1k/Hyg?N4)에서는 400μg/ml 게네티신 G418?200μg/ml HygroGold로 선택 배양을 하였다. 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(중쇄:Pur, 경쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Pur?N4, 1.1k/Hyg?N4)에서는 7.5μg/ml Puromycin?400μg/ml HygroGold로 선택 배양을 하였다. 선택 배양 종료 후, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 1웰당 1.84×105 세포를 6웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 3일간 배양 후, 배양 상청을 회수하고, 폴리클론에서의 KOD3G8 항체의 생산량을 ELISA(파일로코커스?코다카라엔시스 KOD1 유래의 DNA 폴리메라제를 고상화한 것)로 측정하였다.
구체적으로는 30μg/ml 농도의 KOD1 유래의 DNA 폴리메라제 항원을 고상화한 ELISA 플레이트에 배양 상청을 첨가하고, 35℃에서 2시간 인큐베이션하였다. 다음에, PBS-T(0.1% Tween20 함유 인산 완충 생리 식염수)로 3회 세정하고, 10000배 희석한 항마우스 항체-HRP(DAKO사 제조)를 50μl 첨가하여 35℃에서 1시간 인큐베이션한 후, PBS-T로 3회 더 세정하고, TMB+(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine;DAKO사 제조)로 5분간 반응시켰다. 50μl의 1N 황산을 첨가하여 반응 정지후, 플레이트 리더(제품명;SPECTRA CLASSIC, TECAN Auctria사 제조)(주파장 450nm, 부파장 620nm)로 흡광도를 측정하였다.
표준품으로 작성한 검량선을 기초로 항체 농도를 산출하였다. 또한, 표준품으로서 KOD1 유래의 DNA 폴리메라제에 특이적인 항체를 생산하는 마우스 하이브리도마 세포계 3G8(입수처:독립행정법인산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁 번호:FERM BP-6056)로부터 얻어진 항체를 이용하였다. 결과를 도 49에 나타낸다. 도 49로부터 분명한 바와 같이 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 포함하지 않는 것(-/Neo, -/Hyg)과 비교하여 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k/Neo, 1.1k/Hyg)에서는 항체 생산량이 2배 정도 상승했지만, 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(H쇄:Neo, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Neo?N4, 1.1k/Hyg?N4)에서는 항체 생산량이 더욱 상승하여 약 3배로 증가하였다. 또한, 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것으로, 중쇄 발현 구축물의 약제 내성 유전자를 Neo로부터 Pur에 변경하였을 때, 항체 생산량이 현저히 증가하고, 유전자 발현 안정화 엘리먼트 및 mRNA 불안정화 서열을 갖지 않는 발현 구축물에 비해 약 5배의 항체 생산량을 나타냈다.
실시예 28
(6) 항 KOD 항체 발현계에서의 N4 서열과 CHO5 Δ3-3의 조합 효과의 모노클론 에 있어서의 검토
계속해서, 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 포함하지 않는 것(-/Neo, -/Hyg), 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k/Neo, 1.1k/Hyg), 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(H쇄:Neo, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Neo?N4, 1.1k/Hyg?N4), 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(H쇄:Pur, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Pur?N4, 1.1k/Hyg?N4)의 각각에 대하여 한계 희석을 행하여 모노클론에서의 생산성의 비교를 행하였다.
구체적으로는 실시예 27의 KOD3G8 항체를 안정 도입한 폴리클론의 세포를 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 0.75세포/웰의 농도로 96웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 2주간 배양 후, 배양 상청을 회수하고, KOD3G8 항체의 생산량을 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 측정하였다. 표준품으로 작성한 검량선을 기초로 각 클론의 항체 생산량을 산출하고, 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 포함하지 않는 것(-/Neo, -/Hyg), 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k/Neo, 1.1k/Hyg), 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(H쇄:Neo, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Neo?N4, 1.1k/Hyg?N4), 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(H쇄:Pur, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Pur?N4, 1.1k/Hyg?N4)의 각각에 대하여 발현량 상위 클론을 확대 배양한 후, 1웰당 1.84×105 세포를 6웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 3일간 배양 후, 배양 상청을 회수하고, 모노클론에서의 KOD3G8 항체의 생산량을 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 측정하였다.
표준품으로 작성한 검량선을 기초로 산출한 각 클론의 항체 생산량을 플롯팅한 그래프를 도 50에 나타낸다. 그 결과, 폴리클론에서의 생산성을 비교한 경우와 마찬가지로 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 포함하지 않는 것(-/Neo, -/Hyg)과 비교하여 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 항체 발현 카세트 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k/Neo, 1.1k/Hyg)에서 항체 생산량이 상승했지만, 피검 서열 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(H쇄:Neo, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Neo?N4, 1.1k/Hyg?N4)에서 항체 생산량이 더욱 상승하고 있었다. 또한, 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 항체 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것에서는, 중쇄 발현 구축물의 약제 내성 유전자를 Neo?N4로부터 Pur?N4에 변경하였을 때, 각 세포의 항체 생산량이 현저히 증가하여 높은 항체 생산성을 나타내는 클론의 비율이 현저히 커졌다. 이 결과로부터 항체 생산계에서의 고생산성 세포의 선택 효율이 비약적으로 향상되는 것이 확인되었다.
또한, 효과를 확인하기 위해서 유전자 발현 안정화 엘리먼트도 mRNA 불안정화 서열도 포함하지 않는 것(-/Neo, -/Hyg)과, 높은 항체 생산량을 나타낸 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 포함하고, 또한 약제 내성 유전자(H쇄:Pur, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Pur?N4, 1.1k/Hyg?N4)에 대하여 상기 96웰 플레이트에서의2주간 배양 후의 ELISA 측정에 의해 산출된 KOD3G8 항체의 생산량을 재차 해석하고, 도수 분포로서 플롯팅한 결과를 도 51에 나타낸다. 이 결과, KOD3G8 생산량에 대한 클론의 분포는 1.1k/Pur?N4, 1.1k/Hyg?N4에 있어서 유의하게 고생산측에 시프트하고 있고, 매우 높은 항체 생산성을 갖는 세포의 비율이 현저히 증대하고 있다. 유전자 발현 안정화 엘리먼트와 mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 이용이 그 상승 효과에 의해 고생산 세포주 취득에 매우 크게 기여하고 있는 것이 확인되었다.
실시예 29
무혈청 순화 CHO 세포를 이용한 항 KOD 항체 발현계에서의 N4 서열과 CHO5 Δ3-3의 조합 효과의 폴리클론에 있어서의 검토
CHO 세포용 EX-세포 CD CHO 무혈청 배지(EX-CELL CD CHO Serum-Free Medium for CHO Cells), 화학적으로 조성이 분명한 배지(SAFC Biosciences사)를 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라 CHO-K1 세포를 무혈청 순화하였다. 무혈청 순화한 CHO-K1 세포 2.5×105세포/ml가 되도록 Opti-MEM I Reduced-Serum Medium(GIBCO사 제조)에 현탁하고, 초저접착 표면 24웰 플레이트(Corning Life Science사)의 4웰에 1ml씩 파종하였다.
항KOD 항체의 중쇄(HC) 발현 구축물인 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k(이하, 1.1k/Neo라고 기재), pEF1α-KOD3G8HC-Pur?N4-1.1k/1.1k(이하, 1.1k/Pur?N4라고 기재) 및 항KOD 항체의 경쇄(LC) 발현 구축물인 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k/1.1k(이하, 1.1k/Hyg라고 기재), pEF1α-KOD3G8LC-Hyg?N4-1.1k/1.1k(이하, 1.1k/Hyg?N4라고 기재)를 각각 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈(직쇄상화)하였다. 그리고, 중쇄 및 경쇄 발현 구축물을
(1) 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 항체 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k/Neo와 1.1k/Hyg),
(2) 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 항체 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(중쇄:Pur, 경쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Pur?N4와 1.1k/Hyg?N4)
의 각각에 대하여 항체의 중쇄 발현 구축물과 경쇄 발현 구축물의 중량비가 1:1이 되도록 혼합하여 혼합 플라스미드를 제조하였다.
상기 혼합 플라스미드 각 4μg을 Opti-MEM I Reduced-Serum Medium 68μl로 희석하였다. 한편, Lipofectamine 2000 15μl을 Opti-MEM I Reduced-Serum Medium 68μl로 희석하고, 상기 플라스미드 혼합액과 혼합하여 15분간 실온에서 방치하였다. 그 후, 반량씩 2웰의 세포에 첨가하였다.
다음날, 세포를 회수하여 800g×3분간 원심하여 상청을 제거하고, 4ml EX-CELL CD CHO Serum-Free Medium for CHO Cells, 화학적으로 조성이 분명한 배지에 현탁하고, 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 것(1.1k/Neo, 1.1k/Hyg)에는 400μg/ml G418, 200μg/ml HygroGold, 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(H쇄:Pur, L쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Pur?N4, 1.1k/Hyg?N4)에는 7.5μg/ml Puromycin, 200μg/ml HygroGold의 항생 물질을 첨가하여 선택 배양하였다.
