JP2011152124A - 抗体高生産性細胞の樹立のための発現ベクター及び抗体高生産性細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 mRNA不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、少なくとも1つの遺伝子発現安定化エレメント、並びに抗体の軽鎖の定常領域遺伝子を含む抗体遺伝子発現カセット及び/又は抗体の重鎖の定常領域遺伝子を含む抗体遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
【選択図】 図76
Description
(1) mRNA不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、少なくとも1つの遺伝子発現安定化エレメント、及び抗体の軽鎖の定常領域遺伝子を含む抗体遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
(2) mRNA不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、少なくとも1つの遺伝子発現安定化エレメント、及び抗体の重鎖の定常領域遺伝子を含む抗体遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
(3) mRNA不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、少なくとも1つの遺伝子発現安定化エレメント、並びに抗体の軽鎖の定常領域遺伝子を含む抗体遺伝子発現カセット及び抗体の重鎖の定常領域遺伝子を含む抗体遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
(4) mRNA不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の3’非翻訳領域に存在するATリッチ配列に由来することを特徴とする(1)〜(3)のいずれか一に記載の発現ベクター。
(5) mRNA不安定化配列が、TTATTTA(A/T)(A/T)のモチーフ配列を有することを特徴とする(1)〜(4)のいずれか一に記載の発現ベクター。
(6) モチーフ配列が、2回以上繰り返されていることを特徴とする(5)に記載の発現ベクター。
(7) モチーフ配列の繰り返し間に1塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする(6)に記載の発現ベクター。
(8) mRNA不安定化配列中に1ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする(4)〜(7)のいずれか一に記載の発現ベクター。
(9) 遺伝子発現安定化エレメントがチャイニーズハムスターゲノム由来であることを特徴とする(1)〜(8)のいずれか一に記載の発現ベクター。
(10) 遺伝子発現安定化エレメントが、以下の(a)〜(c)のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなることを特徴とする(9)に記載の発現ベクター。
(a)配列番号26で示す配列のうち41601番目から46746番目までの塩基で示す領域の配列を含むDNA;
(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有するDNA;及び
(c)前記(a)又は(b)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNA
(11) 遺伝子発現安定化エレメントが、以下の(d)〜(f)のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなることを特徴とする(10)に記載の発現ベクター。
(d)配列番号26で示す配列のうち41601番目から42700番目までの塩基で示す領域の配列を含むDNA;
(e)(d)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有するDNA;及び
(f)(d)又は(e)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNA
(12) 薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子であることを特徴とする(1)〜(11)のいずれか一に記載の発現ベクター。
(13) 薬剤選択マーカー遺伝子が、ピューロマイシン−N−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ、及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択されることを特徴とする(12)に記載の発現ベクター。
(14) 抗体の軽鎖及び/又は重鎖の定常領域遺伝子がマウス由来であることを特徴とする(1)〜(13)のいずれか一に記載の発現ベクター。
(15) 抗体の軽鎖及び/又は重鎖の定常領域遺伝子がヒト由来であることを特徴とする(1)〜(13)のいずれか一に記載の発現ベクター。
(16) 抗体の軽鎖の定常領域遺伝子がCκであることを特徴とする(14)又は(15)に記載の発現ベクター。
(17) 抗体の重鎖の定常領域遺伝子がCγ1であることを特徴とする(14)〜(16)のいずれか一に記載の発現ベクター。
(18) (1)〜(17)のいずれか一に記載の発現ベクターに、抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変領域遺伝子を挿入する工程を含むことを特徴とする、抗体の重鎖及び/又は軽鎖を発現する発現ベクターを作製する方法。
(19) 抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変領域遺伝子が挿入された(1)〜(17)のいずれか一に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られることを特徴とする形質転換細胞。
(20) 宿主細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする(19)に記載の形質転換細胞。
(21) 哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞であることを特徴とする(20)に記載の形質転換細胞。
(22) (19)〜(21)のいずれか一に記載の形質転換細胞を薬剤選択する工程を含むことを特徴とする、抗体遺伝子を高レベルで発現する細胞群を選別する方法。
(23) (19)〜(21)のいずれか一に記載の形質転換細胞からなる細胞群であって、抗体遺伝子を高レベルで発現することを特徴とする細胞群。
(24) (19)〜(21)のいずれか一項に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、抗体分子を生産する方法。
また、本発明では、遺伝子発現安定化エレメントを利用することにより、選別した細胞の継続培養時の遺伝子発現量の低下を防止している。本発明による遺伝子発現安定化エレメントは、目的タンパク質の発現の安定的維持のみならず、薬剤耐性遺伝子に効果を示す場合には、薬剤耐性遺伝子の発現に対する隣接染色体や調節エレメントの影響を低減させ、薬剤耐性遺伝子本来の機能を発揮する助けとなり、薬剤選択との相乗効果を示すものともなる。
本発明で使用する薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットは、mRNA不安定化配列を有することを除いては、従来公知の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットと同様の構成を有する。そこで、まず、mRNA不安定化配列について説明する。
本発明は、mRNA不安定化配列が極めて効果的に薬剤耐性遺伝子の発現を減弱化することができることを見出したことに基づくものである。本発明のmRNA不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを搭載した発現ベクターを宿主細胞へ遺伝子導入した場合、mRNA不安定化配列を含まない場合と比較して、薬剤選択後の生存細胞数、あるいはそのコロニーは1/10〜1/100に減少する。これはmRNA不安定配列の存在により薬剤選択マーカーのmRNAが不安定化し、薬剤選択マーカーの発現量が下がるため、宿主細胞のゲノム中で転写活性の高い高発現領域に当該発現カセットが組み込まれた細胞でなければ薬剤選択下での生存が困難になるためと考えられる。
本発明における「遺伝子発現安定化エレメント」とは、目的タンパク質、とりわけ抗体の生産性を高めるために、抗体遺伝子発現カセットが宿主ゲノムに挿入された部位近傍のゲノムの転写の活性化の状況に影響を受けてしまう、という位置効果を解消し、遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸領域を意味する。
(a)配列番号26で示す配列からなるDNA;
(b)配列番号26で示す配列の部分配列からなるDNAであって、配列番号26で示す配列のうち41820番目から41839番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むDNA;
