CN100365022C - 新的融合毒素蛋白质及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由毒素分子和导向分子组成的融合毒素蛋白质。更具体地说，本发明涉及由作为细胞毒性剂部分的绿脓杆菌外毒素和作为导向部分的白细胞介素10的受体结合肽组成的融合毒素蛋白质，其制备方法及其作为免疫抑制剂、抗肿瘤剂的应用。

Description

新的融合毒素蛋白质及其应用

发明的领域

本发明涉及由毒素分子和导向分子组成的融合毒素蛋白质。更具体地说，本发明涉及由作为细胞毒性剂部分的绿脓杆菌外毒素和作为导向剂部分的白细胞介素10受体结合肽组成的融合毒素蛋白质，其制备方法及其作为免疫抑制药物的应用。

发明背景

融合细胞毒素是一类能够识别并杀伤过表达特异性受体的靶细胞的导向性分子。在融合毒素分子中，两个或多个以其天然状态存在的分子相互连接或融合在一起，形成具有各基本构成部分的所有功能性的单一分子。其中，导向部分是可与相应的靶分子(例如细胞表面受体或抗原)结合的配体或抗体。例如，当导向部分是抗体时，融合分子便可与携带相应抗原决定基的细胞结合。融合分子的另一个基本组成部分是能够将融合分子运输到其所针对的靶目标的效应分子。包括细胞毒素、标记物、放射性核素、配体、抗体、药物、脂质体等在内的效应分子，一般是指可被递送到靶位点(如靶细胞)并在靶位点发挥特异作用或活性的分子。

特别适于临床治疗应用的效应物分子是细菌或植物毒素，例如假单胞菌外毒素、白喉毒素、霍乱毒素、葡萄球菌内毒素，以及蓖麻毒素和相思豆素等。可使用化学偶联或DNA重组技术使这些毒素或细胞毒性剂连接到作为导向分子的生长因子(如EGF、TGF-α、bFGF等)、细胞因子(如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13等)，或短肽激素(如GnRH、MSH等)上，以产生兼有靶细胞(如免疫细胞、肿瘤细胞等)导向功能和细胞毒活性的嵌合毒素分子。这些融合或嵌合分子借助其针对靶细胞的导向能力将整个分子带向靶细胞并利用其毒素部分直接杀伤靶细胞。

可借助几种方法将药物导向特定细胞。其中方法之一是依赖存在于细胞表面上的特异性受体分子。具有“导向剂”功能的分子可以识别这些细胞表面受体并与之特异性结合。识别特异性细胞表面受体的导向分子可将细胞毒性分子导向具有这些表面受体的细胞。例如，某些细胞表面都有白细胞介素10受体(IL10-R)蛋白质的过度表达。白细胞介素10(IL10)可识别这些细胞上的IL10-R并与之结合。因此，IL10即是这些细胞的导向分子。可以与导向分子连接并与之形成杂合分子的另一个部分是细胞毒素或细胞毒性剂。用于构建杂合分子的最强有力的细胞毒性剂是抑制哺乳动物蛋白质合成的细菌毒素。目前研究较多且认识较为深入的细胞毒性剂包括绿脓杆菌外毒素A(PE40、PE38和PE66)、蓖麻毒素、白喉毒素(DT)等。

Pasten等人报导了用于特异性杀伤肿瘤细胞的，包括与假单胞菌外毒素(PEA)融合之白介素4(IL-4)或转化生长因子α(TGF-α)的，或与白喉毒素(DT)融合之白介素2(IL-2)的嵌合蛋白质(Pasten et al.，Ann，Rev，Biochem.61：331～354，1992)。Williams等人描述了其中DT的天然受体结合区被多肽细胞因子白介素2取代的白喉毒素相关融合蛋白质DAB₄₈₆-IL-2(Willians et al.，Protein Engineering 1：493～498，1987)。

活化的造血细胞分泌的多种细胞因子在调节免疫反应中起重要作用。这些细胞因子作为可溶性细胞间信号转导分子，一般是通过与靶细胞表面上的特异性受体的结合而介导其生物学功能的。其中，人白细胞介素10(IL 10)是一种由单核-巨嗜细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞产生的并主要作用于免疫系统的细胞因子。已知IL10具有抑制活化的T细胞合成细胞因子、刺激胸腺细胞和肥大细胞生长、诱导II类MHC的表达，以及维持培养的B淋巴细胞的存活性等功能。一般认为，IL10与其细胞表面受体的结合是各种特异性细胞反应的起始步骤(Ho etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11267-71，1993)。因此，调节IL10与其受体的结合，从而抑制受体信号转导，有可能用于治疗某些因不适当的免疫反应引起的疾病，例如自身免疫病、超敏反应、B细胞淋巴瘤和爱滋病等。然而，不幸的是，目前缺乏更为有效的IL10拮抗剂和激动剂。

为了有效地阻断IL10与其细胞表面受体的结合，为某些免疫失调特别是免疫增强性疾病例如自身性免疫病的治疗提供一种新的药物，本发明人试图使用IL10分子的受体结合片段(即包括IL10分子的第23至第57位氨基酸的35肽，以下简称IL10_23-57)作为导向分子，与并使用具有细胞杀伤作用的毒素例如绿脓杆菌外毒素A的去除了受体结合区的其余部分(PE40)作为细胞毒性分子，制成一种新的融合蛋白质，并使用该融合蛋白质在特定部位杀伤表面高表达IL10受体分子的T细胞等免疫活性细胞，以期达到缓解和治疗自身性免疫病、移植物抗宿主反应、B细胞淋巴瘤和获得性免疫缺陷综合症(ADIS)等免疫失调性疾病的目的。

