WO2010023787A1 - 遺伝子発現安定化エレメント - Google Patents

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WO2010023787A1
WO2010023787A1 PCT/JP2009/002228 JP2009002228W WO2010023787A1 WO 2010023787 A1 WO2010023787 A1 WO 2010023787A1 JP 2009002228 W JP2009002228 W JP 2009002228W WO 2010023787 A1 WO2010023787 A1 WO 2010023787A1
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sequence
seq
gene expression
expression
dna
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PCT/JP2009/002228
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English (en)
French (fr)
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友実 山▲崎▼
兼治 増田
重明 西井
文清 川上
健史 大政
Original Assignee
東洋紡績株式会社
国立大学法人大阪大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells

Definitions

  • the present invention relates to a gene expression stabilizing element that can be used to efficiently and stably produce a recombinant protein in a mammalian cell into which a foreign gene has been introduced by genetic recombination.
  • the gene expression stabilizing element of the present invention is useful for producing useful proteins such as pharmaceuticals in mammalian cells by genetic engineering techniques.
  • prokaryotes such as Escherichia coli
  • eukaryotic cells including yeast (Saccharomyces, Pichia and Kluyveromyces species) and mammalian cells are used.
  • yeast Sacharomyces, Pichia and Kluyveromyces species
  • mammalian cells are particularly preferred for the production of therapeutic proteins. Because the post-translational modifications of proteins that occur in mammals including humans sometimes contribute deeply to their biological activity, it is better to use mammalian cell expression systems that allow post-translational modifications similar to those to which proteins are administered. This is because the effectiveness of the therapeutic protein can be enhanced.
  • CHO Chinese hamster ovary cells
  • Various approaches have been performed to highly express recombinant proteins using CHO cells.
  • transgene amplification As a classic approach, there is a method of selecting a high-expression clone called transgene amplification in which the copy number of a transgene expressing a target recombinant protein is increased.
  • a selective gene such as dihydrofolate reductase and a gene that expresses a recombinant protein are simultaneously introduced into a mutant cell that requires the expression of the selective gene for growth under selective conditions, and the pressure gradually increases.
  • a high expression clone is acquired by raising (Non-patent documents 1 and 2).
  • Non-patent Document 3 Chinese hamster EF-1alpha (CHEF1) is used (Non-patent Document 3).
  • CHEF1 Chinese hamster EF-1alpha
  • CHEF1 Chinese hamster EF-1alpha
  • CHEF1 Chinese hamster EF-1alpha
  • CHEF1 Chinese hamster EF-1alpha
  • CHEF1 Chinese hamster EF-1alpha
  • a rare site (hot spot) on a chromosome having high transcription activity is identified, and a transgene is introduced into this site.
  • selection of high-expressing cells, improvement of screening methods, and metabolic engineering approaches are also being conducted. While these approaches enable a certain level of high expression, there are cases in which obtaining a high expression strain requires enormous amounts of time or does not maintain stable synthesis of the recombinant protein during the manufacturing phase. is there.
  • Recombinant protein expression varies greatly depending on which site in the host cell genome the gene encoding the recombinant protein is introduced into, but control of the introduced site is usually impossible. Therefore, even if the gene is introduced, most cells do not express the recombinant protein or the expression level is low, so that enormous labor is required for screening. In addition, even cells that had been sufficiently expressed at the time of screening may gradually decrease in expression as culture continues.
  • chromosomal elements cis-acting DNA elements
  • Non-patent document 4 it is said that the increase in protein expression in CHO-K1 cells is not so great (Non-patent document 5).
  • the present invention was created in view of the current state of the prior art, and its object is to provide an element capable of stabilizing the gene expression of recombinant proteins and increasing the expression efficiency in mammalian cells, particularly CHO cells. There is.
  • the present inventors have analyzed in detail the sequence in the vicinity of the foreign gene introduction site in a CHO cell clone in which the introduced foreign gene is highly amplified and highly expressed.
  • the inventors have succeeded in identifying a specific region that contributes to stabilization of expression and increase in expression efficiency, and have completed the present invention.
  • a gene expression stabilizing element comprising any one of the following (a) to (g) or any combination thereof: (A) DNA consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 1; (B) a DNA comprising a partial sequence of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 and comprising at least the sequence of the region represented by the 41820th to 41839th bases of the sequence represented by SEQ ID NO: 1; (C) a DNA comprising a partial sequence of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 and comprising at least the sequence of the region represented by the 41821st to 41840th bases of the sequence represented by SEQ ID NO: 1; (D) a DNA comprising a partial sequence of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 and comprising at least the sequence of the region represented by the 45182nd to 45200th bases of the sequence represented by SEQ ID NO: 1; (E) a DNA comprising a partial sequence of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 and comprising
  • the DNA of (b) or (c) is a nucleotide sequence from positions 41601 to 46746, preferably from positions 41601 to 42700, of the sequence represented by SEQ ID NO: 1. Or a part thereof.
  • such a gene expression stabilizing element a foreign gene expression vector comprising a foreign gene expression cassette arranged in the vicinity thereof, and such a gene expression stabilizing element and a foreign gene expression
  • a transformed host cell characterized in that the cassette is positioned in close proximity to the genome.
  • the gene expression stabilizing element of the present invention can stabilize the gene expression of a foreign gene and increase the expression efficiency by reducing the influence of adjacent chromosomes and regulatory elements on the adjacently placed foreign gene. It is possible to reduce and shorten the work of establishing a high expression cell line in a cell expression system, particularly a CHO cell expression system.
  • FIG. 3 is a diagram showing the construction of a basic construct pEF1 ⁇ -KOD3G8HC-RE2 used for confirming the gene expression stabilizing effect of nucleic acid sequence fragments in the KOD3G8 antibody production system.
  • FIG. 3 is a diagram showing the construction of a basic construct pEF1 ⁇ -KOD3G8LC-Hyg-RE2 used for confirming the gene expression stabilizing effect of nucleic acid sequence fragments in the KOD3G8 antibody production system. It is a figure which shows the H chain or L chain expression vector which inserted each test sequence
  • 5 is a graph plotting antibody production amounts calculated by performing ELISA using the culture supernatant of a polyclonal clone for CHO5 ⁇ 3-3 inserted in both upstream and downstream of the expression cassette (1.1 k / 1.1 k). is there. It is the graph which plotted the antibody production amount of each clone computed by performing ELISA using the culture supernatant of a 96 well plate.
  • the gene expression stabilizing element of the present invention is a nucleic acid molecule identified by the present inventors from the CHO cell DR1000L-4N strain (CHO cell-4N strain) described in Patent Document 2.
  • a human granulocyte macrophage colony stimulating factor (hGM-CSF) gene is introduced as an exogenous gene into an expression vector having a DHFR gene, and this vector is introduced into a CHO cell DG44 strain lacking the DHFR gene.
  • the strain was cultured in a medium supplemented with 10% fetal bovine serum in IMDM medium (containing nucleic acid) to obtain a transformant.
  • IMDM medium containing no nucleic acid
  • MTX methotrexate
  • telomere The genome of eukaryotic cells is divided into two classes of chromatin, genuine chromatin and heterochromatin. Centromere and telomere sequences are a major part of constitutive heterochromatin.
  • the telomere is a gene-poor region composed of a repetitive sequence of TTAGGG and a subtelomeric region and having a distinct heterochromatin three-dimensional structure (Non-patent Documents 6 and 7).
  • telomeres affect the expression of genes introduced nearby by a phenomenon known as telomere position effects, in addition to their contribution to the stability of the genome and a protective role (Non-Patent Documents 8 and 9).
  • the introduced foreign gene is not affected by inactivation from foreign chromosomes near the introduction site, and in long-term culture, High production of stable hGM-CSF was maintained. This suggests that a boundary element that strongly blocks the progress of inactivation exists in the vicinity of the site where the foreign gene has been introduced, stabilizing the gene expression.
