JP2007503837A - 発現ベクター - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本願明細書で使用する“核酸”には、原核生物、真核生物および合成源に由来するDNA、RNA、mRNA、cDNA、ゲノムDNAおよびそのアナログが含まれる。“コード配列”あるいは選択されたポリペプチドを“符号化する”配列とは、適切な制御核酸(または“調節エレメント”)による制御にある場合、in vivoでポリペプチドへと転写(DNAの場合)および翻訳(mRNAの場合)される核酸分子を意味する。コード配列の区切りは5’(アミノ)末端の開始コドンと3’(カルボキシ)末端の翻訳終止コドンで決定される。コード配列には、ウイルス、原核生物または真核生物のmRNAに由来するcDNA、ウイルスまたは原核生物DNAに由来するゲノムDNA配列、および合成DNA配列が含まれるがこれに限定されない。転写終了配列は、一般的にコード配列の3’側に存在する。
プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度および別の成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中の遮断剤の存在または不在(例えば、ホルムアミド、デキストランスルファートおよびポリエチレングリコール)、ハイブリダイゼーションの反応温度および時間パラメーターならびに洗浄条件の変化
ハイブリダイゼーション条件の特定の組合せは、以下の従来公知の標準法から選択される(例えば、Sambrook等、前記の通り、またはAusubel等、前記の通り、参照)。
GOIを組み込んだ宿主細胞を選択するために使用する選択マーカーと、GOIのコピー数を増幅させるのに使用する選択マーカーとを区別するために、後者を“増幅性マーカー”と称することを注記する。選択マーカーおよび増幅性マーカーは従来公知であり、本発明で使用する際には、当業者の所望する特定の発現系をもとに安定な形質移入体が分離することができるように選択される。
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロフォレートレダクターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(Gritz等、1983、Gene25:179〜188およびPalmer等、1987、Proc、Natl.Acad.Sci.USA84:1055〜1059参照)、
キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Mulligan等、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072〜2076参照)、
ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、トリプトファンシンセターゼβサブユニット、ブラスチシジンSデアミナーゼ、ゼオシン、アスパラギンシンセターゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ(Littlefield等、1964、Science145:709〜710参照)、
アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、P−グリコプロテイン、アデノシンデアミナーゼ(Kaufman等、1986、Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:3136〜3140参照)、
オルニチンデカルボキシラーゼ、およびCAD(カルバミル−P−シンセターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、ジヒドロ−オロターゼ)
本願明細書に記載するベクターの組成および方法に関し、選択マーカーを符号化する任意の好適な核酸を使用してよい。一般的に本願明細書で使用される選択マーカーは容易に入手できる。
ジヒドロフォレートレダクターゼ、P−グリコプロテイン、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびCAD(カルバミル−P−シンセターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、ジヒドロ−オロターゼ)
本発明の発現ベクターの1つの実施形態では、neoを選択マーカーとして、DHFRを増幅性マーカーとして使用し、GOIの発現を増加させている。DHFRはプリンの生合成に必須の物質であり、外因性プリンが存在しない場合、DHFRが細胞増殖に必要となる。メトトレキサート(MTX)はDHFRの強力な競合阻害剤であり、MTX濃度が高ければDHFRを高レベルで発現する細胞が選択できる。従来のDHFR増幅法であれば、増幅されたDHFR遺伝子とGOIとを染色体に含んで安定に増幅した細胞を分離することができる。DHFRおよびMTXをそれぞれ選択マーカーとして、および遺伝子増幅に使用する場合は、以下を参照のこと(Maniatis等(1992)Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor,Cold Spring Harbor、NY)。
