JP2003504059A - 発現ベクターと方法 - Google Patents

発現ベクターと方法

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Abstract

(57)【要約】 高レベルの所望のタンパク質を発現する組換え細胞を効果的に単離するためのベクターと方法が提供される。ベクターは、転写と翻訳の連関を至適化するように増幅性選択遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子及び所望の生成物をコード化する遺伝子を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は高レベルの発現細胞をスクリーニングし取得するための方法及びポリ
ヌクレオチド構築物に関する。
【０００２】 （発明の背景） 興味ある異種遺伝子を発現する安定した哺乳動物株化細胞の生産は、選択され
た株化細胞に異種遺伝子と通常は選択マーカー遺伝子（例えばネオマイシンＲ）
を形質移入する。異種遺伝子と選択遺伝子は単一のベクターにクローニングし、
そこから発現させるか、あるいは同時形質移入される二つの別のベクターから発
現させられる。形質移入の数日後に、細胞を選択薬剤（例えばネオ(neo)Ｒマー
カーに対してG418）を含む培地に配し、４−８週の間、選択下で培養される。薬
物耐性コロニー又は増殖巣が生じたら、これらの細胞を単離し、増殖させ、所望
の遺伝子産物の発現に対してスクリーニングする。対象遺伝子と選択マーカー遺
伝子が、選択マーカー遺伝子と生成物遺伝子の間に物理的関連がないために宿主
細胞に同時形質移入される別個のベクターにクローニングされる場合には、薬物
選択下での生存は宿主細胞中の対象遺伝子の安定な導入と発現の良好な予測指標
ではない。多くの非生産物を含む全ての形質移入細胞を蒔き培養するには多くの
時間と労力と、費用のかかる材料、例えば培地、血清及び薬物を消費する。典型
的には、非常に多数のコロニー又は増殖巣のスクリーニングには高レベルの対象
産物を発現する細胞を単離することが必要である。
【０００３】 遺伝子の形質転換と発現を評価するために幾つかの方法が使用されている。こ
れらの方法には、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ又はβ
ガラクトシダーゼのようなレポーター分子を使用するもの、あるいはβガラクト
シダーゼ、ホタルのルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼのコード配列を用い
て融合タンパク質を生成させるものが含まれる。これらの発現アッセイでは、細
胞を固定し、外因的に添加された基質又は補助因子と共にインキュベートし、細
胞試料を破壊することを必要とし、細胞生存度が維持される場合には使用が制限
される。大腸菌βギャル酵素の同時発現に基づく一つの方法では生細胞のフロー
サイトメトリー選別が可能である（Nolan等, PNAS USA 85:2603-2607 (1988)）
。しかし、細胞に蛍光発生基質を予め加えるために低浸透圧化処理が必要とされ
、選別前の特定の時間後に活性を阻害しなければならない。
【０００４】 レポーター分子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が出現したことにより、
異種遺伝子を発現する細胞をスクリーニングし同定する際に幾つかの利点がもた
らされた。ＧＦＰの同時発現により、更なる基質又は補助因子を必要とせず、ま
た細胞試料を破壊しないでリアルタイムの解析と形質移入体の選別が可能になる
。遺伝子導入をモニターするためのレポーター分子としてのＧＦＰの使用は様々
な刊行物に記載されている。米国特許第５４９１０８４号においてChalfie等は
、対象タンパク質をコードしている配列を含む一つのＤＮＡ分子と、ＧＦＰをコ
ードしている第二のＤＮＡ分子で細胞を同時形質移入し、ついでＧＦＰを発現す
る細胞を選択することを含む対象タンパク質を発現する細胞の選択方法を記載し
ている。Gubin等は、Biochem. Biophys. Res. Commun. 236: 347-350(1997)にお
いて選択成長条件がない状態でのＧＦＰの安定した発現を研究するためにネオと
ＧＦＰをコードするプラスミドでＣＨＯ細胞を形質移入することを記載している
。Mosser等, Biotechnique 22: 150-154 (1997)は、誘導性生成物を発現する細
胞をスクリーニングし選択する方法において、ＧＦＰと標的遺伝子をコードして
いるジシストロニック発現カセットを含むプラスミドを使用することを記載して
いる。標的遺伝子は調節可能なプロモーターに結合されている。プラスミドには
ウイルス内因性リボソーム認識部位（ＩＲＥＳ）が組み込まれており、ＧＦＰと
対象タンパク質の双方をコードするジシストロニックｍＲＮＡを発現できるよう
にしている。Mosserにより記載されたこのプラスミドは如何なる選択遺伝子も含
んでいない；選択遺伝子は、連続して形質移入されるか、ＧＦＰ／標的遺伝子コ
ード化プラスミドで同時形質移入される別のプラスミドに提供されている。この
発現系は対象遺伝子、薬物選択マーカー及びＧＦＰの間の空間的及び転写的関連
性を欠いている。Levenson等, Human Gene Therapy 9:1233-1236 (1998)は、複
数のクローニング部位が続く単一のプロモーターとウイルス内因性リボソーム認
識部位（ＩＲＥＳ）と選択マーカー遺伝子を含むレトロウイルスベクターを記載
している。使用される選択マーカーはＧ４１８、ピューロマイシン、ハイグロマ
イシンＢ、ヒスチジノールＤ、及びフェロマイシン（phelomycin）への耐性を付
与するものであり、ＧＦＰをまた含んでいた。
【０００５】 ピコルナウイルスファミリーのメンバーから由来する内因性リボソーム認識部
位を導入した初期のベクターで、ＩＲＥＳが生成物遺伝子と下流の選択マーカー
遺伝子の間に位置させられているものが記載されている（Pelletier等, Nature
334: 320-325 (1988); Jang等, J. Virol. 63: 1651-1660 (1989);及びDavies等
, J. Virol. 66: 1924-1932 (1992)を参照されたい）。 ＧＦＰは他の薬物耐性遺伝子産物に成功裡に融合されている（例えば、Bennet
t等, Biotechniques 24: 478-482 (1998); Primig等, Gene 215: 181-189 (1998
)を参照されたい）。Bennett等は形質移入された哺乳動物細胞に対する同定と選
択のための二作用性選択マーカーを産生するためにゼオマイシンＴＭ耐性遺伝子
（ＺｅｏＲ）に融合したＧＦＰを記載している。Primigはエンハンサーを研究す
るためにＧＦＰネオ・ベクターを記載している。 Lucas等は、Nucleic Acids Res. 24: 1774-1779 (1996)において、差次的なス
プライシングを経由しての単一の一次転写産物から、増幅性選択マーカー、ＤＨ
ＦＲ、及び対象のｃＤＮＡを発現するＣＨＯ細胞のための発現ベクターを記載し
ている。Crowleyは米国特許第５５６１０５３号において、イントロン内に位置
させられた増幅性選択遺伝子と、下流に生成物遺伝子を含むＤＮＡ作成物を用い
て高レベルの生産宿主細胞を選択する方法を記載している。増幅性選択遺伝子と
生成物遺伝子の両方が単一の転写調節領域の制御下にある。細胞は遺伝子増幅が
生じる条件で培養される。Lucas等とCrowleyのベクターと選択方法は、スクリー
ニングを容易にするＧＦＰを組み込んでいない。これらの報告と他の報告では、
ＧＦＰは、決して、対象タンパク質を発現させるために単一のベクターに増幅性
選択マーカーと組み合わされて使用されているものではない。 上記の考察から、高レベルの所望の生成物を発現する組換え体細胞の選択とス
クリーニングの効率を改善するより良い発現系を求める余地があることは明らか
である。対象遺伝子と選択マーカーを単一のベクターに組み込み、対象遺伝子を
増幅した組換え体宿主細胞を選択できるようにして、生産レベルを最適化するこ
とは有利なことであろう。更に、スクリーニング方法において非常に多数の細胞
を一度にスクリーニングできれば有利であり、労力が少なくて済む。本発明は従
来のベクターとスクリーニング方法の制限を解消し、以下の詳細な説明から明ら
かな更なる利点を提供する。
【０００６】 （発明の概要） 本発明は、高レベルの所望の生成物を発現する安定な真核生物細胞を同定し選
択するより効果的な方法を可能にするベクターを提供する。 本発明は、ａ）増幅性選択遺伝子；ｂ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子
；及びｃ）所望の生成物をコードする選択配列を挿入するための少なくとも１つ
のクローニングサイト含んでなり、該選択配列が増幅性選択遺伝子又はＧＦＰ遺
伝子の何れか、及びプロモーターに作用可能に結合されているポリヌクレオチド
を提供する。これらの三種の成分はポリヌクレオチド内の一又は複数の転写ユニ
ットから発現され得る。一実施態様では、ポリヌクレオチドは単一の転写ユニッ
ト内に三種の成分を含む。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは二つの転写ユ
ニットを含む。 好適な実施態様では、増幅性選択遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ
）及びグルタミン合成酵素をコードする遺伝子からなる群から選択される。ＤＨ
ＦＲ遺伝子が最も好適である。 本発明のポリヌクレオチドにおいて使用した好適なＧＦＰは野生型並びに突然
変異体ＧＦＰを包含する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは、野生型ＧＦＰ
より高い蛍光強度を示す突然変異体ＧＦＰをコードする。特定の突然変異体ＧＦ
Ｐは、オワンクラゲ（Aequorea victoria）由来の野生型タンパク質のアミノ酸
６５においてセリンがスレオニンに置換したＧＦＰ−Ｓ６５Ｔである。別の実施
態様では、ＧＦＰ遺伝子はＧＦＰ融合タンパク質をコードしている融合遺伝子と
してポリヌクレオチド中に存在している。一つの特定のＧＦＰ遺伝子融合物は、
ＤＨＦＲ−ＧＦＰ融合遺伝子として実証されている、ＧＦＰ遺伝子に増幅性選択
遺伝子が融合してなる。
【０００７】 一実施態様では、先の実施態様に係るポリヌクレオチドは、プロモーターと選
択配列との間にイントロンを更に含み、該イントロンが５'スプライシングドナ
ー部位と３'スプライシングアクセプター部位により定まる。本発明のベクター
での使用に好適なイントロンは少なくとも９５％のスプライシング効率を提供す
る効率的なイントロンである。一構築物は、イントロン内に位置させられた増幅
性選択−ＧＦＰ融合遺伝子を含み、融合遺伝子と選択配列の両方が互いにかつイ
ントロンの５'側に存在するプロモーターに作用可能に結合している。イントロ
ンを持つポリヌクレオチドは更に選択配列と増幅性選択−ＧＦＰ融合遺伝子の間
に内在性リボソーム認識部位（ＩＲＥＳ）を更に含み；選択配列と融合遺伝子の
双方が選択配列の５'側に存在する同じプロモーターに作用可能に結合し、イン
トロンは空にされている、つまり挿入物がない。 更に別の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターの下流に
（すなわち、３'側）イントロンとＩＲＥＳの両方を含み、選択配列は二つの成
分の間に位置している。このポリヌクレオチドはイントロンに増幅性選択遺伝子
を、ＩＲＥＳの３'側にＧＦＰ遺伝子を位置させて、又はその逆に、有しうる。
ここに記載される二つの転写ユニット構築物の全てにおいて、増幅性選択遺伝子
とＧＦＰ遺伝子を逆にできる、すなわちその位置を交換できることは明らかであ
る。
【０００８】 本発明は更に二つの転写ユニットを有するポリヌクレオチドを提供し、該ポリ
ヌクレオチドは、第一のプロモーターにイントロンと選択配列が続いてなる第一
の転写ユニットと；第二のプロモーターと該第二のプロモーターの３'側にイン
トロンを含む第二の転写ユニットを含む。第一の転写ユニットのイントロンは第
一のイントロンであり、第二の転写ユニットのイントロンは第二のイントロンで
あり；第一及び第二のイントロンの各々は、少なくとも９５％のスプライシング
効率を与える３'スプライシングアクセプター部位と５'スプライシングドナー部
位によって定まる。この実施態様では、増幅性選択遺伝子は第一の転写ユニット
のイントロンに位置させられ得、増幅性選択遺伝子と選択配列は共に第一のプロ
モーターに作用可能に結合される一方、ＧＦＰは空の第二のイントロンの３'に
位置させられ、第二の転写ユニットの第二のプロモーターに作用可能に結合され
ている。逆に、ＧＦＰ遺伝子を第一の転写ユニットのイントロンに、増幅性選択
遺伝子を第二の転写ユニットに位置させることができる。第二の転写ユニットは
更に第二のプロモーターに作用可能に結合された選択配列を含みうる。第一の転
写ユニットの選択配列は第一の選択配列であり、第二の転写ユニットの選択配列
は第二の選択配列であり、ここで、第二の選択配列がポリヌクレオチド内の第二
の所望の生成物をコードしている。この構成の構築物では、増幅性選択遺伝子を
第一のイントロンに位置させ、ＧＦＰ遺伝子を第二のイントロンに位置させるこ
とができる。あるいは、これらの二つの遺伝子の位置は逆にすることができる。 二つの転写ユニットを含むポリヌクレオチドの別の実施態様では、第二のイン
トロンに加えて、第二の転写ユニットは第二の選択配列の３'にＩＲＥＳを更に
含みうる。この構成の一ポリヌクレオチドでは、増幅性選択遺伝子が第一のイン
トロンに位置させられ、第一のプロモーターに作用可能に結合され、ＧＦＰ遺伝
子がＩＲＥＳの３’側に位置させられ、第二のプロモーターに作用可能に結合さ
れている。
【０００９】 二つの転写ユニットと二つのイントロンを含むポリヌクレオチドのまた更なる
実施態様では、増幅性選択遺伝子がＧＦＰ遺伝子に融合されて、第一のイントロ
ンに位置する融合遺伝子が生成される。第二のイントロンは、挿入物を持たない
か、第二のプロモーターに作用可能に結合される更なる選択マーカー遺伝子を含
みうる。別の構成では、第一のイントロンにＧＦＰ−増幅性選択遺伝子融合物を
配する代わりに、第一のイントロンは挿入物が空であるが、第一の転写ユニット
が第一の選択配列の３'側にＩＲＥＳを含み、融合遺伝子はこのＩＲＥＳの３'側
に位置し、第一のプロモーターに作用可能に結合されている。 本発明はまた第一及び第二の転写ユニットを有するポリヌクレオチドを提供し
、そこでは、各転写ユニットは５'から３'への順で：プロモーター、イントロン
、選択配列、ＩＲＥＳ及び増幅性選択遺伝子かＧＦＰ遺伝子の何れかを含み、増
幅性選択遺伝子とＧＦＰ遺伝子のそれぞれの一つのコピーのみがポリヌクレオチ
ドに存在し、それらは異なった転写ユニットから発現される。第一の転写ユニッ
トのＩＲＥＳは第一のＩＲＥＳと称され、第二の転写ユニットのＩＲＥＳは第二
のＩＲＥＳである。 二つの転写ユニットと各ユニットにプロモーターを含む先のポリヌクレオチド
では、同じ又は異なった型のプロモーターを第一プロモーター及び第二プロモー
ターとして用いることができる。転写ユニットにおけるプロモーターの一又は複
数が誘導性プロモーターであるポリヌクレオチドが提供される。好適な実施態様
では、転写ユニット又はユニット群のプロモーターはＣＭＶ ＩＥ又はＳＶ４０
プロモーターである。 好適な実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、サイトカイン、リンフォ
カイン、酵素、抗体、及びレセプターからなる群から選択されるタンパク質をコ
ードしている選択配列を含む。特定の実施態様では、選択配列は、ニューロノト
ロフィン−３、デオキシリボヌクレアーゼ、血管内皮成長因子、免疫グロブリン
及びＨｅｒ２細胞表面レセプタータンパク質をコードしている。
【００１０】 所望の生成物が多鎖（例えばヘテロダイマー）レセプターである場合、第一の
選択配列が多鎖レセプターの一つのポリペプチド鎖をコードし、第二の選択配列
がレセプターの第二のポリペプチド鎖をコードしうる。多鎖タンパク質が免疫グ
ロブリンである場合、第一の選択配列は免疫グロブリン重（Ｈ）鎖をコードし、
第二の選択配列が免疫グロブリン軽（Ｌ）鎖をコードし得る。好適な実施態様で
は、ポリヌクレオチドから発現される免疫グロブリンはヒト化免疫グロブリンで
ある。本発明は、選択配列が抗ＩｇＥ抗体をコードするポリヌクレオチドを提供
する。特定の一実施態様では、抗ＩｇＥは、図１３Ａ及び図１３Ｂにそれぞれ示
される配列番号１（Ｈ鎖）及び配列番号２（Ｌ鎖）のアミノ酸配列を有する全長
Ｅ２６ヒト化抗体である。 真核生物宿主細胞において複製される本発明のポリヌクレオチドがまた提供さ
れる。 本発明はまた本発明のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞で、細菌及び真
核生物宿主細胞の両方を提供する。好適な哺乳動物細胞はチャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞である。構築物に存在する増幅性選択遺伝子がＤＨＦＲ遺
伝子である場合、好適な宿主細胞はＤＨＦＲフェノタイプを有しているＣＨＯ細
胞である。本発明はまたニューロノトロフィン−３、デオキシリボヌクレアーゼ
、血管内皮成長因子、Ｈｅｒ２、及び抗ＩｇＥ抗体からなる群から選択される所
望の生成物を産生する宿主細胞を提供する。 本発明によってまた提供されるものは、本発明のポリヌクレオチドを収容する
容器を含むキットである。
【００１１】 本発明の他の側面は、本発明のポリヌクレオチドを適した真核生物細胞中に導
入し、得られた真核生物細胞を、所望の生成物を発現する条件下で培養し、所望
の生成物を回収することを含んでなる、所望の生成物の製造方法である。好まし
くは、所望の生成物は培地から回収される細胞から分泌される。 本発明の更に他の側面は、所望の生成物を発現する細胞を取得する方法におい
て、本発明のポリヌクレオチドを真核生物細胞の集団中に導入し、緑色蛍光遺伝
子及び増幅性選択遺伝子を発現し、これらの遺伝子の発現が所望の生成物をまた
発現する細胞を示す、細胞を単離することを含んでなる方法である。緑色蛍光タ
ンパク質を発現する細胞は、選別集団内の好ましくは最も明るい１％−１０％の
蛍光細胞である高蛍光細胞を選別しクローニングするために、蛍光活性化セルソ
ーター（ＦＡＣＳ）を使用して単離することができる。細胞は反復回の選別にか
けて、最も明るい蛍光細胞に富ませることができる。細胞は所定の期間、好まし
くは約２週間、選別とクローニングを実施する各ラウンドの間に培養する。好ま
しくは、細胞は所定の間、選択培地で培養される。好ましくは、高蛍光細胞は、
適切な増幅剤を含有する選択培地において培養され、増幅性選択遺伝子と選択配
列を少なくとも増幅させる。遺伝子増幅は培養において細胞に対して増幅剤の量
を増加させることにより達成できる。好適な実施態様では、増幅性選択遺伝子は
ＤＨＦＲであり、増幅剤がメトトレキセートである。増幅剤の存在下で培養する
ことにより、細胞を遺伝子増幅にかけた後、細胞を更に分析して、所望のタンパ
ク質の発現を確認し、高産生細胞を同定し単離する。一実施態様では、所望のタ
ンパク質の発現は、ＲＴ−ＰＣＲの技術を使用して、所望の生成物をコードして
いるＲＮＡについて細胞を分析することによって定量し、特定のＲＮＡの量が所
望の生成物の産生レベルを示す。
【００１２】 （好適な実施態様の説明） 本発明は、増幅性選択遺伝子、ＧＦＰ遺伝子及び所望の産物をコードする配列
を含むベクターであって、これらのエレメントが単一のベクター上に存在し、こ
れらのエレメントの一又は複数が、同一のプロモーターの転写コントロール下に
あるようなベクターを提供する。増幅性選択遺伝子と共にＧＦＰを発現すること
により、異種の遺伝子を高レベルで発現する真核細胞を選択し同定する、より効
率的な方法が提供される。増幅可能な選択マーカーは、安定に形質移入された哺
乳類細胞株の選択を可能ならしめるだけでなく、対象の異種性遺伝子の増幅をも
可能にする。後で示すように、本発明のベクター及び方法は、様々な特徴を持つ
タンパク質の高い発現レベルを達成した。これらのタンパク質には、酵素、抗体
、分泌タンパク質、細胞表面レセプターと同様に、読み枠が配列データベースか
ら調製されるか又はつなぎ合された未知の新規タンパク質も含まれる。従って、
本発明のベクターは、ゲノム機能構造解析のハイスループットなスクリーニング
においても有用である。 ＧＦＰ蛍光発光は、形質移入された細胞のより早くより迅速なスクリーニング
のための技術を提供する。ＧＦＰの小さなサイズは、ベクターの全長を小さく保
ち、高い形質導入、形質移入効率を可能にする。緑色蛍光タンパク質は、基質、
補因子、若しくは、蛍光発光のための酵素のいずれをも必要とせず、リアルタイ
ムで検出可能である点において特徴を有する。細胞内ＧＦＰの検出には、近紫外
光又は青色光による照射のみが必要である。ＧＦＰは、何ら染色技術を必要とし
ないため、一個の細胞中での遺伝子発現をモニターすることおいて、従来の酵素
及び抗体に基づく方法よりも優れた代替となる。ＧＦＰの発現は、細胞の生育及
び機能を妨げることはないようである。ＧＦＰを発現する細胞は、蛍光発色セル
ソーターにより分離することができる。FACSは、2,000細胞/秒以上、約3,000-10
,000細胞/秒を選別することが可能であり、高発現クローンを見つけるために多
数の細胞をスクリーニングすることが可能となる。これにより、仕事量を著しく
減少させ、所望のタンパク質に対するエライザが利用できない場合、高発現クロ
ーンを得ることが可能となる。
【００１３】 転写の場合と同様に、翻訳における選択可能なマーカーと対象の遺伝子との間
のより近接した空間的連関が、選択圧の下、両遺伝子の共増幅の可能性を亢進す
るであろうと考えられていた。しかしながら、統合された発現ベクターと、対象
の生産遺伝子とＧＦＰレポーター遺伝子のような増幅可能な遺伝子との間の転写
における連関の一体性が、当初、予測できなかった。対象の遺伝子及び/又はＧ
ＦＰ遺伝子は、以前DHFR遺伝子について報告されたように、増幅の間に欠失され
る可能性があった（Kaufman等, Mol. Cell. Biol. 12:1069-1076 (1981)；Kufma
n及びSharp, J.Mol.Biol. 159:601-621 (1982)）。驚くべきことに、実施例で示
されるように、本発明におけるポリヌクレオチドを使用することで、所望のタン
パク質の発現（RNAと産物の定量による）とＧＦＰ蛍光発光の間において優れた
相関性が示され、２つの連関した転写ユニットの優れた共発現効率と、増幅中に
おける遺伝子の見かけ上の損失のないことが示された。 また、本発明は、FACSを用いたＧＦＰ蛍光強度に従って細胞を選別すると、高
発現クローンを得るチャンスが増大することを示した。実際、手動でランダムに
144クローンを抽出し、エライザでスクリーニングするよりも、FACS選別によっ
て、より高産生なクローンが得られた（図１２）。FACS選別は、発現が困難な分
子の高発現クローンを得るために特に有用であろう。また、ここに示す実験は、
FACS選別により得られるクローンがより高発現のクローンを得るためにMTXを用
いて増幅されることを示す。 さらに、所望タンパク質のRNA量がタンパク質の定量値と非常によく相関して
おり、従って、高発現クローンは、高い蛍光強度を示すクローンに存在する所望
のタンパク質のRNA量を測定することにより得ることができる。これは、機能未
知の分泌タンパク質がDNA配列データベースから発現される場合、生物学的活性
についてスクリーニングするために非常に有用である。
【００１４】 定義 ここで用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、非天然に生じ、組換体
として産生され、いずれかの長さを持つヌクレオチドのポリマー型であって、リ
ボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかであり、又はその類似
体を示す。この用語は分子の一次構造を意味し、よって二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ
、並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを含む。これはまたメチル化及び／又はキャッ
プポリヌクレオチドのような修飾されたポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオ
チドは単離体でも、又は他の核酸分子、例えば発現ベクターもしくは真核生物宿
主細胞の染色体に組み込まれうる。ポリヌクレオチドは自己再生プラスミドを含
む。「構築物（コンストラクト）」及び「ベクター」という用語はここでの「ポ
リヌクレオチド」と置き換え可能に使用される。ベクターにはシャトルベクター
と発現ベクターが含まれる。典型的には、プラスミド構築物はまた複製起点（例
えばＣｏｌＥ１複製起点）と選択マーカー（例えば、アンピシリン又はテトラサ
イクリン耐性）を細菌中でのプラスミドの複製と選択のためにそれぞれ含む。ポ
リヌクレオチド又は構築物は発現ベクターを含むが、そうでなければならないも
のではない「発現ベクター」は宿主細胞中での少なくとも増幅性選択遺伝子、Ｇ
ＦＰ遺伝子及び選択配列の発現のために必要な調節エレメントを含む構築物を意
味する。
【００１５】 ここで用いられるところの「蛍光タンパク質」とは、例えば蛍光顕微鏡又はフ
ローサイトメトリーによって、タンパク質の蛍光の検出を細胞内的に可能にする
のに十分な蛍光を発するあらゆるタンパク質を意味する。好ましくは、蛍光タン
パク質を発現する宿主細胞は蛍光発色セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用して検出
することができる。蛍光タンパク質の例には、腔腸動物亜門刺胞動物由来の緑色
、シアン色、黄色並びに他の蛍光タンパク質が含まれる。蛍光タンパク質コード
化配列は未変性（野生型）遺伝子、又は遺伝子操作によるような合成的に調製さ
れた遺伝子の変異体でありうる。好適な蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（
ＧＦＰ）で好ましくはオワンクラゲ（Aequorea victoria）由来のものである。
一実施態様では、クラゲ(Aequorea)ＧＦＰ突然変異体Ｓ６５Ｔ（以下に記載）が
使用される。 二種の良く特徴づけられたＧＦＰはクラゲAequorea victoriaと、ウミシイタ
ケRenilla reniformis由来のものである。Aequorea及びRenillaＧＦＰはそれぞ
れ別の一次発光タンパク質からの青色化学発光を緑色蛍光に変える。AequoreaＧ
ＦＰは２３８アミノ酸残基のタンパク質である。このタンパク質は青色光で最大
に励起され、最大吸光度ピークが３９５ｎｍにあり、より小さなピークが４７５
ｎｍにあり、５０８−５０９ｎｍで緑色光を発する。精製された成熟タンパク質
は高度に安定であり、蛍光を６５℃、ｐＨ１１、１％ＳＤＳ又は６Ｍ塩化グアニ
ジウムまで残し、長い時間の間、殆どのプロテアーゼに耐性を有する。Renilla
ＧＦＰはAequoreaＧＦＰよりも更に安定したタンパク質であり；４９８ｎｍに単
一の吸収ピークを示し、５０９ｎｍに発光ピークを持つ。Aequorea及びRenilla
ＧＦＰの性質の概説については、例えばChalfie等, Science 263: 802-805 (199
4);及びCubitt等, Trends Biochem. Sci. 20: 448-455 (1995)を参照されたい。
ＧＦＰは形質転換された原核生物及び真核生物細胞の両方で蛍光を発することが
できる。
【００１６】 本発明は蛍光発色セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いるフローサイトメトリーに
より又は蛍光顕微鏡により細胞内ＧＦＰの蛍光の検出を可能にするのに十分な蛍
光を発するＧＦＰの任意の型又は誘導体を使用することを包含する。本発明にお
いて使用できるＧＦＰには、野生型並びに天然に生じるか（自然突然変異）又は
天然に生じるか野生型のタンパク質の遺伝子操作された突然変異体及び変異体、
切断型及び断片、機能的等価物、誘導体、ホモログ及び融合体が含まれる。ＧＦ
Ｐの発色団（おおよそアミノ酸６４−６８）中と回りの突然変異の範囲は記述さ
れている。これらの突然変異はＧＦＰのスペクトル特性、発色団精製の速度、吸
光係数、及び物理的特性が変更する結果となる。ＧＦＰのこれらの形態は野生型
ＧＦＰと比較して励起及び発光スペクトルを変えるか、より大なる安定性を示し
うる。変異体ＧＦＰは、野生型タンパク質、例えば青色、黄色又は赤色にシフト
した蛍光タンパク質より増加した強度の又は可視的に区別される色彩の蛍光を発
し得、ＤＮＡは市販されているこれら遺伝子を含む（Clontech, Palo Alto, Ca;
Quantum Biotechnologies, Montreal, Canada）。和製型ＧＦＰに対して蛍光が
増加した突然変異体は更に感度の高い検出系を提供する。突然変異体は未変性タ
ンパク質の２つのピーク特性に対して単一の励起ピークを有し、光退色に耐性が
あり、又は発色団に対してより迅速な酸化を示しうる。例えば、Ｓｅｒ６５がＴ
ｈｒによって置換されているAequoreaＧＦＰ変異体Ｓ６５Ｔ（Heim等 Nature 37
3: 663-664 (1995)）が、野生型より６倍強い明るさ、より速い発色団の形成、
光異性化を受けないこと及び非常に遅い光退色という点で野生型ＧＦＰに対して
幾つかの利点を提供する。Ｓｅｒ６５のＴｈｒ又はＣｙｓへの修飾により、〜５
０９ｎｍで最大に発光し続けるが、４８８ｎｍと４７３ｎｍにそれぞれ赤色にシ
フトした単一の励起ピークを有しているＧＦＰが得られる。これは、ＦＩＴＣに
対して蛍光顕微鏡と蛍光発色セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて、既に使用され
たものとより同じような励起ピークをもたらす点で幾つかの利点を有している。
更に、これらの突然変異体の発色団形成は更に迅速で、吸光係数は、より強い蛍
光シグナルを生じるｗｔＧＦＰ（野生型ＧＦＰ）のものよりも高い（上掲のHeim
等, 1995）。他のＧＦＰ変異体は哺乳動物細胞での発現に対して至適化され、並
びに元のＧＦＰ遺伝子よりも大なる蛍光を示すコドンを有している（下記のBenn
et (1998); Crameri等, Nature Biotechnol. 14:315-319 (1996)を参照されたい
）。哺乳動物細胞での高レベルの発現に好適なコドン使用頻度を変更する塩基置
換を含むＧＦＰの「ヒト化」又は他の修飾型が本発明の構築物での使用に適して
いる（例えば、Hauswirth等, 米国特許第５８７４３０４号；Haas等、米国特許
第５７９５７３７号を参照）。蛍光を発し白色光での照明により検出されるＧＦ
Ｐ変異体は国際公開９８２１３５５号に記載されている。更に他の変異体ＧＦＰ
が米国特許第５８０４３８７号（Cormack等）及び国際公開第９７４２３２０号
（Gaitanaris等）に記載されている。ＧＦＰは融合タンパク質として機能的に発
現されている（例えばMarshall等 Neuron 14: 211-215 (1995); Olson等, J. Ce
ll. Biol. 130:639-650 (1995); Bennett等, Biotechniques 24: 478-482 (1998
)を参照されたい）。本発明において有用なＧＦＰ融合タンパク質には、個々の
タンパク質の増幅性選択と蛍光の組み合わせた性質をもたらす増幅性選択マーカ
ーとの融合体が含まれる。そのような融合タンパク質の例はＧＦＰ−ＤＨＦＲ融
合タンパク質である。従って、ここで用いられるところの「緑色蛍光タンパク質
遺伝子」は先のポリペプチドの任意のものをコードしている配列を含む。
【００１７】 「選択マーカー遺伝子」は、対応する選択薬剤の存在下で、遺伝子を有する細
胞を特異的に選択できるようにする遺伝子である。例を挙げると、抗生物質耐性
遺伝子は、形質転換した宿主細胞を対応する抗生物質の存在下で陽性として選択
することを可能にする陽性選択マーカー遺伝子として使用することができ；非形
質転換宿主細胞は選択培養条件下で増殖又は生存することはできないであろう。
選択マーカーは、陽性、陰性又は二作用性でありうる。陽性選択マーカーにより
マーカーを有する細胞の選択が可能になる一方、陰性選択マーカーによりマーカ
ーを有する細胞を選択的に排除することが可能になる。典型的には、選択マーカ
ーは、薬物に耐性を付与し、又は宿主細胞における代謝又は異化作用欠陥を補償
する。増幅性選択遺伝子を含むここで使用される選択マーカー遺伝子は、コード
化産物が選択特性を保持する限り、天然選択マーカー遺伝子の変異体、断片、機
能性等価物、誘導体、ホモログ及び融合体を含む。有用な誘導体は一般には選択
特性に関連する選択マーカーの領域又はドメインにおいて実質的な配列類似性（
アミノ酸レベル）を有している。二機能性（すなわち、陽性／陰性）マーカー（
例えば１９９２年５月２９日に公開された国際公開９２／０８７９６号及び１９
９４年１２月８日に公開された国際公開９４／２８１４３号で、ここに出典明示
により取り込まれるものを参照されたい）様々なマーカー遺伝子が記載されてい
る。例えば、真核生物細胞に一般的に使用される選択遺伝子には、アミノグリコ
シドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ハイグロマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ（ｈｙｇ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（
ｔｋ）、グルタミン合成酵素、アスパラギン合成酵素、及びネオマイシン（Ｇ４
１８）、ピューロマイシン、ヒスチジノールＤ、ブレオマイシン及びフレオマイ
シン（phleomycin）に対する遺伝子が含まれる。
【００１８】 「増幅性選択遺伝子」は上述の選択マーカー遺伝子の性質を有しているが、適
切な条件下で更に増幅することができる（すなわち、染色体内又は染色体外形態
で生存する遺伝子の更なるコピーが産生される）。増幅性選択遺伝子は通常その
条件下で真核生物細胞の成長に必要とされる酵素をコードする。例えば、増幅性
選択遺伝子は、それが形質移入された宿主細胞が選択薬剤メトトレキセート（Ｍ
ｔｘ）の存在下で成長させられるとき遺伝子が増幅されるＤＨＦＲ（ジヒドロ葉
酸還元酵素）をコードしうる。以下の表１の例示的な選択遺伝子はまた増幅性選
択遺伝子である。一般には増幅性遺伝子であると考えられない選択遺伝子の例は
ネオマイシン耐性遺伝子である（上掲のCeplo等）。 選択と続く増幅を可能にする遺伝子マーカーと共になされる遺伝子のコトラン
スフェクションに関する参考文献としては、例えばKaufman, Genetic Engineeri
ng, J. Setlow編(Plenum Press, New York), Vol.9 (1987)；Kaufman及びSharp,
J. Mo. Biol., 159:601 (1982)；Ringold等, J. Mol. Appl. Genet., 1:165-17
5 (1981)；Kaufman等, Nol. Cell Biol., 5:1750-1759 (1985)；Kaetzel及びNil
son, J. Biol. Chem., 263:6244-6251 (1988)；Hung等, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA, 83:261-264 (1986)；Kaufman等, EMBO J., 6:87-93 (1987)；Johnston及
びKucey, Science, 242:1551-1554 (1988)；Urlaub等, Cell, 33:405-412 (1983
)を参照されたい。表１に挙げられた増幅性選択遺伝子の概説については、Kaufm
an, Methods in Enzymology, 185:537-566 (1990)を参照されたい。
【００１９】
【００２０】 好ましい増幅性選択遺伝子はプリンの生合成に必要なジヒドロ葉酸還元酵素（
ＤＨＦＲ）をコードしている遺伝子である。ＤＨＦＲ遺伝子を欠く細胞はプリン
を欠く培地では成長しない。従って、ＤＨＦＲ遺伝子はプリンを欠く培地で成長
する細胞のような遺伝子を選択し増幅するドミナント選択マーカーとして有用で
ある。ＤＨＦＲと組み合わせて使用される選択剤はメトトレキセート（Ｍｔｘ）
である。 ここで使用される「選択培地」とは、選択遺伝子を含み発現する真核生物細胞
を成長させるのに使用される栄養液を意味し、よって「選択剤」を含む。Ｈａｍ
のＦ１０（Sigma）、最小必須培地（[MEM], Sigma）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sig
ma）及びダルベッコの変成イーグル培地（[DMEM], Sigma）のような市販の培地
が例示的な栄養液である。また、その全ての開示が出典明示によりここに取り込
まれるHam及びWallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes及びSato, Anal. Bi
ochem., 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同第４６５７８６６号
；同第４９２７７６２号；又は同第４５６０６５５号；国際公開第９０／０３４
３０号、同第８７／００１９５号；米国再発行特許第３０９８５号；又は米国特
許第５１２２４６９号に記載された培地の何れも培養培地として使用できる。こ
れらの何れの培地にも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、
トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシ
ウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオ
シド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンTM薬)
、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義
される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することが
できる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含
むことができる。培地にはしばしば血清、例えば胎児ウシ又はウマ血清がホルモ
ン、成長因子及び他のエレメントの供給源として補填される。当業者に知られて
いる任意の他の必要なサプリメントを適切な濃度で含ませることもまたできる。
【００２１】 「選択剤」という用語は特定の選択遺伝子が欠乏している宿主細胞の成長又は
生存を妨げる物質を意味する。選択剤の例は上の表１に示される。選択剤は好ま
しくは選択遺伝子のコピーを増幅させるための薬剤としてここでの目的のために
定義した「増幅剤」を含む。選択剤はまた依存する選択マーカー遺伝子が増幅性
選択マーカーである場合は増幅剤とできる。例えばＭｔｘはＤＨＦＲ遺伝子の増
幅に有用な選択剤である。増幅剤の例については表１を参照されたい。 「選択配列」又は「生成物遺伝子」又は「対象遺伝子」はここでは同じ意味を
有し、対象生成物をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を意味する。
典型的には、選択配列は、長さにして1-20キロベースの範囲にあり、好適には、
1-5キロベースの範囲にある。対象の遺伝子は、宿主細胞に対して異種遺伝子で
ある。選択配列は全長か、切断遺伝子、融合体又はタグ遺伝子であり得、またcD
NA、ゲノムDNA、又はDNA断片であり得、好適にはcDNAである。選択配列は、天然
配列、すなわち天然に生じる型（群）であり得、あるいは所望に応じて突然変異
又は他の修飾を受け得る。これらの修飾にはヒト化、宿主細胞においてコドン使
用頻度を至適化するコドン置換又はタギングが含まれる。選択配列は分泌された
、細胞質内、核、膜結合又は細胞表面ポリペプチドをコードし得る。分泌配列の
発現は宿主細胞に有害であってはならず、又は細胞の生存性を保証しなければな
らない。「所望の生成物」には、タンパク質、ポリペプチド及びその断片、ペプ
チド、及びアンチセンスＲＮＡで、分泌された真核生物宿主細胞中で発現され得
るものが含まれる。タンパク質はホルモン、サイトカイン、及びリンホカイン、
抗体、レセプター、接着分子、酵素、及びその断片でありうる。所望のタンパク
質はアゴニスト又はアンタゴニストとなり得、及び／又は治療的又は診断用用途
を有しうる。本ポリヌクレオチドは哺乳動物由来の所望の生成物の発現に対して
最も適しているが、微生物及び酵母生成物もまた生産しうる。
【００２２】 「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は任意の長さのアミノ酸のポ
リマーを指すために交換可能に使用される。これらの用語はまたグリコシル化、
アセチル化及びリン酸化を含む反応を通しての翻訳後修飾されるタンパク質を含
む。「ペプチド」という用語は一般に約３０アミノ酸未満の短いひと配列のアミ
ノ酸を意味する。 ここで用いられるところの「抗体」又は「免疫グロブリン」という用語は、モ
ノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体(例えば、二重特異的
抗体)、ｓＦｖ二量体を含む一本鎖抗体、それらが所望の生物活性を示す限りは
抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ）及びダイアボディを包
含している。非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリ
ンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその
断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ)２又は抗体の他の抗原結合サブ
配列）である。大部分において、ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（
ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性及び機能を有するマウス、ラット
又はウサギのような非ヒト種抗体(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基によって置換
されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫
グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換され
ている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくは移入されたＣＤ
Ｒ又はフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾
は抗体の性能を更に洗練し至適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、
全てあるいは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し
、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列
のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全て
を含む。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的
にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細につ
いては、Jones等, Nature 31, 522-525 (1986); Reichmann等, Nature 332, 323
-329 (1988)及びOresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2,593-596 (1992)を参照さ
れたい。
【００２３】 ここで使用される「調節エレメント」は、ＧＦＰ遺伝子、増幅性選択遺伝子及
び対象の選択配列のポリペプチドへの転写及び翻訳に必要な、シスで存在するヌ
クレオチド配列を意味する。転写調節エレメントは通常発現される遺伝子配列の
５'側にプロモーター、転写開始及び終結部位及びポリアデニル化シグナル配列
を含む。「転写開始部位」という用語は一次転写産物、つまりｍＲＮＡ前駆体中
に組み込まれた第一の核酸に対応する構築物における核酸を意味する；転写開始
部位はプロモーター配列にオーバーラップしうる。「転写終結部位」という用語
は、通常は３'末端に表されるヌクレオチド配列又は転写される配列の伸展で、
ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させるものを意味する。ポリアデニル化シグナ
ル配列又はポリＡ付加シグナルは真核生物ｍＲＮＡの３'末端の特定の部位での
切断のためのシグナル及び切断された３'末端への約１００−２００アデニンヌ
クレオチド（ポリＡテイル）の配列の核における転写後付加を提供する。ポリア
デニル化シグナル配列は切断部位から約１０−３０ヌクレオチド上流に位置した
配列AATAAA、プラス下流配列を含む。 プロモーターは構成的又は誘導的でありうる。エンハンサー（すなわち、転写
を増加させるようにプロモーターに作用するシス作動性ＤＮＡエレメント）はプ
ロモーターだけで得られる発現のレベルを増加させるためにプロモーターと組み
合わせて機能することが必要であり、転写調節エレメントとして含まれうる。し
ばしば、プロモーターを含むポリヌクレオチドセグメントはエンハンサー配列も
同様に含む（例えば、ＣＭＶ ＩＥ Ｐ／Ｅ；Ｓｖ４０ Ｐ／Ｅ；ＭＰＳＶ Ｐ／Ｅ
）。スプライシング転写産物を得るのに必要な場合、スプライシングシグナルが
含められうる。分泌ポリペプチドを製造するには、選択配列は一般に、ポリペプ
チドが分泌のために通過するＥＲ膜まで及びＥＲ膜を新規に合成されたポリペプ
チドを通過させるリーダーペプチドをコードするシグナル配列を含む。リーダー
ペプチドは分泌タンパク質のアミノ末端に普遍的ではないがしばしばあり、タン
パク質がＥＲ膜を通過した後シグナルペプチダーゼにより切断される。天然のシ
グナル配列が存在しない場合は、異種性シグナル配列は分泌配列に融合されうる
。数多くのシグナル配列が従来から知られており、GenBank及びＥＭＢＬのよう
な配列データベースから入手できる。転写調節エレメントは発現される各個のポ
リペプチドのための転写開始部位（ＡＵＧ）、停止コドン及びポリＡシグナルを
含む。内因性リボソーム認識部位（ＩＲＥＳ）がある構築物に含まれる。ＩＲＥ
Ｓは以下に定義される。
【００２４】 「転写ユニット」は転写される一又は複数の遺伝子を含む構築物内の領域を定
め、そこでは、そのセグメント内に含まれる遺伝子が作用可能に互いに結合し、
単一のプロモーターから転写され、その結果、異なった遺伝子は少なくとも転写
的に結合されている。一以上のタンパク質又は生成物を転写し各転写ユニットか
ら発現されうる。各転写ユニットはユニット内に含まれている任意の選択配列、
ＧＦＰ及び増幅性選択マーカー遺伝子の転写と翻訳に必要な調節エレメント、並
びに同じ転写ユニット内でこれらの３つの成分の一つに作用可能に結合しうる任
意の更なる選択マーカー遺伝子を含む。例として、図６は二つの別の転写ユニッ
トを含む構築物を示している；ＤＨＦＲ及び所望のタンパク質は第一の転写ユニ
ットから発現され、ＧＦＰは第二の転写ユニットから発現される。第一の転写ユ
ニットでは、ＤＨＦＲ遺伝子及び所望の生成物をコードする選択配列が互いにま
たＳＶ４０プロモーターに作用可能に結合している。転写はＤＨＦＲ及び選択配
列を通過してポリＡシグナルまで進み、両方の遺伝子をコードする全長一次転写
産物をつくる。転写ユニット内の遺伝子の各々はそれ自身の転写開始コドンＡＴ
Ｇを有している。第二の転写ユニットはＧＦＰ遺伝子とＧＦＰの発現に必要な調
節エレメントを含む。ＧＦＰ遺伝子は構築物内において第二のＳＶ４０プロモー
ターから独立に転写される。各転写ユニットはそれ自身のプロモーターを含むが
、プロモーターのタイプは同じか異なっていてもよい。図２に示した実施例では
、第一及び第二の転写ユニットは同じタイプのプロモーターを使用しており、こ
の場合はＳＶ４０プロモーターである。
【００２５】 「プロモーター」はそれが作用可能に結合している遺伝子又は配列の転写を制
御するポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼの
結合及び転写開始のためのシグナルを含む。使用されるプロモーターは、選択配
列の発現が考えられている宿主細胞の細胞型において機能的である。様々な異な
