KR20190141123A - 생물학적 세포들 간의 상호작용 결정 방법 - Google Patents

생물학적 세포들 간의 상호작용 결정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하는, 세포 공여자로부터 수득되는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계를 포함하는, 세포 공여자의 질환 또는 질환에 대한 소인을 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하는, 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 대상체로부터 수득되는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정함으로써 상기 대상체가 치료제로의 치료에 대해 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 시험 물질이 세포가 상호작용하는 성향을 변경시키는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

생물학적 세포들 간의 상호작용 결정 방법
본 발명은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단(subpopulation)을 포함하는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하는, 세포 공여자로부터 수득되는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계를 포함하는, 세포 공여자의 질환 또는 질환에 대한 소인을 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하는, 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 대상체로부터 수득되는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정함으로써 상기 대상체가 치료제로의 치료에 대해 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 시험 물질이 세포가 상호작용하는 성향을 변경시키는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
다양한 자극, 예컨대 생물학적 제제 및 소분자로의 교란(perturbation) 후 세포 거동의 전체적인 규모에서의 이해는, 세포-대-세포 관계 분석을 포함하는 단일-세포 수준에서의 분석에 의해 상당히 촉진된다. 높은-컨텐트 이미지화 분야는, 세포-집단 표현형의 상세 분석에서 세포-대-세포 다양성 및 세포-마이크로환경이 드문 사건의 결정 및 집단 수준 표현형의 완전한 이해에 필요하다는 증거를 계속해서 제공하고 있다(문헌(Snijder et al. (2011) Nature Reviews 12, 119)에서 검토됨). 세포 표현형의 전체적인 수준에서의 차이는 주로 세포 밀도, 세포-세포 접촉, 상대적 위치 및 세포-공간을 포함하는 특화된 틈새 마이크로환경을 만드는 세포 집단을 발달시키는 고유 특성에 의해 결정된다. 또한, 단일-세포 수준에서, 동일한 교란에 대한 세포-반응의 이질성이 특징화될 수 있다(Slack et al. (2008) PNAS 105(49): 19306-11). (암세포가 항암 약물과 반응하는 정도의 조사와 관련하여) 세포 이질성의 복잡성은, 환자가 치료 동안 동안 세포 수준에서 가질 수 있는 광범위한 효과에 대한 기능적 중요성을 나타낸다. 그러나, 서브-세포 및 단일-세포 분해에 의해 추진된 집단-특성 분석에 대한 기초를 마련한 연구는 유전적으로 동일한 세포주에 의존해 왔으며, 이는 인간 건강 및 질환과 생리학적으로 관련되지 않고 세포 및 범-세포 과정을 촉진하기 위해 생물체에서 정상적으로 일어나는 집단간 소통이 결여된다.
면역계는 2가지 방식: 1) 가용성 신호전달 분자 및 2) 세포의 물리적 상호작용에 의해 조절된다. 면역계를 조절하는 가용성 신호전달 분자의 예는 시토카인, 케모카인이며 또한 소분자, 예컨대 아데노신을 포함한다. 세포-세포 상호작용이 면역 기능을 조절하는 경우의 예는 세포 표면 수용체와 상호작용하는 세포-표면 결합된 리간드, 예컨대 MHC의 T-세포 수용체와 또는 PD-1의 이의 리간드 PD-L1과의 상호작용이며, 이 둘 모두 표적된 반응을 유도하거나 반응을 조절하는 데 필요하다. 또한, 가용성 인자는 2개의 상이한 표적 세포 상의 수용체와 상호작용하여 이들이 가까운 공간적 근접성을 갖게 하고 신호전달 사건을 유도할 수 있다. 예는 하나의 세포 상의 Fc 수용체에 결합할 수 있고 또 다른 세포 상의 표적 항원을 인식할 수 있는 항체를 포함한다. 구체적으로, 이는 면역조절 약물 및 생물의약품, 예컨대 블리나투모맙(Blinatumomab)(이-특이적 항체; CD19/CD3) 또는 리툭시맙(rituximab)(항-CD20 항체)의 새로운 분야에 관한 한 그러하다. 가용성 인자는 멀리서 작용할 수 있지만, 세포-표면 결합된 조절 분자는 세포가 그의 작용을 위해 가까이 공간적으로 근접하는 것을 요구한다. 수용체 매개된 신호전달을 통한 면역세포의 물리적 상호작용인 이 후자의 인자는 유도되고 지시되며 강한 면역 반응 및 세포 제거/프로그래밍된 세포 죽음을 일으키는 데 필수적이다. 또한, 세포-세포 접촉 소통은 상기 설명되는 바와 같이 생물학적 면역조절 약물의 작용 기작에 대한 기초이다.
가용성 신호전달 인자의 농도를 측정하기 위한 많은 잘 확립된 수단, 예컨대 면역 기능을 또는 활성을 평가하기 위한 ELISA, ELISPOT 및 알파 스크리닝이 있다. 면역 조절에 수반되는 가용성 인자의 추적은 질환의 진단 및 다른 건강 관련 생물학적 과학에서 일상적으로 이용된다. 그러나, 현재 생물의약품, 약물 또는 다른 소화합물에 의해 고처리량 및 견고한 방식으로 변형되는 면역조절을 세포-세포 접촉 수준에서 결정하는 능력은 있더라도 제한적이다. 따라서, 세포-세포 접촉, 및 관심 분자로 시스템을 교란함으로써 그들이 어떻게 변경되는 가를 체계적으로 측정하는 능력은, 특정 분자가 면역조절 특성을 갖는지 또는 그렇지 않은지를 나타낼 수 있다. 역으로, 시스템을 공지된 면역조절 효과의 분자로 도전할 때, 세포-세포 접촉의 변화로서 효과를 관찰하는 것은 모델 시스템의 상태에 대한 정보를 나타낼 수 있다.
세포내 소기관의 상호작용을 결정하는 방법은 헬무트 등(Helmuth et al. (2010) BMC Bioinformatics 2010, 11: 372)에 의해 제안되었다. 이 방법은 세포내 객체 X와 Y의 2개의 세트 간의 당김(attraction)을 분석함으로써 통계적 프레임웍을 유도한다. 그러나, 이 문헌에서 사용되는 바와 같이, 세포내 당김은 본원에서 사용되는 바와 같은 세포-세포 접촉과 생물학적으로 상이하다. 또한, 헬무트 등은 Ct로 불리는 객체들 간의 "최근접 이웃의 공동편재화 측정"을 정의하며, 이어 이를 분석되는 많은 수의 객체에 대해 최근접 이웃 거리 분포 분석에 대해 일반화하는 데 사용한다. 이 방법은, 세포-세포 접촉을 검출하기 위해 PBMC/컴플렉스 세포 혼합물에 적용되는 경우 상호작용하는 세포의 수가 전형적으로 모든 세포의 작은 서브세트이므로, 헬무트 등에 의해 기술되는 바와 같이 부적합하다. 헬무트 등에 의해 사용되는 바와 같은 최근접 이웃 분포 분석은 상호작용하는 세포의 작은 서브세트를 쉽게 간과하며 전체적인 집단화(clustering) 또는 2개의 세포 서브세트 간의 당김에 초점을 맞춘다. 또한, 그들의 기술적 해법은 객체 X 및 Y p(d) 간의 관찰된 최근접 이웃 거리 분포를 객체 Y로부터의 가능한 거리 q(d)의 상대적 빈도와 비교하는 것이며, 다른 객체가 또한 생물학적 시스템 내에서 공간을 차지할 수 있다는 사실을 무시한다. 따라서, 상기 접근법은 전체적인 집단화 경향을 교정하지 않는다. 그러나, PBMC 또는 컴플렉스 세포 혼합물의 2개의 서브세트의 세포-세포 접촉 분석에서, 전체적인 집단화는 관심 생물학적 인자에 의해서가 아닌 실험 인자에 의해 크게 결정되므로 이를 교정하는 것이 중요하다.
세포-세포 상호작용을 다루는 추가의 방법은 WO　2016/046346에 기술되어 있다. 이 방법은 세포가 접촉하고 있는 세포수와 관계없이 추가의 세포와 접촉하고 있는 세포수를 결정하는 것을 포함한다.
상기한 바에 비추어 볼 때, 생물학적 샘플, 특히 PBMC 또는 골수세포를 포함하는 특정 샘플에서 세포-세포 상호작용의 고용량 및 비용-효과적인 결정을 가능하게 하는 수단 및 방법이 필요하다.
따라서, 본 발명의 기초가 되는 기술적 문제는, 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 개선된 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 문제는 청구범위에서 특징지어지는 실시양태의 제공에 의해 해결된다.
따라서, 본 발명은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기 단계: (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계; (b) 세포 집단에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 집단 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; 및 (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (b)는 반복되고, 상호작용의 결정된 수는 평균화되며, 바람직하게는 단계 (b)는 적어도 1000회, 적어도 2000회 또는 적어도 3000회 초과로 반복된다.
첨부되는 실시예에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명의 방법은 특히 생물학적 세팅 내의 세포-세포 상호작용의 보다 견고하고, 보다 정확하며, 따라서 개선된 측정을 제공한다. 선행 기술의 방법, 예컨대 WO 2016/046346에 기술된 방법은 추가의 세포와 접촉하고 있는 세포 아집단의 세포 분율(fraction)을 결정하는 것에 의존한다. 따라서, 선행 기술의 일부 방법은 적어도 하나의 추가의 세포와 접촉하고 있는 각각의 세포의 세포 계산을 포함한다. 따라서, 2개의 상태, 즉 "상호작용하는" 및 "상호작용하지 않는" 상태가 존재한다. 선행 기술의 추가의 방법에서, 라크마노비크 등(Lachmanovich et al., Journal of Microscopy, 212, 2003, pp. 122-131)은 객체와 중복되거나(중복되는 픽셀을 갖거나) 인접한(즉 경계를 이루는 픽셀을 갖는) 현미경의 하나의 채널 내의 객체를 또 다른 채널 내의 객체에 대해 퍼센트를 결정함으로써 현미경 이미지에서 객체의 공동-편재화 정도를 측정하였다. 상기 방법은 다른 객체와 중복되거나 가까이 접촉하고 있는 객체의 수를 계수하는 것에 기초하며 미가공 픽셀 데이타를 사용하여 무작위 상호작용의 귀무가설(null hypothesis)을 생성한다.
대안적 접근법은, 예컨대 상기 인용된 헬무트 등에 의해 제공되는 방법은 최근접 이웃 거리에 의존한다.
선행 기술 방법의 우수한 검토가 볼테 등(Bolte et al. Journal of Microscopy, 224, 2006, pp. 213-232)에 의해 제공된다. 그들은 공동-편재화 분석에 이용되는 방법을 검토한다. 객체-기반 공동-편재화 분석의 경우, 그들은 오로지 최근접-이웃 분석에 기초하는 방법을 보고한다. 따라서, 이러한 분석에서 최근접 이웃에 초점을 맞추는 것은 선행 기술에서 사용되는 금-표준으로 간주된다.
세포 또는 객체가 상호작용하는 성향을 결정하기 위한 대안적 접근법은 (a) 2개의 객체 유형들 또는 구분가능한 세포 집단들 간의 거리 분포를 비교하고, 관측된 거리 분포를 적합한 접근법(예: 콜모고로브-스미르노브(Kolmogorov-Smirnov) 시험)에 의해 귀무가설 분포와 비교하거나, 또는 (b) 2개의 구분가능한 세포 집단들 간의 세포 표면 터칭의 정도를 측정하는 것에 기초한다.
본 발명에 따라 본 발명자들에 의해 밝혀진 바와 같이, 본 발명의 방법은 선행 기술의 방법에 비해 놀랍고 예기치 않은 이점을 갖는다. 특히, 본 발명의 방법은 일반적으로 샘플 특성에 대해 보다 견고하다는 점에서 선행 기술 및 가능한 대안적 접근법에서 기술되는 방법에 비해 우수하다. 예컨대, 본 발명의 방법은 높은 객체 밀도를 갖는 세팅에서, 예컨대 본원에서 개시되는 바와 같은 PBMC 또는 골수 단층에서 보다 신뢰할만한 결과를 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 많은 세포에서의 변화에 대해 보다 견고하여 보다 높은 동적 범위를 갖는다. 또한, 본 발명의 방법과 달리, 선행 기술에서 기술되는 방법은 상호작용 성향이 결정될 객체 또는 세포 이외의 객체 또는 세포를 각각 고려하지 않는다. 그러나, 특히 본원에서 개시되는 바와 같은 단층 내의 이들 객체 또는 세포는 공간을 차지하므로 보다 신뢰할만한 결과를 제공하기 위해서는 고려되어야 한다. 또한, 본 발명의 방법은, 선행 기술에 기술되는 방법과 달리, 상이한 세포 집단 크기, 특히 약 100 내지 100,000개 세포의 낮은 세포 집단 크기 또는 심지어 >1,000,000개 세포의 높은 세포 집단 크기에 대해 견고하고 효율적으로 작용한다. 마지막으로, 본 발명의 방법은, 선행 기술의 방법에 비해 개선된 결과를 제공함에도 불구하고, 컴퓨터 기반 알고리즘을 사용하여 고처리량 세팅에 더욱 효율적으로 이용될 수 있다. 즉, 선행 기술의 방법과 비교하여, 본 발명의 방법은 더 적은 시간을 요구하므로 더욱 비용 효율적이다.
본 발명의 방법의 상기한 놀랍고 비예측적인 이점은, 선행 기술의 방법과는 대조적으로, 상기 방법은 아집단의 세포와 제2의 아집단의 세포와의 상호작용의 전체 수를 결정하여 세포가 제2-아집단의 하나 초과의 세포와 상호작용하는 상태를 설명하기 때문에 달성된다. 따라서, 본 발명의 방법은 상호작용 성향이 결정되는 방향(즉, 아집단 A로부터의 세포와 아집단 B의 세포와의 상호작용을 측정하는지 또는 아집단 B의 세포와 아집단 A의 세포와의 상호작용을 측정하는지의 여부)에 독립적이다. 2개의 세포들 간의 물리적 상호작용은 생물학적으로 비-방향적이므로(즉, 제1 세포가 제2 세포와 상호작용하는 경우, 제2 세포도 동일하게 제1 세포와 상호작용하는 경우), 이는 기본적인 생물학적 효과의 보다 정확한 수치적 표현이며 상기한 기술적 이점을 야기한다. 이는 천연 상태의 인위적 표현물(representation), 예컨대 본원에서 및 WO　2016/046346에서 기술되는 단층에서 특히 중요하다. 따라서, 본 발명의 방법은 세포들 간의 상호작용을 결정하는 방향으로부터 독립적이므로, 생성된 상호작용 스코어는, 특히 원-샷(one-shot) 실험에서 더욱 신뢰할만하다. 즉, 본 발명의 방법에서, 세포들 간의 전체 상호작용의 원-샷 결정은 실험이 제1 또는 제2의 구분가능한 세포 아집단에 초점을 맞추는지의 여부로부터 독립적이다. 따라서, 본 발명의 방법은, 상기한 특성에 대해 개선되는 것 외에, 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 보다 신속하고, 보다 용이하고 및/또는 더욱 비용-효율적인 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 방법 및 세포 집단에서, 세포가 상호작용하는 성향은 제1 및 제2의 구분가능한 아집단이 도치되더라도 동일하다. 따라서, 특정한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기 단계: (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계; (b) 세포 집단에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 집단 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; 및 (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하고, 단계 (c)에서 결정된 성향은 제1 및 제2의 구분가능한 아집단이 도치되더라도 동일한 것인 단계를 포함한다. 성향은 상호작용이 제1의 구분가능한 아집단으로부터 제2의 구분가능한 아집단으로 결정되거나 또는 그와 반대인지의 여부로부터 독립적이기 때문에, 원-샷 실험이면 충분한다. 이는 선행 기술의 방법과 비교하여 보다 신속하고, 보다 쉽고 및/또는 더욱 비용-효율적인 실험 구성을 이끈다.
본 발명의 방법은 2개의 세포들 간에 상호작용이 존재하는지의 여부를 결정하는 데 이용되는 방법에 독립적이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 2개의 세포들 간에 상호작용이 존재하는지의 여부를 결정하기 위해 세포의 현미경 이미지를 사용한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 방법은, 예컨대 선행 기술, 예컨대 WO 2016/046346에 기술된 방법에 의해 제조되는 세포의 단층의 현미경 이미지를 사용한다. 적합한 염료, 예컨대 세포-표면 마커에 대한 형광 표지된 항체를 사용함으로써, 세포 표면은 당해 분야에 널리-공지된 방법을 이용하여 이들 세포의 현미경 이미지 상에 표시될 수 있으며 2개 세포의 세포-표면이 물리적 접촉 상태에 있음을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 세포의 핵 간의 거리가 결정될 수 있으며, 거리가 전형적인 세포 직경 크기의 오더(order)를 갖는 컷-오프 미만이면 세포는 상호작용하는 것으로 불린다. 이러한 근사치의 타당성은 2가지 주장으로부터 추론될 수 있다: (i) 상호작용하는 세포, 예컨대 T-세포 및 항원 제시 세포(APC)는 전형적으로 상호작용을 증가 및 감소시키는 일정한 과정에 있으며, 해리하고 이어 재-연합하고 다시 해리할 수 있다("스캐닝"으로도 지칭되는 과정). 상호작용들 간의 세포의 이동을 무작위 워크(random work)로 모델링함으로써, 더 자주 연합하는(즉 서로에 대해 더 높은 친화성을 갖는) 세포는 통계학적으로 다른 세포들보다 서로 더 가까울 것이다. (ii) 상호작용 스코어는 실제 컷-오프가 거의 동일한 직경의 원형 세포 집단에 대해 약 1 내지 3의 평균 세포 직경의 범위에서 변화하는 경우 현저하게 변하지 않음을 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한 세포 공여자가 질환에 걸리거나 질환에 걸리기 쉬운지의 여부를 결정하는 데 사용하기 위한 세포 공여자로부터 수득되는 세포 집단에 관한 것으로서, 상기 결정은 집단 내의 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 것을 포함하고, 상기 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계; (b) 세포 집단에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 집단 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및 (d) 세포가 상호작용하는 성향에 기초하여 세포 공여자가 질환을 가지고 있는지 또는 질환을 가지기 쉬운지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 세포 공여자의 질환 또는 질환에 대한 소인을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 공여자로부터 수득되는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 세포 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계; (b) 세포 집단에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 샘플 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및 (d) 세포가 상호작용하는 성향에 기초하여 세포 공여자가 질환에 걸리거나 질환에 걸리기 쉬운지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 대상체로부터 수득되는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정함으로써 상기 대상체가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 세포 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계; (b) 세포 집단에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 샘플 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수는 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및 (d) 치료제 첨가 전 및 치료제 첨가 후의 성향을 비교하고 이로써 대상체가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정함으로써 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 대상체가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정하기 위한 진단 방법에 사용하기 위한 세포 공여자로부터 수득되는 세포 집단에 관한 것으로서, 상기 결정은 단층 내의 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 것을 포함하고, 상기 단층은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계; (b) 세포 샘플 내에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 샘플 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및 (d) 치료제 첨가 전 및 치료제 첨가 후의 성향을 비교하고 이로써 대상체가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정함으로써 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 시험 물질(들)의 첨가에 기인하여 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정함으로써 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로서, 상기 세포 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계; (b) 세포 샘플에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 샘플 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및 (d) 하나 이상의 시험 물질(들) 첨가 전 및 하나 이상의 시험 물질(들) 첨가 후의 성향을 비교하고 이로써 하나 이상의 시험 물질(들)이 치료제로서 적합한지의 여부를 결정함으로써 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 시험 물질(들)의 첨가에 기인하여 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정함으로써 치료제를 스크리닝하는 데 사용하기 위한 세포 집단에 관한 것으로서, 상기 세포 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 하기 단계: (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계; (b) 세포 샘플에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 샘플 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및 (d) 하나 이상의 시험 물질(들) 첨가 전 및 하나 이상의 시험 물질(들) 첨가 후의 성향을 비교하고 이로써 하나 이상의 시험 물질(들)이 치료제로서 적합한지의 여부를 결정함으로써 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 단계를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 제1 및 제2의 구분가능한 아집단은 동일하다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단계 (b)는 반복되고, 상호작용의 결정된 수는 평균화되며, 바람직하게는 단계 (b)는 적어도 1000회, 적어도 2000회 또는 적어도 3000회 초과로 반복된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법 또는 본 발명의 세포 집단에 사용되는 세포는 말초혈액 단핵세포(PBMC) 또는 골수세포이다.
본 발명에서 진단되는 질환은 바람직하게는 골수증식 장애, 염증 장애, 잠복 바이러스 감염, 세포 성장 장애, 세포 주화성 장애, 대사 장애 또는 자가면역 장애; 또는 백혈병 또는 림프종이다.
