CN103270157A - 产生人il-17的辅助性t细胞检测用标志物及产生人il-17的辅助性t细胞的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明以提供可特异性地检测人的产生IL-17的辅助性T细胞（人Th17细胞）的标志物作为课题。由人Th17细胞检测用标志物，其含具有由选自L1CAM、MCAM及PTPRM的至少1个表示的基因的碱基序列的多核苷酸或其变异型或片段、或者，由其基因编码的蛋白质或其功能上同等的变异型或片段来解决上述的课题。

Description

产生人IL-17的辅助性T细胞检测用标志物及产生人IL-17的辅助性T细胞的检测方法
【技术领域】
本发明涉及用于检测人的产生IL-17的辅助性T细胞（以下，也称为“Th17细胞”）的标志物及检测人Th17细胞的方法。
【背景技术】
慢性类风湿性关节炎（以下，称为“RA”）是以关节炎作为主要的临床症状的全身性的炎症性自身免疫疾病。RA通过如关节的疼痛一样的自觉症状及肿胀的程度、以及基于由骨Ｘ射线的见解等的视觉的方法判断其病势，但尚未确立定量的指标。从而，现状是继续监测治疗效果的定量的方法也尚未确立。
RA的发症原因的细节尚未明，但认为是细菌感染等成为扳机，经免疫细胞群及细胞因子群的复杂的网络而，发生关节组织的炎症。
担负免疫反应之中心的是辅助性T细胞群。未成熟的辅助性T细胞（幼稚T细胞）从抗原呈递细胞呈递抗原，分化为辅助性T细胞。此时，通过存在特定的细胞因子，幼稚T细胞分化诱导为4种的细胞种。4种的细胞种是产生干扰素（IFN）-γ的辅助性T细胞（Th1细胞）、产生白细胞介素（IL）-4的辅助性T细胞（Th2细胞）、产生IL-17的辅助性T细胞（Th17细胞）及有免疫抑制效果的控制性T细胞（Treg细胞）。
在这些的辅助性T细胞之中，已知Th17细胞可与RA的发症相关。例如，在专利文献1中，从在RA患者的关节滑液中，由变形关节炎的患者的关节滑液，由Th17细胞产生的IL-17的量显著地高，及RA患者来源的滑液组织中的T细胞中存在IL-17阳性细胞，示IL-17与RA的病态形成、特别是关节－骨破坏相关。再者，在专利文献1记载，IL-17可作为RA的诊断标志物使用。
另外，在专利文献2记载，在分析来自RA患者的末梢血血清中的细胞因子时，IFN-γ、IL-1β、TNF-α、G-CSF、GM-CSF、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、IL-5及IL-7的水平在RA患者中是显著地高的值，IL-2、CXCL8/IL-8、IL-12及CCL2/MCP-1不是高的值。
关于Th17细胞，由非专利文献1、非专利文献2、及，非专利文献3等的研究，得知以下事实。
●被称为RORγt的核内受体在Th17细胞的分化中发挥重要的作用。
●由IL-6、IL-23及TGF-β，诱导从未成熟的辅助性T细胞（幼稚T细胞）向Th17细胞的分化。
●表达IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-22、IL-26、TNF、IFN-γ、CCL20。
●在Th17细胞的表面存在IL-23受体或IL-12受体β。
非专利文献1～3中使用利用对于IL-17特异性的抗体的酶联免疫吸附法（ELISA法）测定了IL-17的量。但是，为了更深理解在自身免疫疾病中的RA和Th17细胞的关联，不是间接测定IL-17的量，有必要直接检测Th17细胞本身。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:特开2000-186046号公报
专利文献2:特开2007-506100号公报
【非专利文献】
非专利文献1:Ivanov等，"The Orphan Nuclear Receptor RORγtDirects theDifferentiation Program of Proinflammatory IL-17+THelper Cells"，Cell,2006，126，p.1121-1133
非专利文献2:Stumhofer等，"Interleukin27negatively regulatesthe developmentof interleukin17-producing T helper cells duringchronic inflammation of thecentral nervous system"NatureImmunology，2006，vol.7，p.937-945
非专利文献3:Wilson等，"Development，cytokine profile及function of humaninterleukin17-producing helper T cells"NatureImmunology，2007，vol.8,p.950-957
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
本发明旨在发现可特异性地检测人Th17细胞的分子标志物。
【解决课题的技术方案】
本发明人关注被认为是含RA的自身免疫疾病的原因的产生IL-17的辅助T（Th17）细胞，至今鉴定了在从健康的成人的末梢血分离的Th17细胞中特异性地表达的基因（国际申请PCT/JP2010/062807）。本次、本发明人从它们的基因之中，发现了可高精度区别Th17细胞和该细胞以外的辅助性T细胞的标志物的组合，从而完成本发明。
从而，本发明是含具有由选自L1CAM（L1细胞粘接分子）、MCAM（黑色素瘤细胞粘接分子）及PTPRM（蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，M）的至少1个表示的基因的碱基序列的多核苷酸或其变异型或片段的，人Th17细胞检测用标志物。
优选为，上述标志物再含具有由选自CCR6（趋化因子（C-C基序）受体6）及CXCR3（趋化因子（C-X-C基序）受体3）的至少1个表示的基因的碱基序列的多核苷酸或其变异型或片段。
本发明是另外含由选自L1CAM、MCAM及PTPRM的至少1个表示的基因编码的蛋白质或其功能上同等的变异型或片段的，人Th17细胞检测用标志物。
