CN101357947A

CN101357947A - 肿瘤血管靶向剂重组vegf121/rip30融合毒素的制备与应用

Info

Publication number: CN101357947A
Application number: CNA2008102234427A
Authority: CN
Inventors: 孙红琰; 周满祥; 申云飞
Original assignee: SHANXI KANGBAO BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Current assignee: SHANXI KANGBAO BIOLOGICAL PRODUCTS CO Ltd
Priority date: 2008-09-27
Filing date: 2008-09-27
Publication date: 2009-02-04

Abstract

本发明公开了一种具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素与应用。该融合毒素是通过连接肽在苦瓜籽的核糖体失活蛋白RIP30的氨基端连接VEGF₁₂₁得到的融合蛋白。VEGF₁₂₁作为运载工具，可使该融合毒素与血管内皮细胞生长因子受体F1k1/KDR特异结合并内化进入血管内皮细胞，然后RIP30发挥其毒素效应，杀伤肿瘤新生血管内皮细胞，进而破坏肿瘤组织的新生血管，切断肿瘤血液供应，达到抑制肿瘤的目的。此外，该融合毒素的表达条件简单，易于纯化，可进行大规模工业化生产，因而，可以该融合毒素为活性成分制备成抗肿瘤药物。本发明将在医学及生物制药领域发挥重要作用。

Description

肿瘤血管靶向剂重组VEGF121/RIP30融合毒素的制备与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的肿瘤血管靶向剂，特别是涉及一种具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL融合毒素及其编码基因与其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症是严重威胁人类健康的重大疾病之一。自1996年以来，全球肿瘤新增病例每年都在1000万以上，死亡700多万人；1999年底，全球肿瘤患者已逾4000万人。据卫生部统计，在过去20年中，我国肿瘤发病率呈总体上升趋势，近年来，每年新增肿瘤病人200万，死亡130多万，目前，全国肿瘤患者总数估计约为450万人。

特异、高效、低毒是抗癌药研发的重要原则。传统抗癌药物的肿瘤特异性差，在杀死癌细胞的同时，也对骨髓、消化道、肝、肾等正常组织和细胞带来损害，因此治疗效果欠佳、毒副作用大。肿瘤靶向药物则改变了传统化疗药物全面杀伤所有快速分裂细胞的治疗方式，其只针对肿瘤细胞表面的特定标志对肿瘤实施精确打击，具有特异性高、抗癌效果好、毒副作用低的优势，已成为未来抗癌药物发展的主要方向。

通过选择性地抑制肿瘤血管形成和/或破坏肿瘤血管而达到控制肿瘤生长并治疗肿瘤的目的是肿瘤靶向治疗的新思路，也一直是近年来抗癌药物研发的热点和亮点。研究表明，肿瘤组织必须依赖其周围血管获得足够的营养和氧气、并排出有害代谢产物，才能迅速增长，否则肿瘤生长最多不超过2mm³。因此，只要有效抑制肿瘤血管的形成，或者破坏肿瘤已有的血管网络，肿瘤细胞就会因无法获得足够营养而停止生长，并迅速萎缩、凋亡、坏死，最终被机体消除。

在肿瘤血管的形成过程中，血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体家族发挥了重要作用，其与肿瘤的生长、浸润和转移关系密切，是抗癌药物设计的重要靶标。人类VEGF由于mRNA的剪接而产生几种不同的异构体，即：VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉和VEGF₂₀₈，其中VEGF₁₂₁和VEGF₁₆₅为可溶性的细胞因子，具有促进血管内皮细胞增殖、血管生成、增加血管通透性、加快血液流动等功能。VEGF受体(VEGFR₁和VEGFR₂)具有酪氨酸激酶活性，其中VEGFR₁/Flt1表达于所有分化成熟的血管内皮细胞表面，VEGFR₂/KDR则只在肿瘤组织的血管内皮细胞表面高表达，而在正常组织的血管内皮细胞表面几乎无法检测出，是一种具有高度肿瘤血管特异性的靶标。更有意义的是，VEGF₁₂₁与VEGFR₂/KDR以高亲和力特异结合，是一种理想的具有肿瘤血管内皮细胞特异靶向性的细胞因子。

发明内容

本发明提供了一种具有II型VEGF受体(Flk1/KDR)特异性，可特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞(抗肿瘤新生血管作用)的融合毒素。

本发明所提供的具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素，名称为VEGF₁₂₁/RIP30KDEL，是通过连接肽在苦瓜籽的核糖体失活蛋白RIP30的氨基端(N端)连接VEGF₁₂₁得到的融合蛋白。

所述苦瓜籽核糖体失活蛋白RIP30是本发明的发明人从苦瓜籽中获得的一种分子量为30kD的核糖体失活蛋白，其氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，其编码序列可如序列表中SEQ ID NO：4所示。

