JP2010528641A - Ｐｕｒｏ−ｄｈｆｒ四機能性マーカー、及びタンパク質の生産におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
本願発明は、タンパク質の工業生産に関する。より詳しく述べると、本発明は、res-DHFR代用マーカーに関し、それは、DHFRと、毒性化合物に対する耐性を付与するか又は代謝的優位性を付与するタンパク質との間の融合物に相当する。本発明は、注目のタンパク質の高発現について細胞をスクリーニングするためのres-DHFRの使用にさらに関する。本発明は、Puro-DHFR代用マーカーによって例証され、そのマーカーは、ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼとジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の間の融合物に相当する。
Description
本願発明は、タンパク質の工業生産に関する。より詳しく述べると、本発明は、res-DHFR代用マーカーに関し、それは、DHFRと、毒性化合物に対する耐性を付与するか又は代謝的優位性を付与するタンパク質との間の融合物に相当する。本発明は、注目のタンパク質の高発現について細胞をスクリーニングするためのres-DHFRの使用にさらに関する。本発明は、Puro-DHFR代用マーカーによって例証され、そのマーカーは、ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼとジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の間の融合物に相当する。
動物宿主細胞内への異種遺伝子の導入と、加えられた遺伝子の発現についてのスクリーニングは、長く、そして、複雑な工程である。通常、多くのハードル：（i）大きな発現ベクターの構造；（ii）最終的に、選択圧の不存在下での、安定した長期間発現を有するクローンのトランスフェクションと選択；及び（iii）注目の異種タンパク質の高発現率についてのスクリーニング、を克服しなければならない。
1．異種遺伝子を発現するクローンの選択
注目の遺伝子を組み込んだクローンの選択は、選択圧に対する耐性を付与する選択マーカーを使用することで実施される。選択マーカーの大部分は、例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ピューロマイシン、ゼオシン、又はブレオマイシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する。
注目の遺伝子を組み込んだクローンの選択は、選択圧に対する耐性を付与する選択マーカーを使用することで実施される。選択マーカーの大部分は、例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、ピューロマイシン、ゼオシン、又はブレオマイシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する。
発現ベクターから注目の遺伝子を発現する細胞クローンを作製するとき、宿主細胞は、通常、同じベクター上に注目のタンパク質と選択マーカーの両方をコードするプラスミドDNAベクターでトランスフェクションされる。かなり多くの場合、プラスミドの容量が限定されるので、選択マーカーは第2のプラスミドから発現されなければならず、その第2のプラスミドが注目の遺伝子を含んでなるプラスミドと同時トランスフェクションされる。
安定なトランスフェクションは、宿主細胞のゲノム内への発現ベクターのランダムな組み込みにつながる。例えば、培地に抗生物質を投与することによる、選択圧の使用は、それぞれの抗生物質又は選択圧に対する耐性を提供する選択マーカーを含むベクターが組み込まれなかったすべての細胞を排除するだろう。この選択マーカーが注目の遺伝子と同じベクター上に存在する場合、又はこの選択マーカーが第2のベクター上に存在し、且つ、注目の遺伝子を含んでなるベクターが同時組み込みされた場合、細胞は、選択マーカーと注目の遺伝子の両方を発現するだろう。しかしながら、注目の遺伝子の発現レベルが、組み込みの場所によって大きく変化することが頻繁に観察される。
さらに、選択圧を取り除くとき、かなり多くの場合、発現が非常に不安定になるか、又は消滅さえするようになる。よって、少数の初期トランスフェクタントだけが、高くて安定した長期発現を提供している、そして、候補物の大集団の中でこれらのクローンを特定するのは、時間がかかる。通常、高発現性候補物は、単離され、その後、選択圧の不存在下で培養される。これらの条件下、初期に選択された候補物の大部分が、選択圧の除去によりそれらの注目の遺伝子の発現の損失のため排除される。よって、選択圧の不存在下、安定したトランスフェクションについての初期選択期間と、そのとき初めての、注目の遺伝子の発現についてのスクリーンに続いて、候補物を培養するのが有利であるだろう。
2．高発現性クローンについてのスクリーニング
注目のタンパク質の高発現性クローンについてのスクリーニングは、多量のタンパク質の存在を直接的に明らかにする方法によって多くの場合実施される。通常、ELISA又は免疫組織化学的染色などの免疫学的方法が、細胞内又は細胞培養上清中の生成物を検出するために適用される。これらの方法は、退屈で、高価で、時間がかかっていて、そして、多くの場合高スループット・スクリーニング（HTS）に適していない。加えて、発現タンパク質に反応する抗体が入手可能でなければならない。
注目のタンパク質の高発現性クローンについてのスクリーニングは、多量のタンパク質の存在を直接的に明らかにする方法によって多くの場合実施される。通常、ELISA又は免疫組織化学的染色などの免疫学的方法が、細胞内又は細胞培養上清中の生成物を検出するために適用される。これらの方法は、退屈で、高価で、時間がかかっていて、そして、多くの場合高スループット・スクリーニング（HTS）に適していない。加えて、発現タンパク質に反応する抗体が入手可能でなければならない。
蛍光励起セルソーター（FACS）によってタンパク質量を定量化する試みもまた行われたが、特に分泌タンパク質の場合に限定された成功しか得られなかった（Borth et al., 2000）。
高発現率の注目のタンパク質のスクリーニングのための1つのアプローチは、注目の遺伝子と同じベクターから発現される容易に計測可能な代用マーカー使用だろう（Chesnut et al., 1996）。計測可能な代用マーカーの使用の基礎となる考えは、同じベクター上の2つの遺伝子の物理的つながりに起因する、注目の遺伝子の発現と代用マーカー遺伝子との間に相関関係があるということである。
多数の容易に計測可能なマーカーが、当該技術分野で入手可能である。それらは、通常、例えば、β-グルクロニダーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ノパリン・シンターゼ、β-ガラクトシダーゼ、分泌型アルカリ・ホスファターゼ（SEAP）、及びDHFRなどの発色性又は発光性の基質に作用する酵素に相当する。緑色蛍光タンパク質（GFP）もまた、FACSの計測可能なマーカーとして使用できる。これらのすべてのタンパク質の活性が、HTSに使用できる標準的なアッセイで計測され得る。
このアプローチの欠点は、代用マーカー遺伝子のためのさらに別の発現カセットの使用である。これは、発現ベクターを、少なくとも3つのタンパク質（すなわち、注目の遺伝子、選択マーカー、及び代用マーカー）のためのプロモーター、cDNA、及びポリアデニル化シグナルを含んでなる発現ユニットを受け入れた、かなりかさばった状態にする。多鎖型タンパク質に関して、状況はよりいっそう複雑になる。あるいは、それぞれ、注目のタンパク質、選択マーカー、及び代用マーカーをコードする3つの遺伝子を発現する個々のプラスミド・ベクターを、同時トランスフェクションしてもよい。しかしながら、前記ベクターは、異なった遺伝子座に組み込まれるか、又はいろいろな、且つ、非相関性の発現を示す可能性が高い。
前記の限界を克服するための有望なアプローチは、選択マーカーと計測可能なマーカーの機能的特性を組み合わせたキメラ・マーカーの使用にある。
こうした二機能性マーカーは、例えば、Bennett et al.（1998）、Imhof及びChatellard（2006）、並びにDupraz及びKobr（2007）によって説明された。Bennettら（1998）は、GFP-ZeoRマーカーを開示し、そのマーカーは、ゼオシン抗生物質に対する耐性を付与し、且つ、緑色蛍光タンパク質（GFP）と、ゼオシンに対する耐性を付与するタンパク質との間の融合タンパク質に相当する。Imhof及びChatellard（2006）は、Lupacマーカーを開示し、そのマーカーは、ホタル・ルシフェラーゼ・タンパク質と、ピューロマイシンに対する耐性を付与するタンパク質との間の融合物に相当する。Dupraz及びKobr（2007）は、PuroLTマーカーを開示し、そのマーカーは、Griffinら（1988）によって記載された合成ペプチドと、ピューロマイシンに対する耐性を与えるタンパク質との間の融合タンパク質に相当する。
蛍光TMPが蛍光MTXの代替手段であることを示した論文の中で、Millerら（2005）は、ピューロマイシンに対する耐性を付与するタンパク質と、細菌起源のDHFRの間の融合タンパク質を開示している。DHFRは、蛍光MTX又は蛍光TMPに結合することによって検出できる計測可能なマーカーとして使用される。この論文は、siRNA遺伝子抑制の分野での融合タンパク質の使用を想定している。
したがって、組み換えタンパク質を高レベルで発現するクローンの選択のために利用可能なすべてのマーカーが、二機能性マーカーに相当し、そのマーカーは、ただ一つの毒性化合物に対する耐性を付与する。
二機能性マーカーに加えて、高産生体クローンを産出するのに使用されるベクターは、選択圧下にあるとき、コピー数の増大に通じる増幅可能な遺伝子を通常含んでなる。増幅可能な遺伝子に隣接して配置された注目の遺伝子のコピー数もまた増強され、よって、注目のタンパク質を高レベルで発現するクローンの樹立に通じるだろう（Kaufman et al., 1985；Kaufman et al., 1986；Kirn et al., 2001；Omasa, 2002）。一般的に使用される増幅可能な遺伝子には、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、グルタミン・シンテターゼ（GS）、多剤耐性遺伝子（MDR）、オルニチン・デカルボキシラーゼ（ODC）、アデノシン・デアミナーゼ（ADA）、及びN-（ホスホンアセチル）-L-アスパラギン酸耐性（CAD）が含まれる。
2以上の毒性化合物に対する耐性を付与し、また、遺伝子増幅も可能にする、新規で強力なキメラ代用マーカーの発見は、治療用タンパク質の工業生産の分野で非常に役立つだろう。
