CN113981031A - 一种新型t细胞功能检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于医学检测技术领域，提供了一种新型T细胞功能检测方法，包括如下步骤，首先创建TCR刺激和CD28共刺激的T细胞激活双信号模型，采用基因转染表达共同刺激分子CD80或CD86后，流式细胞术定量测定比对CD80与CD86共同刺激与T细胞激活之间的关系，并通过抗体磁珠分选来区分幼稚与记忆T细胞对共同刺激的依赖度；建立Treg抑制和CTLA‑4转内吞模型，并进行激光共聚焦显微检测，以研究Treg对T细胞激活的负向调控作用；通过ABC磁珠染色等方法检测免疫细胞上特异标志物，进行定量可控的T细胞激活和Treg功能试验，来检测T细胞激活是否异常。本发明为类风湿关节炎等自身免疫性疾病早期诊断提供理论依据和实验新资料。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，尤其涉及一种新型T细胞功能检测方法。
背景技术
免疫细胞表型(如CD80、CD86、CD28、CTLA-4等)是判断免疫细胞功能的基础,传统的免疫细胞表型检测是通过流式细胞术(FACS)定量识别抗某种蛋白的荧光抗体的MFI值来确定该蛋白的表达水平。但这种方法因受仪器设置(如激光束能量)每日波动限制而不可靠和不够量化。
现有T细胞激活试验还是用原始的PBMC作为激活对象。这种方法虽然快速简便，但很不准确。因为PBMC中有多种APC亚型(如DC、单核细胞、B细胞)都可以共同刺激T细胞激活,同时人群中各APC亚型比例、共同刺激配体(CD80、CD86)表达量和HLA配型也不同，这些多重因素造成PBMC激活试验不能特异性表明T细胞激活的路径和性质，因而不能进行人群对比；PBMC中有各种T细胞亚型如初始(naive)T细胞(nT细胞)、记忆(memory)T细胞(mT细胞)、普通(conventional)T细胞(cT细胞)、调节性(regulatory)T细胞(Treg细胞)，他们之间的相互作用使得PBMC激活不可能精确评估每种T细胞自身的真实激活状态和程度。
传统的T细胞激活手段是使用CD3+CD28+抗体磁珠，用于提供调节T细胞激活和扩增需要的初级和协同刺激信号。此法虽然能激活CD28但却不能区分CD28的两个配体(CD80、CD86)间的差别。在当前对CD80、CD86双配体与CD28、CTLA-4双受体的系统中，CD80和CD86的功能差别尚有待进一步探索的前提下，用CD28抗体激活CD28显然是不可取的。
在正常情况下自身免疫反应T细胞处于非激活状态，但如果Treg调节功能本身的障碍也可以导致此类T细胞异常激活，间接诱发自身免疫性反应和疾病。但临床上Treg免疫调节功能的测试还是空白，以至于进一步检测Treg调节作用的分子机制试验更无从谈起。
综上，目前最新研究成果和推论表明诊断人体自身免疫性反应和疾病必须从自身免疫性T细胞激活和调节机制入手。
然而目前临床现有的T细胞功能检测不够可靠、难以量化且无特异性，亟待更新、改进及补充。
发明内容
本发明提供一种新型T细胞功能检测方法，旨在解决现有技术存在的问题。本发明是这样实现的，一种新型T细胞功能检测方法，包括如下步骤：
S1：在对I型糖尿病患者、类风湿性关节炎患者及健康对照者的血液样本采集并适当分组后，首先创建TCR刺激和CD28共刺激的T细胞激活双信号模型；
S2：采用基因转染表达共同刺激分子CD80或CD86后，流式细胞术定量测定比对CD80与CD86共同刺激与T细胞激活之间的关系，并通过抗体磁珠分选来区分幼稚与记忆T细胞对共同刺激的依赖度；
