CN101475644A - 具有抗炎作用的新型靶向融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗炎作用的靶向融合蛋白－抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv－Crry及其应用。其目的是提供一种具有特异靶向性的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv－Crry及其在制备治疗机体炎症反应的药物中的应用。抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv－Crry是通过连接肽在抗P选择素单链抗体ScFv的氨基端连接补体抑制物Crry(1－319aa)得到的融合蛋白。实验证明，ScFv－Crry能显著提高抑制补体介导的细胞裂解效，并可在免疫损害部位高度聚集，能够明显抑制炎症的发生发展。因而其可制备成针对治疗炎症反应的靶向P选择素补体抑制物新型基因工程靶向蛋白药物。本发明将在医药学领域发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

具有抗炎作用的新型靶向融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因产品领域，特别是涉及一种具有特异靶向性的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry及其在制备治疗机体炎症反应的药物中的应用。

背景技术

炎症是人类疾病中最常见而复杂的病例过程，可以发生于机体的任何部位和任何组织。炎症反应是多种疾病如肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病及创伤后共同的重要的病理过程。从局部的病理变化看来，它们都有很多共同点，即都是机体对致炎因子的损伤作用所产生的一种过激反应。目前，大量的资料表明炎症的发生与P选择素的高表达和补体的激活密切相关。

炎症反应始于炎症细胞黏附、迁移、浸润、活化以及炎症因子释放，白细胞与内皮细胞的粘附是炎症的起始步骤，这一过程是由炎症细胞和血管内皮细胞表面的细胞粘附分子所介导。粘附分子是由细胞合成的一种复合膜蛋白，存在于细胞膜或细胞外，在炎症过程中对白细胞和内皮细胞间相互作用起着关键的作用。P选择素(P-selectinectin，Ps)又称(GMP-140)，是一种分子量为140kD的I型膜糖蛋白，主要分布于静息血小板的α颗粒和内皮细胞的Weibel palade小体中。P选择素作为血小板/内皮细胞活化的标志和黏附受体，介导白细胞与活化内皮细胞等最初黏附，是启动炎症反应并维持炎症状态的重要成分。当受炎性介质刺激后，P选择素快速转位到细胞表面进行表达，与中性粒细胞、单核细胞上的抗原结合，介导白细胞在内皮上黏附、滚动、聚集及活化并释放炎症递质，参与炎症反应。P选择素参与了肿瘤、心血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病以及与年龄相关的疾病(如关节炎、早老性痴呆病、骨质疏松症等)等多种病理生理过程，其过度或持续表达已成为某些组织病变的标志。正常情况下P选择素不表达或低表达，受到炎症、损伤等因素刺激后可显著表达，且原先不表达的组织也出现表达。已有研究表明抗P选择素抗体、纯化游离P选择素、抗sLe^X可抑制活化的血小板和单核细胞及中性粒细胞的连接，从而抑制炎症反应产生。因此，抑制P选择素表达及其细胞黏附作用可为疾病的诊断和治疗提供了新的策略。

补体既是生理性防御物质，又是造成病理性损伤的介质。补体系统能促进吞噬和溶解靶细胞，是机体免疫防御机制的重要组成部分，对消除外来抗原的侵害，维护机体内环境的平衡具有重要作用，但另一方面，在一些非免疫性因素的刺激下，补体系统活化又可产生炎症反应，并影响凝血及纤溶系统，导致机体正常组织细胞损伤。补体激活过程中产生不同的蛋白水解片段，从而介导各种生物学效应调节作用、引起炎症反应。另外，补体在细胞表面激活，由C5b-9组成MAC。MAC为大分子复合物，它形成跨膜孑L道，使大分子物质和离子双向流动，导致细胞溶解；MAC还能促进释放细胞因子、氧自由基和金属基质蛋白，加剧炎性反应。目前已证明，在肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病以及与年龄相关的如关节炎、早老性痴呆病、骨质疏松症等多种的疾病的炎症反应均与补体的激活有关。

