CN1671842A - 增强体细胞同源重组的方法和构建特异抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

用来提供可显著促进免疫细胞中在抗体基因座的体细胞同源重组而由此建立多样化抗体的新方法。将在抗体基因座发生DNA同源重组的免疫细胞(例如,DT40细胞)与组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(例如,制滴菌素A)等接触,以使得该抗体基因座的染色质结构松弛。因此,可促进在该抗体基因座的体细胞同源重组并且可构建多样化的抗体分子。可从经过促进体细胞同源重组而具有如此多样化抗体分子的细胞,通过合适的筛选法(例如,利用抗原-包被的珠子)构建特异结合抗原的抗体。

Description

增强体细胞同源重组的方法和构建特异抗体的方法
技术领域
本发明一般涉及增强体细胞同源重组的技术,并更详细地涉及增强在体细胞中基因座的体细胞同源重组的方法,以及已经通过所述方法增强体细胞同源重组的免疫细胞。
此外,本发明涉及利用上述用于增强体细胞同源重组的方法获得多样化抗体分子的方法,以及通过所述方法构建的多样化抗体。
进一步的,本发明涉及适用于促进体细胞同源重组的医药试剂。
背景技术
传统上认为体细胞同源重组是产生遗传多样性的一个因素。例如,在雏鸡来源的B细胞系中,已知DNA重组发生在抗体的免疫球蛋白基因座(Buerstedde等人,EMBO J.(1990)9:921-927)。可以想象可利用这种DNA重组产生各种蛋白因子,但实际上,重组频率是极低的,所以单独使用来产生蛋白因子是很困难的。
此外,当生产抗体时,通常使用例如兔和小鼠的动物,但是当需要获得更多样化的抗体时,必须用抗原免疫大量的动物个体。另外,所得到的抗体的滴度取决于动物个体之间的差异和抗原的特性,所以很难稳定地获得高滴度的多样化抗体。
因此,设想利用在上述雏鸡来源的B细胞系中发生的DNA同源重组来获得抗体,并且就原理而言,用该方法合成多样化抗体是有可能的。然而如上所述,由于DNA同源重组频率极低,认为实际中用培养细胞人工生产特异于抗原的抗体是极困难的。
另一方面,近年来,在敲除XRCC2和XRCC3的DT40细胞系中(雏鸡来源的B细胞系),已有报道增加了体细胞突变的频率(Sale等人,自然Nature(2001)412:921:926)。已经考虑使用这种体细胞突变,并且实际上,已经试图利用Ramos细胞和敲除XRCC2和XRCC3的DT40细胞来增加对抗原的抗体亲和性。然而,利用这种方法获得的抗体没有显示出特异性,并且结合多种蛋白质(Cumbers等人,Nat.Biotechnol.(2002)20(11):1129-1134)。由于体细胞突变在体内对亲和性成熟有副作用,认为在抗体特异性中产生大规模的变化是很困难的。
发明公开
本发明的发明人考虑到上述状况,致力于研究是否在可控制的条件下有方法可以诱导或增强所需要的体细胞同源重组,结果发现,与预期的相反,可通过松弛免疫细胞染色体的染色质结构来极大地升高体细胞同源重组的频率。
如此概括而言,本发明的目的是提供在体细胞中的基因座增强体细胞同源重组的方法。
此外,本发明的目的是提供已经在上述方法中促进体细胞同源重组的免疫细胞。
进一步的,本发明的目的是提供利用在免疫细胞中发生的体细胞同源重组使获得多样化抗体成为可能的抗体生产方法。
更进一步的,本发明的目的是提供通过上述的抗体生产方法所生产的多样化抗体。
因此,在本发明中,提供用于促进体细胞同源重组的方法,其特征在于通过松弛所述体细胞中染色体的染色质结构来促进在基因座发生DNA同源重组的体细胞中的同源重组。
此外,在本发明中,抗体生产方法的特征在于从通过松弛所述免疫细胞中染色体的染色质结构而使DNA同源重组发生在基因座的免疫细胞生产抗体时,DNA在抗体基因座的同源重组得到增强,由此获得多样化的抗体。另外,提供该方法中所生产的多样化抗体。
根据获得抗体基因多样性的观点,已知同源重组比突变有更高的效率,并且相对于XRCC2/XRCC3变体株而言(Sale等人,自然Nature(2001)412:921-926),认为更容易获得高多样性的抗体。如果获得在抗体基因座的体细胞同源重组得到增强的细胞,并且通过培养和维持所述细胞来产生所需要的抗体,就可能在任何时间容易地制备所需要的抗体。因此在将来,预期能够建立针对所有的抗原以高效价生产抗体,而不需使用动物实验的技术,并且可能提供用于以高效价且连续不断地治疗疾病等的抗体等。此外,根据对动物的人道主义观点,这具有实用性。
相对于利用动物抗体生产的常规技术而言,本发明可用更少量的抗原生产抗体(小于或等于1μg。通常用数mg免疫动物。),并且可大量的节约生产时间(最短为1周。在动物中,对于多克隆抗体需要数周,而对于单克隆抗体需要数个月。)进一步的,由于缩短生产时间而减少了人员成本,就可能极大地降低生产单克隆抗体杂交瘤所需要的成本。此外,由于这是利用培养细胞的系统,优点就是如果一个因子在生物个体水平是有毒的,而如果它在细胞水平是无毒的,则其可用作抗原。
