UA46772C2 - Кон'югат між суперантигеном дикого типу, який був модифікований, та частиною молекули, що відшукує мішень - Google Patents

Кон'югат між суперантигеном дикого типу, який був модифікований, та частиною молекули, що відшукує мішень Download PDF

Info

Publication number
UA46772C2
UA46772C2 UA97126295A UA97126295A UA46772C2 UA 46772 C2 UA46772 C2 UA 46772C2 UA 97126295 A UA97126295 A UA 97126295A UA 97126295 A UA97126295 A UA 97126295A UA 46772 C2 UA46772 C2 UA 46772C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
amino acid
superantigen
conjugate according
region
wild
Prior art date
Application number
UA97126295A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Пер АНТОНССОН
Йохан ХАНССОН
Пер Бьєрк
Мікаель Дольстен
Терьє Калланд
Ларс АБРАМСЕН
Йєран Форсберг
Йеран Форсберг
Original Assignee
Фармація Енд Апджон Аб
Фармация Энд Апджон Аб.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Фармація Енд Апджон Аб, Фармация Энд Апджон Аб. filed Critical Фармація Енд Апджон Аб
Priority claimed from PCT/SE1997/000537 external-priority patent/WO1997036932A1/en
Publication of UA46772C2 publication Critical patent/UA46772C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Кон'югат між частиною молекули, що відшукує мішень, та модифікованим суперантигеном, який є суперантигеном дикого типу (SA І), в якому амінокислотний залишок у районі суперантигену (районі І), що визначає зв'язування з TCR, переважно TCRV β, та активацію Т-клітин, був замінений іншим амінокислотним залишком при збереженні здатності активувати субпопуляцію Т-клітин. У переважному варіанті модифікований суперантиген є химерою між принаймні двома суперантигенами дикого типу (SA I, SA II і т.д.), у якому один або декілька амінокислотних залишків в районі, що визначає зв'язування з TCR і активацію Т-клітин, були обмінені між різними суперантигенами дикого типу. Описаний терапевтичний спосіб з використанням модифікованих/химерних суперантигенів, описаних у попередніх параграфах, і препарат антитіл, в якому залишки цистеїна, що забезпечують міжланцюгові дісульфідні зв'язки, був мутований таким чином, щоб виключити утворення міжланцюгових дісульфідних мостиків, переважно шляхом заміни на залишки серина, для застосування в якості фармацевтичного засобу.

Description

Опис винаходу
Дана заявка претендує на пріоритет на підставі Шведської патентної заявки Мо9601245-5, яка була 2 зареєстрована 29 березня 1996 року, та на підставі Заявки США 08/695692, яка була зареєстрована 12 серпня 1996 року, які включені в якості посилання.
Область винаходу
Даний винахід відноситься до функціонально активних модифікованих суперантигенів, які є суперантигенами дикого типу (ЗА І), в яких один або декілька амінокислотних залишків замінені зі збереженням при цьому 70 функції суперантигену. У випадку, коли один або декілька замінених залишків (або їх консервативний залишок) зустрічаються у відповідних положеннях в іншому суперантигені дикого типу (ЗА ІІ), модифікований суперантиген називають химерою (інколи гібридом). Таким чином, химерні суперантигени будуть вміщувати часткові послідовності/райони, що відбуваються, принаймні, з двох різних суперантигенів дикого типу.
Під терміном "відповідні" мають на увазі, що залишки, часткові послідовності та райони, що замінюють один 19 одного, мають функціонально одне й те ж положення у суперантигенах ! та Ії, так що заміна призводить до химерної форми, яка здатна функціонувати як суперантиген.
Термінологію "прищеплений/щеплення/щеплена частина (трансплантат) використовують у зв'язку з частинами повної послідовності суперантигену ІІ, які замінюють відповідні частини суперантигену І, навіть якщо замінена тільки одна єдина амінокислота.
До модифікованих/химерних суперантигенів відносяться також функціональні суперантигени, модифіковані іншими шляхами, наприклад, модифіковані заміною амінокислот на ділянках, інших, ніж ті, що відносяться до даного винаходу, кон'юговані з частиною молекули, що відшукує мішень, у тому числі також злиті форми, коли ця частина молекули є поліпептидом/білком. Порядок проведення цих модифікацій може змінюватися (див. нижче).
Суперантигени с
Відповідно до найпершого визначення (приблизно 1988 - 1993), суперантигени являють собою бактеріальні Ге) або вірусні білки, здатні зв'язуватися з антигенами головного комплексу гістосумісності класу ІЇ (МНС сіазв
І) без попереднього внутрішньоклітинного процесингу та активувати Т-клітки шляхом зв'язування з варіабельною областю В-ланцюга (МВ) Т-клітинного рецептору (ТСК). Це зв'язування призводить до рестриктрованої сімейством МВ активації щодо великої частини/субпопуляції Т-кліток до лізису експресуючих сч
МНС І клітин (суперантиген-залежному клітинно-опосередкованому цитолізу - БОСС). -
Добре відомими суперантигенами дикого типу, відповідно до цього визначення; є стафілококові ентеротоксини (ЗЕА, 5ЕВ, ЗЕС1І, 5ЕС2, 5ЕО, 5ЕЕ, 5ЕН). Подальшими прикладами є токсин 1 Синдрому -
Токсичного Шоку (Т551-1, також стафілококового походження), Токсини Ексфоліації (Ех), Стрептококові Ге)
Пірогенні Екзотоксини А, В і С (ЗРЕ А, В і С), білки мишачого вірусу молочної залози (ММТМ), Стрептококові 39 білки М, Ентеротоксин СіовігідІц! репгіпдепе (СРЕТ), суперантигени Мусоріазта апйгйв і т. д. Огляд З суперантигенів та їх властивостей даний Коїгіп еї аї., 1993.
На самому початку 90-х років було виявлено, що активація та наступний лізис клітин можуть відбуватися незалежним від МНС класу ІЇ чином у випадку, коли суперантиген кон'югований з частиною молекули, що впізнає « мішень, здатною зв'язуватися з структурою клітинної поверхні (Оопівіеп еї аі. ММО 9201470 та Абгаптзгеп еї аї. З мо 9601650). Під час інкубування клітин-мішеней (що несе структуру-мішень для частини молекули, що відшукує с мішень) та ефекторних клітин (Т-клітин) з кон'югатами, клітини-мішені стають лізируваними
Із» (суперантиген-антитіло-залежний клітинно-опосередкований цитоліз - ЗАЮСС) без необхідності експересії класу
І. Тому концепція суперантигену наших днів, що використовується у контексті даного винаходу, якщо немає інших вказівок, включає в себе будь-яку сполуку (переважно поліпептидної структури), яка здатна зв'язуватися 49 зі структурою клітинної поверхні (структурою-мішенню) та з одним або декількома ланцюгами поліморфних ТОК, шк зокрема, з ланцюгом МВ, з активуванням тим самим субпопуляції Т-клітин, експресуючих специфічний ланцюг
Ге») ТОК, що бере участь у цьому зв'язуванні. Потім Т-клітини стають цитотоксичними щодо клітин, які несуть цю клітинну структуру (структуру-мішень, клітин-мішеней). Звичайно активована субпопуляція Т-клітин складає
Ше приблизно 1 - 2095 від загального числа Т-клітин індивідуума. -і 20 Передумови винаходу - Структурні та функціональні дослідження, що використовують мутовані та химерні суперантигени із Раніше були описані химерні суперантигени, у тому числі форми з точковими мутаціями (Кирріег еї аї,, УУО 9314364, Каррієг еї а), 1992; Сгозвзтап еї аі). 1991; НиїІпадіеє еї аї., 1991; Нагімд еї аЇ. 1993; ЕРгазег еї аї. 1993; Моск ек а). 1993; Іпміп еї а). 1992; Нийдзвоп еї аЇ. 1193; і Віапсо еї а). 1990). МойШскК еї аї. і 22 Нидвзоп еї а). показують на основі досліджень химер, що МВ-специфічність 5ЕА і 5ЕЕ основана на визначених
ГФ) амінокислотних послідовностях, присутніх у карбоксикінцевому районі (тобто амінокислотних залишках 200, 206 і 207). Крім МВ-специфічності, в основному залежний від цього району, Моск еї аЇ. змогли також показати, що о для повного відтворення ЗЕЕ-подібної активності ЗЕА, що містить ЗЕЕ-щеплення, щодо УВ8 був необхідний фрагмент, що містить 70 М-кінцевих амінокислотних залишків з ЗЕЕ. Цей фрагмент містить частини 60 ЗЕЕ-подібного сайту зв'язування ух-ланцюга МНС класу ІЇ, та химерні молекули ЗЕА/ЗЕЕ, що мітять цю частину з
ЗЕЕ, інгібували зв'язування 5ЕА з ОК1 МНС класу ІІ ЗЕЕ-подібним чином.
Нещодавно були описані химери ЗЕА/5ЕЕ, утворені обміном районів, що беруть участь у зв'язуванні ТСО УВ (Гатрпнаєг еї аї., 9. Іттипої. 156 (Магсп 15, 1996) 2178 - 2135). Злитий білок суперантиген ЗЕЕ/Рар-антитіло, в якому домени 5ЕЕ, що беруть участь у взаємодії з Т-клітинами, були замінені відповідними негомологічними бо доменами ЗЕА, обговорювалися на АВКЕ 96: ВіотоЇесшаг Тесппідцез, Ноїудау Іпп СоЇдеп Саїйемжау, Зап
Егапсівзсо, Са|Могпіа Магсй 30 - Аргії! 2, 1996 (Віогк еї аї., М45).
Передумови винаходу - Терапевтичне використання суперанттигенів
Для терапії були запропоновані некон'юговані суперантигени з лікувальною дією, що переважно здійснюється
Через загальну активацію імунної системи (Каїїапа еї аІ., МО 9104053; Тегтап еї аі,, МО 9110680 та МО 9324136; Мемаї! еї а). 1991).
Також пропонувалося використання модифікованих суперантигенів, кон'югованих з частинами молекули, що відшукують мішень (Оойі віеп еї аіЇ.,, МО 9201470; Аргаптзейп еї аі. М/О 9601650, що включені тут у якості посилання). Це робило можливим більш широке терапевтичне використання активації Т-клітин через МВ. 70 Кон'югати, досліджувані до теперішнього часу, мали знижену спорідненість з класом ІІ, що, в свою чергу, призводило до зниження важкої системної токсичності, звичайно зв'язаної з суперантигенами дикого типу.
Тепгптап еї аІ. (МУ/О 9110680 та МО 9324136) у додаткових рекомендаціях пропонував терапію раку з застосуванням модифікованих суперантигенів та фрагментів суперантигенів.
Карріег еї аІ. (МО 9314634) запропонували використовувати некон'юговані суперантигени (ЗЕВ), мутовані для /5 елімінації їх здатності МВ-зв'язування МНС Класу І (у контексті вакцин та для нейтралізації токсичних ефектів суперантигенів). АбБгапйтвзеп ей аЇ. (М/О 9601650) запропонували терапію раку кон'югованими суперантигенами, що мають модифіковану, переважно зменшену, здатність зв'язуватися з антигенами Класу ІІ.