“目的遺伝子”(GOI)とは転写発現の増加が求められる任意の核酸配列のことである。GOIは機能性核酸分子(例えばアンチセンスRNA分子のようなRNA)を符号化するかまたは、より一般的に、産生増加が望まれるペプチド、ポリペプチドまたはたんぱく質を符号化する。本発明のベクターを使用して“異種”GOIを発現することができる。本願明細書で使用する用語“異種”とは、異種を起源とする核酸配列またはポリペプチド、あるいは同種起源の原形に実質的な修飾を加えた核酸配列またはポリペプチドを意味する。更に通常、細胞内で発現しない非修飾の核酸配列またはポリペプチドも異種と見なす。本発明のベクターは、1つ以上のGOIを有してよく、GOIは同一のまたは異なる挿入部位に挿入されており、各GOIは、発現を可能にする制御核酸配列と機能的に結合している。従って、本発明のベクターは、種々のたんぱく質(例えば、単量体、二量体および多量体のたんぱく質)の発現に利用することができる。別の実施形態で本発明のベクターは殆ど全ての任意の目的遺伝子の発現に使用でき、特に治療に有効な活性を有するかまたは別の商業用途を示す組換えたんぱく質を符号化する遺伝子の発現に使用できる。本発明のGOIの例には以下のものが挙げられるがこれに限定しない。
エリスロポイエチン、ヒト成長ホルモン、インシュリン、インターフェロンα、βおよび/またはγ、インターロイキン−2のようなインターロイキン類、第VIII因子および第IX因子のような造血因子
(i)Fabフラグメント、VL、VH、CLおよびCH1ドメインを含む一価フラグメント
(ii)F(ab’)2フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により相同された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント
(iii)VHおよびCH1ドメインを含むFdフラグメント
(iv)抗体のシングルアームのVLおよびCHドメインを含むFvフラグメント
(v)VHドメインから成るdAbフラグメント(Ward等、1989、Nature341:544〜546)
(vi)分離された相補鎖決定領域(CDR)
更に、Fvフラグメントの2つのドメインであるVLおよびVHは別個の遺伝子で符号化されるが、組換え法を利用して合成リンカーでつなぎ合わせることにより、VLおよびVH領域の対は一価の分子を形成する単一たんぱく質として生成される(単鎖Fv(scFv)として公知であり、Bird等、1988、Science242:423〜426;およびHuston等、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879〜5883参照)。このような単鎖抗体も抗体の“抗原結合部位”に含まれる。このような抗体フラグメントは当業者に公知の一般的技術により得られ、更にフラグメントは無傷の抗体と同じ方法で有用性の有無に関して調査される。
制御核酸とは、制御核酸と機能的に結合する遺伝子を発現する際、(i)転写、(ii)翻訳または(iii)翻訳後の修飾に対して制御するか、または作用する任意の配列を意味し、この配列はこのような活性を制御する“調節エレメント”を1つ以上有する。制御核酸、ならびに機能的に結合する遺伝子は、同一生物または同一細胞株に由来する必要はない。制御核酸は哺乳動物またはウイルスを起源とするのが好ましい。
前述の本発明の発現ベクター系の成分、即ち、選択マーカー遺伝子、GOIおよび適切な制御配列を、バックボーンを形成する数種の好適なベクターへ組み込み、発現ベクターおよびコンストラクトの操作を容易にする。更に、微生物での複製を可能にする手段を内包するベクターへ成分を組み込めば、コンストラクトの増殖と分離がかなり容易になる(即ち、シャトルベクターの生成)。用語“ベクター”および“発現ベクター”は本願明細書では同義的に使用され、(1)減弱したプロモーターを有する制御核酸配列と機能的に結合する選択マーカー遺伝子、(2)制御核酸配列と機能的に結合するGOIを挿入する挿入部位を含む任意の核酸を意味し、好ましくは、DNAを意味する。従ってベクターが選択マーカー遺伝子とGOIとを含有する本発明の特殊な態様では、2つの遺伝子が相関していると考えられる。本願明細書において“相関する”ならびに文法的に異なる同様の表現は、2つの独立した核酸、一般的には遺伝子が、同一ベクター内でDNAの連続した領域に存在することを意味する(ベクター上で2つの相関したDNA配列間にDNAが介在してもよい)。
本発明の核酸または発現ベクターを介して遺伝子発現が可能な任意の細胞種を宿主細胞として本発明において使用できる。用語“宿主細胞”とは、組換えDNA技術を利用したり少なくとも1種の外来遺伝子、即ち減弱したプロモーターと機能的に結合した選択マーカー遺伝子を符号化させたりしてコンストラクトしたベクターで形質転換される細胞を意味する。1つの実施形態で宿主細胞は、G418のようなアミノグリコシド系抗生物質に対して感受性があるが、当該細胞における発現に関しカナマイシン耐性遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子を保有してよい。このような細胞の例としてHeLa細胞、CV−1細胞、CHO細胞、3T3細胞、L細胞あまたはTC7細胞が挙げられる。