发明目的

本发明的一个目的是提供由毒素部分和导向部分组成的融合毒素蛋白质，特征在于所说的导向部分是白细胞介素10分子或其部分。

根据本发明的一个优选实施方案，其中毒素部分选自绿脓杆菌外毒素、白喉毒素、霍乱毒素、葡萄球菌内毒素、蓖麻毒素和相思豆素。

根据本发明的一个优选实施方案，其中毒素部分是绿脓杆菌外毒素A分子除去受体结合区的其余部分。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的导向部分是白细胞介素10的包括第23位至第57位氨基酸的功能性短肽。

本发明的另一个目的是提供生产如上限定的嵌合蛋白质的方法，该方法包括：

(1)提供携带绿脓杆菌外毒素A分子除去受体结合区的其余部分与白细胞介素10的包括第23位至第57位氨基酸的功能性短肽序列之DNA编码序列的重组表达载体；

(2)用步骤(1)的重组载体转化适当的宿主细胞；

(3)在适于表达包括绿脓杆菌外毒素A分子除去受体结合区的其余部分与白细胞介素10的第23位至第57位氨基酸的功能性短肽序列的嵌合蛋白质的条件下培养步骤(2)的被转化的宿主细胞；

(4)收获并纯化所表达的融合毒素蛋白。

本发明的再一个目的是提供含有如上限定的融合毒素及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

本发明的再一个目的是提供如上限定的融合毒素蛋白质在生产免疫抑制药物中的应用。

本发明的再一个目的是提供如上限定的融合毒素蛋白质在生产抗肿瘤药物中的应用。

附图说明

图1显示用于表达IL10_23-57-PE40融合毒素蛋白质的重组表达质粒pET-28a-IL10_23-57-PE40和pET-26b-IL10_23-57-PE40的构建。

图2显示编码IL10_23-57-PE40蛋白质的DNA序列的重叠PCR扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳图谱。其中泳道1是编码IL10_23-57-PE40融合毒素蛋白质的DNA条带；泳道2是DNA分子量标志物。

图3A和B分别显示IL10_23-57-PE40融合毒素蛋白质表达产物的SDS-PAGE分析。其中泳道1是包含表达质粒pET-26b-IL10_23-57-PE40的重组体细胞大肠杆菌BL21(λDE3)pLysS的周质部分；泳道2是包含表达质粒pET-28a-IL10_23-57-PE40的重组体大肠杆菌BL21(λDE3)pLysS的周质部分；泳道3是不携带外来质粒的宿主细胞BL21(λDE3)pLysS的溶胞产物；泳道4是蛋白质分子量标志物；泳道5是包含表达质粒pET-28a-IL10_23-57-PE40的重组体大肠杆菌Rosetta blue(λDE3)的沉淀部分；泳道6是包含表达质粒pET-26b-IL10_23-57-PE40的重组体大肠杆菌Rosetta blue(λDE3)的全菌部分；泳道7是包含表达质粒pET-28a-IL10_23-57-PE-40的重组体细胞Rosetta blue(λDE3)的全菌部分；泳道8是不携带外来质粒的大肠杆菌宿主细胞Rosetta blue(λDE3)的全菌部分。

图4显示纯化的重组质粒pET-28a-IL10_23-57-PE40之表达产物的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。

图5显示本发明的IL10_23-57-PE40融合毒素对表达IL10受体的RAW264.7细胞的特异性杀伤活性。其中1是对照组，2是融合毒素组。

图6显示本发明的IL10_23-57-PE40融合毒素对RAW264.7细胞的半数抑制浓度(IC50)。

发明的具体内容

本发明涉及由毒素分子和导向分子组成的融合毒素蛋白质。更具体地说，本发明涉及由作为细胞毒性剂部分的绿脓杆菌外毒素和作为导向部分的白细胞介素10的受体结合肽组成的融合毒素蛋白质。本发明进一步涉及所说的融合毒素作为免疫抑制剂或在生产免疫抑制药物中的应用。

根据本发明的一个优选实施方案，用作融合蛋白质中的毒素可以是细菌或植物毒素，例如假单胞菌(即绿脓杆菌，PE)外毒素、白喉毒素、霍乱毒素、葡萄球菌内毒素，以及蓖麻毒素和相思豆素等。然而，本发明中特别优选的细胞杀伤性毒素是绿脓杆菌外毒素A(PEA)。

如众所周知，绿脓杆菌外毒素A(PEA)分子是由613个氨基酸组成的单链多肽。PEA的完整分子包括具有受体结合功能的I区、具有跨膜功能的II区，以及指导毒素分子进入靶细胞内质网从而杀伤靶细胞的功能性区域III。毒素分子与细胞表面受体结合后，通过受体介导的内吞作用进入细胞腔隙，然后向胞液内释放出具有酶促活性的毒素片段。该片段催化延长因子2(EF-2)的NAD⁺依赖性ADP核糖基化，导致细胞蛋白质合成抑制和细胞死亡。由于PEA的区域I带有真核细胞受体结合区以及有利于穿过胞浆膜递送功能性片段的序列，所以可以使用DNA重组技术，以各种细胞因子(例如IL2、IL10)和生长因子(如EGF、TGF)取代天然绿脓杆菌外毒素的受体结合区，从而产生对携带特异性受体分子的真核细胞具有选择性细胞毒作用的融合毒素。

根据本发明的另一个优选实施方案，用作融合毒素中的导向剂可以是单克隆抗体、生长因子、细胞因子、短肽激素和可溶性受体。为本发明的目的，其中优选的是细胞因子，特别是白细胞介素10。