Модифікації включали одиночні мутації, а також конструкцію химер між різними суперантигенами.
Проблеми, які повинні бути вирішені даним винаходом
Сироватки популяцій людини звичайно містять високі титри антитіл проти суперантигенів. Наприклад, для стафілококових суперантигенів відносні титри: Т551-125Е825ЕС1»25ЕЗ3»5ЕС2»5ЕА»ЗЕЮО»ЗЕБЕ. Ці відносні титри говорять про проблеми імуногенності та про проблеми з нейтралізуючими антитілами у випадку, коли ЗЕ вводяться парентерально. На основі лише цих проблем, ЗЕЕ повинен був би бути переважним стафілококовим суперантигеном. Але, в ході досліджень зі злитими білками ми виявили, що здатність Т-клітинної незалежної від сч
МНОС класу Ії цитотоксичності, суперантиген-антіло-залежної цитотоксичності (БАЮСС) кон'югатів ЗЕЕ є слабкою. Титри антитіл до ЗЕ (антитіл-«ЗЕ) також вказують на те, що може бути вигідно модифікувати і) суперантиген "високого титра", щоб він був більш подібний до суперантигену "низького тигра".
Цілі даного винаходу
Першою метою є покращення раніше відомих суперантигенів щодо зниження їх імуногенності та реакції з с зо нейтралізуючими антитілами.
Другою метою є забезпечення суперантигенів з меншими побічними діями при використанні їх в якості - лікарського засобу. ї-
Третьою метою є забезпечення покращених суперантигенів, які можуть бути використані в якості активного початку в лікуванні ссавців, що потерпають від ракових пухлин, аутоїмунних захворювань, інвазій паразитами, ісе) вірусних інфекцій або інших захворювань, пов'язаних з клітинами, які експресують на їх поверхні антигени МНС «Е класу ІІ і/або структури, які є специфічними для відповідного захворювання і зв'язуються з частиною, що впізнає мішень, включених у суперантиген.
Відкриття, яке привело до даного винаходу
Аналіз гомології послідовностей ЗЕА та ЕЕ (Фіг.2) виявив, що неідентичні амінокислотні залишки « сконцентровані у 8 різних районах. Поза цими 8 районами, що складають до 3495 послідовності, ідентичність пт») с двох ЗЕ становить 9795, причому заміни консервативних амінокислот відповідальні за решту відмінностей.
Чотири з цих районів структурно близькі до двох сайтів зв'язування МНС класу ІІ (В: АА 37 - 50, 0: 71 - 78, з Е: 136 - 149 та с: 189 - 195) та, мабуть, не взаємодіють з ТСК. Додаткові чотири райони (А: АА 20 - 27, С: 60 - 62, Е: 161 - 176 та Н: 200 - 207) розташовані на кінці молекули, поблизу можливого сайту зв'язування ТОК,
Який, як вважають, знаходився у канавці між двома субдоменами. Шляхом щеплення індивідуальних районів їх (заміни амінокислотних залишків, які відрізняються) ми тепер винайшли, що властивість ЗЕА-кон'югатів індуціювати цитотоксичну реакцію відповіді, а також посилювати проліферативну реакцію відповіді у відсутності
Ме, МН класу ІІ, обумовлена одним районом у домені зв'язування ТСК ЗЕА. Цей Район (А) може переноситися у -І ЗЕЕ та сильно впливати на активність у відсутності Класу ІІ, хоча має обмежений вплив на МВ-специфічність 5р буперантигену (Фіг.6, Таблиця 2). Мабуть, всі райони (А, С, Е та Н) беруть участь, прямо або опосередковано,
Ш- у взаємодії з ТСК, що проявляється у зміненій стимулюючій дії на мишині Т-клітинні гібридоми (Таблиця 2).
Ге Внаслідок аналогічного способу дії зрозуміло, що подібне структурне розділення цих ТСК МВ-зв'язуючих властивостей відноситься також до суперантигенів, аналогічних ЗЕА та ЗЕЕ. Те ж саме можна сказати і щодо інших типів суперантигенів, у яких зв'язуючи структури організовані інакше. Наше відкриття дозволило нам ов намітити у загальних рисах конструювання химерних суперантигенів, потенційно дуже цінних у якості терапевтичних засобів. (Ф) Винахід ка Перший аспект даного винаходу являє собою спосіб лікування захворювання ссавця шляхом активації його імунної системи за рахунок введення терапевтичне ефективної (імуноактивуючої) кількості модифікованого, бо переважно, химерного суперантигену. Переважним ссавцем є людина. Захворювання, про які йде мова, в основному пов'язані з клітинами, експресуючими на їх поверхні структуру-мішень, що зв'язується з суперантигеном. У більшості випадків ця структура-мішень відрізняється від епітопу ТОК, що звичайно зв'язується з суперантигенами. Зв'язування зі структурою-мішенню робить можливими також зв'язування ТОК і активацію Т-клітин. |Ілюстративними прикладами є антигени МНС класу ІІ та інші структури клітинної поверхні, 65 які можуть експресуватися на клітинах, пов'язаних з ходом захворювань. Ілюстративними захворюваннями є недоброякісні пухлини, що включають ракові пухлини будь-якого типу (такі, як карцинома, саркома, меланома,
лімфома і т. д.), вірусні інфекції, паразитарні інвазії та аутоїмунні захворювання. Рак, який може бути підданий лікуванню, може бути локалізований у ободочній кишці, молочній залозі, шийці матки, нирці, шлунку, тонкій кишці, дванадцятиперстовій кишці, простаті, яйці, шкірі, легені, печінці, підшлунковій залозі, скелеті і т. д., у тому числі також метастазування у різних місцерозташуваннях. Активний інгредієнт даного винаходу придатний також для форм ракових захворювань, резистентних до багатьох лікарських засобів. Клітини, що експресують структуру-мішень, можуть також бути клітинами, які деяким чином контролюють або регулюють розвиток захворювання, що піддається лікуванню.
Характерною особливістю цього способу є те, що у ньому використовують модифікований суперантиген, в 7/0 яких один або декілька амінокислотних залишків у районі (районі І), що забезпечує зв'язування з субпопуляцією
Т-клітин через поліморфний ланцюг ТСК, зокрема ТСК МВ, у суперантигені дикого типу (ЗА І), заміни відповідним амінокислотним залишком, що зберігає активність модифікованого таким чином суперантигену.
Переважні на даний час варіанти відносяться до химерного суперантигену, в якому один або декілька амінокислотних залишків у районі (районі І) першого суперантигену дикого типу були замінені відповідними /5 ОДНИМ або декількома амінокислотними залишками у відповідному районі (районі ІІ) другого суперантигену дикого типу (ЗА ІЇ). Райони І! та ІЇ розрізняються по амінокислотним послідовностям. Суперантигени ! та ІЇ були вибрані таким чином, що райони І і ІЇ можуть заміняти один одного без знищення функції суперантигенів. У цьому зв'язку треба вважати фактом, що деякий район | може бути окремо нездатним до заміни на відповідний район другого суперантигену дикого типу, хоча при заміні разом з іншими районами, що визначають зв'язування ТСК та активацію Т-кліток, результатом є функціонально активний суперантиген. Райони, що розглядаються, звичайно містять менше 20 залишків, зокрема, для суперантигенів, аналогічних ЗЕА. Таким чином, амінокислотний залишок, що заміняє, відрізняється від залишку, що заміняється, та, як повинно бути зрозуміло, включає також консервативні заміни та заміни інших амінокислот, що призводять до функціонально активних модифікованих суперантигенів, які роблять можливими зв'язування з ТОК МВ та активацію субполяції Т-клітин. сч ов Це означає, що модифіковані у відповідності з даним винаходом суперантигени у широкому розумінні включають будь-який модифікований суперантиген, в якому одна або декілька амінокислот у вищезгаданих районах були і) функціонально замінені.
Термін "консервативна заміна" відноситься до заміни амінокислотного залишку хімічно подібним залишком, наприклад, гідрофобного залишку іншим гідрофобним залишком, зарядженого залишку іншим, але однаково с зо зарядженим залишком і т. д.
В якості суперантигенів І, ІП ї т. д. до моменту заяви про пріоритет переважними були стафілококові - ентеротоксини, зокрема, ентеротоксини, які координують цинк, тобто ЗЕА, ЗЕЕ, 5Еб і, можливо, також 5ЕН. М
Райони, що розглядаються, можуть мати будь-яку з вищезгаданих функцій (див. розділ з назвою "Відкриття, яке призвело до даного винаходу" та Експериментальну частину): ісе) 1. Сильний вплив на активність суперантигену як таку і обмежену дію на ТСК-специфічність, зокрема, на «Е
МВ-специфічність. Для суперантигенів ЗЕА-типу це означає район А (положення амінокислот 20 - 27). 2. Глибокий вплив на специфічність щодо зв'язування з поліморфними ланцюгами ТСК, такими як МВ-ланцюг.
Для суперантигенів ЗЕА-типу це означає район С (положення суперантигенів амінокислот 60 - 62), Е (положення амінокислот 110 - 126) та Н (положення амінокислот 200 - 207). «
Для ЗЕА-подібних суперантигенів це означає одну або декілька замін (стосовно щеплення з ЗЕА в 5ЕЕ; з с ЗЕЕ/А-химерам).
Район А: 200, М21т, 52406, К27К ;» Район С: С600, Рб28
Район Е: НІТ11К, НІ1140, 5115У, Е117У, 5118М, 5124М, 51260
Район Н: 02000, Р2065, 0207М. їх У момент заявления пріоритету було переважно проводити всі заміни для кожного району. Для інших суперантигенів могли б також проводитися аналогічні заміни між відповідними положеннями/районами.
Ме, У типовому випадку можна було б починати з одного першого суперантигену, подібного ЗЕЕ та 5ЕО, і потім -І заміняти один або декілька його унікальних МВ-зв'язуючих районів відповідним районом (районами) другого суперантигену (наприклад, ЗЕА), причому перший та другий суперантигени переважно вибирають таким чином, ш- що титр антитіл у нормальних сироватках людини для першого суперантигену нижче, ніж для другого
Ге суперантигену. Для химер 5ЕА та ЗЕЕ найкращі способи відповідають химерам ЗЕЕ/А-А, ЗЕЕ/А-АН,
ЗЕА/Е-ВОЕС з абсолютною перевагою для ЗЕЕ/А-А. Див. Експериментальну частину та фігури.
Разом з районами А, С, Е і Н можуть бути також замінені амінокислотні залишки в інших частинах. Одним дв о ТипоМм обміну є обмін для зменшення здатності зв'язування класу ІЇ, оскільки ця властивість пов'язана зі звичайними побічними ефектами, що зустрічаються при терапії з використанням суперантигенів (загальною
Ф) імунною активацією з супутнім системним вивільненням фактору некрозу пухлин (ТМЕ) та інтерферона-у). Для ко таких суперантигенів, як ЗЕА, 5ЕО і ЗЕЕ, положення, які важливі для здатності координувати іони цинку, можуть бути переважно змінені, тобто, наприклад, положення 225 та 227 в мутації Н225А 5ЕА та, особливо, Ю227А, бо мають позитивний вплив на зменшення токсичних побічних ефектів (див. Абгаптзвгеп еї аі. УУО 09601650 І Ргазег еїг а. 1993).