本発明は、新規の四機能性マーカー、Puro-DHFRの構築と特徴づけから生じる。Puro-DHFRは、DHFRと、ピューロマイシンに対する耐性を付与するタンパク質であるピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ（pac）との間の融合タンパク質に相当する。Puro-DHFRが、pacとDHFRの両方の機能的特性を兼ね備えていることが実証された。より詳しく述べると、Puro-DHFRは、以下の：（i）ピューロマイシンに対する耐性について細胞を選択すること；（ii）DHFRに対する耐性について細胞を選択すること；（iii）遺伝子増幅をおこなうこと；及び（iv）蛍光強度を通して細胞を選別すること、を可能にする四機能性マーカーである。治療用タンパク質の高発現性クローンの分離のためのPuro-DHFRの有用性が、さらに実証された。
そのため、本発明の最初の側面は、注目のタンパク質の発現についての細胞のスクリーニング方法に関し、上述の方法は：
a）細胞を、（i）毒性化合物に対する耐性を付与するか又は代謝的優位性を付与するフラグメントと融合させたジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の機能的なフラグメントを含んでなるres-DHFRキメラ・タンパク質と、（ii）注目のタンパク質をコードする発現ベクターによってトランスフェクションするステップ；
b）上述の毒性化合物に耐性であるか、又は上述の代謝的優位性を獲得した細胞を選択するステップ；及び
c）DHFRに結合する蛍光化合物を用いて、ステップ（ii）で選択された細胞の蛍光発光をアッセイするステップ、
を含んでなり、ここで、毒性化合物に対する耐性を付与するか、又は代謝的優位性を付与する上述のタンパク質はDHFRでない。
a）細胞を、（i）毒性化合物に対する耐性を付与するか又は代謝的優位性を付与するフラグメントと融合させたジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の機能的なフラグメントを含んでなるres-DHFRキメラ・タンパク質と、（ii）注目のタンパク質をコードする発現ベクターによってトランスフェクションするステップ；
b）上述の毒性化合物に耐性であるか、又は上述の代謝的優位性を獲得した細胞を選択するステップ；及び
c）DHFRに結合する蛍光化合物を用いて、ステップ（ii）で選択された細胞の蛍光発光をアッセイするステップ、
を含んでなり、ここで、毒性化合物に対する耐性を付与するか、又は代謝的優位性を付与する上述のタンパク質はDHFRでない。
本発明の第2の側面は、注目のタンパク質を発現する細胞株の獲得方法に関し、上述の方法は：
a）本発明の方法による細胞をスクリーニングするステップ；及び
b）上述の細胞から細胞株を樹立するステップ、
を含んでなる。
a）本発明の方法による細胞をスクリーニングするステップ；及び
b）上述の細胞から細胞株を樹立するステップ、
を含んでなる。
本発明の第3の側面は、注目のタンパク質の生産方法に関し、上述の方法は：
a）上述の注目のタンパク質の発現を可能にする条件下、先の方法に従って獲得した細胞株を培養するステップ；及び
b）上述の注目のタンパク質を回収するステップ、
を含んでなる。
a）上述の注目のタンパク質の発現を可能にする条件下、先の方法に従って獲得した細胞株を培養するステップ；及び
b）上述の注目のタンパク質を回収するステップ、
を含んでなる。
本発明の第4の側面は、毒性化合物に対する耐性を付与するか又は代謝的優位性を付与するフラグメントと融合させた、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の機能的なフラグメントを含んでなるres-DHFRポリペプチドに関し、ここで、毒性化合物に対する耐性を付与するか又は代謝的優位性を付与する上述のタンパク質はDHFRでない。
本発明の第5の側面は、本発明によるres-DHFRポリペプチドをコードする核酸に関する。
本発明の第6の側面は、本発明による核酸を含んでなるres-DHFRベクターに関する。
本発明の第7の側面は、本発明による核酸を含んでなるres-DHFR細胞に関する。
本発明のさらなる側面は、注目のタンパク質を生産するための本発明のres-DHFR細胞の使用、注目のタンパク質の発現について細胞をスクリーニングするためのres-DHFRポリペプチドの使用、注目のタンパク質の発現について細胞をスクリーニングするためのres-DHFR核酸の使用、及び注目のタンパク質の発現について細胞をスクリーニングするためのres-DHFRベクターの使用に関する。
本発明の配列の簡単な説明
配列番号1及び2は、それぞれ、本発明によるPuro-DHFRマーカーの核酸及びポリペプチド配列に相当する。
配列番号3及び4は、それぞれ、ストレプトマイセス・アルボニガー（Streptomyces alboniger）ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ（pac）の核酸及びポリペプチド配列に相当する。
配列番号1及び2は、それぞれ、本発明によるPuro-DHFRマーカーの核酸及びポリペプチド配列に相当する。
配列番号3及び4は、それぞれ、ストレプトマイセス・アルボニガー（Streptomyces alboniger）ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ（pac）の核酸及びポリペプチド配列に相当する。
配列番号5及び6は、それぞれ、マウスDHFRの核酸及びポリペプチド配列に相当する。
配列番号7〜10は、本発明に従ってPuro-DHFRマーカーを構築するときに使用したプライマーに相当する（実施例1）。
配列番号11〜16は、QPCRによって遺伝子コピー数を検出するときに使用したオリゴヌクレオチドに相当する（実施例3）。
配列番号7〜10は、本発明に従ってPuro-DHFRマーカーを構築するときに使用したプライマーに相当する（実施例1）。
配列番号11〜16は、QPCRによって遺伝子コピー数を検出するときに使用したオリゴヌクレオチドに相当する（実施例3）。
発明の詳細な説明
本発明は、res-DHFRとも呼ばれる新規な四機能性キメラ・マーカーの構築と特徴づけから生じる。より詳しく述べると、本発明は、Puro-DHFRとも呼ばれるres-DHFRポリペプチドを開示するが、それは、DHFRと、ピューロマイシンに対する耐性を付与するタンパク質であるピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ（pac）との間の融合タンパク質に相当する。
本発明は、res-DHFRとも呼ばれる新規な四機能性キメラ・マーカーの構築と特徴づけから生じる。より詳しく述べると、本発明は、Puro-DHFRとも呼ばれるres-DHFRポリペプチドを開示するが、それは、DHFRと、ピューロマイシンに対する耐性を付与するタンパク質であるピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ（pac）との間の融合タンパク質に相当する。
Puro-DHFRは、DHFRとpacの機能的特性を兼ね備えた四機能性マーカーであることが実証された（実施例2）。従って、Puro-DHFRマーカーは：
‐ピューロマイシン毒性化合物と組み合わせて選択マーカーとして；
‐MTX毒性化合物と組み合わせて選択マーカーとして；
‐増幅可能な遺伝子として；そして
‐顕微鏡とFACSの両方によって検出され得る容易に計測可能な代用として、
使用され得る。
‐ピューロマイシン毒性化合物と組み合わせて選択マーカーとして；
‐MTX毒性化合物と組み合わせて選択マーカーとして；
‐増幅可能な遺伝子として；そして
‐顕微鏡とFACSの両方によって検出され得る容易に計測可能な代用として、
使用され得る。
注目のタンパク質のための高発現性クローンの分離に関するPuro-DHFRの有用性が、さらに実証された。実施例3では、同じプロモーターから発現され、且つ、IRESによって分離されたPuro-DHFRと注目の遺伝子を含んでなるベクターが構築された。Puro-DHFR発現レベルと注目の遺伝子の発現レベルの間に非常に良好な正の相関があることが示された。
従って、本発明は、安定なトランスフェクションの選択性を提供するため、注目の遺伝子の遺伝子増幅を誘発するために使用され得る、そして、注目の遺伝子の高発現についての候補クローンのスクリーニングのための代用マーカーとして機能する強力なマーカーを提供する。ビシストロン性立体配置で注目のタンパク質に連結されたres-DHFRを使用することは、注目の遺伝子の発現レベルが直接計測されるときと同じく、高発現性クローンを選択する機会を保持することを可能にする。そのうえ、res-DHFRを使用することは、（i）標準化された、生成物に依存しない、且つ、簡単な分析が実施され；そして、（ii）FACSを使用することで高発現体が選択されるので、時間、コスト、及び資源の削減を可能にする。
1．本発明のポリペプチド
本発明によるポリペプチドは、毒性化合物に対する耐性又は代謝的優位性のどちらかを付与するフラグメントに融合したジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の機能的なフラグメントを含んでなるキメラ・タンパク質であり、ここで、上記の毒性化合物に対する耐性又は代謝的優位性を付与するフラグメントは、DHFR又はその断片でない。そのようなキメラ・タンパク質は、本明細書中で、さらに、「本発明によるポリペプチド」又は「res-DHFR」とも呼ばれるだろう。
本発明によるポリペプチドは、毒性化合物に対する耐性又は代謝的優位性のどちらかを付与するフラグメントに融合したジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の機能的なフラグメントを含んでなるキメラ・タンパク質であり、ここで、上記の毒性化合物に対する耐性又は代謝的優位性を付与するフラグメントは、DHFR又はその断片でない。そのようなキメラ・タンパク質は、本明細書中で、さらに、「本発明によるポリペプチド」又は「res-DHFR」とも呼ばれるだろう。
毒性化合物に対する耐性を付与する断片は、ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ（毒性化合物ピューロマイシンと組み合わせて使用される）、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼII型（毒性化合物ネオマイシンと組み合わせて使用される）、カナマイシン・ホスホトランスフェラーゼII型（毒性化合物カナマイシンと組み合わせて使用される）、ネオマイシン‐カナマイシン・ホスホトランスフェラーゼII型（毒性化合物ネオマイシン、及び／又はカナマイシンと組み合わせて使用される）、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（毒性化合物ハイグロマイシンと組み合わせて使用される）、ゲンタマイシン・アセチルトランスフェラーゼ（毒性化合物ゲンタマイシンと組み合わせて使用される）、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（毒性化合物クロラムフェニコールと組み合わせて使用される）、ゼオシン耐性タンパク質（毒性化合物ゼオシンと組み合わせて使用される）、及びブレオマイシン耐性タンパク質（毒性化合物ブレオマイシンと組み合わせて使用される）から成る群から選択されてもよい。