선택 배양 종료 후, 2×105세포/ml로 2ml씩 6웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 3일간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 폴리클론에서의 KOD3G8 항체의 생산량을 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 측정하였다. 표준품으로 작성한 검량선을 기초로 산출한 항체 생산량을 플롯팅한 그래프를 도 52에 나타낸다. 이 결과, 무혈청 순화 CHO-K1 세포를 이용하더라도 1.1k/Pur?N4, 1.1k/Hyg?N4에 있어서의 생산성은 실시예 27의 무혈청 순화하지 않은 CHO-K1 세포의 높은 생산성을 재현하는 것이 확인되었다. 일반적으로 바이오 의약품 등의 공업 생산에는 고생산 세포를 스크리닝한 후, 1 내지 2개월 정도에 걸쳐 무혈청 순화하는데, 미리 무혈청 순화된 세포에 유전자 도입함으로써 무혈청 순화 공정을 생략할 수 있는 것이 기대된다. 본 실시예의 결과로부터 무혈청 순화 CHO 세포에 있어서도 본 발명의 유전자 발현 안정화 엘리먼트와 mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 이용에 의해 생산성이 높은 세포를 취득할 수 있는 것이 확인되어 생산성이 높은 세포를 보다 단시간에 수립할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 3O
항 KOD 항체 발현계에서의 2 구축물 항체 발현계와 싱글 벡터 항체 발현계의 비교
(1) pEF1 α- KOD3G8LC , HC - Pur ? N4 -1.1k/1.1k의 구축
다음에, H쇄 발현 카세트와 L쇄 발현 카세트를 하나의 벡터 상에 배치한 경우라도 고생산 세포를 취득 가능한지 검토하기 위해서 도 53에 나타내는 반응식에 따라 pEF1α-KOD3G8LC, HC-Pur?N4-1.1k/1.1k를 구축하였다.
또한, H쇄(중쇄) 발현 카세트와 L쇄(경쇄) 발현 카세트를 각각 별도의 벡터에 배치한 경우를「2 구축물 항체 발현계」 또는 단순히 「2 구축물」라고 하고, H쇄 발현 카세트와 L쇄 발현 카세트를 하나의 벡터 상에 배치한 경우를「싱글 벡터 항체 발현계」 또는 단순히 「싱글 벡터」라고 한다.
우선, pEF1α-KOD3G8HC-Pur?N4-1.1k/1.1k에 L쇄 발현 카세트 삽입용 제한 효소 사이트를 삽입한 pEF1α-KOD3G8HC-Pur?N4-1.1k/1.1k-S를 구축하였다. 즉, 실시예 26에 기재된 pEF1α-KOD3G8HC-Pur?N4-1.1k/1.1k를 제한 효소 BglII, MluI로 처리하여 EF-1α 프로모터를 잘라내었다. 한편, 실시예 16의 도중에서 구축한 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k로부터 서열 번호 58, 59의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, BglII, MluI로 처리하여 제조한 EF-1α 프로모터를 pEF1α-KOD3G8HC-Pur?N4-1.1k/1.1k의 BglII, MluI 사이트에 도입하여 EF-1α 프로모터 상류에 BglII, SphI, SpeI 사이트를 삽입한 pEF1α-KOD3G8HC-Pur?N4-1.1k/1.1k-S를 구축하였다.
계속해서, pEF1α-KOD3G8HC-Pur?N4-1.1k/1.1k-S를 BglII, SpeI로 처리하였다. 한편, 실시예 6의 도중에서 구축한 pEF1α-KOD3G8LC-RE2로부터 서열 번호 60, 61의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, BglII, SpeI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 L쇄 발현 카세트를 pEF1α-KOD3G8HC-Pur?N4-1.1k/1.1k-S의 BglII, SpeI 사이트에 도입하여 싱글 벡터 pEF1α-KOD3G8LC, HC-Pur?N4-1.1k/1.1k를 구축하였다.
실시예 31
(2) 항 KOD 항체 발현계에서의 폴리클론에 있어서의 2 구축물 항체 발현 계와 싱글 벡터 항체 발현계의 비교
싱글 벡터 항체 발현계에서도 2 구축물 항체 발현계와 마찬가지로 항체 생산량이 높은 클론을 취득 가능한지 검토하였다. 2 구축물 항체 발현계로서 실시예 27 및 28에서 가장 양호한 결과가 얻어진 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 항체 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입하고, 약제 내성 유전자(중쇄:Pur, 경쇄:Hyg)에 mRNA 불안정화 서열(N4 서열)을 부가한 것(1.1k/Pur?N4와 1.1k/Hyg?N4)에 대하여 항체의 중쇄 발현 구축물과 경쇄 발현 구축물의 중량비가 1:1이 되도록 혼합한 플라스미드(제한 효소 AhdI로 리니어라이즈 종료)를 트랜스펙션에 이용하였다. 또한, 싱글 벡터 항체 발현계로서 실시예 30에서 구축한 pEF1α-KOD3G8LC, HC-Pur?N4-1.1k/1.1k를 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈하여 트랜스펙션에 이용하였다. 각각의 플라스미드 2μg을 실시예 2에 기재된 방법으로 준비해 둔 CHO-K1 세포에 트랜스펙션하고, 24시간 인큐베이션하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 2 구축물 발현계에서는 7.5μg/ml Puromycin?400μg/ml HygroGold를 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서, 싱글 벡터계에서는 10μg/ml Puromycin을 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 2주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 1웰당 1.84×105 세포를 6웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 3일간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 폴리클론에서의 KOD3G8 항체의 생산량을 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 측정하였다.
표준품으로 작성한 검량선을 기초로 항체 농도를 산출하였다. 결과를 도 54에 나타낸다. 그 결과, 2 구축물 항체 발현계와 싱글 벡터 항체 발현계 사이에서 항체 생산량에 차이는 거의 보이지 않는 것을 알았다.
실시예 32
(3) 항 KOD 항체 발현계에서의 모노클론에 있어서의 2 구축물 항체 발현 계와 싱글 벡터 항체 발현계의 비교
계속해서, 2 구축물 항체 발현계, 싱글 벡터 항체 발현계의 각각에 대하여 한계 희석을 행하여 모노클론에서의 생산성의 비교를 행하였다.
구체적으로는 실시예 31의 KOD3G8 항체를 안정 도입한 폴리클론의 세포를 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 0.75세포/웰의 농도로 96웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 2주간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 KOD3G8 항체의 생산량을 측정하였다. 표준품으로 작성한 검량선을 기초로 각 클론의 항체 생산량을 산출하고, 2 구축물 항체 발현계, 싱글 벡터 항체 발현계의 각각에 대하여 발현량 상위 클론을 선택하였다. 선택한 클론을 확대 배양한 후, 1웰당 1.84×105 세포를 6웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 3일간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 모노클론에서의 KOD3G8 항체의 생산량을 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 측정하였다.
표준품으로 작성한 검량선을 기초로 산출한 발현량 상위 5 클론의 항체 생산량을 플롯팅한 그래프를 도 55에 나타낸다. 그 결과, 폴리클론에서의 결과와 마찬가지로 싱글 벡터 항체 발현계와 2 구축물 항체 발현계 사이에서 항체 발현량은 거의 변하지 않는 것을 알았다. 이로부터 싱글 벡터 항체 발현계에서도 2 구축물 항체 발현계와 마찬가지로 항체 생산량이 높은 클론을 취득 가능한 것을 알았다.
실시예 33
발현 벡터에 있어서의 각 서열 요소로부터의 제한 효소 인식 서열 삭제의 효과의 확인
(1) CHO5 Δ3-3으로부터의 제한 효소 인식 서열의 삭제
계속해서, 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3으로부터 제한 효소 인식 서열을 삭제하였다. 우선, 실시예 16에 기재된 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 62, 63의 프라이머를 사용하여 CHO5Δ3-3 내에 존재하는 제한 효소 SacI 사이트를 삭제한 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE를 구축하였다. 다음에, pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 64, 65의 프라이머를 사용하여 CHO5Δ3-3 내에 존재하는 제한 효소 SmaI 사이트를 삭제한 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE2를 구축하였다. 또한, pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE2를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 66,67의 프라이머를 사용하여 CHO5Δ3-3 내에 존재하는 제한 효소 BamHI 사이트를 삭제한 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE3을 구축하였다. 마지막으로 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE3을 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 68, 69의 프라이머를 사용하여 CHO5Δ3-3 내에 존재하는 제한 효소 HindIII 사이트를 삭제한 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4를 구축하였다.
실시예 34
(2) pEHX 의 구축
멀티 클로닝 사이트와 실시예 33에서 제조한 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트 상류 및 하류에 배치하는 도 56에 기재된 pEHX를 구축하였다. 구체적으로는 실시예 16에 기재된 pEF1α-SNAP26m-Pur2?N4을 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 70, 71의 프라이머를 사용하여 SV40 promoter 하류에 존재하는 제한 효소 HindIII 사이트를 삭제한 pEF1α-SNAP26m-Pur2?N4-ΔH를 구축하였다. 계속해서, pEF1α-SNAP26m-Pur2?N4-ΔH를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 72, 73의 프라이머를 사용하여 Puromycin 내성 유전자 내에 존재하는 제한 효소 SalI 사이트를 삭제한 pEF1α-SNAP26m-Pur3?N4-ΔH를 구축하였다. 또한, pEF1α-SNAP26m-Pur3?N4-ΔH를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 74, 75의 프라이머를 사용하여 Puromycin 내성 유전자 내에 존재하는 제한 효소 SmaI 사이트를 삭제한 pEF1α-SNAP26m-Pur4?N4-ΔH를 구축하였다. 그 후, pEF1α-SNAP26m-Pur4?N4-ΔH를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 76, 77의 프라이머를 사용하여 f1 ori를 삭제한 pEF1α-SNAP26m-Pur4?N4-ΔH-Δf1을 구축하였다. 다음에, pEF1α-SNAP26m-Pur4?N4-ΔH-Δf1을 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 78, 79의 프라이머를 사용하여 제한 효소 NheI, EcoRI, SpeI 사이트를 삽입한 pEF1α-SNAP26m-Pur4?N4-ΔH-Δf1-RE를 구축하였다. 계속해서, pEF1α-SNAP26m-Pur4?N4-ΔH-Δf1-RE를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 80, 81의 프라이머를 사용하여 제한 효소 HindIII, BsiWI, XbaI, BclI 사이트를 삽입한 pEF1α-MCSpre-Pur4?N4-ΔH-Δf1-RE를 구축하였다. 그리고, pEF1α-MCSpre-Pur4?N4-ΔH-Δf1-RE의 HindIII, XbaI 사이트에 서열 번호 82, 83의 프라이머를 혼합후, 95℃에서부터 60℃까지 서서히 온도를 내려 어닐링시켜 제조한 DNA 단편을 삽입하여 pEF1α-MCS-Pur4?N4-ΔH-Δf1-RE를 구축하였다. 다음에, pEF1α-MCS-Pur4?N4-ΔH-Δf1-RE의 NheI, EcoRI 사이트에 서열 번호 84, 85의 프라이머 세트를 사용하여 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4를 주형으로 PCR로 증폭한 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 삽입하여 pEF1α-MCS-Pur4?N4-1.1k를 구축하였다. 또한, pEF1α-MCS-Pur4?N4-1.1k의 BamHI, XhoI 사이트에 서열 번호 52, 86의 프라이머 세트를 사용하여 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4를 주형으로 PCR로 증폭한 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 삽입하여 pEHX를 구축하였다.
