CN106749679A

CN106749679A - 抗P选择素单链抗体靶向抑制物融合蛋白ScFv‑SPLUNC1及其表达方法与应用

Info

Publication number: CN106749679A
Application number: CN201710018341.5A
Authority: CN
Inventors: 张传福; 宋宏彬; 周丽娟; 史云; 贾雷立; 王勇; 郭瑞霞; 张灿
Original assignee: Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Current assignee: Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Priority date: 2017-01-10
Filing date: 2017-01-10
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明公开了一种抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv‑SPLUNC1。该融合蛋白是以P选择素作为靶标，抗P选择素单链抗体(ScFv)作为载体，短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)作为弹头的针对治疗炎症反应的靶向P选择素的融合蛋白，其对炎症部位有靶向作用，可以其为活性成分制备成针对治疗炎症反应，特别是治疗流感病毒介导的肺部炎性损伤的新型基因工程靶向蛋白药物。

Description

抗P选择素单链抗体靶向抑制物融合蛋白ScFv-SPLUNC1及其表达方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域中的融合蛋白及其表达方法与应用，特别是涉及一种抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1及其表达方法与其在制备治疗流感病毒介导的肺部炎性损伤药物中的应用。

背景技术

流感是由流感病毒引起的以呼吸系统损害为主的急性感染性疾病，具有流行快、传播广、危害大等流行病学特点。20世纪以来，全球因感染流感病毒死亡的人数高达4000多万。流感除了造成大量人口发病及死亡外，还给社会造成巨大的经济损失和社会负担，因此寻找治疗流感的有效方法和药物迫在眉睫。

流感病毒感染导致肺部过度炎性反应是流感致死的主要原因。Science杂志提出流感病毒造成的一系列症状和后果并非病毒直接作用引起，而是病毒激活免疫系统所导致的炎性损伤。Nature杂志上的研究发现，1918年“西班牙流感”H1N1病毒通过触发人体免疫系统的过激反应导致致命的肺部组织炎性损伤。

对炎症发生机制与调控因素的研究并有针对性进行药物设计是目前医学研究的重要领域。目前临床使用的免疫调节药物，如糖皮质激素，具有强大的抗炎、抗过敏以及免疫抑制作用，但是长期服用具有非常严重的副作用，如脱发、耐药性、过敏性皮炎等。针对炎性损伤部位的靶向抑制药物还未研究成功，流感病毒对人类的危害问题还未解决。

P选择素(P-selectinectin，Ps，CD62P)是选择素家族中的一个成员，其分子量为140kD，属于I型膜分子，P选择素贮存于静息血小板的ɑ颗粒和内皮细胞的Weibel palade小体中，正常情况下P选择素不表达或低表达，受到炎症、损伤等因素刺激后可显著表达，且原先不表达的组织也出现表达，因此P选择素的活化可以作为炎症反应发生的标志。当凝血酶、组胺、PMA或过氧化物活化细胞后，P选择素从颗粒中迅速与胞膜融合，而表达于细胞膜上。P选择素介导细胞在活化内皮细胞上的滚动，尤其在炎症过程中的早期甚为重要，在炎症晚期同其它选择素分子协同发挥作用。因此，炎症发生时，抑制P选择素及其介导的细胞滚动为靶向消除炎症提供一种新的治疗策略。

腭、肺及鼻咽腔(呼吸道)长期暴露在外界环境中，是各种细菌病毒等病原体进入体内引发各种感染性疾病(炎性肺病)的主要路径，腭、肺及鼻咽上皮克隆(palate,lung,and nasal epithelium clone，PLUNC)蛋白在腭、肺及鼻咽上皮中丰富表达并行使宿主免疫功能，SPLUNC1(短腭、肺及鼻咽上皮克隆1，short、palate、lung and nasal epitheliumclone1)是PLUNC蛋白家族七个成员中的一个，SPLUNC1蛋白具有杀菌/渗透增强蛋白结构域(BPI)和脂多糖结合蛋白(LBP)结构域能与革兰氏阴性菌细胞壁上的脂多糖(LPS)结合从而抑制免疫反应。研究报道在患呼吸道急性炎症的小鼠其呼吸道上皮细胞中SPLUNC1蛋白表达显著下降，SPLUNC1基因缺失的呼吸道急性炎症小鼠模型炎症更加严重。目前已知SPLUNC1通过抑制TLR9/NF-κB信号通路发挥抑炎作用，然而由于SPLUNC1在流感病毒介导的肺部炎性损伤中的具体作用未明确，以及SPLUNC1蛋白在动物模型上的运用剂量未知使得SPLUNC1作为药物使用还存在障碍。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种具有抗炎作用的抗P选择素单链抗体融合蛋白。