Crry是一种膜结合的补体调节蛋白。它是一个单链蛋白，有6或7个SCR，分子量63—74kD。在经典途径和旁路途径上通过限制C3/C5转化酶的活性来阻断补体激活。它是一种理想的补体抑制剂，可协同DAF及H因子加速C3转化酶解离及C3b、C4b的裂解。Crry存在于细血管壁、上皮细胞和内皮细胞的细胞膜或胞质内，在C3水平阻断补体级联反应而调节补体活化。有实验表明，在小鼠体内红细胞免受自发性补体攻击的作用中，Crry是必不可少的。Li B等(Lihua Bao，Hanns M，Boackle AS，et al.Ttanagenic expression of a soluble complement inhibitor protects against renaldisease and promotes survival in MRL/1pr mice[J].journal of immunology.168(2)：3601-3607，2002.)的研究证明，在自发性狼疮性疾病的67只MRL/1Pr小鼠模型中没有整合Crry基因的小鼠的肾损伤比例为42.5％，而87只整合有Crry转基因小鼠的为16.4％，这说明了整合有Crry转基因的MRL/1Pr小鼠比没有转基因的小鼠在肾部组织有更好的补体抑制作用，减轻了小鼠的肾损伤。并且由于可溶性蛋白Crry在小鼠体内大量表达，有效地延长了MRL/1Pr小鼠的存活时间。另一方面，Crry表达减少，对补体的抑制作用减弱，导致了补体过度激活，造成病理性损害。大量的资料表明，增加体内Crry的表达量则可抑制补体过度激活所致的损害，而阻断Crry表达则会加重炎症的发生发展。因此，Crry作为补体抑制剂可以减轻炎症反应所致的病理学改变，作为潜在的抗炎因子具有自身免疫和炎症性疾病的治疗作用。

应用补体抑制剂抑制补体过度激活，能减轻机体造成的免疫损伤，从而应用于某些疾病的治疗。目前，多种补体抑制物正在研制中，如美国已有CR1和C5a的单克隆抗体进入二、三期临床。另外，抗MBLmAb，抗C5mAb和抗C9mAb、眼镜蛇毒因子、N-乙酰肝素、蛋白抑制剂FUT-175等也有一定的抗补体作用。但这类系统性补体抑制物虽然改善了炎症反应，由于补体系统是机体免疫防御机制的重要组成部分，同时全身性的补体抑制，也会造成感染等潜在的副作用。因此，具有靶向特异性补体抑制剂的研究越来越广泛和深人。靶向补体抑制疗法的特点是将补体抑制物特异性导向补体活化位点和病理损伤部位，提高作用特异性，从而减少可能导致严重系统性补体抑制的副作用。

发明内容

本发明提供了一种具有抗炎作用的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry。

本发明所提供的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry，是通过连接肽在抗P选择素单链抗体ScFv的羧基端(C端)连接补体抑制物Crry得到的融合蛋白。

具体来讲，所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有抗炎作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1由569个氨基酸残基组成，自氨基端第251-569位氨基酸残基为补体抑制物Crry，自氨基端第241-250位氨基酸残基为连接肽(Gly₄Ser)₂，自氨基端第1-240位氨基酸残基为抗P选择素单链抗体ScFv，其中，自氨基端第1-122位氨基酸残基为抗P选择素单链抗体ScFv的重链可变区，自氨基端第133-240位氨基酸残基为抗P选择素单链抗体ScFv的轻链可变区。

编码上述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抗炎作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：2由1710个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1710位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第751-1710位碱基编码补体抑制物Crry，自5’端第721-750位碱基编码连接肽(Gly₄Ser)₂，自5’端第1-720位碱基编码抗P选择素单链抗体ScFv，其中，自5’端第1-336位碱基编码抗P选择素单链抗体ScFv的重链可变区，自5’端第397-720位碱基编码抗P选择素单链抗体ScFv的轻链可变区。

含有本发明抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了用于表达上述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的重组表达载体。

本发明所提供的用于表达上述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的重组表达载体，是含有抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry基因的重组表达载体。

所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry基因可插入到重组表达载体中。构建所述重组表达载体的出发载体，可为任意一种指本领域熟知的可进行外源基因表达的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒(如腺病毒、逆转录病毒或其它载体)。总之，只要能在宿主体内复制和稳定表达，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