る供給源由来の構成的、誘導性及び抑制性プロモーターを含む多数のプロモータ
ーが当該分野でよく知られており（またGenBankのようなデータベースで同定さ
れ）、（例えばＡＴＣＣのような寄託所並びに他の商業的又は個人的供給源由来
の）クローン化ポリヌクレオチドとして又はその中で利用できる。誘導性プロモ
ーターでは、プロモーターの活性はシグナルに応答して増加又は減少する。例え
ば、ｃ−ｆｏｓプロモーターは細胞表面のそのレセプターへの成長ホルモンの結
合時に特異的に活性化される。テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）
を含むテトラサイクリン（ｔｅｔ）プロモーターはテトラサイクリン調節トラン
ス活性化タンパク質（ｔＴＡ）により誘導できる。ｔＴＡのｔｅｔＯへの結合は
ｔｅｔの存在下で阻害される（上掲のMosser等 (1997)）。ｊｕｎ、ｆｏｓ及び
メタロチオネイン及び熱ショックプロモーターを含む他の誘導性プロモーターに
対しては、例えば上掲のSambrook等；及びCurr. Opi. Biotech. 5:516-520 (199
4)のGossen等、Inducible gene expression systems for higher eukaryotic ce
llsを参照されたい。高レベルの発現のための強力なプロモーターとして同定さ
れた真核細胞プロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウイルス主要
後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイ
ルス末端反復配列及びヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）
である。
【００２６】 ここで使用されるところの「エンハンサー」は、それが作用可能に結合した遺
伝子又はコード配列の転写を亢進するポリヌクレオチド配列を意味する。プロモ
ーターとは異なり、エンハンサーは相対的な配向と位置が独立であり、イントロ
ン内において(Banerji等, Cell, 33:729 [1983])並びにそれ自身のコード配列内
(Osborne等, Mol. Cell Bio., 4:1293 [1984])において、転写ユニットに対して
５'（Lainins等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 [1981])又は３'(Lusky
等, Mol. Cell Bio., 3:1108 [1983])に見いだされている。従って、エンハンサ
ーは、実際にはエンハンサーがプロモーターと物理的かつ機能的にオーバーラッ
プするけれども、転写開始部位の上流又は下流に、あるいはプロモーターからか
なりの距離に位置しうる。様々な異なった供給源からの多数のエンハンサーが従
来からよく知られており（またGenBankのようなデータベースで同定され）、（
例えばＡＴＣＣのような寄託所並びに他の商業的又は個人的供給源由来の）クロ
ーン化ポリヌクレオチドとして又はその中で利用できる。プロモーター配列（例
えば一般的に使用されているＣＭＶプロモーター）を含む多数のポリヌクレオチ
ドがまたエンハンサー配列を含む。例えば、上に列挙した強力なプロモーターの
全てが強力なエンハンサーを含んでいる。Bendig, Genetic Engineering, 7:91
(Academic Press, 1988)。
【００２７】 ここで使用されている「イントロン」という用語は、スプライシング方法によ
り新たに転写されたｍＲＮＡ前駆体から除かれる多くの真核生物遺伝子内に通常
存在する可変長さの非コード化ヌクレオチド配列を意味する。一般には、スプラ
イシング方法には、イントロンの５'及び３'末端が正しく切断され、ｍＲＮＡの
得られた末端が正確に結合され、タンパク合成のための正しい読み取り枠を持つ
成熟ｍＲＮＡがつくられる。この発明の構築物において有用なイントロンは一般
には、選択マーカー遺伝子（イントロンノンの末端又は中にあってクローニング
された選択マーカー遺伝子）の発現の十分な未スプライシング転写産物をまた提
供しながら所望の生成物の発現に転用される殆どの転写産物に得られるスプライ
シング効率によって特徴付けされる効果的なイントロンである。効果的なイント
ロンは好ましくは約８０から９９％、好ましくは約９０〜９９％のスプライシン
グ効率を有している。イントロンのスプライシング効率は、転写産物に対する適
切なプローブを用いる、定量ＰＣＲ又はノーザンブロット解析によるような従来
から知られている方法によって、イントロンを含む全長のスプライシングされて
いない転写産物に対してスプライシング転写産物を定量することによって即座に
測定される。例えば上掲のSambrook等と他の一般的なクローニングマニュアルを
参照されたい。逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を、スプライシ
ングされたｍＲＮＡ転写産物とスプライシングされていないものの混合物を含む
ＲＮＡ試料を分析するために使用できる。例えば、イントロンをスパンするよう
に設計された蛍光タグプライマーがスプライシングされた標的とスプライシング
されていない標的の両方を増幅するために使用される。ついで、得られた増幅産
物をゲル電気泳動法により分離し、適切なバンドの蛍光発光を測定することによ
り定量する。ＲＮＡ試料中に存在するスプライシングされた転写産物とスプライ
シングされていない転写産物の量を決定するために比較を行う。
【００２８】 イントロンは、イントロンの各末端に又はその近くにスプライシングとイント
ロンの除去に必要な高度に保存された配列を有している。ここで使用される「ス
プライシングドナー部位」又は「ＳＤ」又は「５'スプライシング部位」は、エ
キソンがイントロンの５'に核酸を含むイントロンの５'末端のエキソン−イント
ロン境界を直ぐに囲んでいる保存配列を意味する。「スプライシングアクセプタ
ー部位」又は「ＳＡ」又は「３'スプライシング部位」は、エキソンがイントロ
ンの３'に核酸を含むイントロンの３'末端のエキソン−イントロン境界を直ぐに
囲んでいる配列を意味する。「効率的な」イントロンは定量ＰＣＲによるような
従来から知られている方法により測定して、約８０から９９％、好ましくは９０
から９５％、より好ましくは少なくとも９５％の頻度でメッセンジャーＲＮＡ前
駆体のスプライシングを生じるスプライシングドナー部位とスプライシングアク
セプター部位を含む。多くのスプライシングドナー部位とスプライシングアクセ
プター部位が特徴付けられており、Ohshima等, J. Mol. Biol., 195:247-259 (1
987)がこれらの概説を提供する。効率的なスプライシングドナー配列の例には、
野生型（ＷＴ）ｒａｓスプライシングドナー配列及びGAC:GTAAGT配列が含まれる
。一つの好適なスプライシングドナー部位は「コンセンサススプライシングドナ
ー配列」であり、好適なスプライシングアクセプター部位は「コンセンサススプ
ライシングアクセプター配列」であり、これらのコンセンサス配列は進化的に高
度に保存されている。高等真核生物のｍＲＮＡのスプライシングドナー及びスプ
ライシングアクセプター部位の両方に対するコンセンサス配列は、Molecular Bi
ology of the Cell, ３版, Alberts等（編）, Garland Publishing, Inc., New
York, 1994の３７３頁、図１２−５３に示されている。５'スプライシングドナ
ー部位に対するコンセンサス配列はＣ／Ａ（Ｃ又はＡ）AG:GUAAGU（ここで、コ
ロンは切断部位とライゲーションを示す）。３'スプライシングアクセプター部
位はコンセンサス配列(U/C)１１NCAG:G内に生じる。他の効率的なスプライシン
グドナー及びアクセプター配列はスプライシングの効率を測定する技術を使用し
て即座に決定することができる。
【００２９】 「内因性リボソーム認識部位」又は「ＩＲＥＳ」はＩＲＥＳの５'の遺伝子か
ら独立して転写開始を機能的に促進し、二つのシストロン（オープンリーディン
グフレーム）を動物細胞中で単一の転写産物から翻訳することを可能にする。Ｉ
ＲＥＳは、その直ぐに下流の（下流はここでは３'と交換可能に使用される）オ
ープンリーディングフレームの翻訳のために独立のリボソーム認識部位を提供す
る。多シストロン性でありうる、すなわちｍＲＮＡから連続的に翻訳される幾つ
かの異なったポリペプチドをコードする細菌ＲＮＡと異なり、動物細胞の殆どの
ｍＲＮＡはモノシストロニックであり、ただ一つのタンパク質の合成をコードす
る。真核生物細胞中の多シストロン転写産物で、翻訳は５'の殆どの翻訳開始部
位から開始し、最初の停止コドンで終結し、転写産物がリボソームから放出され
、ｍＲＮＡの最初にコード化されたポリペプチドのみの翻訳が生じる。真核細胞
では、転写産物における第二又は次のオープンリーディングフレームに作用可能
に結合したＩＲＥＳを有する多シストロン転写産物により、オープンリーディン
グフレームの下流の連続的な翻訳が同じ転写産物によりコードされる二以上のポ
リペプチドをつくり出すようになる。ベクター構築物におけるＩＲＥＳエレメン
トの使用は過去に記載されており、例えば、Pelletier等, Nature 334: 30-325
(1988); Jang等, J. Virol. 63: 1651-1660 (1989); Davies等, J. Virol. 66:
1924-1932 (1992); Adam等, J. Virol. 65: 4985-4990(1991); Morgan等 Nucl.
Acids Res. 20: 1293-1299 (1992); Sugimoto等, Biotechnology 12: 694-698 (
1994); Ramesh等, Nucl. Acids Res. 24: 2697-27-00 (1996); 及び上掲のMosse
r等, (1997)）を参照されたい。
【００３０】 「作用可能に結合される」とは、二以上の成分の並列化を意味し、ここで、こ
のように記述される成分はその意図した形でそれらが機能するようにする関係に
ある。例えば、プロモーター及び／又はエンハンサーは、シスで作用して結合配
列を制御又は変調する場合、コード化配列に作用可能に結合している。一般には
、必須ではないが、「作用可能に結合している」ＤＮＡ配列は近接しており、二
つのタンパク質コード化領域を接合する必要がある場合又は分泌リーダーの場合
には、近接していて読み枠にある。しかし、作用可能に結合したプロモーターは
一般にはコード配列の上流に位置しているが、それは必ずしもそれと近接しては
いない。エンハンサーは近接している必要はない。エンハンサーは、エンハンサ
ーがコード化配列の転写を増加させる場合にコード配列に作用可能に結合されて
いる。作用可能に結合したエンハンサーは、コード配列の上流、内部又は下流で
、プロモーターからかなりの距離に位置しうる。ポリアデニル化部位は、転写が
コード配列を通ってポリアデニル化配列に進むようにそれがコード配列の下流端
に位置している場合、コード配列に作用可能に結合している。結合は、従来から
知られている組換え法、例えばＰＣＲ法を用い、アニーリングにより、又は簡便
な制限部位でのライゲーションにより、達成される。簡便な制限部位が存在しな
い場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプター
あるいはリンカーが使用される。
【００３１】 ここで使用される「発現」という用語は、宿主細胞内で生じる転写又は翻訳を
意味する。宿主細胞での所望の生成物の発現レベルは、細胞に存在している対応
するｍＲＮＡの量か、又は選択配列によりコードされる所望生成物の量の何れか
に基づいて決定されうる。例えば、選択配列から転写されたｍＲＮＡはＰＣＲに
より又はノーザンハイブリッド形成（Sambrook等, Molecular Cloning: A Labor
atory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）により定量する
ことができる。選択配列によりコードされるタンパク質は、様々な方法、例えば
エライザにより、タンパク質の生物活性をアッセイすることにより、又はそのよ
うな活性と異なるアッセイ、例えばタンパク質を認識し反応する抗体を用いて、
ウェスタンブロッティング又はラジオイムノアッセイを使用することで、定量す
ることができる。上掲のSambrook等,1989を参照せよ。 「宿主細胞」は本発明のポリヌクレオチドが導入される細胞を意味する。宿主
細胞は、プラスミドストックを調製する構築物の増殖に使用される原核生物細胞
と、選択配列の発現のための真核生物細胞の両方を含む。典型的には、真核生物
細胞は哺乳動物細胞である。
【００３２】 ここで使用されるところの「ポリメラーゼ連鎖反応」、すなわち「ＰＣＲ」の
方法は、一般に、核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの特定片の微小量を、１９８７
年７月２８日に発行された米国特許第４６８３１９５号に記載されているように
して増幅する方法を意味する。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを構築で
きるように、対象の領域の末端又はこれを越えた領域からの配列情報が利用でき
ることが必要であり；これらのプライマーは増幅される鋳型における反対のスト
ランドと配列が同一か類似している。一般に、ＰＣＲ法は、増幅されるヌクレオ
チド配列を含む鋳型核酸に優先的にハイブリダイズ可能な二つのプライマーを使
用する、プライマー伸長合成の反復サイクルを含む。二つのプライマーの５'末
端ヌクレオチドは増幅された材料の末端と一致しうる。ＰＣＲは特定のＲＮＡ配
列、全ゲノムＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列、及び全細胞ＲＮＡ、バクテリオフ
ァージ又はプラスミド配列から転写されたｃＤＮＡ等を増幅するのに使用できる
。一般には、Mullis等, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51：263(198
7)；Erlich編, PCR Technology,(Stockton Press, NY, 1989)；Wang & Mark, pp
.70-75及びScharf,pp.84-98で双方ともPCR Protocols(Academic Press, 1990)に
収録のものを参照されたい。ここで使用される場合、ＰＣＲは、既知の核酸（Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡ）をプライマーとして使用する核酸試験試料を増幅する核酸ポリ
メラーゼ連鎖反応法の一つであるが唯一の例ではないと考えられる。
【００３３】 文献 本発明の実施には、特にそうではないと示さない場合には、当業者の技量内に
ある分子生物学等の一般的な技術を用いる。そのような技術は文献に十分に説明
されている。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook
等, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harber, N.Y., 1989); Curr
ent Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel等編1987書き換え); Essenti
al Molecular Biology (T. Brown編, IRL Press 1991); Gene Expression Techn
ology (Goeddel編, Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis
of Eukaryotic Genes (A. Bothwell等編, Bartlett Publ. 1990); Gene Transf
er and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Me
thodology (R. Wu等編, Academic Press 1989); A Practical Approach (M. McP
herson等, IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Sy
nthesis (M. Gait編, 1984); Cell Cultyre for Biochemists (R. Adams編, Els
evier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cell
s (J. Miller & M. Calos編, 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butle
r編, 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard等編, Humana Press 1990); Cul
ture of Animal Cells, ２版(R. Freshney等編, Alan R. Liss 1987); Flow Cyt
ometry and Sorting (M. Melamed等編, Wiley-Liss 1990); the series Methods
in Enzymology (Academic Press, Inc.); 及びAnimal Cell Culture (R. Fresh
ney編, IRL Press 1987); 及びWirth M.及びHauser H. (1993) Genetic Enginee
ring of Animal Cells, In Biotechnology Vol.2 Puhler A(編) VCH, Weinhcim
663-744を参照されたい。
【００３４】 発明の実施の形態 本発明は高レベルの対象遺伝子又は配列を発現する細胞をスクリーニングし、
選択し、単離するのに有用な構築物を提供する。基本的な構築物デザインの多く
の変形が可能であり、例を以下に詳細に説明する。当業者であれば、本発明の範
囲から逸脱しないで本ベクターに変更を施すことができることが分かるであろう
。また、クローニングを容易にする所望の特徴を、組換えＤＮＡ法の分野で常套
的な方法によって対象遺伝子及びベクターに遺伝子組換えで導入することができ
ることが理解される。 本発明は次の三つのエレメント：ａ）増幅性選択遺伝子；ｂ）緑色蛍光タンパ
ク質（ＧＦＰ）遺伝子；及びｃ）所望の生成物をコードしている選択配列を含む
ポリヌクレオチド又は構築物を提供する。選択配列はプロモーターと、増幅性選
択遺伝子又はＧＦＰ遺伝子の何れか、あるいは双方とに作用可能に結合している
。構築物は選択配列、増幅性選択遺伝子及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝
子の発現のための単一の転写ユニットを含み得る。あるいは、構築物は二以上の
転写ユニットを持ち得、上述の三つのエレメントが別の転写ユニットから発現さ
れ得る。二以上の転写ユニットを有するポリヌクレオチドは以下に更に詳細に説
明する。 本発明のポリヌクレオチドでの使用に適した増幅性選択遺伝子が上記において
例証されている。定義の項を参照されたい。好ましくは、増幅性選択遺伝子はＤ
ＨＦＲをコードしている遺伝子である。ＤＨＦＲ遺伝子を有する形質移入体は最
初に選択され、Ｍｔｘを含む培地中で細胞を培養することによって同定される。
形質移入細胞はついで連続的により多量のＭｔｘに暴露され、ＤＨＦＲ遺伝子の
複数のコピーと、ＤＨＦＲ配列に物理的に連結された配列と対象遺伝子の複数の
コピーを同時を生じる増幅を受けた宿主細胞が選択される（米国特許第４７１３
３３９号；Axel等, 米国特許第４６３４６６５号；Axel等, 米国特許４３９９２
１６号；Schimke, J. Biol. Chem., 263:5389 (1988)）。ＤＨＦＲをコードして
いるＤＮＡが利用できる；マウスＤＨＦＲｃＤＮＡ断片はSimonsen及びLevinson
, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 80:2495-1499 (1983)及び米国特許第５５６１
０５３号に記載されている。
【００３５】 本発明において使用できる蛍光タンパク質、特に緑色蛍光タンパク質は定義の
項に記載されている。ＧＦＰの概説、その使用方法、及びＧＦＰ蛍光の検出のた
めの顕微鏡設定及び蛍光フィルターについては、例えばAusubel等, Current Pro
tocols in Molecular Biology, Supplement 34, 1996, Unit 9.7Cを参照された
い。好適な蛍光タンパク質はＧＦＰで、好ましくはクラゲAequorea victoria由
来のものである。一実施態様ではAequorea変異体Ｓ６５Ｔが使用される。Aequor
ea野生型ＧＦＰの構造及びそれをコードしているｃＤＮＡはPrasher等, Gene 11
1: 229-233(1992); 上掲のChalfie等 (1994)に記載されている（この配列はＰＣ
Ｒによりつくり出された変化を有している；コドン８０がＧｌｕからＡｒｇに変
化している（CAGからCGG））。ＧＦＰをコードしているプラスミドｐＧＦＰ１０
．１はＡＴＣＣ受託番号７５５４７として入手できる（Chalfieの米国特許第５
４９１０８４号を参照）。突然変異体ＧＦＰをコードする核酸の説明については
、例えば米国特許第５６２５０４８号；米国特許第５７７７０７９号、米国特許
第５８０４３８７号、特許出願国際公開第９８０６７３７号、国際公開９８２１
３５５号、国際公開第９７４２３２０号、Chalfie等,国際公開第９５２１１９１
号を参照されたい。野生型タンパク質と比較して細胞性蛍光が増加した他の緑色
蛍光タンパク質突然変異体は、例えばNataranjan等, J. Biotechnol. 62:29-45(
1998);及びCrameri等, Nature Biotechnol. 14:315-319 (1996)に記載されてい
る。突然変異体ＧＦＰはＧＦＰ遺伝子のランダム又は部位特異的突然変異誘発に
よってつくり出すことができる（部位特異的突然変異誘発は、例えばBio-RadのM
uta-Geneファージミドインビトロ突然変異誘発キットを使用して実施することが
できる）。ＣＭＶプロモーターに結合したＧＦＰを含む様々な変異体ＧＦＰ遺伝
子を含むベクターは、例えばClontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA;及
びQuantum Biotechnologies Inc., Montreal, Canadaから商業的に入手可能であ
る。これらのＧＦＰ遺伝子挿入断片は製造者の指示に従ってベクターから切り取
ることができる。 プロモーター、エンハンサー、終結及びポリアデニル化シグナル、スプライシ
ングシグナルの特定の例を含む哺乳動物発現ベクターの機能的成分の説明につい
ては、上掲のSambrook等, 1989, 16章: Expression of Cloned Genes in cultur
ed Mammalian Cells及びそこに引用された文献を参照されたい。
【００３６】 各転写ユニットはプロモーター、転写終結配列及びその転写ユニットに存在す
るコード化配列の下流のポリＡシグナル配列を含む。プロモーターは転写開始部
位とオーバーラップしうる。例えば、ＳＶ４０、Ｂ型肝炎、又はＢＧＨ（ウシ成
長ホルモン）ポリＡのように、様々なポリＡ部位が知られている。更に、各コー
ド配列はそれ自身の転写開始部位（ＡＵＧ）及び停止コドンを含む。対象遺伝子
の一部として既に存在していないならば、これらの調節エレメントは、クローニ
ングを容易にする他の所望の特徴と共に、組換えＤＮＡ法の分野で常套的な方法
によって遺伝子及びベクター中に遺伝子操作によって組み込むことができる。 構築物は所望の生成物をコードする選択配列、増幅性選択遺伝子及び緑色蛍光
タンパク質遺伝子の発現を行わしめるために少なくとも一つのプロモーターを含
む。使用されるプロモーターは、増幅性選択遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦ
Ｐ）遺伝子及び選択配列の発現が考えられる細胞中で機能的であるものである。
例えば、宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、用いられるプロモーターは哺乳動