실시예 35
(3) pEH (M- SNAP26m -N) 및 pEH (B- SNAP26m -N)의 구축
다음에, 엘리먼트로부터의 제한 효소 사이트 삭제의 효과를 확인하기 위해서 도 57에 나타내는 반응식에 따라 pEHX의 멀티 클로닝 사이트에 SNAP26m 유전자를 삽입하였다. 구체적으로는 pEHX의 MluI, NotI 사이트에 서열 번호 3, 20의 프라이머 세트를 사용하여 pSNAPm을 주형으로 증폭한 SNAP26m 유전자를 삽입하여 pEH(M-SNAP26m-N)을 구축하였다. 마찬가지로 pEHX의 BsiWI, NotI 사이트에 서열 번호 3, 87의 프라이머 세트를 사용하여 pSNAPm을 주형으로 증폭한 SNAP26m 유전자를 삽입하여 pEH(B-SNAP26m-N)을 구축하였다.
실시예 36
(4) SNAP26m 발현계에서의 CHO5 Δ3-3으로부터 제한 효소 인식 서열의 삭제 효과의 검토
실시예 2에 기재된 방법으로 트랜스펙션용 CHO-K1 세포를 준비하였다. 한편, 실시예 16에서 구축한 SNAP26m 발현 구축물 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k, 및 실시예 35에서 구축한 SNAP26m 발현 구축물을 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈하였다. 트랜스펙션은 실시예 5에 기재된 방법으로 행하고, 트랜스펙션의 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 각각 7.5, 10μg/ml Puromycin을 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 2주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 실시예 2에 기재된 방법으로 세포 집단의 SNAP26m의 발현 강도를 해석하였다.
도 58은 약제 선택 후의 pEF1α-SNAP26m-Pur?N4-1.1k/1.1k, pEH(M-SNAP26m-N), pEH(B-SNAP26m-N)으로 형질 전환된 세포 집단의 FACS 해석의 결과를 나타낸다. 또한, 도 59에 형광 강도 FL1이 200 이상, 1000 이상인 세포의 비율의 플롯을 나타낸다. 이 결과, 약제 선택 중의 Puromycin 농도에 상관없이 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 이용한 플라스미드를 이용한 쪽이 SNAPm 고발현 세포의 비율이 많은 것을 알 수 있다. 또한, pEHX에 SNAP26m 유전자를 삽입한 경우, 클로닝에 사용한 제한 효소 사이트에 상관없이 SNAPm 고발현 세포의 비율이 많은 것도 알 수 있다.
실시예 37
항체 생산계에서의 발현 벡터의 각 서열 요소로부터의 제한 효소 인식 서열삭제의 효과의 확인
(1) pELX 의 구축
멀티 클로닝 사이트를 포함하는 도 60에 기재된 pELX를 구축하였다. 구체적으로는 실시예 6의 도중에서 구축된 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 88, 89의 프라이머를 사용하여 제한 효소 BglII, SalI 사이트를 삽입한 pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE3을 구축하였다. 계속해서, pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE3을 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 90, 91의 프라이머를 사용하여 f1 ori와 하이그로마이신 내성 유전자의 발현 카세트를 삭제하여 제한 효소 EcoRI, SpeI 사이트를 삽입한 pEF1α-KOD3G8LC-RE4를 구축하였다. 그 후, pEF1α-KOD3G8LC-RE4를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 80, 81의 프라이머를 사용하여 제한 효소 HindIII, BsiWI, XbaI, BclI 사이트를 삽입한 pEF1α-MCSpre-RE4를 구축하였다. 그리고, pEF1α-MCSpre-RE4의 제한 효소 HindIII, XbaI 사이트에 서열 번호 82, 83의 프라이머를 혼합후, 95℃에서부터 60℃까지 서서히 온도를 내려 어닐링시켜 제조한 DNA 단편을 삽입하여 pELX를 구축하였다.
실시예 38
(2) 항 KOD 항체 발현 벡터: pELH ( KOD3G8 )의 구축
계속해서, 항KOD 항체 발현계에서 엘리먼트로부터의 제한 효소 사이트 삭제의 효과를 확인하기 위해서 pELH(KOD3G8)을 구축하였다.
우선, pEHX 및 pELX의 제한 효소 MluI, NotI 사이트에 각각 항KOD 항체의 중쇄 유전자, 경쇄 유전자를 삽입하여 pEH(KOD3G8) 및 pEL(KOD3G8)을 구축하였다. 구체적으로는 실시예 4에 기재된 pEF1α-KOD3G8HC로부터 서열 번호 56, 57의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, 제한 효소 MluI, NotI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 중쇄 유전자를 pEHX의 제한 효소 MluI, NotI 사이트에 도입하여 pEH(KOD3G8)을 구축하였다. 마찬가지로 실시예 6에 기재된 pEF1α-KOD3G8LC로부터 서열 번호 56, 57의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, 제한 효소 MluI, NotI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 경쇄 유전자를 pELX의 제한 효소 MluI, NotI 사이트에 도입하여 pEL(KOD3G8)을 구축하였다.
그리고, 도 61에 나타내는 반응식에 따라 pEL(KOD3G8)을 BglII, SpeI, ScaI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 경쇄 발현 카세트를 pEH(KOD3G8)의 제한 효소 BglII, SpeI 사이트에 삽입하여 pELH(KOD3G8)을 구축하였다.
실시예 39
(3) 항 KOD 항체 발현계에서의 폴리클론에 있어서의 CHO5 Δ3-3으로부터 제한 효소 인식 서열의 삭제 효과의 검토
CHO5Δ3-3 내의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 효과를 항KOD 항체 발현계에서 검토하였다. 제한 효소 인식 서열을 삭제하지 않은 유전자 발현 안정화 서열 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 항KOD 항체 발현용 싱글 벡터로서, 실시예 30에서 구축한 pEF1α-KOD3G8LC, HC-Pur?N4-1.1k/1.1k(1.1k)를 이용하였다. 또한, 유전자 발현 안정화 서열로부터 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 항KOD 항체 발현용 싱글 벡터로서, 실시예 38에서 구축한 pELH(KOD3G8)(1.1k-ΔRE)를 이용하였다. 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈한 플라스미드 2μg을 실시예 2에 기재된 방법으로 준비해 둔 CHO-K1 세포에 트랜스펙션하고, 24시간 인큐베이션하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 10μg/ml Puromycin을 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 2주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 1웰당 1.84×105 세포를 6웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 3일간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 폴리클론에서의 KOD3G8 항체의 생산량을 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 측정하였다.
표준품으로 작성한 검량선을 기초로 항체 농도를 산출하였다. 결과를 도 62에 나타낸다. 그 결과, 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 항KOD 항체 발현용 싱글 벡터의 pELH(KOD3G8)(1.1k-ΔRE)를 이용하는 쪽이 항체 생산량이 높은 것을 알았다.
실시예 40
(4) 항 KOD 항체 발현계에서의 모노클론에 있어서의 CHO5 Δ3-3으로부터 제한 효소 인식 서열의 삭제 효과의 검토
계속해서, CHO5Δ3-3 내의 제한 효소 인식 서열을 삭제하지 않은 것, 삭제한 것의 각각에 대하여 한계 희석을 행하여 모노클론에서의 생산성의 비교를 행하였다.
구체적으로는 실시예 39의 KOD3G8 항체를 안정 도입한 폴리클론의 세포를 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 0.75세포/웰의 농도로 96웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 2주간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 KOD3G8 항체의 생산량을 측정하였다. 표준품으로 작성한 검량선을 기초로 각 클론의 항체 생산량을 산출하고, CHO5Δ3-3 내의 제한 효소 인식 서열을 삭제하지 않은 것, 삭제한 것의 각각에 대하여 발현량 상위 클론을 선택하였다. 선택한 클론을 확대 배양한 후, 1웰당 1.84×105 세포를 6웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 3일간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 모노클론에서의 KOD3G8 항체의 생산량을 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 측정하였다.
표준품으로 작성한 검량선을 기초로 산출한 발현량 상위 5 클론의 항체 생산량을 플롯팅한 그래프를 도 63에 나타낸다. 그 결과, 폴리클론에서의 결과와 마찬가지로 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 삽입한 항KOD 항체 발현용 싱글 벡터의 pELH(KOD3G8)(1.1k-ΔRE)를 이용한 쪽이 항체 생산량이 높은 것을 알았다. 이 결과로부터, 발현 벡터의 각 서열 요소로부터 제한 효소 사이트를 삭제하여 최적화함으로써, 항체 발현계에서도 클로닝부터 목적 단백질의 고발현주 구축까지 간편하고 또한 효율적으로 실시하는 것이 가능하게 되었다고 말할 수 있다.
실시예 41
L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에의 CHO5 Δ3-3 삽입 효과의 확인
3개 이상의 유전자 발현 안정화 엘리먼트의 배치에 의한 효과의 실증을 행하였다. 구체적으로는 2개의 목적 단백질의 유전자 발현 카세트와 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 상류 및 하류에 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 배치한 발현 벡터에 있어서, 또한 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 사이에 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 삽입한 효과를 하기의 방법으로 시험하였다.