따라서, 본 발명은 세포가 서로 상호작용하는 내재적 성향, 즉 세포, 특히 말초혈액 단핵세포(PBMC), 골수, 또는 다른 다계통 일차 포유동물 물질, 예컨대 물질의 이미지에서 검출되는 바와 같은 진단 목적을 위해 취해지는 임의의 단핵세포 함유 샘플의 물리적 상호작용을 정량하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 세포의 단층을 포함하는 세포 샘플 및 적합한 이미지화 기술, 예컨대 공초점 현미경검사를 이용하여 수행된다. 분석될 샘플, 예컨대 단층에 포함되는 세포는 당해 분야에 공지된 형광 염료 또는 다른 마커를 사용하여 확인되므로 구분될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "구분가능한 아군(subgroup)"은, 보다 큰 집단의 일부이고 세포 마커를 사용하여 집단 내의 다른 세포로부터 구분될 수 있는 세포를 지칭한다. 즉, 2개의 구분가능한 아군의 세포는, 세포가 이들을 이미지화 기술, 예컨대 공초점 현미경검사를 이용하여 구분가능하게 하는 세포 마커의 상이한 발현 프로필을 나타내는 한, 동일한 또는 상이한 세포 유형에 속할 수 있다. 세포가 세포 아군에 속하는지의 여부를 쉽게 결정하기 위해, 세포를 단층의 형태로 제공하는 것이 바람직하다. 첨부되는 실시예에 나타나 있는 바와 같이, 단층 형성은 당해 분야에 공지된 방법, 바람직하게는 WO 2016/046346에서 교시되는 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단계 (a) 전에 사용되는 세포 샘플의 세포를 포함하는 단층을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명에서, 세포가 상호작용하는 성향은 상호작용 스코어로 표현된다. 따라서, 세포-세포 상호작용에 영향을 미치는 외인성 인자, 예컨대 세포 밀도 및 과다와 대조되는, 생물학적 원인, 예컨대 부착 분자의 발현, 수용체-리간드 쌍 및 세포-세포 상호작용을 매개하는 다른 세포-유래된 인자 또는 세포를 물리적으로 교차-결합하는 제제, 예컨대 특정 항체 및 이특이적 항체 또는 생물학적 물질에 기인하는, 세포가 상호작용하는 성향은, 상호작용 스코어로 표현된다. 따라서, 본 발명은 또한 세포가 서로 상호작용하는 성향의 측정치로서의 상호작용 스코어가 질환 및/또는 건강한 샘플의 치료제 및/또는 약물에 대한 반응, 또는 반응 결여를 결정할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 환자 및/또는 공여자에서 질환 또는 질환에 대한 소인을 진단하기 위한 상호작용 스코어의 이용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질환이 치료제로의 치료에 반응할 가능성이 있는지 또는 반응적인지의 여부를 결정 및/또는 잠재적인 새로운 치료제 또는 약물의 기작 또는 효과를 발견하고 평가하기 위해 상호작용 스코어를 사용하는 방법을 제공한다(스크리닝 방법). 이에 대해, 병에 걸린 세포가 잠재적인 새로운 치료제/약물로서 평가될 치료제/약물 및/또는 화학 물질에 반응적인지, 즉 그들의 상호작용 스코어가 변화하는지를 평가하는 본 발명의 방법은 일반적으로 참조 샘플의 사용에 의존한다. 건강한 또는 병에 걸린 세포가 반응하는지(즉, 상호작용 스코어가 변화하는지)를 검정하는 것과 관련하여, 이 참조 샘플은 참조 대조군 자극, 예컨대 비히클 DMSO 또는 PBS로의 자극과 비교된다. 상호작용 스코어가 질환의 소인 또는 진단을 결정하는 데 사용되는 경우, 참조 샘플은 건강한 공여자이다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 참조 공여자로부터 수득되는 샘플은 본원에서 제공되는 진단 방법 및 공여자가 치료에 반응할 가능성이 있는지의 여부를 결정하는 방법에 사용된다. 본원에서 정의되는 바와 같은 상호작용 스코어는, 이로 제한됨이 없이, 생체외에서 1) 면역조절 약물(즉, 면역계 세포의 특성 및/또는 거동을 변화시켜 보증된 결과를 얻는 약물 또는 다른 치료제)의 발견, 2) 공지된 면역조절 치료제의 작용 기작의 규명, 3) 환자 샘플에서 약물의 민감성 또는 기능의 규명을 위해, 이미지 내의 세포의 위치(즉, 공간적 레이아웃)을 분석한다. 따라서, 본 발명의 새롭고 독창적인 방법은 이미지화 기술, 예컨대 세포, 특히 BMC 또는 골수세포의 단층의 이미지화와 조합하여 이용된다. 본 발명의 방법은 또한 세포의 서로에 대한 관계 및 관계가 화학 물질, 예컨대 소분자, 생물의약품 또는 다른 가용성 인자와의 인큐베이션 후 어떻게 변화하는지를 결정하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 세포 샘플 내에 포함된 집단의 변화를 결정하는 데 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 질환에 대한 소인을 결정하는 데 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은, 특히 세포 공여자의 질환 또는 질환에 대한 소인을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 공여자로부터 수득되는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 세포 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 하기 단계: (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계; (b) 세포 집단에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 집단 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및 (d) 세포가 상호작용하는 성향에 기초하여 세포 공여자가 질환에 걸리거나 질환에 걸리기 쉬운지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (b)는 반복되고, 상호작용의 결정된 수는 평균화되며, 바람직하게는 단계 (b)는 적어도 1000회, 적어도 2000회 또는 적어도 3000회 초과로 반복된다.
본 발명의 방법은 또한 세포 서로에 대한 물리적 상호작용을 정량함으로써 약물 또는 치료의 치료값을 결정 또는 예측하는 데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 대상체로부터 수득되는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정함으로써 상기 대상체가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 세포 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 하기 단계: (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계; (b) 세포 집단에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 샘플 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수는 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및 (d) 치료제 첨가 전 및 치료제 첨가 후의 성향을 비교하고 이로써 대상체가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정함으로써 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (b)는 반복되고, 상호작용의 결정된 수는 평균화되며, 바람직하게는 단계 (b)는 적어도 1000회, 적어도 2000회 또는 적어도 3000회 초과로 반복된다.
첨부되는 실시예에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명의 방법은, 특히 생물학적, 생화학적 및 생물물리학적 조사에 이용될 수 있는 특유한 스크리닝 시스템을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 의학적 진단 및 스크리닝 방법, 예컨대 자동화된 의학적 진단 및 스크리닝 방법에 이용될 수 있다: 실시예 5를 참조한다. 본원에서 제공되는 방법은 최소한의 공여자 물질을 필요로 하며, 예컨대 일반적인 진단 분석 프로토콜에 대해 수득되는 세포수가 당해 분야에 공지된 현재의 방법을 사용하여 가능한 것보다 공여당 더 많은 수의 교란(예: 개별 시험 조건)을 시험하거나 분석하는 데 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 세포의 집단은 배양 디바이스에서 약 100개 세포/mm²성장 면적 내지 약 30000개 세포/mm²성장 면적의 밀도로 배양되는 세포를 사용함으로써 형성되는 세포의 단층의 형태로 존재한다. 보다 바람직하게는, 세포는 약 500개 세포/mm²성장 면적 내지 약 20000개 세포/mm²성장 면적, 약 1000개 세포/mm²성장 면적 내지 약 10000개 세포/mm²성장 면적, 약 1000개 세포/mm²성장 면적 내지 약 5000개 세포/mm²성장 면적, 또는 약 1000개 세포/mm²성장 면적 내지 약 3000개 세포/mm²성장 면적의 밀도로 배양된다. 가장 바람직하게는, 세포는 약 2000 세포/mm²성장 면적의 밀도로 배양된다. 세포를 상기 밀도로 배양함으로써 본 발명의 방법을 이용하여 분석하기 전에 염색, 고정 및/또는 이미지화될 수 있는 세포의 단층이 형성된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세포-세포 상호작용"은, 특히 다세포 유기체의 발달 및 기능에 중요한 역할을 하는 세포 표면들 간의 직접적인 상호작용을 지칭한다. 이들 상호작용은 세포가 그들의 마이크로환경의 변화에 반응하여 서로 소통하는 것을 가능하게 한다. 이러한 세포-세포 상호작용은 안정하고, 예컨대 세포 정션을 통해 만들어지는 것일 수 있다. 이들 정션은 특정 조직 내의 세포의 소통 및 구성에 수반된다. 다른 것들은 일시적 또는 임시적이며, 예컨대 면역계 세포들 간의 것 또는 조직 염증에 수반되는 상호작용이다. 이들 유형의 세포내 상호작용은 다른 유형, 예컨대 세포와 세포외 기질 간의 것과 구별된다.
본 발명의 방법 및/또는 본 발명의 세포 집단에서, 천연 발생 세포-세포 상호작용은 바람직하게는 분석될 세포의 표현물 형성 동안 유지된다. 즉, 본 발명의 바람직한 실시양태에서 사용되는 세포의 단층 형성 동안, 본원에서 정의되는 바와 같은 세포-세포 상호작용은 유지된다. 세포-세포 상호작용을 유지한다는 것은, 천연 환경에서 또 다른 세포와 상호작용하는 세포가 또한 본원에서 제공되는 방법 전 및 단층 형성 동안 상기 다른 세포 또는 동일한 세포 유형의 세포와 상호작용할 것이라는 것을 의미한다. 즉, 전체적인 세포-세포 상호작용은 유지되나, 세포가 반드시 동일한 상호작용하는 세포와 상호작용을 유지하는 것은 아니다. 따라서, 본원에서 제공되는 방법은 분석될 세포의 생리학적으로 관련된 상태를 나타내는 모델 시스템을 제공한다.
상술되는 세포-세포 상호작용은 바람직하게는 본 발명의 방법에서 사용되고 본 발명의 세포 집단에 의해 형성되는 세포의 표현물 형성 동안, 따라서 바람직하게는 본 발명의 방법 이전에 형성되는 단층에서 유지된다. 일반적으로, 세포-세포 상호작용은, 예컨대 PBMC 또는 골수세포 또는 다른 세포를 포함하는 샘플에서 천연적으로 일어난다. 당업자는 세포-세포 상호작용이 천연적으로 발생하고 샘플 형성 동안, 바람직하게는 단층에서 세포에 의해 유지되는지의 여부를 결정할 수 있다. 특히, 당업자는 당해 분야에 널리-공지된 방법을 이용할 수 있다. 특히, 세포-세포 상호작용은 검출가능한 표지 및/또는 염료, 특히 생존력 염료(viability dye)의 첨가 동안 유지된다. 세포 샘플, 바람직하게는 단층의 형성에 이어, 세포-세포 상호작용은 이미지화 전에, 예컨대 세포, 바람직하게는 단층의 고정에 의해 중단될 수 있다.
세포의 표현물, 바람직하게는 단층의 형성 이후 및 본 발명의 방법을 수행할 때, 세포-세포 상호작용은 화학 물질, 예컨대 치료제의 첨가에 의해 중단되거나 새로이 구축될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 이러한 변화/변경은 치료제인 화학 물질이 세포-세포 상호작용에 영향을 갖는지의 여부를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 이는 치료 반응을 예측할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 변화/변경은, 예컨대 화학 물질의 라이브러리로부터 새로운 치료제/약물을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 화학 물질/시험 화합물/치료제는 세포의 단층의 형성 전에 첨가된다. 이는, 예컨대 당업자에게 공지된 액체 전달 시스템, 예컨대 라브사이트(Labcyte) ECHO 시스템을 사용하여 DMSO 또는 물 중에 용해된 화학 물질/시험 화합물/치료제를 포함하는 액적을 전달하는 형태로 사전-로딩(pre-loading)을 함으로써 수행된다. 화학 물질/시험 화합물/치료제는 또한 소량의 배지에, 바람직하게는 20 μl 미만, 15 μl 미만 또는 가장 바람직하게는 10 μl 미만으로 용해되고, 이어 시험 구획, 바람직하게는 다중웰 플레이트, 예컨대 WO 2017/191203에 기술된 플레이트의 웰에 전달될 수 있다. 이 바람직한 실시양태에서, 분석될 세포는, 예컨대 세포, 바람직하게는 PBMC 또는 골수세포의 단층을 형성하기 위해, 화학 물질/시험 화합물/치료제의 첨가 이후 및 형성된 단층의 고정 전에 첨가된다. 이어서, 고정된 단층은 적합한 염료 및/또는 항체로 염색되고 본 발명에 따라, 예컨대 자동화된 공초점 현미경검사를 이용하여 분석될 수 있다. 생성된 이미지에 기초하여, 세포가 상호작용하는 성향이 본원에서 제공되는 바와 같이 결정될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 분석될 샘플의 제조에서 이러한 바람직한 단계 순서는 추가의 놀라운 유리한 특성을 갖는 것으로 나타났다.
본 발명의 방법에서 사용되는 세포 표현물의 형성 동안, 바람직하게는 단층에서 유지되고 본 발명의 방법 이전에 유지되는 세포-세포 상호작용은, 예컨대, 특히 PBMC, 골수, 또는 단핵세포를 함유하는 다른 물질에서의, 특정 질환을 나타내고/내거나 건강한 공여자를 나타내는, 하기의 세포-세포 상호작용을 포함한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
따라서, 천연-발생 세포-세포 상호작용은 세포 마커를 사용하여 결정/평가/검출될 수 있다. 세포 마커는 단독으로 또는 다른 단백질과 조합하여 이 유형의 세포를 다른 세포 유형과 구별되게 하는 특정 유형의 세포에 의해 발현되는 단백질이다. 즉, 본 발명의 세포 집단에 포함되는, 예컨대 공여자로부터 수득되는 샘플에 포함되는 세포의 표면 상에서 또는 세포 내에서(세포질 내 또는 내부 막 내를 포함) 발현되는 세포 마커를 사용함으로써, 세포 집단에 포함되는 세포가 구별될 수 있다. 따라서, 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단은 상이한 세포 유형에 포함되는 세포에 제한되지 않는다. 오히려, 2개 이상의 구분가능한 아군의 세포는. 아군이 세포 마커, 예컨대 그의 표면 상에서 발현되는 것을 사용하여 구분가능한 한, 동일한 세포 유형의 것, 예컨대 상이한 질환 단계에 있는 동일한 세포 유형의 세포일 수 있다. 즉, 천연-발생 세포-세포 상호작용은 상기 표에 나타난 마커를 사용하여 결정/평가/검출될 수 있다. 예컨대, 건강한 공여자를 나타내는 천연-발생 세포-세포 상호작용은, 특히 CD11c 및 CD3, CD14 및 CD3, CD11C 및 CD8, CD19 및 CD3에 대한 세포 마커 쌍을 사용하여 검출될 수 있다. 그러나, 본 발명의 하나의 실시양태에서, 제1 및 제2의 구분가능한 아집단은 동일하다.
세포, 예컨대 본 발명의 세포 집단의 표현물에, 바람직하게는 단층에 포함되는 세포가 상기 제공되는 세포 마커를 사용하여 검출/표지되는 경우 및 특정 질환을 나타내는 그들 양성 세포의 세포 상호작용 성향을 측정하기 위해, 연관된 질환이 세포 공여자에서 진단될 수 있고/있거나 연관된 질환의 치료가 평가될 수 있다. 또한, 세포, 예컨대 본 발명의 세포 집단의 표현물에, 바람직하게는 단층에 포함되는 세포가 건강한 공여자를 나타내는 마커를 사용하여 검출/표지되는 경우, 천연-발생 세포-세포 상호작용이 이러한 건강한 공여자에 대해 평가/결정될 수 있다.
상술되는 바와 같이, 당업자는 세포-세포 상호작용을 결정/평가/추적/검증하는 수단 및 방법을 인식한다. 특히, 당업자는 천연-발생 세포-세포 상호작용과 세포 샘플의 제조 동안 도입되는 것을 구별할 수 있다. 이와 같이, 당업자는 동일한 유형의 세포 및/또는 상이한 유형의 세포가 살아있는 유기체에서 상호작용하는 것을 이해한다. 또한, 당업자는 세포 집단에 포함되는 구분가능한 세포 아군의 세포가 살아있는 유기체에서 상호작용하는 것을 이해한다. 따라서, 세포 샘플에 포함된 대부분의 세포는 그들의 천연-발생 세포-세포 상호작용을 유지한다. 즉, 대부분의 세포는, 특히 세포 샘플에 포함된 세포의 적어도 50%, 바람직하게는 세포 샘플에 포함된 세포의 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%는 생체내에서와 같이 동일한 세포 또는 동일한 세포 유형의 세포 또는 동일한 구분가능한 아군의 세포와 상호작용한다. 세포-세포 상호작용은 당해 분야에 널리-공지된 방법을 이용하여 검증/평가/결정될 수 있다. 예컨대, 공초점 현미경검사가 세포-세포 상호작용이 천연 환경에서 상호작용하는 세포들 간 또는 천연 환경에서는 상호작용을 나타내지 않는 세포들 간에 존재하는지의 여부를 평가/결정/검증하는 데 이용될 수 있다. 이러한 비-천연 세포-세포 상호작용은, 특히 세포 클럼핑(clumping)에 기인할 수 있다.
본 발명의 방법은 세포 집단/단층에 포함된 각각의 구분가능한 세포 아집단의 수 및 관찰되는 세포-세포 상호작용의 변화/변경을 조절하므로, 세포독성 및/또는 세포 성장 및 전체 세포 밀도의 차이를 조절한다. 본 발명의 방법은 당해 분야에서 이해되는 바와 같이 부착 세포주를 분석하는, 즉 세포의 클론 밀도, 클론 외성장 또는 세포주 단층 발달의 분석을 결정하는 다른 방법과 동일하지 않다. 오히려, 본 발명의 방법에 사용되는 샘플은 하나 이상의 다른 세포와 직접 접촉하나 반드시 배양 표면에 부착되는 것은 아닌 대부분의 세포를 포함하는 고밀도 배양을 포함할 수 있거나, 샘플, 바람직하게는 단층 내의 단지 소수의 세포가 샘플 바람직하게는 단층 내의 다른 세포와 직접적인 물리적 접촉을 하는 저밀도의 배양물을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은, 세포가 하나 이상의 세포와 접촉하는 분리된 영역 및 세포가 다른 세포와 접촉을 나타내지 않는 다른 영역을 갖는 중간 밀도의 부착 및/또는 비-부착 세포를 함유하는 샘플에 대해 이용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 방법은 추가의 적응에 필요로 하지 않으면서 매우 다양한 세포 샘플과 함께 사용하기 위한 특유한 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명의 방법은 광범위한 적용에 이용될 수 있으며, 이는 당해 분야에서 공지된 방법에 비해 중요한 이점이다. 본 발명의 방법은 특정 샘플에 대한 추가의 적응을 요구하지 않거나 단지 약간의 추가의 적응을 요구하므로, 본 발명의 방법은 선행 기술의 방법보다 더욱 비용-효율적이고 선행 기술의 방법 보다 더욱 시간-효율적이다.