所述原核表达载体可为pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a等；所述真核表达载体可为pEE14.1、pCMV5、pSilencel.0-U6(Ambion，Austin，TX，USA)、pcDNA、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo(购于Promega公司)、pTEF1、pPICZd、pAM82或pAAh5等。

其中，以pEE14.1为出发载体，构建的含有所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry基因的重组表达载体为pEE14.1/ScFv-Crry。

可采用本领域技术人员熟知的方法构建含有所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-CD59基因的重组表达载体，如体外重组DNA技术，DNA合成技术和体内重组技术等(Sambrook，et al Molecular cloing，a Laboratory Manual.Cold springharbor laboratory.New York，1989)。所述抗P选择素单链抗体基因的DNA序列可以有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。所述启动子可为：大肠杆菌的lac或trp启动子、噬菌体启动子、反转录病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。所述表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，所述表达载体还可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型形状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因以及绿色荧光蛋白(GFP)基因或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因等。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的方法。

本发明所提供的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的表达方法，是将所述用于表达抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry。

所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；低等真核细胞，如酵母细胞；高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真核细胞如酵母、植物细胞；果蝇S2或Sf9等昆虫细胞；CHO、COS、293细胞或Bowes黑色素瘤细胞等动物细胞。所述宿主细胞优选为CHO细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列，将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，长度通常为10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。如在复制起始点晚期一侧的长度约为100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子或腺病毒增强子等。

可用本领域技术人员熟知的常规技术，将重组DNA转化宿主细胞，培养转化子，诱导表达目的蛋白，并对重组蛋白进分离纯化。

培养含有本发明抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

本发明还提供了一种治疗机体炎症反应的药物。

本发明所提供的治疗机体炎症反应的药物，它的活性成分为上述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry或其编码基因。

所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry基因可存在于真核表达载体中。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、吸收促进剂或吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为200μg抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry/kg体重，每隔1天给药一次，疗程为14天；上述药物的用量一般为200μg抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry基因/kg体重，每隔1天给药一次，疗程为14天。剂量和疗程均可根据实际情况进行调整。

本发明提供了一种抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry。该融合蛋白是以P选择素作为“靶标”，抗P选择素单链抗体ScFv作为“载体”，补体抑制物Crry作为“弹头”的针对治疗炎症反应的靶向P选择素补体抑制物。ScFv-Crry不仅对炎症部位有靶向作用，还可对与炎症有关的两条激活途径(P选择素和补体)进行抑制，不仅可达到治疗炎症的目的，同时降低用药剂量，降低副作用。实验证明，ScFv-Crry能显著提高抑制补体介导的细胞裂解效，并可在免疫损害部位高度聚集，能够明显抑制炎症的发生发展，而且显著降低补体抑制物造成感染的副作用。因而可以其为活性成分制备成针对治疗炎症反应的靶向P选择素补体抑制物新型基因工程靶向蛋白药物。本发明将在医药学领域发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为轻链和重链可变区基因扩增产物的1.2％琼脂糖电泳检测结果

图2为抗P选择素单链抗体基因扩增产物的1.2％琼脂糖电泳检测结果

图3为Crry基因扩增产物的1.2％琼脂糖电泳检测结果

图4为ScFv-Crry基因扩增产物的1.2％琼脂糖电泳检测结果

图5为抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的10％ SDS-PAGE检测结果

图6为抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的Western Blot鉴定结果

图7为补体介导的CHO细胞和红细胞溶解实验结果

图8为SPR检测结果

图9为生物学分布实验结果

图10为动物实验结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的获得及其真核表达载体的构建

一、抗P选择素单链抗体的获得

用下述方法筛选抗P选择素单链抗体，具体方法包括以下步骤：

1、细胞培养及鉴定：将分泌P选择素抗体的杂交瘤细胞(参照杂交瘤细胞和单克隆抗体实验技术，许廷贵，1982.中的方法构建)(培养于含15％牛血清的完全RPMI1640培养基中。培养箱含5％CO₂的混合气体，湿度为98％。用ELISA方法鉴定培养上清中单抗的特异性和滴度，结果抗体滴度达到1∶3200，且有明显的种特异性。

