KR100537292B1 - 변이/키메라 초항원의 접합체 및 그 제약학적 조성물 - Google Patents

변이/키메라 초항원의 접합체 및 그 제약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 - 탐지 반분과 변이 초항원 간의 복합체에 관한 것으로서, 이 초항원은, T 세포의 소단위체를 활성화시키는 능력은 보유하면서 다른 아미노산 잔기로 대체된, TCR, 바람직하게는 TCR Vβ와의 결합을 결정하여 T 세포를 활성화시키는 초항원 부위(부위 I)의 아미노산 잔기인 야생형 초항원(SA I) 임을 특징으로 한다. 바람직한 실시형태에서 이 변이 초항원은 최소한 두 개의 야생형 초항원(SAⅠ, SAⅡ 등)간의 키메라로서, TCR 과의 결합을 결정하여 T 세포를 활성화시키는 부위내의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 다양한 야생형 초항원간에 교환시킨 것임을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 앞 단락에서 정의한 바와 같은 변이 / 키메라 초항원을 사용하는 치료방법에 관한 것이며, 이황화물 다리가 생성되지 않도록 이황화물 결합의 교환을 제공하는 시스테인 잔기를 바람직하게 세린 잔기로 돌연변이시킨, 약제로서 사용하기 위한 항체제제형에 관한 것이다.

Description

변이/키메라 초항원의 접합체 및 그 제약학적 조성물
본 발명은 초항원 기능은 보유하는 반면에 야생형 초항원(SA I)의 아미노산 잔기가 치환된, 기능상 활성인 변이 초항원의 접합체에 관한 것이다. 하나 또는 그 이상의 잔기(또는 그것의 보존적 아미노산 잔기)치환이 다른 야생형 초항원(SA II)에 상응하는 위치에서 일어날 경우에, 변이 초항원은 키메라(종종 하이브리드)라고 불린다. 따라서 키메라 초항원은 적어도 두 개의 상이한 야생형 초항원에서 유도된 일부 서열/영역을 포함할 것이다.
용어 "상응하는" 은 서로 치환되는 잔기, 일부 서열 및 영역이 초항원 I 및 II에서 기능상 동일한 위치를 가짐을 의미하는 것으로, 치환이 이루어지면 초항원으로서 작용할 수 있는 키메라 형태가 될 것이다.
용어 "이식된/이식술/이식편"은 하나의 아미노산이 치환되었다 할지라도 치환된 초항원 I의 상응 부분을 갖는 초항원 II의 전체 서열 부분과 관련하여 사용된다.
변이/키메라 초항원은 다른 방식으로 변이된, 예를들어 본 발명에 관계된 것 이외의 영역에서 아미노산을 치환함으로써 변이된, 반분(moiety)이 폴리펩티드/단백질인 경우에 융합된 형태도 포함하는 표적 - 탐지 반분에 접합되는 기능 초항원도 포함한다. 변이를 일으키는 순서는 다양할 것이다. 하기를 참조하라.
초항원
최초의 규정(1988 년 ～ 1993 년)에 따라, 초항원은 세포내 프로세싱 없이 MHC 제 2 급 항원에 결합할 수 있는 박테리아성 또는 바이러스성 단백질이며, T 세포 수용체(TCR)의 β-사슬 가변 영역(Vβ)에 결합함으로써 T 세포를 활성화시킨다. 결합으로 인해 T 세포의 상대적으로 큰 부분의 Vβ군 제한 활성 및 MHC 제 2 급 발현 세포의 용해(초항원 의존세포 - 중재 세포용해 = SDCC)가 유도된다.
상기 한정한 바에 따른, 널리 알려진 야생형 초항원은 포도상구균성 장독소(SEA, SEB, SEC1, SEC2, SED, SEE 및 SEH)이다. 다른 예로는 독성 쇽 증후군 독소 1(TSST-1, 역시 포도상구균 기원임), 박탈성 독소(Exft), 연쇄상구균 발열성 외독소 A, B 및 C(SPE A, B 및 C), 마우스 유암 바이러스 단백질(MMTV), 연쇄상구균성 M 단백질, 웰치균성 장독소(CPET), 마이코플라스마 관절염 초항원 등이 있다. 초항원과 그 특성에 관하여는 Kotzin 등의 1993 문헌을 참조하라.
90 년대 초반에, 초항원이 세포 표면 구조에 결합할 수 있는 표적 - 탐지 반분에 접합될 경우 활성화 및 그에 이은 세포 용해가 MHC 제 2 급 비의존 방식으로 발생할 수 있다는 것이 밝혀졌다(Dohlsten 등의 W09201470 및 Abrahmsen 등의 W09601650 참조). 표적 세포(표적 - 탐지 반분에 대한 표적 구조를 가지고 있음) 및 작동 세포(T 세포)를 접합체와 함께 항온할 때, 제 2 급 발현에 대한 요구 없이도 표적 세포가 용해된다(초항원 항체 의존 세포 - 중재 세포용해 = SADCC). 오늘날의 초항원 개념 및 본 발명과 관련하여 사용된 초항원 개념에 따라 달리 특정하지 않는 한, 세포 표면 구조(표적 구조) 및 하나 또는 그 이상의 다형성 TCR 사슬, 특히 Vβ 사슬에 결합함으로써 결합에 관계된 특정 TCR 사슬을 발현하는 T 세포의 부분을 활성화시킬 수 있는 모든 접합체가 포함된다. T 세포는 표면 구조(표적 구조, 표적 세포)를 가진 세포에 대해 세포독성이 된다. 일반적으로 활성화된 T 세포 부분은 각각의 총 T 세포량의 약 1 ～ 20 %를 차지한다.
돌연변이된 키메라 초항원을 이용한 구조 및 기능 연구
점돌연변이 형태를 포함한 키메라 초항원은 앞서 기술되어 있다 [Kappler 등의 W09314364, Kappler 등의 1992 ; Grossman 등의 1991 ; Hufnagle 등의 1991 ; Hartwig 등의 1993 ; Fraser 등의 1993 ; Mollick 등의 1993 ; Irwin 등의 1992 ; Hudson 등의 1993 ; 및 Blanco 등의 1990 참조]. Mollick 등과 Hudson 등은 SEA 및 SEE 의 Vβ 특이성이 카르복시 말단 영역에 존재하는 특정 아미노산 서열(즉, 아미노산 잔기 200, 206 및 207)에 존재함을 키메라 연구로부터 밝혔다. Mollik 등은 이 영역에 주로 의존하는 Vβ 특이성 외에도 Vβ8 을 향하는 SEE 이식편을 포함하는 SEA 의 SEE 유사 활성도 재구성을 완성하기 위해, SEE 로 부터의 N - 말단 70 개 아미노산 잔기를 함유하는 단편이 필요함을 밝혔다. 이 단편은 SEE - 유사 MHC 제 2 급 α 사슬 결합 영역의 일부 및 MHC 제 2 급 DR1 에 대한 SEA 의 결합을 SEE - 유사 방식으로 저해하는 SEE 로부터의 이 부분을 함유하는 키메라 SEA/SEE 분자를 포함한다.
TCRVβ에 대한 결합에 관련된 영역의 치환을 포함한 SEE - SEA 키메라에 대하여 최근에 기술되었다[Lamphaer 등의 J. Immunol. 156(1996, 3, 15) 2178 - 2185 참조]. T 세포와의 상호작용에 관련된 SEE 도메인을 상응하는 비 - 상동 SEA 도메인으로 치환한 SEE 초항원 Fab 항체 융합 단백질은 ABRF'96 에서 논의되었다 : 바이오몰레큘러 테크닉스, 미국 캘리포니아 샌프란시스코 홀리데이 인 골든 게이트웨이, 3, 20 - 4, 2, 1996 (Bj
Figure pct00001
rk 등의, M45 참조).
초항원의 치료학적 용도
비 - 접합 초항원은 추측컨대 면역계의 일반적인 활성화를 통해 이루어지는 치료 효과를 수반하는 치료를 위해 제안되어 왔다[Kalland 등의 W09104053 ; Terman 등의 W09110680 및 W09324136 ; Newall 등의 1991 참조].
그것은 또한 표적 - 탐지 반분에 접합되는 변이 초항원을 이용하기 위해 제안되어 왔다[Dohlsten 등의 W09201470 ; Abrahmsen 등의 W09601650 참조, 둘다 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 이것은 Vβ를 통한 T 세포 활성화의 광범위한 치료학적 이용을 가능하게 한다. 이제까지 연구한 접합체는 감소된 제 2 급 친화성을 가졌는데, 일반적으로 야생형 초항원과 관련된 심각한 전신 독성의 감소를 차례로 유도한다.
사이드 - 센턴시즈(side - sentences)의 Terman 등은 변이 초항원 및 초항원 단편을 이용한 암 치료를 제안하였다.
Kappler 등은 W09314634 에서 소실된 Vβ- 결합 또는 MHC 제 2 급 결합능력(백신과 관련하여 초항원의 독성 효과를 없애는)을 갖도록 돌연변이된 비 - 접합 초항원(SEB)을 이용한 것을 제안하였다. Abrahmsen 등은 W09601650 에서 제 2 급 항원에 결합하는 변이된, 바람직하게는 감소된 능력을 갖는 접합 초항원을 이용한 암 치료를 제안하였다. 변이는 단일 돌연변이 뿐만 아니라 상이한 초항원 간의 키메라 구조도 포함된다.