(c)配列番号26で示す配列の部分配列からなるDNAであって、配列番号26で示す配列のうち41821番目から41840番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むDNA;
(d)配列番号26で示す配列の部分配列からなるDNAであって、配列番号26で示す配列のうち45182番目から45200番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むDNA;及び
(e)配列番号26で示す配列の部分配列からなるDNAであって、配列番号26で示す配列のうち91094番目から91113番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むDNA。
本発明における発現カセットは、プロモーター、遺伝子コード配列、及びターミネーター配列(ポリアデニレーションシグナル)からなる。加えて、イントロンやスペーサー配列、翻訳増強領域を含むこともある。抗体遺伝子の発現プロモーターとしてはできるだけ転写活性の高いものが好ましく、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、サルウイルス40(SV40)プロモーターなどのウイルスに由来するものや、ヒトやマウス、さらにはCHO由来のElongation Factor 1α(EF1α)遺伝子、ユビキチン遺伝子、β−アクチン遺伝子など、非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーター/エンハンサーのハイブリッド、例えばCAGプロモーターなどが挙げられる。
本発明において、発現ベクターとは、遺伝子工学に利用されるベクターである。発現ベクターは、プラスミドベクターであることができる。しかし、これに限らず、例えば、ウイルスベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)及び他の非プラスミドベクターも使用できる。
(1)pBS−CMV−SNAPm−Pur及びpBS−CMV−SNAPm−Pur・N4の構築
図1に示すスキームに従って、プラスミドpBS−CMV−SNAPm2を構築した。即ち、まずEmerald Lucベクター(pELuc−test)(東洋紡績社製)の制限酵素ClaI、EcoRIサイトにCMVプロモーター(配列番号1)が導入されたpELuc−CMVプラスミドから制限酵素EcoRI、NotIでEmerald Luc(ELuc)遺伝子を切出した。一方、SNAPm発現プラスミドpSNAPm(Covalys社製)からSNAP26m遺伝子を配列番号2,3のプライマーを用いてPCRで増幅し、pELuc−CMVプラスミドの制限酵素EcoRI、NotIサイトに導入してpSNAP26m−CMVを構築した。続いて、pSNAP26m−CMVより、CMVプロモーター/SNAP26m/SV40 polyAを配列番号4,5のプライマーを用いてPCRで増幅し、部分消化によって、プラスミドpBluescript II KS(−)(ストラタジーン社製)の制限酵素ClaI、BamHIサイトへ導入し、プラスミドpBS−CMV−SNAPm2を構築した。
CHO−K1細胞(理研バイオリソースセンター、No.RCB0285)を1×105cells/mlに調整し、12ウェルプレートに2mlずつ前日に播種し、一晩培養して、トランスフェクション用のCHO−K1細胞を準備した。この際、培地として10%牛胎児血清を添加したHam’s F12培地(日水製薬社製)を使用した。
(1)pBS−CMV−SNAPm−Pur及びpBS−CMV−SNAPm−Pur・N4の細胞導入(2)
つづいて、実施例2同様に遺伝子導入を行い、9μg/ml Puromycinを含むHam’s F12+10%FBS培地中で2週間選択培養を行った。ここで形成されたコロニーを顕微鏡下でピペットの先でpBS−CMV−SNAPm−Purについては48クローン、pBS−CMV−SNAPm−Pur・N4については20クローンをかきとり、12ウェルプレートに播種した。増殖が認められた、それぞれ36クローン、10クローンについて、実施例2と同様にSNAP−Cell−505で標識処理をし、FACS解析を実施した。
(1)pEF1α−SNAP26m−Pur・N4及びpEF1α−SNAP26m−Pur−RE2の構築
次に、目的遺伝子発現カセットのプロモーターをEF1αプロモーターに置換した場合も、上述と同様の効果が認められるか検討するため、プラスミドを構築した。本実験では、図9に示すスキームに従って構築されたプラスミドpEF1α−KOD3G8HC−RE2を利用した。即ち、まず、CMVプロモーターをEF−1αプロモーターに置換したpCI−neoプラスミド(プロメガ社製)の制限酵素XbaI−NotIサイトに抗KOD抗体の重鎖を挿入したプラスミドのpEF1α−KOD3G8HCを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号10、11のプライマーを使って発現カセット上流に制限酵素SalIおよびNheIサイトを付加したpEF1α−KOD3G8HC−REを構築した。なお、抗KOD抗体の重鎖としては、Thermococcus kodakaraensis KOD1株由来のDNAポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系3G8(入手先:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号:FERM BP−6056)から得られた抗体のものを使用した。更に本プラスミドを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号12、13のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素BsiWIおよびXhoIサイトを付加した構築されたプラスミドがpEF1α−KOD3G8HC−RE2である。
実施例2に記載の方法でトランスフェクション用のCHO−K1細胞を準備した。一方、実施例4で構築したSNAP26m発現コンストラクトを制限酵素AhdI(New England Biolabs社製)でリニアライズ(直鎖状化)した。トランスフェクションは、3μl GeneJuice Transfection Reagentを100μl Opti−MEM I Reduced−Serum Mediumで希釈した後、前記のリニア化したプラスミド1μgを加え、10分間放置した後、この混合液を前記CHO−K1細胞に加え、24時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、5、7.5、あるいは10μg/ml Puromycinをそれぞれ含むHam’s F12+10%FBS培地中で1週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例2に記載の方法で、細胞集団のSNAP26mの発現強度を解析した。
(1)pEF1α−SNAP26m−Hyg‐RE2及びpEF1α−SNAP26m−Hyg・N4の構築
ハイグロマシン耐性遺伝子を用いた場合もmRNA不安定化因子の効果が認められるか検討するため、プラスミドを構築した。この構築には、図13に示すスキームに従って構築されたプラスミドpEF1α−KOD3G8LC−Hyg−RE2を利用した。即ち、まず、CMVプロモーターをEF1αプロモーターに変更したpCI−neoプラスミドの制限酵素XbaI−NotIサイトに抗KOD抗体の軽鎖を挿入したプラスミドのpEF1α−KOD3G8LCを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号10、11のプライマーを使って発現カセット上流に制限酵素SalIおよびNheIサイトを付加したpEF1α−KOD3G8LC−REを構築した。なお、抗KOD抗体の軽鎖としては、Thermococcus kodakaraensis KOD1株由来のDNAポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系3G8(入手先:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号:FERM BP−6056)から得られた抗体のものを使用した。更に本プラスミドを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号12、13のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素BsiWIおよびXhoIサイトを付加して構築されたプラスミドがpEF1α−KOD3G8LC−RE2である。
実施例2に記載の方法でトランスフェクション用のCHO−K1細胞を準備した。一方、実施例6で構築したSNAP26m発現コンストラクトを制限酵素AhdIでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例5に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、800μg/mlハイグロマイシン HygroGold(InvivoGen社製)を含むHam’s F12+10%FBS培地中で1週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例2に記載の方法で、細胞集団のSNAP26mの発現強度を解析した。