(1) pELX2 의 구축
실시예 37에서 구축한 pELX의 발현 카세트 하류에 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 배치한 도 64에 기재된 pELX2를 구축하였다. 구체적으로는 실시예 37에서 구축한 pELX를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 90, 92의 프라이머를 사용하여 발현 카세트 하류에 제한 효소 NheI 사이트를 추가한 pELX-N을 구축하였다. 그리고, pELX-N의 NheI, EcoRI 사이트에 실시예 33에서 구축한 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4를 주형으로 하여 서열 번호 50, 93의 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭한 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 삽입하여 pELX2를 구축하였다. 실시예 41 내지 44에서 사용한 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3은 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 것이다.
실시예 42
(2) 항 KOD 항체 발현 벡터: pELH2 ( KOD3G8 )의 구축
계속해서, L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에의 CHO5Δ3-3 삽입의 효과를 확인하기 위해서 pELH2(KOD3G8)을 구축하였다.
우선, pELX2의 제한 효소 MluI, NotI 사이트에 항KOD 항체의 경쇄 유전자를 삽입하여 pEL2(KOD3G8)을 구축하였다. 구체적으로는 실시예 6에 기재된 pEF1α-KOD3G8LC로부터 서열 번호 56, 57의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, 제한 효소 MluI, NotI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 경쇄 유전자를 pELX2의 제한 효소 MluI, NotI 사이트에 도입하여 pEL2(KOD3G8)을 구축하였다.
그리고, 도 65에 나타내는 반응식에 따라 pEL2(KOD3G8)을 BglII, SpeI, ScaI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 경쇄 발현 카세트를 실시예 38에서 구축한 pEH(KOD3G8)의 제한 효소 BglII, SpeI 사이트에 삽입하여 pELH2(KOD3G8)을 구축하였다.
실시예 43
(3) 항 KOD 항체 발현계에서의 폴리클론에 있어서의 L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에의 CHO5 Δ3-3 삽입 효과의 확인
항KOD 항체 발현계에서의 L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에 CHO5Δ3-3을 삽입한 효과를 폴리클론의 단계에서 검토하였다. L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에 CHO5Δ3-3을 포함하는 항KOD 항체 발현용 싱글 벡터로서, 실시예 42에서 구축한 pELH2(KOD3G8)을 이용하였다. 또한, 비교예로서, L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에 CHO5Δ3-3을 포함하지 않는 항KOD 항체 발현용 싱글 벡터로서, 실시예 38에서 구축한 pELH(KOD3G8)을 이용하였다. 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈한 플라스미드 2μg을 실시예 2에 기재된 방법으로 준비해 둔 CHO-K1 세포에 트랜스펙션하고, 24시간 인큐베이션하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 10μg/ml Puromycin을 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 2주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 1웰당 1.84×105 세포를 6웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 3일간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 폴리클론에서의 KOD3G8 항체의 생산량을 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 측정하였다.
실시예 27과 마찬가지의 표준품으로 작성한 검량선을 기초로 항체 농도를 산출하였다. 결과를 도 66에 나타낸다. 그 결과, L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에 CHO5Δ3-3을 삽입한 항KOD 항체 발현용 싱글 벡터의 pELH2(KOD3G8)을 이용한 쪽이 비교예와 비교하여 1.5배 높은 항체 생산량을 나타내고, 항체 생산량이 비약적으로 상승한 것을 알았다.
실시예 44
(4) 항 KOD 항체 발현계에서의 모노클론에 있어서의 L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에의 CHO5 Δ3-3 삽입 효과의 확인
계속해서, L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에 CHO5Δ3-3을 갖는 발현 벡터(pELH2(KOD3G8))에 의해 형질 전환된 세포군, 및 비교예로서 L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에 CHO5Δ3-3을 갖지 않는 발현 벡터(pELH(KOD3G8))에 의해 형질 전환된 세포군의 각각에 대하여 한계 희석을 행하여 모노클론에서의 생산성의 비교를 행하였다.
구체적으로는 실시예 43의 KOD3G8 항체를 안정 도입한 폴리클론의 세포를 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 0.75세포/웰의 농도로 96웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 2주간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 KOD3G8 항체의 생산량을 측정하였다. 표준품으로 작성한 검량선을 기초로 각 클론의 항체 생산량을 산출하고, L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에 CHO5Δ3-3을 포함하는 것, 포함하지 않는 것의 각각에 대하여 발현량 상위 클론을 선택하였다. 선택한 클론을 확대 배양한 후, 1웰당 1.84×105 세포를 6웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 3일간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 모노클론에서의 KOD3G8 항체의 생산량을 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 측정하였다.
표준품으로 작성한 검량선을 기초로 산출한 발현량 상위 5 클론의 항체 생산량을 플롯팅한 그래프를 도 67에 나타낸다. 그 결과, L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에 CHO5Δ3-3을 삽입한 항KOD 항체 발현용 싱글 벡터의 pELH2(KOD3G8)을 이용한 쪽이 항체 생산량이 높은 것을 알았다. 세포주에 따라서는 2배 이상의 생산량을 나타내는 것도 있었다. 이 결과로부터 L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에도 유전자 발현 안정화 서열을 삽입함으로써 보다 항체 생산량이 높은 세포주를 취득할 수 있는 것이 분명하다.
실시예 45
콘카테머화한 발현 벡터의 효과의 확인
(1) 항 KOD 항체 발현 벡터: pELH3 ( KOD3G8 )의 구축
도 68에 나타내는 반응식에 따라 항KOD 항체의 H쇄 발현 카세트, L쇄 발현 카세트, 및 mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트를 각각 2카피씩 코딩하는 pELH3(KOD3G8)을 구축하였다. 즉, 실시예 38에서 구축한 pELH(KOD3G8)의 제한 효소 AseI, XhoI 사이트에, pELH(KOD3G8)을 제한 효소 AseI, SalI, NheI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 L쇄 발현 카세트, H쇄 발현 카세트, Pur 내성 유전자 발현 카세트, 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3으로 이루어지는 DNA 단편을 삽입하여 pELH3(KOD3G8)을 구축하였다.
실시예 46
(2) 항 KOD 항체 발현 벡터: pELH4 ( KOD3G8 )의 구축
도 69에 나타내는 반응식에 따라 항KOD 항체의 H쇄 및 L쇄 발현 카세트, 및 Pur 내성 유전자 발현 카세트를 각각 2카피씩 코딩하고, L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에도 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3이 삽입된 pELH4(KOD3G8)을 구축하였다. 즉, 실시예 42에서 구축한 pELH2(KOD3G8)의 제한 효소 AseI, XhoI 사이트에, pELH2(KOD3G8)을 제한 효소 AseI, SalI, NheI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 L쇄 발현 카세트, 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3, H쇄 발현 카세트, Pur 내성 유전자 발현 카세트, 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3으로 이루어지는 DNA 단편을 삽입하여 pELH4(KOD3G8)을 구축하였다.
실시예 47
(3) 항 KOD 항체 발현계에서의 폴리클론에 있어서의 콘카테머화 발현 벡터의 효과의 확인
콘카테머화 발현 벡터의 효과를 항KOD 항체 발현계에서 검토하였다. 콘카테머화한 발현 벡터는 실시예 45에서 구축한 pELH3(KOD3G8) 및 실시예 46에서 구축한 pELH4(KOD3G8)을 이용하였다. 또한, 비교예로서 실시예 38에서 구축한 항KOD 항체의 H쇄 및 L쇄 발현 카세트 및 Pur 내성 유전자 발현 카세트를 각각 1카피씩 코딩하는 pELH(KOD3G8)을 이용하였다. 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈한 플라스미드 2μg을 실시예 2에 기재된 방법으로 준비해 둔 CHO-K1 세포에 트랜스펙션하고, 24시간 인큐베이션하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 10μg/ml Puromycin을 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 2주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 1웰당 1.84×105 세포를 6웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 3일간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 폴리클론에서의 KOD3G8 항체의 생산량을 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 측정하였다.
실시예 27과 마찬가지로 표준품으로 작성한 검량선을 기초로 항체 농도를 산출하였다. 결과를 도 70에 나타낸다. 그 결과, 콘카테머화한 발현 벡터인 pELH3(KOD3G8) 또는 pELH4(KOD3G8)을 이용하였을 때, 컨트롤의 pELH(KOD3G8)과 비교하여 항체 생산량이 상대비로 1.5배 이상 높은 것을 알았다. 또한, L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에도 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3이 삽입된 pELH4(KOD3G8)을 이용하였을 때, 가장 항체 생산량이 높고, 비교예와 비교하여 2배 이상의 생산량을 나타내는 것을 알았다.
실시예 48
(4) 항 KOD 항체 발현계에서의 모노클론에 있어서의 콘카테머화 발현 벡터의 효과의 확인
계속해서, 발현 벡터 pELH(KOD3G8), pELH3(KOD3G8) 및 pELH4(KOD3G8)로 유전자 도입하여 취득한 폴리클론의 세포에 대하여 각각 한계 희석을 행하여 모노클론에서의 생산성의 비교를 행하였다.
구체적으로는 실시예 47의 KOD3G8 항체를 안정 도입한 폴리클론의 세포를 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 0.75세포/웰의 농도로 96웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 2주간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 KOD3G8 항체의 생산량을 측정하였다. 표준품으로 작성한 검량선을 기초로 각 클론의 항체 생산량을 산출하여 pELH(KOD3G8), pELH3(KOD3G8) 및 pELH4(KOD3G8)로 유전자 도입한 것의 각각에 대하여 발현량 상위 클론을 선택하였다. 선택한 클론을 확대 배양한 후, 1웰당 1.84×105 세포를 6웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 3일간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 모노클론에서의 KOD3G8 항체의 생산량을 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 측정하였다.
