CN112175995A - 一种vsx2绿色荧光报告基因载体系统及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种VSX2绿色荧光报告基因载体系统及其构建方法。本发明的VSX2绿色荧光报告基因载体系统，其包含PX459‑VSX2_sgRNA敲除质粒和pBluescript‑LA‑P2A‑eGFP‑RA供体质粒；利用该载体系统转化构建的VSX2绿色荧光报告基因hiPSC系报告荧光表达亮丽，特异性强，能够长期稳定表达，并且在组织固定及冰冻切片进行末端检测时仍然能检测到强荧光信号。该VSX2绿色荧光报告基因载体系统、VSX2绿色荧光报告基因hiPSC系可为视网膜相关疾病建模、发展机制和防治研究提供有用的工具，用于视网膜细胞命运转归的追踪以及分化系统的优化、眼杯的分选纯化甚至药物筛选和细胞移植等下游研究。

Description

一种VSX2绿色荧光报告基因载体系统及其构建方法
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种VSX2绿色荧光报告基因载体系统及其构建方法。
背景技术
眼睛的正常形成和发育过程由基因网络控制，遗传或环境因素对该过程的任何破坏性影响都可能导致眼睛的生长和结构缺陷，如，无眼症和小眼畸形。无眼症和小眼畸形目前被认为是最严重的发育性眼部异常，可引起严重的视力障碍，约占儿童视力障碍的3-12％，严重影响人类的健康生活。目前无眼症及小眼畸形的发病机制尚不明确。
视觉系统同源框2(visual system homeobox 2，VSX2)，也称为CHX10，编码在哺乳动物眼睛发育中起重要作用的转录因子(Liu等，1994)。VSX2早期在视网膜祖细胞中表达，最后在成熟视网膜的内核层中丰富表达(Liu等，1994)。2000年，Ferda Percin等在小眼畸形患者中找到了VSX2的第一个突变。后来陆续在其他几个具有眼部异常的家族中也发现了VSX2突变(Ammar等，2017；Burkitt Wright等，2010；Chassaing等，2014；Iseri等，2010；Ullah等，2016)。VSX2基因突变与无眼症及小眼畸形有关，但是目前具体的发生机制并不清楚。
人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC)最早在2007年通过重编程获得(Takahashi K等，2007)。由于hiPSC具有无限增殖能力及多向分化潜能，理论上在体外可通过诱导分化获得各种类型的视网膜细胞。近年来相关研究表明，hiPSCs在特定条件下还可分化获得三维(three-dimension，3D)视网膜类器官，可在体外模拟神经视网膜的发育过程和视网膜自然病变进程，为视网膜变性疾病干预药物的筛选和其他治疗方法的探索提供研究平台，也可为视网膜移植治疗提供丰富的种子细胞(Zhong等，2014；Li等，2018；Li等，2019)。hiPSCs诱导分化获得3D视网膜类器官技术的快速发展使得人视网膜发育和视网膜疾病的体外研究成为可能。近年来，成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeatsassociated protein 9，CRISPR/Cas9)等基因编辑技术的发展，以及利用基因编辑技术构建的荧光报告基因细胞系更是为视网膜类器官的活体实时观察，视网膜疾病的机制研究，视网膜疾病干预药物的筛选，以及视网膜移植治疗研究等提供了强有力的工具(Phillips等，2018；Kaewkhaw等，2016)。
发明内容
本发明针对目前VSX2在人视网膜中表达的活体研究存在空缺以及VSX2相关疾病发病机制尚不明确的现状，旨在构建一种VSX2绿色荧光报告基因载体系统及利用该系统构建的VSX2的增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein，eGFP)报告基因hiPSC系及其构建方法，为视网膜发育的实时观察，相关疾病的机制研究，视网膜疾病干预药物的筛选以及细胞替代治疗提供工具。
本发明的第一个目的是提供一种VSX2绿色荧光报告基因载体系统，其包含PX459-VSX2_sgRNA敲除质粒和pBluescript-LA-P2A-eGFP-RA供体质粒。
本发明的第二个目的是提供一种VSX2绿色荧光报告基因载体系统的构建方法，包括以下步骤：
a.根据人VSX2基因序列设计sgRNA并合成sgRNA上下游引物，经过变性和退火后插入至pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)载体中，构建得到PX459-VSX2_sgRNA敲除质粒；
所述的sgRNA上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，sgRNA下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
b.以pBluescript SK(-)载体为骨架，插入LA-P2A-eGFP-RA片段，构建得到pBluescript-LA-P2A-eGFP-RA供体质粒；
所述的LA-P2A-eGFP-RA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选，所述的步骤a，包括以下步骤：根据人VSX2基因序列设计sgRNA并合成sgRNA上下游引物；用BbSⅠ酶酶切pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)载体线性化，然后用T4 DNA连接酶连接线性化的载体和经过变性和退火后的sgRNA上下游引物，连接产物转化至DH5α感受态大肠杆菌，氨苄青霉素筛选培养，经测序验证获得正确插入的质粒，构建得到PX459-VSX2_sgRNA敲除质粒。
优选，所述的步骤b，包括以下步骤：
b1.用EcoRⅠ酶和XhoⅠ酶双酶切pBluescript SK(-)载体线性化；