(1)pEF1α−SNAP26m−Neo・N4の構築
ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合もmRNA不安定化因子の効果が認められるか検討するため、図17に示すスキームに従って、プラスミドpEF1α−SNAP26m−Neo・N4を構築した。即ち、実施例4に記載のpEF1α−SNAP26m−Neo−RE2を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号21、23のプライマーを使ってネオマイシン耐性遺伝子下流にN4配列を付加したpEF1α−SNAP26m−Neo・N4を構築した。
実施例2に記載の方法でトランスフェクション用のCHO−K1細胞を準備した。一方、pEF1α−SNAP26m−Neo−RE2及びpEF1α−SNAP26m−Neo・N4を制限酵素AhdIでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例5に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、1mg/mlジェネティシン G418(ナカライテスク社製)を含むHam’s F12+10%FBS培地中で1週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例2に記載の方法で、細胞集団のSNAP26mの発現強度を解析した。
図20に示すスキームに従って、プラスミドpEF1α−SNAP26m−Pur・N2、pEF1α−SNAP26m−Pur・N6およびpEF1α−SNAP26m−Pur・N8を構築した。実施例4に記載のpEF1α−SNAP26m−Pur・N4を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号16、24のプライマーを使ってPuromycin耐性遺伝子の下流にN2配列(ARE配列モチーフTTATTTATTの2回繰り返し配列)を付加したプラスミドpEF1α−SNAP26m−Pur・N2を構築した。また、同様の方法で、配列番号7、24のプライマーを使ってPuromycin耐性遺伝子の下流にN6配列(ARE配列モチーフTTATTTATTの6回繰り返し配列)を付加したプラスミドpEF1α−SNAP26m−Pur・N6を構築し、配列番号7、25のプライマーを使ってPuromycin耐性遺伝子の下流にN8配列(ARE配列モチーフTTATTTATTの8回繰り返し配列)を付加したプラスミドpEF1α−SNAP26m−Pur・N8を構築した。
CHO細胞DR1000L−4N株(CHO細胞−4N株)より作成されたBACライブラリーのうち、hGM−CSF発現カセットを含むクローンCg0031N14を単離した。このクローンCg0031N14に由来するBACより作成したショットガンクローンの5’,3’ワンパスシーケンスを実施し、Phred/Phrap/Consedによる配列情報のアッセンブルを行い、hGM−CSF発現カセットが導入されたCHO細胞の近傍のゲノム配列約91kbpの配列を決定した。この配列を、配列表の配列番号26に示す。
前記決定された核酸配列中にインスレーター配列が存在するかどうかを、インスレーター結合タンパク質CTCFの結合配列モチーフを検索することによって調査した。解析ツールとしてIn silico CTCFBS prediction tool(http://insulatordb.utmem.edu/)(非特許文献11)を使用した。前記ツールで抽出されたモチーフ配列を表1及び図23に示す。
実施例1の途中で構築されたpSNAP26m−CMVより、CMVプロモーター/SNAP26m/SV40 polyAを配列番号27,28のプライマーを用いてPCRで増幅し、部分消化によって、プラスミドpBluescript II SK(−)の制限酵素BamHI、SacIサイトへ導入し、プラスミドpBS−CMV−SNAPmを構築した(図24)。
前記で発現の上昇が最も高かったコンストラクトCHO5をもとに、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号39、40のプライマーを使って被験配列41601−42902位をデリーションしたCHO5Δ5を、配列番号41,42のプライマーを使って42903−44200位をデリーションしたCHO5ΔMを、配列番号43、44のプライマーを使って44201−46746位をデリーションしたCHO5Δ3を構築した(図28)。
配列番号44〜49のプライマーを使用し、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、CHO5Δ3の被験配列の3’がさらにデリーションされたSNAPm発現コンストラクトを構築した(図30及び表3)。
(1)pEF1α−SNAP26m−Pur−1.1k/1.1k及びpEF1α−SNAP26m−Pur・N4−1.1k/1.1kの構築
次に、ピューロマイシン耐性遺伝子で、N4配列と実施例15で遺伝子発現安定化能の認められたCHO5Δ3−3との組合せ効果を検討するため、プラスミドを構築した。本実験では図32に記載のpEF1α−KOD3G8HC−1.1k/1.1kを利用した。即ち、まず、実施例4の途中で構築されたpEF1α−KOD3G8HC−RE2の発現カセット上流の制限酵素NheI、BglIIサイトに配列番号50、51のプライマーセットを使ってPCRで増幅した被検配列CHO5Δ3−3(以下、コンストラクト中では1.1kと表記)を挿入して、プラスミドpEF1α−KOD3G8HC−1.1kを構築した。更にプラスミドpEF1α−KOD3G8HC−1.1kの発現カセット下流の制限酵素BsiWI、XhoIサイトに配列番号52、53のプライマーセットを使ってPCRで増幅した被検配列CHO5Δ3−3を挿入して構築されたプラスミドがpEF1α−KOD3G8HC−1.1k/1.1kである。
実施例2に記載の方法でトランスフェクション用のCHO−K1細胞を準備した。一方、実施例4および16で構築したSNAP26m発現コンストラクトを制限酵素AhdIでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例5に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、それぞれ5、7.5、10μg/ml Puromycinを含むHam’s F12+10%FBS培地中で1週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例2に記載の方法で、細胞集団のSNAP26mの発現強度を解析した。
(1)pEF1α−SNAP26m−Hyg−1.1k/1.1k及びpEF1α−SNAP26m−Hyg・N4−1.1k/1.1kの構築
次に、ハイグロマイシン耐性遺伝子で、N4配列と実施例15で遺伝子発現安定化能の認められたCHO5Δ3−3との組合せ効果を検討するため、図36に示すスキームに従って、pEF1α−SNAP26m−Hyg・N4−1.1k/1.1k及びpEF1α−SNAP26m−Hyg−1.1k/1.1kを構築した。即ち、pEF1α−SNAP26m−Hyg・N4、pEF1α−SNAP26m−Hyg−RE2から制限酵素MluI、BsiWIで、SNAPm−pA−SV40 プロモーター−Hyg・N4−pA、SNAP26m−pA−SV40 プロモーター−Hyg−pAを切出し、pEF1α−KOD3G8HC−1.1k/1.1kの制限酵素MluI、BsiWIサイトに導入してpEF1α−SNAP26m−Hyg・N4−1.1k/1.1k、pEF1α−SNAP26m−Hyg−1.1k/1.1kを構築した。
実施例2に記載の方法でトランスフェクション用のCHO−K1細胞を準備した。一方、実施例6および18で構築したSNAP26m発現コンストラクトを制限酵素AhdIでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例5に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、800μg/ml HygroGoldを含むHam’s F12+10%FBS培地中で1週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例2に記載の方法で、細胞集団のSNAP26mの発現強度を解析した。
(1)pEF1α−SNAP26m−Neo−1.1k/1.1k及びpEF1α−SNAP26m−Neo・N4−1.1k/1.1kの構築
次に、ネオマイシン耐性遺伝子で、N4配列と実施例15で遺伝子発現安定化能の認められたCHO5Δ3−3との組合せ効果を検討するため、図39に示すスキームに従って、pEF1α−SNAP26m−Neo・N4−1.1k/1.1k及びpEF1α−SNAP26m−Neo−1.1k/1.1kを構築した。即ち、pEF1α−SNAP26m−Neo・N4、pEF1α−SNAP26m−Neo−RE2から制限酵素EcoRI、BsiWIで、SNAP26m−pA−SV40 プロモーター−Neo・N4−pA、SNAP26m−pA−SV40 プロモーター−Neo−pAを切出し、pEF1α−KOD3G8HC−1.1k/1.1kの制限酵素coRI、BsiWIサイトに導入してpEF1α−SNAP26m−Neo・N4−1.1k/1.1k、pEF1α−SNAP26m−Neo−1.1k/1.1kを構築した。
