JP2022543522A - タンパク質ベースの医薬品の高レベル生産のための細胞株 - Google Patents
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Abstract
Description
・混合物中の他の細胞と比較して、細胞1個当たりの小胞体の密度が比較的高い個々の細胞またはハイブリッドを選択する、
・混合物中の他の細胞と比較して、ゴルジ装置の密度が比較的高い個々の細胞またはハイブリッドを選択する、
・小胞体および/またはゴルジを染色する生体色素と共に細胞をインキュベートし、各細胞に関連する生体色素の量に従って細胞を選別する、
・混合物中の細胞において融合タンパク質を発現させ(融合タンパク質は、小胞体および/またはゴルジ装置によって加工されるペプチドと融合した、光信号を生成するペプチド(GFPまたはルシフェラーゼなど)を含有する)、その結果、混合物中の他の細胞よりも高レベルで光信号を発現する細胞が選択される。
・より速く成長する細胞、または特定の培養条件下でより良好に成長する細胞を選択する、
・細胞表面リガンドに特異的な抗体(任意選択的に、標識されたか、または粒子に連結された抗体)と細胞を結合し、抗体で標識された細胞を選択することにより、前記リガンドを発現する細胞が富化された亜集団を得る、
・混合物中の他の細胞と比較して、比較的高レベルのマーカータンパク質を産生する細胞を選択する(マーカータンパク質は、前記細胞から分泌され、かつ/または前記細胞表面上に発現される(分泌型アルカリホスファターゼまたは分泌型ルシフェラーゼなど))、
・混合物中の他の細胞と比較して、マーカータンパク質上で好ましいグリコシル化パターンまたは密度を生成する細胞を選択する、ならびに
・プロデューサー細胞集団を培養し、同じ特徴について、前記プロデューサー細胞集団内の細胞を再選別し、それにより、細胞内小器官の密度の増加が安定して継承可能である細胞がさらに富化された亜集団を得る。
バイオシミラーの生産における競争が激化し続ける一方で、新しいバイオ医薬品は年間約100個の割合で出現している。これらの製品の生産に必要な培養物の容量およびコストを削減できる技術が明らかに必要とされている。
次章で説明するように、個々の高プロデューサー細胞は、この点で不均一である任意の細胞集団から選択できる。多くの単一細胞株(CHO細胞など)は、増殖する細胞集団における遺伝子含有量および細胞内装置の点で最初は十分に多様であるため、標準の培養物から直接高プロデューサー細胞について選別および選択できる。
本開示の価値ある洞察は、出発混合物中の他のハイブリッドまたは親細胞と比較して、増加したタンパク質産生をサポートする、より高レベルの細胞内機構または生化学について、混合細胞集団から細胞を選択することによってタンパク質産生を増加させることができるという着想である。表現型特徴のうちの、特定のタンパク質の産生に必ずしも特異的ではない、少なくとも1つが選択される。この特徴は、単に目的のタンパク質または代用物の発現レベルではない。むしろ、それは様々な異なるタンパク質の産生をサポートする特徴である。このような特徴には、細胞内小器官、特に細胞からのタンパク質の分泌に関与する細胞内小器官の相対密度、および様々な異なるタンパク質の仕上げもしくは分泌を助ける酵素の相対レベルまたは濃度が含まれる。
・ER-Tracker(商標)Blue-White DPX(E12353)
・ER Tracker(商標)Green(グリベンクラミドBODIPY(登録商標)FL)(E34251)
・ER-Tracker(商標)Red(グリベンクラミドBODIPY(登録商標)TR)(34250)
・DiOC6(D273)
・DiOC5(D272)。
ゴルジ装置用の生体色素としては以下のものが挙げられる:
・NBD C6-6-セラミド(N1154)
・NBD C6-スフィンゴミエリン
・BODIPY(登録商標)FL C5-セラミド(cerimide)(D3521)
・BODIPY(登録商標)TRセラミド(D7540)。
Invitrogen:
・CellLight(商標)ER-GFP(C10590)
・CellLight(商標)ER-GFP(C10591)
・CellLight(商標)ゴルジ-GFP(C10592)
・CellLight(商標)ゴルジ-GFP(C10593)
Evrogen:
・pmKate2-ER(FP324)
・pFusionRed-ER(FP420)
・pTagRFP-ゴルジi(FP367)
・pTagRFP-ゴルジi(FP367)
・pFusionRed-ゴルジ(FP419)
Clontech:
・pDsRed2-ERベクター(632409)
・pDsRed-モノマー-ゴルジベクター(632480)
・pAcGFP1-ゴルジベクター(632464)。
目的のタンパク質(標的タンパク質)を発現する細胞株を生成するために、プロデューサー細胞またはそれらの前駆体は、宿主細胞株における発現を引き起こす遍在性または哺乳類プロモーターの制御下で、前記タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトすることができる。標的タンパク質の産生レベルは、タンパク質発現カセットを挿入するための一過性トランスフェクション法を使用した加工過程で決定することができる。あるいは、またはその後、目的の遺伝子またはマーカー遺伝子を細胞株のゲノムに組み込む恒久的なトランスフェクションを行うことができる。トランスフェクションは、リポソームベースの試薬(例えば、Lipofectamine(商標)2000もしくはFuGENE(商標)6)、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、またはアデノウイルス、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベースのベクターによる感染を使用して行うことができる。
本開示で提供されるシステムおよび技術は、製造の目的で細胞成長またはタンパク質産生を増強するための1つ以上の代替戦略と組み合わせることができる。このような技術としては、ベクターおよび発現プラットフォームエンジニアリング、オミクスベースの手法、遺伝子送達および組み込みの進歩、クロマチン開口要素を使用したタンパク質生産の増強、クローンスクリーニング戦略の改善などが挙げられる。
高レベルのタンパク質産生のために選択された細胞株または混合細胞集団は、いくつかの異なるパラメーターのうちのいずれか1つ以上によって、親または開始細胞株と比較して特徴付けられてもよい。例えば、選択したセルは、(1)2つ以上の親細胞株(同じであってもそうでなくてもよい)のゲノムの一部またはすべてを含む、出発細胞よりも異数性であるゲノム、(2)親細胞株のうちのいずれか1つまたはすべてと比較して高い小胞体および/またはゴルジ装置濃度(例えば、2~5倍もしくは4~8倍、または2倍、4倍もしく8倍よりも高い)、(3)細胞1個当たりまたは培養液1リットル当たりのレベルが親細胞株よりも実質的に高い(例えば、2~5倍もしくは4~8倍、または2倍、4倍もしくは8倍よりも高い)標的タンパク質を生成する能力、(4)細胞1個当たり特定の量(例えば、50、65、75、100、150、200、300もしくは500pg/細胞/日、または50~200もしくは75~300pgpg/細胞/日)の標的タンパク質を産生する能力、あるいは(5)培養液の容量当たり一定の量(例えば、培養液1リットル当たり少なくとも5、8、12、20もしくは30グラム、または8~20もしくは10~50グラムのタンパク質)の標的タンパク質を産生する能力、を有してもよい。
実施および適用の形態に応じて、本開示に記載される本発明の態様は、以下の利点のうちのいずれかを任意の組み合わせで提供することができる:
・市場規模の拡大に伴い、新しいGMP生産施設を拡大または建設する必要性を減らす、
・比較的小さいまたは少ないバイオリアクターを用いてキログラム量の最終タンパク質製品のGMP生産を提供する、
・実証済みの生物学的薬剤の生産コストを削減する、
・所望の生物学的薬剤のファミリーの高レベル発現に好適な産生細胞株を作成する、
・発現される遺伝子の組み込み後に必要とされるクローニングまたは選択ステップを減らす、
・製品の品質を向上させる(例えば、グリコシル化)、ならびに
・高品質で分量が少ない研究資料を提供し、臨床試験までの時間を短縮する。
本発明の技術は、CHO細胞のK1株(ATCC(登録商標)CCL-61)を使用して実施することができる。次のプロトコルに従って、培養下で成長したCHO細胞の集団を融合して、アイソタイプハイブリッドを作製する:
1.107個の細胞を遠心分離する。
2.上澄みを廃棄する。
3.チューブの底を軽くタッピングしてペレットを壊す。
4.ピペットチップで細胞を混合しながら、1分間にわたって100μLの50%PEGを添加する。
5.さらに1分間、細胞を攪拌し続ける。
6.混合しながら1分にわたって100μLの成長培地を添加する。
7.混合しながら3分にわたって300μLの成長を添加する。
8.mLの成長培地をゆっくりと添加する。
9.37℃で5分間インキュベートする。
10.遠心分離する。
11.ペレットを20mLの成長培地に再懸濁し、125mLの培養フラスコに移す。