Інші заміни можуть бути виконані по всій молекулі, якщо вони не порушують функції суперантигену, наприклад, консервативні заміни, зокрема, поза районами, що беруть участь у зв'язуванні з класом ІІ ії ТОК.
Зміни у послідовності ДНК для зміни зв'язування МНС класу ІІ або будь-яка інша зміна на рівні ДНК може бути 65 виконана або перед зміненням у районах забезпечення зв'язування з ТОК, або після змінення. Ці інші типи модифікації можуть бути з тим же успіхом введені перед заміною амінокислот у Районі І. Таким чином, у контексті даного винаходу концепція використання "суперантигену дикого типу" на початку модифікації відповідно до формули винаходу первинно відноситься до амінокислотної послідовності дикого типу у районі І, поза яким можуть мати місце попередні модифікації.
Конструювання химерних та мутованих суперантигенів можна проводити у відповідності зі способами, добре відомими у цій області. Переключення від району, специфічного для одного суперантигену, до відповідного району у другому суперантигені здійснюють на геномному рівні, і воно може виконуватись заміною всієї послідовності або точковими мутаціями тих специфічних основ, які потрібні для одержання у результаті бажаної амінокислотної послідовності. Див., наприклад, експериментальну частину і також цитовані вище посилання 7/0 попереднього рівня знань. Термін "мутація" включає заміну, вбудовування або видалення одного або декількох амінокислотних залишків шляхом модифікації послідовності ДНК, кодуючої білок, який повинен бути мутований.
Суперантиген для використання у способі даного винаходу може бути некон'югованим суперантигеном, модифікованим, як описано вище, тобто модифікованим суперантигеном, який не має специфічно приєднаної частини молекули, що впізнає мішень, але має явну здатність зв'язуватися як з антигенами МНС класу Ії, так і 75. 3 субпопуляцією Т-клітин через ТСК. Більш переважно, модифікований суперантиген, переважно, химерний еуперантиген, кон'югований з частиною молекули, що впізнає мішень. В останньому випадку переважними варіантами є "гібриди" (злиття) між частиною, що впізнає мішень, і модифікованим суперантигеном. Ці кон'югати як такі є новими та становлять собою окремий аспект даного винаходу.
Структури кон'югатів даного винаходу аналогічні відомим раніше кон'югатам антитіло/суперантиген (Оопівіеп еї ам. МО 9201470; Абгаптзеп еї аії., МО 09601650, обидві публікації включені в якості посилання), тобто кон'югати часто підпорядковуються формулі т-8-5А(т) де Т позначає частину молекули, що відшукує мішень, ЗА(т) є модифікованим, переважно химерним, суперантигеном, описаним вище, і В є ковалентним містковим зв'язком, що поєднує Т і БА(т) разом. Т може у сч ов принципі містити додаткові суперантигенні частини молекули (ЗА(т), а ЗА(т) додатково частини молекули, що упинають мішень, хоча у переважних кон'югатах є тільки одна частина, що упізнає мішень, і одна частина, що є і) модифікованим антигеном, як описано вище.
Т може бути у принципі будь-якою структурою, яка здатна зв'язуватися зі структурою поверхні клітини, переважно, специфічною для захворювання структурою. Структура, проти якої спрямований Т, звичайно с зо Відрізняється від (а) епітопу МВ-ланцюга, з яким зв'язується ЗА(т), і (б) епітопів МНС класу ІІб з якими зв'язуються суперантигени. Частину, що упізнає мішень, первинно вибирають серед інтерлейкінів (наприклад, - інтерлейкін-2), гормонів, антитіл, у тому числі, антигензв'язуючих фрагментів антитіл, факторів росту і т.д. М
Див., наприклад, УУоодмогій, Ргесііпісаї апа СіІпісаї демеюртепі ої СуоКІпе іохіп5, ргезепівй аг Ше сопіегепсе "МоіІесцаг арргоаспез Ю сапсег ІттипоїПпегару", АзпУПШе, Мой СагоїЇІпа, Мометрьег 7 - 11, 1993). ісе)
На момент заявления пріоритету було переважно, щоб Т був антитілом (повнорозмірним антитілом, Раб, «Е
Каб)», Ем, одноланцюговим антитілом і будь-яким іншим антигензв'язуючим фрагментом антитіла), з особливою перевагою активних фрагментів антитіл (таких як Раб), спрямованих на так званий епітоп С242 (І Іпаноїт еї аї.,
МО 9301303), або більш переважно, на зв'язуючий епітоп для антитіла 514, специфічного для раку легенів (5(егп еї аі,, МО 8907947). Але це не виключає того, що інші специфічні для раку антитіла можуть функціонувати так « же добре або навіть краще. Термін "антитіло" включає як моноклональні, так і поліклональні варіанти, з с переважно, моноклональні препарати. . Т може бути також спрямований на унікальні структури на більш або менш здорових клітинах, які регулюють а або контролюють розвиток захворювання.
Містковий зв'язок В може бути вибраний, як описано раніше (Юопізіеп еї аІ.,, МО 9201470; і Абргаптзеп еї 81, УМО 9601650), тобто В переважно є гідрофільним та виявляє одну або декілька структур, вибраних з аміда, їх тіоефіра, дисульфіда і т. д. Найбільш відомими містковими зв'язками є зв'язки, одержані рекомбінантними способами, тобто кон'югування у цьому випадку має місце на геномному рівні. У таких випадках переважні ме) олігопептидні містки, що містять гідрофільні амінокислотні залишки, такі як Сіп, Зег, Су, СІШ, Рго, Нів та -І Агу. Особливо переважними В є пептидні містки, що складаються з 1 - 10 амінокислотних залишків, з абсолютною перевагою для З - 7 амінокислотних залишків. Типовим містком є трипептид СІусСІуРго, ЗЕО ІЮ М. - Одержання нових кон'югатів даного винаходу може проводитися у принципі у відповідності з двома
Ге головними шляхами реакцій: 1. Рекомбінантні способи та 2. Хімічне зв'язування упізнаючої мішень частини Т з модифікованим, переважно химерним, суперантигеном (ЗА(т)), описаним вище. Ці способи добре відомі дослідникам зі звичайною кваліфікацією та включають у себе велику кількість варіантів.
Хімічне зв'язування модифікованого некон'югованого суперантигену з частиною Т, що відшукує мішень, часто використовують функціональні групи (наприклад, первинні аміногрупи або карбоксигрупи), які присутні у (Ф, багатьох положеннях у цих сполуках. З цього випливає, що кінцевий продукт буде містити суміш молекул ка кон'югату, що відрізняється по положенням зв'язування, а також гетеро- та гомокон'югати.
Для рекомбінантних кон'югатів (злитих білків) одержаний матеріал кон'югата буде однорідним щодо бор положення зв'язування. Або аміно-кінець химерного суперантигену буде зв'язаний з карбокси-кінцем частини, що упізнає мішень, або навпаки. Для антитіл, таких як інтактні антитіла та антигензв'язуючі фрагменти (Раб, РУ, одноланцюгові антитіла і т. д.), для злиття можуть бути використані або легкий ланцюг, або тяжкий ланцюг. У даний час переважні рекомбінантні кон'югати, найбільш переважно, Рар-фрагменти, та зв'язування аміно-кінця химерного суперантигену з першим константним доменом тяжкого ланцюга антитіла (СНІ), без виключення 65 аналогічного зв'язування з легеим ланцюгом або з доменами МН і Мі, яке також може дати дуже добрі результати.
Основна клітка-хазяїн для широкомасштабного рекомбінантного одержання модифікованих суперантигенів даного винаходу (як злитих форм, так і некон'югованих форм) є Е. соїї. Цей хазяїн забезпечує у принципі два шляхи: внутрішньоклітинне продуцювання та секрецію. Останній варіант є переважним, оскільки він забезпечує очищення правильно укладених білків з періплазми та з культурного середовища. Вищесказане не виключає того, що можна одержувати активні кон'югати також і в інших клітинах-хазяїнах, наприклад, у еукаріотичних клітинах, таких як дріжджі або клітини ссавців.
Фармацевтичні композиції, доза та шляхи введення.
Третім аспектом даного винаходу є фармацевтичні композиції, що містять модифіковані, переважно химерні, 7/0 буперантигени даного винаходу, описані вище (як кон'юговані, так ії некон'юговані форми). Композиції, що розглядаються, відомі у даній області, за виключенням того, що тепер вони містять суперантиген даного винаходу. Так, ці композиції можуть бути у формі ліофілізованого, що складається з часток матеріалу, стерильно асептично приготовленого розчину, таблетки, ампули і т. д. Можуть бути присутні носії, такі як вода (переважно забуферена до фізіологічно прийнятної величини рН, наприклад, за допомогою РВ5 (забуференого 7/5 фосфатом фізіологічного розчина, ЗФР)) або інший твердий або рідкий матеріал. У загальних рисах, ці композиції готують з використанням кон'югату, змішаного, зв'язаного або іншим чином комбінованого з одним або декількома водорозчинними або нерозчинними у воді водними або неводними носіями (або розчиненого в них), якщо необхідно, разом з придатними добавками та ад'ювантами. Обов'язковим є те, що носії та умови не повинні здійснювати негативної дії на активність модифікованого суперантигену.
Звичайно суперантиген даного винаходу повинен продаватися та вводитися у заздалегідь розподілених дозах, кожна з яких містить ефективну кількість кон'югату, яка на основі наведеного тут результату повинна знаходитися у діапазоні ТОнг - 5БОмг, наприклад, у діапазоні 1Онг - їмг або у діапазоні 1Омкг - 5О0мг. Точна доза буде варіювати від випадку до випадку в залежності від ваги та віку пацієнта, шляхів введення, типу захворювання, частини молекули, що відшукує мішень, суперантигену, зв'язку (-В-) і т. д. сч
Шляхи введення є звичайно застосовуваними у даній області шляхами, тобто вбиваюча клітини-мішені ефективна кількість або терапевтично активна кількість суперантигену, модифікованого відповідно до винаходу, (8) приводять у контакт з клітинами-мі-шенями. Для описаних вище показників це більшою частиною означає парентеральне введення, таке як ін'єкція або інфузія (підшкірна, внутрішньовенна, внутрішньоартеріальна, внутрішньом'язова, внутрішньочеревна) ссавцю, наприклад, людині. Розглядаємо модифіковані, переважно, с зо Химерні, суперантигени можуть вводитися місцево або системно.