2、mRNA的分离与纯化：用快速制备、纯化mRNA试剂盒(Promega)并参照试剂盒说明书从大约2×10⁷个杂交瘤细胞中提取总RNA，并纯化mRNA，具体方法为：收集约2×10⁷个细胞杂交瘤细胞，加入175μl裂解液裂解细胞，25℃ 13,000g离心10min，收集上清，加入200μl 95％乙醇，转移到吸附柱中，13,000g离心1min，吸附RNA，加入600μl RNA漂洗液，13,000g离心1min，加50μl DNase I，25℃孵育15min消化DNA，再加入200μl Dnase终止液，13,000g离心1min，600μl RNA漂洗液漂洗一次，250μl RNA漂洗液漂洗一次，100μl Nuclease-Free H20洗脱总RNA.取1.0mg总RNA，加入RNase-Free Water至150μl，65℃孵育10min，加入3μlBiotinylated-Oligo(dT)Probe和13μl 20×SSC，冷却至室温，然后将RNA加入到SA-PMPs中，室温孵育10min，用磁铁吸附SA-PMPs，弃上清，用300μl 0.1×SSC漂洗4次，最后用100μl RNase-Free Water洗脱收集mRNA。

3、cDNA制备：以纯化的mRNA为模板，反转录合成cDNA，具体方法为：2μg mRNA，Random Primers 0.5mg/ml 2μl，加无核酸酶的水终体积为15μl，70℃加热8分钟，在冰上冷却5min，短暂离心至管底部，加入5×Buffer 5μl， RibonucleaseInhibitor 40u，37℃ 5min，再加入Sodium Pyrophosphate，40mM 2.5μl，AMV ReverseTranscriptase 30u，补加无核酸酶的水至总体积25μl，温和混匀，37℃ 60min，反应结束后取出20μl作为模板，加入Second Strand 2.5×Buffer 40μl，Acetylated BSA，1mg/ml 5μl，DNA Polymerase I 23u，RNase H0.8u，无核酸酶的水终体积为100μl，14℃孵育2小时，加入10μl 200mM EDTA终止反应，即得到cDNA。

4、抗体可变区基因的扩增：用PCR方法，以反转录合成的cDNA为模板，在PCR反应体系中分别加入一套抗P选择素单链抗体的轻链可变区(V_L)引物(引物序列为GACATCCAGATGACCCAGTCT和CCGTTTTATTTCCAACTTTGT)或重链可变区(V_H)引物(引物序列为GTGCAGCTGCAGGAGTCT和TCCTGAGGAGACGGTGACCGT)(Pharmacia)，10×PCR缓冲液5μl，dNTP终浓度为2.5mM，混匀后经100℃变性5min，加入2单位Taq DNA聚合酶。总反应体积为50μl。混匀后加矿物油。进行30个循环反应，每个循环条件是：94℃变性30s。55℃退火90s，72℃延伸90s，反应进行到最后一个循环后在72℃保温10min。反应结束后，分别从轻链和重链可变区基因扩增产物中取出3μl进行1.2％的琼脂糖电泳检测，检测结果如图1所示，经PCR扩增获得了324bp的轻链可变区基因和366bp的重链可变区基因，与预期结果相符，其余的用Sephagels^TMmBandprep Kit(Pharmacia)回收纯化。

5、单链抗体基因的连接：将回收的轻链和重链可变区基因与连接引物(引物序列为ACCGTCTCCTCAGGAGGCGGTGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCTCT和GGTCATCTGGATGTCAGAGCCGCCGCCACCCGAGCCGCCTC CGCC，编码(Gly₄Ser)₂的DNA序列)在等摩尔浓度的条件下，加入2.5mM的dNTP和3个单位的Taq DNA聚合酶，10×PCR缓冲液5μl，反应体积为50μl。用液体石蜡油封闭后进行7个退火循环，每个循环的反应条件为94℃变性30s，64℃退火4min。