  • DNA consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • B a DNA comprising a partial sequence of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 and comprising at least the sequence of the region represented by the 41820th to 41839th bases of the sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • C a DNA comprising a partial sequence of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 and comprising at least the sequence of the region represented by the 41821st to 41840th bases of the sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • D DNA consisting of a partial sequence of the sequence represented by SEQ ID NO: 1, and comprising at least the sequence of the region represented by the 45182st to 45200th bases of the sequence represented by SEQ ID NO: 1; and
  • e the sequence A DNA comprising a partial sequence of the sequence represented by No. 1 and comprising at least the sequence of the region represented by the 910
  • DNA consisting of a partial sequence of the sequence shown in SEQ ID NO: 1, and when placed close to the foreign gene expression cassette in the host cell, from the foreign gene contained in the foreign gene expression cassette DNA that can increase or stabilize the expression of the target recombinant protein can also be used as a gene expression stabilizing element.
  • homologous elements can be readily isolated and identified by well-known techniques in the art, such as interspecies hybridization or PCR.
  • the DNA complement of any one of (a) to (f) can also be used as a gene expression stabilizing element.
  • the gene expression stabilizing element of the present invention consists of any one of these (a) to (g) or any combination thereof.
  • the DNA of (b) or (c) is from the region represented by the bases from the 41601st position to the 46746th position of the sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a part thereof. Become. In a further preferred embodiment of the gene expression stabilizing element of the present invention, the DNA of (b) or (c) is a region represented by bases from 41601 to 42700 of the sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a part thereof. Consists of.
  • a plasmid vector As a gene construct for introducing a target gene into a host cell genome, a plasmid vector is generally used. Since the maximum length of the plasmid vector is 10 to 20 kbp, the chain length of the gene expression stabilizing element is preferably as short as possible, and the preferred length is 5 kbp or less, more preferably about 1 kb.
  • the element is arranged in the host cell genome at a position close to the introduction site of the foreign gene expression cassette.
  • the term “adjacent” is not particularly limited, but preferably the distance between the gene expression stabilizing element of the present invention and the foreign gene expression cassette is 5000 bp or less, more preferably 500 bp or less. It means that.
  • Such close arrangement is achieved by introducing a mixture of a nucleic acid sequence fragment containing the element of the present invention and a nucleic acid sequence fragment containing an expression cassette of a foreign gene into a host cell by electroporation or transfection, etc.
  • a host cell clone with a high expression level, in order to reliably achieve close placement, the gene expression stabilizing element of the present invention, and expression of a foreign gene placed close thereto It is desirable to prepare a foreign gene expression vector containing a cassette in advance and transform host cells with this expression vector.
  • an exogenous gene expression cassette refers to, for example, an exogenous gene placed downstream of an enhancer and a promoter that can be expressed in a mammalian cell, and a polyadenylation signal is used to stabilize the transcribed foreign gene RNA. It is arranged downstream of.
  • Such an expression cassette may further comprise regulatory elements such as introns.
  • Enhancers and promoters that can be expressed in mammalian cells are not particularly limited, but those derived from viruses such as human and mouse cytomegalovirus, simian virus 40 (SV40), ⁇ -actin and ubiquitin, Enhancer / promoter derived from non-viral cellular genes such as GAPDH and EF-1 ⁇ , and hybrids thereof. It is not always necessary to place foreign genes in the foreign gene expression cassette from the beginning. Instead of foreign genes, multiple cloning sites consisting of multiple restriction enzyme recognition sequences are placed, and various foreign genes can be placed there. cDNA or coding region may be introduced later.
  • the gene expression stabilizing element of the present invention is arranged so as to sandwich the foreign gene expression cassette both upstream and downstream of the foreign gene expression cassette.
  • the vector of the present invention preferably contains a plurality of foreign genes, and these plurality of foreign genes preferably encode antibody heavy and / or light chain polypeptides.
  • the vector of the present invention is more preferably a vector capable of expressing a drug resistance gene in order to select cells into which a foreign gene has been introduced.
  • drug resistance genes include Bacillius cereus (bsr) -derived blasticidin resistance gene encoding deaminase, Tn5-derived neomycin resistance gene encoding aminoglycoside 3'-phosphotransferase, hygromycin resistance gene encoding hph from Escherichia coli, puromycin And a puromycin resistance gene encoding N-acetyltransferase (PAC).
  • selection marker genes such as dihydrofolate reductase (DHFR) gene and glutamine synthetase (GS) gene may be used.
  • the vector of the present invention may contain a plurality of expression cassettes consisting of “promoter-foreign gene-polyadenylation signal” in order to express two or more foreign proteins including the drug resistance gene.
  • the exogenous genes 1 and 2 are placed under the transcriptional control of the same promoter, as in “promoter-foreign gene 1—exogenous gene 2—polyadenylation signal”, and the endogenous ribosome entry site is located between the exogenous genes 1 and 2. It is also useful to introduce (Internal ribosome entry sites, IRES) to enhance the translation of the second gene product in the expression cassette (Non-Patent Documents 10 and 11).
  • Examples of cells into which the gene expression stabilizing element of the present invention is introduced include Chinese hamster ovary cells (CHO) generally used for the production of recombinant proteins, baby hamster kidney cells (BHK), human fibrosarcoma cells ( Examples include cells derived from mammals such as HT1080), but are not limited thereto, and are derived from animals such as humans, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, cows, horses, sheep, monkeys, and pigs. These cells can also be introduced.
  • Chinese hamster ovary cells generally used for the production of recombinant proteins
  • BHK baby hamster kidney cells
  • human fibrosarcoma cells Examples include cells derived from mammals such as HT1080), but are not limited thereto, and are derived from animals such as humans, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, cows, horses, sheep, monkeys, and pigs. These cells can also be introduced.
  • Example 1 Determination of Nucleic Acid Sequence Of the BAC library prepared from CHO cell DR1000L-4N strain (CHO cell-4N strain), clone Cg0031N14 containing an hGM-CSF expression cassette was isolated. A 5 ', 3' one-pass sequence of a shotgun clone prepared from BAC derived from this clone Cg0031N14 was performed, sequence information was assembled by Phred / Phrap / Consed, and CHO cells introduced with an hGM-CSF expression cassette were introduced. A nearby genomic sequence of approximately 91 kbp was determined. The sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • Example 2 Analysis of Nucleic Acid Sequence
  • the presence of an insulator sequence in the determined nucleic acid sequence was investigated by searching for a binding sequence motif of the insulator binding protein CTCF.
  • CTCFBS prediction tool http://insulatordb.utmem.edu/) (Non-patent Document 12) was used.
  • the motif sequences extracted by the tool are shown in Table 1 and FIG.
  • Plasmid pBS-CMV-SNAP26m was constructed according to the scheme shown in FIG. That is, first, the Emerald Luc (ELuc) gene was excised with EcoRI and NotI from the pELuc-CMV plasmid in which the CMV promoter (SEQ ID NO: 6) was introduced into the restriction enzyme ClaI and EcoRI sites of the Emerald Luc vector pELuc-test (Toyobo). .
  • the SNAP26m gene was amplified by PCR from the SNAPm expression plasmid pSNAPm (Covalys) using the primers of SEQ ID NOs: 7 and 8, and introduced into the EcoRI and NotI sites of the pELuc-CMV plasmid to construct pSNAP26m-CMV.
  • CMV promoter / SNAP26m / SV40 polyA was amplified by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 9 and 10, and by partial digestion, BamHI of plasmid pBluescript II SK (-) (Stratagene), The plasmid pBS-CMV-SNAP26m was constructed by introducing into the SacI site.
  • a clone containing a CHO genomic sequence in the vicinity of the binding sequence motif of the CTCF at positions 41820 and 45182 is extracted, and an introduced sequence derived from the CHO genome (Fig. 3) was amplified by PCR and introduced into the KpnI, XhoI or XhoI, ClaI sites of pBS-CMV-SNAP26m.
  • Table 2 shows the correspondence between the shotgun library clone and the SNAP26m expression construct in which the introduced sequence is incorporated.
  • (-) in the column of the SNAP26m expression construct is pBS-CMV-SNAP26m into which the CHO genomic sequence has not been introduced.
  • CHO-K1 cells adjusted to 1 ⁇ 10 5 cells / ml were seeded on the previous day in a 12-well plate and cultured overnight to prepare CHO-K1 cells for transfection.