12.通常通り培養する。
CHO-K1細胞を、PEG支援融合手順に曝露した。細胞を1週間回復させた後、この手順を合計3回繰り返した。3回目の融合から回復させた後、細胞を生体ER追跡色素(ER-Tracker(商標)Green(グリベンクラミドBODIPY(登録商標)FL);Invitrogen、E34251)で染色し、FACSAriaII(商標)セルソーター(BD Biosciences)を使用して選別した。ER-Tracker色素による染色量が最も多い生存集団の10%を収集した。培養下で2週間回復させた後、細胞を最終融合に曝露し、ER追跡色素で染色し、LSRII(商標)フローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して分析した。
1.106個の細胞を遠心分離する。
2.上澄みを廃棄する。
3.100μLのCell Line Nucleofector(商標)溶液Tに再懸濁する。
4.2μgのSEAP発現プラスミドを添加する。
5.エレクトロポレーションキュベットに移す。
6.Amaxa(商標)NucleofectorIIおよび事前設定プログラムU-023を使用してエレクトロポレーションする。
7.0.5mlの成長培地を添加する。
8.1ウェル当たりmLの成長培地を含有する6ウェルプレートに細胞を移す。
Claims (45)
- タンパク質ベースの医薬品の高レベル生産に適合した細胞株を調製する方法であって、
(a)培養細胞の集団を準備することと、ここで、前記集団内の細胞は、導入遺伝子からのタンパク質を発現する能力の点で不均一である、
(b)細胞1個当たりの小胞体および/またはゴルジ装置の密度に従って前記集団から細胞を選別することと、ならびに
(c)細胞1個当たりの小胞体および/またはゴルジ装置の密度が比較的高い細胞を前記集団から選択して回収し、
それにより、出発集団内の他の細胞と比較して増加した組換えタンパク質の産生および/または分泌をサポートするプロデューサー細胞株を得ることと、を含む、方法。 - ステップ(a)が、前記培養細胞の集団から複数の細胞ハイブリッドを形成することを含み、前記細胞ハイブリッドがそれぞれ、前記集団からの前記細胞のうちの2つ以上を含み、ステップ(c)で選択した前記細胞が、細胞ハイブリッドまたはそれらの子孫を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞ハイブリッドが、単一の細胞株から形成される、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞ハイブリッドが、樹立された細胞株からの細胞と一次細胞の集団とを融合することによって形成される、請求項2に記載の方法。
- ステップ(a)で準備した前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、CHO細胞のオートタイプハイブリッド、CHO細胞と別の細胞株からの細胞とのハイブリッド、および/またはCHO細胞と一次細胞とのハイブリッドを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)が、小胞体および/またはゴルジを染色する生体色素と共に前記集団内の細胞をインキュベートすることと、ならびに各細胞に関連する前記生体色素の量に従って前記細胞を選別することと、を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)が、前記集団内の他の細胞と比較した特定のマーカータンパク質のレベルまたは各細胞によって生成されたグリコシル化パターンに従って、前記細胞を選別することを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)が、前記集団内の他の細胞と比較して、細胞1個当たりの小胞体の密度が比較的高い細胞を前記集団から選択して回収することを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)が、前記集団内の他の細胞と比較して、細胞1個当たりのゴルジ装置の密度が比較的高い細胞を前記集団から選択して回収することを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質ベースの医薬品の高レベル生産に適合した細胞株を調製する方法であって、
(a)培養細胞の集団を準備することと、ここで、前記集団内の細胞が、導入遺伝子からのタンパク質を発現する能力の点で不均一である、