本发明所提供的抗P选择素单链抗体融合蛋白，命名为ScFv-SPLUNC1，是通过连接肽在抗P选择素单链抗体(ScFv)的羧基端(C端)连接短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)得到的融合蛋白。

具体来讲，所述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有抗炎作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1由507个氨基酸残基组成，自氨基端第252-507位氨基酸残基为短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)，自氨基端第242-251位氨基酸残基为连接肽(Gly₄Ser)₂，自氨基端第1-241位氨基酸残基为抗P选择素单链抗体(ScFv)，其中，自氨基端第1-122位氨基酸残基为抗P选择素单链抗体(ScFv)的重链可变区，自氨基端第134-241位氨基酸残基为抗P选择素单链抗体(ScFv)的轻链可变区。

编码上述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抗炎作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：2由1524个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1521位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第754-1521位碱基编码短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)，自5’端第724-753位碱基编码连接肽(Gly₄Ser)₂，自5’端第1-723位碱基编码抗P选择素单链抗体(ScFv)，其中，自5’端第1-366位碱基编码抗P选择素单链抗体(ScFv)的重链可变区，自5’端第400-723位碱基编码抗P选择素单链抗体(ScFv)的轻链可变区。

本发明还提供一种ScFv-SPLUNC1融合基因的制备方法，是将ScFv基因和SPLUNC1基因按摩尔比1:1混合后稀释5倍(浓度为38.4ng/μL)作为模板，在正向引物：5’-CCGCGTGGATCCCCGGAATTCATGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG-3’和反向引物：5’-GTCGACTCGAGCGGCCGCATCTTAGACCTTGATGACAAACTGT-3’的引导下，PCR扩增得到ScFv-SPLUNC1融合基因；PCR反应体系为：EX Taq 0.25μL，10×EX Taq buffer 5μL，dNTP Mix 4μL，Fower Primer 2μL，Rewarse Primer 2μL Template 1μL，ddH₂O 35.75μL；PCR反应条件为：先预变性94℃3min，然后变性94℃30s，61℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃5min。

扩增抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

含有本发明抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明还提供了用于表达上述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的重组表达载体。

本发明所提供的用于表达上述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的重组表达载体，是含有抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1基因的重组表达载体。

所述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1基因可插入到重组表达载体中。构建所述重组表达载体的出发载体，可为任意一种本领域熟知的可进行外源基因表达的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒(如腺病毒、逆转录病毒或其它载体)。总之，只要能在宿主体内复制和稳定表达，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

所述原核表达载体可为pGEX-4T-1、pET-32a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a等；所述真核表达载体可为pEE14.1、pCMV5、pSilence1.0-U6(Ambion，Austin，TX，USA)、pcDNA、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo(购于Promega公司)、pTEF1、pPICZα、pAM82或pAAh5等。

其中，以pGEX-4T-1为出发载体，构建的含有所述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1基因的重组表达载体命名为pGEX-4T-1-ScFv-SPLUNC1。

可采用本领域技术人员熟知的方法构建含有所述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1基因的重组表达载体，如体外重组DNA技术，DNA合成技术和体内重组技术等(Sambrook，et al Molecular cloing，a Laboratory Manual.Cold spring harborlaboratory.New York，1989)。所述抗P选择素单链抗体(ScFv)基因的DNA序列可以有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。所述启动子可为：大肠杆菌的lac或trp启动子、噬菌体启动子、反转录病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。所述表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，所述表达载体还可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型形状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因以及绿色荧光蛋白(GFP)基因或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因等。

将ScFv-SPLUNC1融合基因与线性化载体pGEX-4T-1进行连接得到的重组表达载体，命名为pGEX-4T-1-ScFv-SPLUNC1。所述重组表达载体pGEX-4T-1-ScFv-SPLUNC1的构建方法，包括以下过程：

1)、用ECOR1-HF和Sal-HF双酶切载体pGEX-4T-1得到线性化载体pGEX-4T-1；

2)、将ScFv-SPLUNC1融合基因与线性化载体pGEX-4T-1进行连接，连接体系为：线性化载体pGEX-4T-1 0.5μL(100ng)，ScFv-SPLUNC1融合基因0.5μL(200ng)，融合酶1μL，5×融合酶缓冲液2μL，用ddH₂O补充反应体系至10μL；连接条件为：37℃温浴30min，然后放在冰上冷却；

3)电泳回收并纯化条带产物得到携带ScFv-SPLUNC1融合基因的重组载体，命名为pGEX-4T-1-ScFv-SPLUNC1。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的方法。

本发明所提供的抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的表达方法，是将所述用于表达抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1。