実施例2に記載の方法でトランスフェクション用のCHO−K1細胞を準備した。一方、実施例8および20で構築したSNAP26m発現コンストラクトを制限酵素AhdIでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例5に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、1mg/mlジェネティシン G418を含むHam’s F12+10%FBS培地中で1週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例2に記載の方法で、細胞集団のSNAP26mの発現強度を解析した。
図42に示すスキームに従って、プラスミドpEF1α−SNAP26m−Pur・N2−1.1k/1.1k、pEF1α−SNAP26m−Pur・N6−1.1k/1.1kおよびpEF1α−SNAP26m−Pur・N8−1.1k/1.1kを構築した。まず、実施例10で構築したプラスミドpEF1α−SNAP26m−Pur・N2、pEF1α−SNAP26m−Pur・N6およびpEF1α−SNAP26m−Pur・N8を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号54、55のプライマーを使ってPuromycin耐性遺伝子内に存在する制限酵素BsiWIサイトを削除したプラスミドpEF1α−SNAP26m−Pur2・N2、pEF1α−SNAP26m−Pur2・N6およびpEF1α−SNAP26m−Pur2・N8を構築した。続いて、pEF1α−SNAP26m−Pur2・N2、pEF1α−SNAP26m−Pur2・N6およびpEF1α−SNAP26m−Pur2・N8から制限酵素EcoRI、BsiWIで、SNAP26m−pA−SV40 プロモーター−Pur2・N2−pA、SNAP26m−pA−SV40 プロモーター−Pur2・N6−pA、SNAP26m−pA−SV40 プロモーター−Pur2・N8−pAを切出し、pEF1α−KOD3G8HC−1.1k/1.1kの制限酵素EcoRI、BsiWIサイトに導入してpEF1α−SNAP26m−Pur・N2−1.1k/1.1k、pEF1α−SNAP26m−Pur・N6−1.1k/1.1k、pEF1α−SNAP26m−Pur・N8−1.1k/1.1kを構築した。
(1)pEF1α−KOD3G8HC−Neo・N4−1.1k/1.1kの構築
抗体生産系における、mRNA不安定化配列(N4配列)と実施例15で遺伝子発現安定化能の認められた遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3との組合せ効果の検討に用いるため、図45に示すスキームに従って、pEF1α−KOD3G8HC−Neo・N4−1.1k/1.1kを構築した。抗体遺伝子は、サーモコッカス・コダカラエンシス(Thermococcus kodakaraensis)KOD1株由来のDNAポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系3G8(入手先:産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託番号:FERM BP−6056)から得られる抗体(抗KOD抗体)の遺伝子を用いた。
抗体生産系における、N4配列と実施例15で遺伝子発現安定化能の認められたCHO5Δ3−3との組合せ効果の検討に用いるため、図46に示すスキームに従って、pEF1α−KOD3G8LC−Hyg−1.1k/1.1kを構築した。即ち、まず、実施例6の途中で構築されたpEF1α−KOD3G8LC−Hyg−RE2の発現カセット上流の制限酵素NheI、BglIIサイトに配列番号50、51のプライマーセットを使ってPCRで増幅した遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3(以下、コンストラクト中では1.1kと表記)を挿入して、プラスミドpEF1α−KOD3G8LC−Hyg−1.1kを構築した。更にプラスミドpEF1α−KOD3G8LC−1.1kの発現カセット下流の制限酵素BsiWI、XhoIサイトに配列番号52、53のプライマーセットを用いてPCRで増幅した遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を挿入して、pEF1α−KOD3G8LC−Hyg−1.1k/1.1kを構築した。
抗体生産系における、N4配列と実施例15で遺伝子発現安定化能の認められたCHO5Δ3−3との組合せ効果の検討に用いるため、図47に示すスキームに従って、pEF1α−KOD3G8LC−Hyg・N4−1.1k/1.1kを構築した。即ち、実施例18に記載のpEF1α−SNAP26m−Hyg・N4−1.1k/1.1kを制限酵素MluI、NotIで処理し、SNAP26m遺伝子を切出した。一方、実施例6に記載のpEF1α−KOD3G8LCから配列番号56,57のプライマーを用いてPCRで増幅し、制限酵素MluI、NotIで処理して、調製した抗KOD抗体の軽鎖遺伝子を、pEF1α−SNAP26m−Hyg・N4−1.1k/1.1kの制限酵素MluI、NotIサイトに導入して、pEF1α−KOD3G8LC−Hyg・N4−1.1k/1.1kを構築した。
抗体生産系における、N4配列と実施例15で遺伝子発現安定化能の認められたCHO5Δ3−3との組合せ効果の検討に用いるため、図48に示すスキームに従って、pEF1α−KOD3G8HC−Pur・N4−1.1k/1.1kを構築した。即ち、実施例16に記載のpEF1α−SNAP26m−Pur・N4−1.1k/1.1kを制限酵素EcoRI、NotIで処理し、SNAP26m遺伝子を切出した。一方、実施例4に記載のpEF1α−KOD3G8HCから配列番号56,57のプライマーを用いてPCRで増幅し、制限酵素EcoRI、NotIで処理して、調製した抗KOD抗体の重鎖遺伝子を、pEF1α−SNAP26m−Pur・N4−1.1k/1.1kの制限酵素EcoRI、NotIサイトに導入して、pEF1α−KOD3G8HC−Pur・N4−1.1k/1.1kを構築した。
抗KOD抗体の重鎖(HC)発現コンストラクトである、pEF1α−KOD3G8HC−RE2(以下、−/Neoと記載)、pEF1α−KOD3G8HC−1.1k/1.1k(以下、1.1k/Neoと記載)、pEF1α−KOD3G8HC−Neo・N4−1.1k/1.1k(以下、1.1k/Neo・N4と記載)、pEF1α−KOD3G8HC−Pur・N4−1.1k/1.1k(以下、1.1k/Pur・N4と記載)、および、抗KOD抗体の軽鎖(LC)発現コンストラクトである、pEF1α−KOD3G8LC−Hyg−RE2(以下、−/Hygと記載)、pEF1α−KOD3G8LC−Hyg−1.1k/1.1k(以下、1.1k/Hygと記載)、pEF1α−KOD3G8LC−Hyg・N4−1.1k/1.1k(以下、1.1k/Hyg・N4と記載)をそれぞれ制限酵素AhdIでリニアライズ(直鎖状化)した。そして、重鎖および軽鎖発現コンストラクトを、
(1)遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの(−/Neoと−/Hyg)、
(2)遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの(1.1k/Neoと1.1k/Hyg)、
(3)遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子(重鎖:Neo、軽鎖:Hyg)にmRNA不安定化配列(N4配列)を付加したもの(1.1k/Neo・N4と1.1k/Hyg・N4)、
(4)遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子(重鎖:Pur、軽鎖:Hyg)にmRNA不安定化配列(N4配列)を付加したもの(1.1k/Pur・N4と1.1k/Hyg・N4)
のそれぞれについて、抗体の重鎖発現コンストラクトと軽鎖発現コンストラクトの重量比が1:1となるように混合して混合プラスミドを調製した。
続いて、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの(−/Neo,−/Hyg)、遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの(1.1k/Neo,1.1k/Hyg)、遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子(H鎖:Neo、L鎖:Hyg)にmRNA不安定化配列(N4配列)を付加したもの(1.1k/Neo・N4,1.1k/Hyg・N4)、遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子(H鎖:Pur、L鎖:Hyg)にmRNA不安定化配列(N4配列)を付加したもの(1.1k/Pur・N4,1.1k/Hyg・N4)のそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。
