JP2002526071A - トランスフェクションした細胞中の組換えタンパク質発現増大のためのホットスポットを含む発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 組換え遺伝子発現のための特定の遺伝子座（ホットスポット）をチャイニーズハムスター卵巣細胞のゲノムで同定した。該ホットスポットを含むＤＮＡは、トランスフェクションおよび安定な組み込み後に組換え遺伝子の高レベルの発現を引き起こす。特定の遺伝子座の選択およびクローニングおよび組換え遺伝子の発現、並びにＤＮＡベクターおよび宿主細胞を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （背景技術） 組換えタンパク質の製造のための発現系の開発は、研究または治療に使用する
ための所定のタンパク質の供給源を提供するうえで重要である。発現系は、大腸
菌などの原核細胞、および酵母および哺乳動物細胞の両者を含む真核細胞の両者
で開発されている。哺乳動物細胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（また
は「ＣＨＯ」）細胞での発現は、多くの場合、治療用タンパク質の製造にとって
好ましい。なぜならそのような発現系での翻訳後修飾は、微生物（原核細胞）発
現系で生じるタイプの翻訳後修飾に比べてヒト細胞のタンパク質発現において認
められるものに類似していることが多いからである。

【０００２】 真核遺伝子の転写は、種々のシスおよびトランス作動性の調節エレメントによ
り制御されている（Dillonら、(1993) Trends Genet. 9: 134）。最もよく特徴
付けられているシスエレメントはプロモーターおよびエンハンサーである。プロ
モーターは遺伝子のコード配列の直ぐ５'側にあるＤＮＡ配列であり、トランス
作動性の転写因子のためのマルチプル結合部位を包含し、基本的な転写装置を形
成している。エンハンサーもまたトランス作動性の転写因子のためのマルチプル
結合部位を構成するが、コード配列のはるか上流または下流さらにはイントロン
内にさえも見出される。これらエレメントはまた方向に依存しない仕方で作動す
ることができる。プロモーターおよびエンハンサーの活性は一過性の発現系で検
出することができ、組織に特異的なまたは特異的でないエレメントを含む。

【０００３】 他のカテゴリーのシス作動性調節エレメントはクロマチン構造を制御している
と思われるものであり、遺伝子転座調節領域（「ＬＣＲ」）（Grosveldら、(198
7) Cell 51: 975）、マトリックス付着領域（「ＭＡＲ」）（Phi-Vanら、(1990)
Mol. Cell. Biol. 10: 2302）、スカフォールド付着領域（「ＳＡＲ」）（Gass
er & Laemmli (1987) Trends Genet. 3: 16）、インスレーターエレメント（ins
ulator elements）（Kellum & Schedl (1991) Cell 64: 941）および核マトリッ
クス結合ＤＮＡ（Nuclear matrix-Associating DNAs）（Bode J.ら、(1992) Sci
ence 255: 195）を含む。ＭＡＲおよびＳＡＲは長い距離にわたって作動しうる
という点ではエンハンサーに似ているが、その作用が安定に形質転換された細胞
株またはトランスジェニック動物でしか検出できない点で独特である。ＬＣＲも
また位置および方向に依存する点および組織に特異的な仕方で活性である点でエ
ンハンサーとは異なる。

【０００４】 所望のタンパク質の全体または一部をコードする目的遺伝子を含む組換え発現
プラスミドは、所望の組換えタンパク質を発現する安定なＣＨＯ細胞またはトラ
ンスフェクトーマ（transfectomas）を生成するために常用される。これら組換
えプラスミドは、組換えタンパク質を産生する宿主のゲノム中にランダムに組み
込まれる。しかしながら、組換え遺伝子が安定に組み込まれ、所望の組換えタン
パク質を高レベルで発現しうるトランスフェクトーマの頻度は極めて低い。通常
、安定にトランスフェクションされた多数の哺乳動物トランスフェクトーマをス
クリーニングして組換えタンパク質を高レベルで発現するクローンを同定しなけ
ればならない。このことは、とりわけ哺乳動物のゲノムのサイズが大きいことお
よびゲノムＤＮＡの０.１％しか転写に活性な配列を含まないという事実に照ら
して、ゲノムの環境（ホットスポット）およびプラスミドのコピー数によるもの
と広く信じられている（Little (1993) Nature 366: 204）。ＣＨＯ細胞のゲノ
ム中にプラスミドをランダムに組み込むという現在の技術が、遺伝子増幅の可能
な転写ホットスポット中に組換え遺伝子が挿入され高レベルの遺伝子発現へと導
く結果になるであろうことは極めてありそうにないことである。

【０００５】 発現増強配列（expression augmenting sequences）が組換えタンパク質の発
現を増加させることが開示されている（Morris, A.ら、真核発現系のための発現
増強エレメント（ＥＡＳＥ）：ＷＯ９７／２５４２０）。高レベル組換え遺伝子
発現細胞株の頻度の増大は、高タンパク質発現トランスフェクトーマの選択のた
めの遥かに大きなプールを提供するであろう。このことは、転写ホットスポット
をターゲティングした相同な（homologous）組換えプラスミドを生成し、そのよ
うなトランスフェクトーマの選択のための手段を工夫することにより達成できる
。

【０００６】 （発明の要約） 哺乳動物宿主細胞での組換えタンパク質の増大した発現を容易にする新規な転
写調節配列（本明細書では「ＨＩＲＰＥ」（タンパク質発現増大のためのホット
スポット）（Hot spot for Increased Recombinant Protein Expression）と称
する）が開示される。本発明の好ましい態様は、ＣＨＯ細胞のゲノムＤＮＡから
得たＨＩＲＰＥである。

【０００７】 本発明は、高い組換え遺伝子発現が可能なＣＨＯ細胞ゲノム中のゲノム遺伝子
座からのＨＩＲＰＥを開示する。これら遺伝子座は、哺乳動物ゲノム中の複製起
点、遺伝子増幅、およびＭＡＲを規定する配列エレメントを含む。本発明の最も
好ましい態様において、ＨＩＲＰＥは（ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜５０
０６を含むＤＮＡ；（ｂ）ＨＩＲＰＥ活性を有する配列番号１の断片；（ｃ）（
ａ）および／または（ｂ）に相補的なヌクレオチド配列；（ｄ）（ａ）、（ｂ）
および／または（ｃ）の配列と少なくとも約８０％、さらに好ましくは約９０％
、さらに好ましくは約９５％同一であり、ＨＩＲＰＥ活性を呈するヌクレオチド
配列；および（ｅ）上記核酸配列の組合せであってＨＩＲＰＥ活性を呈するもの
よりなる群から選ばれる。

【０００８】 新規なＨＩＲＰＥを含む発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を形質転換して組換えタ
ンパク質の発現を増大させることができる。それゆえ、本発明の他の側面はＨＩ
ＲＰＥを含む発現ベクターである。好ましい態様において、該発現ベクターはさ
らに、目的タンパク質の全体または一部の発現を駆動する真核生物プロモーター
／エンハンサーを含む。２またはそれ以上の発現ベクターを用いて細胞（たとえ
ば、ＣＨＯ細胞）をトランスフェクションすることができ、その際、各ベクター
は（発現されたときに）組み立てられて所望のタンパク質を形成する異なるポリ
ペプチドをコードする核酸配列を含んでいる。さらに好ましい態様において、発
現ベクターは、第一のエクソンが目的遺伝子をコードしており、第二のエクソン
が増幅可能なドミナント選択マーカーをコードしているようなプラスミドを含ん
でいる。好ましいマーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（「ＤＨＦＲ」）である
；他の増幅可能なマーカーもまた本発明の発現ベクターに使用するのに適してい
る。

【０００９】 哺乳動物の宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換して高レベルの組換え
タンパク質を産生させることができる。従って、本発明の他の態様は本発明の発
現ベクターで形質転換した哺乳動物宿主細胞を提供する。また、２つの発現ベク
ターで形質転換され、これら２つの各発現ベクターがポリペプチドサブユニット
をコードしており、これらが同時に発現されたときに生物学的活性を有する所望
のタンパク質に組み立てられるような哺乳動物宿主細胞もまた本発明の範囲に包
含される。最も好ましい態様において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。

【００１０】 本発明はまた、組換えタンパク質を得る方法であって、宿主細胞を本発明の発
現ベクターで形質転換し、形質転換した宿主細胞を該タンパク質の発現を促進す
る条件下で培養し、ついで該タンパク質を回収することを含む方法をも提供する
。本発明の好ましい適用において、形質転換した宿主細胞は２つの選択工程で選
択される。第一の工程はドミナントな増幅マーカーを発現する細胞の選択であり
、第二の工程はマーカー遺伝子並びに目的遺伝子の高い発現レベルおよび／また
は増幅の選択である。好ましい態様において、組換えタンパク質はＣＴＬＡ４−
Ｉｇまたは異なる形態のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を形成するその変異体、たとえば
アミノ酸配列に対する置換、付加および欠失変異体を含む。ＣＴＬＡ４およびＣ
ＴＬＡ４融合タンパク質（たとえば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）の詳細な説明について
はＷＯ９３／００４３１を参照のこと（その全体を参照のため本明細書中に引用
する）。