本発明の枠組みの中では、「代謝的優位性を付与する断片」は、上述の断片が化合物の不存在下で成長する能力を細胞に付与することを意味する。例えば、グルタミン・シンテターゼ（GS）タンパク質は、グルタミンの不存在下で成長する能力をCHO細胞に付与する。よって、代謝的優位性を付与する断片は、例えば、グルタミン・シンテターゼ（GS）又はその機能的な断片に相当する。
「DHFRの機能的な断片」という用語は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ・ファミリー（EC 1.5.1.3）のメンバーであり、且つ、以下の酵素反応：
5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸＋NADP+＝7,8-ジヒドロ葉酸＋NADPH
を触媒するポリペプチドの断片を指す。
5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸＋NADP+＝7,8-ジヒドロ葉酸＋NADPH
を触媒するポリペプチドの断片を指す。
本明細書中に使用されるとき、「ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性」という用語は、先の反応の触媒作用を指す。この活性は、例えば、実施例1.2に記載のとおり、細胞に毒性化合物メトトレキサート（MTX）に対する耐性を付与する能力を測定するか、又は実施例1.4に記載のとおり、MTXの存在下で遺伝子コピー数を増やす能力を測定することによって、計測することができる。あるいは、DHFR活性は、チミジン、及び／又はヒポキサンチンを欠く培地中で成長する、Puro-DHFRでトランスフェクションされたDHFR陰性細胞の能力によって実証され得る。
好ましい態様において、DHFRの機能的な断片は、マウスに由来し、そして、配列番号6の配列の機能的な断片である。この断片は、配列番号6の少なくとも50、75、100、125、150、175、又は187個のアミノ酸を含むことができる。最も好ましくは、前述のDHFRの機能的な断片は、配列番号2の第200〜385アミノ酸を含んでなる。
本発明の好ましい態様において、本発明のres-DHFRポリペプチドは、ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ（pac）の断片に融合したDHFRの断片を含んでなる、ここで、上述のPuro-DHFRポリペプチドは、（i）ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性；及び（ii）ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ活性を示す。さらに本明細書中に使用されるとき、用語「Puro-DHFRポリペプチド」又は「Puro-DHFR」は、そのようなポリペプチドを指す。
本明細書中に使用されるとき、ポリペプチドは、上述のポリペプチドが細胞にピューロマイシンに対する耐性を付与する能力がある場合、「ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ活性」を示す。ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば、実施例1.2に記載のとおり計測できる。
ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼの断片は、例えば、ストレプトマイセス・アルボニガー又はストレプトマイセス・コエリカラーなどのストレプトマイセス種から得ることができる。好ましくは、前記Puro-DHFRポリペプチドは、ストレプトマイセス・アルボニガー pacの断片を含んでなる。本明細書中に使用されるとき、「ストレプトマイセス・アルボニガー pac」という用語は、配列番号4のポリペプチド、又はその対立遺伝子変異体、スプライス変異体、若しくはムテインを指す。より好ましくは、前記pac断片は、配列番号2の第200〜385アミノ酸を含んでなる。あるいは、前述のストレプトマイセス・アルボニガー pacの断片は、ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ活性を保有している限り、配列番号4の少なくとも50、75、100、125、150、又は175個のアミノ酸を含んでなる。
Puro-DHFRポリペプチドにおいて、DHFR断片が、pac断片の3’末端に融合されても、又はpac断片が、DHFR断片の3’末端に融合されてもよい。好ましくは、DHFR断片をpac断片の3’末端に融合させる。
最も好ましい態様において、Puro-DHFRポリペプチドは、配列番号2を含んでなるか、又は配列番号2から成る。
別の最も好ましい態様において、Puro-DHFRポリペプチドは、配列番号2と少なくとも50%同一の、より好ましくは、少なくとも60%同一の、そして、より一層好ましくは、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のアミノ酸配列を含んでなるか、又はそのアミノ酸配列から成る。
本明細書中に使用されるとき、「ムテイン」という用語は、天然に存在するポリペプチドの類似体を指し、それには、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸残基の1つ以上が、異なったアミノ酸残基によって置き換えられているか、欠失されているか、又は天然に存在するポリペプチドと比較して得られた生成物の活性を著しく下げることなく、1つ以上のアミノ酸残基が上記ポリペプチドの天然に存在する配列に付加されている。これらのムテインは、公知の合成、及び／又は部位特異的突然変異誘発技術、あるいは、そのために好適ないずれか他の公知技術によって調製される。本発明に従って使用される、ストレプトマイセス・アルボニガー pac若しくはマウスDHFRのムテイン、又はそのムテインをコードする核酸は、本明細書中に提示された教示と手引きに基づいて、必要以上の実験なしに、当業者によって日常的に入手され得る置換ペプチド又はポリヌクレオチドとして、実質的な対応配列の有限集合を含む。
本発明によるストレプトマイセス・アルボニガー pac又はマウスDHFRのムテインは、中程度又は高ストリンジェント条件下、本発明に従って、pac又はDHFRをコードするDNA又はRNAにハイブリダイズする、DNA又はRNAなどの核酸によってコードでされるタンパク質を含む。「ストリンジェント条件」という用語は、ハイブリダイゼーションとその後の洗浄条件を指し、当業者はそれを慣習的に「ストリンジェント」とも呼ぶ。例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §6.3 and 6.4 (1987, 1992)及びSambrook et al., Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYをを参照のこと）。
限定するものではないが、ストリンジェント条件の例には、例えば、5分間の2×SSC及び0.5%のSDS、15分間の2×SSC及び0.1%のSDS；37℃にて30〜60分間の0.1×SSC及び0.5%のSDS、その後、68℃にて30〜60分間の0.1×SSC及び0.5%のSDS中、研究中の計算されたハイブリッドTmを12〜20℃下回る洗浄条件が含まれる。当業者は、ストリンジェンシー条件はまた、DNA配列、（10〜40塩基といった）オリゴヌクレオチド・プローブ、又は混成オリゴヌクレオチド・プローブの長さにも依存することを理解している。混成プローブが使用される場合、SSCの代わりにテトラメチル塩化アンモニウム（TMAC）を使用するのが望ましい。
ストレプトマイセス・アルボニガー pac又はマウスDHFRのムテインは、天然に存在するポリペプチドに、少なくとも、50%同一の、より好ましくは、少なくとも60%同一の、そして、より一層好ましくは、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のアミノ酸配列を持つポリペプチドを含む。
本発明の問い合わせアミノ酸配列に、少なくとも、例えば、95%「同一である」アミノ酸配列を持つポリペプチドによって、対象のポリペプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列のアミノ酸100個あたり最大5個のアミノ酸変更を含むことができる以外は、対象のポリペプチドのアミノ酸配列が問い合わせ配列と同一であることを意味している。言い換えれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも95%同一であるポリペプチドを得るためには、対象の配列中のアミノ酸残基の最大5%（100個中5個）が、挿入されるか、削除されるか、又は別のアミノ酸で置換されていてもよい。
正確な一致が存在しない配列については、「%同一性」を測定してもよい。一般的に、比較されるべき2つの配列を整列させ、その配列間の最大の相関関係を得る。これには、アラインメントの度合いを高めるために、どちらか又は両方の配列に「ギャップ」を挿入するステップを含むことができる。%同一性は、比較されるそれぞれの配列の全長にわたって測定されてもよく（いわゆる、全体的な整列）、それは、同じか若しくは非常に近い長さの配列、又はより短い、規定の長さにわたり特に好適であり（いわゆる、局所的な整列）、それは、不不均等な長さの配列に関してより好適である。
2つ以上の配列の同一性及び相同性を比較する方法は、当該技術分野で周知である。よって、例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package、バージョン9.1（Devereux et al., 1984）の中の利用可能なプログラム、例えば、プログラムBESTFIT及びGAPが、2つのポリヌクレオチドの間の%同一性、及び2つのポリペプチド配列の間の%同一性と%相同性を測定するのに使用できる。BESTFITは、Smith及びWaterman（1981）の「局所的な相同性」アルゴリズムを使用し、2つの配列の間の類似性が最も高い単一領域を見つける。配列間の同一性、及び／又は類似性を測定するための他のプログラム、例えば、ワールドワイドウェブサイトにおけるNCBIのホームページ（ncbi.nlm.nih.gov）を通じてアクセス可能であるBLASTファミリーのプログラム（Altschul et al., 1990）、及びFASTA（Pearson and Lipman, 1988；Pearson, 1990）もまた当該技術分野で知られている。2つの配列の間の%同一性が、例えば、GenePASTなどの生物情報学的ツールを使用することによって、KERRアルゴリズム（Dufresne et al., 2002）を使用することで測定されることは、非常に好ましい。