본 발명에 의해 해결해야 할 문제점
일반적으로 인체 개체군의 혈청은 초항원에 대해 높은 역가의 항체를 함유한다. 예를들어 포도상구균성 초항원의 경우에 상대적인 역가는 TSST - 1 > SEB > SEC1 > SE3 > SEC2 > SEA > SED > SEE 이다. 이들 상대적 역가는 SE 가 비경구적으로 투여될 경우 면역원성 문제 및 항체 약화에 대한 문제를 나타낸다. 오직 이러한 문제에 근거하면, SEE 는 바람직한 포도상구균성 초항원일 것이다. 그러나 융합 단백질에 대한 연구와 관련하여, 우리는 SEE 접합체의 T 세포 MHC 제 2 급 비의존 세포독성, 초항원 - 항체 의존 세포독성(SADCC)에 대한 능력이 부족함을 발견하였다. 또한 항 - SE 역가는 "높은 역가" 의 초항원을 보다 유사한 "낮은 역가" 초항원으로 변이시키는 데 유리함을 나타낸다.
본 발명의 목적
본 발명의 첫 번째 목적은 면역원성 및 약화된 항체와의 반응을 감소시키는 것에 관하여 앞서 공지된 초항원을 개량하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 약물로 사용할 때 부작용이 보다 적은 초항원을 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은, 암, 자가면역 질환, 바이러스 감염 또는 그 표면이 각각의 질환에 대해 특이한 MHC 제 2 급 항원 및/또는 구조를 발현하고 초항원 내로 결합되는 표적 - 탐지 반분에 결합하는 세포와 관련된 그외의 질환을 앓고 있는 포유동물 치료용 유효 성분으로 이용할 수 있는 개량된 초항원을 제공하는 것이다.
본 발명에 나타난 발견
SEA 및 SEE 의 서열 동질성 분석(도 2 참조)으로, 동일하지 않은 아미노산 잔기가 여덟 개의 다른 영역에 집중되어 있음이 나타난다. 서열의 34 % 를 차지하는 이들 여덟 영역 외에, 여전히 남아 있는 차이를 설명하는 보존적 아미노산 치환에도 불구하고, 두 SE 의 동일성은 97 % 이다. 이들 영역 중 넷은 구조상 두 MHC 제 2 급 결합 부위와 밀접하며(B : AA 37 - 50, D : 71 - 78, E : 136 - 149 및 G : 189 - 195), TCR 에 영향을 미치지는 않는 것 같다. 그 외의 네 영역(A : AA 20 - 27, C : 60 - 62, F : 161 - 176 및 H : 200 - 207)은 두 아도메인(subdomain) 간의 홈에 존재할 것으로 생각되는, TCR 결합 부위 부근의 분자 말단에 위치한다. 각각의 영역을 이식함으로써(상이한 아미노산 잔기의 치환), 세포독성 반응을 유도하는 SEA - 접합체의 특성 뿐만 아니라 MHC 제 2 급의 부재시에 강화되는 증식 반응이 SEA 의 TCR 결합 도메인내 한 영역에서 일어남을 알아내었다. 이 영역(A)은 SEE 에 전이될 수 있으며, 초항원의 Vβ 특이성에 미치는 영향이 제한된다 할지라도 제 2 급의 부재시 활성도에 큰 영향을 끼친다(도 6, 표 2 참조). 모든 영역(A, C, F 및 H)은 마우스 T - 세포 하이브리도마에 대한 가변적인 자극 효과에 의해 입증되는 TCR 과의 상호작용에 직접 또는 간접적으로 참여할 것이다.
작용의 구조유사적 양식에 기인하여, 이들 TCRVβ 결합 특성의 유사한 구조적 분리 또한 SEA 와 SEE 에 대한 초항원 구조유사성인 것으로 생각할 수 있다. 초항원의 다른 형태의 범위내에서 동일물을 이용할 수 있는데, 그것의 결합 구조는 다르게 구성되어 있다. 우리의 발견으로 치료제로서 매우 중요할 수 있는 키메라 초항원 구조의 윤곽을 밝힐 수 있게 되었다.
본 발명
본 발명의 첫 번째 양상은 치료학적 유효(면역 활성화)량의 변이된, 바람직하게는 키메라 초항원을 투여하여 면역 체계를 활성화시킴으로써 포유동물의 질병을 치료하기위한 제약학적 조성물에 관한 것이다. 바람직한 포유동물은 사람이다. 문제의 질병은 주로 초항원에 결합하는 표적 구조를 그 표면에 발현시키는 세포와 관련된 것이다. 표적 구조는 대부분의 경우에 정상적으로 초항원에 결합하는 TCR 에피토프와는 다르다. 또한 표적 구조에 대한 결합은 TCR 에 대한 결합 및 T 세포 활성화를 가능하게 한다. 실례로는 MHC 제 2 급 항원 및 질병의 진행과 관련된 세포 상에 발현되는 그외의 세포 표면 구조가 있다. 질병의 예에는 암종, 육종, 흑색종, 림프종 등과 같은 모든 형태의 암을 포함하는 악성 종양, 바이러스 감염, 기생충감염 및 자가면역 질환이 있다. 치료되는 암은 결장, 유방, 경부, 신장, 위, 소장, 십이지장, 전립선, 고환, 피부, 폐, 간, 이자, 골격 등에 위치하는 것과 각 부위로 전이되는 암도 포함된다. 또한 본 발명의 활성제는 소위 암의 다 - 약물 저해 형태로 가할 수 있다. 표적 구조를 발현하는 세포는 어떤 방법으로 치료되는 질병의 진전을 제어하거나 조절하는 세포일 수 있다.
본 방법의 특징은, 야생형 초항원(SA I) 내 다형성 TCR 사슬, 특히 TCRVβ를 거쳐 T 세포 부분에 결합하기 위해 제공되는 영역(영역 I)내 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를, 변이 초항원에 대한 초항원 활성도를 보유하는 각각의 아미노산 잔기로 치환시킨 변이 초항원을 사용하는 것이다. 현재 바람직한 실시형태는 제 1 야생형 초항원(SAI)의 영역(영역 I)내 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 제 2 야생형 초항원(SA Ⅱ)의 상응 영역(영역 Ⅱ) 내에서 상응하는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기로 치환한 키메라 초항원에 관한 것이다. 영역 Ⅰ 및 Ⅱ의 아미노산 서열은 다르다. 초항원 기능을 없애지 않으면서 Ⅰ및 Ⅱ를 서로 치환할 수 있도록 초항원 Ⅰ및 Ⅱ를 선택하였다. 이것과 관련하여, TCR 결합 및 T 세포 활성을 결정하는 다른 영역과 서로 치환될 때 기능상 활성인 초항원이 되기는 하나, 특정 영역 Ⅰ이 단독으로 다른 야생형 초항원의 상응 영역과 치환될 수는 없다는 사실을 설명해야 한다. 일반적으로 관련 영역은 특히 SEA 에 대한 구조유사성 초항원의 경우 20 개 미만의 잔기를 포함한다. 따라서 치환 아미노산 잔기는 치환 잔기와 다르며, 아마도 보존적 치환 및 TCRVβ에의 결합과 T 세포 부분의 활성화를 가능하게 하는, 기능상 활성인 변이 초항원을 유도하는 다른 아미노산 치환도 포함된다. 이것은 본 발명의 초항원이 가장 광범위한 의미로서, 앞에서 언급한 영역 내 하나 또는 그 이상의 아미노산을 기능상 치환한 모든 변이 초항원을 포함함을 의미한다.
용어 "보존적 치환" 은 아미노산 잔기를 화학적으로 유사한 잔기로 치환, 예를들어 소수성 잔기를 상이한 소수성 잔기로 치환하거나, 다르지만 유사한 하전 잔기 등으로 하전 잔기를 치환함을 의미한다.
우선일에는 초항원 Ⅰ, Ⅱ 등으로서 포도당구균성 장독소, 특히 아연과 결합한 것들이 바람직하였다. 즉 SEA, SEE, SED 및 SEH 관련 영역은 상기 언급한 기능 중 하나를 가질 것이다(표제 "본 발명에 나타난 발견" 및 실험 부분 참조) :
1. 그러한 초항원 활성도에 대한 효과 및 TCR 특이성, 특히 Vβ 특이성에 대한 제한적 효과. SEA - 형태의 초항원인 경우에 이것은 영역 A(아미노산 위치 20 - 27)를 의미한다.
2. Vβ 사슬과 같은 다형성 TCR 사슬에 대한 결합과 관계된 특이성에 대한 효과. SEA - 형태의 초항원인 경우에 이것은 영역 C(아미노산 위치 60 - 62), F(아미노산 위치 161 - 176) 및 H(아미노산 위치 200 - 207)를 의미한다.
SEA - 유사 초항원인 경우에 이것은 하나 또는 그 이상의 치환을 의미한다(SEA 에서 SEE 로 이식 ; SEE/A 키메라) :
영역 A : R20G, N21T, S24G, R27K
영역 C : G60D, P62S
영역 F : H161R, H164Q, G165E, F167Y, G168N, S174V, G176D
영역 H : D200G, P206S, D207N
우선일에는 각 영역에 대해 모든 치환을 실시하는 것이 바람직하였다. 다른 초항원의 경우에, 상응하는 위치/영역 간의 구조유사성 치환을 실시하는 것 또한 생각할 수 있었다.