【００１１】 （発明を実施するための最良の形態） 本願出願人は、発現ベクター中に挿入したときにリポータータンパク質の発現
を安定な細胞プールにて２〜１０倍改善しうる新規な配列エレメントを単離およ
び同定した。本願出願人は、これら新規な配列エレメントをＨＩＲＰＥ（タンパ
ク質発現増大のためのホットスポット）と称する。

【００１２】 本発明の核酸分子を含むＤＮＡクローンは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（「ＡＴＣＣ」）（バージニア２０１１０−２２０９、マナサス
、ユニバーシティー・ブールバール、１０８０１）に１９９８年８月２５日にＡ
ＴＣＣ寄託／受託番号２０３１５３として寄託してある。本明細書に言及する寄
託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の約定の
もとに維持されるであろう。この寄託は当業者の便宜としてのみ提供されるもの
であって、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１２のもとに寄託が要求されることを承認するも
のではない。寄託した材料に含まれるポリヌクレオチドの配列は参照のため本明
細書中に引用され、本明細書中の配列の記載と矛盾する場合には照合される。寄
託した材料を製造し、使用し、または販売するにはライセンスが必要であり、そ
のようなライセンスはここでは許可されない。

【００１３】 本発明は、ＣＨＯ細胞宿主ゲノム中の組換えタンパク質の組み込み部位の同定
、およびＣＨＯ細胞で組換え遺伝子の高発現を達成するための相同組換えベクタ
ーの構築に関する。さらに詳細には、本発明は、ＣＨＯ ＤＧ４４宿主ゲノム中
のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位の同定に関する。

【００１４】 ＨＩＲＰＥ活性は、目的タンパク質をコードする遺伝子の両末端のフランキン
グ領域で同定された。以下に詳細に説明するように、これらフランキング領域を
分離し、シークエンシングして本明細書に開示した新規なＨＩＲＰＥ配列を決定
した。ＨＩＲＰＥ配列を得るのに用いたＤＮＡプライマーの詳細図を作成してあ
る（図９）。本発明の新規なＨＩＲＰＥ配列は、下記核酸配列（配列番号１）を
含む。

【００１５】 TAGGCTAGCC TGCCTCACAA GCTTCCTGGC TCCTCTCTAA CATCTCCCTT 50 TAAATCACTG GGCTCACCAA CATTCCTGCT GCAGTGTCAG GTTTGTTCCT 100 GACTTTAGGG ATTCAAACTC AGGTCCTCAC ACTTGTGTTG CAAAGCTTAC 150 TCAGAGAGTC ATCTGCTCCA CCCGGCTGTT TGTGTTTTGA GACAGGGTCT 200 CCCTATGTAT CTCAGGCTGA CCTCCAACTG ACTCCCTTCC TCCTAACTGC 250 CTCCCTAGTG CTAGGATCCC AGGCCTTTCT TCCCATGATT CTGGGAAAGG 300 CAACACTAGG GACAACTCCC TGGTATACTG AGGGCTCCTG CAGGGACCCT 350 TGCATCCCAT CCTTGGCCAC TGGCCTATAG GGACTCCCTG TGATCCCTGC 400 TTTCTAGCAT TGCCCTGGCT CCACTCATCT TCTTGTTACT TTAATCACTT 450 CCAACATTAA GTTTTTGAAA AGTTGCAGTT TCTACCCTGA GAACATACAC 500 AAATGACTCA TGGGCGAGAA GACTCTCAGT GCCCACATCA TTGCAGAGAT 550 TCAGATCAAA ACTCCAGTGA GTCATCACTT CAACCCCCTG GGAAGAGCAC 600 ATCAAAAACA ATTCTTTTCT TTTCTTCTCT TTTCTTTTCT TTTCTTTCTT 650 TTTCTGACAA CACTGGGGAT TGAGTCTAAG GCCTCATGCA CCTTAGGCAA 700 GCGCTCTACC ACTGAGCTAC AGTCCTAACT TTTTTTTTCT TTTTAAGAAC 750 AATAAAAAAC AAAAACAAAA TATAAAACAA GGGAAACATG GAGGCACATG 800 CTGGTAATCC CAACACTACA GAGGCAAAGA CAGAGGCAGG AAGGACATAA 850 TAAATTCCAG ACCAGCTGGT GTTAGAATGA GACCCTGTCT CAGAAAGAAA 900 GAAAAAAAAG AAAGAAAGAA AGAAAGGAAG AAAGAAAGAA AGAGGGAGGG 950 AGGAGGGAGA AAGAGAGGAA TGGGCAAGGA TGTAGAGAGA CGAGAAACTT 1000 TGTGCACTAT CATGAAAGCA AAATAGTGCA GTCGCTGTGG AGAATGGTAT 1050 GGTAATGCTG GAAAGAAGGC TCATCGAGGA AATGACTTGC AACCAAACCC 1100 GAAGACTCGA GTTTGATCCC TGATACCTAC ATGGTAGAAG AACTAACTCT 1150 ATCAAGTAGT CCTTTGACTT CCAATGTATG CTGTGGCCCA TACAGTCCTC 1200 TTCCCCCAAT AAATAATGTA ATTAAAAAAA GAAAAGGGGC TGGAGAGATG 1250 GCTCAGTGGT TAAGAGCATT GGCTCTTAAT CCAGAGAACC CGGGTTCAAT 1300 TCCCANCACC CACATNGCAG CTTACAACTG CCTCCAGGGG GTCCAACACC 1350 CTCACACAGA CATACACACA GATAAACAGC AATGTACATA AAATAAATAA 1400 ATTATTTTTA ACAACAACAA AAAAAAATGA AAAGAAAAGA AGGCTGGGCA 1450 GTGGTGGCAC ACCACATACC TTTAGTCTTT GTACTCAGGA GTCAGAGACC 1500 GGCAGATCTC TGTGAGTTTG AGGCCAGCCT GGTCTACAAA GCAAGTTCCA 1550 GAACATCCAG GGCTGTTACA CAGAGAAACC TCAAAATAAA ATAAAATAAA 1600 ATAAAATAAA ATGGAAGAAA CAAACAAAGA AAGAAAGAAA GAAGAAAAGA 1650 AAAGGAAAAA GAGCATGATA GTTCTTCAGA AAGTTAAGCG TTGCTACTGA 1700 TGGTGGCCTG AAGTCCTGTC TTCAATACTC CACAATAAGT AATAGTGGCA 1750 AACAAGTACA TAATCCAGCT AAGCACTAAA TTACCCATGT CTTCCTCTTT 1800 GGGTACCTCA AAGAGTGACA GGCAGCCTTA TTAGAGTGAC ATTGTCTTTA 1850 AACCCAGCAT GACCATCTGA TGAACTGCTG TGATGCCCAG GGAAGACAGG 1900 GTAACCTCGA AGTCCAAGTA CTTCCTTAAG ACCATTTAAC TTCTGGATGA 1950 TTATTAAAAA TGCTTCATTG TAGGAGCAGA CAGTATGGAC TCTGAGGCCA 2000 TCAGCAGATT GCATATCCCT TCAAGGGAAG ACTGTGGGGC TGATGGGCAA 2050 GAAACCAAAA TAGCTAACAA GAGCTATTTA AGGCAGGAAG AGTCCATGTT 2100 GGTTTGCAGT TCAAGGGTAC AGTCCATCAC GGTGAAGAAG ACAAGATGGC 2150 AGAAGCATGG GGCAACCGGT CACATTGTGT TCACCAACAG GAAACAGAAA 2200 ACAACAAATG CCGTGCTGGG CTCACTTTCT CCTTTTTTCC TTTTCATTCA 2250 GCTTGGAACT GCTACCCGTG AGATGATGCC ACCCATGTTC AGGGTAGATC 2300 TTCCCTTTTT TTGTTGAGCT TCTCTAGAAA TACCCTCAAA GACACATACA 2350 GTAGTATGCC TCCCAGAGGA CTCTAATGCA AGTAGTGACA AGGAAGTTTA 2400 ACCATCATAG CCGGCAAACC TAGGGTTGAT ACCTTTAATA TAGATTCCTT 2450 TCGGTAGTCT GAGTATGCCT AGTCTAATGC TTGAGTCTTC GAAAAGAACT 2500 CCAGCTGGAG GCTGAGAAGA TTCATTGGTG CACGTTGCAG TTTGCATGGG 2550 GAGAGGCTGC TGTCTGTGGC TGAAGGGAGC AGTGTGCAGA GTATGAGGAT 2600 GAATAGGAGA AGAGCTAGGT GCAAAGTCCA CCGTCCACTT GTCACGGGGC 2650 CCCTGGATGA CCACCATCAA GGAAATGGAG CCCAATACCT GAAAGGTTTG 2700 AGTATGGCCA ATGAGGCCAG AAGAAATTGA GAGTGAGTCA ACCTTAGAGG 2750 AAGATCTACA ATTCTGCTGA CCCCATGATG TTGACCTTAT GAAGCTAAAA 2800 CATAATAAAT GGACTTCCCA CTGATAGAGG TGCAAGATGA ACAAGCCTAT 2850 CTCCATTCGT CAGTCACTGA ACTTGGGATG ATCTGTTAGG GCAGCAACAG 2900 AAAACTAATA TAAATATATA TGTATATGAT ATTTATTGGT TTTTCAGTAC 2950 TTTCCTAGTG AGAGTCATTG CTATGCAGAT ATTGCACGAT GCTATTTATC 3000 ACTTTCCACT TACCCAGCTG AAGCAATCCG TCACTATCTG AGAGCCTCTC 3050 TGCAGTTCAG ATTTGAGTGT CACAGGCATT GTTTCTGAGG CTCTCTGGGA 3100 AACGTACTCC TTCTCTACAG GAGCCTGGCG TCTGGCTGGA GAAAGACTGA 3150 GTGCCTGAGG GTTGTTTCAG AGGCACCAAT CAATACTCAC CCATTAGGAC 3200 AACAACTCCC ACGCATCCAC TAAACTTTGA CCTCCGTGCT CCAGAGAGGT 3250 CCCAAGATGC CAATTGATGC ACAGGCCATA TACATAGTCC ATGAATGCAA 3300 TGCCTTTCAT AGACTCCCTG TGAATTAAAT CATAGAGACT TTAGCAATGG 3350 CAACATAATG TTGTTCATGT ACTAGCAAGC CTGGAATGTG TACAGAGAAT 3400 GCCTGGATTA AAGCTGTGAT GGTATTTGTG CCTTTAAGAA AGGCTTGTGT 3450 CCTTTAAAAA GGTCTTGAGG ATAAATTCTG CATTCAGAAT GTTGGCTAGC 3500 TGTCACTGTC CTCTATATGA CTGGGTGGTG CTGGCATAAG ACTACTGTAA 3550 GCCAGACATG AAATAAGCAC TTGTGGTAGC CCCAAGACCC AACAACAAGC 3600 TTGAGTACAC ACCCTTCCTA GAAATCAGTA GACAGGCCAA GAAGACCTTT 3650 AAGTGTGTTT CTCTTTTATG TGAAACTTTG TGGATTTTAT TTCCCCAGAA 3700 ATGCGTTTTG GGGGGACTTC TTCATTATGG TCTATTGTCA CATAAATTGT 3750 GCTCTTCACA GAAAAGGGTG ATGAAACCCT GTTCCTTGAC TGGGTTGAGT 3800 GGGATCCACT GCCAAACAGC TGTCTGGGGA TAAAACAGAA TAGCTGATTT 3850 GGAAAGACTT AAAAGGGTAA TCATTTTGAT GTTGGTGGGA GTTCGTATCT 3900 GAATGCCATG TTATAGCTTC TTATATCCAA ACAGAATGGT CCACATGTAT 3950 GCCCTGTGTG CCAACAGAGG TCTCCAGTGC CCTATAAGAA GGGCTAGCAG 4000 GAGAGAAGAA TGAAGTCCAT GGAAGAAAAA GTTACAGACT TCAAAAGCAC 4050 CAAAAATCAC TGGGAACCAA AGCAAGTTTC CCACTATCCC CGCCCCCCCC 4100 CTTGCTGGTT TCTTCTGAAA TGTTATGCCT CTTGATAATT GGCCTGCCCA 4150 AGGTTGCAAC CTTCATGTGC CTTGGGTCCA TTTCACTTCT AGCTCTTTAA 4200 GTATATAAAT AAATAGATAA TTAGATGATG GAGTAGGCTC TGTGGGCTTT 4250 ACTTCATTCA TCTGGCTCCT GAACTTGAAT CCAGGCCCAT TTGAAATCCC 4300 AGGGAAGGTT TTGGCTGGGT GTGGGGGCAT AGCTGTGTTC CAGTTGGCTG 4350 ACTCTTCACC TGGTAGAGAG GACAGGAAGT AAATGGGAGT TATTTCCAGA 4400 ACAGGGCAGG GNATGTAGCT CTGTGGTAGA GCACACAGAT GCGTCCCCAG 4450 CATGACCAAA GACCCACTAA CAGGAACACA GACATTTTCT GAATTAAACA 4500 GTAGCAGAGT AACCTTGGCT TTTTGTTTTT TTATTTACTT ATTTGTTATT 4550 GTTTGGGGTT GTTTTTGGTT TTGGTTTTTC TTTCTTTTTT TTTTAAGATT 4600 TTATTTATTT ATTATGTATA CAACATTGTA TATTTGCACA CCAGAAGAGG 4650 GAACCAGATC TCATAATGGA TGGTTGTGAG CCACCATGTG GTTGCTGGGA 4700 ATTGAACTCT GGACCTCTGG AAGAGCAGTC AGCACTCTTA ACCTCTGAGC 4750 CATCTATCCA GCCCCTTGGT TTTGGTTTTT CAAGCAGGGA TTCTCTGTCC 4800 TGTAGCTTAC ATTGTAGACT AGGATGGCCT GGAACTCTCA GAGATCCCCT 4850 CACCTCTGCC TCCTGGTGCT GGATTAAAGG TGTGTGTGTG ACACCACCAC 4900 GTAGCAATTT GTACATTATT ATCTCATTTC TCCATTACTA TAATCCTGTG 4950 AAGATACCAG CACTNAGAGA AGCCATGCAA CTTGCCTAAG GACACATAGT 5000 GAATTC 5006