根据本发明的一个特别优选的实施方案，构成本发明的融合毒素的导向部分是包括白细胞介素10第23至第57位氨基酸的具有高受体结合活性的功能性肽片段(简称IL10_23-57)。并且毒素部分是绿脓杆菌外毒素A的去除了受体结合区的其余部分(简称PE40)。

白细胞介素10(IL10)是一种由单核细胞/巨嗜细胞、T和B细胞、天然杀伤细胞产生的，作用于各种免疫细胞并具有细胞因子合成抑制活性的细胞因子。IL10作用于树突状细胞(DC)，通过诱导抗炎性T细胞群体或抑制“炎性诱导DC”发挥抑制Th1炎性反应的作用。IL10强烈抑制CD4+T细胞和T细胞克隆的增殖和细胞因子产生。IL10提高MHC II类抗原的表达、延长静止B细胞的存活。特别是，已有证据表明，IL10在外周自身抗原和黏膜抗原耐受以及抑制或消除自身免疫反应中具有重要作用。另外，有研究发现，某些肿瘤可以有IL10的过度表达，并可能抑制抗肿瘤免疫反应。IL10也可能是由参与抗肿瘤反应的活化细胞产生的，因此IL10的过表达有可能作为免疫抑制或炎性反应以及肿瘤恶化程度的指征。由于IL10对靶细胞特别是免疫系统的这些生物学活性，因此有可能使用IL10或其受体拮抗剂作为一种免疫抑制剂，用于预防和治疗系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮症、类风湿性关节炎(RA)、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、、肾小球肾炎、哮喘、过敏反应、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、H1V感染(爱滋病)、移植物抗宿主疾病(GvHD)等免疫系统疾病。

由于IL10-R主要分布在单核-巨嗜细胞、B淋巴细胞和CD4⁺Th1细胞表面(200-300个/细胞)，并且受体结合常数(Kd)高达10^-10M(Siegall CB andFitzGErald.，The Jounal of Biological Chemistry，1990，265(27)163 18-23)，因此有理由使用IL10可以作为PE40受体结合区，构建重组融合毒素。然而，已知IL-10在大肠杆菌中通常是以包涵体形式表达的(Josephson R et al，The Jounal ofBiological Chemistry，2000，275(18)：13553-57)，而且如果与PE40融合表达，表达产物形成包涵体的可能性更大。另外，已知IL-10与受体的结合位点主要集中在分子的23-57位氨基酸，而且结合常数(Kd值)在1×10^-8M以上(ReinekeAV.，Protein Science，1998，951-960)。因此，本发明人试图使用IL10的该功能性片段(IL-10_23-57)取代完整的IL-10分子，设计并构建IL-10_23-57-PE40重组毒素蛋白质。

为了确保融合毒素分子具有并发挥良好的生物学活性，选择有适当长度、对靶细胞有稳定的特异结合性的导向剂是十分必要的。基于overlaping peptide scans分析发现，H-10与受体的结合位点主要集中在第23-57位氨基酸，并且结合常数Kd值高达1×10^-8M以上。所以，在使用原核细胞表达系统的情况下，我们选择证实有高受体结合活性的IL10的35肽(IL10_23-57)代替完整的IL10分子作为导向部分构建本发明的融合毒素。

用于构建本发明的融合蛋白质的PEA分子可以是天然PEA分子，但也可以是缺失了受体结合区(Ia区)的PE40分子。例如，这样经过修饰的PE40分子可以是其中1～4个半胱氨酸(Cys²⁶⁵、Cys²⁸⁷、Cys³⁷²和Cys³⁷⁹)被删除或被其他氨基酸如丙氨酸取代的PE40(参见欧洲专利0383599和美国专利5,621,078)，具有氨基酸280～364和381～613(缺失II区中氨基术端的1～28位氨基酸)，并且287位的半胱氨酸被丝氨酸取代的重组PE40分子(参见美国专利5,821,238)，以及可分别在PEA分子羧基末端的氨基酸600-613之间插入第一个识别分子，并在PEA分子的氨基末端连接第二个识别分子的重组假单胞菌外毒素(参见美国专利5,705,163)。此外，可以使用本领域技术人员熟知的位点特异性诱变技术或其他技术进一步修饰PEA分子。当然，这些修饰的前提是没有实质上改变由PEA分子提供的功能特性，特别是靶细胞杀伤活性。

由于作为本发明重组免疫毒素中导向剂的IL10功能性短肽的分子量相对较小(35肽)，所以可使用DNA合成仪在1000A固相载体上合成单个或两分子串联的编码这些短肽的核苷酸序列。为了便于与游离的或携带于特定重组载体上的PE40编码序列连接，可在合成的短肽基因序列的5’和/或3’端引入适当的核酸内切酶(如NcoI、NdeI)酶切位点，并造成适于连接的粘性末端。可按照本领域技术人员已知的重组技术(例如参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor laboratory，1989)，克隆编码这些短肽的基因(或以其cDNA或基因组DNA形式)，并在相当于已被删除的Ia区的位置或在III区内的适当酶切位点处将其连接到线性化的携带PE40的载体中如pET-28a-PE40(Chandhary et al.，PNAS USA 84：4538-4542，1987)或pET-26b-PE40(Novagen Co.)中。然后，可将如此得到的重组载体系统转化到原核细胞如大肠杆菌细胞中以生产IL10_23-57-PE40融合蛋白质。DNA重组操作中，可使用标准的重叠PCR扩增技术扩增所需的基因片段并造成适当的酶切位点。可使用限制性酶切法鉴定序列连接方向的正确性和可能的突变，最后以Sanger双脱氧链终止法进行序列测定以进一步证实之。