통상적으로는 SEE 및 SED 같은 하나의 제 1 항원으로 부터 시작하여, 그것의 유일한 Vβ 결합 영역의 하나 또는 그 이상을 제 2 항원(예를들어, SEA)의 상응 영역으로 치환할 수 있다. 제 1 초항원에 대한 정상적인 인체 혈청 항체 역가가 제 2 초항원 보다 낮도록 제 1 및 제 2 초항원을 선택하는 것이 바람직하다. SEA 및 SEE 키메라의 경우, 최상의 형태는 키메라 SEE/A-A, SEE/A-AH, 및 SEA/E-BDEG 가 해당되며, SEE/A-A 가 가장 바람직하다.
영역 A, C, F 및 H 와 함께 다른 부분의 아미노산 잔기 역시 치환될 수 있다. 치환의 한 형태는, 이러한 특성이 초항원 치료[종양괴사 인자(TNF) 및 인터페론 - γ 의 전신 방출에 따른 일반적인 면역활성]에 따른 일반적인 부작용과 관련되기 때문에 제 2 급 결합능을 감소시킨다. SEA, SED 및 SEE 와 같은 초항원의 경우, 아연 이온과 결합하는 능력에 중요한 위치, 즉 위치 225 및 227을 치환하는 것이 바람직하다. 예를들어 SEA 돌연변이 H225A 및 특히 D227A 는 독성 부작용을 줄이는 데에 확실한 효과를 가질 것이다(Abrahmsen 등의 W09601650 및 Fraser 등의 1993 참조).
초항원이 그 기능을 잃지 않는 한 그 외의 치환, 예를들어 보존적 치환을 분자 전체에 걸쳐 특히 제 2 급 및 TCR 에 대한 결합과 관련된 바깥 영역에 실시할 수 있다. MHC 제 2 급 결합을 변환시키기 위한 DNA 서열의 치환 또는 DNA 수준에서의 그외의 치환을, TCR 에 결합하게 하는 영역의 치환 전 또는 후에 실시할 수 있다. 이러한 변이 형태는 한결같이 영역 1 의 아미노산 치환에 앞서 도입될 수 있다. 본 발명에 있어서, 청구범위에 따른 변이의 개시에 사용된 "야생형 초항원" 의 개념은 일차적으로 변이가 일어나기 전, 영역 1 바깥쪽 야생형 아미노산 서열을 말한다.
키메라 및 돌연변이 초항원의 구성은 본 분야에 공지된 기술에 따라 실시할 수 있다. 한 초항원에 대해 특이한 영역에서 부터 그와의 초항원내 상응 영역까지의 변경은 게놈 수준에서 이루어지며 바람직한 아미노산 서열에서 종료시킬 필요가 있는 특정 염기의 점돌연변이에 의해 또는 완전한 서열을 치환함으로써 실시할 수 있을 것이다. 예를들어 상기 인용된 선행 기술 문헌 및 실험 부분을 참조하라. 용어 "돌연변이" 는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 치환, 삽입 또는 결실시킴으로써 돌연변이될 단백질을 암호하는 DNA 서열을 변이시킴을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용된 초항원은 상기한 바와 같이 변이된 비접합 초항원, 즉 MHC 제 2 급 항원 및 TCR 을 경유하는 T 세포 부분 둘다에 결합하는 공지된 능력은 가지지만 표적 - 탐지 반분에 특이하게 결합하는 능력은 없는 변이 초항원일 수 있다. 더욱 바람직하게는 변이 초항원, 바람직하게 키메라 초항원은 표적 - 탐지 반분에 접합된다. 후자의 경우에 바람직한 변이체는 표적 - 탐지 반분 및 변이 초항원 사이에 융합된다. 이와 같은 접합체는 신규한 것이며, 본 발명의 개별적인 양상이다.
본 발명의 접합체의 구조는 일찍이 공지된 항체 - 초항원 접합체에 대해 구조유사적이다(Dohlsten 등의 W09201470 ; Abrahmsen 등의 WO9601650 참조, 둘다 본원에서 참고문헌으로 인용한 공개 문헌임). 즉, 합체는 종종 다음 식을 따른다 :
T - B - SA(m)
여기에서 T 는 표적 - 탐지 반분을, SA(m) 은 상기와 같이 변이된, 바람직하게는 키메라 초항원을 나타내며, B 는 T 와 SA(m) 을 결합시키는 공유결합 다리이다. 바람직한 접합체에 단 하나의 표적 - 탐지 반분 및 상기와 같이 하나의 변이된 초항원 반분이 존재하기는 하나, T 는 대체로 초항원 반분[SA(m)]을 더 포함하며, SA(m) 은 표적 - 탐지 반분을 더 포함할 수 있다.
T 는 원칙적으로 세포 표면 구조에 결합할 수 있는 모든 구조, 바람직하게는 질환 특이 구조일 수 있다. T 가 향하는 구조는 보통 (a) SA(m) 이 결합하는 Vβ 사슬 에피토프 및 (b) 초항원이 결합하는 MHC 제 2 급 에피토프와는 상이하다. 표적 - 탐지 반분은 우선 인터루킨(예를들어, 인터루킨 - 2), 호르몬, 항체의 항원 결합 단편을 포함한 항체, 성장 인자 등에서 선택된다. 예를들어 1993년 11월 7 - 11일 미국 노스캐롤라이나 애쉬빌에서 열린 "Molecular approaches to cancer Immunotherapy" 회의에서 Woodworth 등의 '시토킨 독소의 잠복기 및 임상성장' 을 참조하라.
우선일에는, T 가 C242 에피토프(Lindholm 등의 W09301303 참조) 또는 바람직하게 폐암 특이 5T4 항체(Stern 등의 W08907947 참조)에 대한 결합 에피토프를 향하는 항체 활성 단편(Fab 처럼)을 특히 강조한 항체[전체 길이 항체, Fab, F(ab)2, Fv, 단쇄 항체 및 그 외의 모든 항원 결합 항체 단편]인 것이 바람직하였다. 그러나 이것은 다른 암 특이 항체가 매우 동일하게 또는 더 많이 작용한다는 것을 배제하지 않는다. 용어 "항체" 는 단클론성 변이체 뿐만 아니라 다클론성 변이체를 포함하는데, 단클론성 제제가 바람직하다.
또한 T 는 질병의 진전을 조절하거나 제어하는 다소 건강한 세포상의 독특한 구조를 향할 것이다.
다리 B 는 앞서 기술한 바와 같이 선택할 것이다(Dohlsten 등의 W09201470 ; 및 Abrahmsen 등의 W09601650 참조). 즉, B 는 친수성을 갖는 것이 바람직할 것이며 아미드, 티오에테르, 이황화물 등에서 선택한 하나 또는 그 이상의 구조를 나타낸다. 가장 바람직한 다리는 재조합 기술에 의해 수득한 것, 즉 게놈 수준에서 발생시킨 접합체이다. 이러한 경우에, Gln, Ser, Gly, Glu, Pro, His 및 Arg 같은 친수성 아미노산을 포함하는 올리고펩티드 다리가 바람직하다. 특히 바람직한 다리는 매우 바람직한 3 - 7개 아미노산 잔기를 갖는 1 - 10 개의 아미노산 잔기로 구성된 펩티드 다리이다. 전형적인 다리는 서열 1 의 트리펩티드 GlyGlyPro 이다.
본 발명의 신규한 접합체의 제조는 대체로 주요한 두 경로에 따라 실시될 것이다 : 1. 재조합 기술 및 2. 상기 규정한 바와 같이 변이된, 바람직하게는 키메라 초항원에 대한 표적 - 탐지 반분 T 의 화학적 결합. 이들 방법은 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있으며 다수의 변이체가 포함된다.
표적 - 탐지 반분 T 에 대한 비 - 접합 변이 초항원의 화학적 결합은 종종 화합물내 많은 위치에 존재하는 작용기(예를들어, 1차 아미노기 또는 카르복시기)를 이용한다. 최종 산물은 헤테로 - 및 호모 - 접합체 뿐만 아니라 결합 위치와는 다른 접합체 분자의 혼합물을 함유할 것이다.
재조합 접합체(융합 단백질)의 경우, 수득한 접합체 물질은 결합 위치에 관하여서는 언제나 같을 것이다. 키메라 초항원의 아미노 말단은 표적 - 탐지 반분의 카르복시 말단에 결합하거나 그 역도 성립한다. 원래의 항체 및 항원 결합 단편(Fab, Fv, 단쇄 항체 등)과 같은 항체의 경우, 경쇄 또는 중쇄를 융합에 이용할 수 있다. 매우 우수한 결과를 제공하는 VH 및 VL 도메인 또는 경쇄에 결합하는 구조유사성을 배제함이 없이, 중쇄 사슬(CH1)의 제 1 불변 도메인에 대한 키메라 초항원의 아미노 말단의 결합 및 Fab 단편에 가장 우세한 것으로는 현재 재조합 접합체가 바람직하다. 본 발명의 변이 초항원(비-접합형 및 융합형)의 대규모 재조합 생산을 위해 주요 숙주 세포는 E.coli 이다. 이 숙주는 대체로 두 경로로 제공된다 : 세포내 생산 및 분비. 후자의 변이체는 그것이 페리플라스마와 배양 배지로부터 제대로 접힌 단백질의 정제를 제공하기 때문에 바람직하다. 상기 내용은 다른 숙주 세포, 예를들어 효모나 포유동물 같은 진핵 세포에서 활성 접합체를 생산하는 것이 가능하다는 것을 배제하지 않는다.