优选为，上述标志物再含由选自CCR6及CXCR3的至少1个表示的基因编码的蛋白质或其功能上同等的变异型或片段。
再者，本发明提供人Th17细胞的检测方法，其包括在含细胞的样品中，取得上述的人Th17细胞检测用标志物的表达水平的步骤，和基于取得的上述标志物的表达水平，检测上述样品中的人Th17细胞的步骤。
【发明效果】
由本发明的人Th17细胞检测用标志物及人Th17细胞的检测方法，可特异性地检测人Th17细胞。
【附图说明】
【图1】是示在Th1、Th2、Treg及Th17的各细胞中，本发明的Th17细胞检测用标志物（L1CAM、MCAM及PTPRM）及作为已知标志物的CCR6的表达量的直方图。
【图2】是标绘相对“本发明的Th17细胞检测用标志物的表达细胞数的比率（%）”的“由IL-17A检测的Th17细胞的比率（%）”的坐标图。
【图3】是示从含Th1、Th2、Treg及Th17细胞的细胞集团，将Th17细胞由本发明的Th17细胞检测用标志物分离时的Th17细胞的浓缩率的坐标图。
【实施方式】
【1.人Th17细胞检测用标志物】
本发明的人Th17细胞检测用标志物（以下，也简称为“标志物”）包括由具有由选自L1CAM、MCAM及PTPRM的至少1个表示的基因的碱基序列的多核苷酸或其基因编码的蛋白质。
本发明人发现，本发明的标志物相比人末梢血来源的其他辅助性T细胞（Th1、Th2及Treg细胞），在Th17细胞中特异性地表达。
再有，在本说明书中，某多核苷酸在Th17细胞中“特异性地表达的”的表述是指，相比在Th17细胞以外的细胞的其多核苷酸的表达，在Th17细胞中该多核苷酸的表达显著地高。
具体而言，在Th17细胞中的该多核苷酸的表达是在Th17细胞以外的细胞的该多核苷酸的表达的约2倍以上、优选为约3倍以上。更优选为，在Th17细胞中的其多核苷酸的表达是在Th17细胞以外的辅助性T细胞（Th1细胞、Th2细胞及Treg细胞）的该多核苷酸的表达的约2倍以上、再者优选是约3倍以上。
从而，用本发明的标志物，可将Th17细胞与Th1、Th2及Treg细胞区别而特异性地检测，及可检查认为Th17细胞与之相关的疾病的活动性指标。
上述的人Th17细胞检测用标志物的碱基序列及氨基酸序列可由UniGene等的美国生物工程学信息中心（National Center forBiotechnology Information：NCBI）提供的数据库知道。各标志物的登录编号示于以下的表1。再有，这些的登录编号是在2011年1月19日时间点的最新的编号。
【表1】
Figure BDA00003407402200051
在本发明的实施方式中，可为人Th17细胞检测用标志物是多核苷酸标志物，也可为多肽标志物。
从而，人Th17细胞检测用标志物是具有由选自L1CAM、MCAM及PTPRM的至少1个表示的基因的碱基序列的多核苷酸或其变异型或片段。或者，人Th17细胞检测用标志物是由选自L1CAM、MCAM及PTPRM的至少1个表示的基因编码的蛋白质或其功能上同等的变异型或片段。
再有，在本说明书中，多核苷酸是DNA或RNA之任何均可，上述的基因本身（DNA）、mRNA、cDNA或cRNA之任何也可。
在本发明的实施方式中，人Th17细胞检测用标志物优选包括选自L1CAM、MCAM及PTPRM的至少2个。此时，人Th17细胞检测用标志物是具有选自L1CAM、MCAM及PTPRM的至少2个所表示的基因的碱基序列的多核苷酸或其变异型或片段也可，或者是由选自L1CAM、MCAM及PTPRM的至少2个所表示的基因编码的蛋白质或其功能上同等的变异型或片段也可。
在本发明的别的实施方式中，人Th17细胞检测用标志物再含在本领域技术中为了检测人Th17细胞而使用的已知标志物也可。在本领域技术中已知，在人Th17细胞中高表达CCR6（“CCR6阳性”或“CCR6+”）并且CXCR3不怎么表达（“CXCR3阴性”或“CXCR3-”）。
在本实施方式中，人Th17细胞检测用标志物优选包括选自L1CAM、MCAM及PTPRM的至少1个，和选自CCR6及CXCR3的至少1个。
在上述的实施方式中，人Th17细胞检测用标志物是有由选自L1CAM、MCAM及PTPRM的至少1个，和选自CCR6及CXCR3的至少1个表示的基因的碱基序列的多核苷酸或其变异型或片段也可。或者，人Th17细胞检测用标志物是由选自L1CAM、MCAM及PTPRM的至少1个，和选自CCR6及CXCR3的至少1个表示的基因编码的蛋白质或其功能上同等的变异型或片段也可。
在本说明书中，多核苷酸的变异型是指导入不改变由上述的基因编码的蛋白质的功能的变异的多核苷酸。这样的变异包括在上述的基因的碱基序列中的1或多个核苷酸的缺失或取代、或者1或多个核苷酸的附加。变异型的碱基序列与原本的基因的碱基序列有至少80%以上、优选为至少85%以上、更优选为至少90%以上、特别优选为至少95%以上的序列相同性。
在本说明书中，蛋白质的功能上同等的变异型是指导入不改变上述的蛋白质的功能的变异的蛋白质。这样的变异包括在上述的蛋白质的氨基酸序列中的1或多个氨基酸的缺失或取代、或者1或多个氨基酸的附加。蛋白质的功能上同等的变异型的氨基酸序列与原本的蛋白质的氨基酸序列有至少80%以上、优选为至少85%以上、更优选为至少90%以上、特别优选为至少95%以上的序列相同性。
再有，在本说明书中，碱基序列及氨基酸序列的序列相同性是以标准设定使用BLASTN、BLASTP、BLASTX或TBLASTN（例如，从http://www.ncbi.nlm.nih.gov利用可能）而算出。
在本说明书中，多核苷酸的片段是指连续具有上述的人Th17细胞检测用标志物的碱基序列之一部分，可与用于取得后述的人Th17细胞检测用标志物的表达水平的探针特异性地杂交的长度的多核苷酸。
在本说明书中，蛋白质的片段是指连续具有上述的人Th17细胞检测用标志物的氨基酸序列之一部分，由用于取得后述的人Th17细胞检测用标志物的表达水平的抗体或核酸适体特异性地识别的长度的多肽。
【2.人Th17细胞的检测方法】
在本发明的范围内也包括，使用上述的人Th17细胞检测用标志物检测含细胞的样品中的人Th17细胞的方法。
本发明的人Th17细胞的检测方法（以下，也简称为“检测方法”）特征在于包括，在含细胞的样品中，取得本发明的标志物的表达水平的步骤，和基于取得的该标志物的表达水平，检测上述的样品中的人Th17细胞的步骤。
