CN115109799A - 一种小分子肽的融合质粒及其在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小分子肽的融合质粒及其在抗肿瘤药物中的应用，主要涉及生物工程领域。制备方法为对GFP利用限制性内切酶消化获得线性化载体；基于PCSK9第593‑618位的氨基酸使用PCR扩增获得目的基因片段；以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化并获得重组产物；提纯得高纯度质粒。本发明的有益效果在于：它能够和PCSK9竞争发生棕榈酰化修饰并且恢复PTEN的表达。

Description

一种小分子肽的融合质粒及其在抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体是一种小分子肽的融合质粒及其在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
枯草溶菌素转化酶9(Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9，PCSK9)是Kexin样前转化酶枯草杆菌蛋白酶家族的第9个成员，在调节胆固醇代谢方面发挥重要功能。近年来科学家还发现PCSK9在某些肿瘤中表达水平升高并促进肿瘤进展，例如PCSK9可促进神经胶质瘤、肺腺癌和黑色素瘤的癌细胞增殖。在这里我们发现PCSK9在肝癌中表达水平升高并导致患者生存期缩短，这说明PCSK9与肝癌的进展密切相关。
通过测定肝癌细胞系SKHep1对九种药物的半数致死浓度(IC50)发现沉默PCSK9表达显著改善肝癌细胞对肝癌化疗一线药物——索拉菲尼的敏感性。PCSK9表达在耐索拉菲尼的肝癌细胞SKHep1-SR中升高，在SKHep1-SR中分别沉默和过表达PCSK9后，通过其对索拉菲尼IC50的变化，显示PCSK9增强了SKHep1-SR对索拉菲尼的抗性。细胞增殖实验、平板克隆以及细胞凋亡流式检测也都说明降低PCSK9的表达可改善SKHep1-SR对索拉菲尼的敏感性。在小鼠皮下瘤模型中同样印证了索拉菲尼显著抑制了低PCSK9水平小鼠的肝癌进展。综上所述，PCSK9促进了肝癌的进展并导致肝癌细胞对索拉菲尼不敏感。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小分子肽的融合质粒及其在抗肿瘤药物中的应用，它能够和PCSK9竞争发生棕榈酰化修饰并且恢复PTEN的表达。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种小分子肽的融合质粒，通过以下方法获得：
对GFP利用限制性内切酶消化获得线性化载体；
基于PCSK9第593-618位的氨基酸使用PCR扩增获得目的基因片段；
以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化并获得重组产物；
提纯得高纯度质粒。
所述PCR扩增的引物序列为：
ACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG。
所述PCR扩增引物在其5’端添加同源重组序列，使用该引物扩增目的基因片段，扩增产物5’和3’最末端的序列分别不线性化克隆载体两末端序列完全一致。
所述重组反应的反应条件为，在冰水浴中建立反映体系，采用吹打混匀，离心后，在37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。
上述融合质粒在制备抗肺癌药物中的应用作为本发明的另一个方面。
对比现有技术，本发明的有益效果在于：
本申请设计了一种小分子肽GFP-PCSK9-PALM-1去竞争PCSK9的棕榈酰化。具体设计为将PCSK9第593-618位的氨基酸融合进入GFP蛋白中然后将融合的质粒转染进入肝癌细胞中检测效果，结果证明PALM-1可以和PCSK9竞争发生棕榈酰化修饰并且恢复PTEN的表达。
附图说明
图1是本发明实施例1小分子肽PCSK9-PALM-1制备流程图。
图2是本发明实施例1的载体图谱。
图3是本发明实施例1PCR扩增产物的电泳图(Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp)。
图4是本发明实施例1PCR鉴定结果的电泳图。
图5是本发明实施例1获得的两种融合质粒。
图6是实施例2中在肝癌细胞中转染EV、GFP-PCSK9-PALM-1和GFP-PCSK9-PALM-2质粒后通过化学点击法(Click-iTpulldown)检测PCSK9和GFP的棕榈酰化水平，并通过免疫印迹分析检测PTEN的表达水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1：设计小分子肽(PCSK9-PALM-1)的融合质粒及鉴定
主要过程包括：利用限制性内切酶消化获得线性化载体。PCR扩增制备目的基因片段。所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源重组序列(图中以绿色和蓝色标记)，使用该引物扩增目的基因片段，扩增产物5’和3’最末端的序列分别不线性化克隆载体两末端序列完全一致。以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化。重组产物直接进行转化，挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养、抽提，获得高纯度质粒，用于后续实验。
一、过表达载体构建
1、目的基因及工具载体信息
1.1目的基因：
基因名称：其他(EGFP+PCSK9)
1.2工具载体：
载体名称：GV219(pcDNA3.1)
