JP2013034474A - 薬剤選択融合遺伝子を含む高生産性細胞の樹立のための発現ベクター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(1)薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、(2)遺伝子発現安定化エレメント、及び(3)目的タンパク質遺伝子発現カセットを少なくとも有する発現ベクター。
【選択図】図15
Description
[1−1]
下記(1)〜(3)を少なくとも有する発現ベクター。
(1)薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、
(2)遺伝子発現安定化エレメント、及び
(3)目的タンパク質遺伝子発現カセット
[1−2]
下記(1)〜(3)を少なくとも有する発現ベクター
(1)薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びmRNA不安定化配列を含む発現カセット、
(2)遺伝子発現安定化エレメント、及び
(3)目的タンパク質遺伝子発現カセット
[1−3]
mRNA不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の3’非翻訳領域に存在するATリッチ配列に由来することを特徴とする[1−2]に記載の発現ベクター。
[1−4]
mRNA不安定化配列が、TTATTTA(A/T)(A/T)のモチーフ配列を有することを特徴とする[1−2]に記載の発現ベクター。
[1−5]
モチーフ配列が、2回以上繰り返されていることを特徴とする[1−4]に記載の発現ベクター。
[1−6]
モチーフ配列の繰り返し間に1塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする[1−5]に記載の発現ベクター。
[1−7]
mRNA不安定化配列中に1ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする[1−3]〜[1−6]のいずれかに記載の発現ベクター。
[1−8]
遺伝子発現安定化エレメントが以下のいずれかである、[1−1]〜[1−7]のいずれかに記載の発現ベクター。
(I)配列番号15で示す配列のうち41601〜46746番目までの配列からなるDNA、もしくは41601〜46746番目までの配列の部分配列であって少なくとも41601〜42700番目までの配列を含む塩基配列からなるDNA
(II)上記(I)の配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列からなるDNA
(III)上記(I)または(II)の配列と相補的な塩基配列からなるDNA
[1−9]
遺伝子発現安定化エレメントを2つ以上含む、[1−1]〜[1−8]のいずれかに記載の発現ベクター。
[1−10]
薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子である、[1−1]〜[1−9]のいずれかに記載の発現ベクター。
[1−11]
薬剤選択マーカー遺伝子がピューロマイシン−N−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択される、[1−10]に記載の発現ベクター。
[1−12]
目的タンパク質の遺伝子発現カセットが、所望の目的タンパク質遺伝子を挿入するためのマルチクローニングサイトを備えていることを特徴とする[1−1]〜[1−11]のいずれかに記載の発現ベクター。
[1−13]
目的タンパク質遺伝子が抗体の重鎖及び/または軽鎖ポリペプチド遺伝子である、[1−1]〜[1−12]のいずれかに記載の発現ベクター。
[2−1]
薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びmRNA不安定化配列を含む発現カセット。
[3−1]
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
(a)[1−1]〜[1−13]のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
(b)形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
(c)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程
(d)高発現を示す細胞株を単離する工程。
[3−2]
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
(a)[1−1]〜[1−13]のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
(b)形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養する工程
(c)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程
(d)高発現を示す細胞株を単離する工程。
[3−3]
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
(a)[1−1]〜[1−13]のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
(b)形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、かつ薬剤存在下で培養する工程
(c)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程
(d)高発現を示す細胞株を単離する工程。
[3−4]
[3−1]〜[3−3]のいずれかに記載の方法において、(c)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程、及び(d)高発現を示す細胞株を単離する工程を複数回繰り返す、高生産細胞を作製する方法。
[3−5]
宿主細胞が哺乳類動物細胞由来の細胞である、[3−1]〜[3−4]のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
[3−6]
宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)由来の細胞である、[3−1]〜[3−4]のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
[3−7]
宿主細胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損細胞である、[3−1]〜[3−4]のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
[3−8]
宿主細胞が無血清馴化された細胞である、[3−1]〜[3−4]のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
[4−1]
[3−1]〜[3−7]のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞。
[5−1]