所述人血管内皮细胞生长因子VEGF₁₂₁是本发明的发明人从人卵巢癌组织中获得的，其氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其编码序列可如序列表中SEQID NO：2所示。

所述连接肽的选择是多种多样的，其氨基酸残基序列可如序列表中的SEQ ID NO：7所示的多肽，其编码序列可如序列表中的SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

为获得更好的粗面内质网定位效果，所述融合毒素的C-末端还可携带有内质网定位信号KDEL，所述内质网定位信号的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，其编码序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

所述连接肽也可替换为其类似物，这些类似物与所述连接肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸的类似物。

具体来讲，所述融合毒素融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：5；

2)将序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：5由393个氨基酸残基组成，自氨基端第1-121位氨基酸残基为VEGF₁₂₁；自氨基端第122-126位氨基酸残基为连接肽序列，自氨基端第127-389(263aa)位氨基酸残基为苦瓜籽核糖体失活蛋白RIP30；自氨基端第390-393(4aa)位氨基酸残基为粗面内质网定位信号KDEL。

编码上述具有特异性破坏肿瘤血管内皮细胞作用的融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的基因(VEGF₁₂₁/RIP30KDEL)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：6的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：6限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：6由1179个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1179位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-363位碱基为VEGF₁₂₁的编码序列，自5’端第364-378位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第379-1167位碱基为苦瓜籽核糖体失活蛋白RIP30的编码序列，自5’端第1168-1179位碱基为内质网定位信号KDEL的编码序列。

所述融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的片段、衍生物和类似物也是本发明要保护的，是指保持本发明的VEGF₁₂₁/RIP30相同生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可定义为：1)由一个或多个保守或非保守氨基酸残基(优选为保守性氨基酸残基)所取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是，也可以不是由遗传密码编码的；2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；3)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽；4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如用来纯化此多肽的序列，或是抗体片段或其它抗原配体序列的融合毒素)，或是将编码另一个多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)融合就可以获得融合多肽的编码序列，再使该融合多肽的编码序列获得表达，就可产生融合多肽。所述产生融合多肽的技术为本领域内公知的，包括连接编码多肽的编码序列，从而使它们在同一个读码框中，并且使融合多肽的表达受控于相同的启动子和终止子。

所述VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的类似物与VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸的类似物。应理解，本发明融合毒素的氨基酸残基序列并不限于上述例举的具有代表性的序列。

所述VEGF₁₂₁/RIP30KDEL融合毒素还可为经过修饰的，或经修饰提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的VEGF₁₂₁/RIP30KDEL多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：1)体内或体外的多肽的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化；2)糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽，这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；3)具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。

编码本发明VEGF₁₂₁/RIP30KDEL融合毒素的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA或人工合成DNA，可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或非编码链。

本发明还提供了所述融合毒素多核苷酸的变异体，其编码与VEGF₁₂₁/RIP30KDEL有相同的氨基酸序列的多肽或多肽片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，还可包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

含有本发明基因VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增VEGF₁₂₁/RIP30KDEL中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的方法。

本发明所提供的融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的表达方法，是将所述融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL基因、该基因变异体或含有融合毒素VEGF121/RIP30KDEL基因的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL。

所述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素VEGF121/RIP30KDEL基因可插入到重组表达载体中。构建所述重组表达载体的出发载体，可为任意一种指本领域熟知的可进行外源基因表达的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒(如腺病毒、逆转录病毒或其它载体)。所述载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(AH Rosenberg，et al.Vectors forselective expression of cloned DNAs by T7RNA polymerase.Gene.1987，56(1)：125-135)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(SJ Lee and D Nathans.Proliferin secreted by cultured cells binds to mannose 6-phosphate receptors.J.Biol.Chem.1988；263：3521-3527)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定表达，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

构建所述重组表达载体的出发载体还可为包含有Thioredoxin(Trx)突变体编码序列的融合表达载体，可将该载体命名为pET32载体，其中Trx突变体在蛋白表达过程中能更有效促进细菌胞浆中目的蛋白二硫键的形成进而促进蛋白的可溶性表达。

其中，以pET32为出发载体，构建的含有所述具有抗肿瘤作用的融合毒素基因VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的重组表达载体为pET32-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL。

可采用本领域技术人员熟知的方法构建含有所述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素基因VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的重组表达载体，如体外重组DNA技术，DNA合成技术和体内重组技术等(Sambrook，et al Molecular cloing，a LaboratoryManual.Cold spring harbor laboratory.New York，1989)。所述所述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素基因VEGF₁₂₁/RIP30基因的DNA序列可以有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。所述启动子可为：大肠杆菌的lac或trp启动子、噬菌体启动子、反转录病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。所述表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，所述表达载体还可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型形状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因以及绿色荧光蛋白(GFP)基因或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因等。

所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；低等真核细胞，如酵母细胞；高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真核细胞如酵母、植物细胞；果蝇S2或Sf9等昆虫细胞；CHO、COS、293细胞或Bowes黑色素瘤细胞等动物细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列，将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，长度通常为10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。如在复制起始点晚期一侧的长度约为100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子或腺病毒增强子等。