6、单链抗体基因的扩增：以单链抗体基因为模板，在上述反应体系中，加入一对5’端含有Sfi 1，3’端含有Not1酶切位点的引物(引物序列为TCAGGCCATTATGGCCATGGTGCAGCTGCAGGAG和TCAGCGGCCGCTAACCGTTTTATTTCAAC)，进行30次PCR循环，每个循环条件为94℃变性1min，55℃退火2min，72℃延伸2min，反应进行到最后一个循环后在72℃保温10min。反应结束后从PCR扩增产物中取出3μl 1.2％的琼脂糖电泳检测，检测结果如图2所示，经PCR扩增获得了720bp的单链抗体基因，与预期结果相符，其余的用SephagelsTM Bandprep Kit回收纯化。

7、单链抗体文库的构建及表达：将表达载体pCANTAB5E(Pharmacia)和回收后的单链抗体基因分别经Sfi 1和Not1双酶切，在T4连接酶的作用下，将pCANTAB5E表达载体和单链抗体基因16℃连接过夜。将重组质粒转化大肠杆菌TG1感受态细胞，并把转化的细胞涂布在含100μg/mL氨苄青霉素LB培养板上，于37℃培养过夜。把生长在平板上的转化菌全部收集下来，用2×YTAG(含100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖)稀释细胞悬液至OD₆₀₀＝0.2，37℃培养培养至对数生长期(约OD₆₀₀＝0.4)，加入2×10⁹pfuM13K07辅助噬菌体，37℃培养1小时，离心。用10mL2×YTAK(含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的2×YT)重悬沉淀细胞，37℃振荡培养过夜，离心后收集含有重组噬菌体的上清，即为单链抗体噬菌体表达文库。

8、重组噬菌体抗体的筛选：用P选择素抗原(购自上海史瑞克生物科技有限公司)包被聚乙烯培养皿，将含有重组噬菌体的上清与该培养皿中37℃孵育2小时。用PBS洗平皿20次，再用PBST(含0.05％ Tween 20的PBS)洗平皿20次，弃PBST。加入10mL处于对数生长期TG1细胞，37℃培养1小时。离心，收集上清，进行下一轮筛选。重复“吸附-洗脱-繁殖”的筛选过程2次。再以M13K07辅助噬菌体(购自Pharmacia)超感染，就可以生成富集克隆的噬菌体表面呈现文库。

9、单克隆重组噬菌体的筛选与鉴定：第三轮筛选后，用2×YT将TG1菌液做倍数稀释(原液、1:10、1:100、1:1000)，然后涂布在SOBAG固体培养基(分子克隆，第三版，黄培堂等译)上，30℃培养过夜。从平板上随机挑取94个单菌落，分别接种于100μl 2×YTAG(含100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖)培养液中，30℃培养过夜。取20μl培养液，转接于200μl含5×10⁸pfu/mL M13K07的2×YTAG培养液中，37℃培养2小时。离心，用200μl 2×YTAK(含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的2×YT)重悬沉淀细胞，30℃培养过夜。离心、收集上清，即为单克隆重组噬菌体。

用P选择素抗原包被酶联板，用0.5％BSA作为阴性对照，用羊抗M13噬菌体抗体作为阳性对照。1％BSA的37℃封闭1小时。把100μl重组噬菌体抗体上清和封闭液的等体积混合物加入到酶联板中，对照孔中加入M13噬菌体。37℃孵育1小时，PBST(含0.05％ Tween 20的PBS)洗板3次，PBS洗板3次。每孔加入100μl羊抗M13噬菌体抗体IgG-HRP(1:2000)，37℃孵育1小时。PBST和PBS一次各洗板3次，加入新鲜配制的底物H₂O₂-OPD，室温反应20min，加入50μl 2M H₂SO₄终止反应，在A₄₉₀处检测每孔的光吸收值。光吸收值为阴性对照的2.1倍以上的为阳性克隆，从中挑选出与P选择素结合活性最强的阳性克隆。