所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；低等真核细胞，如酵母细胞；高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌等细菌细胞；真核细胞如酵母、植物细胞；果蝇S2或Sf9等昆虫细胞；CHO、COS、293细胞或Bowes黑色素瘤细胞等动物细胞。所述宿主细胞优选为大肠杆菌细胞，特别优选为大肠杆菌BL21细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列，将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，长度通常为10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。如在复制起始点晚期一侧的长度约为100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子或腺病毒增强子等。

可用本领域技术人员熟知的常规技术，将重组DNA转化宿主细胞，培养转化子，诱导表达目的蛋白，并对重组蛋白进分离纯化。

培养含有本发明抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度为0.2-1mmol/L，优选为0.5mmol/L，诱导温度为16℃-37℃，优选为16℃，诱导时间为7-26小时，优选为16小时。

本发明还提供了一种治疗机体炎症反应(特别是治疗流感病毒介导的肺部炎性损伤)的药物。

本发明所提供的治疗机体炎症反应的药物，它的活性成分为上述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1或其编码基因。

所述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1基因可存在于真核表达载体中。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、吸收促进剂或吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为50-100μg抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1/kg体重，每天给药一次，疗程为9-15天；剂量和疗程均可根据实际情况进行调整。

本发明提供了一种抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1。该融合蛋白是以P选择素作为“靶标”，抗P选择素单链抗体(ScFv)作为“载体”，短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)作为“弹头”的针对治疗炎症反应的靶向P选择素的融合蛋白。ScFv-SPLUNC1不仅对炎症部位有靶向作用，还可对与炎症有关的两条激活途径(P选择素和TLR9/NF-κB通路)进行抑制，不仅可达到治疗炎症的目的，同时降低用药剂量，降低副作用。实验证明，腹腔注射抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1对流感小鼠模型具有明显的消炎作用，因而可以其为活性成分制备成针对治疗炎症反应(特别是治疗流感病毒介导的肺部炎性损伤)的新型基因工程靶向蛋白药物。本发明将在医药学领域发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1A为PCR扩增的ScFv基因的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图1B为PCR扩增的SPLUNC1基因的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图1C为PCR扩增的ScFv-SPLUNC1基因的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图2为载体pGEX-4T-1的物理图谱；

图3为重组表达抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的变性聚丙烯酰胺；凝胶电泳及蛋白免疫印迹检测结果；

图4为纯化的重组表达抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白免疫印迹检测结果；

图5为小鼠肺组织损伤和炎性浸润情况的各组小鼠肺组织病理切片的HE染色结果；

图6A为各组小鼠的存活率变化；

图6B为各组小鼠的体重变化；

图7为各组小鼠的肺指数变化；

图8A-图8D为各组小鼠血清中炎症因子(IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ)含量变化的ELISA法检测结果；

图9为实施例3蛋白免疫印迹检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物由博迈德公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的重组表达及鉴定

一、获得抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1基因

1、PCR扩增ScFv基因

以携带ScFv ORF的质粒(构建方法参见文献：抗P选择素单链抗体及其应用，专利号：200810224769.6)为模板，在正向引物：5’-ATGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG-3’和反向引物：

5’-CCCAGTTTGAAACATAGATCCGCCGCCACCCGACCCACCTCCGCCCCGTTTTATTTCCAACTTTG-3’的引导下，PCR扩增ScFv基因，反应结束后，对PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1A(泳道M：DNA Maker，泳道1：ScFv基因)所示，经扩增获得了753bp的目的条带，与预期结果相符，回收并纯化ScFv基因。

2、PCR扩增SPLUNC1基因

以携带SPLUNC1ORF的质粒(购自广州复能基因有限公司)为模板，在正向引物：5’-ATGTTTCAAACTGGGGGCCTCA-3’和反向引物：5’-TTAGACCTTGATGACAAACTGT-3’的引导下，PCR扩增SPLUNC1基因，反应结束后，对PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1B(泳道M：DNA Maker，泳道1：SPLUNC1基因)所示，经扩增获得了771bp的目的条带，与预期结果相符，回收并纯化SPLUNC1基因。