(1)pEF1α−KOD3G8LC,HC−Pur・N4−1.1k/1.1kの構築
次に、H鎖発現カセットとL鎖発現カセットを一つのベクター上に配置した場合でも高生産細胞を取得可能か検討するため、図52に示すスキームに従ってpEF1α−KOD3G8LC,HC−Pur・N4−1.1k/1.1kを構築した。
シングルベクター抗体発現系でも、2コンストラクト抗体発現系と同様に抗体生産量が高いクローンを取得可能か検討した。2コンストラクト抗体発現系として、実施例27および28で最も良好な結果が得られた遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子(重鎖:Pur、軽鎖:Hyg)にmRNA不安定化配列(N4配列)を付加したもの(1.1k/Pur・N4と1.1k/Hyg・N4)について抗体の重鎖発現コンストラクトと軽鎖発現コンストラクトの重量比が1:1となるように混合したプラスミド(制限酵素AhdIでリニアライズ済)をトランスフェクションに用いた。また、シングルベクター抗体発現系として、実施例29で構築したpEF1α−KOD3G8LC,HC−Pur・N4−1.1k/1.1kを制限酵素AhdIでリニアライズし、トランスフェクションに用いた。各々のプラスミド2μgを、実施例2に記載の方法で準備しておいたCHO−K1細胞にトランスフェクションし、24時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、2コンストラクト発現系では7.5μg/ml Puromycin・400μg/ml HygroGoldを含むHam’s F12+10%FBS培地中で、シングルベクター系では10μg/ml Puromycinを含むHam’s F12+10%FBS培地中で、2週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散し、1ウェル当たり1.84×105細胞を6ウェルプレートに播き込んだ。3日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのKOD3G8抗体の生産量を実施例27と同様の方法でELISAにて測定した。
続いて、2コンストラクト抗体発現系、シングルベクター抗体発現系のそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。
(1)CHO5Δ3−3からの制限酵素認識配列の削除
続いて、遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3から制限酵素認識配列を削除した。まず、実施例16に記載のpEF1α−KOD3G8HC−1.1kを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号62、63のプライマーを使ってCHO5Δ3−3内に存在する制限酵素SacIサイトを削除したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔREを構築した。次に、pEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔREを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号64、65のプライマーを使ってCHO5Δ3−3内に存在する制限酵素SmaIサイトを削除したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE2を構築した。更に、pEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE2を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号66、67のプライマーを使ってCHO5Δ3−3内に存在する制限酵素BamHIサイトを削除したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE3を構築した。最後に、pEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE3を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号68、69のプライマーを使ってCHO5Δ3−3内に存在する制限酵素HindIIIサイトを削除したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE4を構築した。
マルチクローニングサイトと、実施例32で作成した4箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を発現カセット上流および下流に配する図55に記載のpEHXを構築した。具体的には、実施例16に記載のpEF1α−SNAP26m−Pur2・N4を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号70、71のプライマーを使ってSV40 promoter下流に存在する制限酵素HindIIIサイトを削除したpEF1α−SNAP26m−Pur2・N4−ΔHを構築した。続いて、pEF1α−SNAP26m−Pur2・N4−ΔHを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号72、73のプライマーを使ってPuromycin耐性遺伝子内に存在する制限酵素SalIサイトを削除したpEF1α−SNAP26m−Pur3・N4−ΔHを構築した。更に、pEF1α−SNAP26m−Pur3・N4−ΔHを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号74、75のプライマーを使ってPuromycin耐性遺伝子内に存在する制限酵素SmaIサイトを削除したpEF1α−SNAP26m−Pur4・N4−ΔHを構築した。その後、pEF1α−SNAP26m−Pur4・N4−ΔHを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号76、77のプライマーを使ってf1 oriを削除したpEF1α−SNAP26m−Pur4・N4−ΔH−Δf1を構築した。次に、pEF1α−SNAP26m−Pur4・N4−ΔH−Δf1を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号78、79のプライマーを使って制限酵素NheI、EcoRI、SpeIサイトを挿入したpEF1α−SNAP26m−Pur4・N4−ΔH−Δf1−REを構築した。続いて、pEF1α−SNAP26m−Pur4・N4−ΔH−Δf1−REを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号80、81のプライマーを使って制限酵素HindIII、BsiWI、XbaI、BclIサイトを挿入したpEF1α−MCSpre−Pur4・N4−ΔH−Δf1−REを構築した。そして、pEF1α−MCSpre−Pur4・N4−ΔH−Δf1−REのHindIII、XbaIサイトに、配列番号82、83のプライマーを混合後、95℃から60℃まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したDNA断片を挿入し、pEF1α−MCS−Pur4・N4−ΔH−Δf1−REを構築した。次に、pEF1α−MCS−Pur4・N4−ΔH−Δf1−REのNheI、EcoRIサイトに、配列番号84、85のプライマーセットを使ってpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE4を鋳型にPCRで増幅した、4箇所の制限酵素認識配列を削除したCHO5Δ3−3を挿入し、pEF1α−MCS−Pur4・N4−1.1kを構築した。更に、pEF1α−MCS−Pur4・N4−1.1kのBamHI、XhoIサイトに、配列番号52、86のプライマーセットを使ってpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE4を鋳型にPCRで増幅した、4箇所の制限酵素認識配列を削除したCHO5Δ3−3を挿入し、pEHXを構築した。
次に、エレメントからの制限酵素サイト削除の効果を確認すべく、図56に示すスキームに従って、pEHXのマルチクローニングサイトにSNAP26m遺伝子を挿入した。具体的には、pEHXのMluI、NotIサイトに、配列番号3,20のプライマーセットを使ってpSNAPmを鋳型に増幅したSNAP26m遺伝子を挿入し、pEH(M−SNAP26m−N)を構築した。同様に、pEHXのBsiWI、NotIサイトに、配列番号3,87のプライマーセットを使ってpSNAPmを鋳型に増幅したSNAP26m遺伝子を挿入し、pEH(B−SNAP26m−N)を構築した。