  • Ham's F12 medium (Nissui Pharmaceutical) supplemented with 10% fetal bovine serum was used as the medium.
  • Selective culture was performed in 's F12 + 10% FBS medium for 3 weeks. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days. After completion of selective culture, cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol / l-EDTA Solution, 2 ⁇ 10 5 cells were seeded in a 12-well plate, and the next day, 0.5 ml of Ham's 2 ⁇ M SNAP-Cell-505 (Covalys) was added to the F12 medium and incubated at 37 ° C. for 60 minutes. Thereafter, rinsing was performed 3 times with Ham's F12 medium, and 10 minutes of incubation was performed 3 times while exchanging the medium to remove unreacted fluorescent dye.
  • the cells were treated with 2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol / l-EDTA Solution to disperse the cells, suspended in D-PBS ( ⁇ ) (Nacalai Tesque), and SNAP26m with a flow cytometer BD FACSCalibur. The expression intensity was analyzed.
  • FIG. 4 shows the results of FACS analysis of the cell population transformed with the SNAP26m expression construct into which the test sequences CHO1 to CHO6 were introduced.
  • FIG. 5 shows that cells showing 10 or more signals (M2 in FIG. 4) from the analysis results of untreated CHO cells (upper left of FIG. 4 ( ⁇ )) are SNAP26m expressing cells, and the ratio of the cells is shown in FIG. This is a plotted graph.
  • FIGS. 4 and 5 a significant increase in expression was observed in the construct into which a part of the CHO cell genome was introduced, particularly CHO4 and 5 into which positions 41601 to 46746 of SEQ ID NO: 1 were introduced.
  • the difference between CHO4 and CHO5 is considered to be within the range of variation between samples, just in case, the subsequent narrowing of the optimum region was performed based on CHO5.
  • Example 4 Narrowing of Sequence Regions Having Stability for Gene Expression (1) Based on the construct CHO5 having the highest increase in expression in Example 3, the sequence was determined from the test sequence using the primers of SEQ ID NOs: 21 and 22 by the inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit (Toyobo). CHO5 ⁇ 5 was constructed in which the region corresponding to position 41601-42902 of No. 1 was deleted.
  • CHO5 ⁇ M in which the region corresponding to positions 42903-44200 of SEQ ID NO: 1 was deleted from the test sequence using the primers of SEQ ID NO: 23, 24, and the sequence of the test sequence using the primers of SEQ ID NOs: 25, 26
  • Each CHO5 ⁇ 3 was constructed by deleting the region corresponding to positions 44201-46746 of number 1 (FIG. 6).
  • 1 ⁇ g of the mixed plasmid was transfected into CHO-K1 cells that had been seeded in a 12-well plate the day before and incubated for 24 hours. The next day, the medium was removed, cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol / l-EDTA Solution, transferred to a 90 mm Petri dish, and in Ham's F12 + 10% FBS medium containing 6 ⁇ g / ml Puromycin. Then, selective culture was performed for 3 weeks. During selective culture, the medium was changed every 3-4 days.
  • cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol / l-EDTA Solution, 2 ⁇ 10 5 cells were seeded in a 12-well plate, and the next day, 0.5 ml of Ham's 2 ⁇ M SNAP-Cell-505 (Covalys) was added to the F12 medium and incubated at 37 ° C. for 60 minutes. Thereafter, rinsing was performed 3 times with Ham's F12 medium, and 10 minutes of incubation was performed 3 times while exchanging the medium to remove unreacted fluorescent dye.
  • Ham's 2 ⁇ M SNAP-Cell-505 Covalys
  • the cells were treated with 2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol / l-EDTA Solution to disperse the cells, suspended in D-PBS ( ⁇ ) (Nacalai Tesque), and SNAP26m with a flow cytometer BD FACSCalibur. The expression intensity was analyzed.
  • FIG. 7 is a plot of the percentage of cells showing a signal value of 10 or more as a result of FACS analysis of a cell population transformed with the SNAP26m expression construct into which the test sequences CHO5 ⁇ 5, CHO5 ⁇ M, and CHO5 ⁇ 3 were introduced.
  • the expression intensity of SNAP26m was almost the same as that before deletion for CHO5 ⁇ 3, whereas the effect of increasing the expression was clearly reduced in CHO5 ⁇ M and CHO5 ⁇ 5. From this, it is considered that the 5 ′ side to the first half of positions 41601 to 46746 of the sequence of SEQ ID NO: 1 mainly contributes to the stabilization of expression.
  • Example 5 Narrowing of sequence regions having the ability to stabilize gene expression (2) Using the primers of SEQ ID NOs: 26 to 31, an SNAP26m expression construct in which the 3 ′ of the test sequence 3 ′ of CHO5 ⁇ 3 was further deleted was constructed by the inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit (Toyobo Co., Ltd.) (FIG. 8 and Table 3).
  • FIG. 9 is a plot of the percentage of cells showing a signal value of 10 or more as a result of FACS analysis of a cell population transformed with the SNAP26m expression constructs of the test sequences CHO5 ⁇ 3 and CHO5 ⁇ 3-1 to 5.
  • the expression intensity of SNAP26m which is almost the same as that before the deletion, is observed between CHO5 ⁇ 3-1 to CHO5 ⁇ 3-3, which includes positions 41601 to 42700 of the sequence of SEQ ID NO: 1, although there is variation between samples.
  • CHO5 ⁇ 3-4 and CHO5 ⁇ 3-5 lacking the 3 ′ side of this region clearly reduced the effect of increased expression.
  • Plasmids pEF1 ⁇ -KOD3G8HC-RE2 and pEF1 ⁇ -KOD3G8LC-Hyg-RE2 were constructed according to the schemes shown in FIGS. That is, pEF1 ⁇ -KOD3G8HC or pEF1 ⁇ -KOD3G8LC, which is a plasmid in which the heavy chain or light chain of the anti-KOD antibody is inserted into the XbaI-NotI site of the pCI-neo plasmid (Promega), where the existing promoter is changed to the EF-1 ⁇ promoter, is obtained.
  • restriction enzyme SalI and NheI sites were added to the template for insertion of the test sequence upstream of the expression cassette by the inverse PCR method using KOD-Plus-Mutageness Kit (Toyobo) using the primers of SEQ ID NOs: 32 and 33.
  • pEF1 ⁇ -KOD3G8HC-RE and pEF1 ⁇ -KOD3G8LC-RE were constructed.
  • restriction enzymes BsiWI and XhoI for insertion of a test sequence downstream of the expression cassette using the primers of SEQ ID NOs: 34 and 35 by Inverse PCR using KOD-Plus-Mutageness Kit (Toyobo).
  • PEF1 ⁇ -KOD3G8HC-RE2 and pEF1 ⁇ -KOD3G8LC-RE2 to which sites were added were constructed.
  • pEF1 ⁇ -KOD3G8LC-RE2 was further treated with AflII and BstBI to excise a neomycin resistance gene.
  • the hygromycin resistance gene from pTK-Hyg (Clontech) was amplified by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 36 and 37, and the above-mentioned neomycin resistance gene was excised, and the AflII and BstBI sites of pEF1 ⁇ -KOD3G8LC-RE2 Into pEF1 ⁇ -KOD3G8LC-Hyg-RE2.
  • test sequences were inserted upstream of the expression cassettes of these plasmids or both upstream and downstream of the expression cassettes to construct the plasmids shown in FIG. Specifically, the test sequence CHO5 ⁇ 3 amplified by PCR using the primer set of SEQ ID NOs: 38 and 39 was inserted into the NheI and BglII sites upstream of the expression cassettes of plasmids pEF1 ⁇ -KOD3G8HC-RE2 and pEF1 ⁇ -KOD3G8LC-Hyg-RE2. Thus, plasmids pEF1 ⁇ -KOD3G8HC-2.6k and pEF1 ⁇ -KOD3G8LC-Hyg-2.6k were constructed.
  • test sequence CHO5 ⁇ 3-3 amplified by PCR using the primer set of SEQ ID NOs: 38 and 40 was inserted into the NheI and BglII sites upstream of the expression cassettes of plasmids pEF1 ⁇ -KOD3G8HC-RE2 and pEF1 ⁇ -KOD3G8LC-Hyg-RE2. Plasmids pEF1 ⁇ -KOD3G8HC-1.1k and pEF1 ⁇ -KOD3G8LC-Hyg-1.1k were constructed.