b2.用LA-P2A-eGFP-RA的上下游引物扩增LA-P2A-eGFP-RA片段，扩增产物用EcoRⅠ酶和XhoⅠ酶双酶切；所述的LA-P2A-eGFP-RA的上游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的LA-P2A-eGFP-RA的下游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
b3.用T4 DNA连接酶连接线性化的pBluescript SK(-)载体和双酶切的LA-P2A-eGFP-RA片段，连接产物转化至DH5α感受态大肠杆菌，氨苄青霉素筛选培养，经测序验证获得正确插入的质粒，构建得到pBluescript-LA-P2A-eGFP-RA供体质粒。
本发明中人工合成LA-P2A-eGFP-RA片段(LA和RA分别为左右同源臂序列，P2A为猪捷申病毒自剪切肽序列，eGFP为增强型绿色荧光蛋白序列)，插入至pBluescript SK(-)载体，从而获得pBluescript-LA-P2A-eGFP-RA基因编辑供体质粒。
本发明具有如下优点：
利用本发明的VSX2绿色荧光报告基因载体系统构建的VSX2绿色荧光报告基因hiPSC系，通过在荧光显微镜镜下观察eGFP荧光强弱即可在体实时监测VSX2蛋白的表达情况，而无需繁琐的末端检测；
利用本发明的VSX2绿色荧光报告基因载体系统构建的VSX2绿色荧光报告基因hiPSC系，可分化获得3D视网膜类器官，且VSX2-eGFP报告系统特异性强，eGFP绿色荧光蛋白的表达时程和细胞特异性与VSX2蛋白完全吻合，丰富表达在神经视网膜层的前体细胞和双极细胞，与其他类型细胞如视网膜色素上皮细胞、光感受器细胞区分明显；
利用本发明的VSX2绿色荧光报告基因载体系统构建的VSX2荧光报告基因hiPSC系，VSX2-eGFP荧光报告蛋白在组织固定及冰冻切片进行末端检测时仍然能检测到强荧光信号；
利用本发明的VSX2绿色荧光报告基因载体系统构建的VSX2绿色荧光报告基因hiPSC系，可为视网膜相关疾病建模、发展机制和防治研究提供有用的工具，用于视网膜细胞命运转归的追踪以及分化系统的优化、眼杯的分选纯化甚至药物筛选和细胞移植等下游研究。
附图说明
图1是PCR及Sanger测序表明eGFP报告基因正确插入(标尺＝100μm)，其中：1A：CRISPR/Cas9介导BC1-VSX2eGFP-hiPSC系构建的原理示意图；1B：嘌呤霉素筛选后一株hiPSC克隆明场图；1C：嘌呤霉素筛选后随机挑取的20个hiPSC克隆的PCR鉴定结果图：WT为野生型对照BC1-iPSC；M为100bp DNA Ladder；C1-C20分别对应20个hiPSC克隆，红色表示P2A-eGFP敲入成功的克隆；1D：克隆C5的Sanger测序结果图。
图2是BC1-VSX2eGFP-iPSC的核型分析结果(标尺＝100μm)，其中：2A：秋水仙素处理前BC1-VSX2eGFP-iPSC的明场图；2B：秋水仙素处理2.5h后BC1-VSX2eGFP-iPSC的明场图；2C：BC1-VSX2eGFP-iPSC核型分析图，显示正常的G带核型。
图3是BC1-VSX2eGFP-hiPSC表达多能干细胞分子标签(标尺＝100μm)，其中：3A：RT-PCR检测显示BC1-VSX2eGFP–hiPSC(图中以VSX2代指)及BC1-hiPSC(图中以BC1代指)的多能标志物NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B及GDF3在mRNA水平均有表达，且水平相似；3B-E：免疫荧光检测显示BC1-VSX2eGFP-hiPSC中NANOG、SSEA4、TRA-1-60及OCT4均阳性表达，呈红色荧光(Alexa Fluor-555)，细胞核呈蓝色荧光(DAPI)。
图4是BC1-VSX2eGFP-hiPSC具备三胚层分化能力(标尺＝100μm)，其中：4A-F：免疫荧光显示诱导分化后得到的三胚层组织表达内胚层标志物AFP(肝脏细胞)，中胚层标志物α-SMA(平滑肌)和外胚层标志物TUJ1(神经细胞)，标志物(AFP、α-SMA、TUJ1)均呈红色荧光(Alexa Fluor-555)，细胞核呈蓝色荧光(DAPI)。
图5是3D视网膜类器官中eGFP与VSX2蛋白共表达(标尺＝100μm)，其中：5A-C：BC1-VSX2eGFP-iPSC分化获得视网膜类器官并表达报告荧光蛋白eGFP；5A：明场图；5B：eGFP表达在神经视网膜层；5C：明场与eGFP叠加图；5D-I：免疫荧光检测VSX2蛋白与eGFP在视网膜类器官中共定位，VSX2呈红色荧光(Alexa Fluor-555)，eGFP为绿色荧光(自发荧光)，细胞核呈蓝色荧光(DAPI)。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
图1A是本发明CRISPR/Cas9介导BC1-VSX2eGFP-hiPSC系构建的原理示意图。
1.hiPSC的维持培养
1.1材料和仪器：
1.1.1细胞：BC1-hiPSC，由程临钊教授(中国科学技术大学)馈赠。
1.1.2试剂及耗材：
1)mTeSR1培养基：STEM CELL，#05851；
2)EDTA：Invitrogen，15575-038；
3)PBS(1×)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202；
4)Matrigel：Corning，354277；
5)(-)-Blebbistatin：Sigma，B0560；
6)六孔板：FALCON，353046；
7)离心管：FALCON，352096。
1.1.3仪器：
1)CO2培养箱：SANYO，MCO-20A1C；
2)倒置显微镜：Nikon，TS100。
1.2具体步骤：