3、PCR扩增ScFv-SPLUNC1融合基因

将ScFv基因和SPLUNC1基因按摩尔比1:1混合后稀释5倍(浓度为38.4ng/μL)作为模板，在正向引物：5’-CCGCGTGGATCCCCGGAATTCATGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG-3’和反向引物：5’-GTCGACTCGAGCGGCCGCATCTTAGACCTTGATGACAAACTGT-3’的引导下，PCR扩增ScFv-SPLUNC1融合基因，PCR反应体系为：EX Taq 0.25μL，10×EX Taq buffer 5μL，dNTP Mix 4μL，FowerPrimer 2μL，Rewarse Primer 2μL Template 1μL，ddH₂O 35.75μL。PCR反应条件为：先预变性94℃3min，然后变性94℃30s，61℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1C(泳道M：DNA Maker，泳道1：ScFv-SPLUNC1融合基因)所示，经扩增获得了1524bp的目的条带，与预期结果相符，回收并纯化ScFv-SPLUNC1融合基因，测序，ScFv-SPLUNC1融合基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，序列表中的SEQ ID NO：2由1524个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1521位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质(ScFv-SPLUNC1融合蛋白)，自5’端第754-1521位碱基编码短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)，自5’端第724-753位碱基编码连接肽(Gly₄Ser)₂，自5’端第1-723位碱基编码抗P选择素单链抗体(ScFv)，其中，自5’端第1-366位碱基编码抗P选择素单链抗体(ScFv)的重链可变区，自5’端第400-723位碱基编码抗P选择素单链抗体(ScFv)的轻链可变区。

二、构建抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的重组表达载体

1、线性化载体pGEX-4T-1

用ECOR1-HF和Sal-HF双酶切载体pGEX-4T-1(其物理图谱如图2所示，购自clontech公司)，酶切体系为：ECOR1-HF(购自NEB公司)1μL，Sal-HF(购自购自NEB公司)1μL，pGEX-4T-1 1μg，cutsmart(酶切缓冲液，购自购自NEB公司)5μL，用ddH₂O补充反应体系至50μL，酶切条件为37℃反应5h。酶切结束后，对酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，经酶切获得了4953bp的目的条带，与预期结果相符，回收并纯化线性化载体pGEX-4T-1。

2、构建携带ScFv-SPLUNC1融合基因的重组载体pGEX-4T-1-ScFv-SPLUNC1

将ScFv-SPLUNC1融合基因与线性化载体pGEX-4T-1进行连接，连接体系为：线性化载体pGEX-4T-1 0.5μL(100ng)，ScFv-SPLUNC1融合基因0.5μL(200ng)，Fusion enzyme(融合酶，购自Biotool)1μL，5×fusion buffer(融合酶缓冲液，购自Biotool)2μL，用ddH₂O补充反应体系至10μL，连接条件为：37℃温浴30min，然后放在冰上冷却。连接结束后，对连接产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，经连接获得了6493bp的目的条带，与预期结果相符，回收并纯化携带ScFv-SPLUNC1融合基因的重组载体，命名为pGEX-4T-1-ScFv-SPLUNC1。

三、构建抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的重组表达菌

将携带ScFv-SPLUNC1融合基因的重组载体pGEX-4T-1-ScFv-SPLUNC1转化大肠杆菌BL21感受态细胞，转化体系为：重组载体2μL，大肠杆菌BL21感受态细胞100μL，转化条件为：冰上放置30min，42℃热激90s，转移至冰上放置2min，加入800μL无抗性的LB液体培养基，37℃、200r/min培养1h，取50μL菌液涂布到含氨苄青霉素抗性(浓度为100ug/mL)的LB固体培养基上，37℃温箱中培养过夜(9h-20h)。挑取单克隆，菌落PCR初步鉴定后，提质粒进行测序，测序结果表明获得了转化有pGEX-4T-1-ScFv-SPLUNC1的重组表达载体。

四、抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的诱导及表达

取测序正确的重组大肠杆菌BL21甘油菌菌种100μL加入200mL含氨苄青霉素(浓度为100ug/mL)的LB液体培养基中37℃培养过夜(9h-20h)，次日以1:100加入新鲜LB培养基扩大培养，随时监测600nm处的OD值，当OD600＝0.6-0.8时，取出100mL加入IPTG使其终浓度为0.5mM，余下的100mL菌液不加IPTG作对照组，将诱导组和对照组同时放入摇床，16℃、200r/min培养过夜(12-18h)。

五、重组表达的抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白免疫印迹检测

将对照组和诱导组的菌液离心后加入预冷的PBS冰上超声破碎，裂解液离心15min取上清，沉淀用相同体积的预冷的PBS重悬。上清和沉淀加入5×的蛋白上样缓冲液后在沸水中煮沸变性10min，室温冷却后用10％的分离胶电泳，浓缩胶电压80V，待蛋白进入分离胶调整电压为120V，电泳完毕使用恒压半干转15V、40min。BSA封闭液封闭1h后加入兔抗人一抗(购自ABcom)(1:2500)4℃孵育过夜(9-16h)，用TBST洗膜3次，每次10min，加入含辣根过氧化酶的山羊抗兔二抗(购自普利莱公司)(1:5000)室温孵育1h后曝光显影。

检测结果如图3(泳道M：蛋白质Maker，泳道1：未经IPTG诱导，泳道2：经IPTG诱导)所示，经表达获得了55.8KD的目的蛋白，且该蛋白可与SPLUNC1抗体特异结合，与预期结果相符，表明获得了抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1。