(b)前記集団内の細胞において融合タンパク質を発現させることであって、前記融合タンパク質が、小胞体および/もしくはゴルジ装置によって加工されるペプチドと融合した、光信号を生成する蛍光または生物発光ペプチドを含む、発現させることと、ならびに
(c)前記細胞集団内の他の細胞と比較してより高レベルで前記光信号を発現する細胞を選択して回収することと、を含む、方法。 - 細胞が、ステップ(a)で準備した前記細胞の出発集団と比較して増加した成長速度についてさらに選択される、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団からの細胞を前記導入遺伝子でトランスフェクトして、トランスフェクト細胞集団を得ることと、ならびに、次いで前記トランスフェクト細胞集団内の他の細胞と比較して高レベルで前記導入遺伝子のタンパク質産物を産生するトランスフェクト細胞を前記トランスフェクト細胞集団から選択することと、をさらに含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トランスフェクトすることが、ステップ(b)の前またはステップ(c)の後に実行される、請求項11に記載の方法。
- タンパク質ベースの医薬品に含めることを意図したタンパク質の高レベル産生に適合した細胞株を調製する方法であって、
(1)請求項1~11のいずれか一項に記載の方法に従って調製されたプロデューサー細胞株を得ることと、
(2)前記意図したタンパク質をコードする導入遺伝子を前記細胞株の複数の細胞のゲノムに導入することと、ならびに
(3)前記タンパク質を産生する、前記導入遺伝子でトランスフェクトされた細胞を選択することと、を含む、方法。 - 細胞1個当たりの小胞体および/またはゴルジ装置の密度が比較的高く、それにより、タンパク質ベースの医薬品に含めることを意図したタンパク質の高レベル産生に適合するプロデューサー細胞株であって、
前記プロデューサー細胞株の細胞が、前記細胞のゲノムに組み込まれる前記意図したタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、
前記プロデューサー細胞株が、以下のプロセス:
(a)出発細胞株からの培養細胞の集団を準備することと、ここで、前記細胞が、導入遺伝子からのタンパク質を発現する能力の点で不均一である、
(b)細胞1個当たりの小胞体および/またはゴルジ装置の密度に従って、前記細胞の細胞の集団を選別することと、
(c)前記出発細胞株と比較して、細胞1個当たりの小胞体および/またはゴルジ装置の密度が比較的高い細胞を前記細胞の集団から選択して回収することと、ならびに
(d)ステップ(c)において選択および回収された前記細胞を培養し、それにより、プロデューサー細胞株を樹立することと、
によって、前記出発細胞株から調製されている、プロデューサー細胞株。 - 前記出発細胞株およびそれに由来する請求項15に記載のプロデューサー細胞株の両方を含む、タンパク質ベースの医薬品の高レベル生産のためのシステム。
- 前記プロセスのステップ(a)が、前記出発細胞株から複数の細胞ハイブリッドを形成することを含み、前記細胞ハイブリッドがそれぞれ、前記集団からの前記細胞のうちの2つ以上を含み、ステップ(c)において選択した前記細胞が、細胞ハイブリッドまたはそれらの子孫である、請求項15に記載のプロデューサー細胞株または請求項16に記載のシステム。
- 前記細胞ハイブリッドが、単一の細胞株から形成される、請求項17に記載のプロデューサー細胞株またはシステム。
- 前記細胞ハイブリッドが、スターター細胞株からの細胞と一次細胞の集団とを融合することによって形成される、請求項17に記載のプロデューサー細胞株またはシステム。
- 前記スターター細胞株の細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞であり、前記プロデューサー細胞株がCHO細胞のオートタイプハイブリッド、別の細胞株からの細胞と融合したCHO細胞のハイブリッド、および/または一次細胞と融合したCHO細胞のハイブリッドを含む、請求項15~19のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞株またはシステム。
- 前記プロデューサー細胞株が、商業生産の目的となる標的タンパク質をコードする導入遺伝子を含有する、請求項15~20のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞株またはシステム。
- 前記プロデューサー細胞株の細胞が、前記プロセスに従って得られた結果として、以下の特徴のうちの1つ以上を任意の組み合わせで有する、請求項21に記載のプロデューサー細胞株またはシステム:
前記細胞は異数性である、
前記細胞は、培養液1リットル当たり少なくとも8グラムの前記標的タンパク質を産生する、
前記細胞は、50~200pg/細胞/日の前記標的タンパク質を産生する、
前記細胞は、前記スターター細胞株の細胞と比較して、細胞1個当たり2~10倍多い小胞体またはゴルジ体を含有する、
前記細胞は、前記スターター細胞株の細胞と比較して、細胞1個当たり2~10倍多い標的タンパク質を産生する。 - 前記プロデューサー細胞株の細胞が、前記プロセスに従って得られた結果として、以下の特徴のうちの1つ以上を任意の組み合わせで有する、請求項21または22に記載のプロデューサー細胞株またはシステム:
前記細胞は、培養液1リットル当たり10~20グラムの前記標的タンパク質を産生する、
前記細胞は、少なくとも65pg/細胞/日の前記標的タンパク質を産生する、
前記細胞は、前記スターター細胞株の細胞と比較して、細胞1個当たり少なくとも4倍多い小胞体またはゴルジ体を含有する、
前記細胞は、前記スターター細胞株の細胞と比較して、細胞1個当たり少なくとも4倍多い標的タンパク質を産生する。 - 医薬品を生産する方法であって、
請求項21~23のいずれか一項に記載の標的タンパク質をコードする導入遺伝子を含有するプロデューサー細胞株またはシステムを得ることと、
前記標的タンパク質が前記導入遺伝子から発現される条件下で、前記プロデューサー細胞株からの細胞を培養することと、
細胞培養物から前記標的タンパク質を精製することと、ならびに
前記医薬品がヒトへの投与に好適であるように前記医薬品を生産するべく前記精製タンパク質を配合することと、を含む、方法。 - 前記医薬品が、抗体鎖、治療用酵素、ホルモン、成長因子、および血液の天然成分から選択された標的タンパク質を含有する、請求項24に記載の方法。
- 請求項24または25に記載の方法に従って得られる医薬品。
以下の請求項は、米国特許出願第15/254,852号で認可されている請求項に相当する。 - タンパク質ベースの医薬品の高レベル生産に適合した細胞株を得る方法であって、
(a)細胞の混合物が1つ以上の細胞ハイブリッドを形成する条件下で前記混合物を培養することと、ここで、前記細胞ハイブリッドがそれぞれ、前記混合物からの2つ以上の細胞を含む、次いで、
(b)細胞1個当たりの小胞体および/またはゴルジ装置の密度に従って前記細胞の混合物を選別することと、ならびに
(c)細胞1個当たりの小胞体および/またはゴルジ装置の密度が比較的高い細胞ハイブリッドを前記混合物から選択して回収し、
それにより、出発混合物中の他のハイブリッドもしくは親細胞と比較して増加したタンパク質の産生および/または分泌をサポートするプロデューサー細胞株を得ることと、を含む、方法。 - ステップ(a)で培養した前記混合物が、単一の細胞株からの細胞から本質的になる、請求項27に記載の方法。
- ステップ(a)で培養した前記混合物が、2つ以上の異なる細胞株を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記混合物が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を含む、請求項27~29のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)が、前記混合物中の他のハイブリッドまたは親細胞と比較して、細胞1個当たりの小胞体の密度が比較的高い細胞ハイブリッドを選択して回収することを含む、請求項27~30のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)が、前記混合物中の他のハイブリッドまたは親細胞と比較して、ゴルジ装置の密度が比較的高い細胞ハイブリッドを選択して回収することを含む、請求項27~30のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)が、小胞体および/またはゴルジを染色する生体色素と共に細胞をインキュベートすることと、ならびに各ハイブリッドに関連する前記生体色素の量に従って細胞ハイブリッドを選別することと、を含む、請求項27~32のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質ベースの医薬品の高レベル生産に適合した細胞株を得る方法であって、
(a)細胞の混合物が1つ以上の細胞ハイブリッドを形成する条件下で前記混合物を培養することと、ここで、前記細胞ハイブリッドがそれぞれ、前記混合物からの2つ以上の細胞を含む、次いで、