在本发明的实施方式中，作为含细胞的样品，可举出从人采集的活体样品或含人工地培养的细胞株的样品。作为活体样品，可举出血液、组织、关节液、脑脊髓液、胸水、腹水等。
在本说明书中，“标志物的表达水平”只要是由在本领域技术中公知的方法，示从含细胞的样品取得的各标志物的表达量的数据，就不特别限制。
在本发明的人Th17细胞检测用标志物是多肽标志物时，标志物的表达水平可举出可使用用于取得后述的标志物的表达水平的抗体或核酸适体，由例如免疫沉降法、蛋白印迹法、ELISA法等的本领域技术中公知的方法取得的蛋白质的定量值。
在本发明的人Th17细胞检测用标志物是多核苷酸标志物时，标志物的表达水平可举出可由例如，PCR法、RT-PCR法、实时PCR法、LAMP（环介导的恒温扩增）法等的核酸扩增法、Southern杂交、Northern杂交等的杂交法、微阵列法等的本领域技术中公知的方法取得的核酸（DNA、mRNA、cDNA或cRNA）的定量值。另外，使用针对多核苷酸的抗体或核酸适体，与上述的取得多肽标志物的表达水平的方法同样地，取得多核苷酸标志物的表达水平也可。
在本发明的实施方式中，可与作为多核苷酸标志物的人Th17细胞检测用标志物特异性地杂交的分子可作为用于取得该标志物的表达水平的探针使用（以下，该探针也称为“表达水平取得用探针”）。表达水平取得用探针是可与作为多核苷酸标志物的人Th17细胞检测用标志物特异性地杂交的核酸探针及肽探针之任何也可。作为那样的探针，核酸探针是优选的，特别是DNA探针是优选的。
在本说明书中，“可特异性地杂交”是指上述的探针在严格的条件下可与作为多核苷酸标志物的人Th17细胞检测用标志物杂交。
在本说明书中，严格的条件是指上述的探针可与目标多核苷酸，以相比该目标多核苷酸以外的多核苷酸更检测可能地大的程度（例如，超背景的至少2倍）杂交的条件。
再有，严格的条件通常是序列依赖性的，然后在各种的环境中不同。一般而言，严格的条件选择为相比在规定的离子强度及pH的特定的序列的热熔点（thermal melting point：Tm）更低约5℃。此Tm是（在规定的离子强度、pH及核酸组成之下）与上述的目标核酸分子的碱基序列互补的探针的50%平衡而杂交的温度。
这样的条件是，在本领域技术中公知的多核苷酸间的杂交法、例如PCR法、微阵列法、DNA印迹法等中，多核苷酸间的杂交中使用的条件即可。具体而言，在pH7.0～9.0下盐浓度相比约1.5M Na离子更低的，更具体而言，是约0.01～1.0M Na离子浓度（或者其他盐），可举出至少约30℃的条件。例如，微阵列法中的严格的条件包括，于37℃在50%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS中的杂交、及在60～65℃的0.1×SSC中的清洗。另外，PCR法中的严格的条件可举出pH7.0～9.0、0.01～0.1M的Tris HCl、0.05～0.15M K离子浓度（或者其他盐）、至少约55℃的条件。
上述的表达水平取得用探针的碱基序列可由本领域技术人员基于本领域技术常识以及人Th17细胞检测用标志物的碱基序列，适宜确定可与该标志物特异性地杂交的。那样的序列，例如，一般而言可使用利用可能的引物设计软件（例如Primer3（从http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi利用可能）或DNASIS Pro（日立软件工程株式会社））来确定。
表达量取得用探针可由本领域技术中公知的多核苷酸的合成方法制备。表达水平取得用探针的长度是通常5～50核苷酸、优选为10～40核苷酸。
上述的表达水平取得用探针，可使用仅1种，或者可将多种组合使用。例如，通过使用本领域技术中公知的方法将该探针1种以上固定化到基板上，可制备用于取得人Th17细胞检测用标志物的表达水平的微阵列。
上述的表达水平取得用探针，例如，可作为用于由核酸扩增法扩增人Th17细胞检测用标志物的2种以上的引物的组。
在本发明的实施方式中，可将可与作为多肽标志物的人Th17细胞检测用标志物特异性地结合的分子为了取得该标志物的表达水平而使用。这样的分子是与人Th17细胞检测用标志物特异性地反应的抗体及适体等之任何也可，但优选为抗体（以下，该抗体也称为“表达水平取得用抗体”）。
上述的表达水平取得用抗体，例如，可由如以下一样的本领域技术中公知的顺序制备。基于作为人Th17细胞检测用标志物的基因的碱基序列或蛋白质的氨基酸序列，将编码具有各标志物的氨基酸序列的蛋白质的DNA分子重组到适宜的表达载体中。将得到的表达载体导入适宜的宿主细胞，培养得到的转化细胞，得到目的蛋白质。将得到的蛋白质纯化而作为免疫原，使用该免疫原和根据需要佐剂，免疫适宜的哺乳动物、例如大鼠、小鼠等。从免疫的动物的脾脏细胞等，筛选产生针对目的免疫原的抗体的产生抗体的细胞而选择。将得到的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合而得到杂交瘤，通过对其筛选，可得到产生与由上述的基因编码的蛋白质有特异性结合性的抗体的产生抗体的杂交瘤。通过培养得到的产生抗体的杂交瘤，可得表达水平取得用抗体。
可为了取得人Th17细胞检测用标志物的表达水平而使用的适体（以下，该适体也称为“表达水平取得用适体”）可由例如，如以下一样的本领域技术中公知的顺序制备。由公知的方法制备具有随机的核酸的碱基序列的核酸库，通过对其实施试管内进化法（SELEX法）等而可选择可与目标的蛋白质（作为蛋白质或多肽的人Th17细胞检测用标志物）特异性地结合的适体。
上述的表达水平取得用探针、抗体及适体由本领域技术中通常使用的标记物质标记也可。通过使用标记的探针、抗体或适体，可简便地取得人Th17细胞检测用标志物的表达量。那样的标记物质可为32P、35S、3H及125I等的放射性同位素、荧光素、Alexa Fluor（注册商标）等的荧光物质、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等的酶、生物素、亲和素、链霉亲和素等的本领域技术中通常使用的标记物质。
使用流式细胞仪，取得本发明的标志物的表达水平时，标记物质是荧光物质是优选的。