hiPSC维持培养于mTeSR1培养基中，融合度约80％-90％时进行传代。吸去mTeSR1培养基，用无菌PBS洗涤，加入0.5mM EDTA，37℃消化4-6min。吸去EDTA，用少量mTeSR1培养基吹下细胞，接种到已用Matrigel包被好的培养板，用含有10μM(-)-Blebbistatin的mTeSR1培养基于37℃，5％CO2培养箱培养，次日培养基更换为mTeSR1。
2.PX459-VSX2_sgRNA敲除质粒的构建
2.1材料和仪器：
2.1.1试剂及耗材：
1)BbSⅠ核酸内切酶：NEB，#R3539S；
2)T4 DNA连接酶：NEB，#M0202S；
3)琼脂粉：广东环凯微生物科技有限公司，028990A；
4)蛋白胨：广东环凯微生物科技有限公司，050170B；
5)酵母粉：广东环凯微生物科技有限公司，050090；
6)氯化钠：aladdin，C111533；
7)DH5α感受大肠杆菌：北京全式金生物科技有限公司，CD201-01；
8)质粒提取试剂盒：广州美基生物科技有限公司，P1231-03；
9)DNA凝胶回收试剂盒：广州美基生物科技有限公司，D2110；
10)琼脂糖：Biofroxx，0002A；
11)氨苄青霉素钠：Sigma-Aldrich，A9518；
12)细菌培养皿：广州洁特生物过滤股份有限公司，MCD100150；
13)pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)质粒(以下简称PX459质粒)：Addgene，#48139。
2.1.2仪器：
1)恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司，LH150；
2)水平恒温摇床：上海一恒科学仪器有限公司，THZ300；
3)核酸浓度检测仪：Thermo，Nanodrop 2000；
4)核酸水平电泳仪：北京六一生物科技有限公司，DYCP-31CN。
2.2具体步骤：
2.2.1设计合成VSX2_sgRNA引物
通过在NCBI GeneBank数据库下载人VSX2基因(GeneID:338917)的基因组序列信息，确定人VSX2基因共包含5个外显子，针对第5号外显子读码框终止子前后各100bp序列(一共200bp)，于网站http://crispor.tefor.net/上设计sgRNA，选择综合得分最高(切割效率高且脱靶率低)的sgRNA送至上海生工生物工程股份有限公司合成上下游引物，引物经过变性和退火(反应条件参数为：95℃5min，4℃，∞)后备用(即得VSX2_sgRNA)。sgRNA上下游引物序列如表1所示(对应为序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)，PCR反应体系如表2表所示。
表1 VSX2_sgRNA引物合成序列
Figure BDA0002677858260000061
表2 VSX2_sgRNA引物变性退火体系
Figure BDA0002677858260000062
2.2.2 PX459质粒的扩增
吸取PX459质粒菌液1μL加入到100mL LB液体培养基(LB培养基配置方法见表3)中，置入37℃恒温水平摇床培养18h，之后取出菌液，提取得到PX459质粒，用TE Buffer溶解质粒，检测获得质粒的浓度。
表3 LB培养基配置方案
Figure BDA0002677858260000063
2.2.3 PX459载体的酶切线性化
根据浓度计算PX459质粒的用量，使用1μg质粒用于酶切反应，于PCR仪内进行(反应条件为：37℃1h，4℃∞)，酶切体系的配置如表4。
表4 PX459载体酶切线性化体系
Figure BDA0002677858260000071
预先配置1％琼脂糖凝胶，待酶切反应完毕后，电泳分离得到线性化的PX459载体备用。
2.2.4 PX459线性化载体与VSX2_sgRNA的连接
将2.2.1中退火后备用的VSX2_sgRNA反应液用ddH2O稀释200倍，取2μL进行连接反应，连接反应在PCR仪中进行(25℃1h，4℃∞)，连接体系的配置如表5。
表5 PX459载体与VSX2_sgRNA连接体系
Figure BDA0002677858260000072
2.2.5转化及重组子的筛选
取2.2.4中的连接产物转化至DH5α感受态大肠杆菌，具体反应条件为：2μL连接产物与50μL DH5α混合后冰浴30min，PCR仪中42℃热击1min，冰浴3min，涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板，37℃恒温培养箱培养16h后挑取单菌落送上海生工生物工程股份有限公司进行Sanger测序。
2.2.6 PX459-VSX2_sgRNA重组质粒的提取
将测序显示VSX2_sgRNA插入正确的单菌落用含有氨苄青霉素的LB液体培养基扩增，提取质粒，测定浓度，获得PX459-VSX2_sgRNA敲除质粒。
3.pBluescript-LA-P2A-eGFP-RA供体质粒的构建
3.1材料和仪器：
3.1.1试剂及耗材：
1)T4 DNA连接酶：NEB，#M0202S；
2)琼脂粉：广东环凯微生物科技有限公司，028990A；
3)蛋白胨：广东环凯微生物科技有限公司，050170B；
4)酵母粉：广东环凯微生物科技有限公司，050090；
5)氯化钠：aladdin，C111533；
6)DH5α感受态大肠杆菌：北京全式金生物科技有限公司，CD201-01；
7)低内毒素质粒提取试剂盒：广州美基生物科技有限公司，P1231-03；
8)DNA凝胶回收试剂盒：广州美基生物科技有限公司，D2110；
9)琼脂糖：Biofroxx，0002A；
10)氨苄青霉素钠：Sigma-Aldrich，A9518；
11)细菌培养皿：广州洁特生物过滤股份有限公司，MCD100150；
12)pBluescript SK(-)载体：上海联迈生物工程有限公司，LM1893。
3.1.2仪器：
1)恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司，LH150；
2)水平恒温摇床：上海一恒科学仪器有限公司，THZ300；