物細胞において機能性のプロモーター、好ましくは哺乳動物又はウイルスプロモ
ーターである。プロモーターが宿主細胞発現系と適合性であるならば、対象遺伝
子に通常関連しているプロモーターが使用できる。 ウイルスのゲノムから得られたウイルスプロモーターには、ポリオーマウイル
ス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開された英国特許第２２１１５０４
号）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２又は５）、単純ヘルペスウイル
ス（チミジンキナーゼプロモーター）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス
、サイトメガロウイルス、レトロウイルス（例えば、ＭｏＭＬＶ又はＲＳＶ Ｌ
ＴＲ）、Ｂ型肝炎ウィルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスプロモーター（ＭＰＳＶ）
、ＶＩＳＮＡ及びサルウィルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモータが含まれる。
異種性哺乳動物プロモーターには、例えばアクチンプロモーター、免疫グロブリ
ンプロモーター、熱ショックタンパク質プロモーターが含まれる。上述のプロモ
ーターは従来から知られている。
【００３７】 ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起
点をまた含む制限断片として簡便に得られる。Fiers等, Nature, 273:113 (1978
); Mulligan及びBerg, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakis等, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)。ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭ
Ｖ）の最初期プロモーターは、ＨｉｎｄIIIＥ制限断片として簡便に得られる。G
reenaway等, Gene, 18:355-360 (1982)。広い宿主範囲のプロモーター、例えば
ＳＶ４０初期プロモーター又はラウス肉腫ウイルスＬＴＲが本発現ベクタでの使
用に適している。 一般に、強いプロモーターが所望の生成物の高レベルの転写と発現をもたらす
ために使用される。高レベルの発現のための強いプロモーターとして同定されて
いる真核生物細胞はＳＶ４０初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモ
ーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反
復配列、及びヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ又はＣＭＶ
ＩＥ）である。好適な実施態様では、プロモーターはＳＶ４０又はＣＭＶ初期
プロモーターである。 用いられるプロモーターは構成的又は調節可能、例えば誘導性でありうる。例
示的な誘導性プロモーターには、ｊｕｎ、ｆｏｓ及びメタロチオネイン及び熱シ
ョックプロモーターが含まれる。例えば上掲のSambrook等を参照されたい。一実
施態様では、ＧＦＰは構成的プロモーターから発現され、誘導性プロモーターが
対象遺伝子及び／又は増幅性選択マーカーの転写を駆動する。
【００３８】 高等真核生物中の転写調節領域はエンハンサー配列を含みうる。哺乳動物の遺
伝子由来の多くのエンハンサー配列が知られており、例えばグロビン、エラスタ
ーゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン遺伝子由来である。好
適なエンハンサーは真核細胞ウイルス由来のエンハンサーである。例としては、
複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(塩基対１００−２７０)、サイトメ
ガロウィルス最初期プロモーターのエンハンサー（Boshart等, Cell 41:521 (19
85)）、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー, 及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化の
ためのエンハンサーエレメントについてはYaniv, Nature, 297:17-18 (1982)も
参照されたい。エンハンサー配列は、対象遺伝子の５'又は３'位でベクター中に
導入されうるが、好ましくはプロモーターからの５'位に位置している。 しばしば、選択遺伝子及び／又は対象遺伝子をコードするポリヌクレオチドに
は、成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を持つシグナル
配列をコードするＤＮＡが先行している。一般には、シグナル配列は、基本的発
現ベクターに設計される成分でありうるか、発現ベクターに挿入される所望の生
成物の遺伝子又は選択遺伝子の一部でありうる。異種性シグナル配列が使用され
る場合、それは好ましくは宿主細胞によって認識され加工（すなわちシグナルペ
プチダーゼにより切断）されるものである。哺乳動物細胞の発現に対しては、タ
ンパク質が哺乳動物由来である場合、対象タンパク質の未変性シグナル配列が使
用されうる。あるいは、未変性シグナル配列は、他の適当な哺乳動物シグナル配
列、例えば同じ又は関連の種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、並びにウ
イルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルによって置換されうる。
そのような前駆体領域のＤＮＡは選択遺伝子又は生成物遺伝子に読み取り枠を一
致させて作用可能に結合されている。
【００３９】 哺乳動物発現ベクターは典型的には細菌中でのベクターの増殖を容易にする原
核生物配列を含む。従って、ベクターは他の成分、例えば複製起点（すなわち、
一又は複数の選択宿主細胞においてベクターに複製させる核酸配列）及び細菌中
での選択のための抗生物質耐性遺伝子を持ちうる。更なる真核生物選択遺伝子を
導入してもよい。一般には、クローニングベクターにおいて、複製起点は、ベク
ターに宿主染色体ＤＮＡ独立に複製させるものであり、複製起点又は自己複製配
列を含む。そのような配列はよく知られており、例えば細菌中のＣｏｌＥ１複製
起点である。様々なウイルス起源（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、Ｖ
ＳＶ又はＢＰＶ）が哺乳動物細胞中でのベクターのクローニングに有用である。
一般には、真核生物レプリコンは染色体外（エピソーム）複製が意図されていな
い場合は哺乳動物細胞での発現には必要ではない（初期プロモーターを含んでい
るだけのためにＳＶ４０起源が典型的には使用されうる）。 本構築物は広範囲のヌクレオチド配列挿入断片を収容できる。本発明の構築物
及び発現ベクターからの異なった対象遺伝子の挿入と発現を容易にするために、
任意の対象遺伝子の挿入のための少なくとも一つのクローニング部位を持つ構築
物が設計される。好ましくは、クローニング部位は多重クローニング部位、つま
り複数の制限部位を含む。複数のクローニング部位を含むＤＮＡカセットは市販
のクローニングベクターから単離できる。 各構築物又は発現ベクターは対象生成物をコードする少なくとも一つの選択配
列を含む。特定の実施態様では、発現ベクターは、二つの所望の生成物、例えば
免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖を発現させるために、別の転写ユニットに二つの
選択配列を含む。 「選択配列」は、所望の生成物、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド
、又はその断片を、あるいはアンチセンスＲＮＡさえ、コードする。ペプチドは
、例えば免疫グロブリン又はレセプターのような多鎖タンパク質のサブユニット
でありうる。好適な実施態様では、所望の生成物はヒト由来又はヒト化、例えば
ヒト化抗体、及びヒトの部分を持つキメラ又は融合タンパク質である。キメラ又
は融合タンパク質にはＩｇ−融合タンパク質及びタグ又は他の標識、例えばポリ
ヒスチジンタグ又はエピトープタグに融合されたタンパク質が含まれる。様々な
タグが従来から知られている。一実施態様では、所望の生成物は治療用タンパク
質又はペプチドである。好適な実施態様では、タンパク質は分泌タンパク質であ
る。通常の膜結合タンパク質の分泌又は可溶型は、膜貫通ドメインをコードして
いる配列が欠失している切断遺伝子からつくり出すことができる。例えば、分泌
ポリペプチドは全長遺伝子の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含みうる。
【００４０】 哺乳動物ポリペプチド又はタンパク質の例には、ホルモン、サイトカイン及び
リンホカイン、抗体、レセプター、接着分子及び酵素が含まれる。所望の生成物
の非網羅的なリストには、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲
状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン；ホ
ルモン放出因子；リポタンパク；アルファ−１−アンチトリプシン；インシュリ
ンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；カルシトニン；グルカゴン；レ
ニンのような分子；ＶＩＩＩＣ因子、ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレ
ブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ、心房性ナトリウム利尿因子、肺表面
活性剤等の抗凝固因子；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活
性化剤（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化剤；ボンベシン；トロンビン；
造血性成長因子；腫瘍壊死因子−アルファ及びベータ；エンケファリナーゼ；Ｒ
ＡＮＴＥＳ（regulated on activation normally T-cell expressed and secret
ed(正常なＴ細胞発現及び分泌での調節)）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク
質（ＭＩＰ-１-アルファ）；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミューラ
ー阻害物質；リラキシンＡ鎖又はＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン
関連ペプチド；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；ホルモン又は成長因子の
レセプター；インテグリン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；骨誘導神経栄
養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５又は−６（ＮＴ−３
、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＮＧ
Ｆ−β等の神経成長因子を含む神経栄養因子；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）
；ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６等の線維芽細胞成
長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３
、ＴＧＦ−β４、又はＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータ
等のトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子−Ｉ及び
−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ(１−３)−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧ
Ｆ−Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、
及びＣＤ１９等のＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−
ガンマ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えば、Ｍ−Ｃ
ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えば、
ＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；
表面膜タンパク質、例えばＨＥＲ２；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えば、
ＡＩＤＳエンベロープの一部など；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；ア
ドレシン；調節タンパク質；抗体；キメラタンパク質、例えばイムノアドヘシン
及び上に列挙した任意のポリペプチドの断片が含まれる。細菌性ポリペプチド又
はタンパク質の例には、例えばアルカリホスファターゼ及びβラクタマーゼが含
まれる。
【００４１】 ここでの好適なポリペプチド及びタンパク質は治療用タンパク質、例えばＴＧ
Ｆ−β、ＴＧＦ−α、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＤＮａｓｅ、プ
ラスミノーゲン活性化因子、例えばｔ−ＰＡ、凝固因子、例えば組織因子及びＶ
ＩＩＩ因子、ホルモン、例えばリラキシン及びインシュリン、サイトカイン、例
えばＩＦＮ−γ、キメラタンパク質、例えばＴＮＦレセプターＩｇＧイムノアド
ヘシン（ＴＮＦｒ−ＩｇＧ）又は抗体、例えば抗ＩｇＥである。好適な治療用タ
ンパク質はヒト由来のもの又はヒト化抗体のような「ヒト化」タンパク質である
。特定の実施態様では、選択配列は、ニューロノトロフィン−３、デオキシリボ
ヌクレアーゼ、血管内皮成長因子、ＨＥＲ２レセプター及び免疫グロブリンから
なる群から選択されるタンパク質をコードする。 所望の生成物の遺伝子又は配列はファージディスプレイライブラリー、ｃＤＮ
Ａ又はゲノムＤＮＡライブラリーから得ることができる。対象遺伝子又は配列は
適切なプライマーを用いるＰＣＲ法によって単離することができ、あるいはそれ
らは化学的に合成できる。ライブラリーは、選択遺伝子又は生成物遺伝子（又は
それらによってコードされたタンパク質）を同定するように構築されたプローブ
（例えば抗体又はオリゴヌクレオチド）を用いてスクリーニングできる。選択プ
ローブを用いたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrook
等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989)の１０−１２章に記載された標準的な方法を用いて実
施することができる。
【００４２】 上述されたエレメントは正しい読み取り枠で結合されていると理解される。更
に、本発明のベクターは構築とクローニングを容易にするか選択宿主細胞での発
現を至適化する部位と配列の付加を有しうる。 殆どの発現ベクターは「シャトル」ベクターである、つまりそれらは、少なく
とも一つの生物クラスで複製可能であるが発現のために他の生物に形質移入でき
る。例えば、ベクターは大腸菌でクローニングされ、ついで同じベクターが、た
とえそれが宿主細胞染色体と独立に複製可能ではなくとも、発現のために酵母又
は哺乳動物細胞中に形質移入される。 構築物中の正しい配列を確認するための分析に対しては、形質転換体からのプ
ラスミドを調製し、制限によって分析し、及び／又は従来から知られている方法
によって配列決定する。
【００４３】 図１から６は、本発明の発現ベクターにおけるエレメントの様々な構成の例を
概略的に示す。ＧＦＰと増幅性選択マーカー（及び任意の付加的な選択マーカー
）の構成並びに特定の所望のタンパク質の発現に最適であるプロモーター／エン
ハンサー領域の性質は様々な配置とエレメントを試験し、所望のタンパク質の得
られた生産性を比較することによって当業者によって直ぐに決定されうる。簡便
には、以下の実施例ではＤＨＦＲ遺伝子と遺伝子融合体に言及するが、任意の適
切な増幅性選択遺伝子をＤＨＦＲと置換することができることが理解される。構
築物が一又は複数の転写ユニットを有するかどうかに関わらず、転写ユニットの
各々はそのユニット内の選択配列、ＧＦＰ及び増幅性選択マーカー遺伝子の好適
な宿主細胞中での転写と翻訳に必要なエレメントを含む。これらのエレメントは
、まだ遺伝子の一部として存在していないならば、組換えＤＮＡ法の分野でよく
知られている方法によって構築物中に遺伝子操作によって組み込むことができる
。一般には、プロモーター及び他の転写及び翻訳調節エレメントは、所望の生成
物の発現及び分泌（関連する場合）のレベルを至適化するように選択される。第
二の転写ユニットの調節エレメントは第一の転写ユニットに使用されているもの
と同じであり得、例えばＳＶ４０プロモーター及びポリＡシグナル配列の同じ供
給源が第一及び第二の転写ユニット内にクローニングできる。 一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、図１の１及び２列に実証され
ているように、増幅性選択マーカー、所望のタンパク質及びＧＦＰが発現される
単一の転写ユニットを含む。単一の転写ユニットを持つ構築物では、プロモータ
ーと、場合によってはエンハンサーが、所望のタンパク質、増幅性選択マーカー
及びＧＦＰをコードする配列から上流に位置させられる。エンハンサーは、そう
しなければならないというものではないが、簡便には、転写の亢進に活性である
ようにプロモーターに近接して配置される。転写終結配列及びポリＡシグナルが
三つの成分（増幅性選択マーカー、選択配列及びＧＦＰ遺伝子）の下流に存在す
る。以下の実施例に記載されている構築物に存在するポリＡシグナルを含む配列
は転写終結部位を含む。
【００４４】 ＤＨＦＲ、所望のタンパク質及びＧＦＰは同時発現効率を改善するために一つ
のプロモーターから発現されうる。例えば、ＧＦＰ及びＤＨＦＲは融合タンパク
質として発現でき、又はＩＲＥＳはＧＦＰを発現させる第二のプロモーターの必
要性を排除できる。図９の１及び２列に示した構築物では、例示的な増幅性選択
遺伝子ＤＨＦＲがＧＦＰ遺伝子と融合されてＤＨＦＲ−ＧＦＰ融合遺伝子を生成
している。上流及び下流のコード配列の各々（図９、１列の最初の実施例では、
上流のコード配列はＤＨＦＲ−ＧＦＰ融合遺伝子であり；２列に表した第二の実
施例では上流のコード配列は選択配列である）はその翻訳停止シグナルを有して
いる。翻訳がまた下流のコード配列に対して開始する。これらのシナリオにより
、単一のプロモーターからの二つのタンパク質の発現が可能になる。ここに記載
したように、各転写ユニットにおける様々な成分に対するプロモーター／エンハ
ンサー、翻訳停止シグナル、翻訳開始部位及びポリＡシグナルの位置決めは以下
に記載する構築物の全てに当てはまることが理解される。 ＤＨＦＲ−ＧＦＰ融合遺伝子は組換えＤＮＡ技術の標準的な方法によって調製
することができる。これらの二つの遺伝子を、個々のタンパク質の所望の性質、
すなわちそれぞれ選択及び蛍光特性を保持する形で各タンパク質内の部位に融合
される。融合遺伝子は個々の遺伝子の全長配列を含む必要はない。個々のタンパ
ク質の所望の選択機能を保持する融合タンパク質をつくるのに十分な各遺伝子の
断片が融合できる。しかし、全長ＤＨＦＲ遺伝子の３'末端については、全長Ｇ
ＦＰ遺伝子の５'末端に読み枠を一致して簡便に結合できる。この結合は、例え
ば、ＰＣＲ法を使用して、簡便な制限断片のライゲーションにより、リンカーの
使用により、又は二つの遺伝子を架橋するオーバーラップするオリゴヌクレオチ
ドで両方の遺伝子の制限又はエキソヌクレアーゼ断片をアニールすることにより
、達成することができる。
【００４５】 多シストロニックｍＲＮＡからのＤＨＦＲ−ＧＦＰ融合遺伝子と対象の遺伝子
の両方の翻訳は少なく２通りで達成できる。一つの方法では、図１，列１に示さ
れているように、転写ユニットはイントロンを含み、ＤＨＦＲ−ＧＦＰ融合遺伝
子はそのイントロン内に挿入される。この配置では、前駆体ｍＲＮＡ（ここでは
一次転写産物又は全長メッセージとも称する）がＤＨＦＲ−ＧＦＰ融合遺伝子と
対象遺伝子の双方をコード化するが、ＤＨＦＲ−ＧＦＰ融合遺伝子を産生するよ
うに翻訳される。しかし、イントロン配列のために、前駆体ｍＲＮＡは高頻度で
スプライシングされ、融合遺伝子がスプライシングし、所望の生成物のみを生産
するように翻訳される成熟転写産物を生じる。 他の配置では、転写ユニットは図１、列２に示されているように、生成物遺伝
子と増幅性選択−ＧＦＰ融合遺伝子の間にＩＲＥＳを含む。このシナリオでは、
生成物遺伝子とＤＨＦＲ融合遺伝子の相対位置は逆にできるが、生成物遺伝子の
翻訳を至適化するには生成物遺伝子が上流コード化配列であることが好ましい。
ジシストロニック転写産物に存在するＩＲＥＳシグナルのために両方のコード化
配列が翻訳される。 本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは所望の生成物の発現に向けて殆どの
転写産物を変化させるように構成される一方、安定なトランスフェクタントの選
択ができるように固定した比で増幅性選択遺伝子の発現に向けてそれを関連づけ
る。哺乳動物の発現ベクターに対しては、改善した発現のために遺伝子（対象遺
伝子、ＧＦＰ又は他の選択遺伝子）の５'にイントロンを有していることが好ま
しい。選択遺伝子のコード化配列と選択遺伝子から産生された選択タンパク質の
レベルを低減するイントロンを含むイントロン修飾選択遺伝子。（国際公開第９
２／１７５６６；Abrams等, J. Biol. Chem. 264(24):14016-14021 (1989）。
【００４６】 好ましくは、本発明の構築物中に存在するイントロンは、上述したように、一
次転写産物のスプライシングが９０％、好ましくは少なくとも９５％を越える頻
度で生じるように、効果的なスプライシングドナー及びアクセプター部位を有し
ている。このようにして、少なくとも９５％の転写産物が所望の生成物に翻訳さ
れ、５％以下が、イントロンにある場合には増幅性選択マーカーに翻訳される。
一実施態様では、コンセンサススプライシングドナー及びアクセプター部位を有
するイントロンが使用される。本発明の構築物での使用に好適なイントロンは一
般には少なくとも９１ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオ
チドである。これより短いイントロンは効果的にはスプライシングされない傾向
があるためである。イントロンの長さの上限は３０ｋｂ又はそれ以上までとでき
る。しかし、ここで使用されるイントロンは一般には約１０ｋｂ長未満である。 本発明での使用に適したイントロンは適切には当該分野でよく知られている幾
つかの方法の任意のものによって、例えば天然に生じる核酸からの単離又はデノ
ボ合成によって調製される。多くの天然に生じる真核生物遺伝子に存在するイン
トロンが同定され特徴付けられている。Mount, Nucl. Acids Res., 10:459 (198
2)。機能的スプライシング部位を有する人工イントロンがまた記載されている。
Winey等, Mol. Cell Biol., 9:329 (1989); Gatermann等, Mol. Cell Biol., 9:
1526 (1989)。イントロンは天然に生じる核酸から、例えば、適切な制限エンド
ヌクレアーゼを用いての天然に生じる核酸の消化により、あるいはイントロンの
５'及び３'末端の配列に相補的なプライマーを使用するＰＣＲクローニングいよ
って、得ることができる。あるいは、所望の配列と長さのイントロンは存在して
いるイントロンのインビトロでの欠失突然変異誘発により、又は有機化学の様々
な方法を使用して合成により調製することができる。Narang等, Meth. Enzymol.