可用本领域技术人员熟知的常规技术，将重组DNA转化宿主细胞，培养转化子，诱导表达目的蛋白，并对重组蛋白进分离纯化。

培养含有本发明具有抗肿瘤作用的融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

所述融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL及其编码基因可用于制备抗肿瘤药物，因而本发明还提供了一种抗肿瘤药物。

本发明所提供的抗肿瘤药物，它的活性成分为上述具有抗肿瘤作用的融合毒素VEGF121/RIP30KDEL或其编码基因。

所述具有抗肿瘤作用的融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL基因可存在于真核表达载体中。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液或冻干粉剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述蛋白药物和基因药物的用量可采用药学领域中蛋白药物和基因药物的常规剂量，并可根据实际情况调整。荷瘤裸鼠试验结果表明，本发明的融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL在注射剂量为15mg/kg体重时，可明显延缓肿瘤的生长。

本发明提供了一种具有抗肿瘤新生血管作用的融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL及其编码基因。该蛋白是利用VEGF₁₂₁与恶性肿瘤高表达的VEGF受体Flk1/KDR高度特异结合的特点，与来源于苦瓜籽的核糖体失活蛋白RIP30通过连接肽连接而成的融合毒素。血管内皮细胞生长因子VEGF₁₂₁作为运载工具，可使该融合毒素与血管内皮细胞生长因子受体Flk1/KDR特异结合并内化进入血管内皮细胞，然后苦瓜籽核糖体失活蛋白RIP30发挥其毒素效应，杀伤肿瘤新生血管内皮细胞，进而破坏肿瘤组织的新生血管，切断肿瘤血液供应，达到抑制肿瘤的目的。此外，融合毒素C-末端内质网定位信号KDEL可增加游离RIP30毒素在粗面内质网的富集，进一步增强融合毒素的抗肿瘤效果(RIP30毒素可使其中核糖体大亚基的28S rRNA发生脱腺嘌呤作用，抑制细胞蛋白质的翻译，进而杀死肿瘤血管内皮细胞，破坏肿瘤新生血管)。此外，该融合毒素的表达条件简单，易于纯化，可进行大规模工业化生产，因而，可以该融合毒素为活性成分制备成抗肿瘤药物。本发明将在医学及生物制药领域发挥重要作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

说明书附图

图1为VEGF₁₂₁G45基因PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为RIP30KDEL基因PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3为pET32-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的酶切鉴定结果

图4为在大肠杆菌中表达的Trx-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL融合蛋白的12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

图5为大肠杆菌中表达并经纯化的Trx-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL融合蛋白的12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

图6为纯化的VEGF₁₂₁/RIP30KDEL融合蛋白的12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

图7为对照组和试验组给药后不同时间的肿瘤生长曲线

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物技术有限公司完成。

实施例1、融合蛋白Trx-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL表达载体的构建

用下述方法构建具有破坏肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的编码基因及其原核表达载体，具体方法包括以下步骤：

一、VEGF₁₂₁G4S基因的克隆

1、引物设计

设计PCR扩增VEGF₁₂₁与连接肽G₄S的融合基因(VEGF₁₂₁G4S)，并在正向引物的5’端添加限制性内切酶Kpn I的识别位点，在反向引物上添加连接肽G4S的编码序列和限制性内切酶BamH I的识别位点，引物序列如下：

上游引物F：5’-ggTACCgACgACgACgACAgggCACCgATggCAgAAggTggCggg，下游引物R：5’-ggATCCgCCACCgCCCCgCCTCggCTTgTCACATTTTTC。

2、人卵巢癌组织总RNA的提取

利用Invitrogen公司的Trizol试剂提取细胞总RNA，方法为：取大约100mg组织放入无菌玻璃研磨器中，加入1mL Trizol试剂，冰浴条件下迅速研磨，然后吸取上清至无RNA酶的离心管中，4℃、12,000g离心10min，吸取上清，加入0.2mL氯仿/1mL Trizol，充分混匀后静置2-3min；将水相移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温沉淀10min，再4℃、7500g离心5min，重复漂洗一次，去除乙醇后室温干燥5-10min，加入DEPC水溶解RNA沉淀。

3、反转录合成cDNA

用Promega公司的反转录试剂盒并按照说明书进行操作，方法为：取总RNA 5μl，加入1μl随机引物，70℃5min，冰上冷却5min；再加入5μl AMV RT 5×缓冲液，2.5μldNTPs混合物，1μl RNA抑制剂，7.5μl DEPC处理水，25℃10min，然后升温至37℃时加入3μl AMV RT，最后37℃60min，60℃3min，37℃30min。