구체적으로, 질환에 걸린 또는 건강한 공여자의 혈액 또는 골수로부터 유래되는 비-부착 단핵세포의 단층 또는 부착 및 비-부착 단핵세포의 혼합물 내의 세포-세포 접촉을 자동화된 현미경검사로 분석하는 데 이용하는 이전 방법은 선행 기술, 예컨대 WO 2016/046346에 기술되어 있다. 간단히, 세포를 비-부착 세포 또는 부착 및 비-부착 세포의 혼합물로 이루어진 단층으로 가공하고, 지정된 기간 동안 자극에 노출시키고, 고정하고, 관심 특성을 갖는 세포를 확인하기 위해 형광 표지된 시약, 예컨대 형광 표지된 항체로 염색하였다. 세포, 특히 PBMC 또는 골수세포의 단층을 제공하기 위해 WO 2016/046346에 기술된 새롭고 독창적인 방법이 또한 분석될 적합한 이미지화 세포 샘플을 제공하기 위해 본 발명에서 이용된다. 그러나, 본 발명은 적합한 샘플의 제공보다는 이러한 이미지의 분석에 초점을 맞춘다. 그러나, 단핵세포의 단층을 제조하기 위해 이전에 기술된 방법과 달리, 생리학적으로 관련된 세포-세포 접촉은 안정한 세포 환경을 유지하였던 WO 2016/046346에서 기술되는 시스템을 이용함으로써 유지되었다. 세포-세포 접촉은 WO 2016/046346에서 기술되는 분석 방법을 이용하는 경우 임계값을 정의함으로써 단층의 현미경적 이미지로부터 추론되었다. 2개의 세포가 설정된 임계값보다 더 가까운 경우, 그들은 상호작용하는 것으로 간주되었고, 그렇지 않으면 상호작용하는 것으로 간주되지 않았다. 다른 세포와 접촉하는 세포수는 단핵세포 단층의 현미경 이미지 내의 전체 세포 밀도에 의존한다. 또한, 2개의 분명하게 구분가능한 A형 및 B형 세포 간의 상호작용을 분석함으로써, B 세포와 접촉하는 A 세포의 수는 또한 총 샘플 내의 A 및 B 세포의 비율 및 그들의 상대적 비율에 의존한다. 따라서, 현미경 이미지 내의 B 세포와 접촉하는 A 세포의 단순한 계수는 거의 생물학적 정보를 갖지 않는다. 서로 상호작용하는 2개의 A형 및 B형 세포의 내재적 성향(즉, 세포와 연관된 생물학적 특성에 기인하는, 세포가 서로와 상호작용하는 경향)을 측정하기 위해, B 세포와 접촉하는 A 세포의 수를 총 세포 밀도 및 샘플 내의 A 및 B 세포의 분율에 대해 정규화하는 것이 요구된다. 선행 기술은 이를 하기 수학식을 사용하여 달성했다: Obs = #A 세포로 나눈 적어도 하나의 B 세포를 이웃하는 #A 세포이고, Fi = #모든 세포로 나눈 적어도 하나의 이웃을 갖는 #세포이고; Fa = #모든 세포로 나눈 #A 세포이고; 및 Fb = #모든 세포로 나눈 #B 세포이고, 여기서 "#"는 "의 수"를 의미한다. 이 경우, E = Fa * Fb * Fi이고, 정규화된 상호작용 스코어는 Obs/E의 분율로서 컴퓨팅되고, 전형적으로 서로 상호작용하는 A형 및 B형 세포의 내재적 성향의 척도로서 이 분율의 log2로서 제공되었다. 선행 기술의 이 방법은, 분석되는 이미지의 전체 세포 밀도가 낮고(세포당 약 1개의 상호작용하는 세포) 실험 동안 Fa 및 Fb의 변화가 제한되는 경우, 세포 밀도(Fi) 및 상호작용하는 세포 유형의 분율(Fa 및 Fb)의 변화를 견고하게 정규화한다. 그러나, 높은 세포 밀도(세포당 >> 1개의 상호작용하는 세포)의 경우 및 Fa에 커다란 변화가 실험 과정 동안 예상되는 경우, 스코어는 점점 부정확해진다(실시예 3 및 4). 이러한 결함이 본 발명의 방법에 의해 극복된다. 따라서, 본 발명의 방법은 보다 넓은 범위의 샘플, 특히 높은 세포 밀도를 포함하는 샘플 및/또는 상대적 세포 집단의 변화를 겪는 샘플에서 사용하기에 적합하다.
특히, 이 기술적 문제를 해결하기 위해, A형 세포와 B형 세포 간의 관찰된 상호작용 Iobs(A->B)의 총 수를 계수한다. A 및 B는 2개의 구분가능한 세포 아집단이고; 상호작용은 2개의 세포가 특정 임계값보다 더 가까와지는 것으로 정의되며, 분석되는 세포의 총수는 A형 세포수 + B형 세포수 + A형도 아니고 B형도 아닌 세포수이다.
이어서, Iobs(A-B)는 Iobs(A-B)를 Irand(A-B)로 나눔으로써 무작위 Irand(A-B)에 의해 발생하는 것으로 예상되는 상호작용에 대해 정규화된다. 따라서, 본 발명의 방법에서, A와 B, 즉 제1 및 제2의 구분가능한 아집단 간의 상호작용의 수가 본원에서 개시되는 방법에 의해 결정된다. 제2 단계에서, A와 B, 즉 제1 및 제2의 구분가능한 아집단 간의 상호작용의 이론적으로 예상되는 수는, 그들의 상대적 발생을 토대로 하여, 집단의 세포를 A 또는 B의 아군으로 무작위로 지정함으로써 결정되며, 이로써 각 아군 내의 세포의 총 수는 변함없이 동일하다. 즉, B 세포에 대해 임계치 거리 내의 A 세포는, A 또는 B로 무작위로 지정된 후, 그 자신의 무작위 지정 및 인접 세포의 지정에 따라, 아군 B의 세포와 여전히 상호작용하거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, 관찰되는 상호작용의 총 수는, A 및 B의 세포가 서로 상호작용하는 성향에 따라, 세포를 아군 A 또는 B로 무작위로 지정하는 것에 기초하여 예상되는 것보다 높거나 낮을 수 있다. 세포를 아군 A 또는 B로 무작위로 지정함으로써 상호작용의 수를 신뢰성 있게 결정하기 위해, 이 단계는 바람직하게는 반복되며, 결과는 평균화된다. 바람직하게는, 이 단계는 적어도 1000회, 적어도 2000회 또는 적어도 3000회 반복된다. Irand(A->B)는 대안적으로 모든 세포들 간의 상호작용 Itot의 총 수를 상기 정의와 유사하게 계수하고, 분석되는 모든 세포 중 A 세포의 분율 FA 및 분석되는 모든 세포 중 B 세포의 분율 FB과 곱함으로써 컴퓨팅될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 측정되고 상호작용 스코어(IS')로 표현되는 상호작용 성향은 하기와 같이 정의될 수 있다:
Figure pct00003
(수학식 I).
임계값은 양의 수인 것으로 정의된다. 2개의 세포들 간의 거리가 임계치 미만이면, 그들은 상호작용하는 것으로 간주된다. 동일한 고정된 임계치가 분석되는 모든 세포에 대해 정의된다. 여기서, 임계치의 선택은 연구되는 상호작용 유형과 밀접히 관련된다. 낮은 임계치는 높은 친화성 및 장기간 상호작용의 변화에 더욱 민감하다. 보다 높은 임계치는 또한 낮은 친화성 및 따라서 보다 일시적인 상호작용에 민감하다. 추가적으로, 임계치는 세포 연구의 전체 크기에 따라 설정되어야 한다. 보다 큰 세포는 보다 큰 임계치를 필요로 하고, 보다 작은 세포는 보다 작은 임계치를 필요로 한다.
일부 적용에 대해, 최대 측정 민감도를 유도하는 최적 임계치는, 상호작용을 정의된 방향으로 조정하는 양성 대조군이 이용가능한 경우 경험적으로 결정될 수 있다. 여기서, IS'는 상기 정의된 한계들 간의 상이한 합리적인 임계치 선택을 위한 양성 및 음성 대조군으로의 처리 후 컴퓨팅되며, 임계치는 선택된 표준편차를 최소화하면서 양성 대조군 조건 하에서의 IS'와 음성 대조군 조건 하에서의 IS' 사이의 최대 차이를 제공함으로써 컴퓨팅된다. 전형적으로, 본 발명의 방법에서 및 본 발명의 단층의 분석을 위해 선택되는 임계치는 분석될 세포의 직경의 약 2배의 범위 내이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 임계값은 약 5 μm 내지 약 35 μm의 범위 내, 보다 바람직하게는 약 10 μm 내지 약 20 μm의 범위 내, 더욱 더 바람직하게는 약 10 μm 내지 약 15 μm의 범위 내이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 임계치는 약 12 μm이다. 즉, 바람직한 실시양태에서, 제1의 구분가능한 아집단의 각각의 세포에 대해, 상호작용의 수는, 제1의 구분가능한 아집단의 세포에 대해 약 12 μm 미만의 거리를 갖는 제2의 구분가능한 아집단의 세포의 수에 의해 증가된다. 바람직하게는, 거리는 평가될 세포의 중심 사이에서 측정된다.
따라서, 본 발명은 세포가 서로 상호작용하는 내재적 성향을 정량화하는 방법을 제공하며, 실시예 3 및 4에 나타나 있는 바와 같이, 세포, 특히 PBMC, 골수, 또는 다른 부착 및/또는 비-부착 일차 단핵 또는 다른 세포 물질의 현미경 이미지에 적용되는 경우, 세포 밀도의 변화 및/또는 분석될 집단의 총 세포 수의 변화 및/또는 아집단의 총 세포 수 및 분석되는 아집단의 상대적 세포 수의 변화에 대해 견고하게 정규화된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 및/또는 본 발명의 세포 집단을 포함하는 샘플, 바람직하게는 단층의 제조를 위한 세포, 특히 PBMC, 골수세포, 또는 다른 부착- 및 비-부착 일차 세포는 건강한 대상체, 즉 질환에 걸린 것으로 의심되거나 질환에 걸리기 쉬운 것으로 의심되지 않는 대상체로부터 수득되는 샘플로부터 단리될 수 있거나, 질환에 걸려 있는 것으로 알려지거나 질환에 걸린 것으로 의심되는 대상체로부터 수득되는 샘플로부터 단리될 수 있다. 대상체의 질환 상태의 진단은 당업자, 예컨대 의사에 의해 일상적으로 수행되는 표준 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 기존의 방법은 본 발명의 방법에 의해 보완되거나 대체될 수 있다. 예컨대, 대상체가 질환에 걸리거나 걸릴 것 같은지의 여부를 결정하기 위하여, 각각의 질환에 대해 특징적인 세포-세포 상호작용 패턴이 질환에 걸린 것으로 알려진 대상체로부터의 샘플을 사용하여 결정된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 건강한 공여자의 세포-세포 상호작용 패턴은 각각의 질환에 기인함직한 차이를 결정하는 데 사용될 수 있다. 여기서 세포 상호작용 패턴은, 본 발명에 따라 결정되는, 하나 이상의 상이한 세포 유형이 서로 상호작용하는 성향을 지칭한다.
따라서, 본 발명은 질환이 치료제에 대해 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정하는 진단 방법에 사용하기 위한 방법을 제공한다. 예컨대, 건강한 공여자로부터의 세포-세포 상호작용 패턴은 참조로서 사용되고 질환에 걸린 대상체에 대해 결정되는 세포-세포 상호작용 패턴과 비교될 수 있다. 치료제 첨가 후, 세포-세포 상호작용 패턴의 변화/변경은, 전체 세포-세포 상호작용 패턴이 참조로서 사용되는 건강한 대상체의 세포-세포 상호작용 패턴으로 변경/변화되는지의 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 치료제 첨가 후, 세포-세포 상호작용의 변화/변경은. 전체 세포-세포 상호작용 패턴이 치료제의 작용 기작으로부터 예상되는 세포-세포 상호작용 패턴으로 변경/변화되는지의 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다(실시예 10). 따라서, 본원에서 제공되는 방법은 단일-세포, 다수-세포에서 및 전체적인 수준에서(예컨대 전체-집단 변화) 세포 반응 및 활성의 정량화를 가능하게 하므로, 하나 이상의 치료제에 대한 세포, 특히 PBMC 또는 골수 반응의 평가를 가능하게 하는 특유한 시스템을 제공한다. 따라서, 본원에서 제공되는 방법은 특히, 예컨대 세포, 특히 PBMC 또는 골수세포가 건강한 대상체로부터 수득되는 샘플로부터 단리되는 경우, 치료 반응 또는 치료 반응의 가능성의 평가를 가능하게 하는 일반적 모델로서 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 또는 동일한 질환에 걸린 및/또는 동일한 질환에 걸리기 쉬운 2명 이상의 공여자로부터 수득되는 2개 이상의 샘플의, 바람직하게는 세포의 단층 형태의, 본 발명의 세포 집단을 사용하여 (또는 이의 조합에 의해) 결정되는 치료 반응은, 질환에 걸리거나 질환에 걸리기 쉬운 집단의 예측 표준, 기선 또는 예상된 반응 표현물을 개발하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본원에서 제공되는 방법은 세포가 단리되었던 샘플을 제공하는 공여자가 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운지의 여부 및/또는 세포 공여자가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 예측하는 진단 방법에 이용될 수 있다. 본 발명에서 개시되는 바와 같이 "질환"은 혈액 암, 또는 혈액 악성종양, 고형 종양 암, 또는 말초 조직으로 파종되었던 고형 종양 암, 염증 질환, 예컨대 관절염 및 죽상경화증(질환 소견 부위로부터 또는 주변부로부터 샘플링됨), 및 상기 질환의 진행이 세포-대-세포의 물리적 소통 또는 가용성 인자에 의해 유도되는 물리적 소통에 의해 매개되는 임의의 다른 질환을 지칭한다.
본 발명의 방법을 이용하여 개체에서 질환을 진단하기 위해, 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 개체 및 건강한 개체에서 상이한, 개체의 세포 샘플 중의 하나 이상의 세포 유형들 간의 상호작용이 측정된다. 또한, 환자가 본 발명의 방법을 이용하여 특정 치료에 반응할 것인지의 여부를 결정하기 위해, 세포 샘플에 관심 약물의 첨가 후 또는 첨가 없이, 치료에 반응하는 개체 및 치료에 반응하는 개체에서 상이한, 환자의 세포 샘플 중의 하나 이상의 세포 유형들 간의 상호작용이 측정된다.
예컨대, 본 방법은 질환, 예컨대 류마티스 관절염의 진단에 이용될 수 있으며, 여기서 질환의 진단, 질환의 중증도 및 질환에 대한 약물 효과 모두는 양수 또는 말초혈액 내의 Th17 T-세포(CD3+ 및 CD28+)에 대한 활성화된 B-세포(CD80+ 및 CD19+) 사이의 상호작용 성향을 정량화함으로써 측정될 수 있다. 이들 활성화된 세포의 상호작용이 더 가까워질수록 양성 류마티스 관절염 진단의 선택이 더 높아진다. 동일한 것이 질환, 예컨대 세균 감염 후 이차 멸균 염증의 질환 카테고리 하의 만성 반응성 관절염에 대해서도 수행될 수 있으며, 세균성 병원체 제거 후 양수 내의 단핵구(CD14+)와 T-세포(CD3+)의 상호작용을 정량화함으로써 진단될 수 있다. 마지막 예로써, 죽상경화증은 환자 내피 세포(CCR5+)에 대한 혈액 내의 염증 내장 단핵구(CCR2-, CD16+)의 공간적 상호작용을 결정함으로써 진단될 수 있다. 이 방법을 이용하여 이들 질환 모두가 추적되고, 중증도가 결정되고, 약물의 효과가 정량화될 수 있다.
본원에서 제공되는 방법을 이용하는 이미지 내의 세포의 치료 반응에 대한 분석은 공여자에서 시험되는 요법에 대한 질환 상태의 반응을 예측한다; 이에 대해, 본 발명의 방법은 당해 분야에서 이용가능한 현재의 방법에 비해 이점을 제공한다. 예컨대, 본원에서 제공되는 방법을 혈액 암을 갖는 환자로부터의 비-부착 물질의 이미지에 적용하면 정상 세포의 공간 분해능 뿐만 아니라 질환 세포, 예컨대 비정상적 표현형 또는 그들 자신의 유전형 또는 질환 상태의 표현물을 갖는(예컨대, 건강한 개체에서 예상되는 농도에 비해 증가 또는 감소된 농도를 갖는) 세포를 정량화할 것이다.
따라서, 본원에서 제공되는 방법을 이용하여, 치료제 첨가 후, 이미지 내의 세포의 관계를 추적할 수 있으며; 이것이 치료제의 면역조절 능력의 정량화이다. 또한, 이들 결과는 치료제가 면역 조절에 대해 활성을 갖고 환자 치료를 위한 임상물인 것으로 해독될 수 있는지의 여부를 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되고 본 발명의 세포 집단, 바람직하게는 단층 내에 포함되는 대부분의 세포는 생리학적으로 관련된 상태로 발견되며, 이는 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%의 세포가 생리학적으로 관련된 상태에 있다는 것을 의미한다. 본 발명의 방법에 사용되고 본 발명의 세포 집단, 바람직하게는 단층 내에 포함되는 생리학적으로 관련된 상태의 상기한 퍼센트의 세포는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 결정/측정/평가된다. 특히, 세포 샘플이 생리학적으로 관련된 상태에서 발견되는 세포를 포함하는지의 여부는 세포 샘플/단층 내에 포함된 세포의 정량화에 의해 결정된다. 이는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 특히, 정량화는 참조 샘플 내, 예컨대 참조 개체 또는 다수의 참조 개체, 예컨대 세포 샘플, 특히 PBMC 또는 골수세포 샘플이 질환에 걸린 공여자로부터 유래되는 경우 하나 이상의 건강한 공여자의 말초혈액 또는 골수 내의 세포와 비교하여 이미지 분석을 통해 수행될 수 있다. 세포의 정량화는 표준 진단 수단이다. 세포 샘플, 특히 PBMC 및/또는 골수세포에 포함되는 세포 아집단의 임계치는 건강한 공여자 및 질환에 걸린 공여자에 대해 잘 기록되어 있다. 따라서, 본 발명의 수단 및 방법을 이용하여 평가될 샘플에서의 차이를 토대로 하여, 생리학적 관련성이 결정될 수 있다. 조혈 세포에 포함되는 세포 아집단의 기록은, 예컨대 문헌(Hallek et al. (2008) Blood 111(12))에서 찾을 수 있다. 현미경검사를 이용하는 세포-세포 상호작용의 정량화 및 또한 수단 및 방법, 예컨대 결정은 세포 샘플이 생리학적으로 관련된 상태를 나타내는지의 여부를 결정하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 세포는 단층의 형태로 분석된다. 특히, 단층은 본 발명의 방법 전에 형성되며, 특히 세포 집단, 특히 PBMC 집단 및/또는 골수 집단의 이미지화 및/또는 현미경 분석을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같은 단층은 이미지화 디바이스, 예컨대 당해 분야에 공지되거나 본원에 개시되는 바와 같은 현미경 또는 자동화된 카메라의 동일 초점 평면 내에서 주로 발견되는 세포의 단일 층을 의미한다. 용어 단일 층은 이 층 내의 세포가 주로 이차원인 배양물을 형성한다는 것, 즉 배양물이 주로 단일 세포의 층임을 의미하기 위해 사용된다. 즉, 배양물 내에서 대부분의 세포는 다른 세포 상에 또는 위에 놓여 있는 것이 발견되지 않으며, (예컨대 다른 세포 상에 또는 위에 놓인 세포를 포함함으로써 단일 세포의 층 위에 확장되는 세포 군으로 이루어진) 응집체로 발견되지 않는다. 따라서, 본 발명의 의미 내에서 세포 단층, 특히 PBMC 단층은 바람직하게는 하나의 단일 세포, 특히 PBMC의 높이 두께를 갖는 세포, 특히 PBMC 세포의 수평 층을 포함한다. 유사하게, 본 발명의 의미 내에서 골수세포 단층은 바람직하게는 하나의 단일 골수세포의 높이 두께를 갖는 골수세포의 수평 층을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 단층은, 배양 용기 내에서 세포 응집체 또는 다층 구축물(즉, 각각 하나 초과의 세포, 특히 PBMC 세포 또는 하나 초과의 골수세포의 높이를 갖는 세포 배양물을 갖는 영역) 또는 세포가 없는 영역이 발견될 수 있다는 것을 배제시키지 않는다. 오히려, 상기 용어는 본 발명의 배양물이 세포의 단일 층으로 이루어진 대부분의 (예컨대, 현미경 방법에 의해) 이미지화 가능한 또는 가시적인 영역을 가질 것이라는 것을 의미한다. 이는 세포 배양 표면 상에 세포의 단일 층을 제공함으로써 가장 쉽게 달성된다. 그러나, 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 세포 샘플의 다른 포맷이 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 즉, 어떠한 세포 표현물도 세포-세포 상호작용이 정량활될 수 있는 한 본 발명에 사용될 수 있다.
분석될 비-부착 세포, 예컨대 PBMC 또는 골수세포의 경우, 이러한 세포는 전형적으로 세포-배양 표면과 강한 접촉 또는 강한 세포-대-세포 접촉을 형성하지 않는다는 것이 공지되어 있다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 세포 단층, 특히 본 발명의 다양한 측면에서 사용되는 PBMC 단층은 반드시 당해 분야에서 이해되는 바와 같은, 즉 강하게 부착되고 균일하게 퍼진 세포의 층을 포함하고 대부분의 배양 표면을 덮는, 부착 세포의 단층과 동일한 것으로 생각되지 않는다. 오히려, 일부 실시양태에서, 세포 단층, 특히 본 발명에서 사용되는 PBMC 단층은 하나 이상의 다른 세포와 직접 접촉하나 반드시 배양 표면에 부착하는 것은 아닌 대부분의 세포를 포함하는 고밀도의 배양물을 포함할 수 있거나, 세포가 단층 내에 있으나 배양물 내의 임의의 다른 세포와 (직접적인 물리적) 접촉을 갖지 않는 저밀도의 배양물을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서 사용되는 세포 단층은 또한 세포가 하나 이상의 세포와 접촉하는 분리된 영역 및 세포가 다른 세포와 접촉하지 않는 다른 영역을 갖는 중간 밀도의 배양물을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명은 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 대상체가 질환, 특히 개체의 혈액 악성종양 및/또는 골수 및/또는 림프 조직의 악성종양, 또는 면역계에 영향을 끼치는 질환, 예컨대 염증 질환 또는 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 화합물을 포함하는 치료제 및/또는 제약학적 조성물로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 치료제 및/또는 제약학적 조성물은 적어도 2개 이상의 시험 화합물 중에서 선택되고, 상기 적어도 2개 이상의 시험 화합물 각각은 세포 집단에서 (a) 세포 집단에 포함되는 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계; (b) 세포 집단에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 집단 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및 (d) 치료제 첨가 전 및 치료제 첨가 후의 성향을 비교하고 이로써 대상체가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정함으로써 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 단계를 포함하는 검정으로 시험되며, 상기 검정은 2개 이상의 화합물 각각에 대해 반복되며, 세포가 상호작용하는 성향을 감소 또는 증진시키는 시험 화합물은 치료를 위해 선택되고/되거나 제약학적 조성물이 성분으로 선택된다.