好ましくは、本発明のムテインは、それが対応する天然に存在するポリペプチドと実質的に同じ生物学的活性を示す。
2．それらを含んでなる核酸、ベクター、及び宿主細胞
本発明の別の側面は、本発明によるres-DHFRポリペプチドをコードする核酸に関する。
本発明の別の側面は、本発明によるres-DHFRポリペプチドをコードする核酸に関する。
好ましくは、本発明による核酸は、Puro-DHFRポリペプチドをコードする。さらに、この明細書中で使用されるとき、「Puro-DHFR核酸」という用語は、そのような核酸を指す。
好ましい態様において、Puro-DHFR核酸は、配列番号1を含んでなるか、又は配列番号1から成る。
当該技術分野で知られているあらゆる手順が、本発明のPuro-DHFR核酸を得るために使用できる。Puro-DHFR核酸は、例えば、実施例1に記載されているように得ることができる。
本発明のさらなる側面は、本発明による核酸を含んでなるベクターに関する。res-DHFR核酸を含んでなるベクターは、「res-DHFRベクター」とも呼ばれる。Puro-DHFR核酸を含んでなるベクターは、当該明細書中で「Puro-DHFRベクター」とも呼ばれる。好ましくは、本発明のベクターは、発現ベクターである。「本発明のベクター」という用語は、用語「Puro-DHFRベクター」を網羅する。
「ベクター」という用語は、二本鎖又は一本鎖のいずれかであり、且つ、細胞宿主、又は単細胞若しくは多細胞の宿主生物の体内に運ばれるべき本発明の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含んでなる、環状若しくは直鎖のDNA又はRNA化合物のどちらかを示すのに本明細書中で使用される。「発現ベクター」は、ベクターにおける適切なシグナルを含んでなり、上記シグナルには、宿主細胞内で挿入されたポリヌクレオチドの発現を駆動する、ウイルス、細菌、植物、哺乳動物、及び他の真核生物起源からのエンハンサー／プロモーターなどの様々な調節エレメントが含まれる。
最も好ましい態様において、本発明のベクターは、注目のタンパク質をコードする核酸をさらに含んでなる。実施例3に示されているように、こうしたベクターは、上述の注目のタンパク質の高発現についての細胞のスクリーニングのために特に有用である。
本発明によると、注目のタンパク質は、生産が所望されるあらゆるポリペプチドであり得る。注目のタンパク質は、製薬学、農業関連産業、又は研究所用の備品の分野で利用法を見つけることができる。好ましい注目のタンパク質は、製薬学の分野で利用法を見つけることができる。
例えば、注目のタンパク質は、例えば、天然の分泌タンパク質、普通の細胞質タンパク質、普通の膜貫通タンパク質、又はヒト又はヒト化抗体であってもよい。注目のタンパク質が、普通の細胞質タンパク質又は普通の膜貫通タンパク質である場合、そのタンパク質は、好ましくは、可溶性になるように設計された。注目のポリペプチドは、どんな起源のものであってもよい。好ましい注目のポリペプチドは、ヒト起源のものである。
好ましい態様において、注目のタンパク質は、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、ルトロピン‐絨毛性ゴナドトロピン・ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン（例えば、インターフェロンβ-1a、インターフェロンβ-1b）、インターフェロン受容体（例えば、インターフェロンγ受容体）、TNF受容体p55及びp75、インターロイキン（例えば、インターロイキン2、インターロイキン11）、インターロイキン結合タンパク質（例えば、インターロイキン18結合タンパク質）、抗CD11a抗体、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球‐マクロファージ・コロニー刺激因子、下垂体ペプチド・ホルモン、更年期ゴナドトロピン、インシュリン様成長因子（例えば、ソマトメジンC）、ケラチン生成細胞増殖因子、グリア細胞株由来神経栄養因子、トロンボモジュリン、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン、第八因子、ソマトロピン、骨形成タンパク質2、血小板由来成長因子、ヒルジン、エポエチン、組み換えLFA-3/IgG1融合タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、モノクローナル抗体、及びそのムテイン、断片、可溶型、機能性誘導体、融合タンパク質から成る群から選択される。
好ましくは、前述のモノクローナル抗体は、CD3（例えば、OKT3、NI-0401）、CD11a（例えば、エファリズマブ）、CD4（例えば、ザノリムマブ、TNX-355）、CD20（例えば、イブリツモマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、オクレリツマブ、オファツムマブ、IMMU-106、TRU-015、AME-133、GA-101）、CD23（例えば、ルミリキシマブ）、CD22（例えば、エプラツズマブ）、CD25（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、上皮生長因子受容体（EGFR）（例えば、パニツムマブ、セツキシマブ、ザルツムマブ、MDX-214）、CD30（例えば、MDX-060）、細胞表面糖タンパク質CD52（例えば、アレムツズマブ）、CD80（例えば、ガリキシマブ）、血小板GPIIb/IIIa受容体（例えば、アブシキシマブ）、TNFα（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ）、インターロイキン6受容体（例えば、トシリズマブ）、癌胎児抗原（CEA）（例えば、99mTc-ベシレソマブ）、α-4/β-1インテグリン（VLA4）（例えば、ナタリズマブ）、α-5/β-1インテグリン（VLA5）（例えば、ボロシキシマブ）、VEGF（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ）、免疫グロブリンE（IgE）（例えば、オマリズマブ）、HER-2/neu（例えば、トラスツズマブ）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）（例えば、111In-カプロマブ・ペンデチド、MDX-070）、CD33（例えば、ゲムツズマブ・オゾガマイシン）、GM-CSF（例えば、KB002、MT203）、GM-CSF受容体（例えば、CAM-3001）、EpCAM（例えば、アデカツムマブ）、IFN-γ（例えば、NI-0501）、IFN-α（例えば、MEDI-545/MDX-1103）、RANKL（例えば、デノスマブ）、肝細胞増殖因子（例えば、AMG102）、IL-15（例えば、AMG714）、TRAIL（例えば、AMG655）、インスリン様成長因子受容体（例えば、AMG479、R1507）、IL-4及びIL13（例えば、AMG317）、BAFF/BLyS受容体3（BR3）（例えば、CB1）、CTLA-4（例えば、イピリムマブ）から成る群から選択されるタンパク質に向けられる。
好ましい態様において、本発明のベクターは、注目のタンパク質をコードし、且つ、少なくとも2つのプロモーター（一方が本発明のポリペプチドの発現を駆動し、もう一方が注目のタンパク質の発現を駆動する）を含んでなる核酸である。そのようなベクターは、エンハンサー領域、及び／又は発現促進配列、例えば、（例えば、Blackwood and Kadonaga (1998)によって記載された）インスレーター、境界要素、LCRsなど、又は（例えば、Li et al. (1999)によって記載された）マトリックス／骨格付着領域をさらに含んでもよい。
あるいは、本発明のベクターは、注目の遺伝子発現と本発明のポリペプチドの両方の発現を駆動するプロモーターを含んでなる。この態様において、本発明のポリペプチドのORFは、例えば、内部リボソーム侵入部位（IRES）又は2A配列（de Felipe et al., 2006）などの配列の存在下、注目のタンパク質のORFと分断される。2A配列が使用される場合、Puro-DHFRが第1のORF（すなわち、プロモーターの後）に対応する、且つ、注目のタンパク質が第2のORF（すなわち、2A配列の後）に対応することが好ましい。IRESは、例えば、ウイルス又は細胞遺伝子、に由来してもよい。この態様は、図1Cに示されているpCMV（IE1）SEAP-IRES-Puro/DHFR-325ベクターによって例示されていて、ここで、SEAPの遺伝子（8）とPuro-DHFRマーカー（11）の発現は、mCMV（IE1）プロモーター（5）によって駆動され、且つ、ここで、ORFsは、IRES（9）によって分断される。
「プロモーター」という用語は、本明細書中では、1つ以上のDNA配列の転写を制御するために機能し、且つ、DNA依存性RNAポリメラーゼのための結合部位、及びプロモーター機能を調節するために相互作用するその他のDNA配列の存在によって構造的に特定されるDNAの領域を指す。プロモーターの機能的な発現促進断片は、プロモーターとして活性を保有したまま短縮されたか、又は切断されたプロモーター配列である。プロモーター活性は、当該技術分野で知られているアッセイのいずれか、例えば、レポーター遺伝子としてDHFRを使用する（Wood et al., 1984；SELIGER and McELROY, 1960；de Wet et al., 1985）又はPromega（登録商標）から市販されているレポーター・アッセイにより、計測することができる。「エンハンサー領域」は、1つ以上の遺伝子の転写を増強するために機能するDNA領域を指す。より詳しく述べると、「エンハンサー」という用語は、本明細書中に使用されるとき、発現されるべき遺伝子に対するその位置と方向に関係なく遺伝子発現を促進する、増加させる、改善する、又は向上させる（ameliorates）DNA調節要素であり、そして、2つ以上のプロモーターの発現を促進、増加、改善、又は向上することができる。