六、纯化重组表达的抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1

用10×柱体积的预冷PBS(150mM NaCl(87.75g)，16mMNa2HPO4(57.3g)，4mMNaH2PO4(6.24g)悬浮细菌，超声破碎后4℃、12000r/min离心15min，取上清，重复离心3次。向层析柱(型号5mL，购自上海生工)中添加500μL 50％谷胱甘肽琼脂糖磁珠(购自上海生工)，先用5×柱体积的PBS洗层析柱，然后将样品过柱，再用5×柱体积的PBS洗层析柱，再用3×洗脱缓冲液(上海生工)洗脱蛋白，最后用透析袋透析至无菌的PBS中，并用0.2μm的过滤器过滤，对纯化蛋白进行10％SDS-PAGE和蛋白免疫印迹检测，检测方法与步骤五相同。

检测结果如图4所示，经纯化获得了55.8KD的目的蛋白，且该蛋白可与SPLUNC1抗体特异结合，与预期结果相符，表明获得了纯度很高的抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1，-80℃保存备用。

实施例2、抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的抗炎效果检测

将6-8周龄体重18-20g的雌性BALB/C小鼠随机分成A、B、C、D、E 5组，A组：PBS对照组；B组：PR8+PBS组；C组：PR8+SPLUNC1组；D组：PR8+ScFv组，E组：PR8+ScFv-SPLUNC1组，每组25只。腹腔注射2％的戊巴比妥钠(50mg/kg)后B、C、D、E组小鼠滴鼻接种流感病毒(甲型流感病毒PR8株，用预冷的PBS稀释十倍，病毒LD50＝2.7)30μL，A组接相同体积的PBS，接毒前6hC组小鼠腹腔注射SPLUNC1蛋白(50ug/kg，蛋白获得方法同ScFv-SPLUNC1)1次，D组小鼠腹腔注射ScFV蛋白(50ug/kg，蛋白获得方法参见参见文献：抗P选择素单链抗体及其应用，专利号：200810224769.6)1次，E组小鼠腹腔注射融合蛋白ScFV-SPLUNC1(50ug/kg)1次，B组注射30μL的PBS，以后C组小鼠腹腔注射SPLUNC1蛋白(50ug/kg/day)，D组小鼠腹腔注射ScFV蛋白(50ug/kg/day)，E组小鼠腹腔注射融合蛋白ScFV-SPLUNC1(50ug/kg/day)，B组每天腹腔注射120μL的PBS。每天观察小鼠临床症状的变化，记录体重变化和存活率，流感病毒感染第5天剖杀小鼠取小鼠血清和肺组织。

病理切片法观察小鼠肺组织损伤和炎性浸润情况，小鼠肺组织病理切片HE染色结果如图5(A：PBS对照组，B：流感病毒感染未治疗组；C：流感病毒感染SPLUNC1蛋白治疗组；D：流感病毒感染ScFv治疗组；E：流感病毒感染融合蛋白ScFV-SPLUNC1治疗组)所示，可以看出，PBS对照组(A组)小鼠肺泡规则，排列整齐，肺组织清晰明朗，无出血或炎性浸润情况；流感病毒感染后(B组)小鼠肺泡受到很大程度的破坏，肺间隔增厚，炎性细胞大量聚集有很明显的浸润情况；经SPLUNC1蛋白治疗(C组)和经ScFv治疗(D组)的小鼠肺部炎性浸润的情况有所缓解；经过抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1治疗的(E组)小鼠炎性细胞浸润情况大大改善。该结果显示融合蛋白ScFv-SPLUNC1对肺部炎症有靶向作用。

各组小鼠的存活率变化如图6A(PBS对照组：PBS，流感病毒感染未治疗组：PR8+PBS；流感病毒感染SPLUNC1蛋白治疗组：PR8+SPLUNC1；流感病毒感染ScFv治疗组:PR8+ScFv；流感病毒感染融合蛋白ScFV-SPLUNC1治疗组:PR8+ScFv-SPLUNC1)所示，流感病毒感染未治疗组小鼠存活率只有10％，SPLUNC1蛋白治疗组小鼠存活率显著提高至40％，经ScFv治疗的小鼠存活率提高至33.3％，融合蛋白ScFv-SPLUNC1给药组小鼠的存活率显著提高，达到60％。