此外,作为体外生产抗体的方法,噬菌体展示法等是常规已知的,但是这些方法使用将单链整合到噬菌粒中的文库,其中该单链是通过用接头连接抗体重链和轻链的可变区而制备的。由于除了可变区,天然抗体具有极为不同的结构,为了实际制备抗体,必须再从所选择的噬菌体克隆基因,并且将其与抗体的恒定区连接。另一方面,在本发明所述的方法中,由于它们已经是IgM的形式,其处于可立即以抗体分子的形式进行使用的状态。也可进行用于后继操作的公众已知的方法,并且例如,通过使用已经存在的第二抗体等,可进行分离、纯化等。
进一步的,正常地在体外方法中(例如噬菌体展示),文库的质量(例如,克隆的数目)是很重要的,并且在文库的产生中会有很多麻烦。除此以外,如果重复使用文库,该文库的性能会下降而不易进行保持。
根据本发明的方法,可用对培养物进行简单操作来产生文库,并且由于所生产的文库其本身会单独变化,其可如正常的细胞培养物进行保持和管理。此外,在噬菌体展示的方法中,经常有必须进行数次筛选的情况,但在本发明的方法中,可用一次筛选获得特异的抗体,因此可容易且快捷地获得特异的抗体。
关于可用于本发明的免疫细胞,任何细胞都是可用的,只要其是在抗体基因座发生体细胞同源重组的细胞,但是优选使用是来源于雏鸡的B细胞系的DT40细胞。
关于松弛染色质结构的方式,认为可使用为本领域技术人员公知的任何方式,但是可优选使用将组蛋白脱乙酰化酶抑制剂与靶细胞接触的方法。该抑制剂可以是抑制组蛋白脱乙酰化酶的任何抑制剂,但优选使用制滴菌素A。
此外,当将免疫细胞与组蛋白脱乙酰化酶抑制剂接触作为用于松弛染色质结构的方法,对于组蛋白脱乙酰化酶抑制剂可使用任何处理浓度和处理时间,只要其是在被接触的细胞不死亡的范围内。具体的,当使用制滴菌素A,优选处理浓度为大约0.5ng/ml-大约5.0ng/ml,并且优选处理时间为大约2周-大约2年。
更进一步的,在本发明中,提供用于促进在基因座的体细胞同源重组,并包括组蛋白脱乙酰化酶的抑制剂的医药试剂。
作为本发明中的医药试剂,任何抑制剂都是可用的,只要其是组蛋白脱乙酰化酶的抑制剂,但制滴菌素A是最常用和优选的。
附图简述
图1是表示具有恒定区并缺失用于Southern杂交的探针区的变体产生的框架形式图。利用具有插入的杀稻瘟素抗性基因的质粒(构建体UR1),未排列轻链基因座的恒定区的附近区域(包括探针区)被杀稻瘟素抗性基因置换。
图2表示抗体轻链基因染色质结构TSA依赖的易接近性的增加。裸露的DNA指脱去蛋白质的基因组DNA的相同区域。
图3显示制滴菌素A对同源重组的影响。
(a)显示在存在1.25ng/ml制滴菌素A时培养3周的克隆的抗体轻链基因可变区的多样性。
(b)显示在缺乏制滴菌素A时培养3周的克隆(No.1-No.6)的抗体轻链基因可变区的多样性。
图4显示制滴菌素A对IgM(+)细胞出现频率的影响。
(a)显示在存在1.25ng/ml制滴菌素A时培养的5个克隆(No.1-No.5)的结果。
(b)显示在缺乏制滴菌素A时培养的6个克隆(No.1-No.6)的结果。
图5显示用山羊IgG磁珠所选择的细胞的抗原特异性。
(a)显示在用山羊IgG磁珠选择后,细胞与山羊IgG的结合。左图:显示未进行选择的细胞群与山羊IgG-FITC的结合结果(未选择的)。中图:显示与山羊IgG显示强结合的克隆的结果(克隆No.3)。右图:显示与山羊IgG只显示极弱结合的克隆的结果(只有代表性的
实施例,克隆No.17)。
(b)显示与山羊IgG显示强结合的克隆(No.3)与其它抗原的结合。上部:显示与链霉抗生物素(SA)结合的结果。左图是未进行选择的细胞群(SA,未选择的),而右图显示结合山羊IgG的克隆的结果(SA,克隆No.3)。下部:显示与卵白蛋白-FITC(OA)结合的结果。左图是未进行选择的细胞群(OA,未选择的),而右图显示结合山羊IgG的克隆(SA,克隆No.3)的结果。
图6显示用人IgG磁珠进行选择的细胞的分析结果。
(a)在ELISA方法中观察到强信号的细胞与人IgG-FITC的结合。显示3个代表性克隆(克隆7、克隆8、克隆20)的结果。
(b)显示当考虑到与(a)中所示3个克隆相关的结合特异性时的结果。显示用人IgG-FITC(hIgG)、兔IgG-FITC(rIgG)、山羊IgG-FITC(gIgG)、链霉抗生物素-FITC(SA)、卵白蛋白-FITC(OA)染色,并通过FACS分析的结果。“未染色的”指没有染色的细胞。
(c)细胞培养物上清液的ELISA的结果。对于克隆7、克隆20和未选择的细胞,利用以人IgG(hIgG)、兔IgG(rIgG)、山羊IgG(gIgG)、链霉抗生物素(SA)和卵白蛋白(OA)涂覆的免疫平板进行ELISA方法。培养物上清液稀释1-500000倍。