好ましい態様において、本発明のベクターは、マウスCMV前初期領域の少なくとも1つのプロモーターを含んでなる。例えば、前記プロモーターは、例えば、WO 87/03905で知られている、mCMV IE1遺伝子のプロモーター（「IE1プロモーター」）であってもよい。前記プロモーターはまた、mCMV IE2遺伝子自体が、例えば、Messerle et al.,（1991）で知られている、mCMV IE2遺伝子のプロモーター（「IE2プロモーター」）であってもよい。IE2プロモーター及びIE2エンハンサー領域は、PCT/EP 2004/050280に詳細に記載されている。好ましくは、本発明のベクターは、マウスCMV前初期領域の少なくとも2つのプロモーターを含んでなる。より好ましくは、前記の2つのプロモーターは、IE1及びIE2プロモーターである。
好ましい態様において、本発明のベクターは、マウスCMV前初期領域の少なくとも2つのプロモーターを含んでなり、ここで、それらのうちの一方が本発明のポリペプチドの発現を駆動し、そして、もう一方が注目のタンパク質の発現を駆動する。
別の好ましい態様において、マウスCMV前初期領域のプロモーターは、注目のタンパク質をコードする遺伝子の発現を駆動し、そして、Puro-DHFRポリペプチドが、ベクター骨格内に挿入された追加発現カセットから発現される。前記のIE1及びIE2プロモーターは、注目のタンパク質をコードする遺伝子の2つの同一のコピー、又は注目の多量体タンパク質、例えば、抗体又はペプチド・ホルモンなどの2つのサブユニットのいずれか発現を駆動できる。
本発明の別の側面は、本発明のres-DHFR核酸、及び／又は本発明のres-DHFRベクターでトランスフェクションされた細胞に関する。好ましくは、前述の細胞は、Puro-DHFR核酸、及び／又はPuro-DHFRベクターでトランスフェクションされたPuro-DHFR細胞である。植物及び動物細胞を含めた様々な真核生物からの初代又は樹立細胞株のような多くの細胞が、本発明によると好適である。好ましくは、前述の細胞は、真核細胞である。より好ましくは、前述の細胞は、哺乳動物細胞である。最も好ましくは、前述の細胞は、CHO細胞、ヒト細胞、マウス細胞、又はハイブリドーマである。
例えば、好適な細胞には、NIH-3T3細胞、COS細胞、MRC-5細胞、BHK細胞、VERO細胞、CHO細胞、rCHO-tPA細胞、rCHO-Hep B表面抗原細胞、HEK 293細胞、rHEK 293細胞、rC127-Hep B表面抗原細胞、CV1細胞、マウスL細胞、HT1080細胞、LM細胞、YI細胞、NS0及びSP2/0マウス・ハイブリドーマ細胞等、RPMI-8226細胞、Vero細胞、WI-38細胞、MRC-5細胞、正常ヒト繊維芽細胞、ヒト間質細胞、ヒト肝細胞、ヒト骨肉腫細胞、ナマルバ細胞、ヒト神経細胞、ヒト網膜芽細胞、PER.C6細胞、並びに他の不死化、及び／又は形質転換された哺乳動物細胞が含まれる。
3．上記のポリペプチド及び核酸の使用方法
別の側面は、注目のタンパク質を生産するための、本発明によるres-DHFR核酸を含んでなる細胞の使用に関する。好ましくは、前述の細胞は、Puro-DHFRベクターを含んでなる。
別の側面は、注目のタンパク質を生産するための、本発明によるres-DHFR核酸を含んでなる細胞の使用に関する。好ましくは、前述の細胞は、Puro-DHFRベクターを含んでなる。
実施例3で議論するように、選択及び代用マーカーとしてPuro-DHFRポリペプチドを使用することで、注目のタンパク質の高発現について細胞をスクリーニングための多数の利点が提供される。特に、Puro-DHFRポリペプチドの発現が注目のタンパク質の発現と高度に関連するので、例えば、FACSによって、高Puro-DHFR発現について一次スクリーンを実施することは有利である。注目のタンパク質の発現は、二次スクリーンによりアッセイされ、上記二次スクリーンは、高Puro-DHFR発現についての一次スクリーンに引き続いて、単離された最良の産生体を用いて実施されるだけである。
従って、本発明の別の側面は、注目のタンパク質の発現又は高発現について細胞をスクリーニングするための、本発明によるポリペプチド、本発明による核酸、又は本発明によるベクターの使用に関する。細胞は、最初に、本発明によるポリペプチド（例えば、Puro-DHFR）の高発現についてスクリーニングされ、そして、そのとき、本発明によるポリペプチドの発現は、推測によって、注目のタンパク質の発現に関連する。これは、本発明によるポリペプチドの低い発現レベルに基づいて試験細胞の80〜95%の迅速な排除を可能にし、そして、第2段階における、注目の遺伝子の発現の分析に関して残りの5〜20%を留保することを可能にする。
本発明の用途及び方法との関連において、用語「高発現」は、スクリーニングされる細胞における発現レベル、すなわち、スクリーニングされる他の細胞より高い発現レベルを指す。タンパク質の「高発現」は、相対値である。例えば、商業的に生産された組み換えタンパク質の最終的な発現レベルは、そのタンパク質、年間の必要量、及び治療用量に依存する。スクリーニング中、注目のタンパク質の発現レベルは、最終的な発現レベルより低い。
さらなる側面は、注目のタンパク質の発現又は高発現についての細胞のスクリーニング方法であり、上記方法は：
a）res-DHFRをコードする発現ベクターで細胞をトランスフェクションするステップ；
b）前述の毒性化合物に耐性である細胞を選択するステップ；及び
c）DHFRに結合する蛍光化合物を用いて、ステップ（b）で選択された細胞の蛍光発光をアッセイするステップ、
を含んでなる。
a）res-DHFRをコードする発現ベクターで細胞をトランスフェクションするステップ；
b）前述の毒性化合物に耐性である細胞を選択するステップ；及び
c）DHFRに結合する蛍光化合物を用いて、ステップ（b）で選択された細胞の蛍光発光をアッセイするステップ、
を含んでなる。
好ましくは、注目のタンパク質の発現又は高発現についての、この細胞スクリーニング方法は、ステップ（c）を実施する前に、前記注目の組み換えタンパク質を増幅するステップをさらに含んでなる。そのような増幅ステップは、メトトレキサート（MTX）の存在下での細胞の培養によって好ましくは実施される。メトトレキサートの濃度は、細胞型によって異なるだろう。通常、CHO細胞は、遺伝子増幅のために、50、75、100、125、150、200、300、500、1000、2000、3000、4000、5000、又は6000nMのMTXを含んでなる培地中で培養されるだろう。
細胞の蛍光発光は、DHFRに共有結合で結合されたいずれかの蛍光性標識葉酸類似体を使用して検出できる。こうした蛍光化合物には、例えば、蛍光メトトレキサート（f-MTX）又は蛍光トリメトプリムは（f-TMP）が含まれる。
ステップ（c）において、蛍光発光は、例えば、蛍光顕微鏡又は蛍光励起セルソーター（FACS）又は同様のものなどの当該技術分野で周知のいずれかの装置を使用することで計測することができる。高速大量処理スクリーニングを実施する場合、FACSを使用するのが特に有利である。
好ましい態様において、ステップ（c）において最高の蛍光発光を示した20%の細胞が、前述の注目のタンパク質の最高の発現を示す細胞を含んでいる。好ましくは、ステップ（c）において最高の蛍光発光を示した10%の細胞が、前述の注目のタンパク質の最高の発現を示す細胞を含んでいる。最も好ましくは、ステップ（c）において最高の蛍光発光を示した1%又は5%の細胞が、前述の注目のタンパク質の最高の発現を示す細胞を含んでいる。
いかなる細胞数であっても、前述の方法によってスクリーニングされ得る。好ましくは、少なくとも1、20、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、又は10,000,000個の細胞の蛍光発光が、ステップ（c）においてアッセイされる。最も好ましくは、ピューロマイシンに対して耐性である、少なくとも1,000〜10,000,000個の独立したトランスフェクタントを得るのに十分な細胞集団がスクリーニングされる。これらから、ピューロマイシンに対して耐性である、少なくとも10〜1,000,000個の候補クローンが、蛍光発光についてさらにアッセイされる。
前記のスクリーニング方法の終了時に得られた細胞が、res-DHFR発現に関して互いに相対的に格付けされてもよい。最高の蛍光発光を示す細胞は、先のスクリーニング方法のいずれの終了時で選択されてもよい。例えば、res-DHFR発現体の上位5〜20%に相当するDHFR活性を示す個別の細胞が、その後のステップにおいて、注目の遺伝子の発現のさらなる分析のために選択される。
好ましい態様において、前記スクリーニング方法は、（d）ステップ（c）でアッセイされた細胞の約1%〜約20%を選択する、ステップをさらに含んでなり、ここで、上記の選択された細胞は、ステップ（c）において最高の蛍光発光を示すものである。ステップ（c）でアッセイされた細胞の約5%〜約20%が、最高のres-DHFR活性に基づいて選択されてもよい。あるいは、ステップ（c）でアッセイされた細胞の約1%、1.5%、2%、3%、4%、5%〜約30%、40%、50%、60%、70%、又は80%が、最高のres-DHFR活性に基づいて選択されてもよい。
ステップ（b）（すなわち、耐性菌を選択するステップ）、（c）（すなわち、蛍光発光をアッセイするステップ）、及び（d）（すなわち、最高の蛍光細胞を選択するステップ）は、ステップ（d）の終了時に選択された集団に対して反復的に繰り返されてもよい。例えば、少なくとも2、3、5、又は10回の反復が、実施されてもよい。これは、選択ステップの間での条件の変更の有無にかかわらず、おこなわれてもよい。条件の変更は、例えば、遺伝子増幅を誘導するためのMTX濃度を高めるか、又は培地組成若しくは物理化学的パラメータなどの培養条件を変えることを含むことができる。
最高の蛍光発光を示す細胞の選択により、前述の選択された細胞における注目のタンパク質の発現レベルをさらにアッセイできる。
そして、前述の注目のタンパク質の最高の発現を示す細胞の約1%〜約20%を選択できる。例えば、前述の注目のタンパク質の最高の発現を示す細胞の約1%、1.5%、2%、3%、4%、5%〜約15%、18%、又は20%を選択できる。好ましくは、前述の注目のタンパク質の最高の発現示す細胞が選択される。注目のタンパク質の発現に基づくこの選択は、ステップ（d）（すなわち、蛍光に基づく最後の選択）の最後の反復後に好ましくは実施される。
そして、前述の注目のタンパク質の最高の発現を示す細胞の約1%〜約20%を選択できる。例えば、前述の注目のタンパク質の最高の発現を示す細胞の約1%、1.5%、2%、3%、4%、5%〜約15%、18%、又は20%を選択できる。好ましくは、前述の注目のタンパク質の最高の発現示す細胞が選択される。注目のタンパク質の発現に基づくこの選択は、ステップ（d）（すなわち、蛍光に基づく最後の選択）の最後の反復後に好ましくは実施される。
本発明のさらなる側面は、注目のタンパク質を発現する細胞株に関し、上記方法は：
a）先の方法に従って細胞をスクリーニングするステップ；及び
b）上述の細胞から細胞株を樹立するステップ、
を含んでなる。
a）先の方法に従って細胞をスクリーニングするステップ；及び