[3−1]〜[3−7]のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いてポリペプチドを生産する方法。
[5−2]
[3−1]〜[3−7]のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いて抗体を生産する方法。
[5−3]
[3−1]〜[3−7]のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いてワクチンを生産する方法。
本発明で使用する発現カセットは、mRNA不安定化配列を有することを除いては、前記薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットと同様の構成を有する。そこで、mRNA不安定化配列について説明する。
ATTTのモチーフ配列の1ないし2回以上の繰り返し。
ATTTAのモチーフ配列の1ないし2回以上の繰り返し。
TATTTATのモチーフ配列の1ないし2回以上の繰り返し。
TTATTTA(T/A)(T/A)のモチーフ配列の1ないし2回以上の繰り返し。
(T/A)はTまたはAのいずれかである。
本発明における「遺伝子発現安定化エレメント」とは、目的タンパク質遺伝子発現カセットが宿主ゲノムに挿入された部位近傍のゲノムの転写の活性化の状況に影響を受けてしまう、という位置効果を解消し、遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸領域を意味する。
(b)配列番号15で示す配列の部分配列からなるDNAであって、配列番号15で示す配列のうち41820番目から41839番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むDNA;
(c)配列番号15で示す配列の部分配列からなるDNAであって、配列番号15で示す配列のうち41821番目から41840番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むDNA;
(d)配列番号15で示す配列の部分配列からなるDNAであって、配列番号15で示す配列のうち45182番目から45200番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むDNA;及び
(e)配列番号15で示す配列の部分配列からなるDNAであって、配列番号15で示す配列のうち91094番目から91113番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むDNA。
本発明における目的タンパク質遺伝子の発現カセットは、プロモーター、遺伝子コード配列、及びターミネーター配列(ポリアデニレーションシグナル)からなる。加えて、イントロンやスペーサー配列、翻訳増強領域を含むこともある。目的タンパク質遺伝子の発現プロモーターとしてはできるだけ転写活性の高いものが好ましく、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、サルウイルス40(SV40)プロモーターなどのウイルスに由来するものや、ヒトやマウス、さらにはCHO由来のElongation Factor 1(EF1α)遺伝子、ユビキチン遺伝子、β−アクチン遺伝子など、非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーター/エンハンサーのハイブリッド、例えばCAGプロモーターなどが挙げられる。
本発明において、発現ベクターとは、遺伝子工学に利用されるベクターである。発現ベクターは、プラスミドベクターであることができる。しかし、これに限らず、例えば、ウイルスベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)及び他の非プラスミドベクターも使用できる。
(a)薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
(b)形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
(c)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程
(d)高発現を示す細胞株を単離する工程。
(a)薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
(b)形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養する工程
(c)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程
(d)高発現を示す細胞株を単離する工程。
(a)薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
(b)形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、かつ薬剤存在下で培養する工程
(d)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程
(e)高発現を示す細胞株を単離する工程。
(a)薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びmRNA不安定化配列を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
(b)形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
(c)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程
(d)高発現を示す細胞株を単離する工程。
(b)形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養する工程
(c)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程
(d)高発現を示す細胞株を単離する工程。
(b)形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、かつ薬剤存在下で培養する工程
(d)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程
(e)高発現を示す細胞株を単離する工程。
各種プラスミドベクターの構築
実施例1−1
mRNA不安定化配列を有するベクター
(1)pPUR・N4の構築
図1に示すスキームに従って、pPUR(クロンテック社製)のPuromycin耐性遺伝子のコード配列の3‘末端に、配列番号1、2のプライマーとKOD −Plus− Mutagenesis Kit(東洋紡績社製)を用いたInverse PCR法によって、ARE配列モチーフTTATTTATTの4回繰り返し配列(以下、「N4」と言う。)を挿入してpPUR・N4を構築した。