제약학적 조성물, 투여량 및 투여 경로
본 발명의 세 번째 양상은 상기 규정한 바와 같이 변이된, 바람직하게는 키메라 초항원(접합형 및 비 - 접합형)을 함유하는 제약학적 조성물이다. 이 조성물은 그것이 본 발명의 초항원을 함유하는 것을 제외하고는 본 분야에 공지되어 있다. 따라서, 조성물은 동결건조된 미립자 물질, 멸균 또는 무균적으로 생성된 용액, 정제, 앰풀 등의 형태일 것이다. 물(생리학적으로 용인가능한 pH 값이 되도록 예를들어 PBS 로 바람직하게 완충시킴)이나 다른 불활성 고체 또는 액체와 같은 부형제가 존재할 것이다. 일반적인 용어 조성물은 하나 또는 그 이상의 수용성 또는 불용성 수성 또는 비수성 부형제, 필요에 따라 적당한 첨가제 및 보조제와 혼합되거나, 그 안에 녹아있거나, 거기에 결합하거나 또는 다른 방법으로 화합되는 접합체에 의해 제조된다. 부형제와 조건이 변이 초항원의 활성도에 악영향을 끼치면 안된다는 것은 당연하다.
일반적으로 본 발명의 초항원은 판매될 것이며, 현재 나타난 결과에 기초하여 10 ng - 1 mg 또는 10 ㎍ - 50 mg 이내와 같은 10 ng - 50 mg 의 범위내일 것으로 여겨지는 접합체의 치료학적 유효량을 각각 함유하는 조제전 투여량으로 투여될 것이다. 정확한 투여량은 환자의 체중과 연령, 투여 경로, 질병의 종류, 표적 - 탐지 반분, 초항원, 결합(- B -) 등에 따라 경우별로 달라질 것이다.
투여 경로는 본 분야에서 공통적으로 주목하는 것일 것이다. 즉, 본 발명에 따라 변이된 초항원의 치료학적 활성량 또는 표적 세포 용균 유효량은 표적 세포와 접촉을 일으킨다. 상기 상술한 것에 대하여, 이것은 주로 인체와 같은 포유동물에 대한 주사 또는 주입과 같은 비경구 투여(피하, 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내)를 의미한다. 본 발명의 변이된, 바람직하게 키메라 초항원은 국부적 또는 전신적으로 투여될 것이다.
용어 "표적 용균 유효량" 은 표적 세포를 파괴하기 위하여 T 세포를 활성화하고 지향시키는 데에 유효한 양을 말한다.
우선일 당시의 바람직한 투여 경로는 Dohlsten 등의 W09201470 및 Abrahmsen 등의 W09601650 에 따른 초항원 접합체에 대하여 고찰된 바와 동일하다. 이것은 해열제(파라세타몰)와 연합하여 매일 1 - 5시간 (바람직하게는 4 시간)씩 정맥 주입함을 말한다. 접합체를 향하는 추가항원자극 항체로 인한 위험 사항들에 주의하면서 수 일간, 예를들어 4 일간 투여를 반복한다.
본 발명의 초항원은 주치료로서 또는 외과나 다른 약물과 연합한 보조 치료로서 바람직한 형태로 투여될 것이다.
치료와 관련하여 우리는 비 - 공유결합된 중쇄와 경쇄 항체에 대하여 순수한 항체 제제가, 사슬이 서로 시스테인 결합을 통해 결합된 항체를 함유하는 제제 이상으로 유리하다는 것을 알았다. 그에 따라 본 발명의 네 번째 양상은 사슬을 연결하는 시스테인 잔기가 서로 이황화물 형성을 허락하지 않는 아미노산, 예를들어 세린에 의해 치환된 항체 제제 ; 특히 Fab 제제의 치료학적 용도이다. 본 발명의 이러한 양상 중 가장 바람직한 항체 특성은, 상기 인용된 문헌에 규정한 바와 같이 우선일 당시에는 C242 mab(Lindholm 등의 W09301302) 및 5T4 mab 였다. 항체 사슬 중 바람직한 변이체는 상기한 바와 같이 Vβ 특이 방식으로 T 세포 부분을 활성화시킬 수 있는 초항원에 융합된다. 초항원은 상기한 바와 같이 또는 Dohlsten 등의 W09201470 또는 Abrahmsen 등의 W09601650 에 의해 기술된 바와 같이 야생형, 키메라 또는 점돌연변이체(및 그것의 연합체)일 수 있다. 본 발명의 이러한 양상은 또한 키메라 초항원 대신에 본 발명의 이러한 양상에서 규정한 항체 제제를 함유하는 것을 제외하고는 상기한 바와 같이 제약학적 조성물을 포함한다.
우선일 당시에, 돌연변이 D227A를 수반하는 SEE/A-A 키메라와 연합하여 Fab 단편 5T4 항체(Stern 등의 W08907947)를 이용하는 것이 바람직하였다. 바람직한 Fab 단편은 사슬간 이황화물 결합을 제공하는 위치(Cys 내지 Ser)에서 양 사슬내로 돌연변이시켰다. E.coli에서 생산할 때 항체/융합 단백질의 수득량을 증가시키기 위해, 특정 위치의 V 카파 사슬에 돌연변이를 실시하였다. 실험 부분을 참조하라.
물질 및 방법
SEA/SEE 키메라 유전자의 구성
폴리머라제 사슬 반응법(PCR)을 기초로 한 방법인, 서열 중복 신장법(Horton 등의 문헌 참조)을 이용하여 SEA/SEE 키메라를 구성하였다. PCR 반응법은 제조자의 권고에 따라 울트마(UITma)(퍼킨 - 엘머사 제품)를 가지고 수행하였다. PCR 에서 생성된 단편들을 PCR - 스크립트(미국 스트라타진사 제품)에 클로닝시키고 정확한 서열을 확인하기 위해 서열결정하였다. 마우스 단클론 항체 C215 [Larsson 등의 Int. J. Canc. 32 (1988) 877 - 82 참조]의 Fab 단편에 대한 중쇄 부분에 상기 SE 구성체를 융합시켜, 발현벡터 pKP889(Abrahmsen 등의 1995 문헌 참조)에 키메라 초항원 유전자를 서브클로닝시켰다. 시그날 펩티드 절단용 칸센서스 서열에 따라서 충분한 길이의 폴리펩티드로서 SEA 및 SEE 재조합 융합단백질을 생성하였다(von Heijne 의 문헌 참조).
단백질 발현 및 정제
Fab - SE 융합 단백질과 SEA 돌연변이체를 발현시키기 위해 이전에 기술한 바와 같이(Abrahmsen 등의 1995 문헌 참조) E. coli K12 균주 UL635 [Boyer 및 Roulland - Dessoix, J. Mol. Biol. 41 (1969) 459 - 472 참조]를 사용하였다. 5000 g에서 원심분리하여 Fab - SE 융합 단백질을 수확하고 그 상청액 분획을 이전에 기술한 바와 같이(Abrahmsen 등의 1995 문헌 참조) 단백질 G 세파로스(스웨덴 웁살라에 소재하는 파마시아 바이오테크 에이비사 제품)를 사용하여 정제하였다. SDS - PAGE 로 분석했을 때 상기 친화성 정제된 Fab - SE 변이체의 순도는 ＞ 90 % 순수했다.
세포
인체 B - 세포 임파종 세포주 Raji 및 인체 결장 암종 Colo 205(미국 ATCC 로 부터 수득, 각각 ATCC 제 CCL 86 호 및 ATCC 제 CCL 222 호)는 10 % 송아지 태아 혈청(스코틀랜드 파이슬리에 소재하는 라이프 테크놀로지스 리미티드 집코 비알엘사 제품), 1 mM 글루타민(크래믈링턴에 소재하는 하이클론 유럽 리미티드사 제품), 5 × 10-5 M β - 머캅토에탄올(미국 캘리포니아 코스타 메사에 소재하는 아이엔시 바이오메디컬스 인코포레이티드사 제품), 0.1 M NaHCO3(시롬드 바이오크롬사 제품), 1 × 10-2 M 헤페스(Hepes) 완충액(크래믈링턴에 소재하는 하이클론 유럽 리미티드사 제품), 0.1 mg/ml 젠타마이신(이스라엘 키부츠 베이트 해멕에 소재하는 바이올로지컬 인더스트리스사 제품), 1 × 10-3 M 소듐 피루베이트(크래믈링턴에 소재하는 하이클론 유럽 리미티드사 제품)를 보충한 완전 R - 배지(PRMI - 1640)에 배양하였다. 인체 C215 와 CD80 분자로 형질전환된 CHO 세포는 0.5 mg/ml 제니티신(G418)(스코틀랜드 파이슬리에 소재하는 라이프 테크놀로지스 리미티드 집코 비알엘사 제품)을 보충한 완전 R - 배지에 배양하였다. 말초혈액 단핵 세포(PBM)는 정상 공여자의 헤파린 처리된 혈액으로 부터 제조하였다. 이전에 기술한 바와 같이(Dohlsten 등의 1991 문헌 참조) 피콜 - 패큐(Ficoll - Paque) 상에서 밀도 원심분리하여 상기 PBM 을 분리하였다. 인체 T 임파구는 제조자의 설명서에 따라 인체 CD4 및 CD8 에 특이적인 단클론 항체로 피막된 자기 비드(bead)(독일 밀테니 바이오텍 게엠베하사 제품)와 함께 미니 MACS 컬럼을 사용하여 양성 선택함으로써 균질하게 정제하였다. 인체 SEA 및 SEE 반응 세포주는 이전에 기술한 바와 같이(Dohlsten 등의 1994 문헌 참조) 제조하였다. 인체 TCR Vβ22 발현 세포주는 TCR Vβ22 특이 단클론 항체(프랑스 이뮤노테크사 제품)로 피막된 자기 다이나비드(Dynabead)(노르웨이 다이날 에이.에스.사 제품)를 사용하여 양성 선택함으로써 일차 자극된 SEA 반응 세포주로 부터 생성하였다. 강화세포는 플로우(flow) 세포계산하여 측정한 바와 같이(데이터는 나타나 있지 않음) ＞ 95 % TCR Vβ22+ T 세포를 함유했다. 마우스 T - 세포 하이브리도마(I1B3, 2B4 및 11.40)는 문헌(Fleury 등의 1991 참조)에 기술된 바와 같이 제조하였다.