在本发明的实施方式中，上述的标志物的表达水平是有关高表达或几乎不表达本发明的人Th17细胞检测用多肽标志物的细胞的信息也可。作为那样的信息，例如，可举出从与在样品中的细胞的表面存在的本发明的标志物结合的标记化抗体的标记物质发出的信号。
在本发明的优选的实施方式中，取得上述的标志物的表达水平的步骤是，使与由标记物质标记的，人Th17细胞检测用多肽标志物特异性地反应的标记化抗体与上述的含细胞的样品接触而制备测定用样品，在得到的测定用样品中，经上述的多肽标志物检测与人Th17细胞结合的标记化抗体的标记的步骤。
上述的标记化抗体可通过使上述的表达水平取得用抗体与标记物质直接结合或将该抗体作为第一抗体，使与特异性地识别此第一抗体的标记化第二抗体结合来得到。
在本发明的检测方法中，取得互相不同的多种人Th17细胞检测用多肽标志物的表达水平是优选的。
从而，在本发明的实施方式中，取得上述的标志物的表达水平的步骤优选是取得互相不同的多个Th17细胞检测用标志物的表达水平的步骤。上述的标记化抗体是与多个Th17细胞检测用标志物各自特异性地反应的、互相不同的抗体，并且用可互相识别的标记物质标记是优选的。
再有，可互相识别的标记物质的组合在本领域技术中公知，可举出例如红色的荧光物质和绿色的荧光物质的组合等。
在本发明的实施方式中，标记化抗体优选是由荧光标记物质标记的抗体。
上述的各实施方式中的测定用样品可通过使标记化抗体与含细胞的样品接触适宜的时间来制备。在测定用样品中，在存在时，人Th17细胞经其表面的本发明的标志物与标记化抗体结合。然后，通过检测与此测定用样品中的人Th17细胞结合的标记化抗体的标记，可得到有关高表达或几乎不表达本发明的人Th17细胞检测用多肽标志物的细胞的信息。
上述的标记化抗体是荧光标记化抗体时，从测定用样品的标记的检测优选通过使用流式细胞仪，检测由该荧光标记化抗体发出的荧光来进行。使用流式细胞仪时，也可分离与荧光标记化抗体结合的人Th17细胞。再有，使用流式细胞仪从测定用样品检测荧光是本领域技术中公知，检测的条件等由本领域技术人员适宜决定。
【实施例】
通过实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
【实施例1：人末梢血来源培养Th17细胞中的高表达基因的解析】
【1.从人末梢血的Th1、Th2、Treg及Th17细胞的单离】
【（1）从人末梢血的Th1、Th2及Th17细胞的单离】
将从健康的成人的末梢血得到的血沉棕黄层覆盖到Ficoll-paqueplus溶液（GE HEALTHCAREBioscience株式会社）上，通过将其离心分离，得到单核细胞级分。接下来，使用结合抗CD4抗体的磁珠（Miltenyi Biotec公司），从上述的级分粗纯化CD4阳性细胞。
将如此得到的CD4阳性细胞使用示于表2的荧光标记抗体染色之后，使用细胞分选仪（FACS Aria：Becton Dickinson公司），分离Th1、Th2及Th17的各细胞。另外，分离的选通如表3所示进行。
【表2】
抗原 荧光标记物质 克隆 厂商
CD4 APC-Cy7 RPA-T4 BD Biosciences公司
CD25 PE-Cy7 BC96 eBioscience公司
CXCR3 Alexa Fluor（商标）488 1C6/CXCR3 BD Biosciences公司
CCR4 APC FAB1567A R&D systems公司
CCR6 PE 11A9 BD Biosciences公司
【表3】
细胞 选通
Th1 CD4高CD25低阴性CXCR3+CCR6-CCR4-
Th2 CD4高CD25低阴性CXCR3-CCR6-CCR4+
Th17 CD4高CD25低阴性CXCR3-CCR6+CCR4+
再有，上述的选通的操作的细节参照由Acosta-Rodriguez EV等的文献（Surface phenotype and antigenic specificity of humaninterleukin17-producing T helper memory cells.，Nat Immunol.，2007，vol.8，p.639-646）。
【（2）从人末梢血的Treg细胞的单离】
将如同上述的步骤（1）得到的CD4阳性细胞使用表4所示的荧光标记抗体染色之后，使用上述的细胞分选仪，将CD4高CD25高CD127内部阴性细胞作为Treg细胞纯化。
【表4】
抗原 荧光标记物质 克隆 厂商
CD4 FITC OKT4 eBioscience公司
CD25 PE-Cy7 BC96 eBioscience公司
CD25RO PE UCHL1 BioLegend公司
CD127 Alexa Fluor（商标）647 HL-7R-M21 BD Biosciences公司
再有，上述的选通的操作的细节参照由Weihong Liu等的文献（CD127expression inversely correlates with FoxP3and suppressivefunction of human CD4+T reg cells.，J Exp Med.2006，vol.203，p.1701-1711）。
【2.细胞的培养】
【（1）Th1、Th2及Th17细胞的培养】
将在上述的步骤1.（1）得到的成人末梢血来源的Th1、Th2及Th17细胞向各自96孔板以1.5x105细胞/0.3ml/孔的密度接种。培养基使用Yssel培养基（IMDM，1%人AB型血清，0.25%BSA，1.8mg/l2-氨基甲醇，40mg/l转铁蛋白，5mg/l胰岛素，2mg/l亚油酸，2mg/l油酸，2mg/l棕榈酸，1%青霉素/链霉素）。
另外，为了上述的细胞的活化及增殖，向各孔各添加0.75x105个用抗CD2/3/28抗体包被的磁珠（Miltenyi Biotec公司）（以下，也称为“抗体珠”）。然后，添加适宜于Th1、Th2及Th17细胞的各自的分化培养的细胞因子及中和抗体，将细胞在37℃、5%CO2气氛的温育器内培养。表5示使用的细胞因子及中和抗体。
【表5】
Figure BDA00003407402200131
上述的细胞因子的浓度是，IL-6作为50ng/ml，IL-6以外作为10ng/ml。另外，上述的抗体的浓度是，抗IFN-γ抗体作为10μg/ml，抗IL-4抗体作为2.5μg/ml。
再有，细胞因子及中和抗体各自获自R&D systems公司及eBioscience公司。