元件顺序：CMV-MCS-SV40-Neomycin
克隆位点：XhoI/KpnI
对照编号：CON085
2、载体酶切
根据如下列表，配制50μl酶切体系。按列表顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃1反应3h或过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。
Figure BDA0003764980270000031
1大部分限制性内切酶的最适反应温度为37℃，但也有一些不是37℃，例如Apa I为25℃，Bsl I为75℃。根据所需限制性内切酶确定相应的反应温度。
2限制性内切酶在选定的Buffer下应该具有不低于50％的反应活性。各种限制性内切酶在不同Buffer下的具体活性请参考其说明书。
3、目的基因片段的获取
3.1引物
ID seq
其他(76553-1)-p1 ACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG
其他(76553-1)-p2 TTAAACTTAAGCTTGGTACCTTAAGGGGCCGGGATTCCATGCTC
引物说明：含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因。
3.2PCR扩增目的基因片段
配制如下反应体系，轻轻吹打混匀，短暂离心，置于PCR仪中进行反应。
反应体系：
Figure BDA0003764980270000032
上述模板来源为质粒或者菌液。质粒模板用量一般小于200ng，菌液模板用量一般为1μL，最佳用量参考PrmeSTAR HS DNA polymerase说明书。
反应条件按时间顺序如下为：
Figure BDA0003764980270000033
Figure BDA0003764980270000041
3.3PCR扩增结果
PCR产物大小：845，其电泳图如图3所示。
4、PCR产物与载体进行交换
于冰水浴中配制如下反应体系。用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避免产生气泡。于37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。
反应体系：
阳性对照(μL) 自连对照(μL) 实验组(μL)
ddH<sub>2</sub>O 2.5 4.5 3.5
5×CE Ⅱ Buffer 2 2 2
酶切后的载体DNA 2.5 2.5 2.5
纯化后的PCR产物片段 2 0 1
Exnase<sup>TM</sup>II 1 1 1
Total 10 10 10
说明：
加入线性化载体DNA和纯化的PCR产物最适摩尔比为1：2；
阳性对照加入的纯化的PCR产物为GAPDH基因(带有同样的交换臂)
5、转化
将10μL交换反应产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μL LB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。
6、菌落PCR鉴定
6.1PCR鉴定引物
ID seq
KL76553-p3 CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
KL76553-p4 TTATTAGGAAAGGACAGTGGG
6.2PCR鉴定
配制如下反应体系，震荡混匀，短暂离心。在超净工作台中，用无菌的枪头挑取单个菌落至20μL鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应。
鉴定反应体系：
Figure BDA0003764980270000042
Figure BDA0003764980270000051
PCR反应条件
Figure BDA0003764980270000052
6.3鉴定结果
阳性转化子PCR产物大小：1151
阴性转化子PCR产物大小：353
详见电泳图图4，图中说明如下：
1#：阴性对照(ddH2O)
2#：阴性对照(空载自连对照组)
3#：阳性对照(GAPDH)
4#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp
5-12#:1-8号转化子
7、测序
将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序。对测序结果不目的基因序列进行比对分析。比对结果如下：
7.1阳性克隆测序结果及结果分析：
比对结果：
CTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGAGGCCAGCATCCACGCTTCCTGCTGCCATGCCCCAGGTCTGGAATGCAAAGTCAAGGAGCATGGAATCCCGGCCCCTTAAGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCG
比对结果说明：测通ok
二、质粒抽提
将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的质粒进入下游流程。详细操作步骤如下：
1.收集过夜培养的菌液于标记好的5ml离心管，12000rpm，离心2min收菌；
2.弃上清，加入250μl细胞重悬液，充分振荡，使菌块悬浮均匀；
3.加入250μl细胞裂解液，再加入10μl蛋白酶K，上下颠倒5-6次，轻轻混匀；静置1-2min，致使菌体裂解澄清；
4.加入350μl中和液，上下颠倒混匀，使蛋白完全析出，冰浴静置5min；
5. 10000rpm离心10min，弃蛋白，收集上清于另一干净无菌的1.5ml EP管；