【００１６】 さらに、本発明は、ＨＩＲＰＥ活性を呈する配列番号１の断片を包含する。本
発明において有用な断片の好ましい例は、配列番号１のヌクレオチド３０５０〜
４６７６を含む１.６ｋｂの配列である（この好ましい断片は配列番号２に示し
てある）。

【００１７】 単離した５.０ｋｂの配列（配列番号１）およびより短いその断片を含む発現
ベクターは、ＣＨＯ細胞を形質転換して高レベルのタンパク質発現を導くことが
できる。本発明の新規なＨＩＲＰＥは、それが連結しているプロモーター／エン
ハンサー領域によって駆動される組換えタンパク質の発現を改善するのに有用で
ある。

【００１８】 さらに、ＨＩＲＰＥ活性を呈する配列番号１のさらなる断片、並びに他のタイ
プの細胞からのまたは形質転換細胞中の他の組み込み部位からの同様のＨＩＲＰ
Ｅモチーフを同定することができる。さらに、制限酵素消化により調製したＤＮ
Ａの断片のその後のプロセシングが該断片の末端からのさらなるヌクレオチドの
除去という結果となりうることが当該技術分野で知られている。

【００１９】 配列番号１の断片の他の組合せ、たとえば配列番号１の全体または一部の複数
のコピーを含む配列を開発することもできる。そのような組合せは、隣接して連
結させるかまたは断片の最適のスペーシングを与えるように配置することができ
る。さらに、配列番号１の配列と、該配列内の挿入配列（たとえば、配列番号１
内のある選択した部位での所望のタンパク質をコードする遺伝子の挿入）とを含
む発現ベクターも本発明の範囲に包含される。

【００２０】 本明細書に開示するＨＩＲＰＥはＣＨＯ細胞から単離した。組換えタンパク質
の発現を増大させる相同配列は、他の哺乳動物種からの細胞、並びに他の組織の
タイプからの細胞株にも存在することが予想され、当該技術分野でよく知られた
技術、たとえば交差種（cross-species）ハイブリダイゼーションやＰＣＲベー
スの技術により単離することができる。さらに、配列番号１または配列番号２に
示すヌクレオチド配列を、当該技術分野で知られた部位特異的突然変異誘発法ま
たはランダム突然変異誘発法により変化させることができる。ついで、得られた
ＨＩＲＰＥ変異体を本明細書に記載するようにＨＩＲＰＥ活性について試験する
ことができる。ＨＩＲＰＥ活性を有する、配列番号１の配列と少なくとも約８０
％、さらに好ましくは約９０％、およびさらに好ましくは約９５％同一のＤＮＡ
またはその断片は、通常の実験により単離され、ＨＩＲＰＥ活性を有することが
予想される。配列番号１の断片については、同一性パーセントは該断片中に認め
られる参照天然配列の部分を指称している。従って、開示したＨＩＲＰＥ配列お
よびその変異体もまた本発明により包含される。

【００２１】 組換え発現ベクターは、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適当な転
写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結した、タンパク質をコードする合
成またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を含む。そのような調節エレメントとしては
、転写プロモーター、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、お
よび転写および翻訳の停止を制御する配列が含まれる。哺乳動物発現ベクターは
また、非転写エレメント、たとえば、複製起点、発現すべき遺伝子に連結した適
当なプロモーターおよびエンハンサー、他の５'または３'フランキング非転写配
列、５'または３'非翻訳配列、たとえば必要なリボソーム結合部位、ポリアデニ
ル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、および転写停止配列をも
含む。宿主中での複製能を付与する複製起点、および形質転換体の認識を容易に
する選択遺伝子も含まれていてよい。

【００２２】 ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に連関しているときに作動可能に連結し
ているといわれる。たとえば、プロモーターは、それがコード配列の転写を制御
しているならば該配列に作動可能に連結している；またはリボソーム結合部位は
、それが翻訳を可能とする位置にあるならばコード配列に作動可能に連結してい
る。細胞を形質転換するのに用いる発現ベクター中の転写および翻訳調節配列は
当該技術分野で知られている。