, 68:90 (1979); Caruthers等, Meth. Enzymol., 154:287 (1985); Froehler等,
Nucl. Acids Res., 14:5399 (1986)。
【００４７】 一実施態様では、使用されるイントロンは、Lucas等, Nucl. Acids Res. 24:1
774-1779 (1996)、Suva等, Science 237: 893-896 (1997)、及び米国特許第５５
６１０５３号)に記載されているように、ＣＭＶ最初期遺伝子から取り出された
ＳＤとＩｇＧ Ｈ鎖可変領域遺伝子からのＳＡ部位を含むベクターｐＲＫのイン
トロンである。選択遺伝子又は融合遺伝子はインビトロで核酸を修飾する様々な
既知の方法の何れかを使用してイントロン内に挿入される。遺伝子は、スプライ
シングに重要な配列を妨害しないでコンセンサス配列の外側のイントロンに挿入
することができる。典型的には、選択遺伝子は最初に制限エンドヌクレアーゼで
イントロンを切断し、ついで得られた制限断片を宿主細胞での発現のために正し
い配向で選択遺伝子に、例えばリガーゼでのライゲーションにより、共有結合的
に結合させることにより、イントロン内に導入される。簡便な制限部位がイント
ロン内で欠けている場合には、それらはＰＣＲ、ライゲーション又は制限及びア
ニーリングによりリンカーとオリゴヌクレオチドを使用して導入することができ
る。イントロン修飾の例は上掲のLucas等, 1996に記載されている。 ＩＲＥＳは可変長さで、様々な供給源、例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）
又はピコルナウイルスゲノム由来でありうる。様々なＩＲＥＳ配列及びその構築
は例えばPelletier等, Nature 334: 320-325 (1988); Jang等, J. Virol. 63: 1
651-660 (1989); Davis等, J. Virol. 66: 1924-1932 (1992); Adam等, J. Viro
l. 65: 4985-4990 (1991); Morgan等, Nucl. Acids Res. 20: 1293-1299 (1992)
; Sugimoto等, Biotechnology 12: 694-698 (1994);及びRamesh等 Nucl. Acids
Res. 24: 2697-2700 (1996);及び上掲のMosser等 (1997)に記載されている。一
実施態様では、ＥＣＭＶのＩＲＥＳが本発明のベクターに使用される。下流のコ
ード化配列は、例えばＩＲＥＳの３'末端の約８塩基又はそれ以上下流に又は下
流遺伝子の発現に負に影響を及ぼさない任意の距離で、ＩＲＥＳに作用可能に結
合される。ＩＲＥＳと下流遺伝子の初めの間の最適な又は許容できる距離は、距
離を変え、距離の関数として発現を測定することによって、直ぐに決定すること
ができる。
【００４８】 ＧＦＰ遺伝子と増幅性選択遺伝子を融合させる代わりに、二つの遺伝子が単一
の転写ユニット内に別個に存在させうる。よって、図９、列３に示される第三の
構築物デザインでは、５'から３'の順に、選択配列が続くイントロンとＩＲＥＳ
を含む。一実施態様では、ＤＨＦＲ遺伝子はイントロン内に位置し、ＧＦＰ遺伝
子はＩＲＥＳの下流に位置している。そのような構築物では、一次のスプライシ
ングされていない転写産物は全ての三つの成分をコード化するが、ＤＨＦＲ及び
ＧＦＰ遺伝子のみが翻訳される。しかし、ＤＨＦＲ遺伝子は高頻度で一次転写産
物からスプライシングされ、得られたスプライシング転写産物は翻訳されて所望
の生成物とＧＦＰを生産する。別の実施態様では、ＧＦＰ遺伝子はイントロン内
に配され、ＤＨＦＲ遺伝子はＩＲＥＳの下流にある。 本発明の構築物はまた図９、列４−９に示されているように、二つの発現／転
写ユニットを含みうる。図９、列４に示された二つの転写ユニット構築物は一つ
の選択配列を含む。列５−９は、二つの選択配列が挿入でき、各転写ユニットに
一つがある構築物を示している。二つの転写ユニットの各々はプロモーターと、
場合によってはエンハンサー、転写終結部位及びポリＡシグナル配列を含む。第
二の転写ユニットは第一の転写ユニットに使用されるのと同じ又は異なった種類
のプロモーターを使用することができる。例えば、両方の転写ユニットＳＶ４０
プロモーターを使用できる。転写ユニットの一つ又は両方がイントロンを含みう
る。 図９、列４は、第一の転写ユニットが、選択配列が続くイントロン（第一イン
トロン）にＤＨＦＲを含む構築物を示している。第二の転写ユニットはＧＦＰ遺
伝子を含む。第二の転写ユニットは好ましくはＧＦＰの５'に直ぐイントロン（
第二のイントロンと称する）を含む。三つのコード化配列は一つのベクターでな
お物理的に結合しているが、二つのプロモーターから独立に転写される。第一の
転写ユニットから生産された一次転写産物はＤＨＦＲと選択配列の双方をコード
化しているが、ＤＨＦＲ遺伝子のみが生成物に翻訳される。好ましくは、転写産
物の少なくとも９５％がスプライシングされたＤＨＦＲ遺伝子を有しており、所
望の生成物に翻訳される。第二の転写ユニットでは、ＧＦＰがイントロンの下流
に位置している場合には、この転写ユニットからのスプライシングされた転写産
物とスプライシングされていない転写産物の双方がＧＦＰを生産する。
【００４９】 ＤＨＦＲ及びＧＦＰ遺伝子が別の転写ユニットから発現される場合は、その位
置は、ＤＨＦＲ遺伝子が第一の転写ユニット内に位置し、ＧＦＰが第二の転写ユ
ニットに位置できるように、又はその逆になるように、交換可能である。 それぞれがイントロンを持っている二つの転写ユニットを含む先の構築物は図
１、列５に示されているように、二つの対象遺伝子の発現に有用である。第二の
転写ユニットは第二の選択配列と、第二のイントロン中のＧＦＰ遺伝子とを含み
得、両方のコード化配列が同じプロモーターに操作可能に結合され、それから転
写される。 第二の転写ユニットの第二のイントロン内にＧＦＰ遺伝子を配する代わりに、
二つの転写ユニットと二つのイントロンを含む先の構築物のまた他の実施態様で
は、ＩＲＥＳが第二の選択配列とＧＦＰ遺伝子の間に配されている（図９、列６
）。第二の転写ユニットからの第二の選択配列とＧＦＰ遺伝子の両方がジシスト
ロニックメッセージから翻訳される。 二つの転写ユニットと二つのイントロンを含む先の構築物の更に他の別の配置
では、ＤＨＦＲ−ＧＦＰ融合遺伝子が第一のイントロン内に配されている（図１
、列７）。第二のイントロンは如何なる挿入断片もない（図では空として示され
ている）か、他の選択マーカーがイントロン内に挿入できる。
【００５０】 二つの転写ユニットと二つのイントロンを含む構築物の更に他の変形例では、
第一の転写ユニット内の第一のイントロンが空で残されているが、ＩＲＥＳが第
一の対象遺伝子の下流に挿入され、下流のＤＨＦＲ−ＧＦＰ融合遺伝子の翻訳が
可能になっている。第二の転写ユニットは第二の対象遺伝子が続く第二のイント
ロンを含む（図９、列８）。場合によっては、他の選択マーカー遺伝子（増幅性
選択遺伝子とＧＦＰ遺伝子以外）は第二のイントロン内に配されうるか、イント
ロンは挿入遺伝子ないまま残りうる。 最後に、第一の転写ユニットは５'から３'の順で、第一のイントロン、第一の
選択配列、ＩＲＥＳ及びＤＨＦＲを含み得、第二の転写ユニットは第二のイント
ロン、第二の選択配列、ＩＲＥＳ及びＧＦＰ遺伝子をその順で含みうる（図１、
列９）。 二以上の転写ユニットを有する発現ベクターはヘテロダイマー又は多鎖である
タンパク質の発現に有用である。ベクター中の第一及び第二の選択配列はヘテロ
ダイマーレセプターの二つのポリペプチド鎖をコード化可能である。例えば、第
一の転写ユニット内の第一の選択配列は免疫グロブリン重（Ｈ）鎖をコード化可
能で、第二の転写ユニットの第二の選択配列は免疫グロブリン軽（Ｌ）鎖をコー
ド化する。抗体Ｈ及びＬ鎖の発現のためには、好適な配置は、Ｈ鎖の５'のイン
トロンへの選択マーカーの配置とＬ鎖の５'のイントロンへのＧＦＰ遺伝子の配
置である。
【００５１】 形質移入と宿主細胞 プラスミドを細菌宿主細胞で増殖させ、サブクローニング工程又は真核生物宿
主細胞への導入のためにＤＮＡストックを調製することができる。真核生物細胞
宿主細胞の形質移入は当該分野でよく知られ、例えば上掲のSambrook等に記載さ
れている何れかの方法により実施することができる。形質移入方法には、リポフ
ェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、塩化ルビジウ
ム又はポリカチオン（例えばＤＥＡＥ−デキストラン）媒介形質移入、原形質融
合及びマイクロインジェクションが含まれる。好ましくは、形質移入は安定な形
質移入である。特定の宿主細胞系統及び型の構築物の至適な形質移入頻度及び発
現をもたらす形質移入法が好ましい。好適な方法は常套的な方法によって決定で
きる。安定なトランスフェクタントのために、構築物は宿主染色体内に安定して
維持されるように組み込まれる。 選択配列と増幅性選択マーカーの発現に適した宿主細胞には、真核生物細胞、
好ましくは哺乳動物細胞が含まれる。昆虫及び植物細胞がまた適切なプロモータ
ーを用いて使用できる（例えばＳｆ９昆虫細胞中のバキュロウイルスプロモータ
ー）。細胞型は所望のタンパク質をコード化する構築物を発現し、タンパク質を
加工し、分泌タンパク質を細胞表面に分泌のために輸送することができるべきで
ある。加工には、同時翻訳及び翻訳後修飾、例えばリーダーペプチド切断、ＧＰ
Ｉ接合、グリコシル化、ユビキチン結合、及びジスルフィド結合形成が含まれる
。遺伝子操作に典型的に使用される種類の、形質移入を受け入れられる不死化宿
主細胞培養とインビトロ細胞培養が好ましい。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例
は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株(COS-7, ATCC CRL 1651)
;ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２
９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;ハムスター乳児腎細胞（
BHK, ATCC CCL 10）；ＤＨＦＲチャイニーズハムスター卵巣細胞（ATCC CRL-909
6）；ｄｐ１２.ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ／ＤＨＦＲの誘導体（１９８９年３月１５日
公開の欧州特許出願公開第３０７２４７号）；マウスのセルトリ細胞（TM4, Mat
her,Biol.Reprod., 23:243-251 (1980)）;サルの腎細胞 （CVI ATCC CCL 70）;
アフリカミドリザルの腎細胞（VERO-76, ATCC CRL-1587）; ヒト子宮頸癌細胞 (
HELA, ATCC CCL 2); イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34); バッファローラット肝
臓細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細
胞 (Hep G2, HB 8065); マウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51); ＴＲ
Ｉ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）; ＰＥＥＲヒ
ト急性リンパ芽球性細胞株（Ravid等, Int. J. Cancer 25:705-710 (1980)）；
ＭＲＣ５細胞; ＦＳ４細胞; ヒト肝癌系(Hep G2)、ヒトＨＴ１０８０細胞、ＫＢ
細胞、ＪＷ−２細胞、デトロイト６細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ハイブリドーマ
及びミエローマ細胞である。トランスジェニック動物の産生に使用される胚細胞
もまた好適である（例えば、接合体及び胚幹細胞）。
【００５２】 野生型ＤＨＦＲ遺伝子を用いる場合、好適な宿主細胞は、Urlaub及びChasin,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されたようにして調製され
増殖される、ＤＨＦＲ活性が欠乏したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ-９０９６、並びにｄｐ１２細胞株を含むこの細胞株の派
生体である。ＤＨＦＲ増幅法を多の細胞型に拡張するために、メトトレキセート
に対する感受性が低下したタンパク質をコード化する変異体ＤＨＦＲ遺伝子が、
正常な数の内在性野生型ＤＨＦＲ遺伝子を含む宿主細胞と組み合わせて使用され
うる（Simonsen及びLevinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2495 (1983);
Wigler等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567-3570 (1980); Haber及びSchi
mke, Somatic Cell Genetics, 8:499-508 (1982)を参照されたい）。
【００５３】 スクリーニングと選択 ＧＦＰ遺伝子で形質転換した細菌は長波長ＵＶランプを使用して蛍光について
スクリーニングできる。 哺乳動物細胞の形質移入後、細胞は典型的には非選択培地で約２日の間、成長
させられる。細胞は、形質移入後の約１８−４８時間で選択培地に配され、約２
−４週の間、選択培養に維持される。増幅性選択遺伝子以外の第二の選択マーカ
ー遺伝子が発現ベクター中に存在している場合、細胞は、培地に双方の選択剤を
添加することにより両方のマーカー遺伝子の同時の発現のために選択できる。例
えば、細胞は、メトトレキセートの存在下でのＤＨＦＲの発現と、同時にハイグ
ロマイシン耐性について選択できる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は発現のた
めに選択された宿主細胞で過去に使用されているものであり、当業者には明らか
である。ついで、選択において生存する細胞を例えばＦＡＣＳにより蛍光につい
てスクリーニングする。 高レベルの所望のタンパク質を一般的に発現する組換え宿主細胞の選択は多工
程プロセスである。形質移入された細胞を、ＧＦＰ及び／又は増幅性選択マーカ
ーの発現についてスクリーニングし、発現ベクターを組み込んだ細胞を同定する
。典型的には、形質移入された宿主細胞を、約２週の間、選択培地中で培養する
ことにより、選択マーカーの発現のための選択にかける。それに続いて、生存細
胞が、ＧＦＰの発現のためにフローサイトメトリー又は蛍光顕微鏡によるスクリ
ーニングと選別のためにプールされる。フローサイトメーターには一般には蛍光
を検出するフルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）フィルターが備え
られる。細胞は典型的には数回の連続的な選別、好ましくは少なくとも二回の選
別にかけられる。初期ＦＡＣＳソートからの最も明るい細胞を、次の培養と更な
る選別のためにプールできる；しかし、最終選別では、個々のクローンを分離す
る。繰り返しの選別により、高く安定した蛍光細胞集団を富ませる。典型的には
細胞は、特定の宿主細胞の成長速度に依存して、選別の間に、約１−３週間、よ
り典型的には２週間、成長させられる。任意の数又はパーセントの蛍光細胞を選
別できる。典型的には、分析される集団内で最も明るい１−１０％の蛍光細胞（
ＦＡＣＳ分析により決定してｍｆｅ単位で測定した蛍光強度）を第一回選別及び
第二回選別で選別し、次の選別工程では撚り少ない数の細胞が選別される。例え
ば、第一の選別では、最も明るい５％の蛍光細胞が選別され、第二の選別では最
も明るい１％の細胞が収集され、第三の選別では、上の０．５％の細胞が単離さ
れクローニングされる。懸濁又は付着細胞は典型的にはリン酸緩衝食塩水（ＰＢ
Ｓ）中で選別され、成長培地で収集される。選別された細胞は選択を伴うか伴わ
ないで培養することができる。蛍光選別及び選択／増幅は連続的又は同時に実施
することができる。
【００５４】 蛍光を検出する蛍光顕微鏡法は当該分野で教示されており、例えばBennett等,
Biotechniques 24: 478-482 (1998)を参照されたい。蛍光細胞の検出とＧＦＰ
の分析のためのフローサイトメトリー法は以下の実施例又は文献に記載されてい
るようにして実施することができ、例えば上掲のSubramanian及びSrienc, 1996,
Ropp等, Cytometry 21: 309-317 (1995); Nataranjan等, J. Biotechnol. 62:
29-45 (1998); 上掲のMosser等, p.152 (1997)を参照されたい。簡単に述べると
、形質移入された細胞は、ＧＦＰが可視蛍光を発する条件下で、特定のＧＦＰ突
然変異体タンパク質に適した光の波長で照明される。励起及び発光波長は使用さ
れる特定の蛍光タンパク質で変化し、一般にはＧＦＰ突然変異体の製造者／供給
者により記載されている。蛍光強度は例えばＦＡＣＳＣＡＮ又はＦＡＣＳCalibu
rフローサイトメーターを使用して測定される。 蛍光選別後に、個々のクローンが適切な選択培地で培養され、少なくとも増幅
性選択遺伝子の増幅を受けたクローンと通常はそれにまた物理的に結合した隣接
配列を選択する。「増幅」細胞の選択に適した細胞と選択薬の双方の濃度は細胞
系統と共に変化し、例えば、薬物死滅曲線で一般に約５％の生存率を得るように
薬物濃度又は細胞数を変えるような、常套的な方法によって決定できる。細胞数
を変えながら、低薬物濃度を維持することが好ましい。 ＤＨＦＲ遺伝子と組み合わせて使用される選択剤はメトトレキセート（Ｍｔｘ
）であり、明るい蛍光細胞が、連続的に増加する量のＭｔｘに暴露されることに
より、ＤＨＦＲ遺伝子と生成物遺伝子の増幅のために選択される。形質移入され
た細胞は、典型的には約１ｎＭから１０００ｎＭの範囲、より典型的には５０ｎ
Ｍから５００ｎＭの間の初期濃度でＭｔｘを含む無ＧＨＴ培地で培養される。Ｍ
ｔｘの濃度は例えば１００ｎＭの増分で徐々に増加させることができる。１００
％未満の生存又は集密度が得られなければならない。 薬物選択を生存し、好ましくはまた高蛍光を示すトランスフェクタントをつい
で分析して、タンパク質又はｍＲＮＡを分析することにより、所望の生成物の合
成を確認することができる。
【００５５】 トランスフェクタントの解析 遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識
されたプローブを用い、例えば、一般的なサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を
定量化するノーザンブロット法（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:520
1-5205[1980]）、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド
形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。様々な標識を用いる
ことができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしな
がら、他の技術、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾され
たヌクレオチドもまた使用することができる。このビオチンは、ついで例えば放
射性核種、蛍光又は酵素のような広範囲の標識で標識することができるアビジン
又は抗体への結合部位として作用する。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖
及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク質二本鎖を含む、
特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体
を標識して、アッセイを実施することができ、そこでは、二本鎖は表面に結合し
ており、表面の二本鎖の形成の時点で、その二本鎖に結合した抗体の存在を検出
することができる。 タンパク質タイターは、例えば抗体、リガンド、レセプター又は所望のタンパ
ク質の任意の結合パートナーを用いるエライザによって、当該分野で知られてい
る様々な方法によって検査することができる。所望の生成物の存在はまた機能ア
ッセイによって検査することができる。例えば、所望の生成物が分泌された酵素
である場合は、機能アッセイは基質への酵素作用について細胞上清をアッセイす
ることを含む。他の免疫学的方法、例えば免疫沈降法、抗体を用いるウェスタン
ブロット及びプロービング、組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培地又は体
液のアッセイ法を用いて遺伝子産物の発現を直接定量することができる。免疫組
織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結
合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、ここで、標識は通
常は視覚的に検出可能なもの、例えば酵素的標識、蛍光標識、ルミネセンス標識
等々である。本発明での使用に適した特に感受性のある染色技術は、Hsu等, Am.