实施本发明的最佳方式
由于本发明的抗体生产方法部分地利用促进体细胞同源重组的方法,将详细描述抗体生产的方法。
如先前所描述的,在本发明的抗体生产方法中,选择并培养在抗体基因座发生DNA同源重组的免疫细胞,并且当产生抗体时,进行操作以使得所述免疫细胞的染色体的染色质结构松弛,极大地增加了在抗体基因座发生DNA同源重组的频率,并如此获得多样化的抗体。
因此下文中,将按顺序说明细胞培养、染色质结构松弛的诱导、染色质结构松弛的确证,同源重组的确证和抗体表达的确证。
细胞培养:
本发明中的“免疫细胞”指具有抗体生产能力的B细胞,并且宿主动物的类型包括,小鼠、绵羊、大鼠和雏鸡(Honjo,T.,Alt,F.W.(1995)免疫球蛋白基因Immunoglobulin Genes,第二版(学院出版社))。使用已优选建立的细胞系,并且特别优选的使用DT40细胞作为免疫细胞。
“DT40细胞”是来源于雏鸡B细胞的已建立的细胞培养物,并且已经对所述细胞具有的染色体作了一些改变(例如,特定基因的重组、插入、缺失等)。包括衍生的细胞系和亚系。
根据所述技术领域中公知的方法确定本发明所使用的细胞的培养条件,但不必说,这应在适于所选择免疫细胞的培养基和培养基条件(培养温度,CO2浓度)中进行。因此,当所选择的免疫细胞是DT40,例如,使用IMDM(Ivitrogen)培养基,并且条件是培养温度为例如39.5℃和5%CO2浓度。在保持细胞浓度恒定时进行培养,在适当的时间间隔(例如,每日或每周)确认靶细胞抗体基因座中是否存在体细胞同源重组。
免疫细胞抗体基因座的染色质结构松弛的诱导:
如在此所使用的“染色质结构的松弛”指全部靶基因座的染色质结构的松散,为了使涉及同源重组的每个因子直接或间接地在所述基因座(在此,抗体基因座)发挥作用。在诱导“松弛”的因子中,包括组蛋白乙酰基转移酶(HAT)、组蛋白脱乙酰化酶抑制剂、染色质结构改变因子(例如,Swi/Snf蛋白质、Iswi蛋白质及其同系物,以及其功能性复合物)。诱导“松弛”的优选因子是组蛋白脱乙酰化酶抑制剂。
关于“组蛋白脱乙酰化酶抑制剂”,认为任何这种抑制剂都是可用的,只要其是为本领域的技术人员已知的,例如蛋白因子,如具有组蛋白脱乙酰化醇(HDAC)活性抑制活力的抗体、制滴菌素A、和小分子化合物,例如异丁草丹(butylate)和丙戊酸盐,但最优选的,可利用制滴菌素A。
为了松弛免疫细胞在抗体基因座的染色质结构,使诱导松弛的因子在靶免疫细胞内表达,或直接将该因子与所述的细胞接触。当诱导松弛的因子是蛋白质因子时,并且当染色质结构的松弛是通过使所述因子在细胞内表达而诱导时,这通过将用于所述因子在靶细胞内表达的适当启动子、终止子、增强子等转染靶细胞而实现。对于本领域的技术人员来说,可容易地进行所述因子在免疫细胞内的表达(参见,Spector,D.L.,等人(1998)).Cells a Laboratory Manual(冷泉港实验室出版社))。当将用于诱导松弛的因子直接与靶免疫细胞接触,在保持所述因子浓度恒定的同时进行培养。将其中诱导松弛的因子已经表达,或已经接触该因子的细胞培养合适量的时间以导致抗体基因座的体细胞同源重组。例如,当所述因子是组蛋白脱乙酰化酶抑制剂制滴菌素A时,导致抗体基因座的体细胞同源重组的合适量时间优选为大约2周-大约2年,更优选为大约2周-大约6周,以及最优选为大约5周,并且合适的浓度优选为大约0.5ng/ml-大约5.0ng/ml,以及最优选为1.25ng/ml。
在抗体基因座染色质结构中变化的检测:
通常利用所述区域的DNA酶敏感性作为指示剂检测特异基因座区域染色质结构中的变化。在用上述方法处理的细胞中,当靶基因座区域的染色质结构松弛了,认为该部分DNA和染色质相关蛋白(例如组蛋白)之间的相互作用发生降低。结果是,由于结合染色质相关蛋白而未受到DNA酶消化的DNA区域,因为染色质结构的松弛相互作用降低而变得对DNA酶敏感。随染色质结构中的变化前后对DNA酶敏感性的变化改变了所述区域的DNA切割模式,并且通过经Southern印迹等检测新产生的DNA片段,可确证其中染色质结构松弛的基因座区域。在此,关于DNA酶,通常使用DNA酶1、MNase(微球菌核酸酶)。
在抗体基因座的体细胞同源重组的确证:
通过确定利用上述方法进行处理的细胞的抗体基因座区域的基因组序列,并将其与未利用上述方法进行处理的对照细胞的抗体基因座区域的基因组序列比较来进行体细胞同源重组的确证。关于确定抗体基因座区域的基因组序列的方法,通常,用特异的DNA引物扩增所述的基因区域,并且通过克隆到适合的测序载体中,对扩增的DNA片段进行测序。简单的方法是制备为扩增从靶免疫细胞制备的基因组DNA的抗体基因座区域所必需的DNA引物(例如,为了包括完整的靶抗体基因座区域,在所述基因5’侧的附近区域构建正向的引物,并在所述基因3’侧的附近区域构建反向的引物),并通过PCR扩增抗体基因座区域。所扩增的抗体基因座区域是抗体轻链基因和/或抗体重链基因,优选为任一基因的可变区。关于用于扩增的DNA聚合酶,可使用商业购买的酶,但优选,该酶应可用于长DNA链的延伸,并且是高保真的。进行抗体基因座区域扩增的条件取决于所使用DNA引物的退火温度和所使用DNA聚合酶的特性,例如,在98℃反应2分钟后,98℃30秒,57℃30秒,72℃1分钟进行27个循环,然后进一步在72℃反应15分钟。反应后的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离,切下含有靶抗体基因座区域的DNA条带,并且在回收DNA后,将其克隆到载体中用于测序。测序载体可以是所述技术领域中所使用的任何载体,例如,使用pCR2.1-TOPO(Invitrogen)等。通过分析上述制备的测序载体中抗体基因座区域的DNA序列,并将其与来源于未诱导抗体基因座体细胞同源重组的细胞的相应序列比较来测量体细胞重组的频率。
抗体表达的确证:
在根据上述说明已经证实在抗体基因座体细胞同源重组的细胞中确证是否已经实际诱导了抗体的表达。
“多样化的抗体”包括IgA、IgD、IgE、IgG、IgY和IgM。
(i)分泌抗体的确证
当来源于体细胞同源重组基因座的抗体被分泌出来,在含有所产生抗体分子的培养物上清液中证实靶抗体分子的存在。关于确证的方法,可通过本领域技术人员公知的任何方法进行证实,例如,利用特异识别所产生抗体分子的抗体的检测方法(例如,利用标记的第二抗体,例如Western印迹或ELISA)是很普遍的。简单的方式是在如Western印迹或ELISA等中使用培养物的上清液。当所产生抗体的浓度很低,可从所述的培养物上清液浓缩靶抗体后进行对所产生抗体的确证。简单的方式是通过硫酸铵沉淀(50%硫酸铵)等,随后将抗体分子沉淀悬浮在合适的缓冲液中(例如PBS等),并对该溶液进行透析来从所述的培养物上清液浓缩和沉淀抗体分子。同时交换透析液体,进行透析直到除去硫酸铵。利用特异识别所述抗体分子的抗体,通过所得到抗体分子的Western印迹来直接或间接地进行对所产生抗体分子的检测。备选地,当所产生的抗体是IgG,可通过利用蛋白质A或蛋白质G的亲和色谱法直接纯化来进行确证。
(ii)在细胞膜上表达的IgM的确证
当通过促进体细胞同源重组所产生的抗体是存在于细胞膜上的IgM时,可通过利用抗IgM抗体的激发荧光细胞分离器(FACS)分析来进行确证。
在下文中,将显示实施方案,但本发明不只限于这些。
实施方案1:制滴菌素A(TSA)处理后DT40细胞抗体基因座区域中染色质结构的分析
利用微球菌核酸酶(MNase)敏感性作为指示剂的间接末端标记来分析是否TSA已经实际诱导抗体轻链基因染色质结构的改变。在雏鸡的抗体等位基因中,一个是VJ重排的,而另一个没有重排,但已知抗体生产中实际的功能是VJ重排的那个。然而,由于两个序列几乎是相同的,很难通过简单应用间接末端标记的方法来分析野生型DT40细胞的VJ重排的等位基因。为了解决这个问题,在未发生VJ重组的那侧,产生用作Southern杂交探针的区域附近序列被缺失的突变,并且利用该突变进行MNase敏感性的分析。
缺失突变的产生:
将从抗体轻链基因克隆的质粒#18-4(获得自Shunnichi Takeda教授,Kyoto University Faculty of Medicine)用EcoRI消化,在所产生的2个片段中,将较大的片段与杀稻瘟素抗性基因(获得自Takeda教授)连接,并转化到大肠杆菌中。如此,使恒定区和包括在Southern杂交中用作探针区的区域缺失,并获得置换插入杀稻瘟素抗性基因的质粒(UR1)(图1)。将大约20μg的该质粒用XbaI消化并直链化,根据已知的方法感染到DT40细胞中(Buerstedde,J.M.,Takeda,S.细胞Cell.1991 67(1):179-88),引入具有缺失突变的DT40细胞系(3H12)。
细胞核的分离:
将含有107-108个3H12细胞的培养液在加有TSA(0ng/ml,0.625ng/ml,1.25ng/ml,2.5ng/ml)的培养基中培养8小时后,于300g离心15分钟,回收细胞,悬浮在10ml的PBS中,再于300g离心15分钟,并回收沉淀。随后,将细胞悬浮在4ml的核缓冲液中(10mMTris-HCl(pH 8.0),0.32M蔗糖,5mM MgCl2,1%TritonX-100,0.5mM DTT,0.1mM PMSF),再通过在冰上放置15分钟除去细胞膜。通过在1000g离心5分钟来回收核。
MNase的消化:
将核沉淀重悬在10ml的RSB中(10mM Tris-HCl(pH 7.5),10mM NaCl,1.5mM MgCl2,0.5mM DTT,1mM PMSF)。通过在1000g再离心5分钟来回收核,并且悬浮在400ml的RSB中。通过Hoechst 33258结合来测量该核悬浮液的DNA浓度,用RSB将相当于100μg的悬浮液制备成500ml。对于每种细胞制备4份这种溶液。进一步加入0.5μl的1M CaCl2和MNase(0U,0.04U,0.2U,1U),37℃消化5分钟后,加入20μl的0.5M EDTA和12.5μl的20%SDS,2μl的15mg/ml蛋白酶K,并在50℃反应过夜。加入500μl的酚氯仿,温和搅动30分钟后,在1.5Krpm离心30分钟后,回收上层液,并转入新的试管。进一步加入500μl的氯仿,并再次搅动30分钟,在1.5Krpm离心5分钟后,将上层液转入新试管。加入50μl的3M乙酸钠和1ml冷的乙醇并温和地混合。在1.5Krpm离心20分钟,除去上清液后,加入500μl的80%乙醇并温和混合,在1.5Krpm再离心5分钟。除去上清液后,将沉淀空气干燥。加入100μl的TE(10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA),在55℃保持1个小时,随后在4℃放置过夜而溶解。
Sourthern印迹分析:
通过Church和Gilbert的方法(Church,G.M.,Gilbert,W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1984 81(7):1991-5)进行Southern印迹分析。用旋转柱(Pharmacia ProbeQuant G-50)纯化大约20μg的DNA后,用限制性内切醇BsaAI(NEB)消化。随后进行酚/氯仿抽提,从乙醇沉淀回收DNA后,用1.5%的琼脂糖凝胶在TAE(40mM Tris-乙酸,1mM EDTA)缓冲液中进行电泳。通过Vacu Gene XL核印迹系统(Pharmacia)将DNA转移到膜上。首先,用变性缓冲液(1.5M NaCl,0.5M NaOH)变性15分钟,然后用转移缓冲液(1.5M NaCl,0.25MNaOH)转移超过4小时。膜用20×SSC中和后,用杂交缓冲液(10mg/mlBSA,0.5M Na2PO4(pH 7.4),7%SDS,1mM EDTA)在62℃预杂交1小时。随后将用[α32P]dCTP标记的50ng探针在杂交缓冲液中于62℃杂交过夜。然后膜用预热到65℃的50ml洗涤缓冲液(20mMNa2PO4(pH 7.4),1%SDS,1mM EDTA)在62℃洗涤10分钟,该步骤后进一步重复4次,用BAS 2000分析膜的放射活性。利用PCR方法(Roche,高保真扩展的PCR系统)产生探针DNA。此时,ATCTTGCCTTCCTCATGGC(序列号为1)和GTTTGGGTGAACGTGGTTC(序列号为2)用作引物,并且雏鸡抗体轻链基因的克隆质粒#18-4用作模板。
结果:
当所加入的MNase的量(0U,0.04U,0.2U,1U)在TSA的各种浓度(0ng/ml,0.625ng/ml,1.25ng/ml,2.5ng/ml)下增加时,随着TSA浓度和MNase的量的增加,证实出现由VJ区域的切割而产生的DNA片段(相对于图2,在由“VJ”指示的位置的条带,例如从左开始的第5泳道和第17泳道)。由于当在缺乏TSA(0ng/ml)的MNase量增加时没有检测到这些条带(图2,从左开始的第5泳道),这表明为了使VJ区域受到MNase的切割,必须存在TSA。从上述结果,证实TSA使DT细胞系VJ区域的染色质结构松弛,并且增加了MNase对那些区域的易接近性。
实施方案2:制滴菌素A(TSA)促进DT40细胞抗体基因座的体细胞同源重组的确证
细胞培养:
在CO2恒温箱中于39.5℃,5%CO2培养DT40细胞。利用IMDM培养基(Invitrogen)作为培养基,加入10%FBS,1%雏鸡血清,100单位/ml青霉素,100μg/ml链霉素和55μM 2-巯基乙醇。此外,制滴菌素A(Wako Pure Chemical Industries)在甲醇中溶解至5mg/ml作为原液,将其用适合的培养基稀释到终浓度为1.25ng/ml而使用。
将不在其细胞表面上表达IgM的DT40细胞(在下文中,IgM(-)细胞)稀释到大约20个细胞/ml,并且在96孔板的每孔中吸入100μl。此时,制备加入1.25ng/ml制滴菌素A的培养基和不加入的培养基。培养细胞直到出现单个的克隆,将5个克隆(对于没有TSA的为6个克隆)转入内有2ml新鲜培养基的6孔板。此时,保持起始的TSA浓度继续培养,保持细胞浓度为105-106个细胞/ml。
基因组DNA的提取:
使用上述的方法,通过激发荧光细胞分离器回收培养3周的DT40活细胞。使用EPICS ELITE ESP,将100000个活细胞收集到1.5ml的试管中。通过离心(1000g,10分钟)回收悬浮在保护液体中的细胞,将300μl的基因组提取缓冲液(100mM Tris-HCl,pH 8.0,5mMEDTA,0.2%SDS,200mM NaCl,和100μg/ml的蛋白酶K)直接加入沉淀,并在50℃消化过夜。次日,加入750μl的乙醇,通过温和地上下颠倒进行混合。离心(1000g,10分钟)回收基因组DNA,用70%的乙醇洗涤,并干燥。加入100μl的TE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA),在50℃放置30分钟后,在4℃溶解过夜。
抗体轻链基因可变区序列的分析:
使用PCR(Perkin Elmer 9600)来扩增抗体轻链基因可变区。使用5μl的基因组DNA溶液(相当于5000个细胞)作为模板,至于引物,分别使用10pmol的上游(CACACCTCAGGTACTCGTTGCZG(序列号为3))和下游(TCAGCGACTCACCTAGGACGG(序列号为4))。利用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo),以50μl的规模进行反应。反应条件是,98℃2分钟后,98℃30秒,57℃30秒,72℃1分钟进行27个循环,并且最后在72℃反应5分钟。随后,加入1μl的ExTaq DNA聚合酶(Takara Shuzo),在72℃反应15分钟后,从全部反应液体中取出20μl用琼脂糖凝胶电泳进行分离。切下相应于轻链基因的条带,用凝胶提取试剂盒(Qiagen)回收DNA后,将其用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆到pCR 2.1-TOPO载体中。并转化到大肠杆菌中。提取质粒,并通过ABI PRI SM 377 DNA测序仪(Perkin Elmer)分析序列。
结果:
当分析了克隆到质粒载体中所扩增的抗体轻链基因可变区的序列后,获得图3中的结果。在加入制滴菌素A并培养的细胞中,将42个样品分拣为16个类型(图3(a))。发现这种多样性是从同源重组、基因插入、基因缺失和点突变产生的。另一方面,在没有制滴菌素A而培养的细胞中,在分析了30个样品后,没有发现同源重组(图3(b))。根据上述的分析结果,可得出结论,DT40细胞系的抗体轻链基因的多样性由于加入制滴菌素A而显著增加。
实施方案3:制滴菌素A对IgM(+)DT40细胞出现频率的促进
用激发荧光细胞分离器(FACS)确认IgM的表达:
将含有大约106个用实施方案2中所述方法进行制滴菌素A处理的IgM(-)细胞的培养物液体置入1.5ml的试管中,通过离心(1000g,5分钟)回收所述的细胞,并悬浮在200μl的染色缓冲液中(PBS,0.3%BSA)。再通过离心回收细胞,然后悬浮在200μl用染色缓冲液稀释1/250倍的FITC-标记的抗雏鸡IgM抗体(BETHYL)中,并在冰上反应1小时。通过离心回收细胞,然后通过将细胞再悬浮在200μl的染色缓冲液中并离心来洗涤细胞。再次重复该洗涤步骤后,将细胞悬浮在含有5μg/ml碘化丙锭(Nakarai)的100μl染色缓冲液中。通过用EPICS ELITE ESP(Beckman Coulter)测量10000个细胞计算表达IgM的细胞的分数。此时,拣出被碘化丙锭染色的细胞作为死亡的细胞。
结果:
当用FACS每周测量表达IgM的细胞(在下文中,IgM(+)细胞)的分数后,如图4中,观察到IgM(+)的分数随时间增加。认为IgM(+)细胞是由于IgM(-)细胞经过同源重组而产生的。
实施方案4:抗原特异抗体的选择
抗原磁珠的生产:
使用Dynabeads M-280 Tosylactivated(Dynal)作为磁珠,并根据手册进行偶联。此时,使用Dynal MPC(Dynal)作为磁力表架。将200μl的珠子在500μl的缓冲液A(0.1M的磷酸钠pH 7.4)中洗涤3次后,通过在37℃旋转搅动24小时,而与400μl缓冲液A中的240μg山羊IgG(SIGMA)或人IgG(SIGMA)反应。然后,在500μl的缓冲液C(10mM的磷酸钠pH7.4,150mM NaCl,0.1%BSA)中将珠子洗涤2次。随后,加入500μl的缓冲液D(0.2M Tris-HCl pH 8.5,0.1%BSA),通过在37℃旋转搅动反应4小时,并进行封闭。然后,在500μl的缓冲液C中洗涤2次后,将其悬浮在含有0.02%叠氮化钠的400μl缓冲液C中。
经抗原磁珠的选择:
根据Cumbers等人的方法(Cumbers等人,Nat.Biotechnol.(2002)20(11):1129-1134),利用抗原磁珠进行选择。将在含有1.25ng/ml制滴菌素A的IMDM培养基中生长6周或更长时间的5×107个野生型DT40细胞用5ml选择缓冲液(含有1%BSA的PBS)洗涤2次,并进一步用1ml的选择缓冲液洗涤1次。随后,将细胞悬浮在1ml的选择缓冲液中,然后加入1μl等当量的抗原磁珠(在1ml的选择缓冲液中洗涤2次)。通过在4℃旋转搅动10分钟而进行反应。后继的处理根据所使用的抗原类型而有略微不同,所以这些应分别加以说明。