【００２３】 形質転換した細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクターで形質転換また
はトランスフェクションした細胞であり、組換えタンパク質の全体または一部を
コードする配列を含む細胞である。発現タンパク質は、選択したＤＮＡに応じて
細胞培養の上澄み液に分泌させるのが好ましいであろうが、細胞膜中に沈積させ
てもよい。組換えタンパク質を発現させるのに種々の哺乳動物細胞培養系を用い
ることができ、これらはすべて当該技術分野でよく知られており、たとえばサル
腎臓細胞のＣＯＳ細胞株、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ細胞株を用
いることができる。

【００２４】 一般的に用いられる細胞株はＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞株であり、これはグリシン
、チミジンおよびヒポキサンチン栄養要求性であり、増幅可能なドミナントマー
カーとしてＤＨＦＲ ｃＤＮＡを用いて形質転換してＤＨＦＲ^＋表現型とするこ
とができる。一つのそのような知られたＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞はＤＫＸＢ１１（
Urlaubら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216）である。特異的な選
択または増幅スキームのために開発された他の細胞株もまた、本発明の新規なＨ
ＩＲＰＥに有用であろう。

【００２５】 幾つかの形質転換プロトコールが当該技術分野で知られており、たとえばKauf
manら、(1988) Meth. Enzymology 185: 537に概説されている。選択する形質転
換プロトコールは宿主細胞のタイプおよび目的遺伝子の性質に依存するであろう
し、日常的な実験に基づいて選択することができる。そのようなプロトコールの
基本的要件は、まず目的タンパク質をコードするＤＮＡを適当な宿主細胞に導入
し、ついで該ＤＮＡを安定な発現可能な仕方で導入した宿主細胞を同定および単
離することである。目的タンパク質をコードするＤＮＡを導入するのに有用な方
法の例は、Wiglerら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567；Schaffne
r (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2163；Potterら、(1988) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 81: 7161；およびShigekawa (1988) BioTechniques 6: 742
に記載されている。

【００２６】 目的遺伝子を増幅する方法もまた組換えタンパク質を発現させるのに望ましく
、典型的に選択マーカーの使用を含む。細胞毒性の薬剤に対する耐性は選択マー
カーとして最も頻繁に用いられる特性であり、優性の形質（すなわち、宿主の細
胞型とは独立に用いることができる）かまたは劣性の形質（すなわち、選択すべ
き何らかの活性に欠ける特定の細胞型で有用である）のいずれかの結果となりう
る。幾つかの増幅可能なマーカーが本発明に用いるのに適している（たとえば、
Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual、コールド・スプリングス
・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク(1989)に記載されている）。薬剤耐性
の哺乳動物細胞での遺伝子増幅に有用な選択マーカーとしては、ＤＨＦＲ−ＭＴ
Ｘ（メトトレキセート）耐性（Altら、(1978) J. Biol. Chem. 253: 1357; Wigl
erら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567）、および当該技術分野で
知られた他のマーカー（たとえば、Kaufmanら、(1988) Meth. Enzymology 185:
537に概説されている）が挙げられる。

【００２７】 以下の実施例は本発明の態様を説明するものであって、いかなる意味において
も本発明の範囲を限定することを意図するものではない。上記あるいは下記で本
明細書中に引用された文献はすべて、参照のため本明細書中に引用される。

【００２８】実施例１ ：本発明のＨＩＲＰＥの同定 ＣＨＯ細胞株Ｐは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を高レベルで発現する細胞株
である。この細胞株は、ランダム組み込みを含む哺乳動物細胞株を産生する最も
好ましい方法を用いて選択した。細胞株Ｐを生成するのに用いた哺乳動物発現プ
ラスミドは改変したｐＣＤＮＡ３プラスミド（Invitrogen, Inc.より入手可能）
であった。このベクター中にＤＨＦＲ遺伝子を組み込んでドミナントな選択マー
カーとした。このプラスミド中の組換え遺伝子発現カセットは、ＣＭＶプロモー
ターおよびＢＧＨポリアデニル化配列によって駆動される。細胞株ＰのゲノムＤ
ＮＡ分析は、この細胞株にプラスミドＤＮＡの複数のコピーが安定に組み込まれ
ていることを示唆していた。このプラスミドＤＮＡの増幅は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ
遺伝子をコードするＤＮＡの同時増幅という結果となり、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの高
発現細胞株へと導いた。

【００２９】 ランダム組み込みを用いてＣＨＯトランスフェクトーマを生成する技術分野の
当業者は、高発現細胞株を生成するためには選択マーカーとしてＤＨＦＲ遺伝子
を含むベクターは転写ホットスポット中に組み込まれ、遺伝子コピー数が首尾よ
く増幅されなければならないことを認識している。トランスフェクションした細
胞のうち遺伝子を充分に増幅するもののパーセントは、予想されるように低い、
なぜなら文献は哺乳動物ゲノム中で遺伝子増幅が可能なゲノム遺伝子座は稀であ
ることを示唆しているからである（Robbins (1981) Cell 23: 29; McArthur (19
91) J. Biol. Chem. 266: 6000）。細胞株Ｐ中のＣＴＬＡ４−Ｉｇプラスミド組
み込み部位に隣接するゲノム遺伝子座は、遺伝子増幅および高転写活性に必要な
エレメントを有する独特の遺伝子座の一つを表していた。

【００３０】 ＣＨＯ細胞中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子に隣接するゲノム遺伝子座に組換え遺
伝子を送達するための相同組換えベクターの構築には、当該技術分野で知られた
方法を用い（たとえば、Yarnoldら、(1994) Cancer Research 54: 506; Adair (
1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4574; Smithら、(1989) J. Mol. Bio.
213: 415を参照）、細胞株ＰからのフランキングゲノムＤＮＡをクローニングし
、クローニングした断片を適当な真核発現ベクター中に挿入する必要があった。
このことは、まず組み込み部位をフランキングしているＥｃｏＲＩ生成ＤＮＡ断
片のサイズをマッピングし、ついで大腸菌でＣＨＯゲノムライブラリーを構築し
、これらゲノム断片を含む個々のプラスミドＤＮＡを単離することにより達成し
た。

【００３１】 サザーンブロット分析はＣＨＯ細胞でのＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位のマッ
ピングを容易にした（図７）。本発明者らは、ＣＨＯ細胞株ＰでのＣＴＬＡ４−
Ｉｇ組み込み部位を分析するためにサザーンブロット分析を用いた「ＤＮＡウォ
ーキング」と呼ばれる戦略を用いた。ＤＮＡウォーキング法では、既知のプラス
ミドＤＮＡ配列を用いて該プラスミド配列をフランキングしている未知のＣＨＯ
ゲノムＤＮＡを特徴付けた。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位を分析するため、約
１０μｇのＣＨＯゲノムＤＮＡを１００単位のＥｃｏＲＩ制限酵素（New Englan
d Biolabs）で消化した。制限消化したゲノムＤＮＡを０.７％アガロースゲル上
のアガロースゲル電気泳動に１５ボルトで１２時間供した。この方法によりＤＮ
Ａは分子サイズによって分離され、高分子量のＤＮＡは上部にくる。

【００３２】 アガロースゲル中に埋められたゲノムＤＮＡを０.４Ｍ ＮａＯＨで約３０分間
変性させ、バキュームブロッター（vacum blotter）（Bio-Rad）を用いて０.４
５ミクロンニトロセルロースメンブレン（Boehringer and Mannheim）に９０分
間移した。ブロッティングしたフィルターを２×ＳＳＰＥ緩衝液で中和し、ＵＶ
架橋装置（Stratagene；Ｃ３に２０秒間セッティング）を用いてＤＮＡをメンブ
レンに架橋した。サザーンブロットに用いた１.２ｋｂのハイブリダイゼーショ
ンプローブは、Boehringer Mannheimの標識キットを用いてジゴキシゲニン標識
したＰＣＲ断片であった。このＰＣＲ断片は細菌のベータ−ラクタマーゼ遺伝子
に由来し、下記オリゴヌクレオチドプライマーを用いて調製した：フォアウォー
ドプライマー：ＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣ（配列番号
２）；リバースプライマー：ＣＧＧＴＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧ
（配列番号３）。

【００３３】 ジゴキシゲニン標識したＤＮＡを化学ルミネセンス検出キット（Boehringer M
annheim）を用いて検出した。ゲノムＤＮＡを含むニトロセルロースフィルター
を５ｍｌのEasyハイブリダイゼーション緩衝液（Boehringer Mannheim）中の５
μｌのハイブリダイゼーションプローブと６８℃で１６時間ハイブリダイズさせ
た。フィルターを２×ＳＳＣで６５℃にて３０分間、２回洗浄し、フィルターを
化学ルミネセンスアッセイキット（Boehringer Mannheim）で５分間発色させた
。このサザーンブロット分析により、ベータラクタマーゼプローブにハイブリダ
イズした７.５ｋｂのＣＨＯゲノム左フランキング領域（「ＬＦＲ」）が明らか
となった。この７.５ｋｂ断片の制限マッピングにより、該断片がベータラクタ
マーゼ遺伝子を含む２.５ｋｂのプラスミドＤＮＡと５.０ｋｂのＣＨＯゲノムＤ
ＮＡとを含むことが明らかとなった。同様に、サザーンブロット中のＥｃｏＲＩ
消化ＣＨＯゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブとして０.９ｋｂの
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡでプローブし、ＰＣＲ反応（Ｐ
ＣＲプライマー：フォアウォードプライマー：ＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＡ
ＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＴＣＣＧ（配列番号４）；リバースプライマー：ＣＡＣＧ
ＧＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号５））を用
いて生成した。ジゴキシゲニン標識ハイブリダイゼーションプローブの調製およ
びハイブリダイゼーション条件は上記に記載した条件と全く同じであった。しか
しながら、右のフランキング領域を調べるのに用いたハイブリダイゼーションプ
ローブは（ベータ−ラクタマーゼ遺伝子の代わりに）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子に
由来するものであったので、サザーンブロット分析は１０.０ｋｂの右フランキ
ング領域（「ＲＦＲ」）ＤＮＡバンドを明らかにした。このハイブリッドＤＮＡ
断片は、５.０ｋｂのプラスミドＤＮＡ（ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよびｄｈｆｒ遺伝
子）および５.０ｋｂのＣＨＯゲノムＤＮＡを含んでいる（図７）。