実施例2に記載の方法でトランスフェクション用のCHO−K1細胞を準備した。一方、実施例16で構築したSNAP26m発現コンストラクトpEF1α−SNAP26m−Pur・N4−1.1k/1.1k、および実施例34で構築したSNAP26m発現コンストラクトを制限酵素AhdIでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例5に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、それぞれ7.5、10μg/ml Puromycinを含むHam’s F12+10%FBS培地中で2週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例2に記載の方法で、細胞集団のSNAP26mの発現強度を解析した。
(1)pELXの構築
マルチクローニングサイトを含む図59に記載のpELXを構築した。具体的には、実施例6の途中で構築されたpEF1α−KOD3G8LC−Hyg−RE2を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号88、89のプライマーを使って制限酵素BglII、SalIサイトを挿入したpEF1α−KOD3G8LC−Hyg−RE3を構築した。続いて、pEF1α−KOD3G8LC−Hyg−RE3を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号90、91のプライマーを使って、f1 oriとハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットを削除し、制限酵素EcoRI、SpeIサイトを挿入したpEF1α−KOD3G8LC−RE4を構築した。その後、pEF1α−KOD3G8LC−RE4を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号80、81のプライマーを使って制限酵素HindIII、BsiWI、XbaI、BclIサイトを挿入したpEF1α−MCSpre−RE4を構築した。そして、pEF1α−MCSpre−RE4の制限酵素HindIII、XbaIサイトに、配列番号82、83のプライマーを混合後、95℃から60℃まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したDNA断片を挿入し、pELXを構築した。
続いて、抗KOD抗体発現系でエレメントからの制限酵素サイト削除の効果を確認すべく、pELH(KOD3G8)を構築した。
CHO5Δ3−3内の制限酵素認識配列を削除した効果を抗KOD抗体発現系で検討した。制限酵素認識配列を削除していない遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗KOD抗体発現用シングルベクターとして、実施例29で構築したpEF1α−KOD3G8LC,HC−Pur・N4−1.1k/1.1k(1.1k)を用いた。また、遺伝子発現安定化エレメントから4箇所の制限酵素認識配列を削除したCHO5Δ3−3を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗KOD抗体発現用シングルベクターとして、実施例37で構築したpELH(KOD3G8)(1.1k−ΔRE)を用いた。制限酵素AhdIでリニアライズしたプラスミド2μgを、実施例2に記載の方法で準備しておいたCHO−K1細胞にトランスフェクションし、24時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、10μg/ml Puromycinを含むHam’s F12+10%FBS培地中で、2週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散し、1ウェル当たり1.84×105細胞を6ウェルプレートに播き込んだ。3日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのKOD3G8抗体の生産量を実施例27と同様の方法でELISAにて測定した。
続いて、CHO5Δ3−3内の制限酵素認識配列を削除していないもの、削除したもののそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。
3つ以上の遺伝子発現安定化エレメントの配置による効果の実証を行った。具体的には、2つの抗体遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流及び下流に遺伝子発現安定化エレメントを配置した発現ベクターにおいて、さらに抗体遺伝子発現カセットの間に遺伝子発現安定化エレメントを挿入した効果を、下記の方法にて試験した。
(1)pELX2の構築
実施例36で構築したpELXの発現カセット下流に、4箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を配した、図63に記載のpELX2を構築した。具体的には、実施例36で構築したpELXを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号90、92のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素NheIサイトを追加したpELX−Nを構築した。そして、pELX−NのNheI、EcoRIサイトに、遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を挿入し、pELX2を構築した。実施例40〜43で使用した遺伝子発現安定化エレメントエレメントCHO5Δ3−3は、実施例32で構築したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE4を鋳型に、配列番号50、93のプライマーセットを使ってPCRで増幅した、4箇所の制限酵素認識配列を削除したものである。
続いて、L鎖発現カセットとH鎖発現カセットの間へのCHO5Δ3−3挿入の効果を確認すべく、pELH2(KOD3G8)を構築した。
抗KOD抗体発現系における、L鎖発現カセットとH鎖発現カセットの間へCHO5Δ3−3を挿入した効果をポリクローンの段階で検討した。L鎖発現カセットとH鎖発現カセットの間にCHO5Δ3−3を含む抗KOD抗体発現用シングルベクターとして、実施例41で構築したpELH2(KOD3G8)を用いた。また、比較例として、L鎖発現カセットとH鎖発現カセットの間にCHO5Δ3−3を含まない抗KOD抗体発現用シングルベクターとして、実施例37で構築したpELH(KOD3G8)を用いた。制限酵素AhdIでリニアライズしたプラスミド2μgを、実施例2に記載の方法で準備しておいたCHO−K1細胞にトランスフェクションし、24時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、10μg/ml Puromycinを含むHam’s F12+10%FBS培地中で、2週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散し、1ウェル当たり1.84×105細胞を6ウェルプレートに播き込んだ。3日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのKOD3G8抗体の生産量を実施例27と同様の方法でELISAにて測定した。
続いて、L鎖発現カセットとH鎖発現カセットの間にCHO5Δ3−3を有する発現ベクター(pELH2(KOD3G8))により形質転換された細胞群、および比較例として、L鎖発現カセットとH鎖発現カセットの間にCHO5Δ3−3を有さない発現ベクター(pELH(KOD3G8))により形質転換された細胞群のそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。
(1)抗KOD抗体発現ベクター:pELH3(KOD3G8)の構築
図67に示すスキームに従って、抗KOD抗体のH鎖発現カセット、L鎖発現カセット、およびmRNA不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットをそれぞれ2コピーずつコードするpELH3(KOD3G8)を構築した。即ち、実施例37で構築したpELH(KOD3G8)の制限酵素AseI、XhoIサイトに、pELH(KOD3G8)を制限酵素AseI、SalI、NheIで処理して調製した抗KOD抗体のL鎖発現カセット、H鎖発現カセット、Pur耐性遺伝子発現カセット、および、遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3からなるDNA断片を挿入して、pELH3(KOD3G8)を構築した。
図68に示すスキームに従って、抗KOD抗体のH鎖およびL鎖発現カセット、および、Pur耐性遺伝子発現カセットをそれぞれ2コピーずつコードし、L鎖発現カセットとH鎖発現カセットの間にも遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3が挿入されたpELH4(KOD3G8)を構築した。即ち、実施例41で構築したpELH2(KOD3G8)の制限酵素AseI、XhoIサイトに、pELH2(KOD3G8)を制限酵素AseI、SalI、NheIで処理して調製した抗KOD抗体のL鎖発現カセット、遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3、H鎖発現カセット、Pur耐性遺伝子発現カセット、および、遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3からなるDNA断片を挿入して、pELH4(KOD3G8)を構築した。