(i)利用山羊IgG磁珠的选择
将用山羊IgG磁珠进行选择的细胞利用磁力表架在1ml的选择缓冲液中洗涤3次。随后将回收的细胞悬浮在500μl的选择缓冲液中,然后加入10ml的IMDM培养基,并在96孔板的每孔中吸入100μl。将96孔板保持在40℃热的CO2培养箱内。
(ii)利用人IgG磁珠的选择
将用人IgG磁珠进行选择的细胞利用磁力表架在含有2.5%Pluronic F68(SIGMA)的1ml选择缓冲液中洗涤3次。随后将回收的细胞悬浮在500μl的选择缓冲液中,然后加入30ml的IMDM培养基,并在96孔板的每孔中吸入100μl。将96孔板保持在40℃热的CO2培养箱内。
用荧光标记的抗原染色:
将含有106个来源于96孔板的一个孔的细胞的培养物液体置入1.5ml的试管,通过离心回收细胞,并用200μl的选择缓冲液洗涤2次。然后,将其悬浮在200μl含有10μg/ml FITC标记的抗原(山羊IgG、人IgG、兔IgG(都来自SIGMA)、链霉抗生物素(Dako)、卵白蛋白(分子探针Molecular Probes))的选择缓冲液中,并在冰上反应1小时。通过离心回收细胞,通过再悬浮在200μl的选择缓冲液中并离心而进行洗涤。通过EPICS ELITE ESP(Beckman Coulter)测量染色细胞的荧光强度。
ELISA:
根据SOLID PHASE GUIDE(NalgeNunc)进行ELISA。向Nunc-Immuno Plate MaxiSorp Surface(Nalge Nunc)的每个孔加入200μl的抗原溶液(PBS中5μg/ml),将其在室温下反应过夜,并用抗原进行平板涂覆。次日,除去孔内的液体,加入200μl的封闭缓冲液(含有0.5%脱脂乳的PBS),并反应1小时。第二抗体后,用200μl的ELISA洗涤缓冲液洗涤5次。用100μl的TMB+(Dako)进行颜色反应,并用100μl的1M硫酸中止反应。通过用μQuant生物分子分光计(Biomolecular Spectrometer)(Bio-Tek Instruments)测量450nm处的光吸收来进行测量。
用于ELISA的培养物上清液的生产:
对于通过ELISA分析滴度的培养物上清液,为了除去来源于血清的IgM等,使用按照下列方式制备的培养基。通过50%饱和的硫酸铵从雏鸡血清(Invitrogen)除去沉淀的免疫球蛋白,并将上清液对PBS进行透析。由于透析而增加的体积可通过用Centri Prep(Amicon)浓缩而补偿,并制得除去抗体的雏鸡血清。将其以3%的浓度加入AIM-V无血清的培养基(Invitrogen)中。将细胞以106个细胞/ml的浓度加入其中,培养2天,除去培养物上清液,并进行ELISA。
结果:
对大约5×107个在含有1.25ng/ml制滴菌素A的培养基中生长6周的DT40细胞,利用共价结合山羊IgG的磁珠进行选择,并且选择结合山羊IgG的细胞。将结合磁珠的细胞吸入96孔板并进行培养。研究来源于随后出现克隆的细胞的抗体结合。当通过FACS分析9个克隆与FITC标记的山羊IgG的结合时,观察到1个克隆的强荧光,表明这些细胞与山羊IgG之间的结合(图5(a))。然后,为了研究这种结合是否是特异的,用FITC-标记的链霉抗生物素和卵白蛋白进行相似的实验。对于链霉抗生物素-FITC和卵白蛋白-FITC,都没有观察到荧光强度的增加,表明细胞与山羊IgG之间的结合是特异的(图5(b))可认为上述结果表明在通过制滴菌素A处理而变化的细胞表面上的IgM中,产生了一些IgM与山羊IgG特异结合,而这些是用抗原磁珠选择出来的。
然后为了研究是否可能选择细胞生产针对除山羊IgG外的抗原的抗体,利用人IgG磁珠进行选择。在此,为了获得阳性克隆候选物,进行ELISA。在利用以人IgG涂覆的免疫平板,在96孔平板中用100μl的细胞培养物上清液的分析中,对于来源于14个孔的培养物上清液观察到明显强烈的光吸收。然后,培养这些孔内的细胞,用人IgG-FITC染色,并通过FACS分析。代表性实施例的结果显示在图6(a)中。对于所有这些,发现荧光强度的增强在最低处为几倍,而在最高处为几百倍。此外,观察到显示单个峰的克隆,例如克隆20,但是也观察到显示多个峰或宽分布的其他克隆,例如克隆7或克隆8。当通过有限的稀释克隆具有多个峰和宽峰的这些细胞群,获得显示独特的单个峰的克隆(数据未显示)。由此,可认为显示例如克隆7和克隆8模式的克隆是由于多个阳性克隆存在于96孔板的相同孔中。