从培养开始3天后，将含上述的细胞因子及抗体的培养基将细胞稀释3倍，再培养7天（合计10天）。
【（2）Treg细胞的培养】
将在上述的步骤1.（2）得到的Treg细胞与上述的步骤2.（1）同样地用Yssel培养基培养，然后使用抗体珠活化。再者，在培养基中，作为细胞因子，添加IL-2及TGF-β1（作为R&D systems公司）、以及中和抗体，抗IFN-γ抗体、抗IL-4抗体（eBioscience公司）及抗IL-6抗体（BD bioscience公司）。
再有，这些的细胞因子及中和抗体各自以10ng/ml及5μg/ml的浓度使用。
从培养开始3天后，添加与培养开始时同量的细胞因子及中和抗体。从培养开始3天后，用上述的含细胞因子及抗体的培养基将细胞稀释3倍，再培养7天（合计10天）。
【3.总RNA的提取】
为了从上述的步骤2.得到的各细胞提取总RNA，使用各自RNeasyPlus Mini试剂盒及RNeasy micro试剂盒（QIAGEN公司）。再有，具体性的操作根据各试剂盒的附带文书的记载进行。
【4.表达微阵列的解析】
【Two-Cycle】
使用靶标记及控制试剂（Affymetrix公司），将在上述的步骤3.提取的各细胞的总RNA（10-100ng）逆转录为cDNA，再进行向生物素化cRNA的转录反应。接下来，将扩增的生物素化cRNA（20μg）片段化。再有，具体性的操作根据试剂盒附带的说明书的记载进行。
将在上述得到的各细胞来源的生物素化cRNA（15μg）作为待测样品，各自添加到GeneChip Hunman Genome U-133Plus2.0Array（Affymetrix公司），移到GeneChip Hybridization Oven640（Affymetrix公司），在45℃、60rpm的条件下进行16小时杂交。
杂交结束后，对于上述的微阵列，使用GeneChip Fluidic Station450（Affymetrix公司）进行清洗及荧光标记，将该微阵列使用GeneChip Scanner30007G（Affymetrix公司）扫描，取得荧光强度数据。
【5.在人Th17细胞中特异性地表达的基因的鉴定】
基于在上述的步骤4.得到的荧光强度的数据，使用表达解析软件GeneSpring Ver.10（Agilent Technologies公司），由MAS5算法将该数据标准化。然后，将Th17细胞的各基因的相对荧光强度与Th1、Th2及Treg细胞的进行比较。
再有，将上述的基因的选择步骤中使用的各待测样品的数示于表6。
【表6】
Th1 Th2 Th17 Treg
无活化刺激 5 5 5 4
有活化刺激 5 5 5 3
将Th17细胞中的相对荧光强度相比Th1、Th2及Treg细胞之任何更高3倍以上，并且显著地表达的基因（由相对荧光强度的Th1、Th2、Treg及Th17细胞的4组间的ANOVA统计解析，示“p值<0.05”的基因）鉴定为在Th17细胞中特异性地表达的基因。
结果，鉴定了包括L1CAM、MCAM及PTPRM的142基因。再有，对于L1CAM、MCAM及PTPRM，将对Th1、Th2及Treg细胞的各自的在Th17细胞中的表达比示于表7。
【表7】
Figure BDA00003407402200151
【实施例2：人末梢血来源培养Th1、Th2、Treg及Th17细胞中的Th17细胞检测用标志物的表达蛋白质的解析】
【1.测定用样品的制备】
【（1）MCAM测定用样品的制备】
向在实施例1的“2.细胞的培养”中制备的Th17细胞（5×106细胞/ml），添加藻红蛋白（PE）标记抗MCAM抗体（Biolegend公司)至终浓度成为1.25μg/ml，于4℃反应20分钟。
反应后，添加含有0.5%BSA的磷酸缓冲生理盐水（PBS），由离心分离回收Th17细胞，进行清洗。将清洗后的Th17细胞悬浮于含有0.5μg/ml7-氨基-放线菌素D（7-AAD）及0.5%BSA的PBS，制备Th17细胞的MCAM测定用样品（5×106细胞/ml）。
代替Th17细胞，使用Th1细胞、Th2细胞、及Treg细胞，进行同样的操作而制备各自Th1细胞的MCAM测定用样品（5×106细胞/ml）、Th2细胞的MCAM测定用样品（5×106细胞/ml）及Treg细胞的MCAM测定用样品（5×106细胞/ml）。
代替PE标记MCAM抗体而添加PE标记小鼠IgG2a同种型对照（Biolegend公司)至终浓度成1.0μg/ml，于4℃反应20分钟而制备阴性对照用样品（5×106细胞/ml）。
【（2）PTPRM测定用样品的制备】
向在上述的“2.细胞的培养”中制备的Th17细胞（5×106细胞/ml）添加抗PTPRM抗体（Abcam公司）至终浓度成2.0μg/ml，于4℃反应20分钟。
反应后，添加含有0.5%BSA的PBS，由离心分离回收Th17细胞。使回收的Th17细胞悬浮于含有0.5%BSA的PBS。向此悬浮液添加PE标记抗小鼠IgG抗体（Biolegend公司）至终浓度成1.0μg/ml，于4℃反应20分钟。
使与PE标记抗小鼠IgG抗体反应之后，添加含有0.5%BSA的PBS，通过由离心分离回收Th17细胞来进行清洗。使清洗后的Th17细胞悬浮于含有0.5μg/ml7-氨基-放线菌素D（7-AAD）及0.5%BSA的PBS，制备Th17细胞的PTPRM测定用样品（5×106细胞/ml）。
代替Th17细胞而使用Th1细胞、Th2细胞、及Treg细胞，进行同样的操作而，制备各自Th1细胞的PTPRM测定用样品（5×106细胞/ml）、Th2细胞的PTPRM测定用样品（5×106细胞/ml）及Treg细胞的PTPRM测定用样品（5×106细胞/ml）。
代替抗PTPRM抗体而添加小鼠IgG2a同种型对照（Biolegend公司)至终浓度成1.0μg/ml，于4℃反应20分钟而制备阴性对照用样品（5×106细胞/ml）。
【（3）L1CAM测定用样品的制备】
向在上述的“2.细胞的培养”中制备的Th17细胞（5×106细胞/ml）添加抗L1CAM抗体（BDBioscience公司）至终浓度成1.25μg/ml，于4℃反应20分钟。