세포독성 검정
이전에 기술한 바와 같이(Dohlsten 등의 1991 문헌 참조) 4 또는 6 시간 후에 표준 51Cr 방출 검정으로 세포독성을 측정하였다. 표적 세포로서 인체 Colo 205 또는 Raji 세포를 사용하였다. 표적에 대한 작동자의 비율을 30 : 1 로 하여 작동 세포, 즉 SEA 또는 SEE 반응 인체 T 세포주나 아니면 TCR Vβ22 세포주를 가하였다. V - 모양 바닥의 미량역가 웰내에 2500 세포/200 ml 완전 배지로 하여 51Cr - 표지 표적세포를 세포독성 검정에 사용하였다. 지시한 바와 같이 여러가지 농도로 C215 Fab - SEA/E 혼성체를 가하여 g -계수기로 51Cr 방출량을 측정하였다. 비세포독성 백분율은 100 ×[(c.p.m. 실험 방출량 - c.p.m. 바탕 방출량)/(c.p.m. 총 방출량 - c.p.m. 바탕 방출량)] 으로 계산하였다.
임파구 증식 검정
증식을 측정하기 위해 C215Fab - SEA/E 혼성체의 양을 변화시키면서 U - 모양의 96 - 웰 미량역가 플레이트내의 200 ml 완전 배지에 104 방사선 조사된(20,000 Rad) 자극 세포와 함께 105 인체 T 세포 반응체를 37 ℃ 에서 72 시간 동안 배양시켰다. 문헌(Dohlsten 등의 1988 참조)에 기술된 바와 같이 [3H] - 티미딘 섭취에 따라 증식을 추정하였다.
Fab - SAg - 유도 IL - 2 생성 검정
2×104 Raji 자극 세포의 존재하에서 C215Fab - SEA/E 키메라 단백질과 함께 마우스 T - T 하이브리도마 세포(105)를 200 ml 완전 R - 배지에 배양하였다. 48 시간 후 상청액을 수확하고 마우스 IL - 2 의 존재 여부를 검정하였다. 간단히, 캐처 항체로서 랫 항 - 마우스 사이토킨 mAb 를 사용하여 사이토킨 함량을 검정하였다. 정제된 랫 항 - 마우스 IL - 2, 비오틴 - 표지 랫 항 - 마우스 IL - 2, rIL - 2는 파민젠(PharMingen)(미국 캘리포니아 샌디에고에 소재)에서 구입하였다. 비오틴 - 표지 항 - 사이토킨 mAb, 벡타스타인 ABC 키트(미국 캘리포니아 벡터 라보라토리스에서 구입) 및 과산화효소 기질 키트(미국 캘리포니아 바이오 - 래드 라보라토리스에서 구입)는 사이토킨 검출용으로 사용하였다. 405 또는 450 nm 에서 이뮤노리더(ImmunoReader) NJ2000(덴마크 인터메드 로스킬드사 제품)으로 흡광도를 측정하였다.
5T4 Fab 돌연변이
E. coli 내 5T4Fab - SEA 발현용 벡터의 구성
닥터 피터 스턴(Dr. Peter Stern)으로 부터 수득한 5T4 하이브리도마로부터 5T4의 Fv - 암호화 부위를 클로닝시켰다(Stern 등의 제 W08907947호 참조). 보다 자세히 설명하면, 제 1 불변 도메인의 중쇄와 이 불변 도메인의 경쇄 뿐만 아니라 전체 가변 도메인 영역과 시그날 서열부분에 해당하는 mRNA 로 부터 cDNA 를 제조하여 PCR 로써 증폭시켰다. 올리고누클레오티드
5 ' - CAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGC - 3' (서열 2) 및
5 ' - ACTAGTCGACATGGATGGAGCTITATCATlyTCTT - 3' (서열 3)
를 중쇄용으로 사용하였고, 그 결과 553 bp 단편이 생성된 반면에 올리고누클레오티드
5 ' - ACTAGTCGACATGGGCITCAAGATGGAGTCACAkwyyCwGG - 3' (서열 4) 및
5 ' - GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA - 3' (서열 5)
는 경쇄용으로 사용하였으며, 724 bp 단편이 생성되었다. 각 사슬에 대한 3개의 개별 클론을 서열 결정한 결과 동일하다는 것이 밝혀졌다. 발현벡터(ref) 내로 삽입시키기에 적합한 DNA 단편은 제 2 PCR 단계에서 수득하였다. Fab - 발현 플라스미드를 제조하기 위해, 마우스 IgG1/k 항체 G242 mab(Lindholm 등의 제 W09301302 호 참조)의 불변영역을 암호하는 서열에 5T4의 가변영역을 융합시켰다. 포도상 구균 장독소 A(SEA)로 부터 유래된 초항원을 암호하는 영역을 중쇄 뒤에 융합시켰다. 5T4 항체에 대한 V 카파(Vkappa) 사슬 항체 골격에 대해 확인된 서열은 하기 결과에 제공되어 있다.
5T4 돌연변이유발
상기 항체 골격을 암호하는 영역에 7 개의 아미노산 치환체를 도입시켰다. 이것들은 Phe10Ser, Thr45Lys, Ile63Ser, Tyr67Ser, Phe73Lue, Thr77Ser 및 Leu78Val 이었다. 유사하게, 도메인내 이황화물 결합과 관련되는 각 사슬내 Cys 잔기를 세린 잔기로 치환하여 중쇄 내에 Cys458Ser 돌연변이를 생성하고 경쇄내에 Cys214Ser 돌연변이를 생성하였다. RCP -기저 돌연변이유발을 이용하여 상기 돌연변이를 도입시켰으며, 서열결정하여 수득된 DNA 서열을 확인하였다.
5T4Fab - SEA 의 발효조 발현 및 정제
발현 플라스미드는 IPTG 와 함께 유도될 수도 있는 lacUV5 - 프로모터 및 카나마이신 내성 유전자를 함유한다. 단백질 G 세파로스와 SP - 세파로스(스웨덴 웁살라에 소재하는 파마시아 바이오텍사 제품)를 사용하여 청정화된 배지로부터 융합 단백질을 정제하고 본질적으로 기술한 바와 같이, 세파덱스 G - 25를 사용하여 구연산 완충액내에 제형화시켰다. SDS - PAGE, 역상 HPLC 및 질량 분광법을 사용하여 특정화시킨 결과 정제된 융합 단백질은 95 % 이상 순수하였고 정확한 분자량을 가졌다.
결과 : 초항원의 변형
MHC+ 제 2 급 Raji 세포에 대항하는 C215Fab - SEA 및 C215Fab - SEE의 초항원 의존성 세포매개성 세포독성(SDCC)을, 작동 세포주로서 SEA - 및 SEE - 반응 인체 T 세포를 사용하여 검정하였다. SEA 및 SEE 간에 Vβ 특이성의 차이가 있음에도 불구하고 두 초항원은 두 작동 세포주와 함께 비교할 수 있을 정도의 세포독성 유도를 나타냈다(도 1). MHC 제 2 급 제공 효과와 TCR 인식에 있어 SEA 및 SEE 의 직접 효과를 식별하기 위해, C215 발현 Colo205 세포에 대한 초항원 - 항체 의존성 세포매개성 세포독성(SADCC)을 조사하였다. 이 검정시 Fab 반분은 C215 - 발현 표적세포에 대한 융합단백질로 향했으며 그 결과 MHC 제 2 급 분자에 비의존성인 세포독성 T - 세포(CTL)에 융합된 SE 분자가 제공된다(Dohlsten 등의 1994 문헌 참조). SEA 와 SEE 간에 > 80 %의 아미노산 서열 동일성이 존재함에도 불구하고 SEA 와 SEE 의 TCR 상호작용은 이 유형의 검정에서 질적인 차이를 보인다. C215Fab - SEA 융합 단백질이, MHC- 제 2 급 표적세포에 대하여 SEA 및 SEE 반응 CTL을 지시하는 능력을 유지하고 있는 반면에(도 1), C215Fab - SEE 는 SEA 반응 CTL 이나 SEE 반응 CTL 을 수반하여도 MHC- 제 2 급 표적세포의 세포독성을 유도하지는 못한다(도 1).