然后研究克隆7、8和20的抗原特异性(图6,(b))。用人IgG-FITC、兔IgG-FITC、山羊IgG-FITC、链霉抗生物素-FITC和卵白蛋白-FITC进行染色,并通过FACS进行分析。关于克隆7和克隆8,观察到针对人IgG的明显特异性。另一方面,对于克隆20,观察到与山羊IgG的轻微结合,并且很明显在其他种属中发生与同系物的交叉反应。没有观察到任何克隆与兔IgG、链霉抗生物素或卵白蛋白结合。
进一步的关于克隆7和克隆20,利用培养物的上清液进行ELISA(图6(c))。当使用以人IgG、兔IgG、山羊IgG、链霉抗生物素、卵白蛋白涂覆的免疫平板,克隆7和克隆8显示与人IgG反应,并且检测到显著的信号,克隆7高达50倍的稀释度,而克隆20高达500倍的稀释度。此外,在FACS分析下观察到克隆20与山羊IgG的轻微反应(图6(b)),虽然也在ELISA中观察到与山羊IgG的弱反应,而该结果与FACS分析是一致的。未进行选择的细胞的培养物上清液不显示与任何抗原的特别反应。
工业实用性
根据本发明所述的用于促进体细胞重组的方法,可在控制的条件下诱导并促进所需的体细胞同源重组,由此可利用其,例如用于生产蛋白质因子。
此外,根据本发明所述的抗体生产方法,可利用培养的细胞人工生产多样化的抗体。
进一步的,通过利用所产生的用于生产有效治疗特定疾病的抗体(例如,人抗体、人化抗体等)的免疫细胞的细胞系(美国专利A120020028488),可通过使用培养的细胞系统便利且持续地保证显示更大治疗效果的多样化抗体。
                        序列表
<110>RIKEN
    Japan Science and Technology Corporation,JST
<120>通过增强同源重组的特异抗体的体外产生
<130>PC4009RIK
<150>JP2002-221232
<151>2002-07-30
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于PCR扩增的消化的核苷酸
<400>1
atcttgcctt cctcatggc                                                 19
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于PCR扩增的消化的核苷酸
<400>2
gtttgggtga acgtggttc                                                 19
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>Gallus gallus
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>
<400>3
cacacctcag gtactcgttg cg                                             22
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>Gallus gallus
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(21)
<223>
<400>4
tcagcgactc acctaggacg g                                              21
1
2

Claims (11)

1.一种用于增强体细胞重组的方法,其特征在于通过松弛所述体细胞中染色体的染色质结构来促进在基因座发生DNA同源重组的体细胞的同源重组。
2.一种生产抗体的方法,其特征在于当从在抗体基因座发生DNA同源重组的免疫细胞生产抗体时,通过松弛所述免疫细胞中染色体的染色质结构来增强DNA在抗体基因座的同源重组,并由此获得多样化的抗体。
3.权利要求1或2所述的方法,其特征在于染色体的染色质结构的松弛是通过将细胞与组蛋白脱乙酰化酶抑制剂接触来处理细胞而诱导的。
4.权利要求3所述的方法,其特征在于所述抑制剂是制滴菌素A。
5.权利要求4所述的方法,其特征在于制滴菌素A的处理浓度是大约0.5ng/ml-大约5.0ng/ml,以及接触处理的时间是大约2周-大约6周。
6.权利要求1-5所述的方法,其特征在于所述细胞是DT40培养细胞。
7.已经通过权利要求1,3,4,5或6中任一项所述的方法促进在基因座的体细胞同源重组的免疫细胞。
8.通过权利要求2-6中任一项所述的方法生产的多样化抗体。
9.权利要求8所述的抗体,其中所产生的抗体是IgM。
10.一种医药试剂,其是用于促进在基因座的体细胞同源重组,并包括组蛋白脱乙酰化酶抑制剂的医药试剂。
11.权利要求10所述的医药试剂,其中所述抑制剂是制滴菌素A。
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