S3：建立Treg抑制和CTLA-4转内吞模型，并进行激光共聚焦显微检测，以研究Treg对T细胞激活的负向调控作用；
S4：通过ABC磁珠染色等方法检测免疫细胞上特异标志物，进行定量可控的T细胞激活和Treg功能试验，来检测T细胞激活是否异常。
进一步地，S4的T细胞检测步骤如下：
S401：流式细胞染色荧光ABC磁珠蛋白表达定量；
S402：T细胞亚群磁珠分选和纯化；
S403：T细胞无抗原共同刺激试验；
S404：T细胞有抗原共同刺激试验；
S405：Treg负向免疫调节试验；
S406：T细胞转内吞试验。
进一步地，S401包括如下步骤：
S4011：分别进行ABC表面二抗的荧光抗体FACS标记和细胞GFP融合蛋白的荧光抗体FACS标记；
S4012：ABC表面二抗的荧光抗体FACS标记后建立ABC珠表面二抗数量与荧光抗体MFI间的标准曲线，细胞GFP融合蛋白的荧光抗体FACS标记后建立细胞GFP融合蛋白MFI与荧光抗体MFI间的标准曲线；
S4013：上述的两个标准曲线建立后建立ABC珠表面与细胞GFP融合蛋白MFI的标准曲线；
S4014：导出蛋白分子数量与细胞表面GFP融合蛋白MFI运算公式。
进一步地，S403包括如下步骤：
S4031：CD11c+树突状细胞加入CTLA-4Ig共同刺激受体抑制剂，Violet荧光标记T细胞加入游离anti-CD3TCR刺激抗体，免疫调节T细胞加入游离anti-CTLA-4抑制抗体；
S4032：将上述的三种细胞进行恒温培养5天，在此期间加入细胞计数珠；
S4033：FACS检测T细胞分裂及细胞计数；
S4034：分析抑制T细胞分裂及其与CTLA-4的关系。
进一步地，S404包括如下步骤：
S4041：CHO-CD80vsCD86GFP细胞加入CTLA-4Ig共同刺激受体抑制剂，Violet荧光标记T细胞加入游离anti-CD3TCR刺激抗体；
S4042：将上述的两种细胞进行恒温培养5天，在此期间加入细胞计数珠；
S4043：FACS检测T细胞分裂及细胞计数；
S4044：分析比较CD80vsCD86共同刺激T细胞分裂相关动力学关系。
进一步地，S405包括如下步骤：
S4051：CHO-HLA-DR4+CD80vsCD86GFP细胞加入CTLA-4Ig共同刺激受体抑制剂，Violet荧光标记T细胞加入游离的TCR刺激免疫超级抗原TSST-1；
S4052：将上述的两种细胞进行恒温培养5天；
S4053：荧光特异性抗体标记TCR-Vβ2，在此期间加入细胞计数珠；
S4054：FACS检测T细胞分裂及细胞计数；
S4055：分析比较CD80vsCD86共同刺激T细胞分裂相关动力学关系。
进一步地，S406包括如下步骤：
S4061：CD4+T细胞加入游离anti-CD3TCR刺激抗体，加入CHO-CD80GFP细胞；
S4062：FACS检测T细胞的GFP捕获，荧光显微镜分析T细胞的GFP吞噬。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的一种新型T细胞功能检测方法，在前期研究所揭示的T细胞激活阈值及功能变化对自身免疫病发现有意义的基础上，提出建立一套新型T细胞功能检测方法用于自身免疫病的早期诊断，旨在建立基于TCR敏感度和T细胞激活阈值基础上的检测新方法，用以分析非CD28依赖性T细胞激活及Treg免疫调控功能异常对自身免疫疾病的诊断意义，为该病早期诊断提供理论依据和实验新资料。
附图说明
图1为本发明的流式细胞染色荧光ABC磁珠蛋白表达定量检查流程图；