【００３４】 サザーンブロット分析に基づき、ＣＨＯ細胞株ＰからのゲノムＤＮＡを用いて
７.５ｋｂおよび１０.０ｋｂのフランキングゲノム断片をクローニングした。Ｃ
ＨＯゲノムＤＮＡを、２００ｍｌのＰＦＣＨＯ血清不含培地中で増殖させた１×
１０^８のＣＨＯ細胞から単離した。遠心分離後、細胞ペレットをＤＮＡ抽出キッ
ト（Stratagene Inc.）を用いてゲノムＤＮＡを単離するために処理した。この
操作により１０ｍｇの全ゲノムＤＮＡが得られた。

【００３５】 フランキングゲノム配列を含むＥｃｏＲＩ消化ＣＨＯゲノムＤＮＡを富ませる
ため、１ｍｇのゲノムＤＮＡを１０００単位のＥｃｏＲＩ酵素（New England Bi
olabs#101S--２０単位／μｌ）で３７℃にて６時間消化した。ＥｃｏＲＩ消化を
フェノール抽出およびエタノール沈殿により停止させた。エタノールペレットを
２００μｌの水に再溶解し、Tris-酢酸緩衝液中、（５０Ｖの）定常電圧でのア
ガロースベッド電気泳動（Life Technologies Model 250電気泳動ユニット）に
供した。サイズ分離したゲノムＤＮＡを６.０〜１２.０ｋｂの分子量範囲のＤＮ
Ａについて富ませ、ＱＩＡＥＸゲル抽出キット（Qiagen Inc#20021）を用いてゲ
ルから抽出し戻した。この操作により、２６μｇのＥｃｏＲＩ消化したサイズに
富んだＣＨＯ ＤＮＡ断片が得られた。

【００３６】 ＥｃｏＲＩ末端を有する１μｇのゲノムＤＮＡを、同様に消化した抗生物質カ
ナマイシンに対する耐性を付与するカナマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝
子を含む細菌プラスミド（ｐＳＴＫＮ）中に挿入した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ne
w England Biolabs）を用いてゲノムＤＮＡとプラスミドＤＮＡとをライゲート
してＣＨＯゲノムライブラリーを生成した。ライゲートしたＣＨＯゲノムＤＮＡ
をエレクトロポレーション装置（Bio-Rad #）を用いて大腸菌（ＸＬ１ Ｂｌｕｅ
ＭＲＦ’Stratagene Inc., #200230）中に形質転換し、大腸菌でＣＨＯゲノム
ライブラリーを得た。

【００３７】 ７.５ｋｂの左フランキング領域をクローニングするため、本発明者らは抗生
物質アンピシリンに対する耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子の存在を利
用した。ゲノムライブラリーを含む大腸菌菌体を２つの抗生物質に耐性なクロー
ン（ａｍｐ^ＲおよびＫｎ^Ｒ）について直接スクリーニングした；ａｍｐ^ＲはＬＦ
Ｒ断片の寄与によるものであり、Ｋｎ^Ｒ遺伝子は細菌プラスミド（ｐＳＴＫＮ）
の寄与によるものであった。この手順により両抗生物質に耐性な８つの細菌クロ
ーンが得られた。これらクローンからのプラスミドＤＮＡの速やかなＤＮＡ分析
は、予想されたように７.５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を有するプラスミドを与え、
予想されたようにＬＦＲ断片の存在を示していた。

【００３８】 １０.０ｋｂの右フランキング領域のクローニングには、ハイブリダイゼーシ
ョンプローブとしてＰ^３２標識したＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子（ＤＮＡ）を用いた
コロニーハイブリダイゼーションの通常の分子生物学的方法が含まれていた。コ
ロニーハイブリダイゼーション法はMolecular Cloning laboratory Manual（コ
ールド・スプリングス・ハーバー・ラボラトリー）に記載されている。放射性標
識した ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子特異的なハイブリダイゼーションプローブを、Amersham
Life Sciencesから得たニックトランスレーションキット（#N5000）を用いて調
製した。約１００万の大腸菌クローンをスクリーニングして１０.０ｋｂ断片を
含む６つの推定クローンを単離した。これら推定クローンを２回目のコロニーハ
イブリダイゼーションで再スクリーニングしたところ陽性クローンが２つだけ得
られた。２つの陽性クローンからプラスミドＤＮＡをラピッドミニライセート（
rapid minilysate）プラスミドＤＮＡ単離法（Maniatis, Molecular Biology: A
Laboratory Manual、コールド・スプリングス・ハーバー・ラボラトリー、ニュ
ーヨーク(1989)）を用いて単離した。両クローンともに予想された１０.０ｋｂ
のＥｃｏＲＩ断片を生成し、ＲＦＲ断片が首尾よくクローニングされていること
を示した。

【００３９】 ７.５ｋｂと１０.０ｋｂのゲノムクローンの制限酵素消化パターンを比較した
ところ、プラスミドの組み込み部位でゲノムＤＮＡの複製をたよる（invoking）
共通サイズのＤＮＡバンドが明らかとなった。このことは自動ＤＮＡシークエン
サー（Applied Biosystems - PRISM310 Genetic Analyzer）を用いたＤＮＡ配列
分析により確認された。これら２つの結果は、左および右のフランキング配列が
同一であり、組み込み部位でのＤＮＡ複製により生じたものであることを示唆し
ていた（図２）。これら配列を本明細書では以下、ＦＧＳ（フランキングゲノム
配列（Flanking Genomic Sequences））と称する。

【００４０】 ５.０ｋｂのゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列分析は幾つかの独特の特徴を明らかに
した。ＧＣＧウイスコンシンＤＮＡ配列データ分析ソフトウエアを用いたＤＮＡ
ホモロジーサーチは、この配列が転写ホットスポットを表していることを示唆し
ていた。クローニングしたＦＧＳは、酵母およびＣＨＯ細胞で認められるコンセ
ンサス自律的複製配列（ＡＲＳ）と類似のＤＮＡモチーフを含んでいる（Sohnら
、(1996) Journal of Bacteriology 78(15): 4420; Markら、(1990) J. Mol. Bi
ol. 211: 19）。また、ＦＧＳは転写ホットスポットに共通に認められるＭＡＲ
と類似のモチーフを含んでいる（Harmuttら、(1995) Biochemistry 34: 4108）
。クローニングしたＤＮＡがＣＨＯ細胞からの転写ホットスポットであるとのこ
の情報をもとに、本発明者らは相同組換えベクターの構築を行った。

【００４１】 哺乳動物ゲノム中への外来ＤＮＡの組み込みは、標的ゲノム中のランダムな部
位でのＤＮＡ切断を伴うプロセスにより最も頻繁に起こると考えられる。最近、
内生の遺伝子増幅並びに異種のトランスフェクションしたＤＮＡの増幅のモデル
が提唱された。これらモデルの一つの構成要素は、遺伝子増幅の第一の工程とし
て組み込み部位でのラージ逆方向複製（large inverted duplication）の関与で
ある（Heartlein M. W.ら、(1988) Nucleic Acid Research 17(4): 1697-1716;
Passananti C.ら、(1987) EMBO J. 6: 1697-1703）。このモデルの必須の構成要
素は、逆方向繰返しの生成およびその後の遺伝子増幅の前提条件としての宿主ゲ
ノム中のＡ−Ｔリッチ繰返しエレメント中へのプラスミドＤＮＡの組み込みであ
る。

【００４２】 細胞株Ｐ中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位での逆方向複製の存在、およびＨ
ＩＲＰＥ中の３つの異なる繰返しエレメントの存在は、提唱されたモデルと一致
している。相同挿入組換えベクター中のＨＩＲＰＥ中の繰返しエレメントの存在
は、逆方向繰返しの生成および高発現に必要な遺伝子増幅を容易にするであろう
。

【００４３】実施例２ ：組換えベクター 相同組換えは、正確な部位特異的な遺伝子の組み込みおよび目的遺伝子の発現
を可能とする、酵母での遺伝子操作のための強力な手段であると考えられる（Or
r-Weaver, T.L.ら、(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78(10): 6354-8）
。しかしながら、哺乳動物培養細胞での相同組換え法の適用の可能性は、異常な
（illegitimate）組換え事象および適当な選択法の欠如によって圧倒されている
（overwhelmed）。ホットスポットへの組換え遺伝子の相同的挿入は、組換えタ
ンパク質を高発現する細胞株の増大した頻度を研究することを可能にする。この
概念は、相同組換え抗体発現系をマウス細胞に対していかにして作製するかの一
つの例として以前の刊行物に記載されている（Gregoryら、ＷＯ９５／１７５１
６）。