各组小鼠的体重变化如图6B(PBS对照组：PBS，流感病毒感染未治疗组：PR8+PBS；流感病毒感染SPLUNC1蛋白治疗组：PR8+SPLUNC1；流感病毒感染ScFv治疗组:PR8+ScFv；流感病毒感染融合蛋白ScFV-SPLUNC1治疗组:PR8+ScFv-SPLUNC1)所示，流感病毒感染小鼠后第3天体重开始明显下降，到第7天体重为最低值，约为初始体重的65％，经过融合蛋白ScFv-SPLUNC1治疗的最低体重高于未治疗的小鼠，相同时期经过SPLUNC1蛋白治疗组小鼠和经ScFv治疗的小鼠体重高于未治疗的小鼠，经融合蛋白ScFv-SPLUNC1治疗的小鼠体重高于SPLUNC1蛋白和ScFv治疗的小鼠。

各组小鼠的肺指数变化如图7(PBS对照组：PBS，流感病毒感染未治疗组：PR8+PBS；流感病毒感染SPLUNC1蛋白治疗组：PR8+SPLUNC1；流感病毒感染ScFv治疗组:PR8+ScFv；流感病毒感染融合蛋白ScFV-SPLUNC1治疗组:PR8+ScFv-SPLUNC1)所示，可以看出对照组小鼠肺指数在1％左右，病毒感染后小鼠肺指数上升至1.3％，SPLUNC1蛋白和ScFv治疗组小鼠肺指数分别下降为1.13％和1.16％。经融合蛋白治疗的小鼠肺指数显著下降至1.08％，表明融合蛋白ScFv-SPLUNC1治疗可以显著减轻小鼠肺水肿和肺损伤情况。

采用ELISA法检测各组小鼠血清中炎症因子(IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ)的含量变化，结果如图8A至图8D(A：IL-6，B：TNF-α，C：IL-2，D：INF-γ)所示，流感病毒感染后小鼠血清中抑炎因子IL-2含量显著下降，与之相比，经过SPLUNC1蛋白治疗的小鼠血清中IL-2含量没有明显改变，经ScFv和融合蛋白ScFv-SPLUNC1治疗的流感小鼠血清中抑炎因子IL-2显著提高，其中融合蛋白ScFv-SPLUNC1治疗的流感小鼠IL-2最高；流感病毒感染使小鼠血清中的促炎因子IL-6、TNF-α和INF-γ含量显著上升，经过SPLUNC1蛋白、ScFv和融合蛋白ScFv-SPLUNC1治疗的流感小鼠血清中促炎因子IL-6含量显著下降，且融合蛋白治疗组IL-6含量下降最为显著；SPLUNC1蛋白、ScFv和融合蛋白治疗没有明显改变小鼠血清中TNF-α的含量，但是经过融合蛋白ScFv-SPLUNC1治疗后小鼠血清中的促炎因子TNF-α显著下降。说明将抗P选择素单链抗体ScFv与SPLUNC1进行融合后其抑制炎症的效果明显好于SPLUNC1和ScFv。

以上实验结果说明：本发明的抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1能够明显抑制炎症的发生发展，特别是对流感病毒介导的肺部炎性损伤具有良好的缓解和治疗作用。并且从小鼠的体重、存活率、肺损伤和炎症发生情况综合考虑，单独使用SPLUNC1蛋白治疗和单独ScFv治疗也能起到一定的治疗作用，但是融合蛋白ScFv-SPLUNC1抑制炎症缓解肺损伤的效果明显好于相同剂量的SPLUNC1蛋白和ScFv。因此可以抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1为活性成分制备成治疗机体炎症反应(特别是治疗流感病毒介导的肺部炎性损伤)的药物。

实施例3、抗炎效果比较实验

将6-8周龄体重18-20g的雌性BALB/C小鼠随机分成A、B、C、D、E 5组，A组：PBS对照组；B组：PR8+PBS组；C组：PR8+SPLUNC1组；D组：PR8+ScFv组，E组：PR8+ScFv-SPLUNC1组，每组10只。流感感染各组小鼠模型的建立方法如前所述。流感病毒感染第5天剖杀小鼠取小鼠肺组织。

小鼠肺组织蛋白提取：小鼠肺组织称重后，按照0.1g肺组织加入1mL裂解液，放入组织研磨仪中研磨，研磨后放入4℃裂解20min，后12000r/min离心15min，取上清转移至新的EP管，加入1/4体积的5蛋白上样缓冲液，沸水中煮沸10min使蛋白变性，自然恢复至室温后放入-80℃保存备用。

Western Blot(蛋白免疫印迹检测)步骤如实施例1所述。实验所用兔GAPDH一抗购自Santacruz公司，使用时稀释比例为(1:2500)；兔CD62P一抗购自ABcom公司使用时稀释比例为(1:2000)；兔TLR9一抗和兔P-NF-κB一抗均购自Cell Signaling Technology公司使用时稀释比例为(1:1000)