상기 방법은 또한 새로운 치료제/약물의 스크리닝 방법으로 이용될 수 있다. 즉, 본 발명의 하나의 실시양태에서, 하나 이상의 시험 물질(들)의 첨가에 기인하여 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정함으로써 치료제 또는 제약학적 조성물을 스크리닝하는 스크리닝 방법이 제공되며, 상기 세포 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계; (b) 세포 집단에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 집단 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수는 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및 (d) 시험 화합물 첨가 전 및 시험 화합물 첨가 후의 성향을 비교하고 이로써 시험 화합물이 세포가 상호작용하는 성향을 변경/변화시키는지의 여부를 결정함으로써 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 검정은 2개 이상의 시험 화합물 각각에 대해 반복되며, 세포가 상호작용하는 성향을 감소 또는 증진시키는 시험 화합물은 치료제/제약학적 조성물로서 선택된다. 바람직하게는, 성향의 변경/변화는 시험 화합물의 첨가 전 및 후에 상호작용의 수를 결정하기 위해 동일한 세포 집단이나 상이한 분율의 세포 집단을 사용하여 측정된다. 이는 세포 샘플의 단층이 사용되고 단층이 분석 전에 고정되는 경우에 특히 유용하다.
단층에 포함된 세포의 생존력 및/또는 세포-세포 상호작용 및/또는 생존력 및/또는 세포-세포 상호작용의 변화가 검출가능한 표지/마커/염료를 사용하여 결정/평가/추적/검증될 수 있다. 이러한 표지/마커/염료는 본 발명의 단층에 포함된 하나 이상의 아집단(들)에 대해 특이적일 수 있다. 이러한 특이적인 표지/마커/염료가 사용되는 경우, 이들은 다양한 질환에서 역할을 하고/하거나 질환, 특히 혈액 악성종양 및/또는 골수 및/또는 림프 조직의 악성종양에서 생물학적 기능을 갖는 것으로 공지된 세포 유형에 대해 선택될 수 있다.
따라서, 특정 측면에서, 본 발명은 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 대상체로부터 수득되는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정함으로써 상기 대상체가 질환의 치료에 사용하기 위한 화합물을 포함하는 치료제 및/또는 제약학적 조성물로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 세포 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 (a) 상기 대상체로부터 수득되는 세포 샘플에 포함된 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계; (b) 세포 샘플에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 샘플 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및 (d) 치료제 첨가 전 및 치료제 첨가 후의 성향을 비교하고 이로써 대상체가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정함으로써 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 단계를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 제1 및 제2의 구분가능한 아집단은 각각 CD3 및 CD34 양성 세포이거나, 각각 CD34 및 CD3 양성 세포이다. 바람직하게는, 성향의 변경/변화는 시험 화합물의 첨가 전 및 후에 상호작용의 수를 결정하기 위해 동일한 세포 샘플이나 상이한 분율의 세포 샘플을 사용하여 측정된다. 이는 세포 샘플의 단층이 사용되고 단층이 분석 전에 고정되는 경우 특히 유용하다.
본원에서 사용되는 치료제 또는 본 발명의 제약학적 조성물은 적어도 2개 이상의 시험 화합물로부터 선택되는 화합물을 포함한다. 시험 화합물은 약제로서 사용하기에 적합한 한 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 상기 시험 화합물은 질환, 특히 혈액 악성종양 및/또는 골수 및 림프 조직의 악성종양, 염증 및 자가면역 질환의 치료에 효과적인 것으로 공지된 화합물로부터 선택되는 것이 바람직하다. 이러한 질환의 치료에 효과적인 것으로 공지된 화합물은 화학적 화합물 및 생물학적 화합물, 예컨대 항체를 포함한다. 이러한 질환을 치료하는 데 효과적인 것으로 공지된 화합물의 예는, 이로 제한됨이 없이, 알렘투주맙, 아나그렐리드, 비소 트리옥사이드, 아스파라기나제, ATRA, 아자시티딘, 벤다무스틴, 블리나투모맙, 보르테조밉, 보수티닙, 브렌투시맙 베도틴, 부술판, 세플렌, 클로람부실, 클라드리빈, 클로파라빈, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다사티닙, 다우노루비신, 데시타빈, 데닐류킨 디프티톡스, 덱사메타손, 독소루비신, 두벨리십, EGCG = 에피갈로카테친 갈레이트, 에토포시드, 필그라스팀, 플루다라빈, 겜투주맙 오조가미신, 히스타민 디히드로클로라이드, 호모하링토닌, 히드록시우레아, 이브루티닙, 이다루비신, 이델랄리십, 이포스파미드, 이마티닙, 인터페론 알파-2a, 재조합물, 인터페론 알파-2b, 재조합물, 정맥 면역글로불린, L-아스파라기나제, 레날리도미드, 마시티닙, 멜팔란, 머캅토푸린, 메토트렉세이트, 미도스타우린, 미톡산트론, MK-3475 = 펨브롤리주맙, 닐로티닙, 페그아스파르가제, 페그인터페론 알파-2a, 플레릭사포르, 포나티닙, 프레드니솔론, 프레드니손, R115777, RAD001(에베롤리무스), 리툭시맙, 룩솔로티닙, 셀리넥소르(KPT-330), 소라페닙, 수니티닙, 탈리도미드, 토포테칸, 트레티노인, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 보리노스타트, 졸레드로네이트, ABL001, ABT-199 = 베네토클락스, ABT-263 = 나비토클락스, ABT-510, ABT-737, ABT-869 = 리니파닙, AC220 = 퀴자르티닙, AE-941 = 네오바스타트, AG-858, AGRO100, 아미노프테린, 아스파라기나제 에르위니아 크리산테미, AT7519, AT9283, AVN-944, 바페티닙, 벡투모맙, 베스타틴, 베타 알레틴, 벡사로텐, BEZ235, BI 2536, 부팔리십(BKM120), 카르필조밉, 카르무스틴, 세리티닙, CCGC-11047, CHIR-258, CHR-2797, CMC-544 = 이노투주맙 오조가미신, CMLVAX100, CNF1010, CP-4055, 크레놀라닙, 크리조티닙, 엘라그산, 엘사미트루신, 에포에틴 제타, 에프라투주맙, FAV-201, FavId, 플라보피리돌, G4544, 갈릭시맙, 갈륨 말톨레이트, 갈륨 니트레이트, 기비노스타트, GMX1777, GPI-0100, Grn163l, GTI 2040, IDM-4, 인터페론 알파콘-1, IPH 1101, ISS-1018, 익사베필론, JQ1, 레스타우르티닙, 메클로레타민, MEDI4736, MGCD-0103, MLN-518 = 탄두티닙, 모텍사핀 가돌리늄, 천연 알파 인터페론, 넬라라빈, 오바토클락스, 오비누투주맙, OSI-461, 파노비노스타트, PF-114, PI-88, 피발로일옥시메틸 부티레이트, 픽산트론, 포말리도미드, PPI-2458, 프랄라트렉세이트, 프롤류킨, PU-H71, 라놀라진, 라바스티닙, 사마륨(153sm) 렉시드로남, SGN-30, 골격 표적 방사선 요법, 타세디날린, 타미바로텐, 템시롤리무스, 티오구아닌, 트록사시타빈, 빈데신, VNP 40101M, 볼라세르팁, XL228, 히드록시클로로퀸(플라퀘닐), 레플루노미드(아라바), 메토트렉세이트(트렉살) 술파살라진(아줄피딘), 미노시클린(미노신), 아바타셉트(오렌시아), 리툭시맙(리툭산), 토실리주맙(악테므라), 아나킨라(키네렛), 아달리무맙(휴미라), 에타네르셉트(엔브렐), 인플릭시맙(레미케이드), 세르톨리주맙, 페골(심지아), 골리무맙(심포니), 토파시티닙(젤잔즈, 젤잔즈 XR), 바리시티닙, 셀레콕시브(셀레브렉스), 이부프로펜(처방-강도), 나부메톤(렐라펜), 나프록센 소듐(아나프록스), 나프록센(나프로신), 피록시캄(펠덴), 디클로페낙(볼타렌, 디클로페낙 소듐 XR, 카타를람, 캄비아), 디플루니솔, 인도메타신(인도신), 케토프로펜(오루디스, 케토프로펜 ER, 오루바일, 악트론), 에토돌락(로딘), 페노프로펜(날폰), 플루르비프로펜, 케토롤락(토라돌), 메클로페나메이트, 메페남산(폰스텔), 멜록시캄(모빅), 옥사프로진(데이프로), 술린닥(클리노릴), 살살레이트(디살시드, 아미게식, 마르트리틱, 살플렉스, 모노-게식, 아나플렉스, 살시타브), 톨메틴(톨렉틴), 베타메타손, 프레드니손(델타손, 스테라프레드, 리퀴드 프레드), 덱사메타손(덱스팍, 타페르팍, 데카드론, 헥사드롤), 코르티손, 히드로코르티손(코르테프, A-히드로코르트), 메틸프레드니솔론(메드롤, 메타코르트, 데포프레드, 프레다코르텐), 프레드니솔론, 시클로포스파미드(시톡산), 시클로스포린(겐그라프, 네오랄, 산디뮨), 아자티오프린(아자산, 이무란), 및 히드록시클로로퀸(플라퀘닐)을 포함한다.
하기 표는 공지된 약물-질환 관계 및 세포의 제1 및 제2의 구분가능한 아군을 선택하는 데 사용될 수 있는 세포 마커를 포함한다. 또한, 표는 각각의 약물에 의해 유도되는 세포의 성향의 변경/변화를 나타낸다. 따라서, 이러한 조합은 본 발명의 방법에서 직접적으로 실시될 수 있다.
[표 II]
환자가 특정 치료에 반응할 것인지의 여부를 결정하는 데 사용될 수 있는 마커 1 및 마커 2에 의해 정의되는 세포들 간의 상호작용 성향에 대한 면역조절 약물의 영향
Figure pct00004
Figure pct00005
분석될 샘플, 특히 단층에 포함될 세포의 생존력은 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 결정/평가/검증될 수 있다. 즉, 당업자는 세포의 스타디움, 예컨대 세포가 생존 가능하거나, 살아있거나, 죽었거나 이의 스타디움을 변화시키는 과정을 겪고 있거나, 예컨대 아폽토시스 또는 괴사에서와 같이 죽고 있는지의 여부를 결정/평가/검정하는 방법을 잘 알고 있다. 따라서, 특정 스타디움에 있는 세포를 특이적으로 인식/표지하는 공지된 마커/염료가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 그는 비-무손상 막을 갖는 세포에 대해 선택적인 염료/표지 또는 후기-단계 세포 죽음 또는 초기 아폽토시스에 대해 선택적인 염료/표지를 포함한다. 예컨대, 염료의 사용을 통해 DNA 회전율 및 세포 증식을 결정하는 시토크롬 C에 대한 항체인 고정가능한 생/사 그린(써모피셔(ThermoFisher), 카달로그 번호 L-23101)이 사용될 수 있다. 특히 단층 형태의, 본 발명에서 사용되는 세포 샘플/본 발명의 세포 집단에 포함되는 세포의 생존력을 결정/평가/검증하는 추가의 수단 및 방법은 당업자에게 알려져 있다.
세포 샘플, 특히 단층, 특히 PBMC 단층 또는 골수세포 단층에 포함된 2개 이상의 구분가능한 아집단(들)의 생존력 및/또는 세포-세포 상호작용의 변화를 결정/추적/평가/검증하는 것은 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예컨대, 변화는 현미경검사를 이용함으로써 광학적 감식에 의해 결정/추적/평가/검증될 수 있다. 그러나, 고처리량 적용의 경우, 단층에 포함된 개별 아집단의 생존력 및/또는 세포-세포 상호작용의 변화를 결정/추적/평가/검증하는 자동화된 방법이 이용될 수 있다. 이러한 방법은 세포 샘플, 바람직하게는 단층에 포함된 아집단을, 예컨대 검출가능한 표지로 확인하는 단계를 포함한다. 이어서, 표지된/검출된 아집단이 세포-세포 상호작용을 나타내는지의 여부가 결정될 수 있으며, 세포-세포 상호작용은 (상술된 바와 같이) 혈장 막을 통한 직접적 접촉 또는 간접적 접촉을 포함할 수 있다. 따라서, 표지된 세포들 간의 거리 파라미터, 즉 상기 정의된 임계값이 도입되며, 이는 상호작용의 총 수, 즉 얼마나 많은 세포-세포 상호작용이 표지된 세포들 간에 관찰되는지를 결정한다. 이 절차에서, 구분가능한 아군의 표지된 세포는 제2의 구분가능한 아군의 하나 이상의 세포와 상호작용할 수 있으며, 각각의 상호작용이 계수된다. 생성된 수는 무작위 분포 함수에 의해, 즉 무작위 세포-세포 상호작용에 의해 예상되는 것과 비교된다. 이어서, 상호작용 성향은 본 발명의 방법, 즉 상호작용이 무작위인지 또는 지시되는 것인지의 여부를 결정하는 상호작용 스코어를 사용하여 계산될 수 있다. 하나 이상의 시험 물질(들)이 본 발명의 세포 샘플에 첨가되기 전 및 후 이러한 프로토콜을 따르는 것은 하나 이상의 시험 화합물(들)에 기인하는 세포-세포 상호작용의 변화를 결정/추적/평가/검증하는 것을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명은 고처리량 방식으로 1) 화학요법/면역요법/면역억제요법의 생체외에서 세포 집단 진단 또는 다른 마커에 대한 단일-세포 분석에 기초한 전체적인 수준에서의 효과, 2) 이 기술이 생체외에서 환자 샘플에서 예측적 화학요법을 제공하는 능력, 3) 이 기술이 많은 자극들 또는 자극(예: 약물)의 면역 기능에 대한 영향을 결정하는 능력을 결정하기 위해, 및 4) 치료 평가에서 패턴을 결정하기 위해 시간 경과에 많은 환자 데이타 세트의 통합을 위해 이미지화 연구에서 생리학적으로 관련된 다수-집단 세포 샘플, 특히 일차 조혈 샘플을 사용하는 방법을 제공한다. 원칙적으로, 임의의 세포 샘플, 예컨대 혈액, 골수, 흉막 삼출액, 비장 균질물, 림프 조직 균질물, 피부 균질물로부터의 단핵세포가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 그러나, 단핵세포를 사용하는 것이 바람직하다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용되는 바와 같은 단핵세포 샘플은, 특히 PBMC 및 골수세포 뿐만 아니라 다른 것들도 포함한다. 따라서, 세포 샘플, 바람직하게는 본원에서 제공되고 본 발명의 방법에서 사용되는 바와 같은 일차 단핵세포의 단층은 PBMC 및/또는 골수세포를 포함할 수 있다. 즉, 본원에서 제공되는 수단 및 방법은 일반적으로 세포 또는 PBMC에 대해 기술되었지만, 당업자는 동일한 수단 및 방법이 골수세포 또는 추가의 세포에 대해 제공된다는 것을 이해한다. 따라서, 골수세포를 사용하는 방법, 골수세포 공여자가 질환에 걸리거나 질환에 걸리기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법, 골수 공여자에서 질환 또는 질환에 대한 소인을 진단하는 방법 및 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 대상체가 골수세포의 사용을 포함하는 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 본원에서 제공되는 약물 스크리닝 방법 및 다른 방법은 또한 다른 조혈 세포, 예컨대 골수세포에 대해서도 기술된다.
이와 관련하여, 골수는 뼈 내부의 유연한 조직이다. 인간에서, 적혈구는 조혈로 공지된 과정에서 긴 뼈의 앞에 있는 골수의 코어에 의해 생성된다. 골수 이식은 암의 특정 형태, 예컨대 백혈병을 포함하는 골수의 심각한 질환을 치료하기 위해 수행될 수 있다. 추가적으로, 골수 줄기 세포는 성공적으로 기능적 신경 세포로 전환되었으며 또한 질환, 예컨대 염증성 장 질환을 치료하는 데도 사용될 수 있다. 따라서, 골수세포는 다양한 질환, 예컨대 암성 질환 또는 염증성 질환, 예컨대 염증성 장 질환의 치료에 가치있는 표적을 나타낸다. 이와 같이, 본원에서 제공되는 방법은 공여자로부터 수득되는 골수 샘플을 사용하여 공여자가 이러한 질환에 걸리거나 질환에 걸리기 쉬운지의 여부를 평가/결정하는 데 매우 유용하다. 또한, 본원에서 제공되는 방법은 골수세포를 사용하여 고 처리량 약물 스크리닝 등에서 다양한 이점을 제공한다.
염색 가능하고 이미지화 가능한 단층을 형성하는 데 부착 세포(대식세포, HeLa 등)가 필요하다는 도그마는 WO 2016/046346에서 단층의 제공에 의해 극복되었다. 이에 기술되는 바와 같은 단층 이전에는, 연구군들은, 특히 질환 상태가, 예컨대 혈액-기반 질환 또는 병태, 예컨대 림프종 및 백혈병에서 비-부착 세포에 표현되거나 반영되는 경우, 화학요법-유도된 분자(바이오마커) 변화, 암성 모세포 생존력 평가 및 세포-세포 접촉의 고처리량 결정을 위해 일차 환자 샘플에서 이미지-기반 단일 세포 스크리닝 기술을 실시할 수 없었다. 이 문제를 해결하기 위해 WO 2016/046346의 발명자들은, 전형적으로 당해 분야에 공지된 방법과 비교하여 교란당 필요한 물질을 단지 1/10만은 필요로 하며 처리량 및 속도를 최대화하는, 단일 이미지에서 부착 및 비-부착 세포의 가시화를 가능하게 하는, 수단 및 방법 뿐만 아니라 본원에서 "약물검사(pharmacoscopy)"로 지칭되는 방법학 및 이미지-분석 파이프라인을 제공하였다. 약물검사는 공지된 방법, 예컨대 유세포 분석에 의해 수집되는 동일한 정보를 제공할 수 있으나, 추가의 유리한 정보, 예컨대 세포내 표현형(단백질 편재화/공동-편재화) 및 세포 마이크로환경/이웃 관계의 측정을 제공한다. 또한, WO 2016/046346에 개시된 방법은 보다 소수의 세포 및 이로써 보다 적은 환자 물질, 보다 적은 액체 부피를 필요로 하고 인간 개입이 거의 필요하지 않으며; 따라서 약물검사는 병렬로 시험될 수 있고 보다 상세한 평가를 산출하는 분자 교란의 수를 크게 증가시킨다. 또한, 선천적으로 건강한 집단으로부터 병에 걸린 세포를 분류할 필요 없이, 약물검사는 약물 매개된 바이오마커 변화를 추적하면서 동시에 오프-타겟(off-target) 약물 영향을 조절할 수 있다. 이들 중요한 조절은 동일한 웰 및 동일한 이미지화 필드에 존재하는 동일한 공여자로부터의 건강한 세포의 세포 상호작용 패턴을 표적된-세포 집단의 세포 상호작용 패턴 및 바이오마커 분석에 대해 추적함으로써 수행된다. 본 발명의 방법은 WO 2016/046346의 방법학을 이용하나 추가의 놀랍고 예기치 않은 이점을 포함한다. 특히, 본 발명에 따라, 세포 집단이 변화를 겪는, 예컨대 세포가 실험 동안 사멸되는 경우의 세포 샘플 및 높은 세포 밀도를 갖는 세포 샘플을 보다 신뢰성 있는 방식으로 분석할 수 있다.
본 발명의 방법을 이용함으로써, 환자 혈액 샘플 내의 약물-유도된 서브-세포 및 단일-세포 바이오마커 변화의 분석으로 개별 환자에 대해 맞춰진 임상 요법 결과를 예측할 수 있다. 기초 연구 뿐만 아니라 의료 전문가 및 임상의에 대한 이 기술의 표준화, 완성 및 이용가능성은, 특히 맞춤형 의학, 예측 약리학 뿐만 아니라 약물 스크리닝 및 치료 평가에 유리하다.