  • test sequence CHO5 ⁇ 3- amplified by PCR using the primer set of SEQ ID NOs: 41 and 42 at the BsiWI and XhoI sites downstream of the expression cassettes of plasmids pEF1 ⁇ -KOD3G8HC-1.1k and pEF1 ⁇ -KOD3G8LC-Hyg-1.1k 3 were inserted to construct plasmids pEF1 ⁇ -KOD3G8HC-1.1k / 1.1k and pEF1 ⁇ -KOD3G8LC-Hyg-1.1k / 1.1k.
  • KOD3G8 H chain and L chain expression constructs were linearized with the restriction enzyme AhdI, and the test sequence CHO5 ⁇ 3 was inserted upstream of the expression cassette (2.6 k), and the test sequence CHO5 ⁇ 3-3 was upstream of the expression cassette. Inserted (1.1k), test sequence CHO5 ⁇ 3-3 inserted both upstream and downstream of the expression cassette (1.1k / 1.1k), and test sequence not included (ctrl)
  • the mixed plasmid was prepared by mixing the H chain and L chain expression constructs at a weight ratio of 1: 1.
  • 2 ⁇ g of the mixed plasmid was transfected into CHO-K1 cells that had been seeded in a 6-well plate the day before and incubated for 24 hours. The next day, the medium was removed, cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol / l-EDTA Solution, transferred to a 90 mm Petri dish, and in Ham's F12 + 10% FBS medium containing G418 and HygroGold. Selective culture was performed for 10 days.
  • the medium was changed every 3 to 4 days, and the G418 concentration was gradually increased from 250 ⁇ g / ml to 700 ⁇ g / ml, and the HygroGold concentration was gradually increased from 150 ⁇ g / ml to 350 ⁇ g / ml.
  • the G418 concentration was gradually increased from 250 ⁇ g / ml to 700 ⁇ g / ml
  • the HygroGold concentration was gradually increased from 150 ⁇ g / ml to 350 ⁇ g / ml.
  • cells were dispersed by treatment with 2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol / l-EDTA Solution, and 1.84 ⁇ 10 5 cells were seeded in a 6-well plate.
  • the culture supernatant was collected, and the production amount of KOD3G8 antibody in the polyclone was measured by ELISA (Pyrococcus kodakaraensis KOD1-derived DNA polymerase was immobilized). Specifically, the culture supernatant was added to an ELISA plate on which a DNA polymerase antigen derived from KOD1 at a concentration of 30 ⁇ g / ml was immobilized, and incubated at 35 ° C. for 2 hours. Next, after washing 3 times with PBS-T and adding 50 ⁇ l of 10000-fold diluted anti-mouse antibody-HRP (manufactured by DAKO) and incubating at 35 ° C.
  • the antibody concentration was calculated based on a calibration curve prepared from a standard product.
  • a standard product an antibody obtained from mouse hybridoma cell line 3G8 that produces an antibody specific to DNA polymerase derived from KOD1 was used.
  • the results are shown in FIG.
  • the test sequence CHO5 ⁇ 3 or CHO5 ⁇ 3-3 was inserted upstream of the expression cassette (2.6 k or 1.1 k) and the test sequence CHO5 ⁇ 3-, compared to the test sequence not containing the test sequence (ctrl).
  • the antibody production increased in all of the cases in which 3 was inserted both upstream and downstream of the expression cassette (1.1 k / 1.1 k).
  • FIG. 14 shows a graph plotting the antibody production amount of each clone calculated based on a calibration curve prepared from a standard product.
  • the test sequence CHO5 ⁇ 3 was inserted upstream of the expression cassette (2.6 k), and the test sequence CHO5 ⁇ 3-3 was inserted upstream and downstream of the expression cassette, compared to the test sequence not including the test sequence (ctrl).
  • the ratio of high-expressing clones markedly increased in both of the inserts (1.1k / 1.1k).
  • FIG. 15 shows a graph plotting the antibody production amount of each clone calculated based on a calibration curve prepared from a standard product.
  • the test sequence CHO5 ⁇ 3 was inserted upstream of the expression cassette (2.6 k), compared to the test sequence not containing the test sequence (ctrl), as in the 96-well plate screening, the test The ratio of high-expressing clones markedly increased both in the sequence CHO5 ⁇ 3-3 inserted both upstream and downstream of the expression cassette (1.1 k / 1.1 k).
  • test sequence CHO5 ⁇ 3 or CHO5 ⁇ 3-3 can stabilize the gene expression of a foreign gene arranged in close proximity and increase the expression efficiency.
  • the gene expression stabilizing element of the present invention can stabilize the expression of a foreign gene in mammalian cells, particularly CHO cells, and reduce and shorten the work of establishing a high expression cell line. Therefore, the cell expression system using the gene expression element of the present invention contributes not only to the functional analysis of proteins in various mammalian cells but also to the industry such as drug discovery and medicine as a biopharmaceutical.
  • SEQ ID Nos: 7 to 20 are primer sequences used in Example 3.
  • SEQ ID Nos: 21 to 26 are primer sequences used in Example 4.
  • SEQ ID Nos: 27 to 31 are primer sequences used in Example 5.
  • SEQ ID Nos: 32 to 42 are primer sequences used in Example 6.

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Abstract

　哺乳類細胞、特にＣＨＯ細胞において組換えタンパク質の遺伝子発現を安定化し発現効率を増大させることができるエレメントを提供する。 　配列番号１で示す配列からなるＤＮＡ；配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目まで、４１８２１番目から４１８４０番目まで、４５１８２番目から４５２００番目まで、もしくは９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；これらのＤＮＡの均等物；及びこれらのＤＮＡの相補体のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなる遺伝子発現安定化エレメント。

Description

遺伝子発現安定化エレメント
　本発明は、遺伝子組換えによって外来遺伝子が導入された哺乳類細胞において、組換えタンパク質を効率良く、安定して生産するために使用することができる遺伝子発現安定化エレメントに関する。本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、遺伝子工学的手法により、哺乳類細胞において医薬品などの有用タンパク質を生産するために有用である。
　組換えタンパク質を生産する発現システムの開発は、研究または治療に供されるタンパク質の供給源を提供するうえで重要である。発現システムとしては、大腸菌などの原核生物、ならびに酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，ＰｉｃｈｉａおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種）および哺乳類細胞を含む真核細胞の両者が用いられている。これらの中で、特に哺乳類細胞における発現システムが治療用タンパク質の製造には好ましい。なぜなら、ヒトをはじめとする哺乳動物において起こるタンパク質の翻訳後修飾は、時にその生物活性に深く寄与するため、タンパク質の投与対象と類似した翻訳後修飾が可能な哺乳類細胞発現システムを利用した方が、治療用タンパク質の有効性を増強しうるからである。