SEA 와 SEE 간의 Vβ 특이성의 차이는 주로 선행하는 루프와 비규칙적인 a5 헬릭스에 있어 3 개의 아미노산 차이와 관련되어 있음이 다른 연구자들에 의해 이전에 보고되었다(Irwin 등의 1992, Hudson 등의 1993, Fraser 등의 1993, 및 Mollick 등의 1993 참조). 이 연구에서 보고된 TCR 상호작용에 관한 차이는 변형된 TCR Vβ 특이성과 관련되지는 않는데, 그 이유는 MHC 제 2 급 비의존성 세포독성을 유도하는 C215 Fab - SEA 의 능력이 SEA 반응 CTL 로 제한되는 것이 아니고 SEE 반응 CTL 과 함께 보여지기 때문이다.
SEA 및 SEE의 서열 상동성 분석(도 2)으로, 동일하지 않은 아미노산 잔기들이 8 개의 개별 영역에 집중한다는 것이 나타난다. 서열의 34 % 로 구성되는 이들 8 개 영역을 제외하면, 두 SE's 의 동일성은, 남아 있는 차이의 원인인 보존적 아미노산 치환을 수반하여 97 % 이다. 비상동성 영역중 4 개의 부위는 2 개의 MHC 제 2 급 결합부위와 구조적으로 가까우나(B, D, E 및 G), TCR 과 상호작용하는 것 같지는 않다(도 3). 4개의 부가 영역(A : AA 20 - 27, C : 60 - 62, F : 161 - 176 및 H : 200 - 207)는 2 개의 아도메인 사이의 홈에 위치한, TCR 결합 부위 부근의 분자(도 3)의 가장자리에 위치한다(kappler 등의 1992 문헌 참조). SEA 와 SEE 간에 TCR 인식의 질적인 차이를 조사하기 위해, 단일 영역 키메라로서(SEE/A - A, -C, -F, H), 이중 부위 혼성체로서(SEE/A - AH) SEA 에서 SEE 까지의 영역을 이식시키고, SEA 에 대한 SEE 상의 MHC 제 2 급 결합 부위 부근에 위치한 영역을 이식시킴으로써(SEA/E - BDEG) 혼성체 단백질을 제조하였다(도 4). 키메라 SEs 의 모두는, MHC 제 2 급의 부재시 활성도에 관한 차이를 검출할 수 있는 C215Fab 융합 단백질로서 발현되었다.
C215Fab 반분과의 융합시 SEA/E 혼성체 단백질은 Fab 표적 세포독성 검정에서 차이를 나타낸다.
작동자로서 SEA - 반응 인체 T 세포를 사용하여 MHC+ 제 2 급 Raji 세포에 대항하는 C215Fab - SEE/A 혼성체 단백질의 SDCC 활성도를 검정하였다. C215Fab - SEAwt 및 - SEEwt 뿐만 아니라 C215Fab - SE 혼성체의 EC50 값은 최저 한도의 오차로 내려간다(예를들어, 10-12 - 10-11 M, 도 5). 오직 검출가능한 차이는 반응하는 T 세포의 결여를 나타내는, C215Fab - SEE/A - AH 혼성체에 대해 아주 조금 감소된 플래토우(plateau)이다. 한편, 세포독성이 MHC- 제 2 급/C215+ Colo205 세포주쪽으로 지시되는 SADCC 실험에서는 단지 C215Fab - SEE/A - A, C215Fab - SEE/A - AH 및 C215Fab - SEA/E - BDEG 가 C215Fab - SEAwt 와 비교할 만한 세포독성을 유도했다(도 5). C215Fab - SEE/A - F 혼성체는 보다 더 높은 농도(EC50 >10-10 M)에서 C215 표적된 세포독성을 유도할 수 있다. 비록 C215Fab - SEE/A - H 혼성체가 C215Fab - SEAwt (예를들어, EC50 10-13 M)와 비슷한 1/2 최대 농도로 C215 표적된 세포독성을 유도할 수 있을지라도, 세포독성의 절대 수준은 심하게 감소한다(도 5). 이 차이는 C215Fab - SEE/A - H 의 제한된 Vβ 특이성의 결과일 수 있으나 C215 처리된 세포독성을 유도하는 능력은 반응하는 T 세포 아집단에서 우세하다. 이러한 견해를 더 조사하기 위해, 인체 Vβ22 올리고클론 CTL 주를 제조하였다. 인체 Vβ22 는 이것이 SEE 가 아니라 SEA 특이 Vβ 족이라는 점에서 마우스 Vβ3와 구조유사성이다. SEA 및 SEE Vβ의 주된 기여는 주로 영역 H (AA 200 - 207) 내 SEA 와 SEE 간의 3 개 아미노산 차이에 존재한다는 것이 이전 문헌(Mollick 등의 1993 참조)에 설명되었다. MHC+ 제 2 급 Raji 표적물에 대한 SDCC 검정에 있어 작동자로서 Vβ22 올리고클론 CTL 주를 사용하면, 단지 SEA - H 영역을 함유하는 혼성체만이 C215Fab - SEAwt - 유사 반응(예를들어, C215Fab - SEE/A - H, C215Fab - SEE/- AH 및 C215Fab - SEA/E - BDER, 도 6)을 제공할 수 있다. 작동자로서 전체 CTL 집단과 함께 완전한 SDCC 반응을 유도할 수 있었던 C215Fab - SEE/A - A 혼성체는 이 검정시 1/2 최대농도와 플래토우 둘 다가 심하게 감소되었다(도 6). Vβ22 CTL 의 세포독성이 MHC- 제 2 급/C215+ Colo 205 세포주 쪽으로 지시될 때 SEA - A와 SEA - H 영역 둘다 함유하는 혼성체 만이(예를들어, C215Fab - SEE/A - AH 및 C215Fab - SEA/E - BDEG) C215Fab - SEAwt 에 필적할 만한 세포독성 반응을 유도할 수 있다(도 6). SEA 영역 A 만을 함유하는 혼성체는(C215Fab - SEE/A - A) 유사한 EC50 값을 갖는 보다 낮은 수준의 세포독성을 유도한다. 이것은 작동자로서 전체 T 세포 집단을 수반한 SADCC 에 있어 C215Fab - SEE/A - H 혼성체에서 확인된 잔류 활성도가, 제한된 T 세포 집단의 혼성체 유도 반응의 결과가 아니라는 것을 나타내는 것이다. 이 관찰에 대한 더 그럴듯한 설명은, C215Fab SE 혼성체 단백질의 SADCC 반응을 유도하는 능력이 주로 SEA - H 및 - F 영역의 기여가 적은 SEA - A 영역에 존재한다는 것이다. 이 특성이, 결합한 SEA - SEE 반응 T 세포 집단의 T 세포 중 임의의 소단위체로 제한된다는 증거는 없는데, 그 이유는 C215Fab - SEA는 SEE 반응 CTLs 과도 동일한 반응을 유도할 수 있으며 C215Fab - SEE/A -A가 C215Fab - SEA와 함께 보여진 반응을 완전하게 재구성할 수 있기 때문이다.
C215Fab 반분과의 융합시 SEA/E 혼성체 단백질은 Fab 표적 증식검정에서 차이를 나타낸다.
MHC- 제 2 급/C215+/CD80+ 세포주에 C215Fab - SEA 를 제공함으로써 정제된 휴지 인체 T 세포가 증식되도록 유도시키는 것에 관하여는 이미 기술되어 있다(Lando 등의 1993 문헌 참조). 그러나 MHC 제 2 급 비의존성 증식을 유도하는 C215Fab - SEA 의 능력은 C215Fab - SEE 와 더불어 현저하게 감소한다(표 1). 이와 같은 특성의 차이가 SADCC 에서 보여졌던 바와 같이 SEA 부위 A 에 대한 동일한 제한을 나타내는지 조사하기 위해, CHO - DR1+/CD80+나 아니면 CHO - C215+/CD80+ 형질전환 세포주에 의해 나타나는 C215Fab - SE의 증식능력을 정제된 휴지 인체 T 세포에 대해 조사하였다. CHO - DR1+/CD80+ 상에 Fab - SE 접합체를 제공했을 때 서로 다른 SE 단백질 간의 차이는 보이지 않았다(데이터는 나타나 있지 않음). 그러나 SEE 유력자(potentate) 중에서 SEA 영역 A, C 및 H 이식편의 증식 활성도를 C215Fab - SEE와 비교하였다. 제 2 급 MHC 비의존성 세포독성에 대해 보여졌던 바와 같이 영역 A 에 대한 중요한 역할을 나타내는 가장 좋은 결과가 SEA 영역 A 및 H 를 이식함으로써 수득되었다. 음성 선택을 이용하면, Fab - SEA 와 - SEE 간의 차이가 더 두드러지게 될 것이라는 것이 가능하다.