3)核酸浓度检测仪：Thermo，Nanodrop 2000；
4)核酸水平电泳仪：北京六一生物科技有限公司，DYCP-31CN。
3.2具体步骤：
3.2.1合成LA-P2A-eGFP-RA片段并加酶切位点
由上海生工生物工程股份有限公司负责合成LA-P2A-eGFP-RA序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，通过Primer 5软件设计并合成用于扩增LA-P2A-eGFP-RA的引物(引物序列见表6，对应为序列表中SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5)，配置PCR反应体系：2×TaqMasterMix 25μL，上下游引物各1.5μL，LA-P2A-eGFP-RA片段1μL，无菌超纯H2O 21μL，共50μL。配置1.5％琼脂糖并电泳，按照凝胶回收试剂盒说明书纯化后备用，从而得到两端分别加入了EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LA-P2A-eGFP-RA片段。反应于PCR仪中进行，反应条件设置为：95℃3min，(95℃15s，55℃15s，72℃90s)×35个循环，72℃5min，4℃∞。
表6扩增LA-P2A-eGFP-RA片段引物合成序列
Figure BDA0002677858260000081
Figure BDA0002677858260000091
注：斜体为EcoRⅠ酶切位点，下划线为XhoⅠ酶切位点。
3.2.2 pBluescript SK(-)质粒的扩增
吸取pBluescript SK(-)质粒菌液1μL加入到100mL LB液体培养基(LB培养基配置方法见表3)中，置入37℃恒温水平摇床培养18h，之后取出菌液，提取获得pBluescript SK(-)质粒，用TE Buffer溶解质粒，检测获得质粒的浓度。
3.2.3 pBluescript SK(-)载体的双酶切线性化和LA-P2A-eGFP-RA片段双酶切
按照表7和表8分别配置pBluescript SK(-)载体和两端分别加入了EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LA-P2A-eGFP-RA片段双酶切体系，于PCR仪中反应(37℃1h，4℃∞)，配置1.5％琼脂糖凝胶，电泳分离后，按照凝胶回收试剂盒说明书纯化后，获得线性化的pBluescriptSK(-)载体及双酶切后的LA-P2A-eGFP-RA片段备用。
表7 pBluescript SK(-)载体的双酶切线性化
Figure BDA0002677858260000092
表8 LA-P2A-eGFP-RA片段的双酶切
Figure BDA0002677858260000093
Figure BDA0002677858260000101
3.2.4线性化的pBluescript SK(-)载体和酶切后的LA-P2A-eGFP-RA片段的连接
将3.2.3中双酶切后的LA-P2A-eGFP-RA片段按一定比例加入ddH2O稀释，取1μL(100ng)进行连接反应，连接反应在PCR仪中进行(25℃1h，4℃∞)，连接体系的配置如表9。
表9酶切后的LA-P2A-eGFP-RA片段与线性化的pBluescript SK(-)载体的连接
Figure BDA0002677858260000102
3.2.5转化及重组子的筛选
取3.2.4中的连接产物转化至DH5α感受态大肠杆菌，具体反应条件为：2μL连接产物与50μL DH5α混合后冰浴30min，PCR仪中42℃热击1min，冰浴3min，涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板，37℃恒温培养箱培养16h后挑取单菌落送上海生工生物工程股份有限公司进行Sanger测序。
3.2.6pBluescript-LA-P2A-eGFP-RA质粒的提取
将测序显示LA-P2A-eGFP-RA片段插入正确的单菌落用含有氨苄青霉素的LB液体培养基扩增，提取质粒，测定浓度，获得pBluescript-LA-P2A-eGFP-RA供体质粒。
4.电转
4.1材料和仪器：
4.1.1试剂及耗材：
1)mTeSR1培养基：STEM CELL，#05851；
2)Accutase：Gibco，A1110501；
3)PBS(1×)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202；
4)Matrigel：Corning，354277；
5)(-)-Blebbistatin：Sigma，B0560；
6)六孔板：FALCON，353046；
7)离心管：FALCON，352096；
8)电转缓冲试剂：Invitrogen，Neon MPK10096。
4.1.2仪器：
1)CO2培养箱：SANYO，MCO-20A1C；
2)倒置显微镜：Nikon，TS100；
3)电转仪：Invitrogen,Neon MPK5000；
4)离心机：飞鸽牌，TDL-40B。
4.2具体步骤：BC1-hiPSC培养至融合度达到约90％时，吸去mTeSR1培养基。用PBS洗涤，加入Accutase，37℃消化5min，去除Accutase，加入mTeSR1培养基吹下所有细胞，1500r/min离心5min，收集细胞沉淀。用含10μg PX459-VSX2_sgRNA敲除质粒和10μgpBluescript-LA-P2A-eGFP-RA供体质粒的电转缓冲液(共100μL)重悬细胞，电转仪参数设定为：1100V，10ms/pulse，3pulse，进行电转。电转后的细胞悬液按不同接种密度梯度接种在预先用Matrigel包被的六孔板中，加入mTeSR1培养基继续培养。
5.嘌呤霉素筛选
5.1材料和仪器：
5.1.1试剂及耗材：
1)mTeSR1培养基：STEM CELL，#05851；
2)EDTA：Invitrogen，15575-038；