따라서, 선행 기술과는 달리, 본원에서 제공되는 바와 같은 방법은 WO 2016/046346에서 기술되는 방법 보다 훨씬 더 다양한 적용, 예컨대 높은 세포 밀도를 갖는 샘플 및/또는 세포 샘플에 포함된 세포수에 변화를 겪는 세포 샘플에 대한, 맞춤형 의학, 약물 스크리닝 프로그램, 일반적 약물 스크리닝, 맞춤형 약물 스크리닝, 약물 반응의 평가, 약물의 면역학적 특성의 평가, 치료의 평가, 치료 효능의 검증, 치료 반응의 예측, 집단(약물) 반응 등에 이용될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 수단 및 방법은 약물 스크리닝 및 약물 발견 뿐만 아니라 맞춤형(즉, 대상체/환자/개체 관련된) 약물 발견 또는 약물 스크리닝을 가능하게 한다. 예컨대, 본원에서 제공되는 바와 같은 일반적 약물 발견 및/또는 약물 스크리닝에서, 건강한 환자 대 질환에 걸린 환자의 세포, 특히 PBMC 또는 골수세포가 사용되고 비교될 수 있다. 또한, 수집된 세포 샘플, 특히 PBMC 샘플 또는 골수 샘플이 본원에서 제공되는 수단 및 방법에서 독창적인 단층을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 맞춤형 약물 발견에서, 바람직하게는 대상체/개체/환자의 개별적 PBMC 샘플이 본 발명에 따라 사용될 독창적인 PBMC 단층을 위한 출발 물질로서 사용된다.
본 방법을 이용함으로써, 다수의 교란이 환자로부터 수득되는 단일 샘플, 특히 PBMC 샘플 또는 골수 샘플로부터 유도될 수 있는 다수의 단층을 사용하여 효율적이고 신속하게 조사될 수 있다. 전형적으로, 적어도 1000개, 적어도 4000개, 적어도 8000개, 적어도 12000개, 적어도 16000개, 적어도 20000개, 적어도 24000개, 적어도 50000개, 적어도 75000개, 또는 90000개 이하의 화합물 또는 그 이상의 화합물의 효과가 이러한 단일 샘플로부터 수득되는 다수의 단층에서 조사될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 단층은 높은 콘텐츠 데이타의 다수의 채널을 동시에 사용하여 이미지화되고 분석될 수 있다. 이용가능한 데이타 채널의 수는 단지 특정 이미지화 소프트웨어 및 이용가능한 염색 방법학에만 의존하며, 이 분야는 신속하게 발전하고 있다. 현재 이용가능한 방법학은 높은 콘텐츠 데이타의 2개 이상의 채널, 보다 전형적으로 4, 5 또는 8개 채널의 동시적 이미지화, 프로세싱 및 분석을 가능하게 한다.
말초혈액 단핵세포(PBMC)는 둥근 핵(단핵구: 열편 핵과는 대조적임)을 갖는 혈액 세포이다. PBMC는 림프구(B-세포, T-세포(CD4 또는 CD8 양성), 및 NK 세포), 단핵구(수지상 세포 및 대식세포 전구체), 대식세포, 및 수지상 세포를 포함한다. 이들 혈액 세포는 감염과 싸우고 침입자에 적응하기 위해 면역계에서 중요한 성분이다. 본 발명의 일부 실시양태와 관련하여, 본 발명의 PBMC 단층 또는 PBMC 단층을 포함하는 세포-배양 디바이스를 생성하기 위해 또는 본 발명의 일부 측면에서 제공되는 방법에 사용하기 위해, 피콜 밀도 구배 정제된 PBMC, 바람직하게는 인간 PBMC를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명은 임의의 단핵세포를 사용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은, 이로 제한됨이 없이, 하기 군 내의 세포, 및 최종 세포 단계를 포함하는 세포의 계통 내의 세포의 상호작용 스코어를 결정할 수 있다: 조혈 줄기 세포(이로 제한됨이 없이, 프로-B-세포, B-세포, 이중 음성 t-세포, 양성 T-세포, 혈장-B-세포, NK-세포, 단핵구(대식세포, 수지상 세포)를 포함하는, 일반 림프 전구세포, 일반 골수 전구세포, 및 이들의 성숙 계통 및 말기 상태를 포함). 이들은, 이로 제한됨이 없이, 말초혈액, 골수(국소화된 납작뼈), 제대혈, 비장, 흉선, 림프 조직, 및 질환의 임의의 유체 증가 결과물, 예컨대 흉수에서 발견될 수 있다. 세포는 임의의 건강한 또는 병에 걸린 상태에 있을 수 있다.
본원에서 개시되는 방법에 따라 사용하기 위한 PBMC 세포는 당해 분야에 공지되거나 본원에서 개시되는 임의의 적합한 방법을 이용하여 전체 혈액으로부터 단리될 수 있다. 예컨대, 판다 등(Panda et al.)에 의해 기술되는 프로토콜이 이용될 수 있다(Panda, S. and Ravindran, B. (2013). Isolation of Human PBMCs. Bio-protocol 3(3): e323). 바람직하게는, 밀도 구배 원심분리가 단리에 이용된다. 이러한 밀도 구배 원심분리는 전체 혈액을 층, 예컨대 혈장의 상층, 이어 PBMC의 층 및 다형핵 세포(예: 호중구 및 호산구) 및 적혈구의 바닥 분획으로 구분되는 성분으로 분리한다. 다형핵 세포는 적혈구, 즉 비-핵화된 세포를 분해시켜 추가로 단리될 수 있다. 이러한 원심분리에 유용한 일반적 밀도 구배물은, 이로 제한됨이 없이, 피콜(친수성 다당류, 예컨대 Ficoll®-Paque(GE Healthcare, Upsalla, Sweden) 및 SepMateTM(StemCell Technologies, Inc., K
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ln, Germany)를 포함한다.
본원에서 개시되는 방법에 따른 사용을 위한 골수세포는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 골수로부터 단리될 수 있다. 특히, 지성 비드가 이러한 샘플의 다른 성분으로부터 골수세포를 분리하는 데 사용될 수 있다. 예컨대, MACS 세포 분리 시약이 사용될 수 있다(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany).
당해 분야에 공지된 바와 같이, 이러한 단리된 배양물은 적은 퍼센트의 또 다른 세포 유형의 하나 이상의 세포 집단, 예컨대 비-핵화된 세포, 예컨대 적혈구를 함유할 수 있다. PBMC는 당해 분야에 공지된 바와 같이 및/또는 본원에서 개시되는 바와 같이 이러한 다른 세포 집단으로부터 추가로 단리 및/또는 정제될 수 있다: 예컨대, 적혈구를 분해시키는 방법이 단리된 PBMC로부터 이러한 세포를 제거하기 위해 일반적으로 이용된다. 그러나, 본 발명의 방법은 추가의 정제 방법에 의존적이지 않으며, 본원에서 단리되는 단리된 PBMC는 직접적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서 개시되는 방법은 단리된 PBMC의 샘플로부터/샘플 내의 적혈구를 용해시키는 단계를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 그러나, 존재하는 경우, 일반적으로 PBMC보다 작은 비-핵화된 세포, 예컨대 적혈구의 존재는 PBMC 아래 및 사이의 배양 표면 상에 침전하며, 잠재적으로 이미지화에 적합한 단층의 형성을 방해하는 것으로 믿어진다. 따라서, PBMC 대비 비-핵화된 세포, 예컨대 적혈구의 농도는 약 500 내지 1, 보다 바람직하게는 약 250 내지 1, 가장 바람직하게는 약 100 내지 1이고, 가능한한 낮은 농도가 바람직하다. 즉, 본원에 개시되는 방법에 따른 단리된 PBMC 샘플은 약 100개 미만의 비-핵화된 세포, 예컨대 적혈구/PBMC를 함유하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서 및/또는 본 발명에서 사용되는 단층을 제공하기 위해, 세포, 특히 PBMC는 단리 후 약 100개 세포/mm²성장 면적 내지 약 30000개 세포/mm²성장 면적의 밀도로 인큐베이션된다. 바람직하게는, 세포, 특히 PBMC는 약 500개 세포/mm²성장 면적 내지 약 20000개 세포/mm²성장 면적, 약 1000개 세포/mm²성장 면적 내지 약 10000개 세포/mm²성장 면적, 약 1000개 세포/mm²성장 면적 내지 약 5000개 세포/mm²성장 면적, 또는 약 1000개 세포/mm²성장 면적 내지 약 3000개 세포/mm²성장 면적의 밀도로 인큐베이션된다. 가장 바람직하게는, 세포, 특히 PBMC는 약 2000개 세포/mm²성장 면적의 밀도로 인큐베이션된다. 용어 "약"은 지정된 값 또는 범위의 10% 내, 보다 바람직하게는 5% 내의 의미를 갖는다. 따라서, 세포, 특히 PBMC는, 일부 실시양태에서, 배양 디바이스에서 약 100개, 즉 90 내지 110개 세포/mm²성장 면적 내지 약 30000개, 즉 27000 내지 33000개 세포/mm²성장 면적의 밀도를 갖도록 본 발명의 방법을 이용하여 인큐베이션된다. 보다 바람직하게는, 세포, 특히 PBMC는 약 500개, 즉 450 내지 550개 세포/mm²성장 면적 내지 약 20000개, 즉 18000 내지 22000개 세포/mm²성장 면적, 약 1000개, 즉 900 내지 1100개 세포/mm²성장 면적 내지 약 10000개, 즉 9000 내지 11000개 세포/mm²성장 면적, 약 1000개, 즉 900 내지 1100개 세포/mm²성장 면적 내지 약 5000개, 즉 4500 내지 5500개 세포/mm²성장 면적, 또는 약 1000개, 즉 900 내지 1100개 세포/mm²성장 면적 내지 약 3000개, 즉 2700 내지 3300개 세포/mm²성장 면적의 밀도로 인큐베이션된다. 가장 바람직하게는, 세포, 특히 PBMC는 약 2000개, 즉 1800 내지 2200개 세포/mm²성장 면적의 밀도로 인큐베이션된다.
세포, 특히 PBMC의 수는 당해 분야에 공지된 표준 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 특히, PBMC의 수는 혈구계를 사용하는 세포 계수에 의하거나 문헌(Chan et al. (2013) J. Immunol. Methods 388 (1-2), 25-32)에 의한 방법에 의해 결정될 수 있다. 골수세포의 수는 또한 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 특히, 골수세포는 세포 계수를 이용하여 결정될 수 있다. 다른 세포는 또한 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 계수될 수 있다.
인큐베이션은 배양 배지에 수행된다. 당업자는 세포, 특히 PBMC 또는 골수세포의 생존력을 유지시키는 데 적합한 방법을 잘 알고 있다. 그러나, 본 발명의 방법에 사용될 배양 배지는 특별히 제한되지 않는다. 이에 대해, 배지는 영양물 및 세포 배양에 필요한 물질을 갖는 액체를 나타낸다. 진핵생물 세포를 배양하기 위한 액체 배양 배지는 당업자에게 공지되어 있다(예: DMEM, RPMI 1640 등). 적합한 배지는 배양되는 세포의 유형에 따라 선택될 수 있다. 예컨대, PBMC 또는 골수세포는 RPMI 1640 10% FCS에서 배양될 수 있다. 임의의 적합한 배지가 선택될 수 있으나, PBMC 반응 및 골수세포 반응에 인위적으로 영향을 끼치지 않는 것으로 공지된 배지 성분이 선택되어야 한다. 보충물은 세포 기능을 유도하거나 변형시키기 위해 배양 배지에 첨가되는 물질(예: 사이토킨, 성장 및 증식 인자, 유사분열물질, 혈청)을 기술한다. 보충물은 당업자에게 공지되어 있다. 진핵생물 세포와 함께 일반적으로 사용되는 혈청에 대한 하나의 예는 우태 혈청이다. 배양 배지는 항생제, 예컨대 페니실린, 스트렙토마이신, 시프로플록사신 등으로 추가로 보충될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 시험 물질 및/또는 자극제는 각각의 개별 유닛 내의 살아있는 세포 물질에 별도로 첨가될 수 있다. 시험 물질은 제약학적 약물 또는 약물 성분일 수 있다. 자극제는 세포의 유지, 성장 또는 분화를 지지하는 물질 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 자극제는, 예컨대 면역 세포의 활성화에 의해 면역 세포에 작용하는 물질이다. 면역 세포의 활성화를 위한 자극제는 당해 분야로부터 공지되어 있다. 이러한 제제는 폴리펩티드, 펩티드 또는 항체 및 다른 자극제일 수 있다. 예컨대, OKT-3, 인터페론-알파, 인터페론-베타 및 인터페론-감마, 올리고CPG, 유사분열물질(예: PWM, PHA, LPS) 등. 시험 물질 및 자극제는 세포 배양 배지로 주입될 수 있다. 바람직하게는, PBMC는 10%의 FBS/FCS로 보충된 RPMI(바람직하나 활성화를 최소화하기 위해 반드시 낮은 내독소 등급을 갖지는 않음)에서 배양된다. PBMC 배양물은 또한 PBMC 공여자로부터의 인간 혈청을 포함할 수 있다.
본 발명의 의미 내에서 사용되는 바와 같은 용어 "성장 영역"은 세포가 놓이는 배양 디바이스 내의 표면을 지칭한다. 본 발명의 의미 내에서 사용되는 바와 같은 용어 "밀도"는 세포가 놓이는 디바이스 내의 표면의 단위 면적당 세포의 양이다. 배양 디바이스는 세포 배양에 적합한 임의의 물질, 특히 비-세포독성의 세포 배양 시험 물질로 제조될 수 있다. 예시적 물질은 플라스틱 물질, 예컨대 열가소성 또는 두로플라스틱(duroplastic) 물질이다. 적합한 플라스틱의 예는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리술폰, 폴리카보네이트, 폴리에테르에틸케톤(PEEK) 또는 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE)이다. 특히, 디바이스는 PBMC의 배양 및 및/또는 유지에 적합하다. 당해 분야에 공지되고 본 발명에서 사용되는 전형적인 배양 디바이스는 배양 플라스크, 디쉬, 플레이트 및 다수-웰 플레이트를 포함한다. 다수-웰 플레이트가 특히 유용하며, 이는 최소 물질 요건, 예컨대 최소 배지 요건으로, 예컨대 다수의 교란을 위한 다수의 배양물을 별도로 유지시키는 능력을 제공한다. 바람직한 배양 디바이스는 96 웰 플레이트, 384 웰 플레이트 및 1536 웰 플레이트를 포함한다. 배양물의 이미지화 분석, 특히 형광 이미지화와 관련하여 당해 분야에 공지된 바와 같이, 최소 광 산란 및 감소된 혼선과 함께 배경 형광/배경 광학 간섭을 감소시키는 이미지화를 위해 특별히 디자인된 블랙 웰 플레이트를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 배양 디바이스는 멸균될 수 있다. 가장 바람직한 실시양태에서, 다중웰을 포함하는 다중웰 이미지화 플레이트가 사용되며, 웰의 적어도 일부는, 하나 이상이 제1 측벽 및 바닥 벽에 의해 형성되는 제1 챔버; 하나 이상의 제2 측벽에 의해 형성되고, 액체를 도입하기 위한 개구를 포함하며, 제1 챔버의 상단에 배치되는 제2 챔버; 방해 차단 구조물을 형성하는, 제1 챔버와 제2 챔버 사이에 제공되는 중간 플로어를 포함하며; 중간 플로어에는 제1 챔버와 제2 챔버 사이의 액체 연결을 제공하는 적어도 하나의 관통 구멍이 제공되며; 관통 구멍은 피펫 끝이 제2 챔버를 통해서 상기 관통 구멍을 통해 제1 챔버로 삽입되도록 구성된다.
디바이스는 자동화된 이미지화 시스템 및 분석에 특히 유용하다. 따라서, 디바이스/배양 디바이스는 이러한 시스템에 사용하는 데 적합하다. 비제한적 예로써, 배양 디바이스는 반투명할 수 있다. 이미지화, 예컨대 형광 이미지화를 위해 사용되는 배양 디쉬 및 플레이트는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 시판된다. 본 발명의 실시예 사용하기 위한 시판 배양 플레이트의 비제한적 예는 Corning® 384-웰, 조직-배양 처리된 블랙 뚜껑, 투명 바닥 플레이트(Corning Inc., Massachusetts, USA) 또는 Corning® 384 웰 평평 투명 바닥 블랙 폴리스티렌 TC-처리된 마이크로플레이트(Product #3712)이다. 또 다른 예는 Perkin Elmer Cellcarrier®이다.
바람직하게는 단층 형태의 본 발명의 세포 집단은 당해 분야에 공지되고/공지되거나 본원에서 개시되는 임의의 방법에 따라 이미지화될 수 있고, 본원에서 제공되는 방법은 당해 분야에서 공지된 임의의 이미지화 기술을 이용할 수 있다. 특정 이미지화 방법이 중요하지는 않으며, 당업자의 지식에 따라 결정될 수 있다. 이미지화는 염료 또는 염색의 사용을 필요로 하거나 그러하지 아니할 수 있고, 염색된 성분 및 비-염색된 성분 모두의 이미지화를 포함할 수 있고, 및/또는 염색이 가시적이거나 그러하지 않은 조건 하에서(예컨대, 명시야에서 이미지화(형광 염색이 가시적이지 않은 경우) 및 UV 광 하에서(형광 염색이 가시적인 경우) 또는 이의 조합 하에서의 이미지화를 포함할 수 있다. 명시야 조건 하에서의 이미지화는 당해 분야에서 널리 공지되어 있고 일반적으로 사용되며, 표준 방법에 따라 및/또는 본원에서 개시되는 바와 같이 수행될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 임의의 다른 표지가 없는 이미지화가 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 이러한 표지가 없는 방법은 공지되어 있으며, 예컨대 페이스포커스(PhaseFocus) 이미지화(Phase Focus Ltd, Sheffield, UK)를 포함한다.
본 발명의 실시는 또한 (표지가 없는 방법과 관련하여 또는 독립적으로) 세포 집단, 바람직하게는 단층, 특히 PBMC 단층에 검출가능한 표지의 첨가를 포함할 수 있으며, 표지는 현미경검사 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 검출가능한 표지는 당해 분야에 공지된 바와 같이 분리된 세포 구조물, 성분 또는 단백질을 표지할 수 있다. 표지는 또한 항체에 부착되어 특이적으로 표지하고 항체 항원 검출을 가능하게 할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 검출가능한 표지는 가시광 또는 UV 광 하에서 표지의 가시화를 가능하게 한다. 따라서, 검출가능한 표지는 형광성일 수 있다. 다수의 표지가 당해 분야에 공지되어 있으며, 본 발명에 적합하다. 표지는 추가의 작용 없이 검출가능하거나, 단지 제2의 단계, 예컨대 기질의 첨가, 효소 반응에의 노출 또는 특정 광 파장에의 노출 후에만 검출가능하게 될 수 있다.
세포 아집단(표적 세포), 즉 본원에서 사용되는 바와 같은 구분가능한 아집단, 특히 PBMC 아집단 또는 골수세포 아집단은 표적 세포의 표면 상 또는 세포의 내부의 하나 이상의 마커의 발현을 통해 검출가능한 표지에 의해 확인될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 아집단은 표적 세포의 표면 상 또는 세포의 내부의 하나 이상의 마커의 발현의 결여에 의해 정의될 수 있다. 마커를 발현하거나 발현하지 않는 세포가 실제로 표적 세포, 예컨대 목적하는 세포 아집단의 구성원인지에 대한 추가의 확증을 제공하기 위해 하나 이상의 마커(예컨대, 2개의 마커, 3개의 마커, 4개의 마커 등)의 발현 또는 발현의 결여에 대해 시험하는 것이 바람직할 수 있다. 예컨대, 상이한 마커에 대한 항체의 "칵테일"은 동일한 표지 또는 상이한 표지에 (직접적으로 또는 간접적으로) 각각 커플링될 수 있다. 예시로써, 상이한 마커에 대한 항체의 칵테일은 동일한 표지에 결합하는 결합 모티프를 각각 함유할 수 있다(예컨대, 각각은 동일한 이차 항체에 의해 인식되는 동일한 종의 Fc를 함유하거나, 비오틴 처리되고 동일한 아비딘-커플링된 표지에 의해 특이적으로 결합될 수 있다). 임의적으로, 2개 이상의 상이한 항체 또는 항체의 칵테일이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 서로로부터 구별될 수 있는 2개 이상의 표지를 사용하여 염색되며, 이로써 표적 세포 유형의 2개 이상의 상이한 마커를 발현하는 세포의 확인을 가능하게 한다. 세포는 또한 서로로부터 구별될 수 있는 적어도 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 상이한 표지를 사용하여 염색될 수 있으며, 이로써 많은 수의 표적 세포 유형의 마커를 발현하는 세포의 검출을 가능하게 한다. 임의적으로, 세포는 미리선택된 수의 마커 또는 특정한 미리선택된 마커의 조합을 발현하는 경우 표적 유형의 세포로 확인될 수 있거나, 세포는 미리선택된 마커를 발현하지 않는 경우 표적 유형의 세포로 확인될 수 있다. 추가적으로, 표적 세포 유형의 마커(들)은, 이들이 표적 세포와 집단 내의 다른 세포와의 구별을 허용하는 한, 표적 세포에 특이할 필요는 없다. PBMC의 경우, PBMC 세포 집단의 주요 성분은 수지상 세포에 대해 CD11C, 대식세포에 대해 CD14, T-세포에 대해 CD3(CD4 또는 CD8와 CD3) 및 B-세포에 대해 CD19로 기술된다. 상기 마커들이 PBMC의 이들 주요 부류의 서브세트에서 중복되나, PBMC의 아집단을 확인하기 위한 이들 마커로의 염색이 당해 분야에서 널리 수용된다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 추가의 마커는 CD 마커 편람(Becton, Dickinson and Co. 2010, CA, USA)에서 찾을 수 있다. 골수세포에 포함되는 주요 세포 아집단은 호중구성 후골수세포, 호중구성 골수세포, 분절된 호중구, 적혈모세포 및 림프구이다.