표준품으로 작성한 검량선을 기초로 산출한 발현량 상위 5 클론의 항체 생산량을 플롯팅한 그래프를 도 71에 나타낸다. 그 결과, 폴리클론의 경우와 마찬가지로 콘카테머화한 발현 벡터인 pELH3(KOD3G8) 또는 pELH4(KOD3G8)을 이용하였을 때, 컨트롤의 pELH(KOD3G8)과 비교하여 항체 생산량이 높은 것을 알았다. 또한, L쇄 발현 카세트와 H쇄 발현 카세트의 사이에도 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3이 삽입된 pELH4(KOD3G8)을 이용하였을 때, 가장 항체 생산량이 높은 것을 알았다. 이 결과로부터, 콘카테머화한 발현 벡터를 유전자 도입에 이용함으로써, 보다 항체 생산량이 높은 세포주를 신속하고 또한 효율적으로 취득할 수 있다고 생각된다.
실시예 49
항체의 정상 영역 유전자를 포함하는 발현 벡터의 제작 및 항체의 정상 영역 유전자를 포함하는 발현 벡터의 N4 서열과 CHO5 Δ3-3의 효과의 검토
항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 정상 영역의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작하고, 그 발현 벡터에 항체의 가변 영역의 유전자를 삽입하여 항체 분자를 발현시키고, mRNA 불안정화 서열(N4 서열) 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트(CHO5Δ3-3)의 효과를 확인하였다.
(1) CHO5 Δ3-3으로부터의 제한 효소 인식 서열의 삭제
실시예 33에서 구축한 4개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3으로부터 2개소 존재하는 제한 효소 BlpI 사이트를 더 삭제하였다. 구체적으로는 우선 실시예 33에서 구축한 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 94, 95의 프라이머를 사용하여 CHO5Δ3-3 내에 존재하는 제한 효소 BlpI 사이트를 삭제한 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE5를 구축하였다. 계속해서, pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE5를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 96, 97의 프라이머를 사용하여 CHO5Δ3-3 내에 존재하는 별도의 제한 효소 BlpI 사이트를 삭제한 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE6을 구축하였다.
실시예 50
(2) 인간 중쇄 정상 영역 유전자 Cγ1의 클로닝
건강한 인간의 헤파린 처리한 혈액으로부터 회수한 인간 말초혈 단구 세포로부터 세파졸 RNAI Super(나카라이테스크사 제조)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 다음에, 전체 RNA를 주형으로 ReverTra Ace -α-(도요보세키사 제조)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 계속해서, 서열 번호 98, 99의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 인간 γ1 정상 영역 유전자를 증폭하고, 정제한 PCR 산물을 pTA vector(도요보세키사 제조)에 TA 클로닝하였다. 구축한 플라스미드의 서열을 시퀀싱에 의해 확인하고, 기지 서열과 동일한 서열을 갖는 클론을 pTA-γ1이라고 하였다.
실시예 51
(3) pEH γX의 구축
6개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 발현 카세트 상류 및 하류에 배치하여 인간 γ1 정상 영역 유전자를 코딩하는 도 72에 기재된 pEHγX를 구축하였다. 구체적으로는 실시예 34에 기재된 pEF1α-MCS-Pur4?N4-1.1k의 NheI, BglII 사이트에 서열 번호 50, 51의 프라이머를 사용하여 실시예 49에서 구축한 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE6을 주형으로 PCR로 증폭한 6개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 삽입하여 pEF1α-MCS-Pur4?N4-1.1k-2를 구축하였다. 계속해서, pEF1α-MCS-Pur4?N4-1.1k-2의 XbaI, BclI 사이트에 서열 번호 100, 101의 프라이머를 사용하여 실시예 50에 기재된 pTA-γ1을 주형으로 PCR로 증폭한 인간 γ1 정상 영역 유전자를 삽입하여 pEF1α-γ-Pur4?N4-1.1k를 구축하였다. 다음에, pEF1α-γ-Pur4?N4-1.1k를 주형으로 KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 102, 103의 프라이머를 사용하여 EF1α 프로모터 상류의 EcoRI 사이트를 NotI 사이트에 치환한 pEF1α-γ-Pur4?N4-1.1k-RE를 구축하였다. 또한, pEF1α-γ-Pur4?N4-1.1k-RE를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 104, 105의 프라이머를 사용하여 인간 γ1 정상 영역 유전자 상류에 EcoRI 사이트를 삽입한 pEF1α-γ-Pur4?N4-1.1k-RE2를 구축하였다. 그리고, pEF1α-γ-Pur4?N4-1.1k-RE2의 BamHI, XhoI 사이트에 서열 번호 52, 86의 프라이머를 사용하여 실시예 49에서 구축한 pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE6을 주형으로 PCR로 증폭한 6개소의 제한 효소 인식 서열을 삭제한 CHO5Δ3-3을 삽입하여 pEF1α-γ-Pur4?N4-1.1k/1.1k를 구축하였다. 마지막으로, pEF1α-γ-Pur4?N4-1.1k/1.1k의 BsiWI, EcoRI 사이트에 서열 번호 106, 107의 프라이머를 혼합후, 95℃에서부터 60℃까지 서서히 온도를 내려 어닐링시켜 제조한 DNA 단편을 삽입하여 pEHγX를 구축하였다.
실시예 52
(4) 인간 경쇄 정상 영역 유전자 Cκ의 클로닝
건강한 인간의 헤파린 처리한 혈액으로부터 회수한 인간 말초혈 단구 세포로부터 세파졸 RNAI Super(나카라이테스크사 제조)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 다음에, 전체 RNA를 주형으로 ReverTra Ace -α-(도요보세키사 제조)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 계속해서, 서열 번호 108, 109의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 인간κ 정상 영역 유전자를 증폭하고, 정제한 PCR 산물을 pTA vector에 TA 클로닝하였다. 구축한 플라스미드의 서열을 시퀀싱에 의해 확인하여 기지 서열과 동일한 서열을 갖는 클론을 pTA-κ로 하였다.
실시예 53
(5) pEL κX의 구축
인간κ 정상 영역 유전자를 코딩하는 도 73에 기재된 pELκX를 구축하였다. 구체적으로는 실시예 37에 기재된 pELX를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 110, 111의 프라이머를 사용하여 멀티 클로닝 사이트에 배치한 제한 효소 HindIII, BsiWI 사이트를 삭제한 pELX-RE를 구축하였다. 계속해서, pELX-RE의 XbaI, BclI 사이트에 서열 번호 112, 113의 프라이머를 사용하여 실시예 52에 기재된 pTA-κ를 주형으로 PCR로 증폭한 인간κ 정상 영역 유전자를 삽입하여 pEF1α-κ를 구축하였다. 다음에, pEF1α-κ를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 114, 115의 프라이머를 사용하여 SV40 pA 하류의 EcoRI 사이트를 NotI 사이트에 치환한 pEF1α-κ-RE를 구축하였다. 또한, pEF1α-κ-RE를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 116, 117의 프라이머를 사용하여 인간κ 정상 영역 유전자 상류에 EcoRI, MluI, EcoRV 사이트를 삽입한 pEF1α-κ-RE2를 구축하였다. 마지막으로 pEF1α-κ-RE2의 MluI, EcoRV 사이트에 서열 번호 118, 119의 프라이머를 혼합후, 95℃에서부터 60℃까지 서서히 온도를 내려 어닐링시켜 제조한 DNA 단편을 삽입하여 pELκX를 구축하였다.
실시예 54
(6) 항 KOD 항체 발현 벡터: pEL κHγ( KOD3G8 )의 구축
계속해서, 항KOD 항체의 가변 영역 유전자를 이용한 마우스?인간 키메라 항체 발현계에서, N4 서열 및 CHO5Δ3-3의 효과를 확인하기 위해서 pELκHγ(KOD3G8)을 구축하였다.
우선, 실시예 38에 기재된 pEH(KOD3G8)로부터 서열 번호 56, 120의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, 제한 효소 HindIII, NheI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 중쇄 가변 영역 유전자를 실시예 51에서 구축한 pEHγX의 제한 효소 HindIII, NheI 사이트에 도입하여 pEHγ(KOD3G8)을 구축하였다.
다음에, 실시예 38에 기재된 pEL(KOD3G8)로부터 서열 번호 56, 121의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, 제한 효소 MluI, BsiWI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 경쇄 가변 영역 유전자를 실시예 53에서 구축한 pELκX의 제한 효소 MluI, BsiWI 사이트에 도입하여 pELκ(KOD3G8)을 구축하였다.
그리고, 도 74에 나타내는 반응식에 따라 pELκ(KOD3G8)을 BglII, NotI, ScaI로 처리하여 제조한 마우스?인간 키메라 항체의 경쇄 발현 카세트를 pEHγ(KOD3G8)의 제한 효소 BglII, NotI 사이트에 삽입하여 pELκHγ(KOD3G8)을 구축하였다.
실시예 55
(7) pcH γX의 구축
다음에, pEHγX로부터 N4 서열 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 삭제한 도 75에 기재된 pcHγX를 구축하였다. 구체적으로는 실시예 51에 기재된 pEF1α-γ-Pur4?N4-1.1k-RE2를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 16, 17의 프라이머를 사용하여 N4 서열을 삭제한 pEF1α-γ-Pur4-1.1k를 구축하였다. 계속해서, pEF1α-γ-Pur4-1.1k를 주형으로, KOD -Plus- Mutagenesis Kit를 이용한 Inverse PCR법에 의해 서열 번호 122, 123의 프라이머를 사용하여 유전자 발현 안정화 엘리먼트 CHO5Δ3-3을 삭제한 pEF1α-γ-Pur4를 구축하였다. 마지막으로, pEF1α-γ-Pur4의 BsiWI, EcoRI 사이트에 서열 번호 106, 107의 프라이머를 혼합후, 95℃에서부터 60℃까지 서서히 온도를 내려 어닐링시켜 제조한 DNA 단편을 삽입하여 pcHγX를 구축하였다.
실시예 56
(8) 항 KOD 항체 발현 벡터: pcL κHγ( KOD3G8 )의 구축
계속해서, mRNA 불안정화 서열(N4 서열) 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트(CHO5Δ3-3)의 효과를 확인하기 위해서, 컨트롤로서 항KOD 항체의 가변 영역 유전자를 이용한 마우스?인간 키메라 항체 발현계에 있어서 mRNA 불안정화 서열 및 유전자 발현 안정화 엘리먼트를 삭제한 pcLκHγ(KOD3G8)을 구축하였다.