3)PBS(1×)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202；
4)Matrigel：Corning，354277；
5)(-)-Blebbistatin：Sigma，B0560；
6)六孔板：FALCON，353046；
7)离心管：BD FALCON，352096；
8)嘌呤霉素：Solarbio，P8230。
5.1.2仪器：
1)CO2培养箱：SANYO，MCO-20A1C；
2)倒置显微镜：Nikon，TS100。
5.2具体步骤：
电转后的细胞首先用mTeSR1培养液培养至细胞克隆即将融合，用含终浓度为300ng/mL嘌呤霉素的mTeSR1培养液进行培养与筛选，每天更换新鲜培养液，直至细胞克隆数目不再减少，光学显微镜下挑取存活的单克隆，分别进行扩增培养。
6.PCR鉴定及Sanger测序
6.1材料和仪器：
6.1.1试剂及耗材：
1)EDTA：Invitrogen，15575-038；
2)基因组提取试剂盒：上海碧云天生物科技有限公司，D0065M；
3)PBS(1×)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202；
4)PCR酶：Takara，RR902；
5)DNA Marker：100bp DNA Ladder，BM301；
6)琼脂糖；Brofroxx，0002A；
7)离心管：FALCON，352096。
6.1.2仪器：
1)PCR仪：Bio-Rad，T100；
2)核酸水平电泳仪：北京六一生物科技有限公司，DYCP-31CN。
3)离心机：飞鸽牌，TDL-40B。
6.2具体步骤：
扩增培养后的细胞克隆经过消化离心收集样本，用碧云天动物基因组快速鉴定试剂盒制备DNA混合液，DNA混合液采用Takara Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0plusdye)预混酶进行PCR检测，PCR引物为验证上游引物1(Validation Forward Primer 1，VF1)及验证下游引物1(Validation Reverse Primer 1，VR1)(引物信息见表10)，其中VF1位于供体质粒左同源臂对应基因组的5’端上游，VR1位于供体质粒右同源臂对应基因组的3’端下游。插入片段大小为786bp，插入片段的克隆经PCR获得的条带大小为1468bp，野生型对照BC1-iPSC克隆的条带大小为682bp。PCR体系：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0plusdye)25μL，上下游引物各1.5μL，DNA混合液1μL，无菌超纯H2O 21μL，共50μL。PCR程序设定为：95℃3min，(95℃15s，55℃15s，72℃1min)×35个循环，72℃5min，4℃∞。1.5％琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切胶并送由上海生工生物工程股份有限公司进行Sanger测序。
表10 PCR鉴定引物信息表
Figure BDA0002677858260000131
7.STR检测及核型分析
7.1材料和仪器：
7.1.1细胞：BC1-hiPSC，由程临钊教授(中国科学技术大学)馈赠。
7.1.2试剂及耗材：
1)mTeSR1培养基：STEM CELL，#05851；
2)EDTA：Invitrogen，15575-038；
3)PBS(1×)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202；
4)Matrigel：Corning，354277；
5)六孔板：FALCON，353046；
6)培养皿：FALCON，353003；
7)离心管：FALCON，352096。
7.1.2仪器：
1)CO2培养箱：SANYO，MCO-20A1C；
2)倒置显微镜：Nikon，TS100；
3)离心机：飞鸽牌，TDL-40B。
7.2具体步骤：
BC1-VSX2eGFP-iPSC培养至融合度达到约80％～90％时，吸去mTeSR1培养基，PBS洗涤后，加入0.5mM EDTA，37℃消化5min，去EDTA，加入mTeSR1培养基，吹下所有细胞，1500r/min离心5min，收集细胞沉淀，送Cobioer Biosciences公司进行STR检测。往融合度约50％的BC1-VSX2eGFP-iPSC中加入含终浓度为0.8μg/ml秋水仙素的mTeSR1培养基，处理2.5h，吸去培养基，PBS洗涤后，加入0.25％胰蛋白酶，37℃消化1min，加入mTeSR1培养基将细胞吹下，1500r/min离心10min，收集细胞，送广州达安临床检验中心完成制片及核型分析。
8.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
8.1.1细胞：BC1-hiPSC，由程临钊教授(中国科学技术大学)馈赠。
8.1.2试剂及耗材：
1)mTeSR1培养基：STEM CELL，#05851；
2)EDTA：Invitrogen，15575-038；
3)PBS(1×)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202；
4)Matrigel：Corning，354277；
5)六孔板：FALCON，353046；
6)离心管：FALCON，352096。
8.1.2仪器：
1)CO2培养箱：SANYO，MCO-20A1C；
2)倒置显微镜：Nikon，TS100；
3)离心机：飞鸽牌，TDL-40B。
8.2具体步骤：
BC1-hiPSC及BC1-VSX2eGFP-iPSC培养至融合度达到约80％-90％时，吸去mTeSR1培养基，PBS洗涤后，加入0.5mM EDTA，37℃消化4-6min，去EDTA，加入mTeSR1培养基，吹下所有细胞，1500r/min离心5min，收集细胞沉淀，送广州洪祥生物医药科技有限公司，检测BC1-VSX2eGFP-iPSC及BC1-iPSC中多能干细胞分子标志物的mRNA表达水平，以GAPDH作为内参基因。引物信息见表11。