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)(例えば、DG44およびDUXB11;Urlaub等、Som.Cell Molec.Genet.12:555、1986;Haynes等、Nuc.Acid.Res.11:687〜706、1983;Lau等、Mol.Cell.Biol.4:1469〜1475、1984;Methodeds in Enzymology、1991、vol.185、537〜566、Academic Press,Inc.、San Diego、CA)、
チャイニーズハムスター線維芽細胞(例えばR1610)、
ヒト子宮頸癌細胞(例えばHELA)、
サル腎臓細胞(例えばCVIおよびCOS)、
ネズミ線維芽細胞(例えばBALBc/3T3)、
ネズミ骨髄腫細胞(p3x63−Ag3.653;NSO;SP2/0)、
ハムスター腎臓細胞(例えばHAK)、
ネズミL細胞(例えばL−929)、
ヒトリンパ球細胞(例えばRAJI)、
ヒト腎臓細胞(例えば293および293T)、
酵母宿主細胞系(例えばRE35749;US5,620,203;Gellissen等、Antonie Van Leeuwenhoek62:79〜93(1992);Romanosra ,Yeast8:423〜488(1992);Goeddel,Methods in Enzymology 185(1990);GuthrieおよびFink、Methods in Enzymology194(1991)に記載)
一般的に、宿主細胞株は(例えばBD Biosciences、Lexington、KY;Promega、Madison、WI;Life Technologies、Gaithersburg、MDから)購買入手可能であるか、またはAmerican Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA)から入手できる。
トランスフェクション(エレクトロポレーションを含む)、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープDNAによる細胞融合、マイクロインジェクション、および無傷ウイルスの感染
通常よりも高いレベルの一過性の発現さえ、機能試験あるいは目的たんぱく質の産生および回収に有用である。形質転換された細胞を、GOI(例えば、1つの態様では抗体重鎖および/または軽鎖)の産生に適する条件で増殖させ、符号化された目的ポリペプチドを同定するためにアッセイを行う。遺伝子産物を同定および定量するための典型的なアッセイ技術には、酵素結合抗体免疫吸着法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)または蛍光活性化セルソーター分析(FACS)、免疫組織化学などが含まれる。
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)選択マーカーを促進させるSV40プロモーターをネズミβグロブリン主要プロモーターで置換し、pAGE2ベクターをpcDNA3.1(+)ベクターバックボーン(Invitrogen#V790−20)からコンストラクトした。(Berg等、1983、Molecular and Cellular Biology 3:1246およびWard等、1990、J.Biol.Chem.265:3030)。更に、ネズミジヒドロフォレートレダクターゼ(DHFR)増幅性マーカー(Nunberg等、1980、Cell 19:355)を含む発現カセットをneoカセットの上流へ挿入した。
アンピシリン耐性遺伝子、マルチクローニング部位とその上流に位置するウイルスプロモーター、マルチクローニング部位に続くポリA配列(発現する目的遺伝子の挿入を可能にする)、f1 ori、DHFR遺伝子と機能的に結合するネズミβグロビン主要プロモーター、それに続く機能的に結合したSV40ポリA配列、ネオマイシン遺伝子と機能的に結合した第二のネズミβグロビン主要プロモーター、それに続く機能的に結合したSV40ポリA配列
挿入領域は、図1A〜1Bにおいて配列に注釈を付けて示している(配列番号:1)。
neo選択マーカー遺伝子の発現を促進させるネズミβグロビンプロモーターを減弱化するために、プロモーター内の転写調節エレメントを取り除いた。pAGE8ベクターをpAGE2ベクターからβグロビンプロモーターのRsaIとMs1Iの制限酵素部位間に存在する199bpを除いてコンストラクトした(図2参照)。pAGE9ベクターは、pAGE2からβグロビンプロモーター内のRsaI制限酵素切断部位のすぐ下流128bpを除いてコンストラクトした。pAGE2のネズミβグロビン主要プロモーター配列(配列番号:2)ならびにpAGE8およびpAGE9の修飾ネズミβグロビン主要プロモーター配列(配列番号S:3および4)を図2に示す。pAGE8ベクターのβグロビンプロモーターにはCCAATとTATAエレメントの両方が欠如しているが、pAGE9ベクターのβグロビンプロモーターではCCAATが欠如しているもののTATAエレメントは残存している。
目的遺伝子(GOI)を符号化するDNA配列(165のアミノ酸を有するたんぱく質)をPCR増幅し、pAGE2、pAGE8およびpAGE9各ベクターのマルチクローニング部位に存在するHindIIIおよびXhoI部位へサブクローニングした。pAGE2、pAGE8およびpAGE9のGOIコンストラクトは、neo発現するβグロビンプロモーターに加えられた修飾を除いて同一の配列を有する。