4、PCR扩增VEGF₁₂₁G4S基因

用下述方法PCR扩增VEGF₁₂₁G4S基因：50μl反应体系为：于39μl H₂O中加入5μl10×Pyrobest PCR缓冲液，1μl 10mM dNTPs，步骤1的正、反向引物(F、R)各1μl，2μl步骤3的cDNA，1μl Pyrobest DNA Polymerase；PCR反应条件为：94℃3min，94℃30sec，56℃40sec，72℃60sec，共30个循环。

5、目的基因的纯化、回收

用天根公司的目的基因纯化、回收试剂盒并按照说明书进行操作，方法为：首先用500ul平衡液平衡离心柱；在装有凝胶的离心管中加入3倍体积(约600μl)的溶胶液，置60℃水浴中，直至凝胶完全溶解；将溶液吸至离心柱中，12000g离心1min，弃流出液；加入500ul洗液，12000g离心1min，弃流出液；重复洗涤一次；1300g离心2min；置37℃30分钟，再更换EP管，加入30μl去离子水，放置1min，最后13000g离心1min，收集洗脱液。对回收、纯化的目的基因进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道1为PCR扩增产物，泳道M为DNA分子量标准)，结果PCR扩增的VEGF₁₂₁G4S基因的大小约为400bp，与预期大小一致。

6、VEGF₁₂₁G4S基因与pEASY-B载体连接

向4ul纯化的VEGF₁₂₁G4S基因的PCR扩增片段中加入1ul pEASY-B连接混合物(包含有pEASY-B载体和连接酶，购自北京全式金公司)，室温放置5分钟，然后将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到携带有VEGF₁₂₁G4S基因的重组载体，命名为pEASY-B-VEGF₁₂₁G4S。

7、提质粒

用天根公司的质粒小量提取试剂盒并参照试剂盒说明书提质粒，方法为：将测序正确的携带有pEASY-B-VEGF₁₂₁G4S的阳性单克隆接种于5mL含25ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、250rpm下振荡培养过夜(16小时)；6000rpm离心5分钟，收集菌体；每管加入250ul P1溶液(细菌悬浮液)，混匀；再加入250ul P2溶液(细菌裂解液)，上下颠倒4-5次，直至透明；每管加入350ul P3溶液(中和液)，上下颠倒4-5次，呈团絮状，12,000rpm离心30min；取2个离心柱，分别加入500ul平衡液，12000rpm离心1min，弃流出液；加入菌体裂解上清液，12000rpm离心1min；弃流出液，加入500ul PD(蛋白质去除液)12000rpm离心1min；弃流出液，加入700ulPE(洗涤液)12000rpm离心1min；弃流出液，加入500ul PE(洗涤液)12000rpm离心1min；弃流出液，13000rpm离心2min以去除残留洗液，并置37℃干燥30分钟；将离心柱置于一新的1.5mL离心管中，加入100ul EB(DNA洗脱液)，静置1分钟，最后13000rpm离心1分钟，收集洗脱液。

二、RIP30KDEL基因的克隆

1、引物设计

设计PCR扩增RIP30与内质网定位信号KDEL融合基因(RIP30KDEL)的引物，并在上游引物添加限制性内切酶BamH I识别位点，在下游引物添加Not I识别位点，引物序列如下：

上游引物BamH I_F：5’-ggATCCgATgTTAACTTCgATTTgTCg，

下游引物Not I_R：5’-gCggCCgCTCATTACAgTTCATCTTTATTCACAACAgATTCCCC。

2、苦瓜籽总RNA提取

取市售苦瓜籽于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，加入TRIzol试剂(Invitrogen公司)，4℃、12000rpm离心10分钟，取上清，每1mL TRIzol加入氯仿200ul，剧烈振摇30秒，室温放置3分钟，4℃、12000rpm离心15分钟，取上层水相溶液，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10分钟，4℃、12000rpm离心10分钟，弃上清，加入预冷的75％乙醇(DEPC水配置)洗涤，放置至沉淀透明后加入适量DEPC水溶解，-70℃保存备用。

3、反转录PCR扩增RIP30KDEL基因

用Superscript II(Introgen公司)试剂盒并按照说明书进行操作：取1ug苦瓜籽总RNA作模板进行反转录反应，然后取5ul反转录产物作模板参照下述PCR体系扩增RIP30KDEL基因：10×Pyrobest缓冲液5ul，上、下游引物(BamH I_F、Not I_R)各50pmol，10mM dNTPs 1ul，Pyrobest DNA聚合酶1ul，补水至50ul。PCR反应参数为：先94℃30sec，55℃40sec，72℃1min，共30个循环；然后72℃延伸7分钟。反应结束后，用天根公司的目的基因纯化、回收试剂盒回收、纯化PCR扩增产物，方法与步骤一相同。然后，对回收、纯化的目的基因进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(泳道1为PCR扩增产物，泳道M为DNA分子量标准)，结果PCR扩增的RIP30KDEL基因的大小约为800bp，与预期大小一致。