反应后，添加含有0.5%BSA的PBS，由离心分离回收Th17细胞。使回收的Th17细胞悬浮于含有0.5%BSA的PBS。向此悬浮液添加APC标记抗小鼠IgG抗体（BDBioscience公司）至终浓度成1.0μg/ml，于4℃反应20分钟。
使与APC标记抗小鼠IgG抗体反应之后，添加含有0.5%BSA的PBS，通过由离心分离回收Th17细胞来进行清洗。使清洗后的Th17细胞悬浮于含有0.5μg/ml7-氨基-放线菌素D（7-AAD）及0.5%BSA的PBS，制备Th17细胞的L1CAM测定用样品（5×106细胞/ml）。
代替Th17细胞而使用Th1细胞及Th2细胞，进行同样的操作而制备各自Th1细胞的L1CAM测定用样品（5×106细胞/ml）及Th2细胞的L1CAM测定用样品（5×106细胞/ml）。
代替抗L1CAM抗体而添加小鼠IgG2a同种型对照（Biolegend公司)至终浓度成1.0μg/ml，于4℃反应20分钟而制备阴性对照用样品（5×106细胞/ml）。
【（4）CCR6测定用样品的制备】
代替在上述的“（1）MCAM测定用样品的制备”中的，PE标记抗MCAM抗体，使用终浓度1.0μg/ml的PE标记抗CCR6抗体（BDBioscience公司)，进行同样的操作而，制备Th17细胞的CCR6测定用样品（5×106细胞/ml）、Th1细胞的CCR6测定用样品（5×106细胞/ml）、Th2细胞的CCR6测定用样品（5×106细胞/ml）及Treg细胞的CCR6测定用样品（5×106细胞/ml）。
代替上述的PE标记抗CCR6抗体而添加PE标记小鼠IgG1同种型对照（Biolegend公司)至终浓度成1.0μg/ml，于4℃反应20分钟而制备阴性对照用样品（5×106细胞/ml）。
【2.使用流式细胞仪的各测定用样品中的多肽标志物的表达解析】
将如上述一样制备的MCAM测定用样品、PTPRM测定用样品、L1CAM测定用样品及CCR6测定用样品，使用FACSCanto II（BDBioscience公司）及FACS DIVA软件（BDBioscience公司）解析。由解析得到的荧光强度的直方图（粒度分布）示于图1。再有，在图1中，直方图的纵轴示细胞数，横轴示荧光强度。另外，直方图之右上的数值示各测定用样品中的，相对于全细胞数的标志物阳性细胞数的比率（%）。其中，阳性细胞和阴性细胞的判断以阴性对照中的最大的荧光强度为基准进行。即，将示相比在阴性对照中的最大的荧光强度更高的荧光强度的细胞判断为阳性细胞。相反，将示阴性对照中的最大的荧光强度以下的荧光强度的细胞判断为阴性细胞。阳性细胞比率作为相对于全细胞数的阳性细胞数的比而算出。
由图1知，MCAM、PTPRM及L1CAM相比Th1细胞、Th2细胞及Treg细胞在Th17细胞中更特异性地高表达。另外知，MCAM测定用样品、PTPRM测定用样品及L1CAM测定用样品的Th17细胞的阳性细胞比率相比作为已知标志物的CCR6的测定用样品的情况更高。由以上知，由MCAM、PTPRM及L1CAM所表示的各基因编码的蛋白质可作为Th17细胞检测用多肽标志物利用。
【实施例3：与人末梢血来源培养Th1、Th2、Treg及Th17细胞中的Th17检测用标志物的蛋白质表达的相关解析】
【1.为了由多肽标志物组的测定的样品制备】
【（1）Th细胞混合样品的制备】
将上述的“2.细胞的培养”中制备的Th1细胞、Th2细胞、Treg细胞及Th17细胞各自，以以下的表8所示的比率混合而制备Th细胞混合样品（10种）。将此Th细胞混合样品的制备独立地进行4次，制备计40样品（其中，由于对于2样品无法取得数据，最终使用38样品分的数据进行后述的解析）。
【表8】
Figure BDA00003407402200191
【（2）PTPRM/MCAM多肽标志物测定用样品的制备】
向上述的“1-（1）测定用样品的制备”中制备的Th细胞混合样品（5×106细胞/ml）添加终浓度2.0μg/ml的抗PTPRM抗体（Abcam公司），于4℃反应20分钟。
反应后，添加含有0.5%BSA的PBS，由离心分离回收Th细胞。将回收的Th细胞悬浮于含有0.5%BSA的PBS。向此悬浮液添加APC标记抗小鼠IgG抗体（Biolegend公司）至终浓度成1.0μg/ml，于4℃反应20分钟。
使与APC标记抗小鼠IgG抗体反应之后，添加含有0.5%BSA的PBS，通过由离心分离回收Th细胞来进行清洗。
向清洗后的Th细胞添加PE标记抗MCAM抗体（Biolegend公司)至终浓度成1.25μg/ml，于4℃反应20分钟。
反应后，添加含有0.5%BSA的PBS，通过由离心分离回收Th细胞来进行清洗。
使清洗后的Th细胞悬浮于含有0.5μg/ml的7-氨基-放线菌素D（7-AAD）及0.5%BSA的PBS，制备PTPRM/MCAM多肽标志物测定用样品（5×106细胞/ml）。
【（3）PTPRM/L1CAM多肽标志物测定用样品的制备】
代替上述的“（2）PTPRM/MCAM测定用样品的制备”中的抗MCAM抗体而添加PE标记抗L1CAM抗体（eBioscience公司）至终浓度成1.25μg/ml，于4℃反应20分钟。
反应后，添加含有0.5%BSA的PBS，通过由离心分离回收Th细胞来进行清洗。使清洗后的Th细胞悬浮于含有0.5μg/ml的7-氨基-放线菌素D（7-AAD）及0.5%BSA的PBS，制备PTPRM/L1CAM多肽标志物测定用样品（5×106细胞/ml）。
【（4）PTPRM/CCR6多肽标志物测定用样品的制备】
代替上述的“（2）PTPRM/MCAM测定用样品的制备”中的抗MCAM抗体而添加PE标记抗CCR6抗体（BDBioscience公司）至终浓度成1.0μg/ml，于4℃反应20分钟。
反应后，添加含有0.5%BSA的PBS，通过由离心分离回收Th细胞来进行清洗。使清洗后的Th细胞悬浮于含有0.5μg/ml7-氨基-放线菌素D（7-AAD）及0.5%BSA的PBS，制备PTPRM/CCR6多肽标志物测定用样品（5×106细胞/ml）。
【（5）PTPRM/CXCR3多肽标志物测定用样品的制备】
代替上述的“（2）PTPRM/MCAM测定用样品的制备”中的抗MCAM抗体，添加Alexa488标记抗CXCR3抗体（BDBioscience公司）至终浓度成1.0μg/ml，于4℃反应20分钟。