次に、目的遺伝子発現カセットのプロモーターをEF1αプロモーターに置換したプラスミドを構築した。本実験では、図2に示すスキームに従って構築されたプラスミドpEF1α−KOD3G8HC−RE2を利用した。即ち、まず、CMVプロモーターをEF−1αプロモーターに置換したpCI−neoプラスミド(プロメガ社製)の制限酵素XbaI−NotIサイトに抗KOD抗体の重鎖を挿入したプラスミドのpEF1α−KOD3G8HCを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号3、4のプライマーを使って発現カセット上流に制限酵素SalIおよびNheIサイトを付加したpEF1α−KOD3G8HC−REを構築した。更に本プラスミドを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号5、6のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素BsiWIおよびXhoIサイトを付加して構築されたプラスミドがpEF1α−KOD3G8HC−RE2である。
mRNA不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントとを有するベクター
(1)pEF1α−SNAP26m−Pur・N4−1.1k/1.1kの構築
本実験では図4に記載のpEF1α−KOD3G8HC−1.1k/1.1kを利用した。即ち、まず、実施例1−1の途中で構築されたpEF1α−KOD3G8HC−RE2の発現カセット上流の制限酵素NheI、BglIIサイトに、配列番号13、14のプライマーセットを使ってPCRで増幅した被検配列CHO5Δ3−3(配列番号15の41601番目〜42700番目からなる塩基配列。以下、コンストラクト中では1.1kと表記)を挿入して、プラスミドpEF1α−KOD3G8HC−1.1kを構築した。更にプラスミドpEF1α−KOD3G8HC−1.1kの発現カセット下流の制限酵素BsiWI、XhoIサイトに配列番号16、17のプライマーセットを使ってPCRで増幅した被検配列CHO5Δ3−3を挿入して構築されたプラスミドがpEF1α−KOD3G8HC−1.1k/1.1kである。
発現ベクターにおける各配列要素から制限酵素認識配列を削除したベクター
(1)遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3からの制限酵素認識配列の削除
続いて、遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3から制限酵素認識配列を削除した。まず、実施例1−2に記載のpEF1α−KOD3G8HC−1.1kを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号22、23のプライマーを使ってCHO5Δ3−3内に存在する制限酵素SacIサイトを削除したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔREを構築した。次に、pEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔREを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号24、25のプライマーを使ってCHO5Δ3−3内に存在する制限酵素SmaIサイトを削除したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE2を構築した。更に、pEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE2を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号26、27のプライマーを使ってCHO5Δ3−3内に存在する制限酵素BamHIサイトを削除したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE3を構築した。最後に、pEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE3を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号28、29のプライマーを使ってCHO5Δ3−3内に存在する制限酵素HindIIIサイトを削除したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE4を構築した。
マルチクローニングサイトと、上記実施例1−3(1)で作成した4箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を発現カセット上流および下流に配する図6に記載のpEHXを構築した。具体的には、実施例1−2に記載のpEF1α−SNAP26m−Pur2・N4を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号30、31のプライマーを使ってSV40 promoter下流に存在する制限酵素HindIIIサイトを削除したpEF1α−SNAP26m−Pur2・N4−ΔHを構築した。続いて、pEF1α−SNAP26m−Pur2・N4−ΔHを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号32、33のプライマーを使ってPuromycin耐性遺伝子内に存在する制限酵素SalIサイトを削除したpEF1α−SNAP26m−Pur3・N4−ΔHを構築した。更に、pEF1α−SNAP26m−Pur3・N4−ΔHを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号34、35のプライマーを使ってPuromycin耐性遺伝子内に存在する制限酵素SmaIサイトを削除したpEF1α−SNAP26m−Pur4・N4−ΔHを構築した。その後、pEF1α−SNAP26m−Pur4・N4−ΔHを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号36、37のプライマーを使ってf1 oriを削除したpEF1α−SNAP26m−Pur4・N4−ΔH−Δf1を構築した。次に、pEF1α−SNAP26m−Pur4・N4−ΔH−Δf1を鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号38、39のプライマーを使って制限酵素NheI、EcoRI、SpeIサイトを挿入したpEF1α−SNAP26m−Pur4・N4−ΔH−Δf1−REを構築した。続いて、pEF1α−SNAP26m−Pur4・N4−ΔH−Δf1−REを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号40、41のプライマーを使って制限酵素HindIII、BsiWI、XbaI、BclIサイトを挿入したpEF1α−MCSpre−Pur4・N4−ΔH−Δf1−REを構築した。そして、pEF1α−MCSpre−Pur4・N4−ΔH−Δf1−REのHindIII、XbaIサイトに、配列番号42、43のプライマーを混合後、95度から60度まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したDNA断片を挿入し、pEF1α−MCS−Pur4・N4−ΔH−Δf1−REを構築した。次に、pEF1α−MCS−Pur4・N4−ΔH−Δf1−REのNheI、EcoRIサイトに、配列番号44、45のプライマーセットを使ってpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE4を鋳型にPCRで増幅した、4箇所の制限酵素認識配列を削除したCHO5Δ3−3を挿入し、pEF1α−MCS−Pur4・N4−1.1kを構築した。更に、pEF1α−MCS−Pur4・N4−1.1kのBamHI、XhoIサイトに、配列番号16、46のプライマーセットを使ってpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE4を鋳型にPCRで増幅した、4箇所の制限酵素認識配列を削除したCHO5Δ3−3を挿入し、pEHXを構築した。