본 발명의 실시에서 검출가능한 표지에 접합된 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 항체는 별개의 세포 구조물을 표적하는 것을 가능하게 하므로, 이러한 항체(각각 상이한 표지를 지님)의 칵테일은 다수의 표적물/세포 구조물/세포 성분을 동시에 가시화하는 데 사용될 수 있다. 염색 동안 단층의 파괴를 피하도록 조심해야 한다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 이는 항체-기반 표지의 사용에 특히 문제가 되는 데, 이들의 사용이 일반적으로 정확한 가시화를 방해하는, 즉 비-특이적 염색 및/또는 검정 "노이즈"를 생성하는 결합되지 않은 표지를 제거하기 위한 하나 이상의 세척-단계를 필요로 하기 때문이다. 따라서, 본 발명은 염색 후 세척 요구조건을 최소화하거나 제거하는 검출가능한 표지, 특히 항체-기반 표지로 세포 단층을 염색하는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 세척 부재 하에서 노이즈 시그날의 발생을 피하는 농도로 검출가능한 표지(들)를 첨가하는 단계를 포함할 수 있으며, 이는 당해 분야에 널리 공지되고/되거나 본원에서 개시되는 방법에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 항체 제조사에 의해 권장되는 농도 초과 또는 미만의 농도로 표지된 항체를 사용하는 것을 포함한다.
일부 예시적인 세포 유형의 경우, 마커가 세포 내에서 특징적인 편재화 또는 패턴을 나타내는 경우, 세포는 단지 지정된 마커에 대해 양성인 것으로 간주될 수 있다. 예컨대, 세포는, 세포골격 마커가 세포골격에 존재하는 경우 "양성"으로 간주되고, 일부 분산된 세포질 염색이 있는 경우 "음성"으로 간주될 수 있다. 이러한 경우, 세포는 세포 내에서 특징적인 편재화 또는 패턴을 확인하기 위한 적합한 조건 하에서(예컨대, 부착 배양과 같이) 배양될 수 있다. 지정된 마커의 견고한 검출에 필요할 수 있는 세포골격 어셈블리(또는 세포내 조직화를 확립하기 위한 다른 과정)에 적합한 배양 조건 및 시간은 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 추가적으로, 견고한 염색에 대한 예비조건으로서 부착 배양에 대한 요구를 감소 또는 배제시키는 마커가 쉽게 선택될 수 있다.
단백질을 표지하는 데 유용한 염료는 당해 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 염료는 광학적으로 검출가능한 시그날, 예컨대 비색, 발광, 생물발광, 화학발광, 인광 또는 형광 시그날을 제공할 수 있는 분자, 화합물 또는 물질이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 염료는 형광 염료이다. 염료의 비-제한적 예는, 이중 일부가 시판되는, CF 염료(Biotium, Inc.), 알렉사 플루오르 염료(Invitrogen), 디라이트(DyLight) 염료(Thermo Fisher), Cy 염료(GE Healthscience), IRDyes(Li-Cor Biosciences, Inc.), 및 HiLyte 염료(Anaspec, Inc.)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염료의 여기 및/또는 방출 파장은 350 nm 내지 900 nm, 또는 400 nm 내지 700 nm, 또는 450 내지 650 nm이다.
예컨대, 염색은 다수의 검출가능한 표지, 예컨대 항체, 자가-항체 또는 환자 혈청을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 염색은 가시광 하에서 및 UV 광 하에서 관찰될 수 있다. 염색은 착색 시약 또는 착색 시약을 생성할 수 있는 효소에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 항체를 포함할 수 있다. 항체가 염색의 성분으로 사용되는 경우, 마커가 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 간접적 커플링의 예는 아비딘/비오틴 커플링, 이차 항체를 통한 커플링 및 이의 조합을 포함한다. 예컨대, 세포는 표적-특이적 항원에 결합하는 일차 항체로 염색될 수 있고, 일차 항체 또는 일차 항체에 커플링된 분자에 결합하는 이차 항체는 검출가능한 마커에 커플링될 수 있다. 간접적 커플링의 이용은, 예컨대 배경 결합을 감소시키고/시키거나 시그날 증폭을 제공함으로써 시그날 대 노이즈 비율을 개선할 수 있다.
염색은 또한 형광 표지에 (상기 설명되는 바와 같이) 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 일차 또는 이차 항체를 포함할 수 있다. 형광 표지는 알렉사 플루오르 350, 알렉사 플루오르 405, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 514, 알렉사 플루오르 532, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 555, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 610, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 635, 알렉사 플루오르 647, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680, 알렉사 플루오르 700, 알렉사 플루오르 750 및 알렉사 플루오르 790, 플루오로세인 이소티오시아네이트(FITC), 텍사스 레드, SYBR 그린, 디라이트 플루오르스(DyLight Fluors), 녹색 형광 단백질(GFP), TRIT(테트라메틸 로다민 이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸), 텍사스 레드 염료, 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리언트 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 디곡시게닌, 5-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시 플루오레세인, TET(6-카복시-2',4,7,7'-테트라클로로플루오레세인), HEX(6-카복시-2',4,4',5',7,7'-헥사클로로플루오레세인), Joe(6-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인) 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시 로다민, 탐라(Tamra)(테트라메틸로다민), 6-카복시로다민, 록스(Rox)(카복시-X-로다민), R6G(로다민 6G), 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌(예: Cy3, Cy3.5, Cy5), 크산틴, 숙시닐플루오레세인, N,N-디에틸-4-(5'-아조벤조트리아졸릴)-페닐아민, 아미노아크리딘, 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법의 추가의 예시적 실시양태는 형광 분자, 예컨대 에티듐 브로마이드, SYBR 그린, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 디라이트 플루오르스, 녹색 형광 단백질(GFP), TRIT(테트라메틸 로다민 이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸), 텍사스 레드 염료, 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리언트 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 디곡시게닌, 5-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시 플루오레세인, TET(6-카복시-2',4,7,7'-테트라클로로플루오레세인), HEX(6-카복시-2',4,4',5',7,7'-헥사클로로플루오레세인), Joe(6-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인) 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시 로다민, 탐라(테트라메틸로다민), 6-카복시로다민, 록스(카복시-X-로다민), R6G(로다민 6G), 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌(예: Cy3, Cy3.5, Cy5), 크산틴, 숙시닐플루오레세인, N,N-디에틸-4-(5'-아조벤조트리아졸릴)-페닐아민 및 아미노아크리딘에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된 항체를 사용한다. 다른 예시적 형광 분자는 특허 문헌(예컨대, 미국 특허 번호 6,207,299, 6,322,901, 6,576,291, 6,649,138(혼합된 소수성/친수성 중합체 전달제가 양자점 표면에 결합되는 표면 변형 방법), 미국 특허 번호 6,682,596, 6,815,064(합금 또는 혼합 쉘에 대한 것), 이들 특허들 각각은 본원에 참조로 포함됨) 및 기술 문헌(예컨대, "Alternative Routes toward High Quality CdSe Nanocrystals," (Qu et al., Nano Lett., 1(6):333-337 (2001))에 기술되어 있는 양자점을 포함한다. 다양한 표면 화학 및 형광 특성을 갖는 양자점은 특히 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation), 유진, 오레그.(Eugene, Oreg.), 에비덴트 테크놀로지스(Evident Technologies, 뉴욕주 트로이) 및 퀀텀 도트 코포레이션(Quantum Dot Corporation, 캘리포니아주, 헤이워드)로부터 시판된다. 퀀텀 도트는 또한 합금 양자점, 예컨대 ZnSSe, ZnSeTe, ZnSTe, CdSSe, CdSeTe, ScSTe, HgSSe, HgSeTe, HgSTe, ZnCdS, ZnCdSe, ZnCdTe, ZnHgS, ZnHgSe, ZnHgTe, CdHgS, CdHgSe, CdHgTe, ZnCdSSe, ZnHgSSe, ZnCdSeTe, ZnHgSeTe, CdHgSSe, CdHgSeTe, InGaAs, GaAlAs, 및 InGaN을 포함한다. 합금 양자점 및 이를 제조하는 방법은, 예컨대 미국 출원 공개 2005/0012182 및 PCT 공개 2005/001889에 기술되어 있다.
상기 방법은, 바람직하게는 단층의 형태로 본 발명의 세포 집단을 표지한 후, 검출가능한 표지의 시그날을 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 검출 방법은 검출가능한 표지에 의해 방출되는 시그날의 종류에 따라 적절히 조정될 수 있다. 형광 방출 표지를 검출하기에 적합한 검출 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 검출 방법은 또한 당해 분야에 공지된 표준 방법에 따라 자동화될 수 있다. 예컨대, 당업자가 세포의 현미경검사 이미지를 분석 및 해석하고 그들의 분석에 대한 자동화된 프로토콜을 확립하는 것을 가능하게 하는 다양한 컴퓨터를 사용하는 방법이 존재한다. 현미경검사 이미지의 조도 편향에 대한 교정, 현미경검사 이미지로부터의 개별 세포의 확인 및 마커 강도 및 텍스쳐 뿐만 아니라 핵 및 세포 크기 및 형태 및 위치 파라미터의 측정을 포함하는 일차 이미지 분석을 위해, 공개소스 소프트웨어 셀프로파일러(CellProfiler)(예: 버전 2.1.1)가 사용될 수 있다. 마커-양성 세포(예: CD34+ 전구세포 또는 생존력 염료 양성 세포)의 확인은 공개소스 소프트웨어 셀프로파일러 애널리스트(CellProfiler Analyst)(예: 버전 2.0)을 사용하여 기계 학습에 의해 수행될 수 있고, 이중- 또는 삼중-양성 세포는 연속 게이팅 전략에 의해 확인될 수 있다. 추가 분석 및 히트 선택을 위한 플레이트-개관도 마찬가지로 셀프로파일러 애널리스트를 사용하여 생성될 수 있다.
바이오컨덕터(Bioconductor)(예: 버젼 2.14) 또는 파이프라인 파일롯(Pipeline Pilot)(예: 버젼 9.0; Accelrys)의 cellHTS 패키지 모두가 플레이트-효과 정규화, 대조군-기반 정규화 및 히트 선택을 포함하는 일차 이미지 분석에 이어 데이타 분석에 사용될 수 있다.
시판용의 자동화된 현미경검사 시스템, 예컨대 퍼킨엘머 오페레타(PerkinElmer Operetta) 자동화된 현미경(PerkinElmer Technologies GmbH & Co. KG, Walluf, Germany)(이 시스템은 대응하는 이미지 분석 소프트웨어, 예컨대 퍼킨엘머 하모니 소프트웨어(예: 버젼 3.1.1)를 포함할 수 있음)이 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 이러한 자동화된 및/또는 시판용 시스템은 본 발명의 방법에 따라 현미경 이미지로부터 일차 이미지 분석, 양성 세포 선별 및 히트 선별을 수행하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은, 이 일차 분석에 이어, 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향을 결정하기 위해 또는 세포 공여자의 질환 또는 질환에 대한 소인의 진단을 위해 또는 새로운 치료제의 스크리닝을 위해 (상기 방법은 공여자로부터 수득되는 세포 샘플에서 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계를 포함하며, 공여자의 세포 샘플은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함함) 또는 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 대상체가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정하기 위해 (상기 방법은 대상체로부터 수득되는 세포 샘플에서 세포들 간의 상호작용 변경을 결정하는 단계를 포함하고, 대상체의 세포 샘플은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함함) 수행된다.
상기 방법은 면역 매개된 질환에 대해 이전에 또는 현재 치료된 대상체로부터 세포, 특히 PBMC 또는 골수세포를 단리하고, PBMC 또는 골수세포를 자극하고, PBMC 또는 골수세포의 아집단을 확인하고, PBMC 아집단 또는 골수세포 아집단으로부터의 세포 상호작용 성향 데이타를 치료제에 대한 대상체 반응과 비교하고, 치료제에 대한 양성 반응에 관련된 특징적(signature) 세포 상호작용 프로파일을 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
면역 매개된 질환은 면역결핍 질환, 자가면역 질환 및 과민성 질환을 포함하는 수개의 카테고리로 분류될 수 있다. 면역결핍 질환은 면역계의 일부가 적절히 기능하지 않을 때 발생한다. 자가면역 질환은 병원체 대신에 자신을 공격하는 면역계의 결과이다. 과민성 질환은 면역계가 과대 반응하고 신체에 손상이 생길 때 발생한다.
본 발명의 방법을 이용하여 진단되는 질환은, 세포 집단에 포함된, 바람직하게는 단층에 포함된 세포를 사용하여 진단될 수 있는 한, 특히 각각 PBMC 또는 골수세포를 사용하여 진단될 수 있는 한, 즉 진단되는 질환을 갖는 대상체가 세포 샘플에 포함된 세포, 예컨대 질환과 연관될 수 있는 PBMC 또는 골수세포의 구분가능한 아집단에 대해 건강한 공여자에서 예상되는 것으로부터 변경된 세포 상호작용 패턴(들)을 나타내는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명에서 제공되는 수단 및 방법을 이용하여 진단될 수 있는 질환은, 이로 제한됨이 없이, 혈액 악성종양 및/또는 골수 및/또는 림프 조직의 악성종양 또는 면역 매개된 질환을 포함한다. 특히, 본원에서 제공되는 수단 및 방법에 의해, 특히 PBMC 단층 또는 골수세포 단층에서 진단가능하고/하거나 예측가능한 질환은, 이로 제한됨이 없이, 골수증식 장애(또는 일반 혈액암), 염증 장애, 잠복 바이러스 감염, 세포 성장 장애, 세포 주화성 장애, 대사 장애, 자가면역 장애(예컨대, 자가 리간드로 염색 또는 클론 항체에 대한 환자 혈청 또는 자가 항원 인식)를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법은 백혈병(만성 및 급성), 림프종(성숙 B-세포, 성숙 T- 및 NK 세포, 호지킨 림프종), HIV, 통풍, 쇼크 등을 진단하는 데 이용될 수 있다. 즉, 본 발명의 수단 및 방법은 대상체가 하기 ICD-10 코드의 하기 질환(이에 제한되지 않음)의 치료에 반응할 것인지/반응적인지의 여부를 진단 또는 결정하는 데 사용될 수 있다: A00-B99 - 특정 감염성 및 기생충 질환; C00 - C97 악성 신생물; D70-77 - 혈액 형성 시스템의 기타 질환; D80-89 - 어디에도 분류되지 않는, 면역 기작을 수반하는 특정 장애; D82 - 기타 주요 결함과 연관된 면역결핍; D83 - 공통 가변성 면역결핍; D84 - 기타 면역결핍; G35-37 - 중추신경계의 질환; I00 - I03 - 급성 류마티스성 열; I05-I09 - 만성 류마티스성 심장 질환; I01 - 심장 개입된 류마티스성 열; I06 - 류마티스성 대동맥 판막 질환; I09 - 류마티스성 심근염; I70 - 죽상경화증; K50 - 크론 질환; K51 - 대장염; K52 - 기타 비감염성 위창자염 및 대장염; M00 - M19 관절증; M05 - 혈청 반응 양성 류마티스 관절염; M06 - 기타 류마티스 관절염; M10 - 통풍; M11 - 기타 결정 관절증; M35 - 건조 증후군; M32 - 전신 홍반성 루프스; N70-77 - 여성 골반 기관의 염증 질환; P35-39 - 출산 전후기에 특이한 감염; P50 - P61 - 태아 및 신생아의 출혈 및 혈액성 장애; Z22 - 감염성 질환의 캐리어; Z23 - 단일 세균 질환에 대한 면역화 필요; 및/또는 Z24 - 특정한 단일 바이러스 질환에 대한 면역화 필요.
"치료" 또는 "치료하는"은 치료적 처치 및 예방적(prophylactic 또는 preventative) 조치 둘 다를 지칭하며, 목표는 표적된 병리학적 병태 또는 장애 또는 이와 연관된 하나 이상의 증상을 예방하거나 개선하거나 감속(완화)시키는 것이다. 마찬가지로, "반응적인" 또는 "반응한다" 및 유사한 용어는 표적된 병리학적 병태 또는 이와 연관된 하나 이상의 증상이 예방, 개선 또는 완화되는 표시를 지칭한다. 상기 용어는 또한 본원에서 질환, 특히 골수증식 질환 또는 이러한 마커가 달성하였던 증상의 발병 지연, 억제(예: 성장 감소 또는 억제), 영향의 경감 또는 이를 앓는 환자의 삶의 연장을 나타내기 위해 사용된다. 치료가 필요한 이들은 장애를 갖는 것으로 진단된 이들, 장애를 갖는 것으로 의심되는 이들, 장애를 갖기 쉬운 이들 뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 이들을 포함한다. 따라서, 본원에서 치료되는 포유동물은 장애를 갖는 것으로 진단되었을 수 있거나 장애에 걸리기 쉽거나 장애에 민감할 수 있다.
"반응" 또는 "반응적인"은 치료 이후에 적어도 하나의 변경된 특성을 나타내는 PBMC 또는 대상체를 지칭한다. 대상체의 변경된 특성은 표적된 병리학적 병태 또는 장애의 개선 또는 감속일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 예방제 또는 치료제의 투여로부터 발생되는, 대상체에서 암 질환의 하나 이상의 증상의 발생 및/또는 재발 또는 발병의 예방을 지칭한다.
본원에서 제공되는 수단 및 방법은 대부분 일차 조혈 세포 또는 모든 단핵구 세포에 대해 기술된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 일차 조혈 세포는, 특히 PBMC 및 골수세포를 포함한다. 따라서, PBMC에 대해 본원에서 제공되는 수단 및 방법은 또한 골수세포 뿐만 아니라 임의의 다른 단-핵화된 세포에 대해서도 기술된다.
본 발명의 의미 내에서 "치료제"는, 제한됨이 없이, 폴리펩티드, 펩티드, 당단백질, 핵산, 합성적 및 천연 약물, 펩토이드(peptoide), 폴리엔, 마크로실(macrocyle), 글리코시드, 테르펜, 테르페노이드, 지방족 및 방향족 화합물, 및 이들의 유도체를 포함하는 분자이다. 바람직한 실시양태에서, 치료제는 화학적 화합물, 예컨대 합성 및 천연 약물이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 치료제는 질환, 장애, 병리 및/또는 이와 연관된 증상의 개선 및/또는 치유를 달성한다. 중합체는 본 발명의 방법에서 스크리닝될 하나 이상의 치료제 또는 시험 화합물을 캡슐화할 수 있다.
적합한 치료제는, 제한 없이, 문헌(Goodman and Oilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (예: 제9판) 또는 Merck Index (예: 12판))에 제시된 것들을 포함한다. 일반적인 치료제는, 제한 없이, 염증 반응에 영향을 끼치는 약물, 체액의 조성에 영향을 미치는 약물, 전해질 대사에 영향을 미치는 약물, 화학치료제(예: 과증식 질환, 특히 암에 대한 것, 기생충 감염에 대한 것 및 미생물 질환에 대한 것), 항신생물제, 면역억제제, 혈액 및 혈액-형성 기관에 영향을 미치는 약물, 호르몬 및 호르몬 길항제, 비타민 및 영양물, 백신, 올리고뉴클레오티드 및 유전자 요법제를 포함한다. 2개 이상의 활성제, 예컨대 2개의 약물의 배합물, 예컨대 혼합물 또는 블렌드를 포함하는 조성물이 또한 본 발명에 의해 포함된다는 것이 이해될 것이다.
하나의 실시양태에서, 치료제는 약물 또는 프로드럭, 항체 또는 백신일 수 있다. 본 발명의 방법은 환자에게 치료제의 투여가 치료제 또는 치료제와 함께 투여되는 전달 비히클, 부형제, 담체 등의 성분에 대해 반응을 촉발하는지의 여부를 평가하기 위해 이용될 수 있다.