4、RIP30KDEL基因与pEASY-B载体连接

向4ul纯化的RIP30KDEL基因的PCR扩增片段中加入1ul pEASY-B连接混合物，室温放置5分钟，然后将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，得到携带有RIP30KDEL基因的重组载体，命名为pEASY-B-RIP30KDEL。

5、提质粒

方法与步骤一相同。

三、pET32a(+)-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL融合蛋白表达载体的构建

1、pET32a(+)-RIP30KDEL表达载体的构建

①将载体pET32a(+)和pEASY-B-RIP30KDEL质粒载体用限制性内切酶BamH I和Not I进行双酶切，20ul反应体系及反应条件为：5μl 10×Buffer 1，10μl质粒，1μl BamH I，1μl Not I，水3ul，混匀，在37℃下酶切2小时。

②将pET32载体和pEASY-B-RIP30KDEL酶切片段切胶混合一起回收，方法参照天根公司说明书和步骤一。洗脱体积为30ul。

③pET32a载体与RIP30KDEL片段的连接：取26ul步骤②的洗脱产物，加3ul10×T4DNA连接酶缓冲液，1ul连接酶，混匀，16℃连接过夜。

④取5ul步骤③连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

⑤对转化的单菌落进行PCR和双酶切鉴定，方法为：取单菌落悬于50ul水中，99℃裂解10分钟；50μl反应体系为：于39μl H₂O中加入5μl 10×Taq缓冲液，1μl 10mMdNTPs，通用扩增引物T7promoter(5’-TAATACgACTCACTATAg)和T7terminator(5’-：TgCTAgTTATTgCTCAgC)各1μl，1μl模板，1μl Taq酶；反应条件为：94℃3min，94℃30sec，56℃40sec，72℃60sec，共30个循环。可扩增出约900bp DNA片段的为阳性克隆。反应结束后，对PCR鉴定为阳性克隆的进行扩大培养，小量法提质粒(方法与步骤一相同)，用限制性内切酶BamH I和Not I进行双酶切鉴定，方法同步骤①，经酶切得到约800bp DNA片段的为阳性克隆。

3、pET32-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL表达载体的构建

①对质粒载体pET32-RIP30KDEL和pEASY-B-VEGF₁₂₁G4S用限制性内切酶BamHI和Kpn I进行双酶切，20ul反应体系及反应条件为：5μl 10×Buffer 2，10μl质粒，1μl Kpn I，1μl BamH I，水3ul，混匀，在37℃下酶切2小时。

②将经酶切的pET32-RIP30KDEL和VEGF₁₂₁G4S酶切片段切胶混合一起回收，方法参照天根公司说明书和步骤一。洗脱体积为30ul。

③pET32-RIP30KDEL和VEGF₁₂₁G4S片段的连接：取26ul步骤②的洗脱产物，加入3ul 10×T4DNA连接酶缓冲液，1ul连接酶，混匀，16℃连接过夜。

④取5ul连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

⑤转化菌落的双酶切鉴定：分别取4个单菌落接种于5mL含有200ug/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、250rpm下培养过夜。培养结束后，提取质粒，用限制性内切酶Kpn I和Not I进行双酶切鉴定。对酶切鉴定产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示(泳道1为酶切鉴定产物，泳道M为DNA Marker)，经Kpn I和Not I双酶切后获得了大小约为1.2kb的目的条带，与预期结果一致，再对经酶切鉴定正确的阳性克隆质粒用测序的方法做进一步鉴定，测序结果表明所携带的目的基因具有序列表中SEQ ID NO：6的核苷酸序列，由1179个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1179位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-363位碱基为VEGF₁₂₁的编码序列，自5’端第364-378位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第379-1167位碱基为苦瓜籽核糖体失活蛋白RIP30的编码序列，自5’端第1168-1179位碱基为内质网定位信号KDEL的编码序列。上述检测结果证明获得了序列及插入位置均正确的携带有本发明具有破坏肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL编码基因的原核表达载体，命名为pET32-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL。

实施例2、融合蛋白VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的制备

一、融合蛋白Trx-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL在大肠杆菌中的表达

1.将pET32-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL质粒转化大肠杆菌Origami(DE3)，在37℃下培养30小时，筛选阳性克隆。

2.将阳性单菌落接种于10mL LB液体培养基(含羧苄青霉素200ug/mL，卡那霉素30ug/mL和四环素25ug/mL)中，在37℃、250rpm条件下培养过夜。

3.将10mL过夜培养物转接至1L LB液体培养基(含羧苄青霉素200ug/mL，卡那霉素30ug/mL和四环素25ug/mL)中，在37℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀≈0.6(约4小时)。

4.加入IPTG至终浓度为0.1mM(加入1M IPTG溶液100ul)，在23℃、250rpm条件下继续培养过夜；培养结束后，6000rmp离心5分钟收获细菌。