DHFR活性の欠如したチャイニーズハムスターの卵巣細胞株CHO DG44(Urlaub等、Som.Cell Molec.Genet.12:555、1986)を宿主細胞として使用し、pAGEコンストラクトからGOIを発現させた。CHO DG44細胞を、HAT(100μM ヒポキサンチン、16μM チミジン;Invitrogen#11067−030)を補足した増殖培地(CHO SSFMII;Invitrogen#31033−020)中で浮遊培養して増殖させた。
組換え抗体を発現する第2ベクター系列(pIEと称する)をコンストラクトした。βグロビンプロモーターに修飾を加えたpAGE9ベクターを用いて、抗体を高率で産生する形質移入体のコロニーの数を増加させた。このベクターはpAGE9ベクターバックボーンに、抗体の軽鎖たんぱく質および重鎖たんぱく質の2つの独立した発現カセットを含むように修飾される。代表的なpIEベクターを図4に示す。2種類の任意の目的遺伝子(例えばレセプター複合体のサブユニットまたはその他のたんぱく質)を発現できるようにpIEベクターを修飾することができるということは当業者に明らかである。
pIE−Uγ1z、pIE−Uγ1f、pIE−Uγ1fa、pIE−Uγ4、pIE−SRγ1z、pIE−SRγ1f、pIE−SRγ1fa、pIE−SRγ4
ベクターは、pIEベクターバックボーン、重鎖および軽鎖の発現を促進させるプロモーターならびに重鎖定常領域のイソタイプおよびアロタイプを表している。
ヒトの完全なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに由来する抗体重鎖および軽鎖可変領域cDNAを、前述のpIEベクターの重鎖および軽鎖発現カセットへサブクローン化した。pIE抗体コンストラクトを使用し、pAGE9試験GOIコンストラクトの前述のプロトコールに従ってCHO DG44宿主細胞をトランスフェクトした。pIEコンストラクトでGOIをトランスフェクトした結果、高率で抗体を産生するコロニーの割合が増加し、このことはpAGE9試験抗原で得られた結果に類似していた。図5は、典型的なモノクローナル抗体mAb1を様々な発現レベルで発現する96穴中のコロニーの数を抗体発現レベルはELISAで測定して比較したヒストグラムである。96穴中、コロニーの20/322(6%)が1000ng/mgを越える抗体を産生した。
DHFR発現カセットを前述のpAGEおよびpIEベクターへ処理し、ベクターをCHO DG44細胞のトランスフェクトに使用した。増幅を誘導するために、MTXを5nM、50nMまたは500nM補足したCHO SSFMII培地(Invitrogen#31033−020)で細胞を増殖させた。mAb4を生じる特殊な形質移入体はpIEコンストラクトを含む1つの挿入部位を有し、50nM MTXでの増幅前に8pg/細胞/日の産生能を示した。増幅後、産生能は3倍に増加し、コンストラクトのコピー数は7倍に増加した。1つの挿入部位と4pg/細胞/日のmAb産生能を示すmAb1を産生する形質移入体は、5nM、50nMおよび500nM MTXでの逐次的な増幅において、遺伝子のコピー数は8倍に増加し、産生能は12倍に増加した。
Claims (33)
- (1)転写能の減弱したプロモーターを含む制御核酸と機能的に結合した選択的マーカー遺伝子と、
(2)制御配列と機能的に結合した相同性の目的遺伝子を挿入するための1または複数の挿入部位と、を含む、発現ベクター。 - 前記転写能の減弱したプロモーターは、修飾CCAATboxまたは修飾CACCCエレメントを含む、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記目的遺伝子を1または複数含有し、各該遺伝子が1または複数の前記挿入部位で制御核酸と機能的に結合する、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記選択的マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼである、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記選択的マーカー遺伝子は、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロフォレートレダクターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、トリプトファンシンターゼβサブユニット、ブラスチシジンSデアミナーゼ、ゼオシン、アスパラギンシンターゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、P−グリコプロテイン、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、CAD(カルバモイル−P−シンセターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、ジヒドロオロターゼ)から成る群より選択される、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記目的遺伝子は、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖から選択されるたんぱく質を符号化する、請求項3に記載の発現ベクター。