当然，也可以借助适当的化学偶联基团，用已知的化学方法将两个部分(导向剂和效应物)结合在一起。例如可使用SPDP(N-琥珀酰亚胺-3-2-吡啶二硫代)-丙磺酯、戊二醛、马来酰亚氨基苯甲酰-N-琥珀酰胺酯、亚氨基硫烷等携带功能性基团的异双功能交联剂作为连接IL10和PE40分子的“接头”。

这里应特别指出的是，由于相对于细胞毒性部分PE40来说，导向部分IL10_23-57的分子量较小，所以由两者产生的融合蛋白质中的PE40部分很可能形成新的二级空间构象，导致PE40部分对IL10_23-57的卷曲，影响融合蛋白质的受体结合能力。特别在没有对PEA分子中的半胱氨酸残基进行取代删除修饰的情况下，这种可能性更大。所以，为增加这些导向分子与靶细胞受体的结合几率和结合稳定性，也可以以头-尾串联的两个短肽分子作为融合毒素中的导向部分。

可以将作为导向剂或受体结合剂的小分子短肽插入到天然PEA分子的Ia区的位置上(参见Heimbrook et al.，PNAS USA 87：4697-4701，1990)，或插入到PEA分子羧基末端氨基酸605～613的区域。

可在大肠杆菌或其他原核细胞中表达包括PEA分子和IL10_23-57的融合蛋白质。重组蛋白质基因将被可操纵地连接到适当的表达控制序列上，如连接到适于在大肠杆菌中使用的T₇、trp或λ启动子、核糖体结合位点及转录终止信号上。可使用已知的转化方法，如适于原核细胞的氯化钙处理法或适于哺乳动物细胞的电穿孔法将本发明的重组质粒转化到选择的宿主细胞中。可基于质粒上所含抗生素抗性基因所赋予的抗生素抗性来选择被转化的阳性细胞。一旦表达了所需的融合蛋白质，即可按照本领域已知的方法分离并纯化该融合蛋白质。例如，可从发酵培养物中离心收集菌体细胞并用溶菌酶或盐酸胍裂解之，然后超速离心并在低浓度磷酸盐(约20mM)溶液中反复透析。再次离心除去不溶物后，可使用盐析、离子交换层析、亲合层析及制备性凝胶电泳等方法进行纯化(参见R.Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，N，Y.，1982)。本发明中优选的纯化方法包括但不只限于饱和硫酸铵盐析、阴离子交换层析和铜离子螯合层析。

一般说来，可使用聚丙烯酰胺凝胶以SDS-PAGE电泳法(Laemmli，Nature227：680-689，1970)分析各柱层析洗脱部分，并使用多克隆兔抗PE抗血清和Vectastain试剂盒(Vector Labs，Buvlingame，Calif.)以免疫印迹法监测蛋白质纯化过程。对重组融合蛋白质纯化产物进行蛋白质合成抑制试验(Prior et al.，Cell64：1017-1029，1991)，以检测融合蛋白质的细胞毒性(ID₅₀)。对于IL10_23-57-PE40融合蛋白质，主要是检测其对某些正常或恶变的免疫系统靶细胞的体外杀伤活性，以及用³H标记的亮氨酸掺入法检测融合蛋白对靶细胞的蛋白质合成抑制作用。另外，可按Colliev和Kondel所述的方法(J.Biol.Chem.246：1496-1503，1971)，使用富含延伸因子2的麦胚提取物检测蛋白质样品的ADP-核糖基化活性。

为了完成本发明，可以使用本领域技术人员已知的基因融合技术制备本发明的嵌合毒素蛋白质。为此，可按照已知的DNA重组技术(如参见Sambrook etal.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)完成各种DNA操作。例如，首先使用根据IL-10_23-57氨基酸序列设计并合成寡核苷酸引物(P)1-5(SEQ ID NO：1-5)。经四次套式聚合酶链反应得到所需的IL-10_23-57基因扩增产物。PCR产物经用NcoI和NdeI双酶切后，在DNA连接酶的存在下，分别连接到用同样酶切割的携带PE40编码序列的质粒pET-28a(+)-PE40和pET-26b(+)-PE40(Novagen公司)中，得到携带IL-10_23-57编码序列的重组的重组表达质粒pET-28a-IL10_23-57-PE40和pET-26b-IL10_23-57-PE40(参见附图1和实施例1)。

可使用核酸内切酶消化法和DNA序列分析法鉴定所得到的质粒DNA序列的正确性。然后用如上得到的重组表达载体转化适当的宿主细胞如大肠杆菌细胞，并在适当的条件下培养被转化的细胞，以产生所需的融合毒素蛋白质。

可使用盐析、超滤、离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法从细胞的溶胞产物及培养基中分离并纯化所需的蛋白质表达产物。由于本发明融合毒素产物是以细胞周质内分泌和可溶形式产生的，所以优选的纯化方法是饱和硫酸铵盐析、阴离子交换层析和铜离子螯合层析(参见实施例2)。

在产物的分离和纯化过程步骤中，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和酶联免疫吸附法(ELISA)或Western印迹法监测产物的存在及其分子大小。ELISA或Western印迹分析中，使用兔抗人促黄体素释放激素(LHRH)-PE40血清为第一抗体，并以辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔免疫球蛋白(Ig)为第二抗体。

同时，使用上述同样方法构建和制备以完整IL10分子为导向部分的融合毒素蛋白质，用于继后的生物学活性比较实验，借以判断本发明使用IL10_23-57代替IL10-PE40完整的IL10分子制备IL10_23-57-PE40融合毒素蛋白质的可行性。