　哺乳類細胞発現システムとしては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が広く利用される。ＣＨＯ細胞を用いて組換えタンパク質を高発現するために様々なアプローチが行われてきた。古典的なアプローチとしては、ｔｒａｎｓｇｅｎｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎと称される、目的の組換えタンパク質を発現する導入遺伝子のコピー数を増大させた高発現クローンを選択する方法が挙げられる。この方法によれば、ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅのような選択遺伝子と組換えタンパク質を発現する遺伝子とを、選択条件下では生育に選択遺伝子の発現を必要とする変異型細胞に同時導入し、次第に淘汰圧を上げることによって高発現クローンが取得される（非特許文献１，２）。さらに近年のアプローチとしては、ＣＨＯ細胞の核酸配列の中から内在性プロモーターや好ましいインテグレーション部位の核酸配列などを単離し、ベクターに導入する方法が挙げられる。内在性プロモーターとしては、Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ　ＥＦ－１ａｌｐｈａ（ＣＨＥＦ１）が利用されている（非特許文献３）。一方、インテグレーション部位を使用する方法では、高い転写活性のある染色体上の稀な部位（ホットスポット）を同定し、この部位に導入遺伝子を導入する（特許文献１）。この他にも、高発現細胞の選択やスクリーニング方法の改良、代謝工学的アプローチも行われている。これらのアプローチは、ある程度の高発現を可能にするが、その一方で、高発現株を取得するには膨大な時間を必要としたり、製造フェーズで組換えタンパク質の安定した合成を維持できないケースがある。
　組換えタンパク質の発現は、組換えタンパク質をコードする遺伝子が宿主細胞ゲノム内のどの部位に導入されるかによって大きく変動するが、導入部位の制御は通常、不可能である。従って、遺伝子導入しても大半の細胞は組換えタンパク質を発現しなかったり、発現量が低いため、スクリーニングに膨大な労力を要する。これに加え、スクリーニング時には十分な発現をしていた細胞でも培養を継続していくうちに次第に発現が低下してしまうこともある。このような位置効果や多大なスクリーニングの必要性を克服するため、導入遺伝子への隣接する染色体や調節エレメントの影響を緩和する染色体エレメント（シス作用性ＤＮＡエレメント）が組換えタンパク質の製造に利用されつつある。このようなエレメントの１つがインスレーターと呼ばれる配列で、ニワトリのβ－グロビンＬＣＲの１．２ｋｂ長のＤＮａｓｅＩ　Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ部位（ｃＨＳ４）などが良く機能解析され、組換えタンパク質の発現に利用されているが（非特許文献４）、ＣＨＯ－Ｋ１細胞におけるタンパク質発現の増加はそれほど大きなものではないとされている（非特許文献５）。
ＷＯ００／１７３３７号公報 特開２００１－３７４７８号公報
Ｋａｕｆｍａｎ　Ｒ，Ｓｈａｒｐ　Ｐ．（１９８２）Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　１５９：６０１－６２１ Ｓｃｈｉｍｋｅ　Ｒ，Ｂｒｏｗｎ　Ｐ，Ｋａｕｆｍａｎ　Ｒ．（１９８２）　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ　Ｍｏｎｏｇｒ　６０：７９－８６ Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｄｅｅｒ　Ｊ，Ａｌｌｉｓｏｎ　ＤＳ（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｐｒｏｇ　２０：８８０－８８９ Ｐｉｋａａｒｔ　ＭＪ，Ｒｅｃｉｌｌａｓ－Ｔａｒｇａ　Ｆ，Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ　Ｇ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　１２：２８５２－６２ Ｉｚｕｍｉ　Ｍ，Ｇｉｌｂｅｒｔ　ＤＭ．（１９９９）Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　７６：２８０－２８９ Ｂｌａｓｃｏ　ＭＡ（２００７）Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ　８：２９９－３０９ Ｇｏｎｚａｌｏ　Ｓ，Ｊａｃｏ　Ｉ，Ｆｒａｇａ　ＭＦ，Ｃｈｅｎ　Ｔ，Ｌｉ　Ｅ，Ｅｓｔｅｌｌｅｒ　Ｍ，Ｂｌａｓｃｏ　ＭＡ（２００６）Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　８：４１６－４２４ Ｐｅｒｒｏｄ　Ｓ，Ｇａｓｓｅｒ　ＳＭ（２００３）Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ　６０：２３０３－２３１８ Ｗａｋｉｍｏｔｏ　ＢＴ（１９９８）Ｃｅｌｌ　９３：２３０３－２３１８ ＭｃＢｒａｔｎｅｙ　Ｓ，Ｃｈｅｎ　ＣＹ，Ｓａｒｎｏｗ　Ｐ．（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５：９６１－９６５ Ｋａｕｆｍａｎ　ＲＪ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９：４４８５－４４９０ Ｂａｏ　Ｌ，Ｚｈｏｕ　Ｍ，Ｃｕｉ　Ｙ（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６，Ｄ８３－Ｄ８７
　本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、哺乳類細胞、特にＣＨＯ細胞において組換えタンパク質の遺伝子発現を安定化し発現効率を増大させることができるエレメントを提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するため、導入された外来性遺伝子が高度に遺伝子増幅されて高度に遺伝子発現するＣＨＯ細胞クローンにおいて外来遺伝子導入部位の近傍の配列を詳しく分析した結果、遺伝子発現の安定化及び発現効率の増大に寄与する特定の領域を同定することに成功し、本発明を完成させるに到った。
　すなわち、本発明によれば、以下の（ａ）～（ｇ）のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなることを特徴とする遺伝子発現安定化エレメントが提供される：
　（ａ）配列番号１で示す配列からなるＤＮＡ；
　（ｂ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
　（ｃ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
　（ｄ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
　（ｅ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
　（ｆ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、宿主細胞中で外来遺伝子発現カセットと近接するように配置された際に、外来遺伝子発現カセットに含まれる外来遺伝子からの目的組換えタンパク質の発現を増大または安定化させることができるＤＮＡ；及び
　（ｇ）前記（ａ）～（ｆ）のいずれかのＤＮＡの相補体。
　本発明の遺伝子発現安定化エレメントの好ましい態様によれば、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡは、配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目、好ましくは４１６０１番目から４２７００番目までの塩基で示す領域、又はその一部からなる。
　また、本発明によれば、かかる遺伝子発現安定化エレメント、及びそれに近接して配置された外来遺伝子発現カセットを含むことを特徴とする外来遺伝子発現ベクター、並びにかかる遺伝子発現安定化エレメントと外来遺伝子発現カセットとがゲノム中に相互に近接するように配置されていることを特徴とする形質転換された宿主細胞も提供される。
　本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、近接して配置された外来遺伝子への隣接染色体や調節エレメントの影響を低減させて外来遺伝子の遺伝子発現を安定化し発現効率を増大させることができるので、哺乳類細胞発現システム、特にＣＨＯ細胞発現システムにおける高発現細胞株の樹立作業を低減短縮することができる。
配列番号１の配列中のＣＴＣＦの結合配列モチーフの予測部位を示す図である。 核酸配列断片の遺伝子発現安定化効果の確認に用いた基本コンストラクトｐＢＳ－ＣＭＶ－ＳＮＡＰ２６ｍの構築を示す図である。 配列番号１の配列中のＣＴＣＦの結合配列モチーフ及び被験配列の核酸断片の位置を示す図である。 各核酸配列の断片を含むＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを安定導入されたＣＨＯ細胞をＦＡＣＳ解析して得られたＳＮＡＰ２６ｍ発現強度と細胞数の分布を示すグラフである。 各核酸配列の断片を含むＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを安定導入されたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析の結果、１０以上のＳＮＡＰ２６ｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。 ＣＨＯ５のデリーションコンストラクト構築、及び配列番号１の配列中の被験配列の位置を示す図である。 ＣＨＯ５、及びＣＨＯ５デリーションコンストラクトを安定導入して得られたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析の結果、１０以上のＳＮＡＰ２６ｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。 ＣＨＯ５Δ３の３’デリーションコンストラクト構築のためのＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法に用いたプライマーの位置、及びデリーションによって得られた被験挿入配列を示す図である。 ＣＨＯ５Δ３、及びＣＨＯ５Δ３の３’デリーションコンストラクトを安定導入して得られたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析の結果、１０以上のＳＮＡＰ２６ｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。 ＫＯＤ３Ｇ８抗体生産系での核酸配列断片の遺伝子発現安定化効果の確認に用いた基本コンストラクトｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ－ＲＥ２の構築を示す図である。 ＫＯＤ３Ｇ８抗体生産系での核酸配列断片の遺伝子発現安定化効果の確認に用いた基本コンストラクトｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ－Ｈｙｇ－ＲＥ２の構築を示す図である。 ＫＯＤ３Ｇ８抗体生産系での核酸配列断片の遺伝子発現安定化効果の確認に用いた、各被験配列を挿入済のＨ鎖あるいはＬ鎖発現ベクターを示す図である。 被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセットの上流に挿入したもの（２．６ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３－３を発現カセットの上流に挿入したもの（１．１ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３－３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、抗体生産量をプロットしたグラフである。 ９６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセットの上流に挿入したもの（２．６ｋ）、および被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と被験配列ＣＨＯ５Δ３－３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）をそれぞれ同一グラフ上にプロットしている。 ６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセットの上流に挿入したもの（２．６ｋ）、および被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と被験配列ＣＨＯ５Δ３－３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）をそれぞれ同一グラフ上にプロットしている。
　以下に本発明を詳細に説明する。
　本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、特許文献２に記載のＣＨＯ細胞ＤＲ１０００Ｌ－４Ｎ株（ＣＨＯ細胞－４Ｎ株）から本発明者らによって同定された核酸分子である。当該株は、外来遺伝子としてヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）遺伝子を、ＤＨＦＲ遺伝子を持つ発現ベクターに導入し、このベクターを、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞ＤＧ４４株に導入し、導入株をＩＭＤＭ培地（核酸含有）に１０％牛胎児血清を添加した培地で培養して形質転換体を得、この形質転換体を、次いでＩＭＤＭ培地（核酸不含）、１０％透析牛胎児血清を添加した培地で選択し、さらに５０ｎＭ、１００ｎＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）を含み、核酸を含まないＩＭＤＭ培地を用いて１０から１００倍程度に増加するまで培養し、ＭＴＸ濃度を上昇させることにより得られたテロメアタイプのクローン細胞である。