치료제의 정확한 특성은 본 발명에 대해 제한적이지 않다. 비-제한적 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 임의적으로 부형제, 담체 또는 전달 비히클과 조합하여, 합성 소분자, 천연 발생 물질, 천연 발생 또는 합성적으로 생성되는 생물학적 제제, 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합에 대한 반응을 평가하는 데 이용될 수 있다.
용어 "진단"은 (이의 문법적 변형, 예컨대 "진단하는" 또는 "진단의"와 함께) 분자 또는 병리 상태, 질환 또는 병태의 확인, 예컨대 암의 확인을 지칭하거나, 특정 치료 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 암 환자의 확인을 지칭한다.
용어 "예후" (및 이의 문접적 변형, 예컨대 "예후하는" 또는 "예후의")는 치료, 예컨대 암 요법으로부터의 이익의 가능성을 예측하는 것을 지칭한다.
용어 "예측" 또는 "예측하는"은 본원에서 환자가 특정 치료제에 의해 유리하게 또는 불리하게 반응할 가능성을 지칭하기 위해 사용된다. 하나의 실시양태에서, 예측 또는 예측하기는 이들 반응의 정도와 관련된다. 하나의 실시양태에서, 예측 또는 예측하기는 환자가 치료, 예컨대 특정 치료제로의 치료 후 및 질환 진행 없이 특정 기간 동안 생존하거나 개선될지의 여부 및/또는 확률과 관련된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에서 개시되는 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에서 기술된다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 설명적인 것으로서 제한하려는 것이 아니다.
본원에서 개시되는 일반적 방법 및 기술은, 달리 지시되지 않는 한, 당해 분야에 널리 공지된 통상의 방법에 따라 및 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적인 및 보다 구체적인 참조문헌에서 기술되는 바와 같이 수행될 수 있다. 예컨대, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992); Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990))을 참조한다.
본 발명의 양상이 도면 및 상기 설명에서 상세히 설명되고 기술되었지만, 이러한 설명 및 기술은 설명적이거나 예시적인 것으로 고려되어야 하며 제한적이지 않다. 당업자는 하기 청구범위의 범위 및 취지 내에서 변화 및 변형을 수행할 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 본 발명은 상기 및 하기에서 기술되는 상이한 실시양태들로부터의 특징들의 임의의 조합을 갖는 추가적인 실시양태를 포함한다.
또한, 청구범위에서, 단어 "포함하는"은 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않으며, 단수는 복수를 배제하지 않는다. 단일 유닛은 청구범위에서 열거되는 여러 특색의 기능을 수행할 수 있다. 특히, 속성 또는 값과 관련하여 용어 "본질적으로", "약", "대략" 등은 또한 각각 정확하게 속성 또는 정확하게 값을 정의한다. 청구범위 내의 임의의 기호는 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
특허 또는 출원 파일은 색상으로 작성된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 색상 도면(들)을 갖는 이 특허 또는 특허 출원의 공개문의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 지불시 사무소에 의해 제공될 것이다.
본 발명은 또한 일부 측면에서 하기 도면에 의해 설명된다.
도 1: 3개의 색상, 10x, 384 웰 플레이트로부터의 PBMC 단층의 이미지, 3개의 채널로의 분할의 예시.
도 2: 세포가 상호작용하는 성향 측정에 대한 본 발명의 설정 및 카툰 설명, 및 면역학적 잠재력에 대한 관계.
도 3: 세포가 1개 이하의 다른 파트너와 상호작용하는 상태에서 WO 2016/046346, 본 발명 및 헬무트 등에 따라 측정되는 A와 B 세포 간의 진정한 상호작용 성향 P(a-b)의 함수로서의 A형, B형 및 C형 세포를 포함하는 합성 데이타세트에서의 상호작용 성향의 측정.
도 4: 세포가 1개 초과의 다른 파트너와 상호작용하는 상태에서 WO 2016/046346, 본 발명 및 헬무트 등에 따라 측정되는 A와 B 세포 간의 진정한 상호작용 성향 P(a-b)의 함수로서의 A형, B형 및 C형 세포를 포함하는 합성 데이타세트에서의 상호작용 성향의 측정
도 5: 세포가 1개 초과의 다른 파트너와 상호작용하는 상태에서 WO 2016/046346, 본 발명 및 헬무트 등에 따라 측정되는 총 세포에 대한 A 및 B 세포의 분율인 F(A) 및 F(B)의 함수로서의 A형, B형 및 C형 세포를 포함하는 합성 데이타세트에서의 상호작용 성향의 측정
도 6: K562 종양 세포의 NK 세포 매개된 사멸 조절제를 확인하기 위해 본 발명을 이용하여 측정되는 K562와 NK 세포 간의 상호작용 성향의 이용.
도 7: T-세포 지시된 리간드로 활성화 시 수지상 세포(CD11c+)에 대한 T-세포 서브세트(CD4 또는 CD8+)의 Log2 상호작용 스코어로 표현되는 상호작용 성향의 측정. PBS는 대조군 또는 참조물이고, Tcact는 T-세포 활성화제이다.
도 8: 그람 음성 내독소인 LPS(리포폴리사카라이드)(이는 이러한 단핵구 집단화를 유도하는 것으로 공지됨)으로 자극 후 CD14+ 단핵구 서로간의 Log2 상호작용 스코어로 표현되는 상호작용 성향의 측정. 참조는 PBS 대조군이다.
도 9: 임상적으로 승인된 생물의약품 약물인 블리나투모맙의 증가하는 농도 및 대조군(O)으로 배지 단독과 함께 CD20 세포에 대한 CD3 세포의 Log2 상호작용 스코어로서 표현되는 상호작용 성향의 측정. 블리나투모맙은 세포독성 또는 다른 T-세포 및 암성 B-세포를 소집하고 이 상호작용을 통해 암세포 사멸을 유도하고 이로써 암성 부담을 줄이는 공지된 작용 기작을 갖는다.
도 10: 소분자 크리조티닙으로의 처리 후 CD11c 및 CD3 세포의 Log2 상호작용 스코어로서 표현되는 상호작용 성향의 측정. ALK 억제제인 크리조티닙은 비-소세포 폐암에 대해 승인되어 있으며, 상호작용 스코어에 대한 본 발명 이전에는 이의 작용 기작에 대한 면역조절 성분을 갖지 않았으며, 이는 스크리닝 캠페인 동안 확인되었다.
도 11: 임상적으로 승인된 생물학적 약물인 리툭시맙의 증가하는 농도 및 대조군(O)으로 배지 단독과 함께 CD56 세포에 대한 CD19 세포의 Log2 상호작용 스코어로서 표현되는 상호작용 성향의 측정. 리툭시맙은 NK-세포 및 암성 B-세포를 소집하고 이 상호작용을 통해 암세포 사멸을 유도하고 이로써 암성 부담을 줄이는 공지된 작용 기작을 갖는다.
도 12: 병리 검토에 따라 종양 세포를 포함하였던 CD10+ 양성 표적 세포와 CD3+ T-세포 간의 상호작용을 본 발명의 방법을 이용하여 24시간 동안 블리나투모맙 처리에 반응하여 B-세포 림프종 환자의 샘플에서 측정하고, 상호작용 스코어로서 정량화하였다. 비록 건강한 혈액에서 건강한 B- 및 T-세포는 블리나투모맙에 의해 교차 결합되고 본 발명을 이용하여 측정되는 B-세포와 T-세포 간의 대응하는 상호작용이 증가하지만, 이 환자는 그렇지 않았다. 환자는 후에 블리나투모맙에 반응하지 않는 것으로 밝혀졌다. 상이한 그래프는 환자의 흉막 삼출액(PE)으로부터 단리되는 세포의 상이한 양이 동일한 환자로부터의 매칭된 PBMC의 상이한 양과 혼합되었음을 도시한다.
도 13: 48시간 동안 상이한 사이토킨(5 ng/mL)으로의 처리에 반응하여 PBMC 단층에서의 상이한 구분가능한 세포 아집단 간의 상호작용 성향의 변화. 개별 상호작용 성향을 본 발명에 따라 결정하였으며 log2 상호작용 스코어로 정량화하였다. PBS 대조군 대비 상호작용 성향의 크기는 히트맵에서 음영으로 제공된다. 상호작용 성향의 표시는 "+" 또는 "-" 기호로 표시된다.
본 발명의 측면은 본 발명의 실시양태 및 그의 많은 이점에 대한 더 나은 이해를 제공하는 하기의 예시적인 비-제한적인 실시예에 의해 부가적으로 기술된다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 하기의 실시예에 제시되는 기술은 본 발명의 실시에 잘 기능하도록 본 발명에서 사용되는 기술을 나타내므로, 본 발명의 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 그러나, 당업자는 본 개시물에 비추어 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 기술된 특정 실시양태에 많은 변화가 이루어질 수 있고 여전히 동등하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인식해야 한다.
달리 지시되지 않는 한, 재조합 유전자 기술의 확립된 방법이, 예컨대 문헌(Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001), 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 기술된 바와 같이 이용되었다.
특허 출원, 제조사의 매뉴얼 및 과학 출판물을 포함한 다수의 문헌이 본원에 인용된다. 이들 문헌의 개시는 본 발명의 특허성과 관련되는 것으로 간주되지는 않지만 전체가 참조로 본원에 포함된다. 더욱 특히, 모든 참조된 문헌은 각각의 개별 문헌이 참조로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것과 같이 동일한 범위로 참조로 포함된다.
실시예 1
실험: 384 웰 플레이트에서 이미지화를 위한 염색가능 단층(단일 이미지 가능한 필드/이미지화 평면)을 생성하는, 건강한 공여자 또는 환자로부터의 PBMC의 배양 프로토콜을 확립하기 위함.
방법: PBMC를 약물검사를 위해 발명된 프로토콜에 따라 배양하였다. 첫 번째 단계에서, 혈액을 건강한 발단자(들) 또는 환자(들)로부터 수집한다. 전형적으로, 부피는 9 내지 500 ml이고, 혈액을 EDTA 또는 헤파린을 함유하는 적합한 용기에 저장한다. 이어서, 혈액 샘플을 PBS 버퍼로 1:1 비율로 혼합한다. 30 ml의 혈액/PBS 혼합물을 정제를 위해 50 ml 튜브 내의 15 ml 림포프렙(lymphoprep) 밀도 구배물 위에 적층한다. 튜브를 30분 동안 실온에서 중단 없이(윈심분리기의 중단 없음) 2000 rpm에서 회전시킨다. 밀도 구배물 위 및 혈장 아래의 버피 코트(buffy coat)를 제거하고, 또 다른 50　ml 튜브에 놓는다. 일반적으로, 제거된 부피는 10 내지 15 mml로 다양하다. 이어서, 튜브를 PBS로 채워 50　ml의 최종 부피가 되게 하고, 다시 5분 동안 원심분리 중단과 함께 2000 rpm에서 회전시킨다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 20　ml 10% FCS 및 적합한 항생제를 갖는 RPMI 중에 현탁시킨다. 펠렛은 5 mm 이하의 굵은 RBC 밴드를 가져야 한다. 이어서, 세포를 4x105/ml로 계수하고, 50　μl를 20000개 세포/웰의 밀도로 블랙 벽을 갖는 코닝 384-웰 이미지화 플레이트에 플레이팅한다. 세포를 실온에서 10 내지 15분 동안 방치하여 정착시키고, 이어 37℃ + 5% CO2 인큐베이터에 넣는다. 이어서, 플레이트를 지정된 시간 동안, 이상적으로는 하룻밤 동안보다 길지 않은 시간 동안 인큐베이션한다. 생존력 염료를 첨가하는 경우, 30　μl의 상청액을 손으로 또는 로봇을 이용하여 조심스럽게 제거하고, 인비트로겐 생/사 고정가능 488 염료의 PBS 중의 1:1000 혼합물 30　μl 를 30분 동안 실온에서 첨가한다. 생존력 염료를 자동화된 피펫 또는 로봇으로 초기 상청액으로서 제거한다. 이 단계에서 단층의 혼란이 피해져야 한다. 생존력 염료가 첨가되지 않는 경우 또는 첨가 직 후, 0,1% 트리톤 X-114과 함께 2% 포름알데히드 30　μl를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 상청액을 가볍게 쳐서(flicking) (모두) 제거한다. 이 단계에서 단층은 이미 고정되었으므로, 이는 단층을 혼란시키지 않을 것이다. 염색을 위해, 30　μl의 항체 염색물을 첨가한다. 시험되는 칵테일은 유세포 분석을 위해 사용되는 GFP, PE 또는 APC 표지된 항체의 1:300 희석물이다. 희석은 세척 단계를 피할 수 있게 한다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 항체를 상기와 같이 가볍게 쳐서 제거하고, PBS 중의 DAPI의 1:100 희석물 50　μl를 첨가한다. 플레이트를 4℃에서 이미지화할 때까지 저장한다. 이미지화는 실온에서 4개의 비-중복 채널을 갖는 자동화된 공초점 현미경(PerkenElmer Operetta)을 사용하여 수행하며, 데이타를 분석을 위해 내보낸다.
결과: 우리의 새로운 프로토콜을 이용하여 PBMC를 배양한 후, 부착 및 비-부착 PBMC는 자동화된 공초점 현미경을 사용하면서 시야의 단일 평면에서 이미지화될 수 있는 단층을 형성하였으며, 이는 384-웰 플레이트로 최소화된 자동화된 약물 스크리닝을 가능하게 한다. 현미경검사는 약물검사로 지칭되는 새로이 개발된 방법을 이용하여 20.000개 세포(±5%)가 이미지화될 수 있었음을 확증하였다(도 1).
실시예 2
실험: 본 실시예는 본 발명의 방법이 선행 기술의 방법, 특히 WO 2016/046346 또는 헬무트 등(Helmuth et. al. (2010) BMC Bioinformatics)에서 제공되는 방법보다 더욱 신뢰성 있는 결과를 제공하는지의 여부를 시험하기 위해 수행되었다.
방법: A형, B형 및 C형 세포를 포함하는 세포 혼합물에 대응하여, A형 세포가 B형 세포와 상호작용할 확률을 체계적으로 변화시키고 혼합물 중 A, B 및 C 세포의 수를 유지하고 C 세포가 B 세포와 상호작용할 확률을 고정되게 유지하면서 합성 데이타 세트를 생성하였다. A 세포가 B 세포와 상호작용하는 성향을 WO 2016/046346, 헬무트 등(Helmuth et. al. (2010) BMC Bioinformatics) 및 본 발명에 따라 결정하였다.
결과: A 세포가 최대 하나의 B 또는 C 세포와 상호작용하는 상태에서, WO 2016/046346 및 본 발명 둘 다에 따른 상호작용 성향은 A 세포가 B 세포와 상호작용하는 확률의 로그와 선형 관계를 나타낸다(도 3). 그러나, A형 세포가 하나 초과의 B 또는 C 세포와 상호작용하는 경우(즉, 로세타스가 형성됨), WO 2016/046346에 기술된 방법을 이용하여 결정되는 상호작용 성향은 A 세포가 B 세포와 상호작용하는 확률의 로그와 선형 관계를 나타내지 못하고 증가하는 상호작용 확률에서 평평해지는 반면, 본 발명은 이 선형 관계를 여전히 유지한다(도 4). 헬무트 등에 따른 상호작용 스코어는 A 세포가 B 세포와 상호작용하는 확률의 로그와 선형 관계를 나타내지 못하고, 사실상 A 및 B 세포가 상호작용할 확률과 전혀 상관관계가 없다.
따라서, 본 발명에 따른 세포 상호작용 성향의 측정은 세포가 하나 초과의 다른 세포와 상호 작용할 수 있는 경우 더 높은 동적 범위를 갖는다. 이는 일반적으로 한 유형의 다수의 세포가 종종 또 다른 유형의 하나의 세포와 상호작용하는 1 차 면역 세포의 배양에서 관찰된다. 이 현상은 종종 "로세타스"의 형성으로 기술된다.
실시예 3
실험: A형, B형 및 C형 세포를 포함하는 세포 혼합물에 대응하여, 혼합물 중 A, B 및 C 세포의 분율을 체계적으로 변화시키고 A 및 C 세포가 B 세포와 상호작용하는 확률을 일정하게 유지하면서 합성 데이타 세트를 생성하였다.
방법: A 세포가 B 세포와 상호작용하는 성향을 WO 2016/046346 및 본 발명에 따라 결정하였다. 사용된 자극 세팅 하에서, A 세포와 B 세포 간의 상호작용 성향은 이상적으로는 A 및 C 세포의 분율의 변화에 불변이어야 한다.
결과: 본 발명에 따라 결정되는 상호작용 성향은 A 및 C 세포의 분율의 변화에 불변이었으나, WO 2016/046346에 따른 상호작용 성향은 그렇지 않았다(도 5). 많은 실험적 세팅에서, 예컨대 자극에 의한 노출에 대한 반응에서 A, B 및 C 세포의 분율의 변화는, A, B 및 C 세포의 분율은 일정한 것으로 추정될 수 있고 자극은 대부분 세포 표면 분자의 발현의 변화에 영향을 끼치기 때문에(예컨대, DC에 대한 MHC의 상향조절은 DC 및 T-세포가 상호작용하는 성향을 증가시킴), 교란 인자가 아니다. 그러나, A 및 B 세포의 분율이 변화할 수 있는 상태 하에서, 예컨대 면역학적 이펙터 세포가 암 또는 병원체 감염된 세포를 공격하는 상태에서, A 세포의 분율의 변화에 대해 견고한 상호작용 척도를 갖는 것은 필수적이다.
실시예 4:
종양 세포를 사멸시키는 천연 킬러(NK) 세포의 능력을 조정할 수 있는 소분자 화학적 실체를 확인하기 위해서, 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC) 및 K562 인간 종양 세포를 약 4000개 세포/mm2의 밀도 및 상이한 화학적 화합물의 존재 하에 3:1의 비율로 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 동일한 수의 K562 세포를 동일한 세트의 화학적 화합물의 존재 하에 인큐베이션하였다. 정해진 시간에, 포름알데히드 및 트리톤 X-114를 첨가하여 세포를 고정시키고 투과가능하게 하고, CD56에 대한 항체 및 DAPI로 염색하였다. 세포의 현미경 이미지를 찍고, NK 세포를 CD56에 대한 그들의 양성 염색에 의해 확인하고, K562 세포를 15,000개 예시 세포 이미지에 훈련된 뉴럴 네트워크를 사용하여 DAPI 염색 하에 그들 특유의 핵 크기 및 질감에 의해 확인하였다. K562와 NK 세포 간의 상호작용 성향을 계수하고, 음성 DMSO 대조군 대비 PBMC의 존재 및 부재 하에서 K562의 생존력과 비교하였다. K562와 NK 세포 간의 상호작용 성향은 음성 DMSO 대조군 대비 PBMC의 존재 및 부재 하에 K562의 생존력과 직접적으로 관련이 있다는 것이 밝혀졌으며, 본 발명을 이용하여 측정되는 상호작용 성향은 종양 세포의 NK 세포 매개된 사멸을 조절하는 분자의 확인을 가능하게 한다는 것을 입증한다(도 6).
실시예 5:
본 실시예는 본 발명에 의해 측정되는 상호작용 스코어에 대한 생물학제제의 영향에 관한 것이다.
T-세포 및 APC, 예컨대 CD11c 양성 세포는 항-CD3, 항-CD28 항체 및 IL2로 이루어진 표준 활성화 칵테일로 T 세포를 활성화 시 더 자주 상호작용한다.
상기한 바에 따라 PBMC 단층을 항-CD3 및 항-CD28 항체 + 500 IU/mL IL2의 혼합물로 48시간 동안 처리하였다. 단층을 고정시키고, 상이한 조합의 항-CD3, 4, 8 및 11c 항체로 염색하고, 세포들 간의 상호작용 성향을 본 발명에 따라 측정하였다.
T-세포 활성화는 CD3, 4 또는 8 양성 세포와 CD11c 양성 세포 사이에서 측정된 상호작용 스코어의 증가를 유도하므로 접근법을 검증한다(도 7).
실시예 6:
본 실시예는 본 발명에 따라 측정되는 상호작용 스코어에 대한 생물학적 마크로분자의 영향에 관한 것이다.
CD14 양성 단핵구는 LPS로 처리시 집단화한다.
상기에 따라 제조되는 PBMC 단층을 10 ng/mL LPS로 48시간 동안 처리하였다. 단층을 고정시키고, CD14 항체로 염색하고, 세포들 간의 상호작용 성향을 본 발명을 이용하여 측정하였다.
LPS로의 처리는 CD14 양성 세포들 간의 집단화에 가시적인 증가를 유도하며, 이는 CD14 양성 세포들 간에서 측정된 상호작용 스코어의 증가에 반영되어 접근법을 검증한다(도 8).
실시예 7:
목표: 본 실시예는 2개의 세포 유형들 간에 상호작용을 유도하는 것으로 공지된 생물학적 제제의 측정된 상호작용 성향에 대한 영향을 결정하는 것에 관한 것이다.