图2为本发明的T细胞亚群磁珠分选和纯化检查流程图；
图3为本发明的T细胞无抗原共同刺激试验检查流程图；
图4为本发明的T细胞有抗原共同刺激试验检查流程图；
图5为本发明的Treg负向免疫调节试验检查流程图；
图6为本发明的T细胞转内吞试验检查流程图；
图7为本发明的CD86共同刺激及CTLA-4对CD86转内吞对T细胞激活的抑制作用示意图；
图8为本发明的CTLA-4基因突变患者血液中调节性T细胞上CTLA-4蛋白表达缺失和功能障碍的示意图；
图9为本发明的免疫功能缺陷患者血液中调节性T细胞上CTLA-4蛋白表达正常但功能障碍的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、前期课题组已获取的相关预实验结果：
①本实验组已通过创建T细胞的双信号模型，分析了在特定TCR刺激信号下，变化CD28共同刺激信号的水平对T细胞增值的动态变化影响，以及在依赖CD28共同刺激信号的T细胞激活中，CTLA-4调控CD86水平对T细胞增值的抑制规律。从而初步确定了在研究CTLA-4对CD28共同刺激信号的调节的实验中的检测指标，及实验手段。
请参阅图7，(A)CD86转内吞作用可以被拮抗CTLA-4的抗体来阻断
(B)CD86在表达CD86上的丢失协同CD86在表达CTLA-4细胞中捕获(C、D和E)CTLA-4对的CD86转内吞与CD86蛋白表达量和共培养时间成比例关系
(F、G和H)CD86在表达CD86上剩余分子数量与CD86在表达CTLA-4细胞中捕获量成反比。
②同时运用这些实验方法和技术进行了首创性的临床研究，课题组已经完成检测先天性遗传免疫调节基因缺陷携带者共20例，其中12例自身免疫性疾病患者完成CD3+CD4+CD25+FOXP3+CTLA-4+调节性T细胞表型和功能状态检测。发现患者血液中调节性T细胞表达CTLA-4的数量和质量显著低于健康对照组(图8，图9)，实践了在双信号实验模型中检验Treg上CTLA-4通过转内吞抗原呈递细胞(APC)上的CD80或CD86来调节其对CD28的共同刺激信号的影响，来实现抑制T细胞激活，对已有实验基础进行了成功的前期验证。
请参阅图8，(A).调节T细胞中表达的基因突变的CTLA-4蛋白受体总表达量下降
(B).调节T细胞中的基因突变的CTLA-4蛋白受体转内吞CD80-GFP配体机制降低。
(C).CHO细胞中转染的突变CTLA-4蛋白受体吞噬游离CD80-Ig配体功能下降。
(D).带有突变的CTLA-4蛋白受体的负向调节T细胞(Treg)抑制功能障碍。
请参阅图9，(A).调节T细胞中表达的基因突变的CTLA-4蛋白受体总表达量无异常
(B).调节T细胞中CTLA-4基因突变的CTLA-4蛋白受体吞噬游离CD80-Ig配体机制降低。
二、请参阅图1-6，本发明提供的一种新型T细胞功能检测方法，包括如下步骤：
第一步：在对I型糖尿病患者、类风湿性关节炎患者及健康对照者的血液样本采集并适当分组后，首先创建TCR刺激和CD28共刺激的T细胞激活双信号模型；
第二步：采用基因转染表达共同刺激分子CD80或CD86后，流式细胞术定量测定比对CD80与CD86共同刺激与T细胞激活之间的关系，并通过抗体磁珠分选来区分幼稚与记忆T细胞对共同刺激的依赖度；
第三步：建立Treg抑制和CTLA-4转内吞模型，并进行激光共聚焦显微检测，以研究Treg对T细胞激活的负向调控作用；
第四步：通过ABC磁珠染色等方法检测免疫细胞上特异标志物，进行定量可控的T细胞激活和Treg功能试验，来检测T细胞激活是否异常。