抗体遺伝子を挿入した、各配列要素から制限酵素認識配列を削除したベクター
マルチクローニングサイトを含む図7に記載のpELXを構築した。
実施例1−4(1)で構築したpELXの発現カセット下流に、4箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントCHO5Δ3−3を配した、図8に記載のpELX2を構築した。具体的には、実施例1−4(1)で構築したpELXを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号51、53のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素NheIサイトを追加したpELX−Nを構築した。そして、pELX−NのNheI、EcoRIサイトに、配列番号13、54のプライマーセットを使って、実施例1−3で構築したpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE4を鋳型にPCRで増幅した、4箇所の制限酵素認識配列を削除したCHO5Δ3−3を挿入し、pELX2を構築した。
pELX2の制限酵素MluI、NotIサイトに、抗KOD抗体の軽鎖遺伝子を挿入しpEL2(KOD3G8)を構築した。具体的には、実施例1−4(1)に記載のpEF1α−KOD3G8LCから配列番号20,21のプライマーを用いてPCRで増幅し、制限酵素MluI、NotIで処理して調製した抗KOD抗体の軽鎖遺伝子を、pELX2の制限酵素MluI、NotIサイトに導入して、pEL2(KOD3G8)を構築した。
抗KOD抗体発現系における、ピューロマイシン耐性遺伝子とdhfr遺伝子の融合タンパク質遺伝子とmRNA不安定化配列の組み合わせ効果の検討
続いて、dhfr遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子とdhfr遺伝子の融合タンパク質遺伝子、および、ピューロマイシン耐性遺伝子とdhfr遺伝子の融合タンパク質遺伝子の下流にmRNA不安定化配列を付加したもの、それぞれの効果を比較検討するため、抗KOD抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にMTXで選択して得られたポリクローンの細胞の生産性を評価した。
実施例2−1
dhfr遺伝子を有する発現ベクターの構築
(1)pEHX−dhfr・N4の構築
実施例1−3で構築したpEHXへdhfr遺伝子の発現カセットを挿入した、図9に記載のpEHX−dhfr・N4を構築した。具体的には、pEHXのBamHI、XhoIサイトに、配列番号55、56のプライマーセットを使ってpEHXを鋳型にPCRで増幅し、制限酵素BglII、XhoIで処理して調製したSV40 promoterを挿入し、pEHX−pを構築した。続いて、pEHX−pのBamHI、XhoIサイトに、配列番号57、58のプライマーセットを使って実施例1−3に記載のpEF1α−KOD3G8HC−1.1k−ΔRE4を鋳型にPCRで増幅し、制限酵素BamHI、SalIで処理して調製した、4箇所の制限酵素認識配列を削除したCHO5Δ3−3を挿入し、pEHX−p2を構築した。次に、pEHX−p2のBamHI、XhoIサイトに、配列番号59、60のプライマーセットを使ってpEHXを鋳型にPCRで増幅し、制限酵素BamHI、SalIで処理して調製したSV40 pAを挿入し、pEHX−p3を構築した。一方、dhfr遺伝子の3’末端にタンパク質分解促進配列のPEST配列を付加した配列番号61のDNAを人工合成して、プラスミドベクターpCR2.1−TOPO(インビトロジェン社製)にTOPO TAクローニングし、pCR2.1−dhfr・PESTを構築した。続いて、pCR2.1−dhfr・PESTを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号62、63のプライマーを使って、dhfr遺伝子の3’末端からPEST配列を削除しN4配列を付加したpCR2.1−dhfr・N4を構築した。そして、pEHX−p3のBamHI、XhoIサイトに、配列番号64、65のプライマーセットを使ってpCR2.1−dhfr・N4を鋳型にPCRで増幅し、制限酵素BglII、SalIで処理して調製したDNA断片を挿入し、pEHX−dhfr・N4を構築した。
図10に示すスキームに従って、実施例1−3で構築したpEHX中の、N4配列を下流に付加したピューロマイシン耐性遺伝子の代わりに、ピューロマイシン耐性遺伝子とdhfr遺伝子の融合タンパク質遺伝子、あるいは、N4配列を下流に付加したピューロマイシン耐性遺伝子とdhfr遺伝子の融合タンパク質遺伝子を挿入した、pEHX−Puro・dhfr、および、pEHX−Puro・dhfr・N4を構築した。具体的には、まず、配列番号36、66のプライマーセットを使ってpEHXを鋳型にPCRで増幅したSV40 promoter、ピューロマイシン耐性遺伝子から成るDNA断片と、配列番号67、68、あるいは、配列番号67、69のプライマーセットを使ってpCR2.1−dhfr・N4を鋳型にPCRで増幅したdhfr遺伝子、あるいは、dhfr遺伝子、N4配列から成るDNA断片を、overlap−extension PCRによりアセンブリし、配列番号36、68、あるいは、配列番号36、69のプライマーセットを使って、SV40 promoter、ピューロマイシン耐性遺伝子、dhfr遺伝子から成るDNA断片、あるいは、SV40 promoter、ピューロマイシン耐性遺伝子、dhfr遺伝子、N4配列から成るDNA断片を調製した。これらのDNA断片をKpnI、Csp45Iで消化し、pEHXのKpnI、Csp45Iサイトに挿入し、pEHX−Puro・dhfr、および、pEHX−Puro・dhfr・N4を構築した。
続いて、抗KOD抗体発現系で遺伝子増幅の効果を確認すべく、pELH2−dhfr・N4(KOD3G8)、pELH2−Puro・dhfr(KOD3G8)、および、pELH2−Puro・dhfr・N4(KOD3G8)を構築した。
抗KOD抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
抗KOD抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞の生産性評価