　真核細胞のゲノムは、真正染色質と異質染色質の２つのクラスの染色質に分けられる。セントロメアとテロメアの配列は、構成的な異質染色質の主要な部分である。特に、テロメアは、ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列とサブテロメア領域からなり、際立った異質染色質の立体構造をとる、遺伝子の乏しい領域である（非特許文献６，７）。テロメアは、ゲノムの安定性に対するその寄与や保護的な役割に加え、テロメア位置効果として知られる現象によって、近くに導入された遺伝子の発現にも影響を与える（非特許文献８，９）。
　ところが、ＤＲ１０００Ｌ－４Ｎ株は、テロメアタイプのクローン細胞であるにもかかわらず、導入された外来遺伝子は導入部位付近の異質染色体からの不活性化の影響を受けることなく、長期間の培養において、安定したｈＧＭ－ＣＳＦの高い産生を維持した。これは、外来遺伝子の導入された部位の近傍に、不活性化の進行を強力に遮断するような境界エレメントが存在し、遺伝子発現を安定化していることを示唆する。
　そこで、本発明者らは、ＤＲ１０００Ｌ－４Ｎ株において外来遺伝子導入部位の近傍の配列を分析した結果、配列表の配列番号１で示す約９１ｋｂｐの配列からなるＤＮＡが遺伝子発現の安定化に関与していることを見出した。そして、この配列をさらに詳細に分析したところ、この配列の中でも、（ｉ）４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域、（ｉｉ）４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域、（ｉｉｉ）４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域、及び（ｉｖ）９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の４つの領域が、インスレーター結合タンパク質ＣＴＣＦの結合配列モチーフに相当することを見出した。従って、これらの４つの領域の少なくともいずれかを含む、これらの領域の近傍が特に遺伝子発現の安定化に関与していると考えられた。
　これらの知見から、本発明者らは、以下の５種類のＤＮＡが遺伝子発現安定化エレメントとして使用できると考えた。
　（ａ）配列番号１で示す配列からなるＤＮＡ；
　（ｂ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
　（ｃ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
　（ｄ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；及び
　（ｅ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ。
　これらのエレメントは、ＣＨＯゲノムから単離同定されたものであるが、これらのエレメントと相同なエレメントは、他の哺乳類細胞ゲノムにも存在することが予想される。従って、（ｆ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、宿主細胞中で外来遺伝子発現カセットと近接するように配置された際に、外来遺伝子発現カセットに含まれる外来遺伝子からの目的組換えタンパク質の発現を増大または安定化させることができるＤＮＡも、遺伝子発現安定化エレメントとして使用することができる。このような相同エレメントは、この技術分野の周知の技術、例えば、種間ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲなどによって容易に単離同定されることができる。
　また、（ｇ）前記（ａ）～（ｆ）のいずれかのＤＮＡの相補体も当然、遺伝子発現安定化エレメントとして使用することができる。本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、これらの（ａ）～（ｇ）のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなる。
　本発明の遺伝子発現安定化エレメントの好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの塩基で示す領域、又はその一部からなる。本発明の遺伝子発現安定化エレメントのさらに好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの塩基で示す領域、又はその一部からなる。
　目的遺伝子を宿主細胞ゲノムへ導入するための遺伝子構築物としては、プラスミドベクターが一般に用いられる。プラスミドベクターの長さは最大１０ないし２０ｋｂｐであることから、遺伝子発現安定化エレメントの鎖長は出来るだけ短い方が好ましく、好ましい長さとしては５ｋｂｐ以下、より好ましくは１ｋｂ程度である。
　本発明の遺伝子発現安定化エレメントがその発現安定化効果を奏するためには、エレメントが宿主細胞ゲノム中で外来遺伝子発現カセットの導入部位に近接する位置に配置されることが必要である。本発明において、用語「近接する」とは、特に制限されるものではないが、好ましくは本発明の遺伝子発現安定化エレメントと外来遺伝子発現カセットとの間の距離が５０００ｂｐ以下、さらに好ましくは５００ｂｐ以下であることを意味する。
　このような近接配置は、本発明のエレメントを含む核酸配列断片と、外来遺伝子の発現カセットを含む核酸配列断片との混合物をエレクトロポレーションやトランスフェクションなどによって宿主細胞内へ導入し、外来遺伝子の発現量の高い宿主細胞クローンを選択することによって実現することもできるが、近接配置を確実に達成させるためには、本発明の遺伝子発現安定化エレメント、及びそれに近接して配置された外来遺伝子発現カセットを含む外来遺伝子発現ベクターをあらかじめ作成しておき、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換させることが望ましい。
　本発明において、外来遺伝子の発現カセットとは、例えば外来遺伝子を哺乳類細胞で発現可能なエンハンサー及びプロモーターの下流に配置し、転写された外来遺伝子のＲＮＡが安定化するようにポリアデニル化シグナルを外来遺伝子の下流に配置したものである。かかる発現カセットは、イントロンなどの調節エレメントをさらに含んでもよい。哺乳類細胞で発現可能なエンハンサー及びプロモーターとしては、特に限定されるものではないが、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスに由来するものや、β－アクチンやユビキチン、ＧＡＰＤＨ、ＥＦ－１αなどの非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するエンハンサー／プロモーター、及びそのハイブリッドが挙げられる。外来遺伝子発現カセットには、初めから外来遺伝子を配置しておく必要は必ずしもなく、外来遺伝子の代わりに複数の制限酵素認識配列からなるマルチクローニングサイトを配置しておき、そこに様々な外来遺伝子のｃＤＮＡやコーディング領域を後で導入してもよい。
　本発明のベクターにおいては、外来遺伝子発現カセットの上流及び下流の両方に、外来遺伝子発現カセットを挟むように、本発明の遺伝子発現安定化エレメントが配置されていることがさらに好ましい。また、本発明のベクターは、複数の外来遺伝子を含むことが好ましく、これらの複数の外来遺伝子は、抗体の重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドをコードすることが好ましい。
　本発明のベクターとしては、外来遺伝子が導入された細胞を選択するため、薬剤耐性遺伝子を発現できるものがさらに好ましい。薬剤耐性遺伝子としては、ｄｅａｍｉｎａｓｅをコードするＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ（ｂｓｒ）由来のブラストサイジン耐性遺伝子、ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ　３’－ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードするＴｎ５由来のネオマイシン耐性遺伝子、大腸菌由来ｈｐｈをコードするハイグロマイシン耐性遺伝子、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ　Ｎ－ａｃｅｔｈｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＡＣ）をコードするピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。さらに、ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＤＨＦＲ）遺伝子、ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＳ）遺伝子などの選択マーカー遺伝子を用いてもよい。
　本発明のベクターでは、前記薬剤耐性遺伝子を含む、２つ以上の外来タンパク質を発現させるために“プロモーター－外来遺伝子－ポリアデニル化シグナル”からなる発現カセットを複数含んでもよい。また、“プロモーター－外来遺伝子１－－外来遺伝子２－ポリアデニル化シグナル”のように同じプロモーターの転写調節下に外来遺伝子１，２を配置し、外来遺伝子１，２の間に内在性リボソームエントリー部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅｓ、ＩＲＥＳ）を導入し、発現カセット中の第２の遺伝子生成物の翻訳を増強する方法も有用である（非特許文献１０，１１）。
　本発明の遺伝子発現安定化エレメントが導入される細胞としては、組換えタンパク質の産生に一般的に用いられるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）の他、ベビーハムスターキドニー細胞（ＢＨＫ）、ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）などの哺乳類由来の細胞が例示されるが、これに限定されるものではなく、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタなどの動物由来の細胞なども導入対象とすることができる。
　以下、実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
実施例１　核酸配列の決定
　ＣＨＯ細胞ＤＲ１０００Ｌ－４Ｎ株（ＣＨＯ細胞－４Ｎ株）より作成されたＢＡＣライブラリーのうち、ｈＧＭ－ＣＳＦ発現カセットを含むクローンＣｇ００３１Ｎ１４を単離した。このクローンＣｇ００３１Ｎ１４に由来するＢＡＣより作成したショットガンクローンの５’，３’ワンパスシーケンスを実施し、Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ／Ｃｏｎｓｅｄによる配列情報のアッセンブルを行い、ｈＧＭ－ＣＳＦ発現カセットが導入されたＣＨＯ細胞の近傍のゲノム配列約９１ｋｂｐの配列を決定した。その配列を、配列表の配列番号１に示す。
実施例２　核酸配列の解析
　前記決定された核酸配列中にインスレーター配列が存在するかどうかを、インスレーター結合タンパク質ＣＴＣＦの結合配列モチーフを検索することによって調査した。解析ツールとしてＩｎ　ｓｉｌｉｃｏ　ＣＴＣＦＢＳ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｓｕｌａｔｏｒｄｂ．ｕｔｍｅｍ．ｅｄｕ／）（非特許文献１２）を使用した。前記ツールで抽出されたモチーフ配列を表１及び図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例３　導入遺伝子発現の安定化効果の確認
　図２に示すスキームに従って、プラスミドｐＢＳ－ＣＭＶ－ＳＮＡＰ２６ｍを構築した。即ち、まずＥｍｅｒａｌｄ　ＬｕｃベクターｐＥＬｕｃ－ｔｅｓｔ（東洋紡績）の制限酵素ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイトにＣＭＶプロモーター（配列番号６）を導入されたｐＥＬｕｃ－ＣＭＶプラスミドからＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩでＥｍｅｒａｌｄ　Ｌｕｃ（ＥＬｕｃ）遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍ（Ｃｏｖａｌｙｓ社）からＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号７，８のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＬｕｃ－ＣＭＶプラスミドのＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＳＮＡＰ２６ｍ－ＣＭＶを構築した。続いて、ｐＳＮＡＰ２６ｍ－ＣＭＶより、ＣＭＶプロモーター／ＳＮＡＰ２６ｍ／ＳＶ４０　ｐｏｌｙＡを配列番号９，１０のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、部分消化によって、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社）のＢａｍＨＩ、ＳａｃＩサイトへ導入し、プラスミドｐＢＳ－ＣＭＶ－ＳＮＡＰ２６ｍを構築した。