b）上述の細胞から細胞株を樹立するステップ、
を含んでなる。
本明細書中に使用されるとき、「細胞株」は、実験室で培養できる1種類の特定のタイプの細胞を指す。細胞株は、通常、恒久的に構築された細胞培養により培養でき、そして、所定の適切な新鮮培地と空間で無限に増殖するだろう。分離細胞から細胞株を樹立する方法は、当業者に周知である。
別の側面は、注目のタンパク質の生産方法に関し、上記方法は：
a）上で上述の注目のタンパク質の発現を可能にする条件下、先に記載したように獲得した細胞株を培養するステップ；及び
b）上述の注目のタンパク質を回収するステップ、
を含んでなる。
a）上で上述の注目のタンパク質の発現を可能にする条件下、先に記載したように獲得した細胞株を培養するステップ；及び
b）上述の注目のタンパク質を回収するステップ、
を含んでなる。
注目のタンパク質の発現を可能にする条件は、標準的な方法によって当業者により容易に構築され得る。例えば、実施例3.3.1で開示された条件が使用できる。
好ましい態様において、先の注目のタンパク質の生産方法は、上述の注目のタンパク質を精製するステップを含んでなる。精製は、当業者に周知のいずれの技術でもおこなうことができる。製薬学の分野での使用のための注目のタンパク質の場合では、注目のタンパク質は、好ましくは、医薬組成物中に処方される。
本発明は、注目のタンパク質の発現について細胞をスクリーニングするためのres-DHFRポリペプチドの使用、注目のタンパク質の発現について細胞をスクリーニングするためのres-DHFR核酸の使用、及び注目のタンパク質の発現について細胞をスクリーニングするためのres-DHFRベクターの使用にさらに関する。好ましくは、res-DHFRポリペプチド、核酸、又はベクターは、Puro-DHFRポリペプチド、核酸、又はベクターである。
本願発明をここで完全に記載したので、本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく、且つ、必要以上の実験なしに、同じものが、様々な同等のパラメータ、濃度、及び条件の中で実施され得ることが当業者によって理解されるだろう。
本願発明をその具体的な態様に関連して説明したが、それをさらに修飾できることは理解されるだろう。当該出願は、（一般に、本発明の本質に従い、且つ、本発明が関係する技術分野で知られるようになるか若しくは慣行になるような、又は添付の請求項の範囲のように以下に記載した基本的特徴に適合し得るような、本開示からの逸脱を含んでなる）あらゆる本発明の変形形態、用途、又は適応を網羅するものとする。
雑誌記事又は要約、公開された又は公開されていない米国又は外国特許出願、交付された米国又は外国特許、あるいは、あらゆるその他の参考文献を含めた、本明細書中に引用されたすべての参考文献を、引用された参考文献に提示された、すべてのデータ、表、図面、及び文章を含めて、完全に本明細書中に援用する。さらに、本明細書中に引用された参考文献中に引用された参考文献の全内容もまた、完全に本明細書中に援用する。
公知の方法ステップ、従来の方法ステップ、公知の方法、又は従来の方法への言及は、本発明のあらゆる側面、説明、又は態様が関連技術分野で開示、教示、又は示唆されることを自認するものではない。
具体的な態様に関する前記の説明は、他の当業者が（本明細書中に引用される参考文献の内容を含めた）当該技術分野の技能の範囲内の知識を応用することによって、必要以上の実験なしに、本発明の一般概念から逸脱することなく、こうした具体的な態様を容易に修飾する、及び／又は様々な適用に適合させることができるように、本発明の全体的な性質を完全に明らかにするだろう。そのため、こうした適合及び修飾は、本明細書中に提示された教示及び示唆に基づく、開示した態様の意味及び同等物の範囲の中にあるものとする。本明細書中の言い回し又は専門用語は、（当業者の知識と組み合わせて、当該明細書の専門用語又は言い回しが、本明細書中に提示された教示及び手引きの観点から当業者によって解釈されるような）説明目的のものであり、制限目的のものではないことは、理解されるべきである。
実施例1：プロトコール
1.1. Puro-DHFR核酸の構築
本明細書中で以下に記載した構築物を、図1に描く。すべての構築物が、pGL3基礎プラスミド骨格（Promega）に基づいている。
1.1. Puro-DHFR核酸の構築
本明細書中で以下に記載した構築物を、図1に描く。すべての構築物が、pGL3基礎プラスミド骨格（Promega）に基づいている。
ピューロマイシン耐性遺伝子と野性型マウスDHFRの間の融合タンパク質を、組み換えPCR法によって獲得した。ベクターpmCMV（IE1）-SEAP-IRES-PuroR-p279内に存在しているポリオウイルスIRESの一部と、完全なピューロマイシン耐性遺伝子ORF（終止コドンを除く）を、配列番号7及び8のプライマーと高忠実度DNAポリメラーゼ（HS-KOD；Novagen）を使用したPCR法によって増幅した。プラスミドpSV40-DHFR（p1474）内に存在している野生型マウスのDHFR ORFと、SV40後期ポリアデニル化シグナルの一部を、配列番号9及び10のプライマーを使用して増幅した。
融合Puro-DHFRマーカーを生産するために、得られたPCR産物を、混合し、そして、配列番号7及び10のプライマーを使用して再増幅し、（マウスIE1プロモーターがヒト胎盤アルカリ・ホスファターゼ遺伝子（SEAP）の発現を駆動し、且つ、Puro-DHFR選択マーカーがポリオウイルスIRESの下流に配置された第2のシストロンとして発現される）ベクター内にクローンニングした。PCR法によって増幅されたすべての要素の完全性を、配列決定法によって確かめた。このベクターは、さらに、pmCMV（IE1）-SEAP-IRES-Puro/DHFR-p325又はp325とも呼ばれる。
1.2. トランスフェクションと細胞培養
安定したトランスフェクタントを選択するためのプロトコールを、図2に図式化する。
CHO-S-細胞を、チャイニーズハムスターから得、そして、無血清培地（Invitrogen/Gibco、La Jolla, CA）に順応させた。CHO-S DX11-F10は、無血清培地中の懸濁状態での培養に適合させた、DHFR欠損CHO DUKXB11細胞株に由来する細胞株である（Urlaub et al. 1980）。両細胞を、ProCho5（Lonza Biologies）中でごく普通に培養する。DXB11-F10細胞の培養用培地には、反対のものが示されない限り、ヒポキサンチン（100μM）とチミジン（16μM）を補った（HTサプリメント；Invitrogen/Gibco）。
安定したトランスフェクタントを選択するためのプロトコールを、図2に図式化する。
CHO-S-細胞を、チャイニーズハムスターから得、そして、無血清培地（Invitrogen/Gibco、La Jolla, CA）に順応させた。CHO-S DX11-F10は、無血清培地中の懸濁状態での培養に適合させた、DHFR欠損CHO DUKXB11細胞株に由来する細胞株である（Urlaub et al. 1980）。両細胞を、ProCho5（Lonza Biologies）中でごく普通に培養する。DXB11-F10細胞の培養用培地には、反対のものが示されない限り、ヒポキサンチン（100μM）とチミジン（16μM）を補った（HTサプリメント；Invitrogen/Gibco）。
ポリエチレンイミン（直鎖PEI 25kd）を使用することで、CHO-S細胞及びDXB11-F10細胞をトランスフェクションした。細胞を、1mLあたり5×105細胞の濃度にて、0.05%のPluronic F68（Sigma）を加えた2.5mLのRPMi-1640（Invitrogen/Gibco）中、6ウェル・プレート内に蒔いた。250μlの150mM NaCl中の5μgの線状化プラスミドDNAを、250μlの150mM NaCl中に希釈した1mMの線状PEI25の溶液15μlと混合した。PEI：DNA複合体を、室温にて5分間、形成させ、その後、それを前記細胞に加えた。3時間後に、トランスフェクション培地を無血清培地で置き換える。
トランスフェクションの48時間後に、選択を適用し、そして、細胞が回復し、且つ、細胞生存率が90%を上回るまで、培地を1週間に2回交換した。
選択のために、ピューロマイシンを10μg/mlにて使用し、そして、葉酸類似体であるメトトレキサート（Calbiochem）を50〜100nMの濃度にて使用した。
選択のために、ピューロマイシンを10μg/mlにて使用し、そして、葉酸類似体であるメトトレキサート（Calbiochem）を50〜100nMの濃度にて使用した。
増幅の検討のために、最初に、10μg/mlにてピューロマイシンを用いた選択下、384ウェル・プレートにおける1ウェルあたり0.3細胞の限界希釈法によって、クローンを得た。次に、ピューロマイシン（10μg/ml）又はピューロマイシンとメトトレキサート（100nM）を用いた選択下、クローンを4週間培養した。次に、ゲノムDNAを抽出し、そして、レポーター遺伝子のコピー数をQPCRによって測定した。
1.3. SEAPアッセイによるレポーター遺伝子発現の測定
安定にトランスフェクションされた細胞プールを、125ml振とうフラスコ内に2.5×105細胞/mlにて播種し、そして、バッチ培養により最長7日間培養した。細胞培地を、様々な時点で回収し、そして、SEAP測定値の日差変動を避けるために、サンプルを分析まで−20℃に保った。相対SEAP活性を、動力学的酵素アッセイにより測定した。hepes緩衝生理食塩溶液（HBSS）中への培地の段階希釈物10μlを、96ウェル・プレートに加え、次に、ホスファターゼ基質溶液（Pierce）100μlを各ウェルに加え、そして、405nMのODの測定値を、規定の時間間隔で読み取った。OD対時間のプロットの線形ウィンドウだけを、分析に考慮した。
安定にトランスフェクションされた細胞プールを、125ml振とうフラスコ内に2.5×105細胞/mlにて播種し、そして、バッチ培養により最長7日間培養した。細胞培地を、様々な時点で回収し、そして、SEAP測定値の日差変動を避けるために、サンプルを分析まで−20℃に保った。相対SEAP活性を、動力学的酵素アッセイにより測定した。hepes緩衝生理食塩溶液（HBSS）中への培地の段階希釈物10μlを、96ウェル・プレートに加え、次に、ホスファターゼ基質溶液（Pierce）100μlを各ウェルに加え、そして、405nMのODの測定値を、規定の時間間隔で読み取った。OD対時間のプロットの線形ウィンドウだけを、分析に考慮した。
1.4. QPCRによる遺伝子コピー数の測定