J. Clin. Path., 75: 734-738(1980)に記載されている。上清又はライセート中
に存在するタンパク質を直接的又は間接的に標識することができる。標識用タン
パク質の生合成及びその他の方法は従来から知られている。
【００５６】 転写レベルは所望のタンパク質の合成レベルの有用な間接的指標である。ＲＮ
Ａは、ＰＣＲ、ＰＴ−ＰＣＲ又はノーザンブロット分析のような常套的な方法に
より、適当なプライマー、オリゴヌクレオチド又はプローブを使用して、分析す
ることができる。好適な実施態様では、ｍＲＮＡは、スプライシング効率を決定
するのに有用な定量ＰＣＲによって解析され、タンパク質の発現はエライザを使
用して測定される。 対象タンパク質は、分泌ポリペプチドのように培地から回収されるのが好まし
く、又は分泌シグナルなしで発現される場合には宿主細胞ライセートから回収す
ることができる。生成物遺伝子がヒト由来のもの以外の組換え細胞で発現される
場合、対象の生成物はヒト由来のタンパク質又はポリペプチドを完全に含んでい
ない。しかし、対象生成物について実質的に均一である調製物を得るには組換え
細胞タンパク質又はポリペプチドから対象生成物を精製する必要がある。第一の
工程として、培地又はライセートを遠心分離して微粒状細胞片を除去する。つい
で、対象生成物を汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、例えば免疫
親和性又はイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿法；逆相ＨＰＬＣ；シリ
カ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥでのクロマトグラフィー；クロマトフ
ォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿法；例えばセファデッ
クスＧ−７５を用いるゲル電気泳動法；対象生成物を結合させるプラスミノーゲ
ンカラム及びＩｇＧのような汚染物質を除去するプロテインＡセファロースカラ
ムでのクロマトグラフィーによって精製する。
【００５７】 本発明はまたバイアルのような適切な容器に本発明の一又は複数のポリヌクレ
オチドを含むキットを提供する。発現ベクターを含むポリヌクレオチドは、対象
の選択配列の挿入のための少なくとも一つのクローニング部位を含み得、又はベ
クター中に既に存在する特異的対象遺伝子を有しうる。一実施態様では、キット
中のポリヌクレオチドは、一つの転写ユニットのイントロンにＤＨＦＲ遺伝子を
持つ二つの転写ユニットと、第二の転写ユニットの第二のイントロンの下流にＧ
ＦＰ遺伝子を含む。ポリヌクレオチドは脱水又は凍結乾燥形態で、あるいは水溶
液で提供できる。キットは脱水ポリヌクレオチドを再構成する緩衝液を含むこと
ができる。他の試薬、例えば反応緩衝液、比較のための陽性及び陰性コントロー
ルベクターをキットに含めることができる。一般には、キットはまたその中の試
薬の使用方法に対する指示書を含む。 発明は、発明を例証するためのもので、その範囲を限定するものではない次の
実施例を参照すると、より十分に理解されるであろう。全ての文献と特許引用文
献は出典明示により明示的に取り込まれる。
【００５８】 実施例 略語 CHO、チャイニーズハムスター卵巣；dNTP、デオキシリボヌクレオシドトリホ
スフェート；DHFR、ジヒドロ葉酸還元酵素；DNase、デオキシリボヌクレアーゼ
；ELISA、(エライザ)酵素結合免疫吸着検定法；FACS、蛍光標示式細胞分取器；F
AM、６-カルボキシフルオレセンス；FBS、ウシ胎児血清；GFP、緑色蛍光タンパ
ク質；GHT、グリシン、ヒポキサンチン及びチミジン；IRES、内在性リボソーム
認識部位；kb、キロベース；kDa、キロダルトン；mfe、ミリオンフルオレセイン
等量；MTX、メトトレキセート；NT3、ニューロノトロフィン-3；PBS、リン酸緩
衝液；PCR、ポリメラーゼ連鎖反応法；RNase、リボヌクレアーゼ；RT-PCR、逆転
写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法；TAMRA、６−カルボキシテトラメチルローダミ
ン；VEGF、血管性上皮成長因子。
【００５９】 実施例１ 実施例１は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞中、単一ベクターから
、様々な所望のタンパク質、緑色蛍光タンパク質（GFP）、及びDHFR等の構築及
び発現について記載する。本実験は、高発現クローンはGFPの発現に基づくFACS
選別により得られることを示した。２つのプロモーター系が所望のタンパク質及
びGFPを発現するために使用された。DHFR及び所望のタンパク質は、一つの転写
ユニットから発現され、GFPは別の転写ユニットから発現された（図1及び図6）
。 形質移入された細胞は、選択培地中で増殖させ、GFPの蛍光により選別され、F
ACSによってクローン化された。以下に示す、種々の、所望のタンパク質（酵素
及び成長因子）が、ここで示したベクターから発現された：ニューロノトロフィ
ン-3（NT3）、デオキシリボヌクレアーゼ（DNase）及び血管性上皮成長因子（VE
GF）。FACS選別により、高発現クローンを得る機会が著しく増大した。 全般的
には、所望のタンパク質ＲＮＡとGFPのＲＮＡ間、及び所望のタンパク質とGFP蛍
光の発現量間における良好な関連性 が、所望タンパク質−GFPを発現するクロー
ンにおいて観察され（図8A-B、9A-B及び11A-Dを参照のこと）、二つの関連した
転写ユニットの良好な同時発現効率を証明している。
【００６０】 １．材料と方法 １．１ プラスミドの構築 Lucas等, Nucleic Acid Res. 24:1774-1779(1996)に記載されているように、
イントロン中にDHFR遺伝子を含むベクターは、マウスDHFRのcDNAを発現ベクター
、pRK（Suva等, Science 237:893-896(1987)）のイントロンに挿入することによ
り構築された。発現ベクターpRKは、CMVの即時型初期遺伝子プロモーター及びエ
ンハンサー（CMV IE P/E）により作動し、CMV IE遺伝子由来のスプライシングド
ナー部位とIgG重鎖可変領域由来のスプライシングアクセプター部位を持つ（Eat
on等, Biochem 25:8343-8347(1986)）。EcoRV部位がpRKの144bpのイントロン部
分にあるSD配列より36ベース下流に存在するBstX1部位へ挿入された。マウスDHF
RcDNA（Simonsen及びLevinson(1983)、上掲）を含む678bpの平滑末端断片は、Ec
oRV部位に挿入された。 図５は、5141bpの大きさで、太線で示されるクローニングリンカー領域（ClaI
からHindIIIまでのマルチクローニングサイト）を含むDHFRイントロンベクター
、pSV15.ID.LLn（Lucas等, (1996), 上掲）を示す。ベクターpSV17.ID.LLnは、
マルチクローニングサイトが逆のため HindIIIサイトが1289の位置で、ClaIサイ
トが1331であること（図示せず）以外は、このベクター（pSV15.ID.LLn）と同一
である。 GFPをDHFRとのみ発現させるために、GFPS65TをコードするcDNAを含むpCMV.S65
T.GFP（Ropp等, Cytometry 21:309-317(1995))）からのEcoRI-HindIII断片が、L
ucas等, (1996), 上掲、に記載されているジシストロニックDHFRイントロンベク
ターのクローニングリンカー領域に挿入された。 目的のタンパク質（例えば、NT3、DNase又はVEGF）をGFPと共に発現させるた
めに、DHFRイントロンベクターのクローニングリンカー領域の下流に存在するAv
rII 1900は、SpeIサイトに変換された。この修飾されたベクターは、369の位置
でAvrIIによって、1550の位置でKpnIによって切断され、4kbのKpnI-AvrIIバック
ボーン断片が単離された。NT3、DNase又はVEGF165ｃDNAは、先にDHFRイントロン
ベクターにクローニングされた。DHFR及びNT3、DNase又はVEGFのいずれか一つを
コードするcDNAを含む2kbのAvrII-KpnI断片は、これらのベクターから単離され
、ユニークなSpeIサイトを持つNT3、DNase又はVEGFの発現ベクターを得るために
、上述したKpnI-AvrIIバックボーン断片と連結させた。DHFR遺伝子を含まないこ
と以外はpSV15.ID.LLnと同一であるベクターから、GFRS65T及びSV40のポリAをコ
ードするcDNAを含むAvrII-AvrII断片が、ベクター中、GFPの5'側に存在する第二
のSV40のプロモーター下でGFPを発現させるための第二の転写ユニットを得るた
めに、SpeIサイトにクローン化された。図６は、VEGFを発現させるための２つの
転写ユニットを持つベクターの例を示す。DHFR、対象遺伝子、及びGFPの各々が
そのATG開始部位を有している。
【００６１】 １．２． 細胞培養及び形質移入 CHO K1 DUX B11(DHFR-)の誘導体であるDP12細胞は、2 mM L-グルタミン、10μ
g/ml グリシン、15μg/ml ヒポキサンチン、5μg/ml チミジン、5% ウシ胎児血
清（Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD）を添加した、F12とDMEM
が50：50の割合である培地中で増殖させた。直径100 mmのプレートで増殖させた
CHO細胞（約80-85％のコンフルエント）は、直線化されたプラスミド（15μg）
で形質移入された。GFP単独、GFPとNT3（NT3はRosenthal等, Neuron 4:767-773(
1991)に既載）又はGFPとDNase（DNaseはShak等, Proc.Natl.Acad.Sci USA 87:91
88-9192(1990)に既載）の発現のための形質移入は、リポフェクタミン（Gibco B
RL）により、VEGF単独（Leung等, Science 246:1306-1309(1989)）又はGFPとVEG
Fは、SuperFect（Qiagen Inc., Santa Clarita, CA）により、製造元の説明書に
従って行った。形質移入されたCHO細胞は、2 mM L-グルタミン、5% 透析ウシ胎
児血清が添加されたGHTフリー（グリシン、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く
培地）のF12/DMEM培地中で増殖させた。 メトトレキセート（MTX）中で細胞を増殖させるために、形質移入された細胞
は、10 nM MTX（Sigma, St Louis, MO）を含む培地中に移し、MTX濃度をある時
間にわたって徐々に上昇させた。GFP蛍光発光と目的のタンパク質の生産性との
連関を調べるために、100 mmディッシュあたり1.5 x 106細胞で播き、２日間、
生産性の測定のために培養した。上清を回収し、発現された目的のタンパク質の
量をエライザにより測定した。生産性（pg/cell/day）は、pg/((Ct-C0)t/ln(Ct/
C0)))として計算され、ここでC0及びCtは、細胞の初期及び最終数であり、tはイ
ンキュベーション時間である。MTX中で増殖させた細胞の生産性を調べるために
、培地中にMTXが含まれていた。
【００６２】 １．３．FACS フローサイトメトリーによる解析及び選別は、既述の如く、アルゴンイオンレ
ーザーを具備した（Ropp等, Cytometry 21:309-317(1995)）EPICS Elite-ESPサ
イトメーター（Coulter Corp., Hialeach, FL）を用いて行った。励起波長は、4
88 nmで、放射波長は、525±25 nmであった。100 mmディッシュ上の細胞は、ト
リプシン処理され、2%のダイアフィルターろ過されたFBSを含むPBSに再懸濁され
た。プロピジウムアイオダイドが添加され、細胞はPBS中で1000-3000細胞/秒で
選別され、増殖培地中に回収された。96-ウェルプレートへの単一細胞のクロー
ニングは、サイトメーターに備え付けられたオートクローンシステムを用いて行
われた。クローンの蛍光強度は、FACScanまたはFACSCaliburフローサイトメトリ
ー（Becton Dickinson, San Jose, CA）のどちらかを用いて測定された。カリブ
レーションパーティクル(calibration particle)（4700-3.3 x 105蛍光等量；Sp
herotech, Inc., Libertyville, IL）は、標準曲線を作成するために用いられた
。細胞の相乗平均蛍光強度の蛍光等量が計算され、データ分析に用いられた。
【００６３】 １．４．エライザ GFP エライザにおいて、エライザプレートは、50 mMの炭酸緩衝液、pH9.6中、
4℃一晩にて、野生型のGFP（Clontech, Palo Alto, CA）に対する2μg/mlのウサ
ギポリクローナル抗体でコートされた。プレートは、0.5％ウシ血清アルブミン
を含むPBS中で、1時間、室温でブロッキングされた。0.5%ウシ血清アルブミン、
0.05%ポリソルベート２０を含むPBS中の連続希釈サンプル及び標準物（野生型GF
P）をプレートに添加し、プレートを１時間インキュベートした。プレートに結
合したGFPは、野生型GFPに対するビオチン化されたウサギポリクローナル抗体が
添加され、続いてストレプタビジンペロキシダーゼ（Sigma）及び基質として3,3
',5,5'-テトラメチルベンチジン（Kirkegaard & Perry Laboratories）が添加さ
れることにより検出された。プレートは各ステップ間において洗浄された。吸光
度は、Vmaxプレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）上、450 nm
で読みとった。標準曲線は、４変数非線形回帰曲線至適化プログラム（Genentec
hにより開発された）により至適化された。標準曲線の直線領域上にのるデータ
値は、サンプル中のGFP濃度を計算するために用いられた。アッセイの領域は、0
.16-10 ng/mlであった。また、上清中のNT3、DNase又はVEGFはサンドイッチ型の
エライザを用いて測定された。NT3のエライザにおいては、組換体ヒトNT3(Genen
tech)に対する純種ブタポリクローナル抗体をコーティングに使用し、ビオチン
化された純種ブタポリクローナル抗体を検出に用いた。アッセイ範囲は、0.10-6
.25 ng/mlであった。DNaseのエライザにおいては、組換体ヒトDNase(Genentech)
に対するヤギポリクローナル抗体をコーティングに使用し、ビオチン化されたヤ
ギポリクローナル抗体を検出に用いた。アッセイ範囲は、0.39-25 ng/mlであっ
た。VEGFのエライザにおいては、組換体ヒトVEGF(Genentech)に対するモノクロ
ーナル抗体をコーティングに使用し、ビオチン化されたるモノクローナル抗体を
検出に用いた。アッセイ範囲は0.39-25ng/mlであった。VEGFエライザではコーテ
ィングにVEGFに対するモノクローナル抗体を使用し、ビオチン化されたモノクロ
ーナル抗体を検出に用いた。アッセイ範囲は、0.015-1 ng/mlであった（Shifren
等, J.Clin.Endocrinol.Metab. 81:3112-3118(1996)）。
【００６４】 １．５．RNAの定量化 全RNAは、RNase mini kit（Qiagen）を用いて調製され、濃度は吸光度により
決定された。RT-PCRは、7700 Sequence Detector（PE Applied BioSystems, Fos
ter City, CA）により、PE Applied BioSystemsから購入した試薬を用いて行っ
た。5'、3'末端プライマー及びプローブの配列は、GTGGAGAGGGTGAAGGTGATGC（配
列番号：３）、CGAAAGGGCA GATTGTGTGGAC（配列番号：４）、及びFAM-TAACCGCTA
CCGGGACAGGAAAATGGT-TAMRA（配列番号：５）が、それぞれGFPに対して使用され
、AGAGTCACCGAGGGGAGTA（配列番号：６）、CGTAGGTTTGGGATGTTTTG（配列番号：
７）、及びFAM-ACGGGCAACTCTCCTGTCAAACAAT-TAMRA（配列番号：８）が、それぞ
れNT3に対して使用され、AGCCACTGGGACGGAACA（配列番号：９）、ACCGGGAGAAGAA
CCTGACA（配列番号：１０）、及びFAM-CTGACCAGGTGTCTGCGGTGGACAG-TAMRA（配列
番号：１１）が、それぞれDNaseに対して使用され、TCGCCTTGCTGCTCTACCTC（配
列番号：１２）、GGCACACAGGATGGCTTGA（配列番号：１３）、及びFAM-CCAAGTGGT
CCCAGGCTGCACCCAT-TAMRA（配列番号：１４）が、それぞれVEGFに対して使用され
た。反応液は、50μl中に1 x 緩衝液A、4 mM 塩化マグネシウム、至適濃度のプ
ライマー（GFPに対しては20 nM、NT3及びVEGFに対しては50 nM、DNaseに対して
は25 nM）, 100 nM プローブ, 50 ngの全RNA, 0.3 mMdNTP(又は0.3 mMdNTPの代
わりに0.6 mMのdUTP), RNase阻害剤（400 U/ml), MuLVリバーストランスクリプ
ターゼ（250 U/ml）, TaqGold(25 U/ml)を含んでいた。PCRのサイクル条件は、4
8℃30分、95℃10分で、95℃30秒及び60℃2分の40サイクルで行った。増幅された
PCR産物は、1%SeaKem LEと3%NuSieveを1：3（FMC BioProducts, Rockland, ME）
で混合したアガロースゲルで解析したとき、各々予想される分子量（GFPは536bp
、NT3は243bp、DNaseは159bp、VEGFは202bp）を有していた。 １．６．統計学的解析 相関関係を調べるためのデータは、Fisher's r to z transformation（Stat V
iewプログラム, Abacus Concepts, Berkeley, CA）からのP値による相関係数を
用いて解析された。
【００６５】 ２．結果 ２．１．GFP単独の発現 DHFR CHO細胞は、GFP発現ベクターにより形質移入された。形質移入された細
胞は、GHTを含まない培地で増殖され、FACSにより異なる蛍光発光集団に選別さ
れた。高強度の蛍光発光のクローンを得るために、最も明るい細胞の5%を選別し
た。６倍高強度の蛍光発光を有する細胞が得られた。増殖２週間後、これらの細
胞は、第二回目の選別に供され、最も明るい細胞の１％を回収した。さらに増殖
２週間後、最も明るい細胞の0.4％が第三回目の選別でクローン化された。異な
る蛍光強度を持つ１８クローンが蛍光顕微鏡を用いて選別された。最も強い蛍光
発光クローンは、1.4 mfeの蛍光強度であった。 これらのクローンのGFP濃度を決定するために、コンフルエントな100 mmディ
ッシュ１枚の細胞を、1 mM AEBSF, 11 U/ml アプロチニン及び50 mM ロイペプチ
ン（ICN Biomedicals, Aurora, OH）を含む0.35mlの150 mM NaCl, 50 mM HEPES,
0.5 % Triton X 100中で、氷上15分間インキュベートすることにより、溶解物
が調製された。核はエッペンドルフ遠心機で14,000 rpm遠心して沈殿させ、上清
を回収しアッセイまで凍結させて保存した。細胞溶解物のGFP濃度は、BCAタンパ
ク質アッセイキット（Pierce, Rockford, IL）用いて全タンパク質濃度を測定す
ることにより基準化した。 これらのクローンを解析することにより、FACSにより測定されたGFP蛍光発光
は細胞溶解物中のエライザにより測定されたGFPと非常によく相関していた（相
関係数＝0.99，p<0.0001；図７）。従って、細胞のGFP蛍光発光は、これらのク
ローン中における細胞内GFPタンパク質量を定量的に表していた。このことは、G
FP蛍光発光値は、一過的に形質移入されたCHO細胞中における総GFP含量の有効な
測定値であることを示した（Subramanian等, J.Biotechnol 49:137-151(1996)及
びNatarajan等, J.Biotechnol. 62:29-45(1998)）、これまでの報告と一致して
いる。CHO細胞の増殖に対してGFPは目立った影響は及ぼさず、以前報告されたこ
と（Gubin等, Biochem. Biophys.Res.Commun. 236:347-350(1997))と同じであっ
た。これらのクローンのFACSプロファイルは、２週間の研究において同じ状態を
維持し、凍結後、再培養しても変化しなかった。
【００６６】 いくつかの選択されたクローンの溶解物は、還元状態下にて１６％のSDSポリ
アクリルアミドゲルによって解析された（Lammli等, Nature 227:680-685(1970)
）。タンパク質のブロッティング及び野生型GFPに対する抗体によるプロービン
グの結果、予想される27kDaの分子量（Prasher等, Gene 111:229-233(1992)）に
相当するバンドであることが分かった。 最初の選別から得られたいくつかの高強度の蛍光発光細胞は、２ヶ月間に渡り
MTX濃度を上昇させながら増殖させた。クローンは、50 nM（63クローン）及び10
0 nM(14クローン)のMTX濃度中で増殖させた細胞から手動で抽出し、蛍光顕微鏡
によりスクリーニングされた。選択された6つの50 nMクローン及び選択された5
つの100 nMクローンの蛍光強度は、FACSによって測定された。50 nM及び100 nM
のMTX濃度における最も高い蛍光強度のクローンは、それぞれ、1.6及び3.2 x 10 6 蛍光等量の蛍光強度（mfe）であった。これに対し、繰り返しFACS選別により得
られる最も高い蛍光強度のクローンは1.4 mfeの蛍光強度であった（図７）。従
って、FACS選別は、50 nM MTX中でのクローンの強度と一致する蛍光発光を持つ
クローンを選択したことになる。3.2 mfeの蛍光発光を持つ100 nM Mtxからのク
ローンは、FACS選別により得られた1.4 mfeを持つクローンよりも、2.3倍高いFA
CSによる蛍光測定値を持ち、エライザにより測定された細胞内GFPよりも2.2倍量
多かった。このことは、FACS選別により得られたクローンにいて、FACSによって
測定されたGFP蛍光発光とエライザによって測定された細胞内タンパク質量との
間に観察された相関関係は、3.2 mfeの蛍光強度のクローンにまで拡大適用でき
得ることを示すものである。さらに興味深いことに、FACS選別は、Mtxのみで選
別されたクローンにしばしば付随する不均一性及び不安定性の問題（Kaufman及
びSharp, 1982：Schimke, 1992, 上掲）をも回避する。
【００６７】 ２．２．GFPとNT3又はDNaseとの共発現 CHO細胞は、ニューロノトロフィン３（NT3）（Rosenthal等, Neuron 4:767-77
3 1990）又はデオキシリボヌクレアーゼ（DNase）（Shak等, Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 87:9188-9192 1990）及びGFPをコードするcDNAを含むDHFRイントロンベク