5.将细菌沉淀重悬于40mL 10mM Tris·HCl(pH 8.0)中，冰浴中超声破碎(功率300W，每次5秒，间隔5秒，共50次)，在4℃、12000rpm下离心30分钟，收集上清。取离心前、后样品进行12％SDS-PAGE电泳，鉴定蛋白可溶性。检测结果如图4所示(泳道M为低分子量蛋白质标准，泳道1为诱导前的菌体蛋白，泳道2为诱导后的菌体蛋白，泳道3为裂解上清)。经IPTG诱导表达后，获得了分子量为62KD的重组蛋白，与预期结果一致，并主要以可溶的形式表达。

二、融合蛋白Trx-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的纯化

1、用Ni-NTA亲和柱纯化Trx-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL融合蛋白

①用5倍柱床体积的结合缓冲液(10mM Tris·HCl，pH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑)平衡镍柱(购自Qiagen公司)。

②将细胞粗提液缓慢上柱，流速约0.5mL/min；用10倍柱床体积的洗液(10mMTris·HCl，pH8.0，300mM NaCl，20mM咪唑)洗脱杂蛋白。

③用含有300mM NaCl，250mM咪唑的10mM Tris·HCl(pH8.0)洗脱目的蛋白，收集3倍柱床体积的洗脱液。同时取样，进行12％SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图5所示(泳道M为低分子量蛋白质标准，泳道1为经Ni-NTA亲和柱纯化的Trx-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL融合蛋白)，经Ni-NTA纯化的融合蛋白仍有杂蛋白污染，但分子量均小于35KD。然后，采用孔径为MWCO50000的透析袋4℃透析过夜去除杂蛋白。

三、融合蛋白的切割及Trx标签的去除

按每100单位肠激酶(rEK)裂解10毫克步骤二纯化的Trx-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL融合蛋白，室温消化过夜。

四、VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的进一步纯化

用Blue Sepharose 6Fast Flow亲和层析纯化VEGF₁₂₁/RIP30KDEL蛋白，具体方法包括以下步骤：

①上柱：用5倍柱床体积的20mM Tris·HCl(pH7.4)，50mM NaCl缓冲液平衡凝胶柱，将步骤4酶切产物缓慢上柱，流速约为0.5mL/min。

②洗柱：用10倍柱床体积的20mM Tris·HCl(pH7.4)，150mM NaCl缓冲液洗脱杂蛋白。

③洗脱：洗脱液为20mM Tris·HCl(pH7.4)，2M NaCl，收集2个柱床体积。

④透析或凝胶过滤置换缓冲液：10mM Tris·HCl(pH7.4)，150mM NaCl。

⑤用肠激酶消化去除组氨酸标签，并经Blue Sepharose 6FF柱(购自GE公司)纯化。对纯化产物进行12％SDS-PAGE电泳检测，结果如图6所示(泳道M为低分子量蛋白质标准，泳道1为经纯化的VEGF₁₂₁/RIP30KDEL融合蛋白)，得到了高纯度的分子量为43KD的目的蛋白VEGF₁₂₁/RIP30KDEL。

实施例3、VEGF₁₂₁/RIP30KDEL的抑瘤实验

取5周龄Balb/c裸鼠，雌性，体重为18-20g，随机分为2组，每组5只。体外培养A375M细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，每只裸鼠注射5×10⁵人黑色素瘤A375M癌细胞，以接种肿瘤当天为第一天，第三天给药，剂量为15mgVEGF₁₂₁/RIP30KDEL/kg体重，以注射相同体积的生理盐水(saline)为对照。在不同时间测量对照组和试验组(VEGF₁₂₁/RIP30KDEL)小鼠肿瘤的大小。对结果数据进行一个重复测量的两因素设计的方差分析，结果较对照组(saline)，VEGF₁₂₁/RIP30KDEL组的P＜0.05，表明两组间的差别具有显著统计学意义。根据每组小鼠肿瘤大小的平均值绘出对照组(saline)和试验组(VEGF₁₂₁/RIP30KDEL)给药后不同时间的肿瘤生长曲线，生长曲线如图7所示，表明本发明的融合毒素VEGF₁₂₁/RIP30KDEL对肿瘤的生长具有显著的抑制作用。

序列表

<160>10

<210>1

<211>121

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys

1 5 10 15

Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu

20 25 30

Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys

35 40 45

Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu

50 55 60

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile

65 70 75 80

Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe

85 90 95

Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg

100 105 110

Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg

115 120

<210>2

<211>363

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

gcaccgatgg cagaaggagg agggcagaat catcacgaag tggtgaagtt catggatgtc 60

tatcagcgca gctactgcca tccaatcgag accctggtgg acatcttcca ggagtaccct 120

gatgagatcg agtacatctt caagccatcc tgtgtgcccc tgatgcgatg cgggggctgc 180

tgcaatgacg agggcctgga gtgtgtgccc actgaggagt ccaacatcac catgcagatt 240

atgcggatca aacctcacca aggccagcac ataggagaga tgagcttcct acagcacaac 300

aaatgtgaat gcagaccaaa gaaagataga gcaagacaag aaaaatgtga caagccgagg 360

cgg

363

<210>3

<211>263

<212>PRT

<213>葫芦科苦瓜(Momordica charantia)