本发明适用于先天遗传性和后天获得性的免疫基因或蛋白功能缺陷的人，T细胞检测步骤流程如下：
1.流式细胞染色荧光ABC磁珠蛋白表达定量，流程如图1。
1.1分别进行ABC表面二抗的荧光抗体FACS标记和细胞GFP融合蛋白的荧光抗体FACS标记；
1.2ABC表面二抗的荧光抗体FACS标记后建立ABC珠表面二抗数量与荧光抗体MFI间的标准曲线，细胞GFP融合蛋白的荧光抗体FACS标记后建立细胞GFP融合蛋白MFI与荧光抗体MFI间的标准曲线；
1.3上述的两个标准曲线建立后建立ABC珠表面与细胞GFP融合蛋白MFI的标准曲线；
1.4导出蛋白分子数量与细胞表面GFP融合蛋白MFI运算公式。
2.T细胞亚群磁珠分选和纯化，流程如图2。
3.T细胞无抗原共同刺激试验，流程如图3。
3.1CD11c+树突状细胞加入CTLA-4Ig共同刺激受体抑制剂，Violet荧光标记T细胞加入游离anti-CD3TCR刺激抗体，免疫调节T细胞加入游离anti-CTLA-4抑制抗体；
3.2将上述的三种细胞进行恒温培养5天，在此期间加入细胞计数珠；
3.3FACS检测T细胞分裂及细胞计数；
3.4分析抑制T细胞分裂及其与CTLA-4的关系。
4.T细胞有抗原共同刺激试验，流程如图4。
4.1CHO-CD80vsCD86GFP细胞加入CTLA-4Ig共同刺激受体抑制剂，Violet荧光标记T细胞加入游离anti-CD3TCR刺激抗体；
4.2将上述的两种细胞进行恒温培养5天，在此期间加入细胞计数珠；
4.3FACS检测T细胞分裂及细胞计数；
4.4分析比较CD80vsCD86共同刺激T细胞分裂相关动力学关系。
5.Treg负向免疫调节试验，流程如图5。
5.1CHO-HLA-DR4+CD80vsCD86GFP细胞加入CTLA-4Ig共同刺激受体抑制剂，Violet荧光标记T细胞加入游离的TCR刺激免疫超级抗原TSST-1；
5.2将上述的两种细胞进行恒温培养5天；
5.3荧光特异性抗体标记TCR-Vβ2，在此期间加入细胞计数珠；
5.4FACS检测T细胞分裂及细胞计数；
5.5分析比较CD80vsCD86共同刺激T细胞分裂相关动力学关系。
6.T细胞转内吞试验，流程如图6。
6.1CD4+T细胞加入游离anti-CD3TCR刺激抗体，加入CHO-CD80GFP细胞；
6.2FACS检测T细胞的GFP捕获，荧光显微镜分析T细胞的GFP吞噬。
以下是本发明通过与传统T细胞功能检测方法的对比本发明的优势：
(1)新的标志物的定量分析及数据库的建立：免疫细胞表型(如CD80、CD86、CD28、CTLA-4等)是判断免疫细胞功能的基础,传统的免疫细胞表型检测是通过流式细胞术(FACS)定量识别抗某种蛋白的荧光抗体的MFI值来确定该蛋白的表达水平。但这种方法因受仪器设置(如激光束能量)每日波动限制而不可靠和不够量化。如果用抗体结合能力(Abbindingcapacity，ABC)磁珠染色结合流式细胞术的新方法既可以不受机器影响更可以准确测算出蛋白分子的数目。这将大大提高表型检查的可靠性和准确性，同时可以建立进行大样本分析的数据库，提供各种蛋白的表达基线用于人群比对。