ターで形質移入された。DHFR及びNT3又はDNaseは、一つの転写ユニット中で発現
され、GFPは第二の転写ユニット中で発現された（図1, 列４及び図６）。選択か
ら約２週間後、又は選別のために利用可能な十分な細胞が得られる時に、形質移
入された細胞は、FACSにより選別されクローン化された。高い蛍光発光を持つク
ローンは、最初の選別において最も明るい5％の細胞を選別し、その細胞を２週
間増殖させ、上位4％（NT3）又は2％(DNase)の細胞を第二回目の選別においてク
ローン化した。異なる蛍光強度を持つ１７のNT3-GFPクローン及び１５のDNase-G
FPクローンが蛍光顕微鏡を用いて選択された。 生産性及びGFP蛍光発光の間の相関が、１７のNT3-GFP生産クローン（相関係数
＝0.68，p=0.0018；図８Ａ）及び１５のDNase-GFP生産クローン（相関係数＝0.5
2，p=0.048；図９Ａ）において示された。（検出できないNT3又はDNase産物のを
有するクローンの生産性は、それぞれエライザアッセイの限界値を用いて起算さ
れた）。従って、GFP蛍光発光によりFACSを用いて細胞を選別することにより、
高い生産性のクローンを得る機会が増加した。NT3-GFPクローンは、同じGFP蛍光
発光を持つDNase-GFPクローンと比較して、NT3（単量体で15kD；Rosenthal等, N
euron 4:767-773 1990）とDNase（29kD；Shak等, 1990）の分子量を考慮したと
しても、かなり低い生産性しか示さなかった。NT3は前駆体タンパク質として合
成され、その後成熟体にプロセスされることが知られており、発現が困難である
ことが見いだされていた。FACS選別は、発現が困難な分子について高発現のクロ
ーンを得るために、特に0有用であろう。 リアルタイムPCRを用いたRT-PCRにより測定されたNT3又はDNase RNA量は、個
々のクローンにおいて非常によく生産性と相関していた（NT3及びDNaseは共に、
相関係数＝0.91，p<0.0001；図８Ｂ及び9B）。RNAの量は、最も高い蛍光発光を
持つクローンのRNAの量に対して規準化した。
【００６８】 ２．３．FACSによるの高い生産性を示すVEGFクローンの入手とランダムに抽出し
たクローンの比較 血管性上皮成長因子（VEGF）（Leung等, 1989）を、GFPと共に発現した。形質
移入された細胞は、FACSにより選別されクローン化された。VEGFは、インヴィト
ロにおいて血管性上皮細胞に対するタンパク質性の分裂促進因子であり、インヴ
ィボにおいて血行性の因子である。形質移入された細胞は、FACSにより選別され
クローン化された。高い蛍光発光を示す細胞を得るために、上位2.5％の細胞が
選別され、35,000の細胞が回収された。さらに２週間増殖させた後、上位1.5％
の細胞が第二回目の選別により選別され50.000細胞が回収された。さらに２週間
増殖させた後、上位0.5％の細胞が第三回目の選別において選別された。繰り返
し選別により、高い蛍光発光を示す細胞集団が濃縮された。 非選別細胞集団における高い蛍光の蛍光強度は、0.025 mfe（図１０A）、第一
回目の選別に由来する細胞は0.12 mfe、第二回目の選別に由来する細胞は1.2 mf
eであった（図１０B）。第三回目の選別に由来する最も高い蛍光を発する細胞の
蛍光強度は、5.0 mfe（図１０C）であった。蛍光顕微鏡で観察すると、非常に明
るい蛍光が細胞質及び核全体に分布しているのが観察され、前の報告（Ogawa等,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11899-11903 1995；Subramanian等, J.Biotechnol
49:137-151 1996）と一致する。上述のようにして得られた15の強い蛍光を示す
クローンを含む、異なる蛍光強度を示す48クローンは、相関を調べるために、蛍
光顕微鏡により選択された。
【００６９】 これらクローン化された細胞を解析することにより、強い蛍光を発するクロー
ンは、大量のVEFGを産生し、VEGFの生産性は、GFPの蛍光量とよく相関すること
が示された（相関係数＝0.70，p<0.0001；図１１A）。従って、FACS選別は、高
い生産性のクローンを得るために非常に有用であった。さらに、VEGFの生産性は
、VEGFのRNA量と非常によく相関し（相関係数＝0.90，p<0.0001；図１１B）、GF
Pの蛍光値はGFPのRNA量とよく相関した（相関係数＝0.78，p<0.0001；図１１C）
。さらに、VEGF RNAは、GFPのRNA量とよく相関した（相関係数＝0.71，p<0.0001
；図１１D）。 FACSにより高いVEGFの生産性を示すクローンを得るのに２ヶ月を要した。選別
の間の２週間自発的に増幅されるクローンの頻度を増大（Johnson等, Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 80:3711-3715 1983）させないのであれば、FACSの選別ステップ
は、選別の間の期間をより短期間にすることにより短縮することが可能であろう
。 ４種のVEGF-GFPクローンがMTXによって増幅され、500 nM MTX中にて２ヶ月半
に渡りクローン化された。3.3 pg/細胞/日を生産する２種のクロンにおいて、生
産性は、以前として同一に保たれおり、このことは、高い生産性を示す細胞には
、増幅において高濃度のMTXが必要とされるであろうことを示す。いくつかのク
ローンにおいて、生産性が1.9 pg/細胞/日から減少したものもあれば、1.3 pg/
細胞/日を生産するクローンに関しては、4-5 pg/細胞/日に増加した。従って、F
ACS選別によって得られるクローンは高い生産性のクローンを得るためにMTXによ
って増幅され得る。
【００７０】 伝統的な方法により高い生産性を示すクローンを得るためには、100 mmプレー
ト中のCHO細胞は、VEGF発現ベクターで形質移入され、細胞の半数をGHTフリーの
培地中、６枚の100 mmプレートに継代された。形質移入２週間後、144クローン
（各プレートから24クローン）がランダムに抽出され、96ウェルプレートへ移さ
れ、エライザによりVEGFの産生に対するスクリーニングが行われた。次の評価の
ために、24のVEGFクローンが12ウェルプレートに移された。9のクローンが選択
され、それらの生産性が測定された。クローンをランダムに抽出することにより
得られた最も高い生産性を示すクローンは、0.71pg/細胞/日を産生した。これに
対し、FACSによって得られた最も高い生産性を示すクローンは、4.4pg/細胞/日
を産生した。従って、FACS選別は、高い生産性を示すクローンを効率よく選び出
し、その結果、より高い生産性を示すクローンがFACS選別により得られた。 GFPの蛍光発光は、Mtx中で高い生産性のクローンを選択することに対し、有用
であるかどうかを評価するために、VEGF及びVEGF-GFP産生細胞を、一ヶ月半の間
、増加するMTX濃度中で生育させた。細胞は、蛍光顕微鏡を用いて選択された７
のVEGF-GFPクローン（Mtx 25 nMから4クローン、50 nMから3クローン）から抽出
された。7つのクローンは全てかなりの量のVEGF（0.6-3.2pg/細胞/日）を産生し
た。相対的に、Mtx（25 nMから10クローン、50 nMから15クローン、100 nMから
20クローン）中、45のランダムに選択されたVEGFクローンから抽出された細胞は
、2.4pg/細胞/日しか産生しなかった。従って、蛍光顕微鏡により、Mtx中におい
てよく生産する細胞が選択され、このことは、FACSは、Mtx中で選択される細胞
の更なるスクリーニングにとって有用であることを示す。ランダム抽出又はFACS
選別にどちらかにより得られた上位5番目までの産生クローンの生産性、及びラ
ンダム抽出又は蛍光顕微鏡により得られたMtx中で得られた上位5番目までの産生
集団の生産性は、図１２に示されている。
【００７１】 実施例２ 実施例２には、抗体重（H）鎖遺伝子が位置の転写ユニットにクローン化され
、軽（L）鎖遺伝子が第二の転写ユニットから転写されるベクターからの抗IgEヒ
ト化抗体（E26）の発現について記述されている。E26抗体の詳細については、１
９９９年１月１４日に発行された国際公開第９９/０１５５６を参照のこと。図
４は、DHFR DP12 CHO細胞中におけるE26抗体を発現するために使用されたベクタ
ーの異なる配置を示す。転写ユニット無とは、イントロンに挿入遺伝子がクロー
ン化されていない（空のイントロン）ことを意味する。図より明らかなように、
抗体のH鎖とL鎖は、２つの転写ユニットの位置において相互に変換可能である。
同様に、第一又は第二のイントロンに存在するGFP及び増幅可能な選択マーカー
の位置も、相互に変換可能である。一の構築物において、選択マーカーであるピ
ューロマイシンが第一のイントロンにクローン化され、第二のイントロンは遺伝
子挿入が空のままであり、DHFR-GFP融合遺伝子はIRESの3'側に挿入された（図４
の中段）。 図１５は、E26抗体を発現する細胞プールのGFP FACS解析の結果を示す。平均
のGFP値（log-GFP）は100％ゲート化された細胞について測定された。また、抗
体の発現レベルは、48時間後（図１４）に、各プール同一の条件下にてアッセイ
され、GFP発現との相関について比較された。GHT不添加の培地中、DHFRプロトコ
ール（Ｄ）に対して最小緊縮性の標準で選択された細胞に比較して、かなり高い
緊縮性の条件である10 nMのmtx（10 nM）中で選択されたプールは、生産性及び
平均のGFP蛍光発光の両方において増加を示した。また、GHT不添加培地のプール
のうち２つは選別され、上位5％の蛍光値の細胞が増やされ、抗体発現及びGFP蛍
光発光に関し再評価された。各場合において、抗体の発現は蛍光（選別）により
向上した。全ての場合において、H鎖の5'側イントロンに存在する選択マーカ（D
HFR又はピューロマイシン-DHFR融合体）と、L鎖の5'側イントロンに存在するGFP
遺伝子の配置は、その発現とGFPの定量において一致した相関関係を示した。
【００７２】 実施例３ 実施例３には、図１６に示されるSVintPDORESGFPベクターの使用について記載
されているが、このベクターは、ゲノム機能構造解析においてハイスループット
な発現のために用いられるものである。ゲノム機能構造解析の試みの目的は、大
量のバイオアッセイにおいて調べるために十分な量のタンパク質を発現されるこ
とであった。この目的を達成する上で、分泌タンパク質をコードする数千ものcD
NAの発現が目的とされるため、非常に効率的でハイスループットな発現な方法が
用いられなければならない。機能ゲノム解析のライブラリー中の遺伝子は、タン
パク質の単離とそれに続くcDNAのクローニングに依る伝統的なアプローチという
よりは、むしろ主にゲノム検索の方法論に基づいた発現を行うために選択されて
きた。発現されるcDNAは、それらのタンパク質が未だ性質決定されておらず、タ
ンパク質に特異的な試薬（例えば、抗体）が存在しない場合、それらの検出及び
精製を可能ならしめるために、C末端又はN末端のどちらかに「タグ」を含むよう
に修飾された。 ベクター（図１６）の転写ユニットは、SV40プロモーター（SV40）、イントロ
ン中のピューロマイシン/DHFRハイブリッドからなる選択マーカーを含み、ピュ
ーロマイシンかDHFRのいずれかによる選択を可能ならしめている；マルチプルク
ローニング部位（MCS）は目的のタンパク質の挿入のため；GFPの前に存在する内
在性リボソーム認識部位（IRES）は単一のmRNAから対象の遺伝子とGFP遺伝子の
いずれの翻訳をも可能にするためものものである。当該ベクターは、選択マーカ
ー、対象のタンパク質、及び増強されたタイプの緑色蛍光タンパク質（GFP）、
これら全てが単一の転写前駆体より生成されることを可能にした。単一の転写産
物上でこれら全てが関連性を有することにより、対象のタンパク質を高いレベル
で発現する細胞を選択し、FACS選別することが可能となる。この過程は、他の方
法が必要となるような手動によるクローンの単離を行うことなく、全て実施可能
である。
【００７３】 図１７は、伝統的なベクターと技術を用いた場合と、ここに記載のベクターと
方法論を用いた場合の２つのタンパク質（8つのヒスチジン残基を持つC末端部を
含むように修飾されたもの）の発現を示す。そのうちの一つは、52196Hisを表記
されており、細胞の異なる選択及び選別変数下における発現レベルが、タンパク
質ゲルのレーン１から６に示されている；第二のタンパク質は、33222Hisと表記
されており、発現レベルがレーン９から１２に示されている。レーン８は、VEGF
のポリHisタグ化された形態に対応するバンドを示す；このタンパク質発現レベ
ルは、発現の基準量を提供する。即ち、ここに示すVEGF-Hisと同レベルの発現か
、それ以上で発現されたタンパク質は、内部バイオアッセイにおいて用いるのに
十分な量のレベルである。伝統的なアプローチを用いた場合、これらのタンパク
質のアッセイには不十分な量のタンパク質しか産生されなかった。SVintPDIresG
FPベクターによる形質移入に引き続き、DHFR発現による選択、発現を行った集団
から最も強い蛍光発光(上位5%)を示す細胞をFACS選別することで、実験を行った
２つタンパク質おいて、各々7.3倍、12.7倍の増量となる。最も高い発現レベル
は、GFP蛍光発光を用いたFACS選別により達成された。ピューロマイシン又は低
レベルでのメトトレキセート選択により、わずかな発現の増加が見られた。これ
らの結果は、7日間、同数の細胞をインキュベートし、培地を集め、Niセファロ
ースビーズを用いてポリHisタンパク質を回収し、洗浄後イミダゾールによりビ
ーズからタンパク質を溶出し、その後タンパク質を製造者の説明書に従ってウェ
スタン分析に供すること基づいている。 次いで、図１７に示される薬剤選択又は選別単独によるHer2の発現レベルと比
較するために、薬剤選択が選別と組み合わされる。形質移入された細胞は、mtx
の固定又は増加濃度下にて選択され、生存細胞のプールは、蛍光発光細胞のうち
最も明るい5%及び1%を対象とする高レベルの選別に供される。タンパク質発現解
析は、上述の如く行われる。
【００７４】 実施例４ 実施例４には、ガンの免疫治療の標的とされる細胞表面タンパク質を評価する
ためのCMVintPDIresGFPベクターの使用について記載される。この試みは、腫瘍
に共通に増幅される細胞表面タンパク質をコードする遺伝子を同定するためのゲ
ノム機能構造解析に基づくアプローチである。腫瘍細胞の表面に高度に発現され
るタンパク質は、Her2を過発現する乳ガン腫に対するHERCEPTIN（登録商標）（
組換体ヒト化抗Her2モノクローナル抗体、米国特許第５，８２１，３３７番）に
よる治療のように、細胞自体を抗体治療に感受性にする可能性がある。 Her2（ErbB2又はp185neu）は、Erbファミリーの第二のメンバーであり、元々
、化学的に処理されたラットの神経芽細胞腫由来の形質転換遺伝子の産物として
同定された。Her2膜貫通タンパク質である。neuのヒトホモログの増幅は、乳ガ
ン及び子宮ガンにおいて観察され、予後の悪さと相関を示す（Slamon等, Scienc
e, 235:177-182 (1987)；Slamon等, Science, 244:707-712 (1989)；及び米国特
許第４，９６８，６０３号）。ErbBの過発現（しばしば遺伝子増幅によるが常に
そうではない）は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓、膀
胱を含む他の癌腫にも観察された。他を参照のこと（King等, Science, 229:974
(1985)；Yokota等, Lnacet, 1:765-767(1986)；Fukushigi等, Mol Cell Biol.,
6:955-958 (1986)；Geurin等, Oncogene Res., 3:21-31(1988)；Cohen等, Onco
gene, 4:81-88(1989)；Ynemura等, Cancer Res., 51:1034(1991)；Geurin等, On
cogene Res., 3:21-31(1988)；Borst等, Gynecol Oncol., 364 (1990)；Weiner
等, Cancer Res., 50:421-425(1990)；Kern等, Cancer Res., 50:5184(1990)；P
ark等, Cancer Res., 49:6605(1989)；Zhau等, Mol.Carcinog., 3:354-357(1990
)；Aasland等, Br.J.Cancer., 57:358-363(1988)；Williams等, Pathiobioloby,
59:46-52(1991)；Weiner等, Cancer Res., 50:421-425(1990)；及びMaCann等,
Cancer, 65:88-92(1990)）。ErbB2は、前立腺ガンにおいて過発現されている可
能性がある（Gu等, Cancer Lett., 99:185-189(1996)；Ross等, Hum.Pathol. 28
:827-833 (1997)；Ross等, Cancer 79:2162-2170(1997)；及びSadasivan等, J.U
rol. 150:126-131(1993)）。Her2のcDNA配列及びアミノ酸配列は、Yamano等 Nat
ure 319:230-234に提供されている。
【００７５】 このアプローチを評価するために、ガン関連細胞表面タンパク質の例として、
野生型Her2が、SV40初期プロモーターに代わりにサイトメガロウィルス即時型初
期プロモーター（CMV IE）により転写が作動される以外は、前出実施例３に記載
のベクターと同様のベクターから発現された。このプラスミドは、従来ドミナン
トに作用する発ガン遺伝子の同定に使用されてきたNIH3T3細胞に形質移入された
。NIH3T3細胞が形質転換型表現型を示すためには、野生型Her2遺伝子が高度に増
幅されなければならないことが、以前の研究により示されていた。形質移入の後
、NIH3T3細胞は、ピューロマイシン中での選択に供された。その後、これらの細
胞の幾つかは、GFPの高レベルな発現（上位5%）に基いて選択された。次いで、
非選別細胞及び選別細胞は、GFPとHer2の発現に対して２色の蛍光を用いて評価
された。負のコントロールとして空のベクターが形質移入された。Her2は、HERC
EPTIN（登録商標）（Genentech, Inc., S. San Francisco,CA）を用い、フィコ
エリトリンを結合させたヒトIgGによる細胞染色により検出された。図１８Aは、
ベクターのみでHer2は形質移入されていない細胞の結果を示す。図１８B-Cは、
実際に、GFPの発現が、対象の遺伝子の発現と密接な連関を持つことを実証する
形質移入された細胞表面上でのGFPとHer2との間における直線的な相関を示す。H
er2の発現は、GFPの選別により10倍増加した。図１９は、Her2の発現に富む細胞
集団は、強化された形質転換表現型を示すことを確認するものであった。コント
ロールの細胞には、形質転換増殖巣は存在せず（図１９Ａ）、Her2の非選別細胞
は、ほとんど増殖巣が存在せず（図１９Ｂ）、GFPで選別した集団は、均一な複
数層の形質転換細胞として増殖した（図１９Ｃ）。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ９つの例示的な構築物のデザインを模式的に示す。遺伝子とは、
対象の遺伝子のことである；空とは挿入遺伝子が存在しないイントロを意味する
；DHFR-ＧＦＰは融合遺伝子を示す。
【図２】 異なる転写産物、つまりスプライシングされた産物とされていな
い産物に由来する翻訳産物及びそれらの相対量を示す。図２A、2B及び2Cは、そ
れぞれ図1の配置1、3及び4にに対応する。Goiとは、対象の遺伝子を意味する；T
U、転写ユニット；T1-4は、構築物の指示された領域からの異なる転写産物を意
味する。
【図３】 対象遺伝子の発現のための単一転写ユニットを持つベクター中の
、イントロンとIRESとの組合わせを模式的に示す。ＧＦＰで選択するために、Ｇ
ＦＰ遺伝子は介在性（転写において連関する）、IRES配列の後（翻訳において連
関する）にも存在し得、また、、選択マーカと連結され、イントロン中又はIRES
配列の後に位置した融合タンパク質として発現され得る。
【図４】 完全なE26抗体を形成するE26抗体重鎖及び軽鎖の例示的な発現の
ためのイントロンとIRESの複数転写ユニット配置中における組合わせを示す。
【図５】 実施例１に記載の例として示される介在性DHFRイントロンベクタ
ー、pSV15.ID.LLnの構築物を示す。
【図６】 VEGFを発現させるための２つの転写ユニットを持つベクターの例
を示す；図1の配置４を参照のこと。
【図７】 エライザによって測定された細胞溶解物中のＧＦＰタンパク質量
が、18のＧＦＰ発現クローン中のFACSによって測定されたＧＦＰの蛍光発光と相
関していることを示す（相関係数=0.99, p<0.0001）。エラーバーは、少なくと
も２回のエライザのデータ値からの標準偏差である。
【図８】 図８Ａは、17のNT3-ＧＦＰ発現クローンにおける、ＧＦＰ蛍光に
対するNT3の生産性を示す（相関係数=0.68, p=0.0018）；図８Ｂは、NT3の生産
性に対するNT3RNAの相対量を示す（相関係数=0.89, p<0.0001）。
【図９】 図９Ａは、15のDNase-ＧＦＰ発現クローンにおける、ＧＦＰ蛍光
に対するDNaseの生産性を示す（相関係数=0.52, p<0.048）。エラーバーは、少
なくとも3回のエライザのデータ値からの標準偏差である。図９Ｂは、DNaseの生
産性に対するDNaseのRNA相対量を示す（相関係数=0.90, p<0.0001）。エラーバ
ーは、少なくとも２回のRT-PCRの測定値からの標準偏差である。
【図１０】 VEGF及びＧＦＰを発現するCHO細胞のフローサイトメトリーの
プロファイルを示す。図１０Aは、形質移入の2週間後で最初の選別直前の細胞の
蛍光プロファイルを示す。右のピークの蛍光強度は、0.025 mfeである。非形質
移入細胞のバックグラウンド蛍光発光は、0.0005 mfeであった。図１０Bは、３
度目の選別直前の細胞の蛍光プロファイルを示す。平均の蛍光強度は、1.2 mfe
であった。これらの細胞は、最初の選別において上位2.5%の蛍光強度を持つ35,0
00細胞、及び上位1.5%の蛍光強度を持つ50,000細胞を回収して得られた。細胞は
、選別と選別の間、２週間増殖させた。図１０Cは、最も強い蛍光を発するクロ
ーンの蛍光プロファイルを示す。蛍光強度は5.0 mfeであった。
【図１１】 48のVEGF-ＧＦＰ発現クローンにおける、ＧＦＰ蛍光に対するV
EGFの生産性を示す（相関係数=0.70, p<0.0001）。VEGFの濃度は、少なくとも３
回のデータ値の平均であった。エラーバーは、標準偏差である。図１１BはVEFG
生産性に対するVEGF RNAの相対値を示す（相関係数=0.90, p<0.0001）。図１１C
はＧＦＰ蛍光に対するＧＦＰ RNA量の相対値を示す（相関係数=0.78, p<0.0001
）。図１１Dは、ＧＦＰ RNA量に対するVEFG RNA量の相対値を示す（相関係数=0.