10、阳性克隆重组质粒的DNA序列分析：用T7DNA序列TAATACGACTCACTATAGGG测定该阳性重组质粒上抗P选择素单链抗体的DNA序列，结果该基因具有序列表中SEQID NO：3的核苷酸序列，由720个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-720位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：4的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第1-366位碱基编码重链可变区，自5’端第397-720位碱基编码轻链可变区，将该抗体命名为ScFv(亦称V_L-Linker-V_H)。

二、抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的获得

1、Crry基因的克隆：用RNA提取试剂盒(Promega)并参照试剂盒说明书提取小鼠淋巴瘤细胞(协和细胞中心：CCC0235)组织的总RNA，并反转录成cDNA。用PCR方法，以此cDNA为模板，在PCR反应体系中加入Crry(1-319aa)的上、下游引物(引物序列为CTCACATGCTACCACTGT和ACTTTTGTTACACAAGTT)，10×PCR缓冲液5μl，dNTP终浓度为2.5mM，2单位Taq DNA聚合酶，混匀后加矿物油。进行30个循环反应，每个循环条件是：94℃变性30s。55℃退火30s，72℃延伸40s，反应进行到最后一个循环后在72℃保温5min。从扩增产物中取出3μl进行1.2％琼脂糖电泳检测，检测结果如图3所示，经PCR扩增获得了960bp的Crry基因，与预期结果相符，其余的用SephagelsTM Bandprep Kit(Pharmacia)回收纯化。

2、ScFv-Crry基因的扩增：将抗P选择素单链抗体ScFv基因和回收的Crry(1-319aa)基因与连接引物(引物序列为TTGGAAATAAAACGGGGCGGAGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCT和GTGGTAGCATGTGAGAGATCCGCCGCCACCCGACCCACCTCCGCC，编码(Gly4Ser)2的DNA序列)在等摩尔浓度的条件下，加入2.5mM的dNTP和3个单位的Taq DNA聚合酶，10×PCR缓冲液5μl，反应体积为50μl。用液体石蜡油封闭后进行7个退火循环，每个循环的反应条件为94℃变性30s，64℃退火4min。再在上述反应体系中，加入一对5’端含有Hind III，3’端含有Sma I酶切位点的引物(引物序列为TACAAGCTTGTGCAGCTGCAGGAGTCT和TACCCCGGGACTTTTCTTACACAAGTT)，进行30次PCR循环，每个循环条件为94℃变性50s，55℃退火60s，72℃延伸70s，反应进行到最后一个循环后在72℃保温10min。反应结束后从PCR扩增产物中取出3μl进行1.2％的琼脂糖电泳检测，检测结果如图4所示，经PCR扩增获得了1710bp的DNA片段，与预期结果相符，其余的用SephagelsTM Bandprep Kit(Pharmacia)回收纯化。

3、ScFv-Crry真核表达载体的构建：将纯化的目的基因经Hind III和Sma I双酶切，与经同样双酶切的真核表达载体pEE14.1连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到携带抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物—ScFv与Crry融合基因的重组表达载体，命名为pEE14.1/ScFv-Crry。将阳性克隆重组质粒进行DNA测序分析，由1710个碱基组成，自5’端第751-1710位碱基编码补体抑制物Crry，自5’端第721-750位碱基编码连接肽(Gly₄Ser)₂，自5’端第1-720位碱基编码抗P选择素单链抗体ScFv，其中，自5’端第1-336位碱基编码抗P选择素单链抗体ScFv的重链可变区，自5’端第397-720位碱基编码抗P选择素单链抗体ScFv的轻链可变区。将此抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物命名为ScFv-Crry(亦称V_L-Linker-V_H-Linker-Crry)。

实施例2、抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry高效表达细胞株的筛选及抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的纯化