(b)前記混合物中の細胞において融合タンパク質を発現させることと、ここで、前記融合タンパク質が、小胞体および/もしくはゴルジ装置によって加工されるペプチドと融合した、光信号を生成する蛍光または生物発光ペプチドを含む、ならびに
(c)前記混合物中の他の細胞と比較してより高レベルで前記光信号を発現する細胞を選択して回収し、
それにより、出発混合物中の他のハイブリッドもしくは親細胞と比較して増加したタンパク質の産生および/または分泌をサポートするプロデューサー細胞株を得ることと、を含む、方法。 - 細胞表面リガンドに特異的な抗体と前記細胞ハイブリッドを結合することと、ならびに前記抗体で標識された細胞ハイブリッドを選択し、それにより、前記リガンドを発現する細胞ハイブリッドが富化された亜集団を得ることと、をさらに含む、請求項27~34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合物中の他の細胞ハイブリッドと比較して、比較的高レベルのマーカータンパク質を産生する細胞ハイブリッドを選択することをさらに含み、前記マーカータンパク質が、前記細胞から分泌され、かつ/または細胞表面上に発現される、請求項27~35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合物中の他の細胞ハイブリッドと比較して、特定のグリコシル化パターンを生成するか、または特定のマーカータンパク質を発現する細胞ハイブリッドを選択することをさらに含む、請求項27~36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロデューサー細胞集団を培養することと、ならびに前記細胞ハイブリッド内の小胞体および/またはゴルジ装置の密度に従って、前記プロデューサー細胞集団内の細胞ハイブリッドを再選別し、それにより、細胞内小器官の密度の増加が安定して継承可能である細胞ハイブリッドが富化された亜集団を得ることと、をさらに含む、請求項27~37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロデューサー細胞株からの細胞を目的の遺伝子でトランスフェクトして、トランスフェクト細胞集団を得ることと、ならびに前記トランスフェクト細胞集団内の他の細胞と比較して高レベルで前記目的の遺伝子のタンパク質産物を産生するトランスフェクト細胞を前記トランスフェクト細胞集団から選択することと、をさらに含む、請求項27~38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記目的の遺伝子が、抗体重鎖、抗体軽鎖、または一本鎖抗体をコードする、請求項27~39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロデューサー細胞株が、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方を発現し、これらが組み合わさって、所望の特異性を有する抗体を産生する、請求項27~39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロデューサー細胞株が、治療用酵素、ホルモン、成長因子、または血液の天然成分であるタンパク質を発現する、請求項27~39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロデューサー細胞株が、組換えにより挿入された遺伝子のうちの1つまたはそれらの組み合わせから、培養液1リットル当たり少なくとも8グラムのタンパク質を発現する、請求項27~39のいずれか一項に記載の方法。
- 2つ以上の親細胞株のゲノムの一部またはすべて、前記親細胞株のうちのいずれかと比較してより高濃度の小胞体および/またはゴルジ装置、ならびに組換えにより挿入された遺伝子のうちの1つまたはそれらの組み合わせから培養液1リットル当たり少なくとも8グラムのタンパク質を産生する能力、を含む、ハイブリッド細胞株。
- バイオ医薬品として配合するためのタンパク質を生産する方法であって、
請求項44に記載のハイブリッド細胞株から細胞を得ることと、ここで前記組換えにより挿入された遺伝子(複数可)が前記タンパク質の一部または全部をコードする、ならびに
前記タンパク質またはその一部が前記組換えにより挿入された遺伝子(複数可)からの前記細胞によって発現される条件下で前記細胞を培養することと、を含む、方法。
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