可使用文献中已公开的各种检测方法鉴定本发明的IL10_23-57-PE40融合蛋白质的性质及生物学活性。这些方法包括(1)ADP糖基化试验，该方法是根据IL10_23-57-PE40催化延伸因子2(EF-2)的ADP核糖基化的能力检测其对哺乳动物细胞蛋白质合成的抑制作用；(2)受体结合试验，该方法是根据IL10_23-57-PE40竞争性置换与A431细胞浆膜结合之¹²⁵I-IL10_23-57的能力检测其特异性受体结合活性；(3)MTT细胞存活率试验，该方法是根据活细胞将MTT转化成兰紫色甲瓒结晶体的能力检测靶细胞与IL10_23-57-PE40接触后的存活性；(4)细胞蛋白质合成抑制试验，该方法是根据活的靶细胞在蛋白质合成过程中摄入[³H]-亮氨酸的能力检测IL10_23-57-PE40抑制细胞蛋白质合成的细胞毒活性；(5)靶细胞生长抑制试验，该方法是根据IL10_23-57-PE40对高表达IL10受体的免疫细胞的生长抑制作用判定融合毒素的特异性细胞杀伤活性(附图5和6)；(6)免疫系统疾病模型动物治疗实验，该方法是根据IL10_23-57-PE40对肾小球肾炎模型大鼠的保护作用判断该重组毒素的抗自身免疫反应活性(参见实施例3和4)。

我们的研究结果表明，使用上述IL10_23-57片段与PE40融合得到的融合毒素，不仅显著地提高了产物在原核系统中表达效率，而且还改善了分子内折迭、提高了细胞表面受体结合能力以及毒素分子的细胞内在化能力，从而大大提高了嵌合毒素的产率和靶细胞特异性细胞毒活性。

本发明进一步涉及含有上述融合毒素和至少一种医药上可接受的惰性载体或赋形剂的药物组合物。可按照制药工业领域已知的基本原则和方法制备适于胃肠道外途径给药的药物组合物(如参见Remington’s Pharmaceutical Science，15thed.，Mack Publishing Company，1980)。可通过各种给药途径，特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔内、鼻内、皮内、皮下等胃肠道外途径投用本发明的药物组合物。

如前所述，可使用本发明的融合毒素或含有该融合毒素蛋白质的药物组合物作为免疫抑制剂，用于治疗可依赖该蛋白质的毒性作用得以缓解或消除的特定类型人体细胞的各种疾病。一种优选的用途是用于治疗其表面上过度表达IL10-R之细胞相关的疾病，特别是系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮症、类风湿性关节炎(RA)、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、肾小球肾炎、哮喘、过敏反应、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、HIV感染(爱滋病)、移植物抗宿主疾病(GvHD)，以及恶性肿瘤等免疫系统功能障碍导致的疾病。本发明的融合毒素或含有该融合毒素的药物组合物的治疗有效剂量一般应根据疾病的性质、严重程度、病人的一般状况及其对药物的敏感性，以及给药途径等因素由临床医生按照个体化原则来确定。

发明的最佳实施方式

下列借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。

实施例1：重组质粒pET-28a-IL10_23-57-PE40或pET-26b-IL10_23-57-PE40的构建

本实施例举例描述用于表达本发明IL10_23-57-PE40融合毒素的重组表达质粒pET-28a-IL10_23-57-PE40或pET-26b-IL10_23-57-PE40的构建策略和基本方法(参见附图1)。

首先，使用适当的引物以RT-PCR方法从绿脓杆菌总DNA扩增得到绿脓杆菌毒素A全基因，并将其克隆到质粒载体pGEM-T(Novagen)中。然后，使用合成的寡核苷酸引物1：P1：5-CATGCCATGGGTCTGCGTGATCTGCGTGATGCTTTTTCTCGTGTAAAAACTTTCTTC-3(含有NcoI酶切位点)(SEQ IDNO：1)；P2：3-TTTTGAAAGAAGGTCTACTTTCTAGTCGACCTATTGGACGACGACTTTCTTAGAGACGAC-5(SEQ ID NO：2)；P3：5-CTGCTGAAAGAATCTCTGCTGGAAGATTTCAAACATATGGCCGAAGAGGGCGGCAGC-3(含有NdeI酶切位点，酶切位点后面的为与PE40互补的18bp)(SEQ ID NO：3)；P4：5-CATGCCATGGGTCTGC-3(SEQ ID NO：4)；以及P5：5-GCTGCCGCCCTCTT-3(SEQ ID NO：5)。

使用重叠PCR方法扩增得到编码IL-10_23-57的DNA片段。(1)PCR反应1：以P1与P2互为模板，94℃预变性45秒，68℃延伸60秒，共10个循环后得到扩增产物A；(2)PCR反应2：以P4与P3互为模板，94℃预变性45秒，68℃延伸60秒，10个循环后得到扩增产物B；(3)PCR反应3：以上述产物A与B互为模板，94℃预变性45秒，68℃延伸60秒，10个循环后得产物C；(4)PCR反应4：以C为模板并以P4和P5为扩增引物，按94℃预变性45秒，50.4℃退火45秒和72℃延伸60秒的程序，经30个循环后所得所需的扩增产物IL-10_23-57编码序列(参见附图2)。