一、抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry高效表达细胞株的筛选

为了得到在分子结构、理化特性和生物学功能方面更接近于天然的高等生物蛋白质分子，利用脂质体将实施例1获得的重组真核表达质粒pEE14.1/ScFv-Crry转染至中国仓鼠卵巢细胞CHO中。转染24小时后，吸去培养基，加入10mL新鲜的选择性培养基DMEM+10％FCS+25μm MSX。在含5％CO₂的混合气体，湿度为98％的37℃培养箱中培养。2周后，出现大约1-2mm的克隆，用克隆环将出现的克隆转接至24孔板中，每孔加入1mL选择性培养基DMEM+10％FCS+25μm MSX继续培养。转化子生长至5天后，吸取上清。将该上清100μl加入到用P选择素抗原包被的酶联板中，37℃孵育1小时，PBS洗板3次。每孔加入100μl HRP标记的二抗抗体IgG(1:2000)，37℃孵育1小时。PBS洗板3次，加入新鲜配制的底物H₂O₂-OPD，室温反应20min，加入50μl 2M H₂SO₄终止反应，在A₄₉₀处检测每孔的光吸收值。光吸收值为阴性对照的2.1倍以上的为阳性克隆，从中挑选出与P选择素结合活性最强的阳性克隆，即为高效表达抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的CHO细胞株。

二、抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的纯化

将高效表达抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-CCrry的CHO细胞株放大培养，收获上清。将上清缓慢加入HiTrap N-hydroxysuccinimide column(AmershamBiosciences)中，纯化单链抗体。用0.01mol/L pH 7.4的PBS洗脱，流速为1mL/min，至洗出液OD₂₈₀<0.02为止。加入0.1mol/L pH 2.4的甘氨酸-HCl缓冲液，流速为1mL/min，收集吸附下来的成分，立即以1mol/L碳酸钠中和，以免蛋白变性。经SDS-PAGE和Western Blot鉴定，结果如图5和图6所示，经表达获得了63KD的目的蛋白，且该蛋白可与Crry和P选择素特异结合，与预期结果相符，表明获得了纯度很高的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry。

实施例3、体内外生物学活性鉴定和动物实验

一、补体裂解抑制实验

为测定对补体的抑制活性，60％～80％融合的CHO细胞用乙二胺四乙酸分开，用DMEM洗2次，然后重悬于DMEM中，使其终浓度为10⁹/L。在细胞悬液中加入100mL/L兔抗CHO细胞膜抗血清，4℃作用30min，使细胞致敏。然后弃抗血清，细胞重悬于用DMEM稀释的NHS中，终体积为50μL或100μL。37℃作用60min，最后用胎盘兰染色排除法测量细胞成活力(活细胞与死细胞均计数)。融合蛋白ScFv-Crry用DEME稀释后先加入到NHS中，再加入至CHO细胞悬液。终浓度以100g/L NHS可导致大约90％抗体致敏的对照CHO细胞溶解为准。补体介导的红细胞溶解抑制实验用抗体致敏的羊红细胞(EAs)进行测定。溶血试验在明胶佛罗那缓冲液(GVB⁺⁺)中进行，终体积为300μL，包含有2.5×10⁷Eas，NHS按照1∶300稀释。反应混合物在37℃孵育60min，最后加入300μL含10mmol/L EDTA-PBS溶液终止反应。离心，取上清，在413nm波长下用光谱成像仪对上清中的血红素进行定量检测。补体介导的CHO细胞和红细胞溶解实验结果如图7所示，靶向补体抑制物ScFv-Crry比相应的非靶向补体抑制物的抑制效果明显。

二、生物传感器亲和力分析

ScFv-Crry融合蛋白与生物素标记的P选择素(P选择素-生物素)相互作用的动力学分析用表面细胞质基因组共振(SPR)检测系统进行检测(BIAcore 3000仪器)。按照每个流动细胞平均50mg/L的量，将P选择素-生物素以2μL/min的速度注射到BIAcore抗生物素蛋白链菌素传感器芯片上，作用20min，缓冲液是0.5×PBS(pH7.4)(含有0.5g/L Tween20)。从捕获的P选择素上获取的SPR信号产生BIAcore反应单位(范围是250到500)。以不加融合蛋白组作为对照。25℃，以25μL/min的流速，用0.5×PBST(0.5g/L Tween20)洗涤后，通过检测ScFv-Crry融合蛋白浓度(500nmol～1μm/L)来评估其亲和力。SPR检测结果如图8显示，融合蛋白ScFv-Crry与P选择素-生物素有较高的结合与解离速，表明了ScFv-Crry与P选择素亲具有较高的亲和力。