製造業者の取扱説明書に従いGenElute Mammalian Genomic DNA Miniprepキット（Sigma）を使用して、ゲノムDNAを単離し、そして、分光光度測定により定量化した。遺伝子コピー数の測定のために、10ngのゲノムDNAを、多重アッセイにおける標準的なサイクル条件を使用して7500 Real-Time PCR施設（Applied Biosystems）を用いて定量的PCRによって分析した。レポーター構築物を検出するために、ピューロマイシン特異的TaqManプローブを使用し、そして、ハムスター・グリセルアルデヒド・リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子を検出する第2のTaqManプローブを、内在性コントロールとして使用した。検量線を、ピューロマイシン遺伝子のコピー数をサザンブロットによって測定した細胞株からのゲノムDNAを使用して作成した。
製造業者の取扱説明書に従いGenElute Mammalian Genomic DNA Miniprepキット（Sigma）を使用して、ゲノムDNAを単離し、そして、分光光度測定により定量化した。遺伝子コピー数の測定のために、10ngのゲノムDNAを、多重アッセイにおける標準的なサイクル条件を使用して7500 Real-Time PCR施設（Applied Biosystems）を用いて定量的PCRによって分析した。レポーター構築物を検出するために、ピューロマイシン特異的TaqManプローブを使用し、そして、ハムスター・グリセルアルデヒド・リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子を検出する第2のTaqManプローブを、内在性コントロールとして使用した。検量線を、ピューロマイシン遺伝子のコピー数をサザンブロットによって測定した細胞株からのゲノムDNAを使用して作成した。
前記オリゴヌクレオチドは、ピューロマイシン・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を検出するための配列番号11、12の配列、及びFAM‐配列番号13‐BHQ1の配列、並びにGAPDH遺伝子を検出するための配列番号14、15の配列、及びYY‐配列番号16‐BHQ1の配列を持っていた。FAM及びYYは、それぞれ、蛍光発色団5-カルボキシフルオレセイン及びヤキマ・イエロー（Epoch Biosciences）の略語である。BHQ1（商標）（Biosearch Technologies, Inc）は、TaqManプローブの3’に連結されたクエンチャーである。
Core PCR試薬はApplied Biosystems製であり、そして、96ウェル検出プレートはAxonLabから入手した。
1.5. 逆転写酵素-QPCRによる相対レポーター遺伝子発現の測定
全RNAを〜5×106細胞から‐DNase処理ステップを含めた‐NucleoSpin RNA IIキット（Macherey-Nagel）を使用して単離し、そして、RNA濃度を、260nmにて分光光度測定を用いて測定した。
全RNAを〜5×106細胞から‐DNase処理ステップを含めた‐NucleoSpin RNA IIキット（Macherey-Nagel）を使用して単離し、そして、RNA濃度を、260nmにて分光光度測定を用いて測定した。
レポーター発現の相対的な定量化を、先に記載したPuro及びGAPDHプライマー、そして、TaqManプローブを使用した、25ngの全RNAに対するOne-Step Reverse Transcriptase-QPCR（One-Step RT-PCR Master Mix Reagent；Applied Biosystems）によって実施した。GAPDHが内在性コントロールとしての役割を果たした。レポーターmRNAの量を、ΔΔCt法によって計算し、そして、（ピューロマイシンだけで選択された）プールp279と比較して表した。
1.6. フルオレセイン‐メトトレキサートでの標識
2.5〜5×105個の細胞を、10mMのフルオレセイン標識メトトレキサート（F-MTX、Molecular Probes/Invitrogen）を含む0.5mlの培地中、29℃にて一晩インキューベートした。標識細胞を、無血清培地で洗浄し、そして、は、FITCフイルター・セットを使用した蛍光顕微鏡（DP50デジタルカメラを備えたOlympus CKX41顕微鏡）を使用することで記録した。
2.5〜5×105個の細胞を、10mMのフルオレセイン標識メトトレキサート（F-MTX、Molecular Probes/Invitrogen）を含む0.5mlの培地中、29℃にて一晩インキューベートした。標識細胞を、無血清培地で洗浄し、そして、は、FITCフイルター・セットを使用した蛍光顕微鏡（DP50デジタルカメラを備えたOlympus CKX41顕微鏡）を使用することで記録した。
実施例2：Puro-DHFRは四機能性マーカーである
2.1. Puro-DHFRは、トランスフェクションされた細胞にピューロマイシンに対する耐性を付与する（すなわち、Puro-DHFRには、ピューロマイシン・アセチルトランスフェラーゼ活性がある）
2.1. Puro-DHFRは、トランスフェクションされた細胞にピューロマイシンに対する耐性を付与する（すなわち、Puro-DHFRには、ピューロマイシン・アセチルトランスフェラーゼ活性がある）
実施例1.2に記載のとおり、CHO DXB11-F10細胞に、Puro-DHFRをコードするp325ベクターでトランスフェクションした。図3に示されているように、Puro-DHFR選択マーカーは、トランスフェクションされた細胞にピューロマイシン耐性を付与する。
2.2. Puro-DHFRは、HTの不存在下での成長を可能にする（すなわち、Puro-DHFRには、DHFR活性がある）
DHFR欠乏細胞は、MTXに対する感受性を欠き、且つ、成長のために培地中にHT（ヒポキサンチン及びチミジン）の存在を必要とする。
DHFR欠乏細胞は、MTXに対する感受性を欠き、且つ、成長のために培地中にHT（ヒポキサンチン及びチミジン）の存在を必要とする。
実施例1.2に記載のとおり、DHFR欠損CHO DXB11-F10細胞に、Puro-DHFRをコードするp325ベクターでトランスフェクションした。図3に示されているように、Puro-DHFR選択マーカーは、HT不存在下、p325でトランスフェクションされたDXB11-F10細胞にピューロマイシン耐性を付与する。
2.3. Puro-DHFRは遺伝子増幅を誘導する
実施例1.2に記載のとおり、内因的にDHFRを発現するCHO-S-細胞に、Puro-DHFRをコードするp325ベクターでトランスフェクションした。その細胞を、ピューロマイシン（10μg/ml）の存在下で選択した。耐性個体群の限界希釈によって、クローンを得た。興味深いことに、本明細書中に示された実験が、内因性DHFRバックグラウンド発現にもかかわらず、Puro-DHFR選択及び増幅がCHO-S-細胞において実現可能であることを実証した。
実施例1.2に記載のとおり、内因的にDHFRを発現するCHO-S-細胞に、Puro-DHFRをコードするp325ベクターでトランスフェクションした。その細胞を、ピューロマイシン（10μg/ml）の存在下で選択した。耐性個体群の限界希釈によって、クローンを得た。興味深いことに、本明細書中に示された実験が、内因性DHFRバックグラウンド発現にもかかわらず、Puro-DHFR選択及び増幅がCHO-S-細胞において実現可能であることを実証した。
20個の無作為に選択したクローンを、遺伝子増幅について試験するために、ピューロマイシン（10μg/ml）の存在下、又はピューロマイシンと100nMのMTXの存在下のいずれかで4週間培養した。
次に、実施例1.4に記載のとおり、遺伝子コピー数を、形質転換細胞のプールについて測定した。図8に示されているように、遺伝子コピー数の増幅は、MTXを用いた選択に依存する。ピューロマイシンと100nMのMTXを用いて再選択した20個のクローンのうち3個で（丸く囲んだ）、ピューロマイシンだけでの選択と比較して、レポーターのコピー数が増強されており、遺伝子増幅の可能性を実証している。
2.4. Puro-DHFRはその蛍光発光を介して検出できる
図5は、Puro-DHFRをコードするp325ベクターでトランスフェクションされたCHO DXB11-F10細胞の蛍光メトトレキサートでの標識を示している。蛍光発光を、実施例1.6に記載のとおり検出した。非トランスフェクションDXB11-F10細胞は、トランスフェクションしたものより蛍光発光がかなり弱かった。加えて、MTX（50nM）の存在下のより高い選択圧が、puro-DHFR選択マーカーと、より強い細胞標識の発現増強につながる。
図5は、Puro-DHFRをコードするp325ベクターでトランスフェクションされたCHO DXB11-F10細胞の蛍光メトトレキサートでの標識を示している。蛍光発光を、実施例1.6に記載のとおり検出した。非トランスフェクションDXB11-F10細胞は、トランスフェクションしたものより蛍光発光がかなり弱かった。加えて、MTX（50nM）の存在下のより高い選択圧が、puro-DHFR選択マーカーと、より強い細胞標識の発現増強につながる。
図7は、Puro-DHFRをコードするp325ベクターでトランスフェクションされたCHO-S細胞の蛍光メトトレキサートでの標識を示している。（内因性DHFR遺伝子だけを発現する）CHO-S p279のプールにおける蛍光発光のバックグラウンド・レベルは、高レベルのMTXにて選択したCHO-S p325細胞のプールにおける蛍光発光に比べて、有意に低かった。
よって、Puro-DHFRは、DHFR＋（CHO-S）及びDHFR-（CHO-DXB11-F10）細胞の両方で検出できる。
よって、Puro-DHFRは、DHFR＋（CHO-S）及びDHFR-（CHO-DXB11-F10）細胞の両方で検出できる。
実施例3：Puro-DHFRは、注目のタンパク質を高レベルで発現する細胞についてスクリーニングするために有用な代用マーカーである
3.1. Puro-DHFRは、注目のタンパク質を高レベルで発現するクローンの単離を可能にする
DXB11-F10細胞に、Puro-DHFRをコードするp325ベクターでトランスフェクションした。このベクターは、レポーター遺伝子（注目のタンパク質）としてSEAPをさらに含んでなる。安定なプールを、MTXの存在下、又は不在在下で選択し、そして、SEAPの発現を、実施例1.3に記載のとおり計測した。図4に示されているように、MTXの存在下で選択したプールは、ピューロマイシンを用いて、又はHTだけの不存在下で選択したプールに比べて、約2倍高いSEAP発現を示した。
3.1. Puro-DHFRは、注目のタンパク質を高レベルで発現するクローンの単離を可能にする
DXB11-F10細胞に、Puro-DHFRをコードするp325ベクターでトランスフェクションした。このベクターは、レポーター遺伝子（注目のタンパク質）としてSEAPをさらに含んでなる。安定なプールを、MTXの存在下、又は不在在下で選択し、そして、SEAPの発現を、実施例1.3に記載のとおり計測した。図4に示されているように、MTXの存在下で選択したプールは、ピューロマイシンを用いて、又はHTだけの不存在下で選択したプールに比べて、約2倍高いSEAP発現を示した。