　次に、実施例１で作成したショットガンライブラリーのクローンうち、４１８２０位、４５１８２位のＣＴＣＦの結合配列モチーフの付近のＣＨＯゲノム配列を含むクローンを抽出し、ＣＨＯゲノムに由来する導入配列（図３参照）をＰＣＲで増幅し、ｐＢＳ－ＣＭＶ－ＳＮＡＰ２６ｍのＫｐｎＩ、ＸｈｏＩまたはＸｈｏＩ、ＣｌａＩサイトに導入した。ショットガンライブラリークローンと、当該導入配列が組み込まれたＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトの対応関係を表２に示す。なお、表２中のＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトの欄の（－）は、ＣＨＯのゲノム配列が導入されていないｐＢＳ－ＣＭＶ－ＳＮＡＰ２６ｍである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　これらのＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトとｐＰＵＲ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性ベクター）を制限酵素ＡｈｄＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）でリニアライズした後、それぞれ重量比が９：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。
　一方、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したＣＨＯ－Ｋ１細胞を１２ウェルプレートに２ｍｌずつ前日に播種し、一晩培養して、トランスフェクション用のＣＨＯ－Ｋ１細胞を準備した。この際、培地として１０％牛胎児血清を添加したＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地（日水製薬）を使用した。
　トランスフェクションは、１８μｌ　ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク）を６００μｌ　Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ　Ｉ　Ｒｅｄｕｃｅｄ－Ｓｅｒｕｍ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ）で希釈し、前記の混合プラスミド１μｇにこの希釈液１０３μｌを加え、１０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ－Ｋ１細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ－Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク）で処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、６μｇ／ｍｌ　Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を含むＨａｍ’ｓ　Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３～４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ－Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、２×１０５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地に２μＭ　ＳＮＡＰ－Ｃｅｌｌ－５０５（Ｃｏｖａｌｙｓ社）を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ－Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ－ＰＢＳ（－）（ナカライテスク）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ　ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
　図４は、被験配列ＣＨＯ１～ＣＨＯ６がそれぞれ導入されたＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図５は、未処理のＣＨＯ細胞（図４左上の（－））の解析結果から１０以上のシグナル（図４中のＭ２）を示す細胞をＳＮＡＰ２６ｍの発現細胞とし、その細胞の割合をプロットしたグラフである。図４，５から明らかな通り、ＣＨＯ細胞ゲノムの一部を導入したコンストラクト、特に配列番号１の４１６０１～４６７４６位を導入したＣＨＯ４及び５において、有意な発現の上昇が認められた。ＣＨＯ４とＣＨＯ５の間の差異はサンプル間のバラツキの範囲内と考えられるが、念のため、以後の最適領域の絞り込みはＣＨＯ５に基づいて実施した。
実施例４　遺伝子発現安定化能を有する配列領域の絞り込み（１）
　実施例３で発現の上昇が最も高かったコンストラクトＣＨＯ５をもとに、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡績）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法によって、配列番号２１、２２のプライマーを使って被験配列から配列番号１の４１６０１－４２９０２位に相当する領域をデリーションしたＣＨＯ５Δ５を構築した。同様にして、配列番号２３，２４のプライマーを使って被験配列から配列番号１の４２９０３－４４２００位に相当する領域をデリーションしたＣＨＯ５ΔＭ、及び配列番号２５，２６のプライマーを使って被験配列から配列番号１の４４２０１－４６７４６位に相当する領域をデリーションしたＣＨＯ５Δ３をそれぞれ構築した（図６）。
　これらのＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトとｐＰＵＲ（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性ベクター）を制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした後、それぞれ重量比が９：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。
　前記の混合プラスミド１μｇを、前日に１２ウェルプレートに播種しておいたＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ－Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、６μｇ／ｍｌ　Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ　Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３～４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ－Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、２×１０５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地に２μＭ　ＳＮＡＰ－Ｃｅｌｌ－５０５（Ｃｏｖａｌｙｓ社）を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ－Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ－ＰＢＳ（－）（ナカライテスク）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ　ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
　図７は、被験配列ＣＨＯ５Δ５、ＣＨＯ５ΔＭ、ＣＨＯ５Δ３がそれぞれ導入されたＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果、シグナル値１０以上を示した細胞の割合をプロットしたものである。図７から明らかな通り、ＣＨＯ５Δ３についてはデリーション前とほぼ同程度のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度が認められたのに対し、ＣＨＯ５ΔＭ、ＣＨＯ５Δ５では発現上昇の効果が明らかに低減した。このことから、発現の安定化には配列番号１の配列の４１６０１～４６７４６位のうちの５’側～前半部分が主に寄与していると考えられる。
実施例５　遺伝子発現安定化能を有する配列領域の絞り込み（２）
　配列番号２６～３１のプライマーを使用し、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡績）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法によって、ＣＨＯ５Δ３の被験配列の３’がさらにデリーションされたＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを構築した（図８及び表３参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　これらのＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを実施例４と同様にして処理し、ＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。
　図９は、被験配列ＣＨＯ５Δ３、ＣＨＯ５Δ３－１～５のＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果、シグナル値１０以上を示した細胞の割合をプロットしたものである。図９から明らかな通り、配列番号１の配列の４１６０１～４２７００位を含むＣＨＯ５Δ３－１からＣＨＯ５Δ３－３までについては、サンプル間のバラツキはあるものの、デリーション前とほぼ同程度のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度が認められたのに対し、かかる領域の３’側が欠失したＣＨＯ５Δ３－４及びＣＨＯ５Δ３－５では発現上昇の効果が明らかに低減した。
実施例６　抗ＫＯＤ抗体発現系における遺伝子発現安定化能の評価
　図１０および１１に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ－ＲＥ２およびｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ－Ｈｙｇ－ＲＥ２を構築した。即ち、既存のプロモーターをＥＦ－１αプロモーターに変更したｐＣＩ－ｎｅｏプラスミド（プロメガ社）のＸｂａＩ－ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の重鎖あるいは軽鎖を挿入したプラスミドであるｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣあるいはｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣを鋳型に、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡績）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法によって、配列番号３２、３３のプライマーを使って発現カセット上流への被験配列挿入用に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ－ＲＥおよびｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ－ＲＥを構築した。更に本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡績）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法によって、配列番号３４、３５のプライマーを使って発現カセット下流への被験配列挿入用に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加したｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ－ＲＥ２およびｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ－ＲＥ２を構築した。ｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ－ＲＥ２については、さらにＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩで処理し、ネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、ｐＴＫ－Ｈｙｇ（クロンテック社）からハイグロマイシン耐性遺伝子を配列番号３６、３７のプライマーを使ってＰＣＲで増幅し、上述のネオマイシン耐性遺伝子が切出されたｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ－ＲＥ２のＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ－Ｈｙｇ－ＲＥ２を構築した。