Під терміном "вбиваюча мішень ефективна кількість" розуміють, що ця кількість є ефективною в активації та - націлюванні Т-клітин для руйнування клітин-мішеней, М
Переважний шлях введення у момент заявления пріоритету відповідає шляху введення, що обговорюється для кон'югатів суперантигенів згідно Юопівіеп еї аі, МО 9201470 і Аргаптзеп еї а)І., МО 9601650. Це означає 1 ре) зв 5-годинну внутрішньовенну інфузію (переважно 4-годинну) на день разом з жарознижуючим засобом «Е (парацетамолом). Введення повинно повторюватися протягом декількох днів, наприклад, протягом 4 днів, з дотриманням безпеки щодо ризику посилення утворення антитіл, спрямованих проти кон'югату.
Суперантигени даного винаходу можуть вводитися або в якості основної терапії, або, в переважних схемах, в якості ад'ювантної (додаткової) терапії у сполученні з хірургією або іншими лікарськими засобами. «
У контексті терапії ми виявили, що препарати антитіл, які є чистими щодо нековалентно зв'язаних тяжких та з с легких ланцюгів антитіл, забезпечують переваги порівняно з препаратами, що містять антитіла, в яких ці ланцюги зв'язані разом через цистинові зв'язки. Четвертим аспектом даного винаходу є терапевтичне ;» використання препарату антитіл, зокрема, препарату Раб, в якому цистеїнові залишки, що зв'язують ланцюги разом, були замінені амінокислотою, що не дозволяє утворення дисульфідних зв'язків, наприклад, серином.
Найбільш переважними специфічними антитілами для цього аспекту винаходу були в момент заявления їх пріоритету С242таб (І Іпапоїт еї аї.,, МО 9301302) та 5Т4 таб, як описано у цитованих вище посиланнях. У переважних варіантах один з ланцюгів антитіла злитий з суперантигеном, який здатний активувати субпопуляцію
Ме, Т-клітин МВ-специфічним чином, як описано вище. Суперантиген може бути антигеном дикого типу, химерою або -І варіантом з точковою мутацією (та їх комбінаціями), описаними вище або ЮОопПівіеп еї аі., МО 9201470 і 5р Абгаптзеп еї аі., УМО 9601650. Цей аспект винаходу включає також фармацевтичні композиції, описані вище, але ш- які містять препарат антитіл, описаних у даному аспекті винаходу, замість химерного суперантигену.
Ге У момент заявления пріоритету було переважно використовувати фрагмент Рар антитіла 5Т4 (ет еї аї.,
МО 8907947) у сполученні з химерою ЗЕЕ/А-А з мутацією 0227А. Переважний фрагмент Рар був мутований в обох ланцюгах у положенні,: що забезпечує міжланцюгові дисульфідні зв'язки (Зег замість Сув). Для збільшення ов виходу злитого з антитілом білка при продуціюванні його у Е. соїї. мутації також проводили у Мк-ланцюзі при визначених положеннях, Див, експериментальну частину. (Ф, МАТЕРІАЛИ ТА СПОСОБИ ка Конструювання химерних генів ЗЕА/5ЕЕ
Конструювання химер 5ЕА/ЗЕЕ виконували з використанням способу на основі полімеразної ланцюгової 6о реакції (ПЛР), перекриваючогося подовження послідовності (Ногоп еї а). ПЛР проводили з О1Тта (Регкіп-ЕІтег) відповідно до рекомендацій виробників. Продуцюємі ПЛР фрагменти клонували у РСЕК-зсгірі (5ігабадепе, ОБ5А) та секвенували для перевірки правильності послідовності. Потім химерні гени суперантигенів субклонували у експресуючий вектор рКР889 (Абгаптзгеп еї аї!., 1995), поєднуючи ці конструкції ЗЕ з частиною тяжкого ланцюга з фрагментом Бар мишиного моноклонального антитіла С215. Рекомбінантні злиті білки ЗЕА та 65 ЗЕЕ одержували у вигляді повнорозмірних поліпептидів у відповідності з консенсусною послідовністю для відщеплення сигнального пептиду (моп Не||пе, 1986).
Експресія та очищення білка.
Штам ШІ 635 Езвспегіспіа сої! К12 використовували для експресії злитих білків РГар-зЕ та мутантів ЗЕА, описаних раніше (Абгаптзгеп еї аї., 1995). Злиті білки Рар-ЗЕ збирали центрифугуванням при 50009 та фракції супернатанту піддавали очищенню на Протеїн С-Сефарозі (Рпагтасіа Віоїесп АВ, Оррзаїа, Змедеп), як описано раніше (Аргайтвгеп еї аї!., 1995). Чистота аффінно очищених варіантів Баб-ЗЕ була » 9095 при аналізі з використанням елекрофорезу у ДСН-ПААГ.
Клітини
Лінію клітин В-клітинної лимфоми любини Каї! та карціноми ободової кишки людини Соіо 205 культивували у 7/0 повному К-середовищі (середовищі КРМІ-1640) з додаванням 1095 фетальної телячої сироватки (С1Ірсо ВК, (Не
Тесппоіодієв, 14. Раїзієу ЗсоШапа), 1мМ глутаміна; НуСіопе Ецгоре, (4. Сгатііпдіоп, 5 х 502М
В-меркаптоетанолу; ІСМ ВіотеаіІсаіз ІМС. Совіа Меза СА, 01М МанНсоО»;Зеготей Віоспготе, 1 х 102М
Нерез-буфера; НуСіопе Еипгоре, Ша. Сгатііпдіоп, 0О,їмг/мл гентаміцина; Віоіодіса! Іпдивзігез КіІрБиї: Веїї
Наетек Ілгаєї, 1 х 109М пірувата натрія; НуСіопе Ешгоре, Ца. Сгатііпоіоп). Клітини СНО, трансфіковані молекулами С215 і СО80 людини, культивували у повному К-середовищі з додаванням 0О,5мг/мл Геніцитину (0418) СіІрсо ВК, І Ме Тесппоіодіеєв, ЦЯ. Раївієу ЗсоМПапа). Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМ) одержували з гепаринізованої крові здорових донорів. Клітини виділяли центрифугуванням у градієнті щільності через РіІсоІ-Радце, як описано раніше (Юопівіеп еї аї., 1991). Т-лімфоцити людини очищували до гомогенності позитивною селекцією з використанням колонок МіпІМАС5 у поєднанні з магнітними гранулами, покритими моноклональними антитілами, специфічними для СО4 і СО8 людини (МіКепуї! Віоїес зтЬН, Сегпгтапу), відповідно до інструкцій виробників. Реагуючі з ЗЕА і ЗЕЕ (5ЕА- і ЗЕЕ-реактивні) клітинні лінії людини одержували, як описано раніше (Оопівіеп еї аї!., 1994). Експресуючу ТСК МВ22 клітинну лінію людини одержували з первинно стимульованої реагуючої з 5ЕА клітинної лінії за допомогою позитивного відбору з магнітними гранулами (ОЮупареадз, ЮОупа! А.5., Моглмау), покритими моноклональними антитілами, специфічними для ТОК МУВ22 с (|птипоїесі, Егапсе). Збагачені клітини містили » 9595 ТОК МВ22" Т-клітин, як визначено проточною Ге) цитометрією (дані не наведені). Мишині Т-клітинні гібрідоми (183, 284 та 11.40) одержували, як описано (Ріешгу еї аї., 1991).
Тест на цитотоксичність
Цитотоксичність вимірювали у стандартному тесті вивільнення Сг після 4 або 6 годин, як описано раніше с (Оопівіеп еї аї., 1991). Клітини Соіо205 або Каї|Ї людини використовували в якості клітин-мішеней. Ефекторні рч- клітини, ЗЕА- або 5ЕЕ- реактивні лінії Т-клітин людини або лінії ТСК Мр227 клітин людини додавали при м відношенні ефектору до мішені 30 : 1. 5Сг-мічені клітини-мішені використовували у тестах на цитотоксичність при 2500 клітин / 200мл повного середовища у лунках мікротитраційного планшету з М-дном. Гібриди Ф
С215Еар-5ЕА/Е додавали при різних концентраціях, як вказано, та вивільнення. "Сг вимірювали на лічильнику «Е
Гейгера. Питому цитотоксичність у відсотках розраховували як 100 х (експериментальне вивільнення у імп/хв. - фонове вивільнення у імп/хв.) / (загальне вивільнення у імп/хв. - фонове вивільнення у імп/хв.)|.
Тести проліферації лімфоцитів
Для вимірювання проліферації 10 5 Т-клітин-респондентів людини інкубували при 372С з 107 опроміненими « (20000рад) стимулюючими клітинами у 200мл повного середовища у 9б-луночному мікротитраційному планшеті й с з О-дном з різними кількостями гібридів С215Рар-ЗЕА/Е протягом 72 годин. Проліферацію оцінювали по а включенню ІНІ-тімідину, як описано (Сопйівіеп еї! а/!., 1988). "» Аналіз інкубованого РГар-зАд продуціювапня 1ІЛ-2
Клітини мишиної гібридоми Т - Т (107) інкубували у 200мл повного середовища К-середовища з химерними білками С215Еар-5ЕД'Е у присутності 2 х 107 стимулюючих клітин ВаїЇ. Після 48 годин супернатанта збирали та о аналізували на присутність мишиного ІЛ-2. Коротше, вміст цитокіна аналізували з використанням пацюкових тА
Ге» проти мишиного цнтокіну в якості зв'язуючих антитіл, Очищені пацюкові антитіла проти мишиного ІЛ-2, пацюковий ІЛ-2 були придбані з РпагмМіпдеп (Зап ОіІедо, СА). Мічені біотином тАбпроти цитокіна, набір
Ш- МесіазіаІп АВС (Месіог І арогаїгіеєв, СА) використовували для виявлення цитокінів. Поглинання визначали в -І 20 |мунорідері (І(ттипоКеадег М.)2000, ІпіегМеа КозкіЇІде, Оептагк) при 405 або 45Онм.
Мутування 5Т4ЕРар г» Конструювання вектору для експресії 5Т4ГРар-5ЕА в Е. сої
Кодуючі Гм частини 5Т4 клонували з гібридоми 514, одержаної від лікаря Петера Стерна (Зіет еї а|., УМО 8907947). Більш детально: кКДНК одержували з мРНК, райони цілих варіабельних доменів і частини сигнальних 5о послідовностей, а також перший константний домен тяжкого ланцюга та константний домен легкого ланцюга
ГФ) ампліфікували за допомогою ПЛР. Олігонуклеотиди 5-СААТТТТСТТОТССАССТТООСТОС-3'ЇЗЕО ІЮ М 2) і о 5-АСТАСТСОАСАТОСАТОСАССТІТАТСАТІУТСТТ-3З'ЇЗЕО ІЮ М 3) використовували для тяжкого ланцюга з одержанням фрагменту 553п. н., тоді, як олігонуклеотиди 60 5-АСТАСТСОАСАТОСОСІТСААСАТОСАСТСАСАКМУууУСМУОО-35ЕО ІЮ М 4) і 5-ВСОССОТСТАСААТТААСАСТСАТТССТОТТОАА-З'ЇЗЕО ІЮО М 5) використовували для легкого ланцюга з одержанням фрагменту 724п. н. для кожного ланцюга секвенували три різних клона та винайшли, що вони були ідентичними. Фрагменти ДНК, придатні для вбудовування в експресуючий вектор (геї), одержували у другій стадії ПЛР. Для збирання Рар-експресійної плазміди варіабельні бо області 5Т4 зливали з послідовностями, що кодують константні області, з мишиного ІдДсСІ/К антитіла С242 тар
(ГІпапоїт еї аї, МО 9301302). Район, що кодує суперантиген, виготовлений з стафілококового ентеротоксину
А(ЗЕА), приєднували після тяжкого ланцюга. Підтверджена послідовність для Мк-ланцюга каркаса антитіла 5Т4 наведена у результатах.