(2)用细化的T细胞亚型的激活检测取代全外周血单个核细胞(PBMC)激活：现有T细胞激活试验还是用原始的PBMC作为激活对象。这种方法虽然快速简便，但很不准确。因为PBMC中有多种APC亚型(如DC、单核细胞、B细胞)都可以共同刺激T细胞激活，同时人群中各APC亚型比例、共同刺激配体(CD80、CD86)表达量和HLA配型也不同，这些多重因素造成PBMC激活试验不能特异性表明T细胞激活的路径和性质，因而不能进行人群对比；PBMC中有各种T细胞亚型如初始(naive)T细胞(nT细胞)、记忆(memory)T细胞(mT细胞)、普通(conventional)T细胞(cT细胞)、调节性(regulatory)T细胞(Treg细胞)，上述细胞之间的相互作用使得PBMC激活不可能精确评估每种T细胞自身的真实激活状态和程度。所以取代PBMC激活，并用分离和纯化的单独的APC和T细胞亚型进行激活试验极有必要；通过比较，更容易确定致病T细胞亚群并进行更有针对性的检测。
(3)创建新型双信号T细胞激活模型：传统的T细胞激活手段是使用CD3+CD28+抗体磁珠，用于提供调节T细胞激活和扩增需要的初级和协同刺激信号。此法虽然能激活CD28但却不能区分CD28的两个配体(CD80、CD86)间的差别。在当前对CD80、CD86双配体与CD28、CTLA-4双受体的系统中，CD80和CD86的功能差别尚有待进一步探索的前提下，用CD28抗体激活CD28显然是不可取的。而使用CD28的配体CD80或CD86即更符合生理实际又有助于发现人群中CD80与CD86的功能区别及其对T细胞激活与调控的价值。
(4)创建新型T细胞调节控制模型：在正常情况下自身免疫反应T细胞处于非激活状态，但如果Treg调节功能本身的障碍也可以导致此类T细胞异常激活，间接诱发自身免疫性反应和疾病。但临床上Treg免疫调节功能的测试还是空白，以至于进一步检测Treg调节作用的分子机制试验更无从谈起。本发明利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪建立新型DC介导的Treg抑制幼稚T细胞和CTLA-4转内吞试验模型研究Treg负向调节对T细胞激活的控制作用。将有利于研究CD80、CD86和CD28、CTLA-4的功能配对关系，填补该项功能检测缺失的空白。
本发明的目的是：
1、对免受检者及家属(如果受检者阳性)疫检查点基因测序：CTLA-4和PD-1是否有原发性基因突变(即阳性)。
2、检测受检者血液中T细胞活化对TCR刺激的敏感性，及其对CD28共刺激的依赖性。进一步分析此CD28依赖度与后续以CTLA-4为主的T细胞负向调节的相关性。
3、分析受检者共刺激配体CD80、CD86在设定CD28依赖性T细胞激活阈值中的区别，研究这两种共刺激配体蛋白数量与所激活的T细胞分化之间的动态变化关系。
4、分析比较由CD80、CD86所激活的T细胞功能特性蛋白的表达变化。进一步探讨表型与功能的相关性。明确两个共同刺激配体CD80、CD86与两个共同刺激受体CD28、CTLA-4的功能配对关系及其机制。
5、使用APC-freeTreg体外调节(或抑制)的全新方法测试分析受检者中Tregs以CTLA-4为主导的负向调节功能。
综上所述，本发明提出的新型T细胞功能检测方法，本发明在前期研究所揭示的T细胞激活阈值及功能变化对自身免疫病发现有意义的基础上，提出建立一套新型T细胞功能检测方法用于自身免疫病的早期诊断，旨在建立基于TCR敏感度和T细胞激活阈值基础上的检测新方法，用以分析非CD28依赖性T细胞激活及Treg免疫调控功能异常对自身免疫疾病的诊断意义，为该病早期诊断提供理论依据和实验新资料。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种新型T细胞功能检测方法，其特征在于：包括：
S1：在对I型糖尿病患者、类风湿关节炎患者及健康对照者的血液样本采集并适当分组后，首先创建TCR刺激和CD28共刺激的T细胞激活双信号模型；