表11 RT-PCR检测引物信息表
Figure BDA0002677858260000141
Figure BDA0002677858260000151
9.三胚层形成
9.1材料和仪器：
9.1.1试剂及耗材：
1)mTeSR1培养基：STEM CELL，#05851；
2)EDTA：Invitrogen，15575-038；
3)PBS(1×)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202；
4)Matrigel：Corning，354277；
5)(-)-Blebbistatin：Sigma，B0560；
6)DMEM/F12基础培养基：Gibco，C11330500BT；
7)非必需氨基酸(MEM-NEAA)：Gibco，11140-050；
8)GlutaMAX：Gibco，35050-061；
9)胎牛血清(FBS)：Natocor，10099-141；
10)β-巯基乙醇：Invitrogen，21985123；
11)培养皿：BIOFIL，TCD000100；
12)离心管：FALCON，352096。
9.1.2仪器：
1)CO2培养箱：SANYO，MCO-20A1C；
2)倒置显微镜：Nikon，TS100；
9.2具体步骤：
BC1-VSX2eGFP-iPSC培养至融合度达到约80％～90％时，吸去mTeSR1培养基，PBS洗涤后，加入0.5mM EDTA，37℃消化4-6min。吸去EDTA，用mTeSR1培养基吹下所有细胞，移入低吸附皿中，加入含有10μM(-)-Blebbistatin的mTeSR1培养基，15mL，摇匀，37℃，5％CO2培养过夜。将构建拟胚体当天记为诱导分化第0天，第1天，将培养基更换为mTeSR1培养基，第12天，将培养基更换为MEFG培养基(MEFG成分：DMEM/F12基础培养基中补充体积分数为1％的MEM-NEAA，体积分数为10％的FBS，体积分数为1％的GlutaMAX，终浓度为100μM的β-巯基乙醇)，继续培养14天，收集样本，免疫荧光检测三胚层标志物。
10.免疫荧光检测
10.1材料和仪器：
10.1.1试剂及耗材：
1)PBS粉末：Boster Immunoleader,AR0030；
2)PFA粉末：Sigma,P6148-1KG；
3)蔗糖粉末：Biofroxx，1245GR500；
4)DAPI染料：NY809，1:1000，东仁化学科技(上海)有限公司；
5)TritonX100：MP Biomedicals,LLC；194854；
6)Donkey serum：Hyclone，XT-100；
7)兔抗人NANOG一抗(1:100，ab21624，英国Abcam公司)，鼠抗人SSEA4一抗(1:100，ab16287，英国Abcam公司)，鼠抗人TRA-1-60一抗(1:100，ab16288，英国Abcam公司)，鼠抗人TUJ1一抗(1:500，ab7751，英国Abcam公司)，鼠抗人α-SMA一抗(1:500，ab119952，英国Abcam公司)，鼠抗人AFP一抗(1:200，ab3980，英国Abcam公司)，兔抗人OCT4一抗(1:200，A7920，武汉爱博泰克生物科技有限公司)，羊抗人VSX2一抗(1:200，ab9016，美国Millipore公司)；
8)驴抗兔Alexa Fluor-555标记二抗(1:500，A31572，美国Thermo FisherScientific公司)、驴抗鼠Alexa Fluor-555标记二抗(1:500,A31570，美国Thermo FisherScientific公司)、驴抗羊Alexa Fluor-555标记二抗(1:500,A21436，美国Thermo FisherScientific公司)；
9)O.C.T包埋剂：樱花，4583；
10)抗荧光淬灭封片剂：碧云天，P0128M-2。
10.1.2仪器：
1)倒置荧光显微镜：ZEISS，HAL100；
2)实体显微镜：LEICA，M26；
3)冰冻切片机：LEICA，CM1950；
4)玻片扫描仪：ZEISS，Axio Scan.21。
10.2具体步骤：
BC1-VSX2eGFP-iPSC及BC1-iPSC经4％PFA固定后进行免疫荧光检测。三胚层组织及视网膜类器官在4％PFA中固定后，转移至含不同质量分数梯度蔗糖的磷酸盐缓冲溶液中进行梯度脱水，O.C.T包埋，冰冻切片后进行免疫荧光检测。免疫荧光检测方法：用含10％驴血清的0.25％X-Triton100在室温封闭通透1h，滴加相应一抗，4℃孵育过夜，洗去一抗，滴加相应二抗，室温避光孵育1h。洗去二抗，加入DAPI溶液，室温避光染核5min，洗去DAPI，抗荧光淬灭封片剂封片后，在荧光显微镜下观察记录相应通道的荧光表达情况。
11.诱导分化获得3D视网膜类器官
11.1材料和仪器：
11.1.1试剂及耗材：
1)mTeSR1培养基：STEM CELL，#05851；
2)Matrigel：Corning，354277；
3)DMEM/F12基础培养基：Gibco，C11330500BT；
4)DMEM Basic培养基：Gibco，C11995500BT；
5)N2添加剂：Gibco，17502-048；
6)非必需氨基酸(MEM-NEAA)：Gibco，11140-050；
7)GlutaMAX：Gibco，35050-061；
8)B27(不含维生素A)：Gibco,17504044；
9)肝素：Sigma，2mg/mL in PBS；
10)牛磺酸：Sigma，#T-0625；
11)胎牛血清(FBS)：Natocor，10099-141；
12)抗细菌真菌药(AA)：Gibco，15240；
13)培养皿：BIOFIL，TCD000100；
14)钨针；
11.1.2仪器：
1)CO2培养箱：SANYO，MCO-20A1C；