三、生物学分布实验

采用Iodogen法将ScFv-Crry融合蛋白标记¹²⁵I，在涂布有200μg Iodogen的EP管中，依次加入现配制的50mmlo/L PBS(pH7.4)150μl、含1mg BSA溶解的ScFv-Crry100μl(100μg)、Na¹²⁵I溶液15μl(185MBq)，室温下间断轻微摇动标记管15min。SEP-PAK C18柱分别用甲醇、双蒸水和0.1％三氟乙酸(TFA)各5ml依次洗涤使其活化；标记混合物上柱，0.1％TFA淋洗；60％的乙腈溶液洗脱，收集前1.5ml洗脱液。经冷冻干燥后，用含1mg/mlBSA的PBS溶液稀释、分装，-80℃冰箱贮存备用。雄性DBA/1J小鼠尾根部皮下注射0.1ml胶原II和完全弗氏佐剂(均购于美国Sigma公司)，第21天加强一次建立类风湿关节炎(CIA)小鼠模型。试验和分组方法如下：①对照组尾静脉注射¹²⁵I-ScFv-Crry(2ug)，分别在24h、48h后断头处死，收集血液，取出组织器官，称重并测定其放射性(Bq)，结果换算为ID％/g组织。②关节炎组尾静脉注射¹²⁵I-ScFv-Crry(2ug)，分别在24h、48h、72h、96h后，采取同上处理、检测。③关节炎治疗组，尾静脉注射一次¹²⁵I-ScFv-Crry(0.25ug)，24h后，采取同上处理、检测。④关节炎治疗组，每天尾静脉注射一次¹²⁵I-ScFv-Crry(0.25ug)，连续7天、24h后，采取同上处理、检测。结果分析如图9所示，表明ScFv-Crry可在关节炎部位高度聚集。

四、动物实验

利用类风湿关节炎(CIA)小鼠模型(同上)，从第21天开始试验，分组如下：①注射50μl PBS对照组。②ScFv-Crry治疗组，每天注射一次ScFv-Crry(0.25)mg，共注射7次。③ScFv-Crry治疗组，每天注射一次ScFv-Crry(0.25)mg，共注射4次。④ScFv-Crry治疗组，注射一次ScFv-Crry(0.25)mg。第23天开始临床评分，按一下标准对动物关节炎程度计分：0分，无关节炎；1分，轻微炎症和爪部发红；2分，严重红斑和肿胀，影响爪部功能；3分，爪部或关节变形、僵硬，失去功能。每只小鼠四肢最高总分为12分。结果如图10所示，从第23天开始ScFv-Crry三个治疗组的关节炎严重程度明显低于PBS组。

以上实验结果表明ScFv-Crry融合蛋白与非靶向补体抑制物相比，抑制补体介导的细胞裂解效能显著提高；靶向补体抑制物ScFv-Crry可在免疫损害部位高度聚集，能够明显抑制炎症的发生发展。

序列表

<160>4

<210>1

<211>569

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

<210>2

<211>1710

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

<210>3

<211>720

<212>DNA

<213>噬菌体

<400>3

<210>4

<211>240

<212>PRT

<213>噬菌体

<400>4

Claims (10)

1、抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry，是通过连接肽在抗P选择素单链抗体ScFv的羧基端连接补体抑制物Crry得到的融合蛋白。

2、根据权利要求1所述的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry，其特征在于：所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有抗炎作用的蛋白质。

3、编码权利要求1或2所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的基因。

4、根据权利要求3所述编码抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的基因，其特征在于：所述基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抗炎作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、用于表达抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的重组表达载体，是含有权利要求3或4所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry编码基因的重组表达表达载体。

6、根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pEE14.1/ScFv-Crry。

7、一种表达权利要求1所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的方法，是将权利要求5或6所述用于表达抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到抗P选择素单链抗体。

8、根据权利要求7所述的表达方法，其特征在于：所述宿主细胞为CHO细胞。

9、权利要求1或2所述的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry在制备治疗机体炎症反应的药物中的应用。

10、权利要求3或4所述编码抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的基因在制备治疗机体炎症反应的药物中的应用。

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