SE - 혼성체의 Vβ 특이성
C215Fab - SEA/SEE 혼성체 - 융합 단백질이 특정 Vβ 특이성과 관련이 있는지 더 조사하기 위해 Vβ1, Vβ3 및 Vβ11 을 발현시키는 SEA 반응 마우스 T 세포 하이브리도마를 사용하였다. 조사한 모든 영역이 직접적으로나 간접적으로, TCR 과의 상호 작용에 영향을 미친다는 것은 수득된 데이터로부터 명백하다. SEA 영역 C 및 F 를 C215Fab - SEE 에 이식시킴으로써, SEA 및 SEE 교차 반응 Vβ1 하이브리도마 I1B3 로 향하는 활성도는 파괴된다. C215Fab - SEE와 비교해 볼 때 동일한 키메라들이 Vβ3 및 Vβ11 하이브리도마(2.B4 및 11.40)의 활성도에 영향을 미치지 않거나 적게 미치는 것처럼 보인다. SEA 영역 A를 C215Fab - SEE 에 이식시킴으로써 Vβ3(2.B4)로 향하는 활성도는, C215Fab - SEE와 비교해 볼 때 최소한 인자 100 까지 증가한다.
SEA 영역 H를 C215Fab - SEE에 이식시킴으로써 동일한 세포주와 함께 보다 두드러진 효과가 보여진다. SEA 영역 H 에 의한 Vβ3 특이성의 영향에 대한 이 두드러진 효과 역시 보다 일찍 조사되었다(Mollick 등의 1993 문헌 참조). 그러나 동일한 키메라(C215Fab - SEE/A - H)는 SEA/SEE 교차 반응 Vβ1 및 Vβ11 하이브리도마(I1B3 및 11.40)로 향하는 활성도를 인자 10까지 감소시키는 것처럼 보인다. 결과적으로, SEA 의 TCR 상호작용은 SEA - SEE, 가변영역 A, C, F 및 H 모두와 관련있는 것처럼 보인다.
혈청반응성
개인 혈청 뿐만 아니라 세계의 다른 지방으로부터 모은 시료로, 키메라 SEs 에 대한 인체 혈청 시료의 혈청반응성을 조사하였다. SEA 영역 A 및 H 를 SEE 에 이식시킴으로써 우리는 중간 혈청반응성을 수득하였다(도 8). 키메라 C215Fab - SEE/A 에 대하여도 유사한 혈청 반응성이 확인되었다. 그러나, SEE 내 SEA 영역 A 의 단일 이식편(C215Fab - SEE/A - A)은 C215Fab - SEE 유사 혈청반응성을 제공하는데, 이것은 SEA 영역 H 가 C215Fab - SEE/A - AH 에 대항하는 잔류 혈청반응성을 초래한다는 것을 나타내는 것이다. 이것은 SEA 영역 H 가 SEA 내 항원성 에피토프를 지배하는 부분이라는 것을 암시해준다. 스웨덴의 14명 개인 시료 뿐만 아니라 세계의 다른 지방으로 부터 모은 혈청 시료(일본 및 미국)로 부터의 혈청반응성은 동일한 일반 양식을 확립한다(데이터는 나타나 있지 않음).
결과 : 융합 단백질의 Fab 부분의 돌연변이
5T4FabSEA - 구성체의 발현
발효조내에서 5T4Fab - SEA의 E. coli 내 생산 수준은 우리 실험실에서 이전에 연구한 다른 Fab - 초항원 구성체보다 상당히 더 낮다는 것이 발견되었다. 따라서 생산 수준을 증가시키기 위해 두가지 유형의 변형체를 도입하였다. 첫째, 경쇄 골격 영역에 7 개의 다른 점 돌연변이를 도입시켰다. 이것은 Phe10Ser, Thr45Lys, Ile63Ser, TyR67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser 및 Leu78Val 였다. 둘째, 중쇄와 경쇄를 연결 시키는 이황화물 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 세린 잔기로 치환하였다. 후자의 변형은 결과적으로 생산 수준을 3 배 증가시켰으며 7 개 점 돌연변이는 부가적으로 12 배 증가시켰다. 상당히 증가된 생산 수준 이외에도, 이황화물 결합을 제거시키면, 다른 티올 함유 약물과 반응하는 이들 반응 티올기의 가능성이 배제되므로 더 균질한 산물이 제공된다.
SADCC 의 생물학적 활성도 뿐만 아니라 항원에 대한 친화성에 대해 변형된 5T4 분자를 조사하였다. 이 검정에서 돌연변이체와 야생형 간의 차이는 검출될 수 없었다.
몇몇 다른 모노클로날 항체의 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄에서도 Cys/Ser 돌연변이를 수행하였다. 이 산물은 균질하였으며 항원 결합 능력을 충분히 보유하였다.
항체 골격중 5T4 V카파(Vkappa) 사슬에 대한 영역의 서열 : DAVMTQTPTF LLVSAGDRVT ITCKASOSVS NDVAWYQQKP GQSPTLLISY 50
TSSRYAGVPD RFIGSGYGTD FTFTISTLQA EDLAVYFCOO DYNSPPTFGG 100
GTKLEIK (서열 6)
밀줄 친 서열은 CDRs 이다. 볼드형(bold-type) 위치가 돌연변이 되었다 : Phe10Ser, Thr45Lys, Ile63Ser, Ile63Thr, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser, Leu78Val.
Figure pct00002
Figure pct00003
도 1. 인체 SEE 및 SEA CTL을 수반한 MHC 제 2 급 의존성 및 비의존성 세포독성.
작동분자로서 C215Fab - SEA (■) 와 C215Fab - SEE (◆)를 수반한 MHC 제 2 급 의존성 세포매개성 세포독성(A 및 B) 및 C215 의존성 세포매개성 세포독성(C 및 D). SEE - 반응 인체 T - 세포주(A 및 C)와 SEA - 반응 인체 T - 세포주(8 및 D)를 사용하여 표준 4 - h 51Cr 방출 검정하여 세포독성을 분석하였다. 표적 세포주는 제 2 급 MHC+/C215- Raji(A 및 B)와 MHC- 제 2 급/C215+ Colo 205(C 및 D) 였다. 데이터는 둘(A 및 C) 내지 다섯(B 및 D)의 독립 실험을 대표하는 단일 검정으로부터 수득한 것이다.
도 2. SEA 및 SEE 의 상동성 정렬.
SEA/SEE 가변영역은 TCR 결합 부위에 가깝고(A, C, F 및 H) 이 가변영역은 2 개의 MHC 제 2 급 결합 부위에 가깝다.
도 3. SEA 의 밑그림 모델.
SEA 결정(Schad 등의 1995 문헌 참조)의 몰스크립 모델(Kraulis의 1991 문헌 참조). SEA/SEE 가변영역은 TCR 결합부위에 가깝고(A, C, F 및 H) 이 가변영역은 2 개의 MHC 제 2 급 결합 부위에 가깝다. 둥근 구(球) 모양은 아연이다.
도 4. 키메라 SE 분자의 개략적인 대표도.
SEA 서열의 신장 부분은 움푹 들어가 있다. SEA/SEE 가변영역은 A, B, C, D, E, F, G 및 H 로 표시되어 있다.
도 5. 인체 SEA 반응 CTL 을 수반한 MHC 제 2 급 의존성 및 비의존성 세포독성.
C215Fab - SEE/A - A(▲), C215Fab - SEE/A - C(□), C215Fab - SEE/A - F(◇), C215Fab - SEE/A - H(·), C215Fab - SEE/A - AH(△) 및 C215Fab - SEA/E - BDEG(○)의 (A) MHC 제 2 급 의존성 세포매개성 세포독성 및 (B) C215 의존성 세포매개성 세포독성. SEA - 반응 인체 T - 세포주를 사용하여 표준 4 - h 51Cr 방출 검정하여 세포독성을 분석하였다. 표적 세포주는 MHC+ 제 2 급/C215- Raji (A) 및 MHC- 제 2 급/C215+ Colo 205 (B) 였다. 데이터는 5 번의 독립 실험을 대표한 단일 검정으로 부터 수득한 것이다.
도 6. 인체 Vb22+ CTL 을 수반한 MHC 제 2 급 의존성 및 비의존성 세포독성.
작동 분자로서 C215Fab - SEA(■), C215Fab - SEE(◆), C215Fab - SEE/A - A(▲), C215Fab - SEE/A - C(□), C215Fab - SEE/A - F(◇), C215Fab - SEE/A - H(·), C215Fab - SEE/A - AH(△) 및 C215Fab - SEA/E - BDEG(○)를 수반한(A) 제 2 급 MHC 의존성 세포매개성 세포독성 및 (B) C215 의존성 세포매개성 세포독성. Vb22 선택된 SEA - 반응 인체 T - 세포주를 사용하여 표준 4h 51Cr 방출 검정하여 세포독성을 분석하였다. 표적 세포주는 MHC+ 제 2 급/C215- Raji(A) 및 MHC- 제 2 급/C215+ Colo 205 (B) 였다. 데이터는 2 번의 독립 실험을 대표하는 단일 검정으로 부터 수득한 것이다.
도 7. MHC 제 2 급 의존성 및 비의존성 증식(우선 출원에는 없음).
MHC 제 2 급 의존성 (A) 및 비의존성 (B) T 세포 증식에 대한 Fab - SE 혼성체의 효과. MHC+ 제 2 급/C215- CHO - DR4/C215 형질전환체(A) 및 MHC- 제 2 급/C215+ CHO - CD80/C215 형질전환체 (B) 상에 제공된 C215Fab - SEA(■), C215Fab - SEE(◆), C215Fab - SEE/A - A(▲), C215Fab - SEE/A - C(□), C215Fab - SEE/A - F(◇), C215Fab - SEE/A - H(·), C215Fab - SEE/A - AH(△) 및 C215Fab - SEA/E - BDEG(○)로 정제된 인체 T - 세포를 96 시간 동안 자극시켰다. 72 시간 후에 이 세포를 [3H] - 티미딘으로 24 시간 동안 펄스시키고 삽입된 표지를 측정하여 1/2 최대 농도(ED50)로 나타내었다. 데이터는 2 번의 독립 실험을 대표하는 단일 검정으로 부터 얻은 것이다.