방법: 블리나토무맙은 B 및 T 세포를 교차 결합시켜 B 세포를 사멸시키도록 T 세포를 유도하는 BiTE 포맷의 이특이적 항체이다.
PBMC 단층을 WO 2016/046346에 기술되어 있는 바와 같이 제공하고, 블리나투모맙 또는 PBS 대조군(0)으로 48시간 동안 처리하고, 고정시키고, 형광 표지된 CD3 및 CD19 항체로 염색하고, 자동화된 공초점 현미경검사를 이용하여 이미지화하였다. 이어서, 제공된 비-부착 세포 단층에서 B(CD19 양성) 및 T 세포(CD3 양성)의 상호작용 성향을 본 발명을 이용하여 결정하였다.
결과:
블리나토무맙의 첨가로 B 세포와 T 세포 간의 상호작용 성향이 PBS 대조군(0)을 능가하는 증가를 나타내므로 접근법을 검증한다. 도 9.
실시예 8:
본 실시예는 질환의 진단에 관한 것이다.
류마티스 관절염 및 류마티스 관절염의 중증도는 양수 또는 말초혈액 내의 Th17 T-세포(CD3+ 및 CD28+)에 대한 활성화된 B-세포(CD80+ 및 CD19+) 간의 상호작용 성향을 정량화함으로써 진단될 수 있다. 이들 활성화된 세포들의 상호작용이 가까울수록, 양성 류마티스 관절염 진단의 기회가 더 높아진다.
세균 감염 후 이차 멸균 염증의 질환 카테고리 하의 만성 반응성 관절염은 세균 병원체 제거 후 양수 내의 단핵구(CD14+) 및 T-세포(CD3+)의 상호작용을 정량화함으로써 진단될 수 있다.
죽상경화증은 환자 내피 세포(CCR5+)에 대한 혈액 내의 염증 내장 단핵구(CCR2-, CD16+)의 공간적 상호작용을 결정함으로써 진단될 수 있다.
실시예 9:
본 실시예는 소분자 약물의 면역조절 능력의 평가 및 검출에 관한 것이다.
크리조티닙은 비-소세포 폐암에 대해 승인된 것으로 공지된 면역조절 특성을 갖지 않는다.
건강한 공여자의 PBMC를 다양한 농도의 크리조티닙 또는 DMSO 대조군으로 처리하고, WO 2016/046346에 따라 처리 및 비처리된 조합된 샘플로부터 수득되는 비-부착 세포 단층에서의 CD11C 및 CD3 세포의 상호작용 성향을 본 발명을 이용하여 결정하였다.
크리조티닙은 상호작용 스코어에 의해 나타나는 바와 같이 DC와 T-세포의 상호작을 증가시키는 면역조절 성향을 가지며, 이 상호작용은 약물의 임상적 작용 기작에서 공지되지 않은 인자일 수 있다(도 10).
실시예 10:
목표: 본 실시예는 2개의 세포 유형들 간의 상호작용을 유도하는 것으로 공지된 생물학적 제제의 측정된 상호작용 성향에 대한 영향을 결정하는 것에 관한 것이다.
방법: 리툭시맙은 B 및 NK 세포를 연결하여 이들을 접촉시키고 B 세포를 사멸시키도록 NK 세포를 유도하는 항-CD20 항체이다.
PBMC 단층을 WO 2016/046346에 기술되어 있는 바와 같이 제공하고, 리툭시맙 또는 PBS 대조군(0)으로 48시간 동안 처리하고, 고정시키며, 형광 표지된 CD56 및 CD19 항체로 염색하고, 자동화된 공초점 현미경검사로 이미지화하였다. 이어서, 제공되는 비-부착 세포 단층에서 B(CD19 양성) 및 NK 세포(CD56 양성)의 상호작용 성향을 본 발명을 이용하여 결정하였다.
결과: 블리나토무맙의 첨가로 B 세포와 NK 세포 간의 상호작용 성향이 PBS 대조군(0)을 능가하는 증가를 나타내므로 접근법을 검증한다(도 11).
실시예 11:
목적: 본 실시예는 질환을 갖는 것으로 진단된 환자가 처리에 반응할 것인지의 여부 및 생물학적 작용 기작이 평가될 수 있는지의 여부를 결정하는 것에 관한 것이다.
방법: 리툭시맙은 B 및 NK 세포를 연결하여 이들을 접촉시키고 B 세포를 사멸시키도록 NK 세포를 유도하는 항-CD20 항체이다.
B-세포 급성 림프아구성 백혈병(B-ALL)을 갖는 환자의 골수 및 동일한 환자의 PBMC를 조합하고, 리툭시맙 또는 PBS 대조군으로 처리하고, WO 2016/046346에 따라 처리 및 비처리된 조합된 샘플로부터 수득되는 비-부착 세포 단층에서 B 및 NK 세포의 상호작용 성향을 본 발명을 이용하여 결정하였다.
결과: 리툭시맙에 반응하는 환자는 B 세포와 NK 세포 간의 상호작용 성향에서 증가를 나타내는 반면, 임상적으로 반응하지 않는 환자는 상호작용에서 이러한 증가를 나타내지 않는다.
실시예 12:
목적: 본 실시예는 질환을 갖는 것으로 진단된 환자가 처리에 반응할 것인지의 여부 및 생물학적 작용 기작이 평가될 수 있는지의 여부를 결정하는 것에 관한 것이다.
방법: 블리나토무맙은 B 및 T 세포를 교차 결합시켜 B 세포를 사멸시키도록 T 세포를 유도하는 BiTE 포맷의 이특이적 항체이다.
B-세포 급성 림프아구성 백혈병(B-ALL)을 갖는 환자의 골수 및 동일한 환자의 PBMC를 조합하고, 블리나투모맙 또는 PBS 대조군으로 처리하고, WO 2016/046346에 따라 처리 및 비처리된 조합된 샘플로부터 수득되는 비-부착 세포 단층에서 B 및 T 세포의 상호작용 성향을 본 발명을 이용하여 결정하였다.
결과: 블리나투모맙에 반응하는 환자는 B 세포와 T 세포 간의 상호작용 성향에서 증가를 나타내는 반면, 임상적으로 반응하지 않는 환자는 상호작용에서 이러한 증가를 나타내지 않는다.
실시예 13:
목적: 본 실시예는 생물학적 자극으로의 처리에 반응하여 세포-세포 상호작용 성향 변화의 핑거프린트 벡터를 구성하기 위해 동일한 샘플 내의 다수의 상이한 구분가능한 아집단들 간의 세포-세포 상호작용 성향을 측정하는 것에 관한 것이다.
방법: 384-웰 플레이트(Perkin Elmer Cell Carrier)에, 10% FCS(Gibco) 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 15 μL RPMI(Gibco)에 15 ng/mL의 농도로 용해된 사이토킨을 로딩하였다. PBMC를 제조사 프로토콜(Stem Cell)에 따라 림포프렙을 사용하여 레드 크로스(Red Cross)로부터 수득되는 버피 코트로부터 단리하고, 계수하고, 동일한 RPMI 배지에 20,000개 세포/30 μL의 최종 농도로 재현탁하였다. 30 μL의 세포 현탁액을 PBMC의 단층이 형성되도록 WO 2016/046346에 따라 사이토킨 용액으로 미리-로딩된 각각의 웰에 첨가하였다. 이러한 첨가 순서는 먼저 세포를 첨가한 후 사이토킨을 첨가하는 반대 순서보다 보다 균일한 단층을 제공한다. 단층을 37 ℃/5% CO2에서 48시간 동안 배양하고, 0.5% 포름알데히드 및 0.1% 트리톤 X-114의 용액 15 μL를 15분 동안 가하여 고정시키고, 상이한 형광 표지된 항체로 염색하여 상이한 구분가능한 세포 아집단을 확인하였다. 상기한 포름알데히드 용액을 사용하는 것은, 특정 에피토프를 온전하게 유지하고 당해 분야에서 전형적으로 사용되는 농도 만큼 형광단의 밝기를 감소시키지는 않지만 여전히 세포를 고정시키는 목적하는 효과를 갖기 때문에, PBMC 또는 골수 단층을 고정시키는 세팅에 유익하다. 자동화된 퍼킨 엘머 오페라 페닉스(Perkin Elmer Opera Phenix) 형광 현미경으로 이미지화한 후, 상이한 구분가능한 세포 아집단의 상호작용 성향을 본 발명에 따라 결정하였으며 (세포의 핵이 2-배 비닝(binnng)을 갖는 현미경으로부터 수득되는 10x 이미지 상에서 20 px 미만으로 분리되는 경우, 세포는 상호작용하는 것으로 칭함), 상호작용 성향을 log2 상호작용 스코어로 표현하였다.
결과: 모든 측정된 상호작용 스코어를 벡터로 요약하면 PBS 처리된 세포에 대해 정규화된 핑거프린트가 제공된다. 이 핑거프린트는 사이토킨 또는 다른 자극으로의 처리에 기인하여 세포-세포 상호작용 성향의 총괄적인 변화를 묘사하였다. T-세포 활성화 특성을 갖는 사이토킨 또는 자극은 T-세포 활성화 특성이 없는 자극에 비해 서로에 대해 보다 유사한 핑거프린트를 가졌다(도 13).
실시예 14:
B-세포 림프종을 갖는 환자로부터의 흉막 삼출액을 밀도 구배 원심분리로 수집하였다. 이 흉막 삼출액은, 유체 증가와 함께 흉막강으로 이동된, 골수에서 발견되는 세포 유형과 PBMC의 혼합물로 이루어지고, 암 세포 뿐만 아니라 건강한 세포를 함유하였다. 매칭되는 혈액 샘플을 또한 림포프렙 구배 상에서 정제하였다. 흉막 삼출액으로부터 수득되는 세포를 WO 2016/046346에 따라 제조되는 매칭되는 PBMC 샘플 및 단층으로부터의 세포에 대해 적정하였다. 단층을 상이한 농도의 블리나투모맙으로 처리하고, 병리학자에 의해 CD10 양성인 것으로 이전에 결정된 종양 세포 집단의 이펙터 T-세포와의 상호작용을 본 발명에 개시된 방법을 이용하여 결정하였다. 비록 블리나투모맙은 이의 작용 모드로서 종양 B- 및 T- 세포를 교차-결합하여 종양 B-세포의 T-세포 매개된 사멸을 유도하도록 디자인되나, 어떠한 이러한 상호작용 변화도 관찰되지 않았다(도 12). 또한, 종양 B-세포의 분율은 생체외에서 블리나투모맙 처리 시 유의하게 변화하지 않았다. 그래도, 치료 의사는 환자에게 블리나투모맙을 투여하는 것을 결정하였지만, 환자는 단지 일시적 및 약한 반응을 가졌다.
실시예 15:
목적: 질환 진단
방법: 말초혈액을 자가-면역 또는 염증 질환을 앓는 환자 및 건강한 대조군으로부터 단리하고, 말초혈액 단핵세포(PBMC)을 림포프렙(Stem Cell Inc.)으로 단리하였다. PBMC의 단층을 WO　2016/046346에 따라 제조하고, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, TNFa, CXCL12, IL-33 및 다른 교란물을 포함하는 상이한 사이토킨으로 생체외에서 24, 48 및 72h 동안 처리하였다. 단층을 고정시키고, 마커 양성 세포의 모든 가능한 조합(예: CD3과 CD11c, CD3과 CD19, CD3과 CD20, CD3과 CD56 등)이 별개의 채널에서 자동화된 형광 현미경을 사용하여 이미지화될 수 있도록 CD3, 4, 8, 11c, 14, 19, 20 및 56에 대한 형광 표지된 항체로 염색하였다. 상기-열거된 마커의 발현에 의해 특징지어지는 PBMC에 존재하는 모든 주요 세포 유형들(T-세포, 수지상 세포, 단핵구, B-세포 및 NK 세포) 간의 서로의 상호작용 영향을 본 발명에 따라 결정한다. 특히, 2개의 세포는 그들의 핵의 질량 중심이 약 2 평균 세포 직경 미만으로 분리되는 경우 상호작용하는 것으로 간주된다. 모든 시험되는 교란에 반응하여 모든 주요 세포 유형들 간의 모든 상호작용 성향의 수집을 본 발명에 따라 상호작용 스코어로 정량화한다. 이들 상호작용 스코어의 수집을 각각의 공여자를 특징짓는 상호작용 성향 공간에서 핑거-프린트 벡터로 요약한다(실시예 14 참조). 충분한 수의 환자 및 대조군 샘플에 대해 이 분석을 수행함으로써, 건강한 공여자에 특유한 핑거프린트 및 상이한 질환 서브유형에 특유한 핑거프린트가 결정될 수 있다. 각각의 시험되는 개체에 대한 핑거프린트 벡터를 다차원 척도법(MDS) 또는 또 다른 적합한 치수 감소 기술을 이용하여 2D 평면으로 배치함으로써, 건강한 개체 및 질환에 걸린 개체에 대응하는 상이한 클러스터가 확인될 수 있다. 이어서, 당해 분야에 공지된 방법(예컨대, k-최근접 이웃 분류자의 맥락에서 유클리딘(Euclidean) 거리 측정)에 의해 특정 클러스터에 대응하는 공지된 핑거프린트에 대한 새로운 혈액 샘플의 핑거프린트의 유사성을 평가함으로써, 새로운 혈액 샘플은 건강한 대조군보다는 환자로부터 오는 것으로 분류될 수 있다.
질환 진단의 예는 또한 상기한 실시예 9에서 제공된다.
실시예 16:
목적: 새로운 T-세포 활성화제의 발견
방법: 말초혈액을 건강한 공여자로부터 단리하고, 말초혈액 단핵세포를 림포프렙(Stem Cell Inc.)으로 단리한다. PBMX의 단층을 WO　2016/046346에 따라 제조하고, T-세포 활성화를 유도하는 것으로 공지된 상이한 사이토킨 및 시약, 예컨대 IL-2, IL-15, CD3 결합 항체, CD28 결합 항체, 슈퍼 항원 등 뿐만 아니라 저조한 T-세포 활성화 능력을 갖는 자극, LPS, 폴리 I:C 등으로 처리한다. 단층을 고정시키고, 마커 양성 세포의 모든 가능한 조합(예:, CD3과 CD11c, CD3과 CD19, CD3과 CD20, CD3과 CD56 등)이 자동화된 형광 현미경으로 이미지화될 수 있도록 CD3, 4, 8, 11c, 14, 19, 20 및 56에 대한 형광 표지된 항체로 염색한다. 상기-열거된 마커의 발현에 의해 특징지어지는 PBMC에 존재하는 모든 주요 세포 유형들(T-세포, 수지상 세포, 단핵구, B-세포 및 NK 세포) 간의 서로의 상호작용 영향을 본 발명에 따라 결정하여 각각의 처리 조건을 특징짓는 상호작용 성향 공간에 핑거-프린트를 생성한다. 충분한 수의 샘플에 대해 이 분석을 수행함으로써, T-세포 활성화제에 특징적인 핑거프린트가 결정될 수 있다(즉, 벡터는 정의된 세포-세포 상호작용 성향을 나타냄, 또한 실시예 14 참조). 당해 분야에 공지된 방법(예컨대, k-최근접 이웃 분류자의 맥락에서 유클리딘 거리 측정)에 의해 핑거프린트를 T-세포 활성화제의 공지된 핑거프린트와 비교함으로써, 본 발명에 따라 새로운 또는 공지되지 않은 자극의 T-세포 활성화 능력이 평가될 수 있다.

Claims (13)

  1. 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향의 결정 방법으로서, 하기 단계:
    (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계;
    (b) 세포 집단에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 집단 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계; 및
    (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계
    를 포함하는 것인 결정 방법.
  2. 세포 공여자가 질환에 걸리거나 질환에 걸리기 쉬운지의 여부를 결정하는 데 사용하기 위한 세포 공여자로부터 수득되는 세포 집단으로서, 상기 결정은 집단 내의 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 것을 포함하고, 상기 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 하기 단계:
    (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계;
    (b) 세포 집단에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 집단 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계;
    (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및
    (d) 세포가 상호작용하는 성향에 기초하여 세포 공여자가 질환을 가지고 있는지 또는 질환을 가지기 쉬운지의 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 세포 집단.
  3. 세포 공여자의 질환 또는 질환에 대한 소인의 진단 방법으로서, 상기 방법은 공여자로부터 수득되는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 세포 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 하기 단계:
    (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계;
    (b) 세포 집단에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 집단 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계;
    (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및
    (d) 세포가 상호작용하는 성향에 기초하여 세포 공여자가 질환에 걸리거나 질환에 걸리기 쉬운지의 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 진단 방법.
  4. 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 대상체로부터 수득되는 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 것에 의한 상기 대상체가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부의 결정 방법으로서, 상기 세포 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 하기 단계:
    (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계;
    (b) 세포 집단에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 샘플 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수는 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계;
    (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및
    (d) 치료제 첨가 전 및 치료제 첨가 후의 성향을 비교하고 이로써 대상체가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정함으로써 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 결정 방법.
  5. 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 대상체가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정하기 위한 진단 방법에 사용하기 위한 세포 공여자로부터 수득되는 세포 집단으로서, 상기 결정은 단층 내의 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 것을 포함하고, 상기 단층은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 하기 단계:
    (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계;
    (b) 세포 샘플에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 샘플 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계;
    (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및
    (d) 치료제 첨가 전 및 치료제 첨가 후의 성향을 비교하고 이로써 대상체가 치료제로의 치료에 반응할 것인지 또는 반응적인지의 여부를 결정함으로써 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 세포 집단.
  6. 하나 이상의 시험 물질(들)의 첨가에 기인하여 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 것에 의한 치료제의 스크리닝 방법으로서, 상기 세포 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 하기 단계:
    (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계;
    (b) 세포 샘플에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 샘플 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계;
    (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및
    (d) 하나 이상의 시험 물질(들) 첨가 전 및 하나 이상의 시험 물질(들) 첨가 후의 성향을 비교하고 이로써 하나 이상의 시험 물질(들)이 치료제로서 적합한지의 여부를 결정함으로써 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 스크리닝 방법.
  7. 하나 이상의 시험 물질(들)의 첨가에 기인하여 세포 집단에서 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정함으로써 치료제를 스크리닝하는 데 사용하기 위한 세포 집단으로서, 상기 세포 집단은 2개 이상의 구분가능한 세포 아집단을 포함하고, 상기 방법은 하기 단계:
    (a) 제1의 구분가능한 아집단의 세포와 제2의 구분가능한 아집단의 세포 간의 상호작용의 수를 결정하는 단계;
    (b) 세포 샘플에 포함된 세포를 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단으로 무작위로 지정함으로써 세포 샘플 내의 상호작용의 수를 결정하는 단계로서, 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포의 절대수 각각은 (a)에서의 제1 및 제2의 구분가능한 세포 아집단 내의 세포수와 동일한 것인 단계;
    (c) (a)를 (b)로 나눔으로써 세포가 상호작용하는 성향을 결정하는 단계로서, 성향은 생성된 수에 따라 증가하는 것인 단계; 및
    (d) 하나 이상의 시험 물질(들) 첨가 전 및 하나 이상의 시험 물질(들) 첨가 후의 성향을 비교하고 이로써 하나 이상의 시험 물질(들)이 치료제로서 적합한지의 여부를 결정함으로써 세포가 상호작용하는 성향의 변경을 결정하는 단계.
    를 포함하는 세포 집단.
  8. 제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 방법 또는 제2항, 제5항 및 제7항 중 어느 한 항의 세포 집단에 있어서, 제1 및 제2의 구분가능한 아집단이 동일한 것인 방법 또는 세포 집단.
  9. 제1항, 제3항, 제4항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항의 방법 또는 제2항, 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항의 세포 집단에 있어서, 단계 (b)가 반복되고, 상호작용의 결정된 수가 평균화되며, 바람직하게는 단계 (b)가 적어도 1000회 초과로 반복되는 것인 방법 또는 세포 집단.
  10. 제1항, 제3항, 제4항, 제6항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항의 방법 또는 제2항, 제5항, 제7항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항의 세포 집단에 있어서, 세포가 (a) 말초혈액 단핵세포(PBMC) 또는 (b) 골수세포인 방법 또는 세포 집단.
  11. 제1항, 제3항, 제4항, 제6항, 제8항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 방법 또는 제2항, 제5항, 제7항, 제8항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 세포 집단에 있어서, 질환이 골수증식 장애, 염증 장애, 잠복 바이러스 감염, 세포 성장 장애, 세포 주화성 장애, 대사 장애 또는 자가면역 장애인 방법 또는 세포 집단.
  12. 제10항의 방법 또는 제10항의 세포 집단에 있어서, 질환이 백혈병 또는 림프종인 방법 또는 세포 집단.
  13. 제1항, 제3항, 제4항, 제6항, 제8항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 방법 또는 제2항, 제5항, 제7항, 제8항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 세포 집단에 있어서, 세포가 단층 형태로 존재하는 것인 방법 또는 세포 집단.
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