经1％琼脂糖凝胶电泳回收并以酶切法鉴定后，用核酸内切酶NcoI和NdeI双酶切，并在T4 DNA连接酶存在下将此片段连接到已用同样内切酶切割的携带PE40基因片段的重组质粒pET-28a(+)(Novagen)中，从而得到重组表达质粒pET-28a-IL10_23-57-PE40，其中融合毒素IL10_23-57-PE40具有下列SEQ ID NO：6所示的核苷酸编码序列。用所得到的连接混合物转化感受态大肠杆菌JM105细胞(Promega)，以大量制备质粒DNA。然后筛选阳性克隆并以DNA测序法鉴定之。按同样方法制备IL10_23-57-PE40重组DNA编码序列并与载体pET-26b(+)(Novagen)连接，得到重组表达载体pET-26b-IL10_23-57-PE40，其中融合毒素IL10_23-57-PE40具有下列SEQ ID NO：6所示的核苷酸编码序列。

可用所得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(λDE3)PLysS，培养后挑选单个菌落提取质粒DNA，并进一步使用PCR方法鉴定之。

实施例2：IL10_23-57-PE40融合蛋白质的表达、纯化及鉴定

本实施例举例描述本发明的IL10_23-57-PE40融合毒素蛋白质在大肠杆菌宿主细胞中的诱导表达，以及表达产物的分离纯化及鉴定。

用实施例1中制得的重组质粒pET-28a-IL10_23-57-PE40或pET-26b-IL10_23-57-PE40分别转化感受态大肠杆菌BL21(λDE3)PlysS或Rosetta blue(λDE3)菌株(Novagen Co.)，并按常规方法37℃培养被转化的细胞。当OD₆₀₀nm＝0.6时，降低培养温度至32℃并向培养物中加IPTG以诱导表达。诱导过程中，以SDS-PAGE电泳法监测蛋白质表达产物。诱导3小时后，SDS-PAGE分析显示，表达产物中存在一条分子量约43KDa的条带(参见附图4)。

培养完成后，收集BL21(λDE3)PlysS菌体细胞并悬浮在10倍体积含有20mmol Tris-HCL和2 mmol EDTA的20％蔗糖溶液中，4℃放置10分钟后离心收集菌体。再用重蒸水悬浮菌体并于4℃放置10分钟，然后取上清液进行SDS-PAGE电泳分析。同时，收集Rosettablue(λDE3)菌体细胞，超声裂解后分别取上清和沉淀物进行SDS-PAGE电泳分析。分析结果表明，在重组体BL21(λDE3)PlysS细胞中，融合毒素以分泌形式被表达；在重组体Rosetta blue(λDE3)宿主细胞中，融合毒素则以胞内可溶形式被表达。

经SDS-PAGE分析后，将表达产物电转移到硝酸纤维素膜上并进行Western印迹分析。Western印迹分析中所使用的第一抗体是曲本室保存的抗LHRH-PE40抗血清，第二抗体是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗血清(HRP-IgG)，显色剂是市售的DAB(二硝基苯)。结果显示，在相当于IL10_23-57-PE40融合蛋白质的位置上出现一条明显的杂交带(参见附图3)。

然后用免疫印迹分析法和N术端氨基酸序列测定法(Sanger双脱氧末端终止法)鉴定表达产物。结果显示，本发明制备的IL10_23-57-PE40为分子量约43KDa，N末端15个氨基酸完全正确的融合蛋白质。

使用盐析、阴离子交换层析和铜离子螯合层析等方法纯化如上得到的融合蛋白质。重组体BL21(DE3)pLysS细胞周质成份经35％饱和硫酸铵盐析后，过预先用含0.75mol/L硫酸铵的缓冲液(20mmol/L Tris-Cl，2mmol/L EDTA，pH8.0)平衡的Octyl Sepharose 4 Fast Flow疏水层析柱，并依次用上述缓冲液、溶液A(20mmol/L Tris-Cl，2mmol/L EDTA，0.75mol/L硫酸铵pH8.0)和溶液B(20mmol/LTris-Cl，2mmol/L EDTA，10％甘油，pH8.0)进行梯度洗脱(流速5ml/分，时间60分钟)。洗脱后，收集各组分峰进行SDS-PAGE和细胞活性分析。然后，用起始缓冲液A(20mmol/L Tris-Cl，2mmol/L EDTA，pH7.5)平衡DEAE Sepharose4 Fast Flow阴离子交换层析柱，有活性的样品经脱盐(Sephardex G-25)后上样。依次用缓冲液A(20mmol/L Tris-Cl，2mmol/L EDTA，pH7.5)和B(20mmol/LTris-Cl，2mmol/L EDTA，1mol/LNaCl，pH7.5)梯度洗脱，然后收集各组分峰进行SDS-PAGE和细胞活性分析。最后，收集活性洗脱物，过预先用起始缓冲液A(PB50mmol/L，NaCL0.3mol/L，pH7.8)平衡的铜-螯合层析柱。依次用起始缓冲液A(PB 50mmol/L，NaCL0.15mol/L，pH7.8)和B(PB 50mmol/L，NaCL0.15mol/L，，咪唑0.2mol/L，pH7.8)梯度洗脱。洗脱后，收集各组分峰进行SDS-PAGE和细胞活性分析，并用紫外分光光度法测定蛋白浓度。