우선, 실시예 38에 기재된 pEH(KOD3G8)로부터 서열 번호 56, 120의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, 제한 효소 HindIII, NheI로 처리하여 제조한 항KOD 항체의 중쇄 가변 영역 유전자를 실시예 55에서 구축한 pcHγX의 제한 효소 HindIII, NheI 사이트에 도입하여 pcHγ(KOD3G8)을 구축하였다.
그리고, 도 76에 나타내는 반응식에 따라 실시예 54에서 구축한 pELκ(KOD3G8)을 BglII, NotI, ScaI로 처리하여 제조한 마우스?인간 키메라 항체의 경쇄 발현 카세트를 pcHγ(KOD3G8)의 제한 효소 BglII, NotI 사이트에 삽입하여 pcLκHγ(KOD3G8)을 구축하였다.
실시예 57
(9) 마우스?인간 키메라 항체 발현계에서의 폴리클론에 있어서의 N4 서열 및 CHO5 Δ3-3의 효과의 확인
항KOD 항체의 가변 영역 유전자를 이용한 마우스?인간 키메라 항체 발현계에서, N4 서열 및 CHO5Δ3-3의 효과를 검토하였다. N4 서열 및 CHO5Δ3-3을 포함하는 구축물로서 실시예 54에서 구축한 pELκHγ(KOD3G8)을, N4 서열 및 CHO5Δ3-3을 포함하지 않는 구축물로서 실시예 56에서 구축한 pcLκHγ(KOD3G8)을 이용하였다. 제한 효소 AhdI로 리니어라이즈한 플라스미드 2μg을 실시예 2에 기재된 방법으로 준비해 둔 CHO-K1 세포에 트랜스펙션하고, 24시간 인큐베이션하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산시키고, 90mm 페트리 디시에 옮기고, 10μg/ml Puromycin을 포함하는 Ham's F12+10% FBS 배지 중에서 2주간 선택 배양을 행하였다. 선택 배양 중 3 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 선택 배양 종료 후, 2.5g/l-Trypsin?1mmol/l-EDTA Solution으로 처리하여 세포를 분산하고, 1웰당 1.84×105 세포를 6웰 플레이트에 뿌려 넣었다. 3일간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 폴리클론에서의 KOD3G8 항체의 생산량을 실시예 27과 마찬가지의 방법으로 ELISA로 측정하였다.
표준품으로 작성한 검량선을 기초로 항체 농도를 산출하였다. 결과를 도 77에 나타낸다. 그 결과, N4 서열 및 CHO5Δ3-3을 포함하는 키메라 항체 발현 벡터의 pELκHγ(KOD3G8)을 이용하였을 때, 컨트롤의 pcLκHγ(KOD3G8)과 비교하여 항체 생산량이 약 4배로 높은 결과였다. N4 서열 및 CHO5Δ3-3 외에 인간 항체의 정상 영역 유전자를 코딩하는 발현 벡터를 이용함으로써, 정상 영역이 인간형이 된 키메라 항체 발현 벡터나 파지 디스플레이법 등에 의해 취득한 가변 영역 유전자를 완전 항체로서 발현하는 벡터를 간편히 구축할 수 있고, 또한 이들 항체의 고발현주의 수립까지를 용이하고 또한 단기간에 실시할 수 있는 것이 분명해졌다.
<산업상 이용가능성>
본 발명의 유전자 발현의 안정화 기능을 갖는 핵산 영역과 약화된 약제 유전자 발현 카세트를 구비한 발현 벡터는, 목적 단백질 유전자를 고도로 발현하는 세포를 효율적으로 취득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 발현 벡터를 사용한 세포 발현 시스템은 여러 가지 동물 세포, 특히 포유류 동물 세포의 단백질의 기능 해석은 물론 바이오 의약품으로서 창약?의료 등의 산업계에 기여하는 점이 크다.
SEQUENCE LISTING <110> Toyo Boseki Kabushiki Kaisha <120> Expression vector for establishment of high productive cells and the high productive cells <130> F-3671PT <150> JP 2009-136512 <151> 2009-06-05 <150> JP 2009-146703 <151> 2009-06-19 <150> JP 2009-297963 <151> 2009-12-28 <150> JP 2010-023321 <151> 2010-02-04 <150> JP 2010-027317 <151> 2010-02-10 <150> JP 2010-098246 <151> 2010-04-21 <150> JP 2010-098247 <151> 2010-04-21 <150> JP 2010-126179 <151> 2010-06-01 <160> 123 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 654 <212> DNA <213> cytomegarovirus <400> 1 gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 60 attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 120 aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 180 gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 240 taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 300 gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 360 cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 420 cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 480 attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 540 aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 600 agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga aatt 654 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 1 <400> 2 atcgaattca ccatggacaa agactg 26 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 1 <400> 3 ctatgcggcc gctcatggcg cgcctatacc tgcaggac 38 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 1 <400> 4 gggatcgatg tacgggccag atatacgcg 29 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 1 <400> 5 ctgggatcca taccacattt gtagaggttt tacttg 36 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 1 <400> 6 ttatcaggca ccgggcttgc gggtcatgc 29 <210> 7 <211> 79 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 1 <400> 7 ttatttattg atccttattt attgatcctt atttattgat ccttatttat taaggcccgc 60 cccacgaccc gcagcgccc 79 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 1 <400> 8 gggggatcct gtggaatgtc tctacgttag gg 32 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 1 <400> 9 ggggagctcc agacatgata agatacattg atg 33 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 4 <400> 10 cgctagctga gatctcttcg tgaggctccg 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 4 <400> 11 gtcgacagtc gagccatgtg agcaaaaggc 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 4 <400> 12 gactcgaggc gtatggtgca ctctcagtac 30 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 4 <400> 13 cttcgtacgt ggatccttat cgctatcgat tc 32 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 4 <400> 14 gggcttaagc caccatgacc gagtacaagc ccacg 35 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 4 <400> 15 gcttcgaagg gcgctgcggg tcgtggggcg ggcc 34 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 4 <400> 16 ggttcgaaat gaccgaccaa gc 22 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 4 <400> 17 tcaggcaccg ggcttgcggg tcatgc 26 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 6 <400> 18 gatggcttaa gatgaaaaag cctgaactca ccg 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 6 <400> 19 gtaggttcga atcagttagc ctcccccatc tcc 33 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 6 <400> 20 atcacgcgta ccatggacaa agactg 26 <210> 21 <211> 54 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 6 <400> 21 ttatttattg atccttattt attttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacc 54 <210> 22 <211> 56 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 6 <400> 22 ggatcaataa ataaggatca ataaataatc agttagcctc ccccatctcc cgatcc 56 <210> 23 <211> 56 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 8 <400> 23 ggatcaataa ataaggatca ataaataatc agaagaactc gtcaagaagg cgatag 56 <210> 24 <211> 44 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 10 <400> 24 ggatcaataa ataaggatca ataaataata atcaggcacc gggc 44 <210> 25 <211> 72 <212> DNA <213> The sequence of designed polynucleotide described in Example 10 <400> 25 ggatcaataa ataaggatca ataaataagg atcaataaat aaggatcaat aaataataat 60 caggcaccgg gc 72 <210> 26 <211> 91450 <212> DNA <213> Chinese hamster <400> 26 aagcttggat aaacatggtc tcctggtcat gggagcaact gtgatcacaa agtcacagac 60 cagtgtctcc ctgaagatat tcctatattc ctagggacag gccagccaag ggatagtcag 120 gggtacccat gtgggttaaa aagtaccctc tccatcattt ctggatcctt acaggattct 180 gggctgggga agagatttcg tgaagttgac tttctggagg aaaatcaaca gccggagggg 240 aactgcttta ctccagatct gcaggggagg gcctaaacta gaatccagga acagggtgtc 300 atcacatgtc atcatataag gccttgggac agacttcaaa cactggtcat ctgcttcccg 360 gcaatagctc ttcccaccca ccctaggtcc ttgcaaagag cgaacagagt taacgggaga 420 cgcagcggca tttattaagg tctggcagat gaggtgaagg tggagctagg cataggcaca 480 cctagggcgg ggtgccagag gctcccttgg aggaggtccc cttccgtccc tgcttccacc 540 caacacccac cccagctgcc tcccacctgc tcctgcctcc cagagcacag caccaagaac 600 acaggatccc agctcagggc agagcccagg cttctgtctc ccatggcggg agaagtgggg 660 tgttctggga acccccttgg ccctgctgcc ataataaagt taggaagccc ctttgtctgt 720 ccccagaaca gaacaagcac tggttctctg tggtggggtg gccaagctga acccctgagg 780 gcagaggtga atgacagcaa attcattgct gcctttagac ttgtcctgcc tcactgtcct 840 tcccgaagac tgctttttgg ccgagtctgg ccaggagtaa gatggaataa tgacgatgtg 900 accccagaga cttgtatggg catcaacatg agggcttccc caacgccgaa tctgttgata 960 tgtacatcgg gcagccccac ccatggcaag ggaaagccac tggtacctaa taagaatatc 1020 cacctttgtg gctaaagggc tgagcagggc cagccagttc tgggaggtag gcagggctct 1080 catccaagtg ggacaaaggg actgtgtcct cctcgctgac tggccggtca aactcagcct 1140 tcagagctgg acgctgatta tccgggaagg ccagagagaa cagggcctcg ggctcacaca 1200 caaacttgta cacgtagcgc tcaccagcca cctgtggaga gagggctgtc aggccaacat 1260 gcataccctg cctcagtagg gaatgtagag gatcccgtcc ttctcatagg tcacaaaaac 1320 acaccaggaa ccccttccct tgcttttcca cactggttct tctttaaacc agcacgcttt 1380 ggaacagccc agtcactgtt taacaacttc acagaggaac cttgggtttt ataatttctg 1440 ttcccacaaa cctaagaaac tccctgtctc tccctccctc tctctcttcc tccctccctc 1500 cctcctctta accctccctt gatctctcct catggccatg ctaagacctc agtccgacct 1560 tctgcataat gcctttctca taatagtatc gaagtgaacg gctcagcttg tcatagttca 1620 tggctggcct gttcttctgg atgccccaga gcctggcgac ctagggacaa gagacaaagc 1680 atttgggtgg agatgccatt tccaaggaaa attgggagga aaggagtgga aagagcattt 1740 gagattcttg gtgtaatcta gacttgttac catacaactg actcaggctt ggcaactagg 1800 tcaggcagat ggaggatgcc ggtgaaggca agtgccctgt ttctcctctc aaggctccta 1860 aggtgctgcg gaggaggggt gggaacaacc aagacccacc tcttcaggtt caattagttt 1920 aaactccatc ccccggcctg tccaagcaat gaaatgcgca ttcgttgggt catccagcag 1980 ggccaccaga aactgccaca gttgcaaggc accccggcgc tggtagggtg gcccctcccg 2040 gaaagctcca accccttcct gtttgatgtc tcctgggaaa gtggaaatag gtgtgaggta 2100 catatcccct aaccaacctc cttcccttcc ccgtggggtg tccccaaaac tctttcctga 2160 gagttccgat ctctaccaac aaagaaatgt gattcttaca ggacccagtg tgataggggt 2220 ggagaggccc taaccctccc atgcagtcac ttgtctgacc ttcaaatttt tcagggacaa 2280 tgcagacatc atctgggaat ggtcgaagag atttctcata gccataacct tgtggagaaa 2340 gttggggatt gctcaggact tagggttcac tgattgaaga ccccctagaa tccaaaggaa 2400 ctcctaggtg gagtgactct ccctgacagc aaggaccccc cccaccccaa aattaggagg 2460 ccttagccag gagaggaaga ggcgccttac ctatcacccc atcacctgga gagggccccg 2520 agaagccctc tgggtggagg tacattgatg cacaccctgg gacatctgcg ggaggaaaga 2580 aagggtgacg cgggtaaggg gctggtgagg ctgaggagca ggggaggaag aagccctgca 