コンカテマー化発現ベクターの効果を抗KOD抗体発現系で検討した。コンカテマー化した発現ベクターは、実施例44で構築したpELH3(KOD3G8)、および、実施例45で構築したpELH4(KOD3G8)を用いた。また、比較例として、実施例37で構築した抗KOD抗体のH鎖およびL鎖発現カセット、および、Pur耐性遺伝子発現カセットをそれぞれ1コピーずつコードするpELH(KOD3G8)を用いた。制限酵素AhdIでリニアライズしたプラスミド2μgを、実施例2に記載の方法で準備しておいたCHO−K1細胞にトランスフェクションし、24時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、10μg/ml Puromycinを含むHam’s F12+10%FBS培地中で、2週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散し、1ウェル当たり1.84×105細胞を6ウェルプレートに播き込んだ。3日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのKOD3G8抗体の生産量を実施例27と同様の方法でELISAにて測定した。
続いて、発現ベクターpELH(KOD3G8)、pELH3(KOD3G8)、および、pELH4(KOD3G8)で遺伝子導入して取得したポリクローンの細胞について、それぞれ限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。
抗体の軽鎖及び/又は重鎖の定常領域の遺伝子を含む発現ベクターを作製し、その発現ベクターに抗体の可変領域の遺伝子を挿入して抗体分子を発現させ、mRNA不安定化配列(N4配列)及び遺伝子発現安定化エレメント(CHO5Δ3−3)の効果を確認した。
(1)CHO5Δ3−3からの制限酵素認識配列の削除
実施例32で構築した4箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3から更に2箇所存在する制限酵素BlpIサイトを削除した。具体的には、まず実施例32で構築したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE4を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号94、95のプライマーを使ってCHO5Δ3−3内に存在する制限酵素BlpIサイトを削除したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE5を構築した。続いて、pEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE5を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号96、97のプライマーを使ってCHO5Δ3−3内に存在する別の制限酵素BlpIサイトを削除したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE6を構築した。
健康なヒトのヘパリン処理した血液から回収したヒト末梢血単球細胞より、セパゾールRNAI Super(ナカライテスク社製)を用いて全RNAを抽出した。次に、全RNAを鋳型にReverTra Ace −α−(東洋紡績社製)を用いてcDNAを合成した。続いて、配列番号98、99のプライマーを使ってPCRによりヒトγ1定常領域遺伝子を増幅し、精製したPCR産物をpTA vector(東洋紡績社製)にTAクローニングした。構築したプラスミドの配列をシークエンシングにより確認し、既知配列と同じ配列を持つクローンをpTA−γ1とした。
6箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を発現カセット上流および下流に配し、ヒトγ1定常領域遺伝子をコードする図71に記載のpEHγXを構築した。具体的には、実施例33に記載のpEF1α−MCS−Pur4・N4−1.1kのNheI、BglIIサイトに、配列番号50、51のプライマーを使って、実施例48で構築したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE6を鋳型にPCRで増幅した、6箇所の制限酵素認識配列を削除したCHO5Δ3−3を挿入し、pEF1α−MCS−Pur4・N4−1.1k−2を構築した。続いて、pEF1α−MCS−Pur4・N4−1.1k−2のXbaI、BclIサイトに、配列番号100、101のプライマーを使って、実施例49に記載のpTA−γ1を鋳型にPCRで増幅したヒトγ1定常領域遺伝子を挿入し、pEF1α−γ−Pur4・N4−1.1kを構築した。次に、pEF1α−γ−Pur4・N4−1.1kを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号102、103のプライマーを使ってEF1αプロモーター上流のEcoRIサイトをNotIサイトに置換したpEF1α−γ−Pur4・N4−1.1k−REを構築した。更に、pEF1α−γ−Pur4・N4−1.1k−REを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号104、105のプライマーを使ってヒトγ1定常領域遺伝子上流にEcoRIサイトを挿入したpEF1α−γ−Pur4・N4−1.1k−RE2を構築した。そして、pEF1α−γ−Pur4・N4−1.1k−RE2のBamHI、XhoIサイトに、配列番号52、86のプライマーを使って、実施例48で構築したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE6を鋳型にPCRで増幅した、6箇所の制限酵素認識配列を削除したCHO5Δ3−3を挿入し、pEF1α−γ−Pur4・N4−1.1k/1.1kを構築した。最後に、pEF1α−γ−Pur4・N4−1.1k/1.1kのBsiWI、EcoRIサイトに、配列番号106、107のプライマーを混合後、95℃から60℃まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したDNA断片を挿入し、pEHγXを構築した。
健康なヒトのヘパリン処理した血液から回収したヒト末梢血単球細胞より、セパゾールRNAI Super(ナカライテスク社製)を用いて全RNAを抽出した。次に、全RNAを鋳型にReverTra Ace −α−(東洋紡績社製)を用いてcDNAを合成した。続いて、配列番号108、109のプライマーを使ってPCRによりヒトκ定常領域遺伝子を増幅し、精製したPCR産物をpTA vectorにTAクローニングした。構築したプラスミドの配列をシークエンシングにより確認し、既知配列と同じ配列を持つクローンをpTA−κとした。
ヒトκ定常領域遺伝子をコードする図72に記載のpELκXを構築した。具体的には、実施例36に記載のpELXを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号110、111のプライマーを使ってマルチクローニングサイトに配した制限酵素HindIII、BsiWIサイトを削除したpELX−REを構築した。続いて、pELX−REのXbaI、BclIサイトに、配列番号112、113のプライマーを使って、実施例51に記載のpTA−κを鋳型にPCRで増幅したヒトκ定常領域遺伝子を挿入し、pEF1α−κを構築した。次に、pEF1α−κを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号114、115のプライマーを使ってSV40 pA下流のEcoRIサイトをNotIサイトに置換したpEF1α−κ−REを構築した。更に、pEF1α−κ−REを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号116、117のプライマーを使ってヒトκ定常領域遺伝子上流にEcoRI、MluI、EcoRVサイトを挿入したpEF1α−κ−RE2を構築した。最後に、pEF1α−κ−RE2のMluI、EcoRVサイトに、配列番号118、119のプライマーを混合後、95℃から60℃まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したDNA断片を挿入し、pELκXを構築した。
続いて、抗KOD抗体の可変領域遺伝子を利用したマウス・ヒトキメラ抗体発現系で、N4配列およびCHO5Δ3−3の効果を確認すべく、pELκHγ(KOD3G8)を構築した。