实施例3：IL10_23-57-PE40融合蛋白质的体外细胞毒活性试验

本实施例旨在试验本发明的嵌合毒素蛋白质对各种培养的小鼠免疫系统恶性靶细胞的体外细胞毒活性。实验中所使用的细胞系RAW264.7均可从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)或中国药品生物制品检定所购得。将细胞(2×10⁴/ml)接种于96孔微量培养板的各孔中(0.2ml/孔)并按常规方法37℃培养12小时后，向各孔内加入不同浓度的IL10_23-57-PE40或对照样品IL10-PE40(0.01ml)。继续保温12小时后，于高倍(倒置)显微镜下观察处理后的靶细胞的形态并向各实验和对照孔中加入XTT染色剂(100μl)，37℃继续保温4小时。保温后，于490nm波长下使用ELISA检测仪测定吸光值，并计算重组毒素对各种靶细胞的50％蛋白质合成抑制浓度。结果可见，以未加任何样品组为空白对照，经ELISA反应后，测得加入纯化样品组的OD平均值为0.9，加入空白BL21(DE3)pLysS菌体周质的过滤除菌液组的OD平均值为0.07。这些结果表明，本发明的融合毒素IL-10_23-57-PE40可结合在RAW264.7单核-巨噬瘤细胞的表面上。另外，本发明的融合毒素IL-10_23-57-PE40对RAW264.7单核-巨噬瘤细胞致死作用十分明显，对SP2/0骨髓细胞和T淋巴细胞的杀伤作用次之，Hut-78和B淋巴细胞的作用较差.，空白BL21(DE3)pLysS菌体周质的过滤除菌液对RAW264.7、T细胞、B细胞、Hut-78和SP2/0均无影响(附图5)。XTT法计算重组毒素对RAW264.7的IC50剂量为13.9pmol/L(附图6)。

同时，向另外的各实验个对照组小孔内加入[³H]-亮氨酸(0.5μCi/孔)并保温过夜。快速冻融细胞后将细胞收集到滤膜上，然后通过β计数检测掺入到细胞内的放射活性(参见表1)。

表1.[³H]掺入法检测的完整IL10-PE40和 IL10_23-57-PE40对不同靶细胞的体外细胞毒作用

细胞系	来源	IC<sub>50</sub>(μg/ml)完整的IL10-PE40	IL10<sub>23-57</sub>-PE40
				Hut-78B细胞SP2/0T细胞RAW264.7		2.341.360.880.650.98	2.871.431.761.041.23

由上述结果可以看出，纯化的融合毒素蛋白质可显著地抑制各种恶性和正常免疫系统细胞系的蛋白质合成，从而发挥其细胞毒活性。另外，使用由完整的IL10分子与PE40偶联得到的IL10-PE40融合毒素，与本发明的由IL10功能性短肽与PE40偶联得到的IL10_23-57-PE40融合毒素的比较实验结果表明，本发明的IL10_23-57-PE40融合毒素的ID₅₀值几乎接近与对照组IL10-PE40融合毒素，表明本发明的方法是完全成功的。

实施例4：IL10_23-57-PEA0融合蛋白质对大鼠肾小球肾炎的治疗作用

本实施例旨在观察本发明的融合毒素对抗基底膜抗体诱导的大鼠肾小球肾炎的治疗作用。

(1)兔抗大鼠肾小球基底膜抗血清的制备：以常规方法将大鼠(体重250克)肾脏皮质制成匀浆，金属网过滤后收集肾小球。离心并超声破碎得到基底膜部分，经胰酶消化并冻干后用作抗原。然后，将如此得到的肾小球基底膜抗原(1mg)溶解于盐水(0.5ml)中，加完全佛氏佐剂乳化后按每周一次经皮下免疫家兔.。第7周检测被免疫动物的被动皮肤过敏反应，证实动物确实产生了抗基底膜抗体后，颈动脉放血处死家兔。然后分离血清，加热灭活补体后将抗血清于-20℃下保存备用。

(2)大鼠肾小球肾炎的诱导和实验治疗：分别给20只雄性SD大鼠(平均体重约310克)尾静脉内注射如上得到的兔抗大鼠肾小球基底膜抗血清(0.5ml)。次日，继续皮下注射含γ球蛋白的生理盐水与等体积完全佛氏佐剂的乳化混合物(0.5ml)，以造成大鼠肾小球肾炎动物模型。

给大鼠投用抗基底膜抗血清后5天，将动物分为4组，每组5只。两个实验组动物分别皮下接受20和5μg本发明的融合蛋白质(溶于生理盐水)，阳性对照组接受10μg IL-10-PE40，阴性对照组接受等体积(1ml)的生理盐水溶液。各组动物连续用药10天后，收集动物尿液。然后处死动物，收集血液，同时解剖动物并分离肾脏和胸腺组织，以进行免疫化学和组织病理学分析。

(3)实验结果：我们初步结果表明：肾小球肾炎模型动物(大鼠)经使用本发明的融合毒素IL-10_23-57-PE40后，尿蛋白和玻璃管型明显少于阴性对照组；血浆纤维蛋白原含量和胸腺组织/体重比例则明显高于阴性对照组。而且，与阴性对照组相比，可见大剂量实验组动物的肾小球细胞明显增生。

实施例5：IL10_23-57-PE40融合蛋白质对培养的肿瘤细胞生长的抑制活性

本实施例旨在使用观察本发明的融合毒素对体外培养的肿瘤细胞生长的抑制作用。

按照Prior等人(Cell 64：1017～1023，1991)所述的方法检测本发明的IL10_23-57-PE40融合蛋白质对选择的肿瘤细胞或正常细胞系的蛋白质合成的抑制作用。实验中所使用的靶细胞是子宫颈癌HeLa细胞和结肠癌HCT-8细胞等肿瘤细胞，并使用小牛睾丸细胞和人乳腺细胞的原代培养物作为正常细胞对照。