抗KOD抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にMTXで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
dhfr遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の配置順序の検討
続いて、dhfr遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の配置順序を検討するため、上流側にdhfr遺伝子を配置し下流側にピューロマイシン耐性遺伝子を配置した融合タンパク質遺伝子を有する発現ベクターを構築し、抗KOD抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にMTXで選択して得られたポリクローンの細胞の生産性を評価した。
実施例3−1
dhfr遺伝子を有する発現ベクターの構築
(1)dhfr遺伝子(上流)とピューロマイシン耐性遺伝子(下流)の融合タンパク質遺伝子を有する発現ベクター:pEHX−dhfr・Puro・N4の構築
図16に示すスキームに従って、実施例1−3で構築したpEHX中の、N4配列を下流に付加したピューロマイシン耐性遺伝子の代わりに、N4配列を下流に付加したdhfr遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の融合タンパク質遺伝子を挿入したpEHX−dhfr・Puro・N4を構築した。具体的には、まず、配列番号11、70のプライマーセットを使ってpEHX−dhfr・N4を鋳型にPCRで増幅したSV40 promoter、dhfr遺伝子から成るDNA断片と、配列番号69、71のプライマーセットを使ってpEHXを鋳型にPCRで増幅したN4配列を下流に付加したピューロマイシン耐性遺伝子を、overlap−extension PCRによりアセンブリ、配列番号11、69のプライマーセットを使って、SV40 promoter、dhfr遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、N4配列から成るDNA断片を調製した。このDNA断片をKpnI、Csp45Iで消化し、pEHXのKpnI、Csp45Iサイトに挿入し、pEHX−dhfr・Puro・N4を構築した。
続いて、抗KOD抗体発現系で遺伝子増幅の効果を確認すべく、pELH2−dhfr・Puro・N4(KOD3G8)を構築した。
抗KOD抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
dhfr遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の上流に配置した効果を抗KOD抗体発現系で検討した。dhfr遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の上流に配した抗KOD抗体発現用シングルベクターとして、実施例3−1で構築したpELH2−dhfr・Puro・N4(KOD3G8)を、dhfr遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の下流に配した抗KOD抗体発現用シングルベクターとして、実施例2−1で構築したpELH2−Puro・dhfr・N4(KOD3G8)を用いた。制限酵素AhdIでリニアライズしたプラスミド1.6μgを、実施例2−2に記載の方法で準備しておいたCHO/dhfr−細胞にトランスフェクションし、24時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、7.5μg/ml Puromycin、10%牛胎児血清、4mM Glutamineを添加したIscove’s Modified Dulbecco’s Medium中で2週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散し、1ウェル当たり1.84×105細胞を6ウェルプレートに播き込んだ。3日間培養後、培養上清を回収し、ピューロマイシンで選択して取得したポリクローンの細胞でのKOD3G8抗体の生産量を前記実施例2−2と同様の方法でELISAにて測定した。
抗KOD抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞の生産性評価
抗KOD抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にMTXで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
無血清馴化CHO/dhfr−細胞を用いた、抗KOD抗体発現系における、dhfr遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の融合タンパク質遺伝子とmRNA不安定化配列の組み合わせ効果の検討
次に、あらかじめ無血清馴化したCHO/dhfr−細胞を用いて、下流にmRNA不安定化配列を付加したdhfr遺伝子(上流)とピューロマイシン耐性遺伝子(下流)の融合タンパク質遺伝子の効果を検討した。
抗KOD抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞の生産性評価
抗KOD抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にMTXで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
Claims (26)
- 下記(1)〜(3)を少なくとも有する発現ベクター。
(1)薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、
(2)遺伝子発現安定化エレメント、及び
(3)目的タンパク質遺伝子発現カセット - 下記(1)〜(3)を少なくとも有する発現ベクター
(1)薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びmRNA不安定化配列を含む発現カセット、
(2)遺伝子発現安定化エレメント、及び
(3)目的タンパク質遺伝子発現カセット - mRNA不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の3’非翻訳領域に存在するATリッチ配列に由来することを特徴とする請求項2に記載の発現ベクター。
- mRNA不安定化配列が、TTATTTA(A/T)(A/T)のモチーフ配列を有することを特徴とする請求項2に記載の発現ベクター。
- モチーフ配列が、2回以上繰り返されていることを特徴とする請求項4に記載の発現ベクター。
- モチーフ配列の繰り返し間に1塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする請求項5に記載の発現ベクター。
- mRNA不安定化配列中に1ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする請求項3〜6のいずれかに記載の発現ベクター。
- 遺伝子発現安定化エレメントが以下のいずれかである、請求項1〜7のいずれかに記載の発現ベクター。