Мутагенез 5Т4
Сім амінокислотних замін вводили у райони, що кодують каркас антитіл. Це були РпеОбзег, ТПАга45і уз,
ПебЗег, Тугб7Зег, Рпе7Зі еи, Тиг77Зег І І еи7вМа!. Подібним чином, залишки Суз у кожному ланцюгу, що беруть участь в утворенні міждоменного дісульфідного зв'язку, були замінені залишками серину, що призводило до мутації Суз4585ег у тяжкому ланцюгу та Суз2145бег у легкому ланцюгу. Ці мутації вводили за допомогою 7/0 Мутагенезу на основі ПЛР та одержану послідовність ДНК підтверджували секвенуванням.
Експресія у ферменті та очищення 5Т4Рар-5ЕА.
Експресійна плазміда містить ген стійкості до канаміцину та тТасОМ5-промотор, який може індуцюватися ІРТО.
Злиті білки очищували з освітленого культурального середовища з використанням Протеїн з-Сефарози та
ЗР-Сефарози (РНагтасіа Віоїес, Оррзаїа, Зуу"едеп) та переводили у цитратний буфер за допомогою Сефадексу 7/5 3-25 в основному, як описано. Характеристика за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ, зворотнофазової
ВЖХ (ВЖХ у зверненій фазі) та мас-спектрометрії показала, що очищений злитий білок мав чистоту 9595 та мав правильну молекулярну масу.
РЕЗУЛЬТАТИ: Модифікації суперантигену
Суперантиген-залежну клітинну цитотоксичність (5ОСС) С215Рар/5ЕА і С215Бар-5ЕЕ проти МНС класу
М'"-клітин Ка) аналізували з використанням ЗЕА- і ЗЕЕ-реактивних Т-клітин людини в якості ефекторних клітинних ліній. Недивлячись на різницю у МВ-специфічності між 5ЕА і ЗЕЕ обидва суперантигена виявляли індукцію порівнюваного ступеня цитотоксичності з обома ефекторними клітинними лініями (Фіг.1). Для розрізнення між ефектами надання МНС класу ІІ і прямими діями 5ЕА і ЗЕЕ у впізнанні ТОК їх досліджували у тесті суперантиген-антитіло-залежної клітинної цитотоксичності (ЗАЮОСС) проти експресуючих С215 клітин сч СоІо205. У цьому тесті Рар-частина спрямовує злитий білок до експресуючих С215 клітин-мішеней і призводить до надання злитих молекул 5Е цитотоксичним Т-клітинам (СТІ) незалежно від молекул МНС класу ІІ (Оопівіеп еї і9) а!І., 1994). Не дивлячись на » 8095 ідентичність амінокислотної послідовності між ЗЕА і 5ЕЕ, взаємодія з ТОК 5ЕА і ЗЕЕ виявляє якісні різниці у цьому типі тесту. Злитий білок С215Рар-5ЕА зберігає його здатність спрямовувати ЗЕА- і БЕЕ-реактивні СТІ. проти МНС класу ІІ-клітин-мішеней (Фіг.1), тодіякС215Бар-ЗЕЕ неможе «М індуціювати цитотоксичність щодо МНС класу ІІ-клітин-мішеней ні з ЗЕА, ні з ЗЕЕ-реактивними СТІ (Фіг.1).
Раніше повідомлялося іншими дослідниками, що відмінність у МВ-специфічності між ЗЕА та ЗЕЄЕ первинно - зв'язана з відмінностями у трьох амінокислотах у петлі, що передує спіралі аб, а у спіралі а5 (Ігміп еї аї., рч- 1992, Нийдзоп еї аїЇ., 1993, Ргазег еї аЇ., 1993 і МоШск еї аїЇ., 1993). Різниці щодо взаємодії з ТОК, повідомлені у цьому дослідженні, не зв'язані зі зміненою ТОК МВ-специфічністю, оскільки здатність С215БаБ-5ЕА о індуцювати МНС класа ІІ-незалежну цитотоксичність не обмежується ЗЕА-реактивними СТІ, але також «Її спостерігається з ЗЕЕ-реактивними СТІ.
Аналіз гомології послідовності ЗЕА та 5ЕЕ (Фіг.2) виявляє, що неідентичні амінокислотні залишки сконцентровані у восьми різних районах. Поза цих вісім районів, що складають до 3495 послідовності, « ідентичність двох ЗЕ становить 9795, причому за решту відмінностей відповідні консервативні амінокислотні 70 заміни. Чотири з негомологічних районів структурно близькі до двох сайтів зв'язування МНС класу І! (В, О,Е і - с б), і вони, мабуть, не взаємодіють з ТСК (Фіг.3). Додаткові чотири райони (А: АА 20 - 27, С: 60 - 62, Р: 161 ц - 176 та Н: 200 - 207) локалізовані на кінці молекули (Фіг.3), поблизу сайту зв'язування ТОК, розташованого у "» канавці між двома субдоменами (Карріег еї аї., 1992). Для дослідження якісної відмінності в упізнанні ТСК між
ЗЕА та ЗЕЕ ми виготовили гібридні білюим щепленням районів з ЗЕА та ЗЕЕ у вигляді химер одного району («ЗЕБЕ/А-А, -С, -Е, Н) у вигляді гібридів двох районів (ЗЕЕ/а-АН) та щепленням районів, локалізованих поблизу «г» сайтів зв'язування МНС класу ІІ на ЗЕЕ у ЗЕА (ЗЕА/Е-ВОЕС) (Фіг.4). Всі ці химерні 5Е експресувалися у вигляді злитих білків з С215Рабр для виявлення відмінностей щодо їх активності у відсутності МНС класа ІІ.
Фо Гібридні білки 5ЕА/Е, злиті з С215РЕРар-часттюю, виявляють відмінність у Рар-націлених тестах -І цитотоксичності. - 50 ЗОСс-активність гібридних білків С215Бар-ЗЕЕ/А проти МНС класу ПП'-клітин Ка) аналізували з використанням ЗЕА-реактивних Т-клітин людини в якості ефекторів. Величини ЕС во всіх гібридів С215Раб-5Е,
ІК) а також С215Еар-ЗЕАмі та -«ЗЕЕМі (мі - дикого типу) знаходяться у межах помилок (наприклад, 10712 - 1071М,
Фіг.5). Єдиною відмінністю, що детектується, є трохи знижене плато для гібриду С215Раб-ЗЕЕ/А-АН, що вказує на втрату Т-клітин. З іншого боку, у ЗАЮСС-експерименті, де цитотоксичність спрямована на лінію МНС класа ПуУС215"-клітин Соо205, тільки гібриди С215Рар-ЗЕЕ/А-А, С215Раб-ЗЕЕ/А-АН та С215Баб-5ЕЕ/Е-ВОЕС
ГФ) індуцювали цитотоксичність, що порівнюється з цитотоксичністю С215Рар-ЗЕАм/і (Фіг.5). Гібрид
С215гар-ЗЕБ/А-Е здатний індуцювати С215-спрямовану цитотоксичність при більш високих концентраціях о (ЕСво » 1079М). Хоча гібрид С215Барб-ЗЕЕ/А-АН здатний індуцювати С215-спрямовану цитотоксичність з такою ж
ЕСво, що і С215ГБаб-ЗЕАмі (наприклад, ЕСво 1073М), абсолютний рівень цитотоксичності значно зменшується 60 (Фіг.5). Ця відмінність могла б бути наслідком обмеженої МВ-специфічності С215Рар-ЗЕЕ/А-АН, хоча здатність індуцювати С215-спрямовану цитотоксичність переважає у відповідаючій субпопуляції Т-клітин. Для подальшого дослідження цієї ідеї ми приготували М р22-олігоклональну лінію СТІ. людини. МВ22 людини аналогічні УВЗ мишей у тому відношенні, що вони являють собою сімейство Ур, специфічне для ЗЕА та неспецифічне для ЗЕЕ, 65 Раніше було показано (Моск еї аЇ., 1993), що головний внесок МВ ЗЕА і ЗЕЕ первинно пов'язаний з відмінністю в трьох амінокислотах між 5ЕА і 5ЕЕ в районі Н (АА 200 - 207). В БОСС-тестах проти МНС класу
П"-клітин Каї! (мішеней) з використанням МВ22-олігокл опальної лінії СТІ в якості ефекторів тільки гібриди, що містять район ЗЕА-Н, здатні давати С215Рар-ЗЕАмл-подібну реакцію відповіді (наприклад, С215Рар-ЗЕЕ/А-Н,
С215гар-ЗЕЕ)/-АН та С215Раб-зЗЕА/Е-ВОЕС, Фіг.6). Гібрид С215ГРар-зЕА/А-А, який здатний індуціювати повну ЗОСС-відповідь з усіма популяціями СТІ в якості ефекторів, у цьому тесті сильно знижений як щодо напівмаксимальної концентрації, так і щодо плато (Фіг.б). Коли цитотоксичність МВ22 СТІ спрямована на лінію
МНС класу П7/С215'-клітин Соіо205, тільки гібриди, що містять як ЗЕА-А, так і ЗЕА-Н (наприклад,
С215гар-ЗЕЕ/А-АН і С215Бар-ЗЕЕ/Е-ВОЕС) райони, здатні індуціювати цитотоксичну відповідь, що порівнювану з відповіддю, що індуцюється С215Рар-зЕАмі (Фіг.б). Гібрид, що містить тільки район А ЗЕА (С215 БРар-5ЕЕ/А-А), 70 індуцює більш низький рівень цитотоксичності з порівняльною величиною ЕС 50. Це вказує на те, що решта активності, що спостерігається з гібридом С215Рар-ЗЕЕ/А-АН, у тесті ЗАЮСС з популяцією цілих Т-клітин в якості ефекторів не є наслідком відповіді, що індуційованої гібридом, у рестриктурованій популяції Т-клітин.
Більш ймовірним поясненням цього спостереження є те, що здатність індуціювати ЗАОСС-відповідь гібридних білків С215Раб ЗЕ первинко зв'язана з районом ЗЕА-А та з меншим внеском з боку районів ЗЕА-Н і -Е. Немає 75 доказів, що ця якість обмежується тільки будь-якою субпопуляцією Т-клітин у поєднаній ЗЕА-ЗЕЕ-відповідаючій популяції Т-клітин, оскільки гібрид С215Рар-5ЕА здатний індуціювати ту ж саму відповідь з ЗЕЕ-реактивними
СТІ, та гібрид С215Рар-ЗЕЕ/А-А здатний повністю відтворювати відповідь, що спостерігається з С215Рар-зЕА.