6. 12000rpm离心5min，同时准备标记好的回收柱，将上清转移至回收柱中，12000rpm离心1min，弃下层废液；
7.加入600μl预先配置好的漂洗液，12000rpm离心1min，弃下层废液，重复一次，12000rpm空离2min，进一步除去残留的漂洗液；
8.在超净台中将回收柱转移至新的1.5ml EP管中，静置10-20min，自然晾干；
9.往回收柱中加入95μl Nuclease-Free Water，静置2min，12000rpm离心2min，收集样品做好编号，电泳、测定浓度，进行质检。
实施例2：对实施例1中融合的质粒转染入肝癌细胞进行检测
由于PCSK9在棕榈酰化修饰后可增强其与PTEN的结合，诱导PTEN进入溶酶体降解进而导致肝癌对索拉菲尼产生抵抗，而且目前靶向PCSK9的抑制剂和单克隆抗体无法阻断PCSK9棕榈酰化。基于此我方设计一种小分子肽(GFP-PCSK9-PALM-1)去竞争PCSK9的棕榈酰化。具体设计为将PCSK9第593-618位的氨基酸融合进入GFP蛋白中，然后将融合的质粒转染进入肝癌细胞中检测效果如下。
结果证明PALM-1可以和PCSK9竞争发生棕榈酰化修饰并且恢复PTEN的表达，而突变的PALM-2则无生物学功能。
在图5中，构建绿色荧光蛋白(GFP)和PCSK9第593-618位氨基酸的融合质粒，分为GFP-PCSK9-PALM-1(野生型)和GFP-PCSK9-PALM-2(突变型)两种。
在图6中，在肝癌细胞中转染EV、GFP-PCSK9-PALM-1和GFP-PCSK9-PALM-2质粒后通过化学点击法(Click-iTpulldown)检测PCSK9和GFP的棕榈酰化水平，并通过免疫印迹分析检测PTEN的表达水平。PALM-1可以和PCSK9竞争发生棕榈酰化修饰并且恢复PTEN的表达，而突变的PALM-2则无生物学功能。
所涉及的化学点击法(Click-iT pull down)如下：
1.将肝癌细胞和100uM的Click-iT palmitic acid-azide(棕榈酸叠氮化物)孵育6小时。
2.然后将肝癌细胞裂解以提取蛋白质。
3.用Click-iT蛋白反应缓冲液试剂盒催化蛋白样品与Biotin-Alkyne(生物素-炔烃)反应。
4.用链霉亲和素珠富集沉淀生物素炔烃-叠氮化物-棕榈酸-蛋白复合物，进行免疫印迹分析。
所涉及的免疫印迹分析(Western Blotting)如下：
1.提取细胞蛋白：弃培养基用PBS清洗3次；将含有1％蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液加入后用细胞刮将细胞刮下来并转移至1.5ml离心管中；超声裂解15秒后12000rpm 4℃高速离心15min；收集上清并用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；向上清液中加入1/4体积的5×蛋白上样缓冲液，然后95℃煮沸10min使蛋白变性。
2.制备SDS-PAGE凝胶：按照雅酶试剂盒说明书配制分离胶和浓缩胶。
3.电泳：向SDS-PAGE凝胶不同泳道中加入蛋白样品进行电泳。蛋白在浓缩胶中电压调为80V，蛋白进入分离胶后电压调为120V。
4.转膜：根据目的蛋白分子量在转膜液中切取胶条并将胶条放在转膜夹的黑面，排尽中间气泡；将甲醇活化的PVDF膜盖在胶条上，排尽中间气泡；将转膜夹夹好(类似一个三明治结构)放入转膜槽中进行转膜。转膜电流为300mA，转膜时间视蛋白分子量而定。
5.封闭：在转膜结束后，将条带放入封闭液(5％脱脂奶粉+95％TBST缓冲液)中在室温摇床上缓慢摇晃1小时。
6.孵育一抗：封闭结束后，TBST清洗条带3次；将条带浸泡在配好的一抗中4℃过夜。
7.孵育二抗：一抗孵育结束后，TBST清洗条带3次，每次10min；加入配好的二抗(50ml封闭液+10ul二抗)在室温摇床上孵育1小时。
8.曝光：二抗孵育结束后，TBST清洗条带3次，每次10min；配制ECL超敏发光液，在Image lab凝胶成像系统曝光观察结果。
使用ENCORI(The Encyclopedia of RNA Interactomes)数据库分析PCSK9在肝癌组织和正常组织中的表达差异；使用GEPIA(Gene Expression Profiling InteractiveAnalysis)数据库和The Human Protein Atlas数据库分析不同PCSK9表达水平的肝癌患者的生存时间。

Claims (5)

1.一种小分子肽的融合质粒，其特征在于，通过以下方法获得：
对GFP利用限制性内切酶消化获得线性化载体；
基于PCSK9第593-618位的氨基酸使用PCR扩增获得目的基因片段；
以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化并获得重组产物；
提纯得高纯度质粒。
2.根据权利要求1所述一种小分子肽的融合质粒，其特征在于，所述PCR扩增的引物序列为：ACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG。
3.根据权利要求1所述一种小分子肽的融合质粒，其特征在于，所述PCR扩增引物在其5’端添加同源重组序列，使用该引物扩增目的基因片段，扩增产物5’和3’最末端的序列分别不线性化克隆载体两末端序列完全一致。
4.根据权利要求1所述一种小分子肽的融合质粒，其特征在于，所述重组反应的反应条件为，在冰水浴中建立反映体系，采用吹打混匀，离心后，在37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。
5.权利要求1所述的融合质粒在制备抗肺癌药物中的应用。
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