2)倒置显微镜：Nikon，TS100；
3)倒置荧光显微镜：ZEISS，HAL100；
11.2具体步骤如下：
BC1-VSX2eGFP-iPSC融合度约70％-80％时，吸去mTeSR1培养基，PBS洗涤后，加入0.5mM EDTA，37℃消化4-6min。吸去EDTA，用mTeSR1培养基吹下细胞，得到小细胞团，将细胞团移入低吸附皿中，加入含有10μM(-)-Blebbistatin的mTeSR1培养基，摇匀，37℃，5％CO2培养过夜。将构建拟胚体当天记为诱导分化第0天。第1-3天，将培养基逐渐全量换成NIM培养基(NIM成分：DMEM/F12基础培养基中添加体积分数为1％的N2添加剂，体积分数为1％的MEM-NEAA，终浓度为2μg/mL的肝素)。第4-7天将拟胚体接种到Matrigel包被的培养皿继续培养。第16天将培养基更换为RDM培养基(RDM成分：DMEM/F12基础培养基中添加体积分数为35％的DMEM Basic培养基，体积分数为2％的B27(不含维生素A)，体积分数为1％的AA，体积分数为1％的MEM-NEAA)。第28天，结构良好的3D视网膜可突出于培养孔底表面，用钨针将3D视网膜组织挑起，悬浮培养于低吸附培养皿中，得到3D视网膜杯。第42天将培养基更换为RC2培养基(RC2成分：DMEM/F12基础培养基中添加体积分数为40％的DMEM Basic培养基，体积分数为2％的B27(不含维生素A)，体积分数为1％的AA，体积分数为1％的MEM-NEAA，体积分数为10％的FBS，体积分数为1％的GlutaMAX，终浓度为100μM的牛磺酸)。拍照记录绿色荧光表达变化，收集样本进行免疫荧光检测。
具体结果如图1-5所示。
嘌呤霉素筛选中，嘌呤霉素筛选后光学显微镜下挑取存活的单克隆，其中一株hiPSC克隆明场图如图1B所示。
图1C为嘌呤霉素筛选后随机挑取20个hiPSC克隆的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳结果：WT为野生型对照BC1-iPSC；M为1500bp DNA Ladder；C1-C20分别对应20个hiPSC克隆，其中的C5、C11、C14、C15是P2A-eGFP敲入成功的克隆。其中克隆C5的Sanger测序结果图如图1D所示。以上PCR及Sanger测序结果表明eGFP报告基因正确插入。
STR检测及核型分析中，BC1-VSX2eGFP-iPSC的核型分析结果如图2所示，其中：2A：秋水仙素处理前BC1-VSX2eGFP-iPSC的明场图；2B：秋水仙素处理2.5h后BC1-VSX2eGFP-iPSC的明场图；2C：BC1-VSX2eGFP-iPSC核型分析图，显示正常的G带核型。STR检测结果，与权威数据库如ATCC进行比对表明，BC1-VSX2eGFP-iPSC与其它细胞无交叉污染。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)中，检测BC1-VSX2eGFP-iPSC及BC1-iPSC中多能干细胞分子标志物的mRNA表达水平，以GAPDH作为内参基因；结果如图3A所示，RT-PCR检测显示BC1-VSX2eGFP–hiPSC(图中为VSX2)及BC1-hiPSC(图中为BC1)的多能标志物NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B及GDF3在mRNA水平均有表达，且水平相当。
图3B-E的结果表明，免疫荧光检测显示BC1-VSX2eGFP-hiPSC中多能干细胞分子标志物NANOG、SSEA4、TRA-1-60及OCT4均阳性表达，呈红色荧光(Alexa Fluor-555)，细胞核呈蓝色荧光(DAPI)。
图4A-F结果表明，免疫荧光显示诱导分化后得到的三胚层组织表达内胚层标志物AFP(肝脏细胞)，中胚层标志物α-SMA(平滑肌)和外胚层标志物TUJ1(神经细胞)，标志物(AFP、α-SMA、TUJ1)均呈红色荧光(Alexa Fluor-555)，细胞核呈蓝色荧光(DAPI)。说明BC1-VSX2eGFP-hiPSC具备三胚层分化能力。
图5A-C：BC1-VSX2eGFP-iPSC分化获得视网膜类器官并表达报告荧光蛋白eGFP；5A：明场图；5B：eGFP表达在神经视网膜层；5C：明场与eGFP叠加图；图5D-I：免疫荧光检测VSX2蛋白与eGFP在视网膜类器官中共定位，VSX2呈红色荧光(Alexa Fluor-555)，eGFP为绿色荧光(自发荧光)，细胞核呈蓝色荧光(DAPI)。说明eGFP特异性表达在早期神经视网膜层，并且与VSX2蛋白共表达。
序列表
<110> 中山大学中山眼科中心
<120> 一种VSX2绿色荧光报告基因载体系统及其构建方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccgggagg acatggctta ggtca 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaactgacct aagccatgtc ctccc 25
<210> 3
<211> 1289
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccaagctcga caagatggag caggacgagc ggggccccga cgctcaggcg gccatctccc 60
aggaggaact gagggagaac agcattgcgg tgctccgggc caaagctcag gagcacagca 120
ccaaagtgct ggggactgtg tctgggccgg acagcctggc ccggagtacc gagaagccag 180
aggaggagga ggccatggat gaagacaggc cggcggagag gctcagtcca ccgcagctgg 240
aggacatggc tggaagcgga gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg 300