Гідридні білки ЗЕА/Е, злиті з С215Рар-частиною, виявляють відмінність у РГар-націлених тестах проліферації
Раніше було показано, що очищені спочиваючі неактивні Т-клітини людини індуцюються щодо проліферації при наданні С215Рар-ЗЕА на лінії МНС класу 1/С2157УСО80'-клітин (Гапдо еї аїЇ, 1993). Але, здатність
С215гар-5ЕА індуціювати МНС ІІг-незалежну проліферацію помітно зменшується з С215Рар5зЕЕ (Таблиця 1).
Для дослідження, чи пов'язана ця відмінність в якості також з районом А 5ЕА, як це спостерігали у
ЗАОСС-тестах, ми досліджували проліферативну активність гібридів С215Рар-5Е, що надаються або
СнНО-ОК17/С080", або СНО-С215"7/С880" трансфікованними клітинними лініями, на очищених спочиваючих с 29 Т-клітинах людини. При наданні кон'югатів Гар-ЗЕ на СНО-ОК1"/СО80" не було відмінностей між різними Ге) білками 5Е (дані не наведені). Але, щеплення районів А, С і Н ЗЕА у ЗЕЕ посилюють проліферативну активність порівняно С215Рар-ЗЕЕ. Найкращі результати були одержані шляхом прищеплення районів А та Н ЗЕА, що вказує на важливу роль району А, як це спостерігали для МНС класу ІІ-незалежної цитотоксичності. Можливо, що при застосуванні негативної селекції відмінності між Рар-5ЕА і -ЗЕЕ були більш значними. см 3о МВ-специфічтсть ЗЕ-гібридів. -
Для подальшого дослідження, чи зв'язані гібридні злиті білки С215БРар-ЗЕА/ЗЕЕ з визначеною
МВ-специфічністю, ми використовували ЗЕА-реактивні мишині Т-клітинні гібридоми, експресуючі МВІ1, МВ3 і -
МВ11. З одержаних даних очевидно, що всі досліджені райони, прямо або опосередковано, впливають на (се) взаємодію з ТСК. При щепленні районів С і Є ЗЕА в С215Рар-ЗЕЕ активність щодо ЗЕА- і ЗЕЕ-перехресно реактивної МВ-гібридоми І183 знищується. Ти ж самі химери, мабуть, не впливають або здійснюють незначний З вплив на активність УВ3- і МВ11-гібридом (2.84 і 11.40) порівняно з С215Рар-ЗЕЕ. При щепленні району А ЗЕА у
С215гар-ЗЕЕ активність щодо УВЗ (2.84) збільшується, принаймні, у 10 разів порівняно з С215Рар-ЗЕЕ. Більш помітно виражені ефекти спостерігаються з тою ж клітинною лінією при щепленні району Н 5ЗЕА у С215Рар-5ЕЕ. « дю Цей більш сильний ефект щодо впливу району Н 5ЕА на МВ-специфічність відзначався також у більш ранніх з дослідженнях (Моск еї аї., 1993). Однак, та ж сама химера (С215Рар-5ЕЕ/А-Н), мабуть, зменшує активність с щодо ЗЕА/ЗЕЕ-перехресно реактивних МВ1- і МВ11-гібридом (1183 і 11.40) у 10 раз. На завершення, можна :з» відзначити, що взаємодія з ЗЕА з ТСЕ, мабуть, включає в себе всі варіабельні райони А, С, Е і Н 5БЕА-5ЕБЕ.
Сіркореактивність аж. Сіркореактивність У пробах сироваток людини щодо химерних 5Е досліджували як У поєднаних пробах у 1» різних частин світу, так і в індивідуальних пробах сироваток. Шляхом щеплення обох районів А і Н ЗЕА у ЗЕЕ ми одержали проміжну Сіркореактивність (Фіг.8). Подібну Сіркореактивність спостерігали також проти химери (о) С215гаБ-5ЕЕ/А. Однак окремі щеплення району А ЗЕА (С215Рар-5ЗЕЕ/А-А) дали С215ГРар-ЗЕЕ-подібну - Сіркореактивність, що говорить про те, що за решту сіркореактивності проти С215Рар-зЗЕЕ/А-АН відповідальний район Н ЗЕА. Це вказує на те, що район Н 5ЕА є домінуючим антигенним епітопом у 5ЕА. Сіркореактивність -і 50 поєднаних проб сироваток з інших частин світу (Японії та СІЛА), а також 14 окремих проб з Швеції підтверджує "з один і той же загальний характер результатів (не показано).
РЕЗУЛЬТАТИ: Мутації Рар-частини злитих білків
Експресія конструкцій 5ТАРаьзЕА
Було виявлено, що рівень продуцювання 5Т4Рар-ЗЕА у Е. соїї. у ферменті значно нижче, ніж у інших конструкцій Рар-суперантиген, досліджених у нашій лабораторії. Тому були введені два типа модифікацій для
ГФ) збільшення рівня продуцювання. По-перше, були введені сім різних точкових мутацій у каркасну область легкого 7 ланцюга. Це були Рпе10о5ег, Тиг45іІ уз, Пеб3Зег, Тугб7Зег, Рпе7Зі еш, Тпг/7Зег та І ен78Маї. По-друге, залишки цистеїну, що утворюють дисульфідний зв'язок, що поєднує тяжкий та легкий ланцюги, були замінені залишками серину. Остання модифікація призвела до трикратного збільшення, а 7 точкових мутацій призвели до 60 додаткового 12-кратного збільшення рівня продуцювання. Крім значного збільшеного рівня продуцювання, видалення дисульфідного зв'язку також призвело до одержання більш гомогенного продукту, оскільки виключена можливість реакції реакційноздатних тіолових груп з іншими агентами, що містять тіол.
Модифіковану молекулу 5Т4 перевіряли на споріднення з її антигеном, а також на біологічну активність у
ЗАОСС-тестах. У цих тестах не змогли виявити відмінностей між мутантною формою та формою дикого типу. бо Мутацію Сувз/Зег одержували також у тяжких і легких ланцюгах фрагментів Бар декількох інших моноклональних антитіл. Продукти ставали гомогенними та повністю зберігали їх здатність зв'язування антигену.
Послідовність району каркасної області антитіла для Мк-ланцюга 574:
РАММТОТРТЕРГІ МЗАСОКМТІТСКАЗБОЗУЗМОМАМУООКРООБРТИ ІЗУБО
ТЗЗКУХАСМРОКЕІОБОУОСТОЕТЕТІЗТ ОАЕОГАМУЕСОООУМЗРРТЕОО100
СТКГЕЇК (ЗЕО ІО МО 6).
Підкреслені послідовності є СОК. Положення, виділені більш жирним шрифтом, були мутовані: Рпе1о5зег,
Тига5і уз, Пебззег, ПебЗТНг, Тугб7зЗег, Рпе7Зі еи, Тиг77зЗег і І ен7в8Маї. 7 смвеаьвввм во, смвевьвєвАло, ів сч о сч зо - ча
Підписи до фігур
Фіг1 МНС класу ІІ-залежна та -незалежна цитотоксичність з ЗЕЕ- і БЕА-СТІ людини ісе)
МНС класу ІІ-залежна клітинна цитотоксичність (А і В) ії С215-залежна клітинна цитотоксичність (С і 0) з «Е молекулами С215Рар-ЗЕА (ш) та С215Рар-ЗЕЕ (є) в якості ефекторних молекул. Цитотоксичність аналізували у стандартному 4-годинному тесті вивільнення Сг з використанням ЗЕЕ-реактивної лінії Т-клітин людини (А і
С) та ЗЕА-реактивної лінії Т-клітин людини (В і 0). Клітинними лініями-мішенями були МНС класу ІІ "-клітин КаїЇ « (А і В) та МНС класу ІІ /С2157-клітин Соіо205 (С і 0). Представлені дані з окремих тестів, які представляють два(А Її с) - п'ять (В і 0) незалежних експериментів. З с Фіг.2. Аналіз гомології первинної структури ЗЕА і ЗЕЕ "» Варіабельні райони ЗЕА/5ЕЕ поблизу сайту зв'язування ТОК (А, С, Е і Н) та варіабельні райони поблизу двох " сайтів зв'язування МНС класу ІІ.
Фіг.3. Ескіз моделі ЗЕА
Модель (Моізсгірі тодеї, Кгаціів, 1991) кристала ЗЕА (Зснай еї аї., 1995). Варіабельні райони ЗЕА/ЗЕЕ о поблизу сайта зв'язування ТОК (А, С, Е і Н) та варіабельні райони поблизу двох сайтів зв'язування МНС класу
Ге» ІІ. Іон цинку у вигляді круглого шарика.
Фіг.4. Схематичне представлення химерних молекул 5Е - Відрізки послідовності ЗЕА знижені. Варіабельні райони ЗЕА/ЗЕЕ позначеніА, В, С, О, Е, СІ Н. -І 20 Фіг.5. МНС класу ІІ-залежна та -незалежна цитотоксичність з ЗЕА-СТІ. людини (А) МНС класу ІІ-залежна клітинна цитотоксичність і (В) С215-залежна клітинна цитотоксичність г» С215Гар-ЗЕБЕ/А-А (5), С215Бар-ЗЕБЕ/А-С (5), С215Рар-ЗЕБ/А-Е (0), С215Рар-ЗЕЕ/А-Н (г), С215Бар-5ЕЕ/А-АН (А) і С215Баб-ЗЕА/Е-ВОЕС (0). Цитотоксичність аналізували у стандартному 4-годинному тесті вивільнення Сг з / Використанням ЗЕА- реактивної лінії Т-клітин людини. Клітинними лініями-мішенями були МНС класу ІІ "-клітин
Каї (А) та МНС класу 1Г/С215"-клітин Соіо205 (В). Представлені дані з окремих тестів, які представляють (Ф, п'ять незалежних експериментів. ко Фіг.6. МНС класу ІІ-залежна та -незалежна цитотоксичність з МД" СТІ. людини (А) МНС класу ІІ-залежна клітинна цитотоксичність і (В) С215-залежна клітинна цитотоксичність С215Бар-5ЕА 60 (т), С215Баб-5ЕЕ (9), С215Бар-ЗЕЕ/А-А (5), С215Бар-ЗЕЕ/А-С (є), С215Бар-ЗЕЕ/А-Е (0), С215Раб-5ЕБЕ/А-Н (2),
С215Бар-5ЕБЕ/А-АН (А) і С215Бар-ЗЕА/Е-ВОЕ (0) в якості ефекторних молекул. Цитотоксичність аналізували у стандартному 4-годинному тесті вивільнення Сг з використанням. М р22-відібраної ЗЕА-реактивної лінії
Т-клітин людини. Клітинними лініями-мішенями були МНС класу ІІ "-клітин Раї| (А) та МНС класу 1 /С2157-клітин
Соо205 (В). Представлені дані з окремих тестів, які представляють два незалежних експерименти. бо Фіг.7. МНС класу ІІ-залежна та -незалежна проліферація (не наведена у пріоритетних заявках)
Дія гібридів Рар-ЗЕ на МНС класу ІПІ-залежну (А) та -незалежну (В) проліферацію Т-клітин. Очищені
Т-клітини людини стимулювали протягом 96 годин С215Рар-ЗЕА (щ), С215ГРар-5ЕЕ (5), С215Бар-5ЕБЕ/А-А (»),
С215Рар-5ЕЕ/А-С (є), С215Раб-зЕБ/А-Е (0), С215ГРар-ЗЕЕ/А-Н (г), С215Рав-ЗЕБЕ/А-АН (А) і С215Бав-ЗЕА/Е-ВОЕО (ОО) представленими на МНС класу 1/С215- СНО-ОМКА/С215 - трансфектантах (А) та МНС класу
П/С2157-СНО-СОВ80/С215 - трансфектантах (В). Після 72 годин клітини імпульсно-мітили (ЗНІ-тімідином протягом 24 годин і включену мітку вимірювали та представляли у вигляді напівмаксимальної концентрації (ЕС во).