次に、pEHγXからN4配列および遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を削除した図74に記載のpcHγXを構築した。具体的には、実施例50に記載のpEF1α−γ−Pur4・N4−1.1k−RE2を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号16、17のプライマーを使ってN4配列を削除したpEF1α−γ−Pur4−1.1kを構築した。続いて、pEF1α−γ−Pur4−1.1kを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号122、123のプライマーを使って、遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を削除したpEF1α−γ−Pur4を構築した。最後に、pEF1α−γ−Pur4の制限酵素BsiWI、EcoRIサイトに、配列番号106、107のプライマーを混合後、95℃から60℃まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したDNA断片を挿入し、pcHγXを構築した。
続いて、mRNA不安定化配列(N4配列)および遺伝子発現安定化エレメント(CHO5Δ3−3)の効果を確認するため、コントロールとして、抗KOD抗体の可変領域遺伝子を利用したマウス・ヒトキメラ抗体発現系においてmRNA不安定化配列および遺伝子発現安定化エレメントを削除した、pcLκHγ(KOD3G8)を構築した。
抗KOD抗体の可変領域遺伝子を利用したマウス・ヒトキメラ抗体発現系で、N4配列およびCHO5Δ3−3の効果を検討した。N4配列およびCHO5Δ3−3を含むコンストラクトとして実施例53で構築したpELκHγ(KOD3G8)を、N4配列およびCHO5Δ3−3を含まないコンストラクトとして実施例55で構築したpcLκHγ(KOD3G8)を用いた。制限酵素AhdIでリニアライズしたプラスミド2μgを、実施例2に記載の方法で準備しておいたCHO−K1細胞にトランスフェクションし、24時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、10μg/ml Puromycinを含むHam’s F12+10%FBS培地中で、2週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散し、1ウェル当たり1.84×105細胞を6ウェルプレートに播き込んだ。3日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのKOD3G8抗体の生産量を実施例27と同様の方法でELISAにて測定した。
Claims (24)
- mRNA不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、少なくとも1つの遺伝子発現安定化エレメント、及び抗体の軽鎖の定常領域遺伝子を含む抗体遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
- mRNA不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、少なくとも1つの遺伝子発現安定化エレメント、及び抗体の重鎖の定常領域遺伝子を含む抗体遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
- mRNA不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、少なくとも1つの遺伝子発現安定化エレメント、並びに抗体の軽鎖の定常領域遺伝子を含む抗体遺伝子発現カセット及び抗体の重鎖の定常領域遺伝子を含む抗体遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
- mRNA不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の3’非翻訳領域に存在するATリッチ配列に由来することを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- mRNA不安定化配列が、TTATTTA(A/T)(A/T)のモチーフ配列を有することを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- モチーフ配列が、2回以上繰り返されていることを特徴とする請求項5に記載の発現ベクター。
- モチーフ配列の繰り返し間に1塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする請求項6に記載の発現ベクター。
- mRNA不安定化配列中に1ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする請求項4〜7のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 遺伝子発現安定化エレメントがチャイニーズハムスターゲノム由来であることを特徴とする請求項1〜8のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 遺伝子発現安定化エレメントが、以下の(a)〜(c)のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなることを特徴とする請求項9に記載の発現ベクター。
(a)配列番号26で示す配列のうち41601番目から46746番目までの塩基で示す領域の配列を含むDNA;
(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有するDNA;及び
(c)前記(a)又は(b)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNA - 遺伝子発現安定化エレメントが、以下の(d)〜(f)のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなることを特徴とする請求項10に記載の発現ベクター。
(d)配列番号26で示す配列のうち41601番目から42700番目までの塩基で示す領域の配列を含むDNA;
(e)(d)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有するDNA;及び
(f)(d)又は(e)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNA - 薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子であることを特徴とする請求項1〜11のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 薬剤選択マーカー遺伝子が、ピューロマイシン−N−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ、及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項12に記載の発現ベクター。
- 抗体の軽鎖及び/又は重鎖の定常領域遺伝子がマウス由来であることを特徴とする請求項1〜13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 抗体の軽鎖及び/又は重鎖の定常領域遺伝子がヒト由来であることを特徴とする請求項1〜13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 抗体の軽鎖の定常領域遺伝子がCκであることを特徴とする請求項14又は15に記載の発現ベクター。
- 抗体の重鎖の定常領域遺伝子がCγ1であることを特徴とする請求項14〜16のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 請求項1〜17のいずれか一項に記載の発現ベクターに、抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変領域遺伝子を挿入する工程を含むことを特徴とする、抗体の重鎖及び/又は軽鎖を発現する発現ベクターを作製する方法。
- 抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変領域遺伝子が挿入された請求項1〜17のいずれか一項に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られることを特徴とする形質転換細胞。
- 宿主細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする請求項19に記載の形質転換細胞。
- 哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞であることを特徴とする請求項20に記載の形質転換細胞。
- 請求項19〜21のいずれか一項に記載の形質転換細胞を薬剤選択する工程を含むことを特徴とする、抗体遺伝子を高レベルで発現する細胞群を選別する方法。
- 請求項19〜21のいずれか一項に記載の形質転換細胞からなる細胞群であって、抗体遺伝子を高レベルで発現することを特徴とする細胞群。
- 請求項19〜21のいずれか一項に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、抗体分子を生産する方法。
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