2640 cacattcaag aaactcatgc ctgctagcct gcagcccaga ctgccctttt cccgccacca 2700 aatgccaggg gaagttcccc cagagggagc tggaagcttg aagctctcgg tttgagggct 2760 gggacgaagg gcacgaggtg ggaagagcac gggggtgggg gggaggtggg gggcagcagc 2820 tggggctagg cagcctgttc cacaaggccc aagattccag ggagcagctg tttcctgtga 2880 gttcagggga aggagggggt gagagatgaa cctccggggg ttgggaaggg ttcggtaaga 2940 cttcctcgga atgggcacat gtccggtcag ccggtcaggt tccaaggcca gtacctctgt 3000 gtctctgtgt ctctctgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgcat gtgtgaacaa gtgagagagg 3060 agcgcagggg gtggagtggg ggccatctag agaaaaggca gcgggcactg ggctgttttt 3120 ttgtttgttt gtttgttttt tcgggtctaa gcggactcta cggcgttccc tgccatagaa 3180 ctgaaagctc ccagctccac ctagggaagg tgactgtgtg aaccacgctt caagtccaac 3240 cccttcccgc cccctccact cccacctatg aatgagccgc tgacacccga cacctcgggg 3300 gtggggggag gcaggaggga gggttcattc atgcctccat tttgtgaatg gaattcctga 3360 ctccattcag gaaagcggag ggaggcgggg aaggagttca agggcaagta acacgatccc 3420 cctccggtct ctagcctttg aaggtcagta actcagagca tctcttccag ccgccacttc 3480 accaggggcg atacagccag gtttgaggaa aggaagcaag cacctatcct gttctccctg 3540 gagcagctgg ggtttcgtgg ttcagccccc gaccaagaaa tactgtgctc atcaggaaaa 3600 gaaaaattct acagttctag actctccctt tctccattta ttttgagaca cggtctctgc 3660 agcccaggct ggcctgaaac tcattatgta gctcaggtta gtcttaaact catggccatc 3720 catctgcccc cacctcctga atgctggcat taatggaaag gcacaaccac agctcagttt 3780 tttgtttttt ttaatagaca ctagtccagg ctagcctttg cgttgctgat cactctgcca 3840 tcacttccca agggcttgga ttacatgggt acacatgttc agctcccttc atagttttaa 3900 gccatttttg tatccttcaa ctgcatactc tagttccagg cacagtactc ttgtcttagt 3960 gggttaatta aaacccctaa acctcaaaca gaagtaaatg ccaacccttt tttattgtat 4020 aagggcaaag gtctatatac cttattattt tatctaaaaa aaaaaaagtg agttgtatta 4080 tgaactgatg tatggaccac agaaaggcac aaaccttcta ggggtctttg cttaacctca 4140 ctgctcatag gagtacttgc cactccaccc tgtcaatccc agaaaaactc ctggaatccc 4200 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ctgtagacca ggctgacctc aaattcacag agatctgcct gcctctgtct cctgagtgct 5100 gggattaaag ggagcaccac cactgccaaa gcaattttgt ttgtttatcg tctttttgag 5160 gtagggtttc tctatgtatc cctggctgtc ctagaactca ctctgtagac caggccggcc 5220 tatgcctccc cagtgctagg aaagtttttt gtttaaagta gggtctcatg taccccgtgg 5280 tggcctcaga ctctccgtat gtagccaaca atgacctcca acgccattct cctcacaagt 5340 gctgagcctg catgcacata atcacccgcc aggtttatgt agtgctgaca gtcaaatcag 5400 gatgtgctcc agaggctagc actctgccag ctcagctaca ttcccagcct ctaggcgaat 5460 tctttttcct ctcctccaaa agggtcttgc tttgtacccc agcttgacct ggacctcccc 5520 atggagcgaa ggctatcctc aaacttacta tcctcctgtc tcaagcacat gccatcatat 5580 ttgtctaagt gacaacctct tagcttgaca acatctctcc aaagcacagc gtaactggtt 5640 tgagtaggac aagggcctcc aagtagaaac tcactgtgct caggtctctc agcacgctgg 5700 gggccatctg tccagtgtgt gctgcctcct gctaatactc acagggaacc ttgctagtac 5760 tacctacagg actaggaaac cctgttagcc acccttcatt gcgccctcag ctcacagccc 5820 cctccccctc aacaaagcct tgacctcctg acaccttgcc ccagacttca ccacacccac 5880 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34 gggctcgaga actacagaca tcaccaacca aagc 34 <210> 35 <211> 31 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example13 <400> 35 cccggtacct ccccgaggac tattacggtt c 31 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example13 <400> 36 gggctcgaga tgaaattcct cctctgtatt cgaaag 36 <210> 37 <211> 38 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example13 <400> 37 cccggtaccg aatcattcac tttttttttt tttaactg 38 <210> 38 <211> 38 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example13 <400> 38 gggctcgagc aaagttaata gaaatactgt tttaaagc 38 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example14 <400> 39 cgccctatag tgagtcgtat tacgcg 26 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example14 <400> 40 atgacaatga tgattatgat tttatg 26 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example14 <400> 41 cattgtcagt atcagcctct cctgg 25 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example14 <400> 42 cttctggttt ctggttcccc ctgc 24 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example14 <400> 43 agctagtata tcacatgcca catc 24 <210> 44 <211> 29 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example14 <400> 44 gtacgggcca gatatacgcg ttgacattg 29 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example15 <400> 45 cagactacat agttagtgcc aaacc 25 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example15 <400> 46 cagtgatgac aataggcaac ctcc 24 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example15 <400> 47 gctctcacag gataaggagg gtcg 24 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example15 <400> 48 ctgagtagca gccttcctgc ctgg 24 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example15 <400> 49 tcaaaccgta tgacttggct ctgag 25 <210> 50 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example16 <400> 50 tagtccacta gtctccccga ggactattac ggttc 35 <210> 51 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example16 <400> 51 acggacagat ctgctctcac aggataagga gggtc 35 <210> 52 <211> 34 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example16 <400> 52 gtggactcga gctccccgag gactattacg gttc 34 <210> 53 <211> 34 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example16 <400> 53 gtggacgtac ggctctcaca ggataaggag ggtc 34 <210> 54 <211> 30 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example16 <400> 54 gtcccccggg ccgtccgcac cctcgccgcc 30 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example16 <400> 55 ggcggcgagg gtgcggacgg cccgggggac 30 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example23 <400> 56 gttaggccag cttggcactt gatg 24 <210> 57 <211> 37 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example23 <400> 57 cccggatcca taccacattt gtagaggttt tacttgc 37 <210> 58 <211> 44 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example30 <400> 58 gagcagatct gcatgcacta gtcttcgtga ggctccggtg cccg 44 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example30 <400> 59 ccagtttcac atcacactgg acac 24 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example30 <400> 60 gccacctctg acttgagcgt cg 22 <210> 61 <211> 44 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example30 <400> 61 cgcgtactag taagcatgcc cattcgccat tcaggctgcg caac 44 <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example33 <400> 62 cagctccagg agagtttgac ccttc 25 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example33 <400> 63 acccagaagc tccaagagga gggca 25 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example33 <400> 64 accggggcct gggcaacctc ctgcc 25 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example33 <400> 65 gacccacaag caggggattg cccag 25 <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example33 <400> 66 cgatcctgag gccaagacac cc 22 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example33 <400> 67 aaggcagccc taaagagacc agg 23 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example33 <400> 68 cagcttggtg accctggatg tcttc 25 <210> 69 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example33 <400> 69 tgctaagagt aactcaaacc gtatg 25 <210> 70 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 70 ggattcttct gacacaacag tctcg 25 <210> 71 <211> 26 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 71 agctttttgc aaaagcctag gcctcc 26 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 72 ggacccggac cgccacatcg agcg 24 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 73 acggtgtggc gcgtggcggg gtag 24 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 74 gtcccccgcg ccgtccgcac cctcgccgcc 30 <210> 75 <211> 28 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 75 gtcgtcgcgg gtggcgaggc gcaccgtg 28 <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 76 ctgatgcggt attttctcct tacg 24 <210> 77 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 77 ccattcgcca ttcaggctgc gcaac 25 <210> 78 <211> 37 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 78 attcaggact agtcttcgtg aggctccggt gcccgtc 37 <210> 79 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 79 tctcagctag cagtcgagcc atgtgagcaa aaggc 35 <210> 80 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 80 tctagatgat cattcccttt agtgagggtt aatgc 35 <210> 81 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 81 cgtacgaagc ttttcacgac acctgaaatg gaaga 35 <210> 82 <211> 38 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 82 agcttcgtac gcccgggacg cgtcaggcgg ccgcaagt 38 <210> 83 <211> 38 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 83 ctagacttgc ggccgcctga cgcgtcccgg gcgtacga 38 <210> 84 <211> 34 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 84 agtaagctag cctccccgag gactattacg gttc 34 <210> 85 <211> 59 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 85 cgtccgaatt cggtcagtcg acctcagatc tgctctcaca ggataaggag ggtcgggag 59 <210> 86 <211> 34 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example34 <400> 86 gtgaggatcc gctctcacag gataaggagg gtcg 34 <210> 87 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example35 <400> 87 cagttcgtac gaccatggac aaagactgcg aaatg 35 <210> 88 <211> 39 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example37 <400> 88 agatctgagg tcgaccttcg tgaggctccg gtgcccgtc 39 <210> 89 <211> 26 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example37 <400> 89 gtcgagccat gtgagcaaaa ggccag 26 <210> 90 <211> 39 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example37 <400> 90 gaattcagga ctagtcagta caatctgctc tgatgccgc 39 <210> 91 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example37 <400> 91 ccattcgcca ttcaggctgc gcaac 25 <210> 92 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example41 <400> 92 cagagctagc ccattcgcca ttcaggctgc gcaac 35 <210> 93 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example41 <400> 93 gtcggacaga attcgctctc acaggataag gaggg 35 <210> 94 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example49 <400> 94 acgctggctg gcacgtttgt gttac 25 <210> 95 <211> 26 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example49 <400> 95 tgagcaccta cgaggtgtca aaggtc 26 <210> 96 <211> 25 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example49 <400> 96 tggcaaagag gaaaatatat gttcc 25 <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example49 <400> 97 cttagccaaa ccactgtcag ctgc 24 <210> 98 <211> 28 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example50 <400> 98 gcctccacca agggcccatc ggtcttcc 28 <210> 99 <211> 28 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example50 <400> 99 tcatttaccc ggagacaggg agaggctc 28 <210> 100 <211> 40 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example51 <400> 100 cgcaggtcta gaagctcagc tagcaccaag ggcccatcgg 40 <210> 101 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example51 <400> 101 gtccgtgatc atcatttacc cggagacagg gagag 35 <210> 102 <211> 28 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example51 <400> 102 ggccgcagga ctagtcttcg tgaggctc 28 <210> 103 <211> 28 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example51 <400> 103 gctgtcagtc gacctcagat ctgctctc 28 <210> 104 <211> 31 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example51 <400> 104 tcgttagctc agctagcacc aagggcccat c 31 <210> 105 <211> 29 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example51 <400> 105 attcgaacgt acgaagcttt tcacgacac 29 <210> 106 <211> 75 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example51 <400> 106 gtacggccac catgaaacac ctgtggttct tcctcctgct ggtggcagct cccagatggg 60 tcctgtccca ggtgg 75 <210> 107 <211> 75 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example51 <400> 107 aattccacct gggacaggac ccatctggga gctgccacca gcaggaggaa gaaccacagg 60 tgtttcatgg tggcc 75 <210> 108 <211> 28 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example52 <400> 108 atcaaacgaa ctgtggctgc accatctg 28 <210> 109 <211> 29 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example52 <400> 109 ctaacactct cccctgttga agctctttg 29 <210> 110 <211> 27 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example53 <400> 110 tcccgggacg cgtcaggcgg ccgcaag 27 <210> 111 <211> 24 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example53 <400> 111 gtacgtagct tttcacgaca cctg 24 <210> 112 <211> 47 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example53 <400> 112 tgcaggtcta gaaccaagct tgaaatcaaa cgtacggtgg ctgcacc 47 <210> 113 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example53 <400> 113 gtcaggtgat cactaacact ctcccctgtt gaagc 35 <210> 114 <211> 28 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example53 <400> 114 ccgcaggact agtcagtaca atctgctc 28 <210> 115 <211> 26 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example53 <400> 115 ccgcccattc gccattcagg ctgcgc 26 <210> 116 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example53 <400> 116 ccagatatct ggaagcttga aatcaaacgt acggt 35 <210> 117 <211> 34 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example53 <400> 117 acgcgtgaat tcttcacgac acctgaaatg gaag 34 <210> 118 <211> 74 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example53 <400> 118 cgcgtgccac catggtgttg cagacccagg tcttcatttc tctgttgctc tggatctctg 60 gtgcctacgg ggat 74 <210> 119 <211> 70 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example53 <400> 119 atccccgtag gcaccagaga tccagagcaa cagagaaatg aagacctggg tctgcaacac 60 catggtggca 70 <210> 120 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example54 <400> 120 gcaggtgcta gctgaggaga cggtgaccgt ggtcc 35 <210> 121 <211> 35 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example54 <400> 121 gactggcgta cgtctgattt ccagcttggt gcctc 35 <210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example55 <400> 122 tgagatctga ggtcgactga cagc 24 <210> 123 <211> 23 <212> DNA <213> The sequence of primer used in Example55 <400> 123 actagcagtc gagccatgtg agc 23

Claims (28)

  1. mRNA 불안정화 서열을 포함하는 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트, 적어도 1개의 유전자 발현 안정화 엘리먼트, 및 목적 단백질의 유전자 발현 카세트를 갖는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, mRNA 불안정화 서열이 사이토카인, 인터루킨 또는 암원 유전자의 3' 비번역 영역에 존재하는 AT 리치 서열에서 유래하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  3. 제1항에 있어서, mRNA 불안정화 서열이 TTATTTA(A/T)(A/T)의 모티프 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 모티프 서열이 2회 이상 반복되어 있는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 모티프 서열의 반복 사이에 1 염기 이상의 스페이서 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 불안정화 서열 중에 1 내지 수 염기의 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 차이니즈 햄스터 게놈 유래인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 이하의 (a) 내지 (h) 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
    (a) 서열 번호 26으로 나타내는 서열로 이루어지는 DNA;
    (b) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41820번째부터 41839번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 포함하는 DNA;
    (c) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41821번째부터 41840번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 포함하는 DNA;
    (d) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 45182번째부터 45200번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 포함하는 DNA;
    (e) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 91094번째부터 91113번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 포함하는 DNA;
    (f) 서열 번호 26으로 나타내는 서열의 부분 서열로 이루어지는 DNA로서, 숙주 세포 중에서 외래 유전자 발현 카세트와 근접하도록 배치되었을 때에 외래 유전자 발현 카세트에 포함되는 외래 유전자로부터의 목적 재조합 단백질의 발현을 증대 또는 안정화시킬 수 있는 DNA; 및
    (g) 상기 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 유전자 발현 안정화 기능을 갖는 DNA
    (h) 상기 (a) 내지 (g) 중 어느 하나의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA
  9. 제8항에 있어서, 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 이하의 (i) 내지 (k) 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
    (i) 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41601번째부터 46746번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 포함하는 DNA;
    (j) (i)의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 유전자 발현 안정화 기능을 갖는 DNA; 및
    (k) 상기 (i) 또는 (j)의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA
  10. 제9항에 있어서, 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 이하의 (l) 내지 (n) 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
    (l) 서열 번호 26으로 나타내는 서열 중 41601번째부터 42700번째까지의 염기로 나타내는 영역의 서열을 포함하는 DNA;
    (m) (l)의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 유전자 발현 안정화 기능을 갖는 DNA; 및
    (n) (l) 또는 (m)의 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 상류에 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 목적 단백질의 유전자 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현 안정화 엘리먼트가 목적 단백질의 유전자 발현 카세트 및 약제 선택 마커 유전자 발현 카세트의 상류 및 하류의 양쪽에 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 약제 선택 마커 유전자가 단백질 합성 저해계 항생 물질 내성 유전자인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 약제 선택 마커 유전자가 퓨로마이신-N-아세틸트랜스페라제, 하이그로마이신-B-포스포트랜스페라제 및 네오마이신포스포트랜스페라제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 단백질의 유전자 발현 카세트가 원하는 목적 단백질 유전자를 삽입하기 위한 멀티 클로닝 사이트를 구비하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 단백질이 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 단백질의 유전자 발현 카세트가 항체의 경쇄의 정상 영역 유전자를 포함하는 항체 유전자 발현 카세트 및/또는 항체의 중쇄의 정상 영역 유전자를 포함하는 항체 유전자 발현 카세트인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 형질 전환 세포.
  20. 제19항에 있어서, 숙주 세포가 동물 세포인 것을 특징으로 하는 형질 전환 세포.
  21. 제20항에 있어서, 동물 세포가 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 형질 전환 세포.
  22. 제21항에 있어서, 포유류 세포가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인 것을 특징으로 하는 형질 전환 세포.
  23. 제22항에 있어서, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포가 무혈청 순화되어 있는 것을 특징으로 하는 형질 전환 세포.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항의 형질 전환 세포를 약제 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 세포군을 선별하는 방법.
  25. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항의 형질 전환 세포로 이루어지는 세포군이며, 목적 단백질 유전자를 고레벨로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포군.
  26. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항의 형질 전환 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는, 단백질을 생산하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 단백질이 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 단백질이 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
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