按每孔2×10⁴个细胞将各种被试细胞接种在96孔微量培养板中，在5％CO₂环境下37℃保温24小时后，向各孔中加入不同浓度的IL10_23-57-PE40和作为阳性对照样品的IL10-PE40，以及作为阴性对照样品的含牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液(BSA-PBS)。所有被试样品均稀释到0.2％牛血清白蛋白-磷酸盐缓冲盐(BSA-PBS)中。37℃保温24小时后，加入[³H]-亮氨酸(Amersham，Corp)(2μCi/孔)继续保温12小时。低温冷冻并快速融解后将细胞收获到玻璃纤维滤膜上，然后用β计数器检测掺入到细胞内的放射活性。以占没有接触毒素蛋白质而只加BSA-PBS的对照细胞的百分掺入量表示的结果如图4中所示。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所

<120>新的融合毒素蛋白质及其应用

<141>

<160>7

<210>1

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的带有附加酶切位点的引物序列。

<400>1

CATGCCATGGGTCTGCGTGA TCTGCGTGAT GCTTTTCTCGTGTAAAAACTTTCTTC

<210>2

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物序列。

<400>2

TTTTGAAAGA AGGTCTACTT TCTAGTCGAC CTATTGGACG ACGACTTTCT

TAGAGACGAC

<210>3

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的带有附加酶切位点的引物序列。

<400>3

CTGCTGAAAG AATCTCTGCT GGAAGATTTC AAACATATGG CCGAAGAGGG

CGGCAGC

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物序列。

<400>4

CATGCCATGG GTCTGC

<210>5

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物序列。

<400>5

GCTGCCGCCC TCTT

<210>6

<211>1209

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的IL10_23-57-PE40编码序列。

<400>6

GGTCTGCGTG ATCTGCGTGA TGCTTTTTCT CGTGTAAAAA CTTTCTTCCA

GATGAAAGAT CAGCTGGATA ACCTGCTGCT GAAAGAATCT CTGCTGGAAG

ATTTCAAACA TATGGCCGAA GAGGGCGGCA GCCTGGCCGC GCTGACCGCG

CACCAGGCTT GCCACCTGCC GCTGGAGACT TTCACCCGTC ATCGCCAGCC

GCGCGGCTGG GAACAACTGG AGCAGTGCGG CTATCCGGTG CAGCGGCTGG

TCGCCCTCTA CCTGGCGGCG CGGCTGTCGT GGAACCAGGT CGACCAGGTG

ATCCGCAACG CCCTGGCCAG CCCCGGCAGC GGCGGCGACC TGGGCGAAGC

GATCCGCGAG CAGCCGGAGC AGGCCCGTCT GGCCCTGACC CTGGCCGCCG

CCGAGAGCGA GCGCTTCGTC CGGCAGGGCA CCGGCAACGA CGAGGCCGGC

GCGGCCAACG CCGACGTGGT GAGCCTGACC TGCCCGGTCG CCGCCGGTGA

ATGCGCGGGC CCGGCGGACA GCGGCGACGC CCTGCTGGAG CGCAACTATC

CCACTGGCGC GGAGTTCCTC GGCGACGGCG GCGACGTCAG CTTCAGCACC

CGCGGCACGC AGAACTGGAC GGTGGAGCGG CTGCTCCAGG CGCACCGCCA

ACTGGAGGAG CGCGGCTATG TGTTCGTCGG CTACCACGGC ACCTTCCTCG

AAGCGGCGCA AAGCATCGTC TTCGGCGGGG TGCGCGCGCG CAGCCAGGAC

CTCGACGCGA TCTGGCGCGG TTTCTATATC GCCGGCGATC CGGCGCTGGC

CTACGGCTAC GCCCAGGACC AGGAACCCGA CGCACGCGGC CGGATCCGCA

ACGGTGCCCT GCTGCGGGTC TATGTGCCGC GCTCGAGCCT GCCGGGCTTC

TACCGCACCA GCCTGACCCT GGCCGCGCCG GAGGCGGCGG GCGAGGTCGA

ACGGCTGATC GGCCATCCGC TGCCGCTGCG CCTGGACGCC ATCACCGGCC

CCGAGGAGGA AGGCGGGCGC CTGGAGACCA TTCTCGGCTG GCCGCTGGCC

GAGCGCACCG TGGTGATTCC CTCGGCGATC CCCACCGACC CGCGCAACGT

CGGCGGCGAC CTCGACCCGT CCAGCATCCC CGACAAGGAA CAGGCGATCA

GCGCCCTGCC GGACTACGCC AGCCAGCCCG GCAAACCGCC GCGCGAGGAC

CTGAAGTAA

Claims (5)

1.由毒素部分和导向部分组成的融合毒素蛋白质，特征在于所说的导向部分是白细胞介素10分子第23至第57位氨基酸的35肽的IL10_23-57，并且毒素部分是绿脓杆菌外毒素A分子除去受体结合区的其余部分。

2.生产权利要求1限定的融合毒素蛋白质的方法，该方法包括：

(1)提供携带绿脓杆菌外毒素A分子除去受体结合区的其余部分与白细胞介素10的包括第23位至第57位氨基酸的功能性短肽序列之DNA编码序列的重组表达载体；

(2)用步骤(1)的重组载体转化适当的宿主细胞；

(3)在适于表达包括绿脓杆菌外毒素A分子除去受体结合区的其余部分与白细胞介素10的第23位至第57位氨基酸的功能性短肽序列的嵌合蛋白质的条件下培养步骤(2)的被转化的宿主细胞；

(4)收获并纯化所得到的融合毒素蛋白质。

3.含有如权利要求1限定的融合毒素蛋白质及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

4.如权利要求1限定的融合毒素蛋白质在生产免疫抑制药物中的应用。

5.如权利要求1限定的融合毒素蛋白质在生产抗肿瘤药物中的应用。

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