- 前記制御核酸と機能的に結合する第1の前記目的遺伝子、および前記制御核酸と機能的に結合する第2の前記目的遺伝子を含む、請求項3に記載の発現ベクター。
- 前記制御核酸と機能的に結合する前記第1の目的遺伝子、および前記制御核酸と機能的に結合する第2の目的遺伝子を含み、第1および第2の前記目的遺伝子が、それぞれ免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を符号化する、請求項3に記載の発現ベクター。
- 前記制御核酸と機能的に結合する増幅性遺伝子を符号化する核酸を更に含む、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記増幅性遺伝子は、ジヒドロフォレートレダクターゼである、請求項9に記載の発現ベクター。
- 前記増幅性遺伝子は、P−グリコプロテイン、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびCAD(カルバモイル−P−シンセターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、ジヒドロオロターゼ)から成る群より選択される、請求項9に記載の発現ベクター。
- (i)CCAATボックス配列の欠如したβグロビン遺伝子プロモーターを含む、制御核酸と機能的に結合した選択マーカー遺伝子と、
(ii)制御核酸と機能的に結合した1または複数の目的遺伝子と、を含む、発現ベクター。 - 前記βグロビン遺伝子プロモーターは、CACCCエレメントが欠如する、請求項12に記載の発現ベクター。
- 1または複数の前記目的遺伝子は、免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖から選択されるたんぱく質を符号化する、請求項12に記載の発現ベクター。
- 前記βグロビン遺伝子プロモーターは、配列番号:4に示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有し、前記βグロビン遺伝子プロモーターは、CCAATボックス配列が欠如し、かつTATAボックス配列を有する、請求項12に記載の発現ベクター。
- 前記制御核酸と機能的に結合したジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子を更に含む、請求項12に記載の発現ベクター。
- 前記修飾βグロビンプロモーターは、前記転写能の減弱したプロモーターを含む、図4に記載の発現ベクター。
- 前記修飾βグロビンプロモーターは、配列番号:4に示す配列と少なくとも70%の配列同一性を有する配列を含み、前記修飾βグロビンプロモーターは、CCAATボックス配列が欠如し、かつTATAボックス配列を有する、請求項17に記載の発現ベクター。
- 請求項1、12または17に記載の発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞。
- 前記発現ベクターは、前記宿主細胞の染色体へ安定に組み込まれている、請求項19に記載の宿主細胞。
- 哺乳動物細胞である、請求項17に記載の宿主細胞。
- チャイニーズハムスターの卵巣細胞である、請求項17に記載の宿主細胞。
- 目的遺伝子が符号化するポリペプチドの産生方法であって、請求項19に記載の細胞を、前記目的遺伝子が前記ポリペプチドを発現できる好適な条件で培養する工程を含む、ポリペプチドの産生方法。
- 前記好適な条件は、前記発現ベクターを前記細胞の染色体へ安定的に組み込むことができるものである、請求項23に記載の方法。
- 前記選択マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼである、請求項23に記載の方法。
- 前記プロモーターは、前記βグロビン遺伝子プロモーターである、請求項23に記載の方法。
- 前記プロモーターは、CCAATボックス配列を欠如している、請求項23に記載の方法。
- 前記好適な条件として、前記選択マーカー遺伝子を発現させるために選択された化合物へ前記細胞を接触させる工程を更に含む、請求項23に記載の方法。
- 前記発現ベクターが増幅性マーカー遺伝子を更に含み、前記好適な条件として更に該増幅性マーカー遺伝子を発現させるために選択された化合物へ前記細胞を接触させる工程を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記増幅性マーカー遺伝子は、ジヒドロフォレートレダクターゼである、請求項29に記載の方法。
- 前記発現ベクターは、2つの前記目的遺伝子を含む、請求項24に記載の方法。
- 2つの前記目的遺伝子は、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を符号化する、請求項31に記載の方法。
- 前記ポリペプチドを回収する、請求項24に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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