Представлені дані з окремих тестів, які представляють два незалежних експерименти.
Фіг.8. Сіркореактивність у пулу Ід людини
Пул з » 5000 сироваток зі здорових донорів у Південній Європі проти злитих білків. Серійно розведеному Ід людини давали взаємодіяти протягом 1 години при кімнатній температурі з С215Бар-5ЕАмМіЇ, С215Рар-5ЕЕМІЇ,
С215гар-ЗЕЕ/А-А, С215Рар-5ЕБЕ/А-Н і С215Бар-5ЗЕБЕ/А-АН, імобілізованими на мікротитраційних планшетах при концентрації Інг/лунку. Корекцію на зв'язування з сироватковими білками робили відніманням ОО-величини для
С215Раь у кожній точці. Кожна точка являє собою середнє з двох повторностей (двох проб). Подальші деталі 72 див. у Матеріалах і способах.
Таблиця 1. Очищені Т-клітини людини стимулювали протягом 96 годин відповідними С242Рар-ЗЕ, представленими на МНС класу ІІ-негативних СНО-СО80/С215-трансфектантах. Після 72 годин клітини імпульсно-мітили ЗН-тімідином протягом 24 годин і включену мітку вимірювали та представляли у вигляді напівмаксимальної концентрації (ЕСво)
Таблиця 2. Мишині Т-клітинні гібридоми стимулювали протягом 48 годин або химерним ЕРар-кон'югованим суперантигеном. Активність вимірювали у вигляді продуцювання /Л-2 і представляли у вигляді напівмаксимальної концентрації (ЕСво).
Робота протягом року пріоритету
У спробі зведення до мінімуму токсичності злитого білка (суперантиген-антитіло) С215Рар-ЗЕЕ/А-А химеру с 29 ЗЕБ/А-А мутували у сайтах зв'язування Класу ІЇ, як описано у УУО 9601650 і зливали з С215Раб. Були одержані Ге) конструкції С215РаБ-5ЕЕ/А-А-0227А, С215гаБ-5ЕЕ/А-А-Р47А/0227А, С215гаБ-5ЕЕ/А-А-Н187А/0227А,
С215РгаБ-5ЕЕ/А-А-М/130А/0227А, С215гаБ-5ЕЕ/А-А-0О70А/0227А, С215гаБ-5ЕЕ/А-А-М505/0227А,
С215гаБ-5ЕЕ/А-А-М50О5/070А/0227А, С215Рар-ЗЕБЕ/А-А-Р47У/0227А осп С215Баб-5ЕЕ/А-А-07ОК/0227А. Всі злиті білки досліджували на здатність індуціювати проліферацію РВМС людини для ідентифікації мутантів, що с мають знижену активність порівняно з С215Рар-5ЕЕ/А-А-0227А. Знижену проліферативну активність рч- спостерігали для С215гаБ-5ЕЕ/А-А-Р47А/0227А, С215гаБ-5ЕЕ/А-А-Р47У/0227А, осп
С215гар-ЗЕЕ/А-А-070К/0227А. Деякі з химерних злитих білків досліджували також на титр антитіл у нормальній - сироватці людини (С215Баб-ЗЕЕ/А-А-0227А, С215Баб-5ЕЕ/А-А-0О70А/0227А і С215Бар-5ЕЕ/А-А-0О70К/0227А). «о
Проводили порівняння з С215ГРар-зЕА-0227А і С215Бар-5ЕЕ-0227А. Відносно С215Бар-5ЕА-0227А, титр був набагато нижче для кожної дослідженої химери. Відносно С215Рар-ЗЕЕ-0О227А, титр був трохи вище для кожної в химери.
Це означає заміни у положеннях, що відповідають одній або декільком, переважно двом, з положень 47, 50, 70, 130, 187, 227, згідно нумерації у ЗЕО ІЮ Мо? і 8 у Фіг.2. «
Оскільки багато різних варіантів та змін можуть бути зроблені в об'ємі описаної тут концепції винаходу, - 70 та оскільки можуть бути зроблені модифікації в описаних тут детально варіантах відповідно до передбачених с вимог закону до формули винаходу, повинно бути зрозуміло, що описані тут деталі повинні розглядатись як з» ілюстративні, а не як обмежувальні.
СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ щ»

Claims (1)

  1. Формула винаходу
    1. Кон'югат між суперантигеном дикого типу, який був модифікований, та частиною молекули, що відшукує ш- мішень, який відрізняється тим, що зазначений модифікований суперантиген містить амінокислотну -і 20 послідовність, яка відрізняється від амінокислотної послідовності першого суперантигену дикого типу тим, що один або декілька амінокислотних залишків в районі І, який знаходиться у ТСК (рецептор Т-клітин) - їз зв'язуючому сайті та визначає зв'язування з М 2 -ланцюгом ТСК і активацію Т-клітин, зазначеного першого суперантигену замінені амінокислотними залишками з відповідних положень у другому суперантигені дикого типу вв Таким чином, що зазначений модифікований суперантиген має покращену здатність індуціювати проліферацію та цитотоксичність Т-клітин порівняно з першим суперантигеном дикого типу і має зменшену серореактивність (Ф) порівняно з другим суперантигеном дикого типу, Її модифікований суперантиген додатково містить мутацію, яка ГІ зменшує його здатність зв'язуватися з МНОС-антигенами класу ІІ порівняно також з вказаним суперантигеном дикого типу. во 2. Кон'югат за п. 71, який відрізняється тим, що зазначений перший суперантиген дикого типу є стафілококовим ентеротоксином А (5ЕА).
    З. Кон'югат за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений перший суперантиген дикого типу є стафілококовим ентеротоксином Е (5ЕЕ).
    4. Кон'югат за п. 2, який відрізняється тим, що другий суперантиген дикого типу є стафілококовим де /ентеротоксином Е (ЗЕЕ).
    5. Кон'югат за п. 3, який відрізняється тим, що другий суперантиген дикого типу є стафілококовим ентеротоксином А (5ЕА).
    б. Кон'югат за п. 4, який відрізняється тим, що зазначений район | є районом А, що складається з амінокислотних залишків 20-27 амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ Мо8: бек бі уз Бехг бій бі їІ1їе Азп січ ув Азр о Пец
    5 . 10 АхЯ Шуз Шуз бек біч Шем бій Акд АБп лЛіа їТец бекг 15 20 Ап о бреч Ат біп І1е Тук Тук Тук Авзп бі Був Аїа 25 3о 35 се о се їч- ча (Се) «І « - с з т» (е)) -І - 50 ще) (Ф) ко бо б5
    Тіе ТнЕ б)9 А5п о пуз бі бБег АБр АЗр біп Рде шШец -0 ав . С19 Азпо Тахо Беч пе Рг шув сіу Рпе Рав твЕ свіу БО 55 6о єю Нів Рго Тер Туг Авп АвБр о Шеп де Уаї АБр тез с1у 65 70 Бех Туз Ар о Аїа ТП о Азпо пуз Тук о Буб5 б1іу Був уз 75 80 Уаї Авр Ше Тук с1іу Аїа Туг Тук сіу Тук біп сувз 85 90 95 іа біу біу Так о РКО АБп о Був тТйг о А1їа Ссув Меє тукг 100 105 сту б1іу У"Хаї Тпї Шеч Нібв АБр Абп о АБпо Агдо їечз о ТвЕг см 110 115 120 (о) с19 610 пуб Туз Уаї Рко 116 Ап о рей Тгр І1Тїе Азр сч 20 125 130 м- м- с1іу Гуз біп ТП Так о Уаї Ро І1їе АБр Туз Уа) Був 135 150 ' ' (се) « тах о бБекг Пйу5 Пу5з бій Уаї Тип Маї сіб 010 пе) лд5о5 145 150 155 Й « , , о) с Геч біп АТїа Ага Ні Тук о Гео Ніс сСіу ЩЦує Рав б61у . 160 165 и? Пец о Тут о Аєпо бек о Авро бек Рпе біу сіу Гуз Маї біп 170 175 180 г» Ф Ака біу Пе Іїе Уаї Рпе Ніб5 бБег Бек сі б1у бек -І 185 190
    -0.720 . о й тах о Маї Бек Тук АБр Пес Ре А5р Аїа сіп біу сіп Ко) 195 200 Тут Ркго Або Так Пе Бе Акад о Тіее Ту Ахтд АБр о Агп 205 210 215 Ф) з Пуз тп Ії Азпо бек о біб АБп о їем Ні ЇІ1е Авро без 220 225 6о Тук Без Тук Так тТпг 230 65 Кон'югат за п. 4, який відрізняється тим, що зазначений район І є районом С, що складається з амінокислотних залишків 60-62 амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ Мов.
    8. Кон'югат за п. 4, який відрізняться тим, що зазначений район | є районом Е, що складається з амінокислотних залишків 160-176 амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ Мо8.
    9. Кон'югат за п. 4, який відрізняється тим, що зазначений район | є районом Н, що складається з амінокислотних залишків 200-207 амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ Мо8.
    10. Кон'югат за п. 5, який відрізняється тим, що зазначений район | є районом А, що складається з амінокислотних залишків 20-27 амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ Мо8.
    11. Кон'югат за п. 5, який відрязняється тим, що зазначений район | є районом С, що складається з амінокислотних залишків 60-62 амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ Мо8. 70 12. Кон'югат за п. 5, який відрізняється тим, що зазначений район | є районом Е, що складається з амінокислотних залишків 160-176 амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ Мо8.
    13. Кон'югат за п. 5, який відрізняється тим, що зазначений район | є районом Н, що складається з амінокислотних залишків 200-207 амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ Мо8.
    14. Кон'югат за п. 10, який відрізняється тим, що в ньому проведені такі амінокислотні заміни: К200, М21Т, 5245 і К27К, де позиції визначені в амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ Мов.