<400>3

Asp Val Asn Phe Asp Leu Ser Thr Ala Thr Ala Lys Thr Tyr Thr Lys

1 5 10 15

Phe Ile Glu Asp Phe Arg Ala Thr Leu Pro Phe Ser His Lys Val Tyr

20 25 30

Asp Ile Pro Leu Leu Tyr Ser Thr Ile Ser Asp Ser Arg Arg Phe Ile

35 40 45

Leu Leu Asn Leu Thr Ser Tyr Ala Tyr Glu Thr Ile Ser Val Ala Ile

50 55 60

Asp Val Thr Asn Val Tyr Val Val Ala Tyr Arg Thr Arg Asp Val Ser

65 70 75 80

Tyr Phe Phe Lys Glu Ser Pro Pro Glu Ala Tyr Asn Ile Leu Phe Lys

85 90 95

Gly Thr Arg Lys Ile Thr Leu Pro Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Asn Leu

100 105 110

Gln Thr Ala Ala His Lys Ile Arg Glu Asn Ile Asp Leu Gly Leu Pro

115 120 125

Ala Leu Ser Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala Gln Ser

130 135 140

Ala Pro Ser Ala Leu Leu Val Leu Ile Gln Thr Thr Ala Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Arg His Val Ala Lys Tyr Val Ala Thr Asn

165 170 175

Phe Lys Pro Asn Leu Ala Ile Ile Ser Leu Glu Asn Gln Trp Ser Ala

180 185 190

Leu Ser Lys Gln Ile Phe Leu Ala Gln Asn Gln Gly Gly Lys Phe Arg

195 200 205

Asn Pro Val Asp Leu Ile Lys Pro Thr Gly Glu Arg Phe Gln Val Thr

210 215 220

Asn Val Asp Ser Asp Val Val Lys Gly Asn Ile Lys Leu Leu Leu Asn

225 230 235 240

Ser Arg Ala Ser Thr Ala Asp Glu Asn Phe Ile Thr Thr Met Thr Leu

245 250 255

Leu Gly Glu Ser Val Val Asn

260

<210>4

<211>789

<212>DNA

<213>葫芦科苦瓜(Momordica charantia)

<400>4

gatgttaact tcgatttgtc gactgccact gcaaaaacct acacaaaatt tatcgaagat 60

ttcagggcga ctcttccatt tagccataaa gtgtatgata tacctctact gtattccact 120

atttccgact ccagacgttt catactcctc aatctcacaa gttatgcata tgaaaccatc 180

tcggtggcca tagatgtgac gaacgtttat gttgtggcct atcgcacccg cgatgtatcc 240

tactttttta aagaatctcc tcctgaagct tataacatcc tattcaaagg tacgcggaaa 300

attacactgc catataccgg taattatgaa aatcttcaaa ctgctgcaca caaaataaga 360

gagaatattg atcttggact ccctgccttg agtagtgcca ttaccacatt gttttattac 420

aatgcccaat ctgctccttc tgcattgctt gtactaatcc agacgactgc agaagctgca 480

agatttaagt atatcgagcg acacgttgct aagtatgttg ccactaactt taagccaaat 540

ctagccatca taagcttgga aaatcaatgg tctgctctct ccaaacaaat atttttggcg 600

cagaatcaag gaggaaaatt tagaaatcct gtcgacctta taaaacctac cggggaacgg 660

tttcaagtaa ccaatgttga ttcagatgtt gtaaaaggta atatcaaact cctgctgaac 720

tccagagcta gcactgctga tgaaaacttt atcacaacca tgactctact tggggaatct 780

gttgtgaat

789

<210>5

<211>393

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys

1 5 10 15

Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu

20 25 30

Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys

35 40 45

Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu

50 55 60

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile

65 70 75 80

Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe

85 90 95

Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg

100 105 110

Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val

115 120 125

Asn Phe Asp Leu Ser Thr Ala Thr Ala Lys Thr Tyr Thr Lys Phe Ile

130 135 140

Glu Asp Phe Arg Ala Thr Leu Pro Phe Ser His Lys Val Tyr Asp Ile

145 150 155 160

Pro Leu Leu Tyr Ser Thr Ile Ser Asp Ser Arg Arg Phe Ile Leu Leu

165 170 175

Asn Leu Thr Ser Tyr Ala Tyr Glu Thr Ile Ser Val Ala Ile Asp Val

180 185 190

Thr Asn Val Tyr Val Val Ala Tyr Arg Thr Arg Asp Val Ser Tyr Phe

195 200 205

Phe Lys Glu Ser Pro Pro Glu Ala Tyr Asn Ile Leu Phe Lys Gly Thr

210 215 220

Arg Lys Ile Thr Leu Pro Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Asn Leu Gln Thr