【００４４】 にもかかわらず、本発明は、すべての組換え遺伝子に対してより広く適用でき
ること、ＣＨＯゲノム遺伝子座の選択、クローニングした組換え遺伝子を一貫し
て増幅しうること、およびプラスミド組み込み部位でのゲノム複製の生成の点で
当該技術分野で知られているものと異なる。

【００４５】 上記のように相同組換えベクターは、遺伝子のタンパク質への転写および翻訳
に必要なエレメントを含む真核発現ベクターである。本明細書に記載する相同組
換えベクターは、ドミナント選択マーカーとしてＤＨＦＲ遺伝子を含むベクター
ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen Inc.）に由来する再度遺伝子操作したベクターであ
る。この発現ベクターをジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素を欠くＣＨＯ宿主細胞Ｄ
Ｇ４４およびＤＵＫＸＢ１１細胞中に導入し、ＤＨＦＲ遺伝子機能を相補するこ
とによってトランスフェクトーマをバックグラウンドに対して選択する（ジヒド
ロ葉酸レダクターゼを欠く変異チャイニーズハムスター卵巣細胞でのメトトレキ
セート代謝（Joannon P.ら、(1987) Biochem-Pharmacol. 36(7): 1091; Urlaub
ら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216））。

【００４６】 相同挿入組換えベクター（ｐＴＶ(Ｉ)として表す）は、全５.０ｋｂ ＨＩＲＰ
Ｅ配列（配列番号１）をクローニングしたゲノムＤＮＡを含んでいた（図３）。
このゲノム断片を５'末端のＮｏｔＩ制限部位および同一平面の３'（平滑）末端
で再構築し、前以て両立しうる（compatible）制限部位で消化しておいたｐｃＤ
ＮＡ／ＤＨＦＲ／ＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現ベクター中にクローニングした。得られ
た相同ベクターｐＴＶ(Ｉ)は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組換え遺伝子の５'末端にＣＨ
ＯゲノムＤＮＡを含んでいた（図３）。このプラスミドＤＮＡをQUIAGEN Inc.よ
り市販されているMidi−プラスミド単離キットを用いて精製した。ｐＴＶ(Ｉ)プ
ラスミドをＥｃｏＲＩ制限酵素で直線状にし、エレクトロポレーションによりＣ
ＨＯ ＤＧ４４細胞中に導入した。

【００４７】 ヌクレオシド（ヒポキサンチン１６μｇ／ｍｌおよびチミジン０.２μｇ／ｍ
ｌ）を含むＰＦＣＨＯ培地（JRH Biosciences，血清不含−タンパク質不含＃１
４６０２−７９Ｐ）での短い回収期間（７２時間）の後、細胞を、ヌクレオシド
を含まないＰＦＣＨＯ培地および２０ｎＭメトトレキセートとともに５％透析ウ
シ胎仔血清を含む培地中での選択に供した。これら細胞を１０の９６ウエルプレ
ート（９６０ウエル）に分配した。３週間のインキュベーション期間の後、約１
２０のトランスフェクトーマがＥＬＩＳＡにおいてＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現につい
て陽性であった。６つのクローン（５％）が５μｇ／ｍｌを超える一次（primar
y）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質力価を生成した（表１）。これら最良の６つの
クローンをＴ−７５組織培養フラスコ中に拡張し、Stratagene Inc.より市販さ
れているゲノムＤＮＡ単離キットを用いてＣＨＯゲノムＤＮＡをサザーンブロッ
ト分析のために調製した。

【００４８】 従来の発現ベクター（たとえば、ｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｏ^ＲおよびｐｃＤＮＡ／
ｄｈｆｒ）は、５μｇ／ｍｌの最高のＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質力価を有する
トランスフェクトーマを生成した。５μｇ／ｍｌを超えて生成したトランスフェ
クトーマを、ＨＩＲＰＥ配列が首尾よく組み込まれ増大した発現を示すものとし
て選択した。５μｇ／ｍｌが従来の発現ベクターで得ることのできる最高のタン
パク質力価であるため、所望のタンパク質、たとえばＣＴＬＡ４−Ｉｇを一次力
価において５μｇ／ｍｌを超えて発現するトランスフェクトーマはすべて有意で
あり、発現が「増大」していると考えられる。

【００４９】 表１

【表１】

【００５０】 上記表Ｉ中の６つのクローンは、挿入ターゲティングベクターｐＴＶ(Ｉ)を用
いて生成した最良のＣＴＬＡ４−Ｉｇ産生トランスフェクトーマを表している。
表Ｉ中のこれら６つのクローンはすべて５.０ｋｂのゲノムＤＮＡを含んでいる
。太字で示した４つのクローンは、これらクローンからのゲノムＤＮＡをサザー
ンブロットにより分析したことを示す。クローン２Ｃ５および２Ｆ２（太字でな
い）はサザーンブロットにより分析しなかった。ＮＤは「決定せず（Not Determ
ined）」を示し、サザーンブロットにより分析しなかったクローンを示すのに用
いた。

【００５１】 使用した本発明者らの対照トランスフェクトーマ（ｐｃＤＮＡ／ｄｈｆｒ）に
おいて、本発明者らは５μｇ／ｍｌまたはそれ以上のＣＴＬＡ４−Ｉｇ力価を発
現するトランスフェクトーマを見出さなかった。本発明者らの手元にある従来の
ランダム組み込みベクターは、所望のタンパク質、すなわちＣＴＬＡ４−Ｉｇを
５μｇ／ｍｌの力価で発現する１／１０００トランスフェクトーマを生成した；
この数字に基づき、ランダム組み込みベクターを用いた高産生クローンの頻度を
約１／１０００（０.１％）と予測することができる。本明細書に示したデータ
は、本発明のＨＩＲＰＥを含む相同組換えベクターが、従来の対照ベクターに比
べて高組換えタンパク質力価を有するトランスフェクトーマを得る頻度を０.１
％（対照）から５％に増大させることを示している。これは、ランダム組み込み
ベクターに比べて高産生クローンを得る頻度における５０倍の増大を表している
。

【００５２】 サザーンブロット分析を用いて４つの独立のトランスフェクトーマでのｐＴＶ
(Ｉ)プラスミド組み込み部位を調べた。これらトランスフェクトーマからのゲノ
ムＤＮＡを以下の点について分析した：（ａ）部位特異的なターゲティングを示
唆するクローン間での類似のＤＮＡバンドパターン；および（ｂ）組み込み部位
での逆方向繰返しの生成の証拠としての３つのバンドパターンの存在。Stratage
ne, Inc.からのゲノムＤＮＡ単離キットを用い、４つの異なるトランスフェクト
ーマからゲノムＤＮＡを調製した。約１０μｇのＣＨＯゲノムＤＮＡをＫｐｎＩ
制限酵素で３７℃にて１２時間消化した。ＫｐｎＩ消化したゲノムＤＮＡを１５
Ｖでの０.７％アガロースベッドゲル電気泳動により１６時間分離した。ゲルに
埋もれたゲノムＤＮＡを０.４Ｍ ＮａＯＨで変性させ、Bio-Radバキュームブロ
ッターを用いて０.４５ミクロンのニトロセルロースフィルター上にブロッティ
ングした。

【００５３】 ＰＣＲ増幅を用い、５.０ｋｂのゲノムＤＮＡの異なる領域からそれぞれ２０
０ｂｐおよび５００ｂｐの２つのハイブリダイゼーションプローブを生成した。
２００ｂｐのハイブリダイゼーションプローブは、ＰＣＲプライマー ＣＴＡＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧ（配列番号６）および ＧＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＡＣＡＴＡＧ（配列番号７）を用いて生成した
。同様に、５００ｂｐのハイブリダイゼーションプローブは、ＰＣＲプライマー ＧＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＴＧＧＣＴＡＧＣ（配列番号８）および ＧＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣ（配列番号９）を用いて生成
した。

【００５４】 上記実施例１に記載したように、ハイブリダイゼーションプローブはジゴキシ
ゲニン標識ＵＴＰ（Boehringer Mannheim）を含んでおり、これらは化学ルミネ
センス検出キット（Boehringer Mannheim）により検出される。これら２つのハ
イブリダイゼーションプローブを等容量で混合し、上記（実施例１）と同様のハ
イブリダイゼーション条件を用いてニトロセルロースにハイブリダイズさせた。
ＥｃｏＲＩで消化しこれら混合ハイブリダイゼーションプローブ（２００ｂｐお
よび５００ｂｐ）とハイブリダイズさせた親Ｐ細胞株のゲノムＤＮＡのサザーン
ブロット分析は、３つのＥｃｏＲＩ ＤＮＡバンドを生成した。これら結果は、
ＥｃｏＲＩバンドのうちの２つが組み込み部位での逆方向繰返しの生成の結果で
あり、第三のバンドが妨害されないゲノムホモログであることを示唆している。
当業者であれば、この３ＤＮＡバンドパターンを参照マーカーとして用い、部位
特異的な組み込みの証拠のために同じ発現ベクターを用いて生成した他のトラン
スフェクトーマを分析することができる。