71, p<0.0001）。エラーバーは、２回のRT-PCRの測定値からの標準偏差である。
VEGF又はＧＦＰ RNAの量は、最も強い蛍光強度を示すクローンのRNA量に対して
標準化された。
【図１２】 ランダム抽出及びVEGFのクローニング（白四角）、又はＧＦＰ
蛍光強度に基づくFACS選別及びVEGF-ＧＦＰ産生細胞のクローニング（白丸）の
どちらかにより得られた、上位５つの発現クローンにおけるVEGF生産性の比較を
示す；また、MTX中におけるVEGF産生集団のランダム抽出（25 nM から3、50 nM
から1、100 nMから1）（黒四角）、又はVEGF-ＧＦＰ産生細胞の蛍光顕微鏡によ
るスクリーニング（25 nM から2及び50 nMから3）（黒丸）のどちらかにより得
られた、上位５つの発現クローンにおけるVEGF生産性の比較を示す。
【図１３】 抗IgE抗体、E26の重鎖（図１３A；配列番号１）と軽鎖（図１
３B；配列番号2）の全長のアミノ酸配列を示す。
【図１４】 異なるＧＦＰ配置からのE26抗体の発現レベルを示す。グラフ
の各バーの下の表記は、5'から3'の方向に、H鎖を転写するのに用いられたプロ
モーター（SV40又はMPSA=骨髄増殖性サルコーマウィルスプロモーター及びエン
ハンサー、又はVISNA＝レンチウィルスP/E）、第一イントロンの選択マーカー（
DHFR, ＧＦＰ, PD＝ピューロマイシン/DHFR融合体、DHFR/ＧＦＰ＝融合体）、L
鎖を転写するために用いられるプロモーター、及び第二転写ユニットの第二イン
トロンに存在するマーカーを示す。空は、空のイントロンのことを表す；IR/Ｇ
ＦＰは、空の第二イントロンを伴うＧＦＰが後に続くIRESを表す。
【図１５】 異なるＧＦＰ配置を持つベクターからE26を発現する細胞のＧ
ＦＰの平均値を示す。
【図１６】 実施例３に記載されているような、ゲノム機能構造解析ライブ
ラリーからのcDNAによりコードされる分泌タンパク質の発現を増加させるために
使用されたベクター（SVintPDIresＧＦＰ）の配置を示す。この転写ユニットは
、SV40プロモーター（SV40），イントロン中のピューロマイシン/DHFRハイブリ
ット選択マーカー（Pur/DHFR）, 対象の遺伝子挿入のためのマルチクローニング
サイト（MCS）, 内在性リボソーム認識部位（IRES）,及びＧＦＰを含む。
【図１７】 後述の実施例３に記載されているように、図１６に示されるベ
クターSVintPDIresＧＦＰからの、２つのHisタグcDNA（52196His及び33222His）
のタンパク発現レベルを比較している。タンパク質ゲルの右隣の添付表に示され
るように、ゲルのレーン1-6は、標準的なベクター（1-2）又はIRES.ＧＦＰ（レ
ーン3-6）から発現された52196Hisタンパク質を示す；レーン7は、空のベクター
（対象のcDNAを除いたもの）を持つDP12CHO/DHFR細胞株によるコントロールを示
す；レーン8は、ポリHisタグVEGFタンパク質（VegHis）；及びレーン9-12は、標
準的なベクター（レーン9）又はIRES.ＧＦＰベクター（レーン10-12）から発現
された33222Hisタンパク質を示す。表題の「ベクター」の下に表記されている「
standard」は、cDNAがDHFRは含むがＧＦＰを含まない既に記述されているベクタ
ーにクローニングされたことを意味する（図５を参照；Crowley等, 米国特許第
５，５６１，０５３号及びLucas等, (1996), 上掲）；IRES.ＧＦＰは図１６の
ベクターである；「Negative」とはベクターを含まないことを意味する。選択の
下のDHFRは、GHTを含まない培地において最小の緊縮性にてDHFRを選択すること
を意味する；「Medium sort」は、ＧＦＰ蛍光強度が85-95パーセントである細胞
の選別プールを意味し、「High sort」は、蛍光を発する細胞の上位5％の選別を
意味する。強度欄は、タンパク質のバンドの強度がコントロールを1倍として標
準化されている。
【図１８】 図１８A-Cは、実施例４記述されるように、形質移入されたNIH
3T3細胞表面におけるＧＦＰとHer2の発現間の相関を示すFACSプロットである。
図１８Aは、ＧＦＰ遺伝子のみを含みHer2を含まないベクターで形質移入された
コントロール細胞を示す。図１８Bは、Her2cDNAインサートを含むベクターで形
質移入された細胞の非選別プールからの発現を示す。図１８Cは、ＧＦＰの高い
レベルの蛍光強度（上位5％）に基づいて選別された、Her2形質移入細胞のプー
ルからの発現を示す。
【図１９】 実施例４に記述されるように、形質移入されたNIH3T3細胞の表
現型を示す。図１９Ａは、ベクターのみでHer2を含まないベクターで形質移入さ
れた細胞を示す；図１９Ｂは、Her2含有ベクターであってＧＦＰで選別されてい
ないベクターで形質移入された細胞を示す；及び図１９Ｃは、ＧＦＰの高発現（
蛍光発光細胞の上位5％）を指標に選別されたHer2発現細胞を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｃ１２Ｒ 1:91 ４Ｂ０６５ 33/483 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 チザム，バネッサ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94403， サン マテオ，オーバールック コート 848 (72)発明者 クローリー，クレイグ，ダブリュー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94028， ポルトラ バリー，ドゥラスノ ウェイ 151 (72)発明者 クランメン，リン，エー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94116， サン フランシスコ，2622−22番 アヴェ ニュー (72)発明者 メン，ユー−ジュ，ジー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94706， アルバニー，ベンチュラ アヴェニュー 1033 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 DA02 EA01 FA02 2G045 AA24 BA11 BA14 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FA16 FA26 FA29 FA37 FB03 FB07 FB12 GC15 2G054 AA08 BA04 BB13 CA23 EA03 EB02 FA19 GA03 GA04 4B024 AA11 AA20 BA01 BA08 BA10 BA21 BA44 BA63 BA80 CA04 CA07 DA02 EA04 FA02 FA10 GA11 GA27 4B064 AG01 AG02 AG13 AG20 AG26 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AB01 AC20 BA21 BA25 CA24 CA25 CA29

Claims (58)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）増幅性選択遺伝子； ｂ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子；及び ｃ）所望の生成物をコードする選択配列を含んでなり、該選択配列が増幅性選択
    遺伝子又はＧＦＰ遺伝子の何れか、及びプロモーターに作用可能に結合されてい
    るポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 増幅性選択遺伝子が、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及
    びグルタミン合成酵素をコードする遺伝子からなる群から選択される請求項１に
    記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 増幅性選択遺伝子がジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝
    子である請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 ＧＦＰ遺伝子が突然変異体ＧＦＰをコードしている請求項１
    に記載のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 突然変異体ＧＦＰが、野生型ＧＦＰより高い蛍光強度を示す
    請求項４に記載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 突然変異体ＧＦＰが、オワンクラゲ（Aequorea victoria）
    の野生型ＧＦＰのアミノ酸６５のセリンがスレオニンに置換したＧＦＰ−Ｓ６５
    Ｔである請求項４に記載のポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 ＧＦＰ遺伝子がＧＦＰ融合タンパク質をコードしている請求
    項１に記載のポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 増幅性選択遺伝子が融合遺伝子としてＧＦＰ遺伝子に融合し
    ている請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 増幅性選択遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子である請求項８に記載の
    ポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 プロモーターと選択配列との間にイントロンを更に含み、
    該イントロンが５'スプライシングドナー部位と３'スプライシングアクセプター
    部位により定まる請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 イントロンが少なくとも９５％のスプライシング効率を提
    供する請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 融合遺伝子がイントロン内に位置させられ、融合遺伝子と
    選択配列がイントロンの５'側のプロモーターに作用可能に結合している請求項
    １０に記載のポリヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 選択配列と融合遺伝子の間に内在性リボソーム認識部位（
    ＩＲＥＳ）を更に含み、選択配列と融合遺伝子が選択配列の５'側のプロモータ
    ーに作用可能に結合している請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  14. 【請求項１４】 プロモーターの３'側；少なくとも９５％のスプライシン
    グ効率を与える３'スプライシングアクセプター部位と５'スプライシングドナー
    部位により定まるイントロン；及びＩＲＥＳを更に含み、選択配列がイントロン
    とＩＲＥＳの間に位置させられている請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  15. 【請求項１５】 増幅性選択遺伝子がＤＨＦＲがイントロンに位置させられ
    、ＧＦＰ遺伝子がＩＲＥＳの３'側である請求項１４に記載のポリヌクレオチド
    。
  16. 【請求項１６】 ＧＦＰ遺伝子がイントロンに位置させられ、増幅性選択遺
    伝子がＩＲＥＳの３'側である請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
  17. 【請求項１７】 第一のプロモーターにイントロンと選択配列が続いてなる
    第一の転写ユニットと；第二のプロモーターと該第二のプロモーターのイントロ
    ン３'を含む第二の転写ユニットを更に含み、第一の転写ユニットのイントロン
    が第一のイントロンであり、第二の転写ユニットのイントロンが第二のイントロ
    ンであり、第一及び第二のイントロンの各々が少なくとも９５％のスプライシン
    グ効率を与える３'スプライシングアクセプター部位と５'スプライシングドナー
    部位によって定まる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  18. 【請求項１８】 増幅性選択遺伝子が第一の転写ユニットのイントロンに位
    置させられ、増幅性選択遺伝子と選択配列が共に第一のプロモーターに作用可能
    に結合され；ＧＦＰが第二のイントロンの３'側に位置させられ、第二の転写ユ
    ニットの第二のプロモーターに作用可能に結合された、請求項１７に記載のポリ
    ヌクレオチド。
  19. 【請求項１９】 第二の転写ユニットが第二のイントロンの３'側に選択配
    列を含み、第一の転写ユニットの選択配列が第一の選択配列であり、第二の転写
    ユニットの選択配列が第二の選択配列であり、第二の選択配列が第二のプロモー
    ターに作用可能に結合され第二の所望の生成物をコードしている、請求項１７に
    記載のポリヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 増幅性選択遺伝子が第一のイントロンに位置させられ、第
    一のプロモータに作用可能に結合され、ＧＦＰ遺伝子が第二のイントロンに位置
    させられ、第二のプロモーターに作用可能に結合された請求項１９に記載のポリ
    ヌクレオチド。
  21. 【請求項２１】 ＧＦＰ遺伝子が第一のイントロンに位置させられ、第一の
    プロモータに作用可能に結合され、増幅性選択遺伝子が第二のイントロンに位置
    させられ、第二のプロモーターに作用可能に結合された請求項１９に記載のポリ
    ヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 第二の選択配列の３'側にＩＲＥＳを更に含んでなる請求
    項１９に記載のポリヌクレオチド。
  23. 【請求項２３】 増幅性選択遺伝子が第一のイントロンに位置させられ、第
    一のプロモーターに作用可能に結合され、ＧＦＰがＩＲＥＳの３'側に位置させ
    られ、第二のプロモーターに作用可能に結合されている請求項２２に記載のポリ
    ヌクレオチド。
  24. 【請求項２４】 増幅性選択遺伝子がＧＦＰ遺伝子に融合されて融合遺伝子
    を生成し、融合遺伝子が第一のイントロンに位置する、請求項１９に記載のポリ
    ヌクレオチド。
  25. 【請求項２５】 第二の転写ユニットが、第二のイントロンに位置させられ
    第二のプロモーターに作用可能に結合される選択マーカー遺伝子を更に含む、請
    求項２４に記載のポリヌクレオチド。
  26. 【請求項２６】 第一の転写ユニットが、第一の選択配列の３'側にＩＲＥ
    Ｓを更に含む請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  27. 【請求項２７】 増幅性選択遺伝子とＧＦＰ遺伝子が融合して、ＩＲＥＳの
    ３'側に位置させられ第一のプロモーターに作用可能に結合された融合遺伝子を
    生成している、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
  28. 【請求項２８】 第二の転写ユニットが、第二のイントロンに位置されられ
    第二のプロモーターに作用可能に結合される選択マーカー遺伝子を更に含む、請
    求項２７に記載のポリヌクレオチド。
  29. 【請求項２９】 第二の転写ユニットが、第二の選択配列のＩＲＥＳ３'を
    更に含み、第一の転写ユニットのＩＲＥＳが第一のＩＲＥＳであり、第二の転写
    ユニットのＩＲＥＳが第二のＩＲＥＳである、請求項２６に記載のポリヌクレオ
    チド。
  30. 【請求項３０】 増幅性選択遺伝子が第一のＩＲＥＳの３'側に位置させら
    れ、第一のプロモーターに作用可能に結合され、ＧＦＰが第二のＩＲＥＳの３'
    側に位置させられ、第二のプロモーターに作用可能に結合されている、請求項２
    ９に記載のポリヌクレオチド。
  31. 【請求項３１】 第一のプロモーターと第二のプロモーターが同じ型のプロ
    モーターである請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  32. 【請求項３２】 第一のプロモーターと第二のプロモーターがＣＭＶ又はＳ
    Ｖ４０プロモーターである請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
  33. 【請求項３３】 少なくとも一つのプロモーターが誘導性である請求項１９
    に記載のポリヌクレオチド。
  34. 【請求項３４】 プロモーターがヒトサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ
    ）プロモーターである請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  35. 【請求項３５】 選択配列が、サイトカイン、リンフォカイン、酵素、抗体
    、及びレセプターからなる群から選択されるタンパク質をコードしている請求項
    １に記載のポリヌクレオチド。
  36. 【請求項３６】 選択配列が、ニューロノトロフィン−３、デオキシリボヌ
    クレアーゼ、血管内皮成長因子、免疫グロブリン及びＨｅｒ２レセプターからな
    る群から選択されるタンパク質をコードしている請求項１に記載のポリヌクレオ
    チド。
  37. 【請求項３７】 第一の選択配列が免疫グロブリンＨ鎖をコードし、第二の
    選択配列が免疫グロブリンＬ鎖をコードしている請求項１９に記載のポリヌクレ
    オチド。
  38. 【請求項３８】 第一の選択配列が多鎖レセプターの一つのポリペプチド鎖
    をコードし、第二の選択配列が該レセプターの第二のポリペプチドをコードして
    いる請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  39. 【請求項３９】 真核生物宿主細胞において複製する請求項１に記載のポリ
    ヌクレオチド。
  40. 【請求項４０】 ａ）増幅性選択遺伝子； ｂ）蛍光タンパク質遺伝子；及び ｃ）所望の生成物をコードする選択配列を含んでなり、該選択配列が増幅性選択
    遺伝子又は蛍光遺伝子の何れか、及びプロモーターに作用可能に結合されている
    ポリヌクレオチド。
  41. 【請求項４１】 請求項１のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞。
  42. 【請求項４２】 細胞が哺乳動物細胞である請求項４１に記載の宿主細胞。
  43. 【請求項４３】 哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
    胞である請求項４２に記載の宿主細胞。
  44. 【請求項４４】 増幅性選択遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子であり、ＣＨＯ細胞が
    ＤＨＦＲフェノタイプを有している請求項４３に記載の宿主細胞。
  45. 【請求項４５】 所望の生成物が、ニューロノトロフィン−３、デオキシリ
    ボヌクレアーゼ、血管内皮成長因子、免疫グロブリン及びＨｅｒ２レセプターか
    らなる群から選択される請求項４３に記載の宿主細胞。
  46. 【請求項４６】 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む容器を含んでな
    るキット。
  47. 【請求項４７】 請求項１に記載のポリヌクレオチドを適した真核生物細胞
    中に導入し、得られた真核生物細胞を、所望の生成物を発現する条件下で培養し
    、所望の生成物を回収することを含んでなる、所望の生成物の製造方法。
  48. 【請求項４８】 所望の生成物が培地から回収される請求項４７に記載の方
    法。
  49. 【請求項４９】 所望の生成物を発現する細胞を取得する方法において、 ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドを適した真核生物細胞の集団中に導入し
    ； ｂ）緑色蛍光遺伝子及び増幅性選択遺伝子を発現し、発現が所望の生成物をまた
    発現する細胞を示す、工程ａ）の細胞を単離することを含んでなる方法。
  50. 【請求項５０】 緑色蛍光タンパク質遺伝子を発現する細胞を単離する工程
    が、最も明るい１％−１０％の蛍光細胞を選別しクローニングすることを含み、
    選別とクローニングが蛍光活性化セルソーターを使用して実施される請求項４９
    に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 細胞を、２回以上の選別にかけ、細胞が各選別回の間の時
    間、培養される、請求項５０に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 細胞が、各選別回の間の約２週間の間、培養される請求項
    ５１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 細胞が選択培地で培養される請求項５２に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 最も明るい蛍光細胞が、適切な増幅剤を含有する選択培地
    において培養される請求項５２に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 最も明るい蛍光細胞が、増加量の増幅剤を含む培地におい
    て培養される請求項５２に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 増幅性選択遺伝子がＤＨＦＲであり、増幅剤がメトトレキ
    セートである請求項５３に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 所望の生成物の発現に対して、増幅剤を用いて培養後の細
    胞を分析し、高レベルの所望の生成物を生成する細胞を単離することを更に含ん
    でなる請求項５４に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 ＲＴ−ＰＣＲによって所望の生成物をコードしているＲＮ
    Ａについて細胞を分析し、ＲＮＡの量が所望の生成物の産生レベルを示す、請求
    項５７に記載の方法。
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