CHO-S-細胞に、Puro-DHFRをコードするp325ベクター、又はピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ及びSEAPをコードするp279ベクターのいずれかでトランスフェクションした。安定なプールを、ピューロマイシン、及び0、50、又は100nMのMTXの存在下で選択した。SEAPの発現を、両方とも7日目に、実施例1.3a及び実施例1.5に記載のとおり計測した。図6は、ピューロマイシン及びMTX（100nM）を用いたCHO-S p325の安定なプールの選択圧の増強が、タンパク質レベル（A）及びmRNAレベル（B）の両方で有意に高いSEAPタンパク質の発現につながった。
puro-DHFRマーカーは、ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼなどの従来技術のマーカーに比べて、より高いレベルでSEAPタンパク質を発現するクローンの単離を可能にする。
3.2. Puro-DHFRは、高速大量処理スクリーニングにおける代用マーカーとして使用できる
Puro-DHFRを、Puro-DHFRと注目のタンパク質の両方を発現するベクターを持つ候補クローンを樹立し、そして、スクリーニングするための選択及び代用マーカーとして使用する。トランスフェクション、選択、そして、増幅の後に、一次スクリーンを、高度な注目の遺伝子の発現も示すクローンを選択する確率が高い、蛍光発光（すなわち、高いPuro-DHFR発現）についてFACSによっておこなう。次に、二次スクリーンを、注目のタンパク質の発現について、できる限り、ELISAによって直接的に実施する。
Puro-DHFRを、Puro-DHFRと注目のタンパク質の両方を発現するベクターを持つ候補クローンを樹立し、そして、スクリーニングするための選択及び代用マーカーとして使用する。トランスフェクション、選択、そして、増幅の後に、一次スクリーンを、高度な注目の遺伝子の発現も示すクローンを選択する確率が高い、蛍光発光（すなわち、高いPuro-DHFR発現）についてFACSによっておこなう。次に、二次スクリーンを、注目のタンパク質の発現について、できる限り、ELISAによって直接的に実施する。
よって、高速大量処理スクリーニング（HTS）におけるPuro-DHFRの使用は、高発現性クローン選択するための同じ機会を維持することを可能にし、且つ、時間と資源の削減を可能にする。加えて、大きく異なる活性と起源を有する2種類の個々の酵素の融合が、驚いたことに、本明細書中にそれが記載されているとおり、Puro-DHFRにおいてそれらの機能が維持されていることに留意するのが重要である。実際、Puro-DHFRは、本当に、安定なトランスフェクションに関する選択性を提供するために、増幅可能な遺伝子としての役割を果たすように、そして、注目の遺伝子の高発現について候補クローンをスクリーニングするための代用マーカーとしての役割を果たすように使用できる。
Claims (35)
- 注目のタンパク質の発現についての細胞のスクリーニング方法であって：
a）（i）毒性化合物に対する耐性を付与するか、又は代謝的優位性を付与する断片に融合させたジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の機能的な断片を含んでなるキメラ・タンパク質；及び（ii）注目のタンパク質、をコードする発現ベクターで細胞をトランスフェクションするステップ；
b）上記毒性化合物に耐性であるか、又は上記代謝的優位性を獲得した細胞を選択するステップ；及び
c）DHFRに結合する蛍光化合物を用いて、ステップ（b）で選択された細胞の蛍光発光をアッセイするステップ、
を含んでなり、ここで、上記の毒性化合物に対する耐性を付与する断片はDHFR又はその断片ではない、方法。 - ステップ（c）を実施する前に、前記注目の組み換えタンパク質を増幅するステップをさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅ステップを、メトトレキサート（MTX）の存在下で細胞を培養することによって実施する、請求項2に記載の方法。
- 前記のDHFRに結合する蛍光化合物が、蛍光メトトレキサート（f-MTX）又は蛍光トリメトプリム（f-TMP）である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キメラ・タンパク質が、前記のDHFRの断片に融合させたピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼの断片を含んでなるPuro-DHFRポリペプチドであり、ここで、前記ポリペプチドが：
a）ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ活性；及び
b）ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性、
を示す、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼの断片が、ストレプトマイセス・アルボニガーに由来する、請求項5に記載の方法。
- 前記ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼの断片が、配列番号2の第1〜199アミノ酸から成る配列を含んでなる、請求項6に記載の方法。
- 前記DHFRの断片が、マウス起源のものである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DHFRの断片が、配列番号2の第2〜385アミノ酸から成る配列を含んでなる、請求項8に記載の方法。
- 前記の毒性化合物に対する耐性を付与する断片を、前記DHFRの断片の5’末端に融合させる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DHFRの断片を、前記の毒性化合物に対する耐性を付与する断片の5’末端に融合させる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キメラ・タンパク質が、配列番号2の配列を含んでなる、請求項1〜10のいずか1項に記載の方法。
- 前記注目のタンパク質が、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）、ヒト卵胞刺激ホルモン（FSH）、ヒト黄体形成ホルモン（r-hLH）、インターフェロンβ-1a（IFN-1a）、及びヒト成長ホルモン（rhGHm）から成る群から選択される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記蛍光発光を、蛍光顕微鏡又は蛍光励起セルソーター（FACS）のどちらかを使用して計測する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ（c）において、少なくとも20、50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、又は1,000,000個の細胞の蛍光発光をアッセイする、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- d）ステップ（c）において最高の蛍光活性を示した細胞の約1%〜約20%を選択するステップ、をさらに含んでなる、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップ（b）、（c）、及び（d）を、少なくとも2、3、5、又は10回繰り返すステップをさらに含んでなる、請求項16に記載の方法。
- e）最後のステップ（d）の終了時に選択された細胞において注目のタンパク質の発現レベルをアッセイするステップ、をさらに含んでなる、請求項16又は17に記載の方法。
- f）前記注目のタンパク質の最高の発現を示した細胞の約1%〜約20%を選択するステップ、をさらに含んでなる、請求項18に記載の方法。
- 注目のタンパク質を発現する細胞株の獲得方法であって：
a）請求項16、17、又は19に記載の方法に従って細胞をスクリーニングするステップ；及び
b）前記細胞から細胞株を樹立するステップ、
を含んでなる前記方法。 - 注目のタンパク質の生産方法であって：
a）前記注目のタンパク質の発現を可能にする条件下、請求項20に記載の方法に従って獲得した細胞株を培養するステップ；及び
b）前記注目のタンパク質を回収するステップ、
を含んでなる前記方法。 - 前記注目のタンパク質を精製するステップをさらに含んでなる、請求項21に記載の方法。
- 前記注目のタンパク質を医薬組成物中に処方するステップをさらに含んでなる、請求項22に記載の方法。
- マウスDHFRの断片に融合させたピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼの断片を含んでなるPuro-DHFRポリペプチドであって、以下の：
（i）ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ活性；及び
（ii）ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性、
を示す前記Puro-DHFRポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、配列番号2の配列を含んでなる、請求項24に記載のPuro-DHFRポリペプチド。
- 請求項24又は25に記載のPuro-DHFRポリペプチドをコードする核酸。
- 前記ポリペプチドが、配列番号1の配列を含んでなる、請求項26に記載の核酸。
- 請求項26又は27に記載の核酸を含んでなるベクター。
- 注目のタンパク質をコードする核酸をさらに含んでなる発現ベクターである、請求項28に記載のベクター。
- 少なくとも2つのプロモーターを含んでなり、その一方が前記Puro-DHFRポリペプチドの発現を駆動し、そして、もう一方が前記注目のタンパク質の発現を駆動する、請求項29に記載の発現ベクター。
- 前記Puro-DHFRポリペプチドをコードする核酸が、前記注目のタンパク質をコードする核酸と同じプロモーターによって駆動され、ここで、上記核酸の間に位置する、内部リボソーム侵入部位（IRES）又は2A配列を含んでなる、請求項29に記載の発現ベクター。
- 請求項26又は27に記載の核酸を含んでなる細胞。
- 請求項28〜32のいずれか1項に記載のベクターを含んでなる、請求項32に記載の細胞。
- ヒト細胞、CHO細胞、マウス細胞、及びハイブリドーマから成る群から選択される、請求項33に記載の細胞。
- 注目のタンパク質を生産するための、請求項32〜34のいずれか1項に記載の細胞の使用。
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