【００５５】 ｐＴＶ(Ｉ)ベクターを含む上位４つの産生クローン（ＩＡＩ、３Ｃ２、３Ｃ１
１および６Ｂ８）からのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化したもののサザーンブ
ロット分析は、分析した４つのクローンの３つに共通する３バンドパターンを生
成した。新たなトランスフェクトーマにおける３バンドパターンの存在は、プラ
スミド組み込み部位での逆方向繰返しの生成と一致している。第二に、これらト
ランスフェクトーマにおける同一のサイズの３バンドパターンの存在は、これら
相同組換えベクターがＣＨＯゲノム中の同一部位に独立にターゲティングし、高
組換え遺伝子発現を生成したことを示唆している（図５）。サザーンブロット分
析はさらに、５.０ｋｂのＨＩＲＰＥが逆方向繰返しの生成および遺伝子増幅を
誘発して高発現へと導くモチーフを含むことを示唆している。

【００５６】 ランダムなプラスミド組み込みは、ＣＨＯ細胞での組み込みの好ましい様式で
ある（＞９９％）。ＣＨＯ細胞における相同組換え事象は０.１〜０.３％未満を
占めるにすぎない（Thomasら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 615）
。ランダムな組換え事象は一般に広範なＤＮＡを必要とせず、基質として全プラ
スミドＤＮＡ（５.０ｋｂのゲノムＤＮＡを含む）を潜在的に使用しうる。もし
もそのような事象が生じたら、発現ベクターｐＴＶ(Ｉ)は相同部位とは異なる部
位で組み込まれる。本出願において、サザーンブロット分析は、本願出願人の新
規なベクターが圧倒的な半端物（overwhelming odds）に対して主たる高産生ク
ローンにおいてＣＨＯ細胞中の単一のゲノム遺伝子座に組み込まれることを示唆
している。

【００５７】 ｐＴＶ(Ｉ)プラスミドが一貫して高組換えタンパク質力価を有するＣＨＯトラ
ンスフェクトーマを生成することを独立に確認するため、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞
株中へのｐＴＶ(Ｉ)プラスミドの第二のトランスフェクションを行った。第二の
トランスフェクションの結果を下記表IIに示す。第二のトランスフェクションか
らの結果から、ｐＴＶ(Ｉ)ベクターが好ましい遺伝子座での組み込みにより高組
み込みタンパク質力価を有するトランスフェクトーマを一貫して生成することが
確認された。表II中の太字のクローンは、部位特異的な組み込みを示すためにそ
の後にサザーンブロットにより分析したことを示す。「ＮＤ」は試験しなかった
ことを示す。

【００５８】 表II

【表２】

【００５９】 ５.０ｋｂのゲノムＤＮＡをシークエンシングする際に、本発明者らは、おそ
らく立体障害のためにジゴキシゲニン標識ｄＴＴＰ（デオキシヌクレオシド三リ
ン酸）を用いたＰＣＲ反応で増幅されなかった７０％Ａ−ＴリッチなＡ−Ｔリッ
チモチーフに出くわした。これと一致して、哺乳動物ゲノムで高度に発現される
遺伝子は優勢にＡ−Ｔに富んだシス作動性のエレメントを含んでいる（Mehta (1
996) J. Biol. Chem. 271(52): 33616）。このことは、下流の組換え遺伝子発現
を増大させるシス作動性エレメントとしての５.０ｋｂ ＣＨＯゲノムＤＮＡ中の
Ａ−Ｔリッチモチーフの評価へと導く。本発明者らは、ＰＣＲ増幅および被験遺
伝子（所望のタンパク質）としてのＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子および陽性の選択マ
ーカーとしてのＤＨＦＲ遺伝子を含むベクター中への所望の生成物のクローニン
グを用い、２つの同遺伝子型挿入ベクターｐＴＶ(Ｉ)/１.６（配列番号１のヌク
レオチド３０５０〜４６７６を含む）およびｐＲＶ(Ｉ)/１.４（配列番号１のヌ
クレオチド３０５０〜４４８５を含む）を構築した。

【００６０】 上記のように５.０ｋｂゲノムＤＮＡからの１４３５ヌクレオチドを含むｐＲ
Ｖ(Ｉ)/１.４ベクターは、ＰＣＲプライマー ＡＧＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＴＣＡ（配列番号１０）および ＣＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＡＧＴＧ（配列番
号１１）を用いて生成した。ベクターｐＴＶ(Ｉ)/１.６（５.０ｋｂゲノムＤＮ
Ａからの１６２６ヌクレオチドを含む）は、ＰＣＲプライマー ＡＧＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＴＣＡ（配列番号１２）および ＣＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡ（配列番号
１３）を用いて生成した。

【００６１】 ＰＣＲ由来断片を、ＣＴＬＡ４−Ｉｇリポーター遺伝子およびｄｈｆｒ選択マ
ーカーを含む上記同発現ベクター中にクローニングした。これら２つの新たなベ
クターは共通するフォアウォードプライマーにより生成される同じ５'末端を有
しているが、１.４ｋｂのＨＩＲＰＥの３'末端は１.６ｋｂのＨＩＲＰＥに比べ
て約２００ｂｐ短い。ＣＨＯ ＤＧ４４細胞中に形質転換すると、両ベクターと
もＥＬＩＳＡにおいてＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質発現について陽性の約１２０
のトランスフェクトーマを生成した（Symingtonら、(1993) J. Immunol. 150(4)
: 1286）。しかしながら、各クラスの上位４つの産生クローンからのＣＴＬＡ４
−Ｉｇ力価を比較したときに、ｐＴＶ(Ｉ)/１.６ベクターを含むトランスフェク
トーマは約４倍高いＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質力価を発現したが、ｐＴＶ(Ｉ)
/１.４を含むトランスフェクトーマはＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質発現を有意に
改善しなかった（図８参照）。これら結果から、５.０ｋｂゲノムＤＮＡ中の２
００ｂｐ Ａ−ＴリッチモチーフはＣＨＯ細胞で組換え遺伝子発現を増大させる
シス作動性のエレメントとして作用すると結論された。

【００６２】 以下の記載は、相同置換ベクターの利点および５.０ｋｂのゲノムＤＮＡを含
む置換ベクターｐＴＶ(Ｒ)の構築の詳細である。置換ベクターを用いた導入ＤＮ
Ａと染色体ＤＮＡとの間での相同組換えは、外来ＤＮＡを哺乳動物細胞中に導入
するために広く用いられている。ＣＨＯ細胞での相同組換えに影響を及ぼす変数
としては、これらに限られるものではないが、遺伝子座、相同配列の量、および
陽性選択カセットを含む多くの変数がある。置換ベクターは相同組換えの頻度が
５〜１０倍低いが、外来プラスミド配列は組換え事象の間に切り出されながら挿
入物（組換え遺伝子）が安定に組み込まれるという利点がある。このことは、プ
ラスミド配列全体が挿入される挿入ベクター（ｐＴＶ(Ｉ)）とは対照的である。
さらに、置換ベクターは、置換ベクターに適用可能な部位特異的な組み込みのた
めの一般に受け入れられているエンリッチメント（enrichment）手順のために好
ましい（Hastyら、(1991) Mol. Cell. Bio. 11: 4509）。最後に、ＨＳＶ−ｔｋ
遺伝子と組み合わせた置換ベクターは、相同組換えの結果得られるトランスフェ
クトーマを単離するのに用いる最も一般的なエンリッチメント手順を提供する（
Zheingら、(1990) Nature 344: 170）。

【００６３】 ヌクレオシドアナログであるアシクロビルは、ＨＳＶ−チミジンキナーゼ（「
ＨＳＶ−ｔｋ」）遺伝子を発現する哺乳動物細胞を選択的に殺す。ＨＳＶ−ｔｋ
はアシクロビルをそのリン酸化形態に変換するが、これは細胞にとって毒性であ
る。その結果、ＨＳＶ−ｔｋを発現する細胞のみが殺され、正常なＣＨＯ細胞は
殺されない。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は、置換ベクター中で相同組換えの後に該ＨＳ
Ｖ−ｔｋ遺伝子が欠失されるような領域に戦略的に配置され、一方、他のすべて
の組換え事象（ランダムな組み込み）は遺伝子をそのまま保持する。その結果、
相同組換えの結果得られるトランスフェクトーマはアシクロビル選択を生き残る
が他のクラスのトランスフェクトーマは殺される（Evrardら、(1996) Cell. Bio
l. Toxicol. 12(4-6): 345）。

【００６４】 ｐＴＶ(Ｒ)ベクターは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現カセットの５'末端にＡ−Ｔリ
ッチ領域を含む１.６ｋｂのゲノムＤＮＡおよびＤＨＦＲ選択マーカーの３'末端
に２.２ｋｂのフランキングゲノム断片を含む（図４）。ゲノムＤＮＡの２つの
部分へのクローニングはポリメラーゼ連鎖反応を用いて新たな制限部位を作製す
ることにより行ったが、これは組換えＤＮＡ法の当業者には自明の方法である。
置換ベクターは、相同組換えの結果得られるトランスフェクトーマではＨＳＶ−
ｔｋ遺伝子が離脱されるが、異常な組換え体は活性なＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を保持
するようにデザインされている。その結果、活性なＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含む異
常な組換え体はすべて阻害剤のアシクロビルにより殺され、部位特異的な組換え
の結果得られるクローンのみを選択的に増殖させることができる（Pfizerら、(1
987) Am. J. Cancer 40: 114; Davidsonら、(1981) Virology 113: 9）。