反应后，添加含有0.5%BSA的PBS，通过由离心分离回收Th细胞来进行清洗。使清洗后的Th细胞悬浮于含有0.5μg/ml7-氨基-放线菌素D（7-AAD）及0.5%BSA的PBS，制备PTPRM/CXCR3多肽标志物测定用样品（5×106细胞/ml）。
【（6）CCR6/CXCR3多肽标志物测定用样品的制备】
代替上述的“（5）PTPRM/CXCR3测定用样品的制备”中的抗PTPRM抗体而，添加PE标记抗CCR6抗体（BDBioscience公司）至终浓度成1.0μg/ml，于4℃反应20分钟。再有，此时，不进行使用“（5）PTPRM/CXCR3测定用样品的制备”中的第二抗体（APC标记抗小鼠IgG抗体）的处理。
反应后，添加含有0.5%BSA的PBS，通过由离心分离回收Th细胞来进行清洗。使清洗后的Th细胞悬浮于含有0.5μg/ml的7-氨基-放线菌素D（7-AAD）及0.5%BSA的PBS，制备CCR6/CXCR3多肽标志物测定用样品（5×106细胞/ml）。
【（7）CCR6/MCAM多肽标志物测定用样品的制备】
代替上述的“（2）PTPRM/MCAM测定用样品的制备”中的抗PTPRM抗体而，添加Alexa488标记抗CCR6抗体（Biolegend公司）至终浓度成1.0μg/ml，于4℃反应20分钟。再有，此时，不进行使用“（2）PTPRM/MCAM测定用样品的制备”中的第二抗体（APC标记抗小鼠IgG抗体）的处理。
反应后，添加含有0.5%BSA的PBS，通过由离心分离回收Th细胞来进行清洗。使清洗后的Th细胞悬浮于含有0.5μg/ml的7-氨基-放线菌素D（7-AAD）及0.5%BSA的PBS，制备CCR6/MCAM多肽标志物测定用样品（5×106细胞/ml）。
【（8）CCR6/L1CAM多肽标志物测定用样品的制备】
代替上述的“（7）CCR6/MCAM测定用样品的制备”中的抗MCAM抗体，添加PE标记抗L1CAM抗体（eBioscience公司）至终浓度成1.0μg/ml，于4℃反应20分钟。
反应后，添加含有0.5%BSA的PBS，通过由离心分离回收Th细胞来进行清洗。使清洗后的Th细胞悬浮于含有0.5μg/ml的7-氨基-放线菌素D（7-AAD）及0.5%BSA的PBS，制备CCR6/L1CAM多肽标志物测定用样品（5×106细胞/ml）。
【2.为了由各Th细胞的已知标志物的测定的样品制备】
【（1）IFN-γ、IL-4、IL-17A测定用样品的制备】
用5%FBS/RPMI制备上述的“1.（1）Th细胞混合样品的制备”中制备的Th细胞混合样品至成2.5×105细胞/ml。接下来，添加肉豆蔻酰乙酸佛波酯至终浓度成50ng/ml及添加离子霉素至终浓度成1μM，于37℃温育4小时来刺激Th细胞。接下来，添加布雷菲德菌素A至终浓度成10μg/ml，于37℃温育2小时。
培养后，添加含有0.5%BSA的磷酸缓冲生理盐水（PBS），通过由离心分离回收Th细胞来进行清洗。向清洗的Th细胞添加2%多聚甲醛，固定。固定后，添加皂苷缓冲液（0.5%皂苷、0.5%牛血清白蛋白（BSA）、1mM叠氮化钠（PBS中）），使Th细胞的细胞膜的透过性亢进。
向皂苷缓冲液处理后的样品添加终浓度0.15μg/ml的PerCP-Cy5.5标记抗IL-17A抗体（eBioscience公司），终浓度0.2μg/ml的APC标记抗IL-4抗体（eBioscience公司），及终浓度1.0μg/ml的Alexa488标记抗IFN-γ抗体（Biolegend公司），于4℃反应20分钟。再有，作为IFN-γ使用Th1细胞检测用的已知标志物，IL-4使用Th2细胞检测用的已知标志物，IL-17A使用Th17细胞检测用的已知标志物。
反应后，添加皂苷缓冲液，通过由离心分离回收Th细胞来进行清洗。使清洗后的Th细胞悬浮于含有0.5%BSA的PBS，制备IFN-γ、IL-4、IL-17A测定用样品（2.5×105细胞/ml）。
【（2）FOXP3测定用样品的制备】
将上述的“1.（1）Th细胞混合样品的制备”中制备的，Th细胞混合样品由FOXP3染色缓冲液套件（eBioscience公司）进行固定及膜透过处理之后，添加PE标记抗FOXP3抗体（Biolegend公司）至终浓度成3.125μg/ml，于4℃反应20分钟。再有，将FOXP3作为Treg细胞检测用的已知标志物使用。
反应后，添加含有0.5%BSA的磷酸缓冲生理盐水（PBS），通过由离心分离回收Th细胞来进行清洗。使清洗后的Th细胞悬浮于含有0.5%BSA的PBS，制备FOXP3测定用样品（5×106细胞/ml）。
【3.使用流式细胞仪的各测定用样品中的多肽标志物组及Th细胞已知标志物的表达解析】
将上述1.（2）～（8）中制备的各多肽标志物测定用样品和上述2.（1）～（2）中制备的IFN-γ、IL-4、IL-17A、FOXP的测定用样品使用FACSCanto II（BDBioscience公司）及FACS DIVA软件（BDBioscience公司）解析。在各多肽标志物测定用样品中，算出表达以下的表9所示的多肽标志物的细胞的数的，相对于全细胞数的比率（%）。另外，在IFN-γ、IL-4、IL-17A、FOXP3的测定用样品中，将相对于全细胞数的，IFN-γ阳性细胞数、IL-4阳性细胞数、IL-17A阳性细胞数及FOXP3阳性细胞数的比率作为各自Th1细胞比率（%）、Th2细胞比率（%）、Th17细胞比率（%）及Treg细胞比率（%）。再有，阳性细胞和阴性细胞的判断以阴性对照中的最大的荧光强度作为基准进行。即，示相比在阴性对照的最大的荧光强度更高的荧光强度的细胞判断为阳性细胞。相反，将示阴性对照中的最大的荧光强度以下的荧光强度的细胞判断为阴性细胞。阳性细胞比率作为相对于全细胞数的阳性细胞数的比算出。
【表9】
测定用样品 多肽标志物 备考
1.（2） PTPRM阳性且MCAM阳性 新颖的标志物组
1.（3） PTPRM阳性且L1CAM阳性 新颖的标志物组
1.（4） PTPRM阳性且CCR6阳性 新颖的标志物组
1.（5） PTPRM阳性且CXCR3阴性 新颖的标志物组
1.（6） CCR6阳性且CXCR3阴性 新颖的标志物组
1.（7） CCR6阳性且MCAM阳性 新颖的标志物组
1.（8） CCR6阳性且L1CAM阳性 新颖的标志物组
【4.各Th17标志物和Th阳性细胞的相关解析】