    15. Кон'югат за п. 14, який відрізняється тим, що додатково містить мутацію у положенні 227 як визначено у амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ Мов.
    16. Кон'югат за п. 15, який відрізняється тим, що зазначена мутація являє собою Ю227А.
    17. Кон'югат за будь-яким з пунктів 1-16, який відрізняється тим, що зазначена частина молекули, що 2о Відшукує мішень, вибирається з групи, яка складається з активного щодо зв'язування антигена фрагмента антитіла зв'язуючий антиген антитіла, одноланцюгового антитіла, Раб, Е(аб)» і Гм.
    18. Кон'югат за будь-яким з пунктів 1-17 , який відрізняється тим, що використовується для лікування захворювання ссавця шляхом активації його імунної системи.
    19. Кон'югат за п. 18, який відрізняється тим, що захворювання зв'язано з клітинами, експресуючими сч ов структуру-мішень поверхні, яка зв'язується з суперантигеном в епітопі, що структурно відрізняється від епітопа, що зв'язується з ТСК з наступною активацією Т-клітин. і)
    20. Кон'югат за п. 19, який відрізняється тим, що захворювання вибрано з групи, яка складається з ракових захворювань, вірусних інфекцій, паразитарних інвазій і аутоїмунних захворювань. се у у (Се) «І
    - . а т» (е)) - і - і ще) ко бо б5
UA97126295A 1996-03-29 1997-03-26 Кон'югат між суперантигеном дикого типу, який був модифікований, та частиною молекули, що відшукує мішень UA46772C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9601245A SE9601245D0 (sv) 1996-03-29 1996-03-29 Chimeric superantigens and their use
US08/695,692 US6514498B1 (en) 1996-03-19 1996-08-12 Modified/chimeric superantigens and their use
PCT/SE1997/000537 WO1997036932A1 (en) 1996-03-29 1997-03-26 Modified/chimeric superantigens and their use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA46772C2 true UA46772C2 (uk) 2002-06-17

Family

ID=20402035

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA97126295A UA46772C2 (uk) 1996-03-29 1997-03-26 Кон'югат між суперантигеном дикого типу, який був модифікований, та частиною молекули, що відшукує мішень

Country Status (10)

Country Link
US (1) US6514498B1 (uk)
KR (1) KR100537292B1 (uk)
CN (1) CN1318450C (uk)
AR (1) AR006455A1 (uk)
DK (1) DK0835266T3 (uk)
MY (1) MY126352A (uk)
RU (1) RU2198895C2 (uk)
SE (1) SE9601245D0 (uk)
UA (1) UA46772C2 (uk)
ZA (1) ZA972492B (uk)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9402430L (sv) * 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
TW517061B (en) * 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
US7276488B2 (en) * 1997-06-04 2007-10-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
US7635687B2 (en) * 1997-06-04 2009-12-22 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
PT1012259E (pt) * 1997-06-04 2009-11-06 Oxford Biomedica Ltd Vector dirigido a tumor
PL338338A1 (en) * 1997-07-21 2000-10-23 Pharmacia & Upjohn Ab Controllable cytolysis of target cells, cytolysis causing media and composition as well as compound suitable for use in obtaining such media
US6514495B1 (en) * 1998-03-23 2003-02-04 Novozymes A/S Phytase varinats
US7491402B2 (en) * 1998-12-24 2009-02-17 Auckland Uniservices Limited Superantigens SMEZ-2, SPE-G, SPE-H and SPE-J and uses thereof
JP2003515323A (ja) * 1999-11-18 2003-05-07 オックスフォード バイオメディカ（ユーケイ）リミテッド 抗 体
US20030124142A1 (en) * 2000-12-04 2003-07-03 Fraser John David Immunomodulatory constructs and their uses
SE0102327D0 (sv) * 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy
GB0118155D0 (en) * 2001-07-25 2001-09-19 Lorantis Ltd Superantigen
GB0126378D0 (en) * 2001-11-02 2002-01-02 Oxford Biomedica Ltd Antigen
AU2003245182A1 (en) * 2002-05-09 2003-11-11 Auckland Uniservices Limited Streptococcal superantigens spe-l and spe-m
ITRM20020277A1 (it) * 2002-05-17 2003-11-17 Geymonat Spa Muteine del fattore di crescita placentare tipo 1, metodo di preparazione e loro applicazioni.
NZ519371A (en) * 2002-06-04 2004-11-26 Auckland Uniservices Ltd Immunomodulatory constructs and their uses
SE0402025D0 (sv) * 2004-08-13 2004-08-13 Active Biotech Ab Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
US20070178113A1 (en) * 2005-11-22 2007-08-02 Backstrom B T Superantigen conjugate
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
PL3590949T3 (pl) 2010-10-01 2022-08-29 Modernatx, Inc. Kwasy rybonukleinowe zawierające n1-metylo-pseudouracyle i ich zastosowania
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
AU2012318752B2 (en) 2011-10-03 2017-08-31 Modernatx, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
LT2791160T (lt) 2011-12-16 2022-06-10 Modernatx, Inc. Modifikuotos mrnr sudėtys
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
AU2013243951A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of secreted proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
CA2902530C (en) 2013-03-11 2023-05-09 Genzyme Corporation Site-specific antibody-drug conjugation through glycoengineering
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
CA2942769A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Genzyme Corporation Site-specific glycoengineering of targeting moieties
SG10202002153PA (en) 2014-10-09 2020-05-28 Genzyme Corp Glycoengineered antibody drug conjugates
EA201891601A1 (ru) 2016-01-10 2019-03-29 Неоткс Терапьютикс Лтд. Способы и композиции, усиливающие эффективность опосредованной суперантигеном иммунотерапии злокачественных опухолей
AU2020275142A1 (en) 2019-05-15 2021-12-16 Neotx Therapeutics Ltd. Cancer treatment
CN115484978A (zh) 2020-03-05 2022-12-16 尼奥克斯医疗有限公司 使用免疫细胞治疗癌症的方法和组合物
CN113981031A (zh) * 2021-11-01 2022-01-28 山西中医药大学 一种新型t细胞功能检测方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3627644A (en) 1968-03-01 1971-12-14 Hajime Okamoto Process for the cultivation of hemolytic streptococci
US4237224A (en) 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
GB1587244A (en) 1977-07-01 1981-04-01 Memm Spa Streptococcal antigen pharmaceutical compositions containing it and its use in medical diagnosis and treatment
US4268434A (en) 1979-01-09 1981-05-19 Higerd Thomas B Immunosuppressive extracellular product from oral bacteria
US5091091A (en) 1981-11-06 1992-02-25 Terman David S Protein A perfusion and post perfusion drug infusion
US4699783A (en) 1983-03-11 1987-10-13 Terman David S Products and methods for treatment of cancer
US4681870A (en) 1985-01-11 1987-07-21 Imre Corporation Protein A-silica immunoadsorbent and process for its production
FR2589267B1 (fr) 1985-10-25 1991-05-31 Bertin & Cie Procede de traitement d'images, notamment dans une installation de tri postal
US4980160A (en) 1986-10-16 1990-12-25 Biogen, Inc. Combinations of tumor necrosis factors and anti-inflammatory agents and methods for treating malignant and non-malignant diseases
AU3353989A (en) 1988-03-04 1989-09-22 Cancer Research Campaign Technology Limited Improvements relating to antigens
DE3822997A1 (de) 1988-07-07 1990-01-18 Henkel Kgaa Detergensmischung aus nichtionischen und anionischen tensiden und deren verwendung
ATE91152T1 (de) 1988-07-22 1993-07-15 Imre Corp Gereinigte protein a-zusammensetzungen und verfahren zu ihrer herstellung.
DE3921211C1 (uk) 1989-06-28 1990-11-29 Idt Ag Fuer In Vivo Diagnostik Und Therapie, Zuerich, Ch
SE8903100D0 (sv) 1989-09-20 1989-09-20 Pharmacia Ab New pharmaceutical agent
US6126945A (en) * 1989-10-03 2000-10-03 Pharmacia Ab Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
ATE303157T1 (de) 1990-01-17 2005-09-15 David S Terman Verwendung von staphylococcus-enterotoxinen oder verwandte verbindungen für krebs-therapie
DE69122777T2 (de) 1990-07-20 1997-04-10 Pharmacia & Upjohn Ab Zielgerichtete spezifische antikörper-superantigen konjugate und ihre präparation
WO1993024136A1 (en) 1991-01-17 1993-12-09 Terman David S Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
US6090914A (en) * 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
JPH08500328A (ja) 1992-01-28 1996-01-16 ナショナル ジューイッシュ センター フォア イミュノロジィ アンド レスパラトリィ メディスン 突然変異したスーパー抗原の保護作用
SE9402430L (sv) 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten

Also Published As

Publication number Publication date
US6514498B1 (en) 2003-02-04
AR006455A1 (es) 1999-08-25
ZA972492B (en) 1997-10-02
CN1194651A (zh) 1998-09-30
SE9601245D0 (sv) 1996-03-29
KR19990022110A (ko) 1999-03-25
DK0835266T3 (da) 2005-05-30
RU2198895C2 (ru) 2003-02-20
KR100537292B1 (ko) 2006-10-20
MY126352A (en) 2006-09-29
CN1318450C (zh) 2007-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA46772C2 (uk) Кон'югат між суперантигеном дикого типу, який був модифікований, та частиною молекули, що відшукує мішень
EP0835266B1 (en) Modified/chimeric superantigens and their use
CN110818802B (zh) 一种嵌合t细胞受体star及其应用
KR100667121B1 (ko) 바이러스 감염증 치료를 위한 조성물 및 방법
EP1379672A2 (en) Chimeric molecules containing a module able to target specific cells and a module regulating the apoptogenic function of the permeability transition pore complex (ptpc)
KR920008744B1 (ko) Hiv 감염의 치료 및 진단용 모노클로날항체 및 펩티드
CN114751984A (zh) 靶向人Claudin18.2蛋白的单克隆抗体及其应用
Yang et al. A new class of antigen-specific killer cells
CN109422814B (zh) 一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用
EP4089165A1 (en) Engineered t cell, and preparation and use thereof
CN113528452A (zh) 共表达IL-21和hrCD16嵌合受体的免疫细胞及其应用
WO2005019420A2 (en) Chimeric receptors with disrupted dileucine motifs
US20060177454A1 (en) Method of promoting an immune response with a bispecific antibody
CN114369581B (zh) 一种具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒、制备方法及应用
CN113005088B (zh) 工程改造的t细胞、其制备及应用
US20220306740A1 (en) Bispecific binding molecules
WO2021245580A1 (ko) Pa63 도메인 4 변이체를 세포외 결합 도메인으로 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
WO2024047114A1 (en) Adenoviral-based in situ delivery of bispecific t cell engagers
KR20220144327A (ko) Hla-dr 특이적 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
CN116284419A (zh) 靶向人gucy2c蛋白的单克隆抗体及其应用
CN113005088A (zh) 工程改造的t细胞、其制备及应用