　次に、これらのプラスミドの発現カセットの上流あるいは発現カセットの上流および下流の両方に被験配列を挿入し、図１２に記載のプラスミドを構築した。具体的には、プラスミドｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ－ＲＥ２およびｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ－Ｈｙｇ－ＲＥ２の発現カセット上流のＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩサイトに、配列番号３８、３９のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被験配列ＣＨＯ５Δ３を挿入して、プラスミドｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ－２．６ｋおよびｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ－Ｈｙｇ－２．６ｋを構築した。また、プラスミドｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ－ＲＥ２およびｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ－Ｈｙｇ－ＲＥ２の発現カセット上流のＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩサイトに、配列番号３８、４０のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被験配列ＣＨＯ５Δ３－３を挿入して、プラスミドｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ－１．１ｋおよびｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ－Ｈｙｇ－１．１ｋを構築した。更に、プラスミドｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ－１．１ｋおよびｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ－Ｈｙｇ－１．１ｋの発現カセット下流のＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号４１、４２のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被験配列ＣＨＯ５Δ３－３を挿入してプラスミドｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ－１．１ｋ／１．１ｋおよびｐＥＦ１α－ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ－Ｈｙｇ－１．１ｋ／１．１ｋを構築した。
　これらのＫＯＤ３Ｇ８のＨ鎖およびＬ鎖発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした後、被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセットの上流に挿入したもの（２．６ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３－３を発現カセットの上流に挿入したもの（１．１ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３－３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）、および被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）のそれぞれについて、Ｈ鎖およびＬ鎖発現コンストラクトを重量比が１：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。
　前記の混合プラスミド２μｇを、前日に６ウェルプレートに播種しておいたＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ－Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、Ｇ４１８およびＨｙｇｒｏＧｏｌｄを含むＨａｍ’ｓ　Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１０日間選択培養を行った。選択培養中、３～４日ごとに培地を交換し、Ｇ４１８濃度を２５０μｇ／ｍｌから７００μｇ／ｍｌまで、ＨｙｇｒｏＧｏｌｄ濃度を１５０μｇ／ｍｌから３５０μｇ／ｍｌまで段階的に上昇させた。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ－Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量をＥＬＩＳＡ（パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼを固相化したもの）で測定した。
　具体的には、３０μｇ／ｍｌ濃度のＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼ抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートに、培養上清を添加し、３５℃で２時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、１００００倍希釈した抗マウス抗体－ＨＲＰ（ＤＡＫＯ製）を５０μｌ添加して３５℃で１時間インキュベートした後、さらにＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ＋（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＫＯ製）で５分間反応させた。５０μｌの１Ｎ硫酸を加えて反応停止後、プレートリーダー（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。
　標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。なお、標準品として、ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系３Ｇ８から得られた抗体を用いた。結果を図１３に示す。図１３から明らかな通り、被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と比較して、被験配列ＣＨＯ５Δ３あるいはＣＨＯ５Δ３－３を発現カセット上流に挿入したもの（２．６ｋあるいは１．１ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３－３を発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）の全てで抗体生産量が上昇していた。
　そこで、被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセット上流に挿入したもの、被験配列ＣＨＯ５Δ３－３を発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの、被験配列を含まないものの計３系列について、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。
　具体的には、前記のＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ－Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、ＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記と同様の方法でＥＬＩＳＡで測定した。
　標準品から作成した検量線をもとに算出した各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図１４に示す。図１４から明らかな通り、被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と比較して、被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセット上流に挿入したもの（２．６ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３－３を発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）のどちらにおいても高発現クローンの割合が顕著に上昇していた。
　次に、９６ウェルプレートでの培養上清を用いたスクリーニングでそれぞれについて発現量上位１８クローンを拡大培養した後、１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、モノクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記と同様の方法でＥＬＩＳＡで測定した。
　標準品から作成した検量線をもとに算出した各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図１５に示す。図１５から明らかな通り、９６ウェルプレートでのスクリーニングの場合と同様、被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と比較して、被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセット上流に挿入したもの（２．６ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３－３を発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）のどちらにおいても高発現クローンの割合が顕著に上昇していた。
　以上の結果から、被験配列ＣＨＯ５Δ３又はＣＨＯ５Δ３－３は、近接して配置された外来遺伝子の遺伝子発現を安定化し、発現効率を増大させることができることが明らかである。
　本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、哺乳類細胞、特にＣＨＯ細胞における外来遺伝子の発現を安定化し、高発現細胞株の樹立作業を低減短縮することができる。従って、本発明の遺伝子発現エレメントを使用した細胞発現システムは、種々の哺乳類細胞のタンパク質の機能解析は勿論、バイオ医薬品として創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。
　配列番号７～２０は、実施例３で使用したプライマーの配列である。
　配列番号２１～２６は、実施例４で使用したプライマーの配列である。
　配列番号２７～３１は、実施例５で使用したプライマーの配列である。
　配列番号３２～４２は、実施例６で使用したプライマーの配列である。

Claims (8)

  1. 　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなることを特徴とする遺伝子発現安定化エレメント：
    　（ａ）配列番号１で示す配列からなるＤＮＡ；
    　（ｂ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
    　（ｃ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
    　（ｄ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
    　（ｅ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
    　（ｆ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、宿主細胞中で外来遺伝子発現カセットと近接するように配置された際に、外来遺伝子発現カセットに含まれる外来遺伝子からの目的組換えタンパク質の発現を増大または安定化させることができるＤＮＡ；及び
    　（ｇ）前記（ａ）～（ｆ）のいずれかのＤＮＡの相補体。
  2. 　（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡが、配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの塩基で示す領域、又はその一部からなることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現安定化エレメント。
  3. 　（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡが、配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの塩基で示す領域、又はその一部からなることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子発現安定化エレメント。
  4. 　請求項１～３のいずれかに記載の遺伝子発現安定化エレメント、及びそれに近接して配置された外来遺伝子発現カセットを含むことを特徴とする外来遺伝子発現ベクター。
  5. 　遺伝子発現安定化エレメントが、外来遺伝子発現カセットの上流及び下流の両方に配置されていることを特徴とする請求項４に記載の外来遺伝子発現ベクター。
  6. 　複数の外来遺伝子を含むことを特徴とする請求項４又は５に記載のベクター。
  7. 　複数の外来遺伝子が、抗体の重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項６に記載のベクター。
  8. 　請求項１～３のいずれかに記載の遺伝子発現安定化エレメントと外来遺伝子発現カセットとがゲノム中に相互に近接するように配置されていることを特徴とする形質転換された宿主細胞。
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