S2：采用基因转染表达共同刺激分子CD80或CD86后，流式细胞术定量测定比对CD80与CD86共同刺激与T细胞激活之间的关系，并通过抗体磁珠分选来区分幼稚与记忆T细胞对共同刺激的依赖度；
S3：建立Treg抑制和CTLA-4转内吞模型，并进行激光共聚焦显微检测，以研究Treg对T细胞激活的负向调控作用；
S4：通过ABC磁珠染色等方法检测免疫细胞上特异标志物，进行定量可控的T细胞激活和Treg功能试验，来检测T细胞激活是否异常。
2.如权利要求1所述的一种新型T细胞功能检测方法，其特征在于：2.S4的T细胞检测步骤如下：
S401：流式细胞染色荧光ABC磁珠蛋白表达定量；
S402：T细胞亚群磁珠分选和纯化；
S403：T细胞无抗原共同刺激试验；
S404：T细胞有抗原共同刺激试验；
S405：Treg负向免疫调节试验；
S406：T细胞转内吞试验。
3.如权利要求1所述的一种新型T细胞功能检测方法，其特征在于：S401包括如下步骤：
S4011：分别进行ABC表面二抗的荧光抗体FACS标记和细胞GFP融合蛋白的荧光抗体FACS标记；
S4012：ABC表面二抗的荧光抗体FACS标记后建立ABC珠表面二抗数量与荧光抗体MFI间的标准曲线，细胞GFP融合蛋白的荧光抗体FACS标记后建立细胞GFP融合蛋白MFI与荧光抗体MFI间的标准曲线；
S4013：上述的两个标准曲线建立后建立ABC珠表面与细胞GFP融合蛋白MFI的标准曲线；
S4014：导出蛋白分子数量与细胞表面GFP融合蛋白MFI运算公式。
4.如权利要求1所述的一种新型T细胞功能检测方法，其特征在于：4.S403包括如下步骤：
S4031：CD11c+树突状细胞加入CTLA-4Ig共同刺激受体抑制剂，Violet荧光标记T细胞加入游离anti-CD3TCR刺激抗体，免疫调节T细胞加入游离anti-CTLA-4抑制抗体；
S4032：将上述的三种细胞进行恒温培养5天，在此期间加入细胞计数珠；
S4033：FACS检测T细胞分裂及细胞计数；
S4034：分析抑制T细胞分裂及其与CTLA-4的关系。
5.如权利要求1所述的一种新型T细胞功能检测方法，其特征在于：S404包括如下步骤：
S4041：CHO-CD80vsCD86GFP细胞加入CTLA-4Ig共同刺激受体抑制剂，Violet荧光标记T细胞加入游离anti-CD3TCR刺激抗体；
S4042：将上述的两种细胞进行恒温培养5天，在此期间加入细胞计数珠；
S4043：FACS检测T细胞分裂及细胞计数；
S4044：分析比较CD80vsCD86共同刺激T细胞分裂相关动力学关系。
6.如权利要求1所述的一种新型T细胞功能检测方法，其特征在于：S405包括如下步骤：
S4051：CHO-HLA-DR4+CD80vsCD86GFP细胞加入CTLA-4Ig共同刺激受体抑制剂，Violet荧光标记T细胞加入游离的TCR刺激免疫超级抗原TSST-1；
S4052：将上述的两种细胞进行恒温培养5天；
S4053：荧光特异性抗体标记TCR-Vβ2，在此期间加入细胞计数珠；
S4054：FACS检测T细胞分裂及细胞计数；
S4055：分析比较CD80vsCD86共同刺激T细胞分裂相关动力学关系。
7.如权利要求1所述的一种新型T细胞功能检测方法，其特征在于：S406包括如下步骤：
S4061：CD4+T细胞加入游离anti-CD3TCR刺激抗体，加入CHO-CD80GFP细胞；
S4062：FACS检测T细胞的GFP捕获，荧光显微镜分析T细胞的GFP吞噬。
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