(I)配列番号15で示す配列のうち41601〜46746番目までの配列からなるDNA、もしくは41601〜46746番目までの配列の部分配列であって少なくとも41601〜42700番目までの配列を含む塩基配列からなるDNA
(II)上記(I)の配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列からなるDNA
(III)上記(I)または(II)の配列と相補的な塩基配列からなるDNA - 遺伝子発現安定化エレメントを2つ以上含む、請求項1〜8のいずれかに記載の発現ベクター。
- 薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子である、請求項1〜9のいずれかに記載の発現ベクター。
- 薬剤選択マーカー遺伝子がピューロマイシン−N−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項10に記載の発現ベクター。
- 目的タンパク質の遺伝子発現カセットが、所望の目的タンパク質遺伝子を挿入するためのマルチクローニングサイトを備えていることを特徴とする請求項1〜11のいずれかに記載の発現ベクター。
- 目的タンパク質遺伝子が抗体の重鎖及び/または軽鎖ポリペプチド遺伝子である、請求項1〜12のいずれかに記載の発現ベクター。
- 薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びmRNA不安定化配列を含む発現カセット。
- 以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
(a)請求項1〜13のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
(b)形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
(c)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程
(d)高発現を示す細胞株を単離する工程。 - 以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
(a)請求項1〜13のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
(b)形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養する工程
(c)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程
(d)高発現を示す細胞株を単離する工程。 - 以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
(a)請求項1〜13のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
(b)形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、かつ薬剤存在下で培養する工程
(c)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程
(d)高発現を示す細胞株を単離する工程。 - 請求項15〜17のいずれかに記載の方法において、(c)形質転換された細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で培養する工程、及び(d)高発現を示す細胞株を単離する工程を複数回繰り返す、高生産細胞を作製する方法。
- 宿主細胞が哺乳類動物細胞由来の細胞である、請求項15〜18のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
- 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)由来の細胞である、請求項15〜18のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
- 宿主細胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損細胞である、請求項15〜18のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
- 宿主細胞が無血清馴化された細胞である、請求項15〜18のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
- 請求項15〜22のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞。
- 請求項15〜22のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いてポリペプチドを生産する方法。
- 請求項15〜22のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いて抗体を生産する方法。
- 請求項15〜22のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いてワクチンを生産する方法。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010023787A1 (ja) * | 2008-08-29 | 2010-03-04 | 東洋紡績株式会社 | 遺伝子発現安定化エレメント |
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JP2010528641A (ja) * | 2007-06-07 | 2010-08-26 | メルク セローノ ソシエテ アノニム | Puro−dhfr四機能性マーカー、及びタンパク質の生産におけるその使用 |
WO2010023787A1 (ja) * | 2008-08-29 | 2010-03-04 | 東洋紡績株式会社 | 遺伝子発現安定化エレメント |
JP4491808B1 (ja) * | 2009-06-05 | 2010-06-30 | 東洋紡績株式会社 | 高発現細胞の効率的な選別に有用な薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット |
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Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6014040002; Protein Expression and Purification Vol.8, 1996, pp.358-364 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113025651A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-06-25 | 重庆医科大学 | 靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及结构类似物新应用 |
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