【００６５】 部位特異的な組換え体を選択的に富ませる戦略は予想された結果をもたらし、
置換ベクターを用いて生成したトランスフェクトーマの１０％がこの選択を生き
残った。エレクトロポレーションによりｐＴＶ(Ｒ)をＣＨＯ細胞株ＤＧ４４中に
導入すると、第１回目の２０ｎＭメトトレキセート選択を生き残った８６０のト
ランスフェクトーマが得られた。しかしながら、第２回目の１.０ｍＭアシクロ
ビルによる選択では９４のトランスフェクトーマ（１０％）のみが生き残った。
これら二重の選択を生き残ったトランスフェクトーマは、部位特異的な組換え事
象によるものである。これら９４のトランスフェクトーマすべてをＣＴＬＡ４−
Ｉｇタンパク質力価についてスクリーニングした。最高のＣＴＬＡ４−Ｉｇタン
パク質力価を有する上位６つのトランスフェクトーマを下記表IIIに示す。

【００６６】 表III

【表３】

【００６７】 これら６つのトランスフェクトーマ（すなわち、１Ｃ９、２Ｂ１１、３Ｄ５、
４Ｆ４、５Ｃ４および６Ｆ１）からのゲノムＤＮＡを上記手順を用いて調製した
。ゲノムＤＮＡをＢｓｐ１２０１制限酵素で消化し、上記セクションで記載した
のと同様にＰＣＲにより生成した２００ｂｐおよび５００ｂｐのハイブリダイゼ
ーションプローブを用いたサザーンブロット分析に供した。アガロースゲルベッ
ド電気泳動および洗浄条件を含むハイブリダイゼーション条件は、上記に記載し
た条件と同じであった。分析した６つのすべてのクローンからのＤＮＡバンドパ
ターンは、それぞれ３.５ｋｂおよび２.７ｋｂのバンドを有する２バンドパター
ンを明らかにした（図６）。これらの結果から、２.７ｋｂ ＤＮＡのバンドが妨
害されないゲノムホモログを表し、３.５ｋｂ ＤＮＡはプラスミドとＣＨＯ細胞
での組み込み部位を説明するゲノムＤＮＡとを含むハイブリッドバンドであるこ
とが推論された。分析した６つのすべてのトランスフェクトーマからの共通する
３.５ｋｂのハイブリッド断片の存在は、相同置換ベクターがＣＨＯ細胞中の特
定の部位に選択的に組み込まれたことを示している。さらに、本発明のＨＩＲＰ
Ｅ遺伝子（配列番号１）またはその断片（配列番号２）を含む置換ベクター中に
ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を用いて生成したトランスフェクトーマの数を減らした後で
もタンパク質産生は高いままであった。

【００６８】 上記の開示は、本発明が組換えタンパク質の発現を増大させるための独特で信
頼性のある方法を提供することを示している。本発明者らによって教示されたＨ
ＩＲＰＥ配列（配列番号１）またはＨＩＲＰＥ活性を示す配列番号１の断片（好
ましくは配列番号２に示す断片）を用いることにより、当業者は首尾よくトラン
スフェクションした細胞のパーセントを増大させることができるのみならず、そ
れらトランスフェクションした細胞での発現をも増大させることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 親のＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現細胞株（本明細書で細胞株「Ｐ」と称
する）でのＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位のクローニングを示す。図１Ａはサザ
ーンブロットを示しており、５.５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片はＤＧ４４宿主および
Ｐ ＣＨＯ細胞株の両者中の天然染色体を表す。レーン２の８.０ｋｂおよび１０
.０ｋｂのバンドは、それぞれ再配置した左および右のフランキング領域を表す
。図１Ｂは、細胞株Ｐ組み込み部位の左フランキング領域（レーン１）および右
フランキング領域（レーン２）を含むクローニングＥｃｏＲＩ断片が細胞株Ｐか
らのＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡと一緒に移動することを示している。

【図２】 細胞株Ｐ中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位の分子構成を表して
いる。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子の両末端にフランキングする同一の５.０ｋｂゲ
ノム配列；Ａ−Ｔリッチモチーフ；ＭＡＲ様配列（マトリックス結合領域）；お
よびＡｌｕ様配列を示す。

【図３】 相同挿入組換えベクター、ｐＴＶ(Ｉ)の模式図を示す。

【図４】 相同置換組換えベクター、ｐＴＶ(Ｒ)の模式図を示す。

【図５】 サザーンブロット分析を示しており、挿入組換えベクター、ｐＴ
Ｖ(Ｉ)を含むトランスフェクトーマでの部位特異的な組み込みが確認される。

【図６】 サザーンブロット分析を示しており、置換組換えベクター、ｐＴ
Ｖ(Ｒ)を含むトランスフェクトーマでの部位特異的な組み込みが確認される。ブ
ロットは５つのすべてのクローンで３.５ｋｂのバンドを明らかにしており、置
換ベクターが同様のゲノム遺伝子座をターゲティングすることを示唆している。

【図７】 サザーンブロット分析および制限酵素マッピングにより分析した
ＬＦＲ断片およびＲＦＲ断片の模式図を示す。

【図８】 組換え遺伝子発現に及ぼすＡ−Ｔリッチモチーフ領域の効果を示
す。完全長の５.０ｋｂ核酸配列；１.６ｋｂの核酸配列（Ａ−Ｔリッチモチーフ
を含む）；またはＡ−Ｔリッチモチーフを含まない１.４ｋｂ領域のいずれかを
含む上位４つのトランスフェクトーマからのＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現をμｇ／ｍｌ
で示す。

【図９】 本発明のＨＩＲＰＥを得るのに用いたオリゴヌクレオチドを示す
。

【図１０】 本発明のＨＩＲＰＥがＣＴＬＡ４−Ｉｇの発現を促進すること
を示す。

【図１１】 挿入ベクターおよび置換ベクターが同様の結果を与えることを
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジョン・ティ・ミラー アメリカ合衆国13206ニューヨーク州シラ キュース、ティール・アベニュー1001番 (72)発明者 パライア・タマナ アメリカ合衆国13104ニューヨーク州マン リウス、ジャック−イン−ザ−プルピッ ト・サークル4410番 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA31 CA02 CA09 DA02 FA06 FA10 4B064 AG31 BH09 CA19 DA01 4B065 AA91X AA91Y AB05 BA02 CA44

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号１に示す配列；（ｂ）（ａ）の相補体；また
   は（ｃ）配列番号１の断片を含む単離核酸配列であって、該核酸断片を発現ベク
   ター中に導入したときに目的組換えタンパク質の発現を増大させることができる
   ことを特徴とする単離核酸配列。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
3. 【請求項３】 該断片が配列番号１のヌクレオチド３０５０〜４６７６を含
   む、請求項１に記載の核酸配列。
4. 【請求項４】 配列番号１のヌクレオチド３０５０〜４６７６を含む、請求
   項２に記載の発現ベクター。
5. 【請求項５】 さらに選択マーカーを含む、請求項２に記載の発現ベクター
   。
6. 【請求項６】 さらに選択マーカーを含む、請求項４に記載の発現ベクター
   。
7. 【請求項７】 請求項２に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項４に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
9. 【請求項９】 目的タンパク質の全体または一部をコードする核酸配列をさ
   らに含む、請求項２に記載の発現ベクター。
10. 【請求項１０】 目的タンパク質の全体または一部をコードする核酸配列を
    さらに含む、請求項４に記載の発現ベクター。
11. 【請求項１１】 請求項９に記載の発現ベクターで形質転換したＣＨＯ細胞
    。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換したＣＨＯ細
    胞。
13. 【請求項１３】 該目的タンパク質がＣＴＬＡ４−Ｉｇまたはその変異体で
    ある、請求項９に記載の発現ベクター。
14. 【請求項１４】 該目的タンパク質がＣＴＬＡ４−Ｉｇまたはその変異体で
    ある、請求項１０に記載の発現ベクター。
15. 【請求項１５】 組換えタンパク質を得る方法であって、請求項１１に記載
    の形質転換した宿主細胞を該タンパク質の発現を促進する条件下で培養し、つい
    で該タンパク質を回収することを含む方法。
16. 【請求項１６】 組換えタンパク質を得る方法であって、請求項１２に記載
    の形質転換した宿主細胞を該タンパク質の発現を促進する条件下で培養し、つい
    で該タンパク質を回収することを含む方法。
17. 【請求項１７】 組換えＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を得る方法であって、請求項
    １３に記載の形質転換した宿主細胞を該ＣＴＬＡ４−Ｉｇの発現を促進する条件
    下で培養し、ついで該ＣＴＬＡ４−Ｉｇを回収することを含む方法。
18. 【請求項１８】 ＡＴＣＣ受託番号２０３１５３に含まれる核酸分子。