225 230 235 240

Ala Ala His Lys Ile Arg Glu Asn Ile Asp Leu Gly Leu Pro Ala Leu

245 250 255

Ser Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala Gln Ser Ala Pro

260 265 270

Ser Ala Leu Leu Val Leu Ile Gln Thr Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe

275 280 285

Lys Tyr Ile Glu Arg His Val Ala Lys Tyr Val Ala Thr Asn Phe Lys

290 295 300

Pro Asn Leu Ala Ile Ile Ser Leu Glu Asn Gln Trp Ser Ala Leu Ser

305 310 315 320

Lys Gln Ile Phe Leu Ala Gln Asn Gln Gly Gly Lys Phe Arg Asn Pro

325 330 335

Val Asp Leu Ile Lys Pro Thr Gly Glu Arg Phe Gln Val Thr Asn Val

340 345 350

Asp Ser Asp Val Val Lys Gly Asn Ile Lys Leu Leu Leu Asn Ser Arg

355 360 365

Ala Ser Thr Ala Asp Glu Asn Phe Ile Thr Thr Met Thr Leu Leu Gly

370 375 380

Glu Ser Val Val Asn Lys Asp Glu Leu

385 390

<210>6

<211>1179

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gcaccgatgg cagaaggagg agggcagaat catcacgaag tggtgaagtt catggatgtc 60

tatcagcgca gctactgcca tccaatcgag accctggtgg acatcttcca ggagtaccct 120

gatgagatcg agtacatctt caagccatcc tgtgtgcccc tgatgcgatg cgggggctgc 180

tgcaatgacg agggcctgga gtgtgtgccc actgaggagt ccaacatcac catgcagatt 240

atgcggatca aacctcacca aggccagcac ataggagaga tgagcttcct acagcacaac 300

aaatgtgaat gcagaccaaa gaaagataga gcaagacaag aaaaatgtga caagccgagg 360

cggggcggtg gcggatccga tgttaacttc gatttgtcga ctgccactgc aaaaacctac 420

acaaaattta tcgaagattt cagggcgact cttccattta gccataaagt gtatgatata 480

cctctactgt attccactat ttccgactcc agacgtttca tactcctcaa tctcacaagt 540

tatgcatatg aaaccatctc ggtggccata gatgtgacga acgtttatgt tgtggcctat 600

cgcacccgcg atgtatccta cttttttaaa gaatctcctc ctgaagctta taacatccta 660

ttcaaaggta cgcggaaaat tacactgcca tataccggta attatgaaaa tcttcaaact 720

gctgcacaca aaataagaga gaatattgat cttggactcc ctgccttgag tagtgccatt 780

accacattgt tttattacaa tgcccaatct gctccttctg cattgcttgt actaatccag 840

acgactgcag aagctgcaag atttaagtat atcgagcgac acgttgctaa gtatgttgcc 900

actaacttta agccaaatct agccatcata agcttggaaa atcaatggtc tgctctctcc 960

aaacaaatat ttttggcgca gaatcaagga ggaaaattta gaaatcctgt cgaccttata 1020

aaacctaccg gggaacggtt tcaagtaacc aatgttgatt cagatgttgt aaaaggtaat 1080

atcaaactcc tgctgaactc cagagctagc actgctgatg aaaactttat cacaaccatg 1140

actctacttg gggaatctgt tgtgaataaa gatgaactg 1179

<210>7

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210>8

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

ggcggtggcg gatcc 15

<210>9

<211>4

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>9

Lys Asp Glu Leu

1

<210>10

<211>12

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>10

aaagatgaac tg 12

Claims

1、具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素，是通过连接肽在苦瓜籽的核糖体失活蛋白RIP30的氨基端连接VEGF₁₂₁得到的融合蛋白。

2、根据权利要求1所述的融合毒素，其特征在于：所述连接肽的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：7所示。

3、根据权利要求2所述的融合毒素，其特征在于：所述融合毒素是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：5；

2)将序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的蛋白质。

4、根据权利要求1或2或3所述的融合毒素，其特征在于：所述融合毒素的C-末端还携带有内质网定位信号，所述内质网定位信号的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，其编码序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

5、编码权利要求1或2或3或4所述的具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素的基因。

6、根据权利要求5所述的基因，其特征在于：所述基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：6的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列；

7、含有权利要求5或6所述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

8、一种表达权利要求1所述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素的表达方法，是将权利要求5或6所述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素基因、该基因变异体或含有所述具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素基因的重组表达载体转化或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素；所述含有具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素基因的重组表达载体为pET32-VEGF₁₂₁/RIP30KDEL。

9、权利要求1-4任一项所述的具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素在制备抗肿瘤药物中的应用。

10、权利要求5或6所述的具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合毒素的编码基因在制备抗肿瘤药物中的应用。