aggagaaccc tggacctatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca 360
tcctggtcga gctggacggc gacgtgaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 420
agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 480
ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 540
accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 600
aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 660
tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 720
gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 780
ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 840
gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 900
tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 960
agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 1020
acgagctgta caagtaagtc aaggcgcgct cagatgccgg agccccaaga ctctgctctc 1080
ctcgggccct gtggtgctgg gagatgctct ctgaggcaag gcccagacct ggcctctgcc 1140
atcctccctg ttccccacag gtcctccatc acccctggtg gctgcaggca ccgctgggtt 1200
ctgactctgg accatgctga gacatccctc atctagtctt gacctctcca gcatcccagc 1260
ctcagaagcc ttcttgctgc ccacaacgt 1289
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atagaattcc caagctcgac aagatggagc a 31
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atactcgaga cgttgtgggc agcaagaagg cttctga 37

Claims (4)

1.一种VSX2绿色荧光报告基因载体系统，其特征在于，包含PX459-VSX2_sgRNA敲除质粒和pBluescript-LA-P2A-eGFP-RA供体质粒。
2.一种VSX2绿色荧光报告基因载体系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.根据人VSX2基因序列设计sgRNA并合成sgRNA上下游引物，经过变性和退火后插入至pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)载体中，构建得到PX459-VSX2_sgRNA敲除质粒；
所述的sgRNA上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，sgRNA下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
b.以pBluescript SK(-)载体为骨架，插入LA-P2A-eGFP-RA片段，构建得到pBluescript-LA-P2A-eGFP-RA供体质粒；
所述的LA-P2A-eGFP-RA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤a，包括以下步骤：根据人VSX2基因序列设计sgRNA并合成sgRNA上下游引物；用BbSⅠ酶酶切pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)载体线性化，然后用T4 DNA连接酶连接线性化的载体和经过变性和退火后的sgRNA上下游引物，连接产物转化至DH5α感受态大肠杆菌，氨苄青霉素筛选培养，经测序验证获得正确插入的质粒，构建得到PX459-VSX2_sgRNA敲除质粒。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤b，包括以下步骤：
b1.用EcoRⅠ酶和XhoⅠ酶双酶切pBluescript SK(-)载体线性化；
b2.用LA-P2A-eGFP-RA的上下游引物扩增LA-P2A-eGFP-RA片段，扩增产物用EcoRⅠ酶和XhoⅠ酶双酶切；所述的LA-P2A-eGFP-RA的上游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的LA-P2A-eGFP-RA的下游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
b3.用T4 DNA连接酶连接线性化的pBluescript SK(-)载体和双酶切的LA-P2A-eGFP-RA片段，连接产物转化至DH5α感受态大肠杆菌，氨苄青霉素筛选培养，经测序验证获得正确插入的质粒，构建得到pBluescript-LA-P2A-eGFP-RA供体质粒。
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