蛋白免疫印迹检测结果如图9所示，可以看出：

(1)PR8流感感染后CD62P表达明显上升，C组PR8+SPLUNC1蛋白干预组与B组：PR8+PBS组CD62P的表达没有明显差异，而D组：PR8+ScFv组CD62P的表达较B组明显下降，说明仅SPLUNC1蛋白不能影响CD62P的表达。

(2)PR8流感感染后TLR9/NF-κB信号通路关键蛋白TLR9和p-NF-κB表达明显上升，C组PR8+SPLUNC1蛋白干预组与B组：PR8+PBS组相比TLR9和p-NF-κB表达明显下降，而D组PR8+ScFv组与B组相比没有明显的差异，说明SPLUNC1蛋白干预抑制了TLR9/NF-κB信号通路，而ScFv干预对此信号通路没有任何作用。

上述实验结果说明ScFv-SPLUNC1对与炎症有关的两条激活途径进行抑制，而SPLUNC1仅通过抑制TLR9/NF-κB信号通路发挥抑炎作用，ScFv仅通过抑制P选择素发挥作用。

由此可见，本发明设计的抗P选择素单链抗体ScFv-SPLUNC1融合蛋白是以P-selectin为靶标，抗P-selectin单链抗体ScFv为载体，将SPLUNC1靶向到流感肺部炎性损伤部位，同时抑制炎症有关的两条激活途径P-selectin和SPLUNC1信号通路，从而提高疗效，抑制局部炎症反应，克服了SPLUNC1蛋白对机体免疫功能系统抑制而带来的副作用。从上述实验结果可以看出，使用同等剂量的药物蛋白分子，融合蛋白ScFv-SPLUNC1对流感肺炎的治疗效果明显优于单个SPLUNC1或者ScFv蛋白分子，达到同样的治疗效果可以显著降低药物用量，减少大剂量药物使用对机体的毒副作用。

序列表

<110> 中国人民解放军疾病预防控制所

<120> 抗P选择素单链抗体靶向抑制物融合蛋白ScFv-SPLUNC1及其表达方法与应用

<130> CGCNB175007W

<160> 2

<210> 1

<211> 507

<212> PRT

<213> 抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1

<400> 1

Met Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg His Tyr Gly Asn Tyr Glu Gly Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu

130 135 140

Phe Met Ala Ile Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr

145 150 155 160

Gly Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro

165 170 175

Pro Lys Leu Leu Ile Ser Glu Gly Asn Val Leu Arg Pro Gly Val Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Leu Phe Thr Ile

195 200 205

Glu Asn Ile Leu Ser Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr

210 215 220

Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235 240

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Phe Gln Thr Gly

245 250 255

Gly Leu Ile Val Phe Tyr Gly Leu Leu Ala Gln Thr Met Ala Gln Phe

260 265 270

Gly Gly Leu Pro Val Pro Leu Asp Gln Thr Leu Pro Leu Asn Val Asn

275 280 285

Pro Ala Leu Pro Leu Ser Pro Thr Gly Leu Ala Gly Ser Leu Thr Asn

290 295 300

Ala Leu Ser Asn Gly Leu Leu Ser Gly Gly Leu Leu Gly Ile Leu Glu

305 310 315 320

Asn Leu Pro Leu Leu Asp Ile Leu Lys Pro Gly Gly Gly Thr Ser Gly

325 330 335

Gly Leu Leu Gly Gly Leu Leu Gly Lys Val Thr Ser Val Ile Pro Gly

340 345 350

Leu Asn Asn Ile Ile Asp Ile Lys Val Thr Asp Pro Gln Leu Leu Glu

355 360 365

Leu Gly Leu Val Gln Ser Pro Asp Gly His Arg Leu Tyr Val Thr Ile

370 375 380

Pro Leu Gly Ile Lys Leu Gln Val Asn Thr Pro Leu Val Gly Ala Ser

385 390 395 400

Leu Leu Arg Leu Ala Val Lys Leu Asp Ile Thr Ala Glu Ile Leu Ala

405 410 415

Val Arg Asp Lys Gln Glu Arg Ile His Leu Val Leu Gly Asp Cys Thr

420 425 430

His Ser Pro Gly Ser Leu Gln Ile Ser Leu Leu Asp Gly Leu Gly Pro

435 440 445

Leu Pro Ile Gln Gly Leu Leu Asp Ser Leu Thr Gly Ile Leu Asn Lys

450 455 460

Val Leu Pro Glu Leu Val Gln Gly Asn Val Cys Pro Leu Val Asn Glu

465 470 475 480

Val Leu Arg Gly Leu Asp Ile Thr Leu Val His Asp Ile Val Asn Met

485 490 495

Leu Ile His Gly Leu Gln Phe Val Ile Lys Val

500 505

<210> 2

<211> 1524

<212> DNA

<213> 抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1基因

<400> 2

atggtgcagc tgcaggagtc tggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcaa 120

tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataagca gtggaagaac aagctacaac 180

ccatctctca aaagtcgaat ctctatcact cgagacacat ccaagaacca gttcttcctg 240

cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag acactatggt 300

aactacgagg gctattacta tgctatggac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360

tcctcaggag gcggtggcgg ctcgggtggc ggcggctctg acatccagat gacccagtct 420

ccagcatccc tgttcatggc tataggagaa aaagtcacca tcagatgcat aaccagcact 480

ggtattgatg atgatatgaa ctggtaccag cagaagccag gggaacctcc taaactcctt 540

atttcagaag gcaatgttct tcgtcctgga gtcccatccc gattctccag cagtggctat 600

ggtacagatt ttctttttac gattgaaaac attctctcag aagatgttgc agattactac 660

tgtttgcaaa ctgataactt gcctctcacg ttcggctcgg ggacaaagtt ggaaataaaa 720

cggggcggag gtgggtcggg tggcggcgga tctatgtttc aaactggggg cctcattgtc 780

ttctacgggc tgttagccca gaccatggcc cagtttggag gcctgcccgt gcccctggac 840

cagaccctgc ccttgaatgt gaatccagcc ctgcccttga gtcccacagg tcttgcagga 900

agcttgacaa atgccctcag caatggcctg ctgtctgggg gcctgttggg cattctggaa 960

aaccttccgc tcctggacat cctgaagcct ggaggaggta cttctggtgg cctccttggg 1020

ggactgcttg gaaaagtgac gtcagtgatt cctggcctga acaacatcat tgacataaag 1080

gtcactgacc cccagctgct ggaacttggc cttgtgcaga gccctgatgg ccaccgtctc 1140

tatgtcacca tccctctcgg cataaagctc caagtgaata cgcccctggt cggtgcaagt 1200

ctgttgaggc tggctgtgaa gctggacatc actgcagaaa tcttagctgt gagagataag 1260

caggagagga tccacctggt ccttggtgac tgcacccatt cccctggaag cctgcaaatt 1320

tctctgcttg atggacttgg ccccctcccc attcaaggtc ttctggacag cctcacaggg 1380

atcttgaata aagtcctgcc tgagttggtt cagggcaacg tgtgccctct ggtcaatgag 1440

gttctcagag gcttggacat caccctggtg catgacattg ttaacatgct gatccacgga 1500

ctacagtttg tcatcaaggt ctaa 1524

Claims

1.抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1，是通过连接肽在抗P选择素单链抗体(ScFv)的羧基端(C端)连接短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)得到的，命名为ScFv-SPLUNC1。

2.根据权利要求1所述的抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1，其特征在于：连接肽为(Gly₄Ser)₂，所述融合蛋白ScFv-SPLUNC1是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

3.编码权利要求1或2所述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的基因。

4.根据权利要求3所述编码抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的基因，其特征在于：编码抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

5.权利要求3或4所述基因的制备方法，是将ScFv基因和SPLUNC1基因按摩尔比1:1混合后稀释5倍(浓度为38.4ng/μL)作为模板，在正向引物：5’-CCGCGTGGATCCCCGGAATTCATGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG-3’和反向引物：5’-GTCGACTCGAGCGGCCGCATCTTAGACCTTGATGACAAACTGT-3’的引导下，PCR扩增得到ScFv-SPLUNC1融合基因；PCR反应体系为：EX Taq 0.25μL，10×EX Taq buffer 5μL，dNTP Mix 4μL，Fower Primer 2μL，Rewarse Primer 2μL Template 1μL，ddH₂O 35.75μL；PCR反应条件为：先预变性94℃3min，然后变性94℃30s，61℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃5min。

6.用于表达权利要求1或2所述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的重组表达载体，是含有权利要求3或4所述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1基因或权利要求5制备得到的ScFv-SPLUNC1融合基因的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的用于表达抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的重组表达载体，其特征在于：是将ScFv-SPLUNC1融合基因与线性化载体pGEX-4T-1进行连接得到的重组表达载体，命名为pGEX-4T-1-ScFv-SPLUNC1。

8.权利要求7所述重组表达载体pGEX-4T-1-ScFv-SPLUNC1的构建方法，包括以下过程：

9.一种表达权利要求1或2所述抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的方法，是将权利要求6或7所述用于表达抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的重组表达载体或权利要求8制备得到的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1；所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选为大肠杆菌BL21细胞。

10.权利要求1或2所述的抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1或权利要求3或4所述编码抗P选择素单链抗体融合蛋白ScFv-SPLUNC1的基因在制备治疗机体炎症反应(特别是治疗流感病毒介导的肺部炎性损伤)的药物中的应用。