도 8. 인체 Ig 풀(pool)의 혈청반응성.
남유럽의 건강한 공여자로 부터 수득한, C215Fab - SE 융합 단백질에 대항하는 ＞ 5000 혈청의 풀. 단계 희석한 인체 Ig 를 C215Fab - SEAwt, C215Fab - SEEwt, C215Fab - SEE/A - A, C215Fab - SEE/A - H 및 FabSEE/A - AH 와 함께 실온에서 1 시간 동안 상호작용되도록 하였다. 1 ng/웰의 농도로 미량역가 평판에 고정시켰다. 각 점에서 C215Fab에 대한 OD - 값을 뺌으로써 혈청 단백질에 결합하는 C215Fab 에 대해 보정하였다. 각 점은 이중 시료의 평균을 나타낸 것이다. 더 상세한 설명은 물질 및 방법 부문을 참조하시오.
표 1. 정제된 인체 T - 세포를 MHC- 제 2 급 CHO- CD80/C215 형질전환체상에 제공된 반응성 C215Fab - SE 와 함께 96 시간 동안 자극시켰다. 72 시간 후에 이 세포를 3H - 티미딘으로 24 시간 동안 펄스시키고 삽입된 표지를 측정하여 1/2 최대 농도(EC50)로서 나타내었다.
표 2. 마우스 T 세포 하이브리도마를 천연 또는 키메라 Fab 결합된 초항원과 함께 48 시간 동안 자극시켰다. IL - 2 생성에 따라 활성도를 측정하여 1/2 최대 농도(ED50)로 나타내었다.
우선년 동안의 연구.
초항원 키메라 항체 융합체 C242Fab - SEE/A - A의 특성을 최소화하기 위한 시도로, 제 W09601650 호에 기술된 바와 같이 상기 키메라 SEE/A - A를 제 2 급 결합 부위내에서 돌연변이시켜 C215Fab 에 융합시켰다. 이 구성체는 C215Fab - SEE/A - A - D227A, C215Fab - SEE/A - A/F47A/D227A, C215Fab - SEE/A - A - H187A/D227A, C215Fab - SEE/A - A - W130A/D227A, C215Fab - SEE/A - A - D70A/D227A, C215Fab - SEE/A - A - N50S/D227A, C215Fab - SEE/A - A - N50S/D70A/D227A, C215Fab - SEE/A - A - F47Y/D227A 및 C215Fab - SEE/A - A - D70R/D227A 이다. C215Fab - SEE/A - A - D227A 와 비교하여 낮아진 활성도를 갖는 돌연변이체를 확인하기 위해 모든 융합체를 인체 PBMC 의 증폭을 유도하는 능력에 대해 시험하였다. 낮아진 증식 활성도가 C215Fab - SEE/A - A - F47A/D227A, C215Fab - SEE/A - A - F47Y/D227A 및 C215Fab - SEE/A - A - D70R/D227A 에 대해 관찰되었다. 키메라 융합체중 일부도 인체 정상 혈청내 항체 역가에 대해 시험하였다(C215Fab - SEE/A - A - D227/A, C215 - FabSEE/A - A - D70A/D227A 및 C215Fab - SEE/A - A - D70R/D227A). C215Fab - SEA - D227A 및 C215Fab - SEE - D227A 와 비교하였다. 비교상의 C215FabSEA - D227A 는 그 역가가 시험된 각 키메라에 대해 훨씬 더 낮았다. 비교상의 C215Fab - SEE - D227A 는 그 역가가 시험된 각 키메라에 대해 조금 더 높았다.
이것은 도 2 의 서열 번호 7 및 8 에서 정의한 바와 같은 위치 47, 50, 70, 130, 187 및 227 중에서 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 둘에 상응하는 위치에서 치환되었음을 의미한다.
본 발명 개념의 범위내에서 다양하고 다른 많은 발명의 실시구체 형태가 있을 수 있고, 법률상 기술적 요구에 따라 상세한 실시구체 형태의 변형이 있을 수 있으므로, 본원의 상세한 설명은 제한하려는 것이 아니라 실례로서 판단해야 한다.
서 열 목 록
(2) 서열 1 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 3 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 분자의 종류 : 펩티드
[서열 1]
Figure pct00004
(3) 서열 2 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 24 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
[서열 2]
CAATTTTCTT GTCCACCTTG GTGC
(4) 서열 3 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 35 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
[서열 3]
ACTAGTCGAC ATGGATGGAG CTITATCATI YTCTT
(5) 서열 4 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 41 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
[서열 4]
ACTAGTCGAC ATGGGCITCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G
(6) 서열 5 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 34 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
[서열 5]
GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCATTCCTGT TGAA
(7) 서열 6 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 107 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 분자의 종류 : 펩티드
[서열 6a]
Figure pct00005
[서열 6b]
Figure pct00006
(8) 서열 7 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 233 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 분자의 종류 : 펩티드
[서열 7a]
Figure pct00007
[서열 7b]
Figure pct00008
(9) 서열 8 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 233 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 분자의 종류 : 펩티드
[서열 8a]
Figure pct00009
[서열 8b]
Figure pct00010
본 출원은 1996년 3월 29일에 출원 번호 제 9601245 - 5 호로 스웨덴 특허청에 우선권을 주장하였고 1996년 8월 12일에 출원 번호 제 08/695,692 호로 미국에 우선권을 주장하였으며, 둘 다 본원에 참고문헌으로 인용한다.

Claims (10)

  1. 변이된 야생형 초항원 및 표적 탐지 반분 간의 접합체에 있어서,
    상기 변이된 초항원은, T 세포 수용체(TCR) 결합 부위 내에 존재하고 TCR Vβ 사슬로의 결합 및 T 세포 활성을 결정하는 도 2 의 SEE 의 영역 A, C, F 및 H 의 아미노산 잔기 20, 21, 24, 27, 60, 62, 161, 164, 165, 167, 168, 174, 176, 200, 206 및 207 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 SEA 의 상응 위치 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기로 치환된 SEE 이고, 상기 변이된 초항원은 SEE 에 비해 T 세포 세포독성을 유도하는 향상된 능력을 가지고 SEA 에 비해 감소된 혈청 반응성을 가지며,
    변이된 초항원은 상기 두 야생형 초항원 중 어느 하나의 초항원에 비해 MHC 제 2 급 항원에 결합하는 능력을 감소시키는, 서열 7 의 위치 227 에서의 돌연변이를 추가로 포함함을 특징으로 하는 접합체
  2. 제 1 항에 있어서, 서열 7 에 규정된 바와 같은 위치에서 R20G, N21T, S24G 및 R27K의 아미노산 치환이 일어남을 특징으로 하는 접합체.
  3. 제 1 항에 있어서, 돌연변이는 D227A 임을 특징으로 하는 접합체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 탐지 반분은 항원 결합 항체 활성 단편, 항원 결합 항체, 단일-사슬 항체, Fab, F(ab)2 및 Fv 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 접합체.
  5. 포유동물의 면역계를 활성화시켜 암, 바이러스 감염, 기생충 감염 및 자가면역 질환 중에서 선택한 포유동물의 질환을 치료하기 위한, 변이된 야생형 초항원 및 표적 탐지 반분 간의 접합체의 치료학적 유효량을 포함하는 약학적 조성물에 있어서,
    상기 변이된 초항원은, T 세포 수용체(TCR) 결합 부위 내에 존재하고 TCR Vβ 사슬로의 결합 및 T 세포 활성을 결정하는 도 2 의 SEE 의 영역 A, C, F 및 H 의 아미노산 잔기 20, 21, 24, 27, 60, 62, 161, 164, 165, 167, 168, 174, 176, 200, 206 및 207 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 SEA 의 상응 위치 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기로 치환된 SEE 이고, 상기 변이된 초항원은 SEE 에 비해 T세포 세포독성을 유도하는 향상된 능력을 가지고 SEA 에 비해 감소된 혈청 반응성을 가지며,
    변이된 초항원은 상기 두 야생형 초항원 중 어느 하나의 초항원에 비해 MHC 제 2 급 항원에 결합하는 능력을 감소시키는, 서열 7 의 위치 227 에서의 돌연변이를 추가로 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 질환은 TCR 결합 에피토프와는 구조적으로 다른 초항원 에피토프에서의 초항원 융합체에 결합하고, 초항원의 세포 활성화및 TCR 로의 결합을 위해 결합하는 표면 표적 구조를 발현하는 세포와 관련됨을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서, 질환은 암임을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서, 서열 7 에 규정된 바와 같은 위치에서 R20G, N21T, S24G 및 R27K 의 아미노산 치환이 일어남을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 5 항에 있어서, 돌연변이는 D277A 임을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 탐지 반분은 항원 결합 항체 활성 단편, 항원 결합 항체, 단일-사슬 항체, Fab, F(ab)2 및 Fv 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 조성물.
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