将在上述3.中得到的表达各多肽标志物的细胞数的比率（%）和IL-17A阳性细胞数的比率（即Th17细胞比率）（%）的斯皮尔曼次序相关系数由StatFlex软件（株式会社Artec）算出。同样地，算出表达各多肽标志物的细胞数的比率（%）和IFN-γ阳性细胞数的比率（即Th1细胞比率）（%）、IL-4阳性细胞数（即Th2细胞比率）（%）或FOXP3阳性细胞数的比率（即Treg细胞比率）（%）的斯皮尔曼次序相关系数。各标志物的组合（标志物组）中的斯皮尔曼次序相关系数示于表10。另外，对于各待测样品的相对于“表达各多肽标志物的细胞数的比率（%）”的“由IL-17A检测的Th17细胞的比率（%）”的标绘图示于图2。在图2中，“rs”表示斯皮尔曼次序相关系数。另外，各标志物的名称之后付的“+”及“-”各自表示“标志物表达（阳性）”及“标志物不表达（阴性）”。
【表10】
Figure BDA00003407402200241
由图2及表10知，本发明的Th17细胞检测用标志物的各组合对于使用作为标准的Th17细胞的检测方法的IL-17A标志物的检测方法，示与作为已知的标志物组的CCR6及CXCR3同程度以上的高的相关。
另一方面，无法确认本发明的Th17细胞检测用标志物的各组合对于Th1、Th2及Treg细胞的检测方法（使用INF-γ、IL-4及FOXP3标志物的方法）相关。
以上提示，本发明的Th17细胞检测用标志物可特异性地检测Th17细胞。例如认为，通过使用本发明的标志物，在从患者采集的组织等的含细胞的样品中可特异性地检测Th17细胞，再者，可用于判断患者是否罹患被认为Th17细胞相关的疾病、例如RA等的自身免疫疾病。
【实施例4：各Th17细胞检测用标志物级分中含的Th17细胞比率的解析】
【（1）分级分离样品的制备】
从实施例3的1.（1）中制备的Th细胞混合样品2（混合比率是Th1：Th2：Treg：Th17=0.5：1：1：1的样品），由与实施例3的1.（2）、（4）、（6）及（8）同样的方法，各自制备PTPRM/MCAM、PTPRM/CCR6、CCR6/CXCR3及CCR6/L1CAM多肽标志物测定用样品。
从制备的各多肽标志物测定用样品中的Th细胞，使用细胞分选仪（FACS Aria：Becton Dickinson公司），各自分离PTPRM阳性并且MCAM阳性的细胞、PTPRM阳性并且CCR6阳性的细胞、CCR6阳性且CXCR3阴性的细胞及CCR6阳性并且L1CAM阳性的细胞。
将此分离的细胞各自向96孔板以1.5x105细胞以下/0.3ml/孔的密度接种。培养基是由添加IL-2（R&D systems公司）至终浓度成10ng/ml的Yssel培养基（IMDM，1%人AB型血清，0.25%BSA，1.8mg/l2-氨基甲醇，40mg/l转铁蛋白，5mg/l胰岛素，2mg/l亚油酸，2mg/l油酸，2mg/l棕榈酸，1%青霉素/链霉素）将细胞在37℃、5%CO2气氛的温育器内培养3天，制备PTPRM/MCAM分级分离样品、PTPRM/CCR6分钟级分离样品、CCR6/CXCR3分钟级分离样品及CCR6/L1CAM分级分离样品。
【（2）为了IL-17A阳性细胞测定的样品处理】
为了测定上述（1）的分级分离前的Th细胞混合样品2、以及分级分离后的PTPRM/MCAM分级分离样品、PTPRM/CCR6分钟级分离样品、CCR6/CXCR3分钟级分离样品及CCR6/L1CAM分级分离样品的各自中含的IL-17A阳性细胞，从各样品制备IL-17A测定用样品。具体而言，用5%FBS/RPMI制备Th细胞混合样品2、PTPRM/MCAM分级分离样品、PTPRM/CCR6分钟级分离样品、CCR6/CXCR3分钟级分离样品、CCR6/L1CAM分级分离样品至成2.5×105细胞/ml。接下来，添加肉豆蔻酰乙酸佛波酯至终浓度成50ng/ml及添加离子霉素至终浓度成1μM，于37℃温育4小时来刺激Th细胞。接下来，添加布雷菲德菌素A至终浓度成10μg/ml，于37℃温育2小时。
培养后，添加含有0.5%BSA的磷酸缓冲生理盐水（PBS），通过由离心分离回收Th细胞来进行清洗。向清洗的Th细胞添加2%多聚甲醛，固定。固定后，添加皂苷缓冲液（0.5%皂苷、0.5%牛血清白蛋白（BSA）、1mM叠氮化钠（PBS中）），使Th细胞的细胞膜的透过性亢进。
向皂苷缓冲液处理后的样品添加终浓度0.15μg/ml的PerCP-Cy5.5标记抗IL-17A抗体（eBioscience公司），于4℃反应20分钟。
反应后，添加皂苷缓冲液，通过由离心分离回收Th细胞来进行清洗。使清洗后的Th细胞悬浮于含有0.5%BSA的PBS，制备IL-17A测定用样品。
【（3）IL-17A阳性细胞的测定】
将上述（2）中制备的各IL-17A测定用样品使用FACSCanto II（BDBioscience公司）及FACS DIVA软件（BDBioscience公司）解析。算出在各IL-17A测定用样品中，相对于全细胞数的，IL-17A阳性细胞数的比率，Th17细胞比率（%）。
其中，阳性细胞和阴性细胞的判断以阴性对照中的最大的荧光强度作为基准进行。即，将示相比在阴性对照中的最大的荧光强度更高的荧光强度的细胞判断为阳性细胞。
相反，将示阴性对照中的最大的荧光强度以下的荧光强度的细胞判断为阴性细胞。阳性细胞比率作为相对于全细胞数的阳性细胞数的比算出。
【（4）Th17浓缩率的算出】
基于上述（3）中得到的各样品的Th17细胞比率（%），算出Th17细胞检测用标志物分级分离中的Th17浓缩率。具体而言，各自算出相对于上述（3）中得到的Th细胞混合样品2的Th17细胞比率（%）的，PTPRM/MCAM分级分离样品、PTPRM/CCR6分钟级分离样品、CCR6/CXCR3分钟级分离样品、CCR6/L1CAM分级分离样品的Th17细胞比率（%）的比。将得到的比作为Th17浓缩率，将Th17细胞检测用标志物分级分离中的Th17浓缩率示于图3。
由图3知，“CCR6和PTPRM”、“CCR6和L1CAM”及“MCAM和PTPRM”的本发明的Th17细胞检测用标志物的组合以相比作为以往的标志物组的CCR6及CXCR3更高的浓度浓缩Th17细胞。因此知，通过使用本发明的标志物，可从含人来源的各种的细胞的样品以相比以往更高精度单离Th17细胞。

Claims (9)

1.产生人IL-17的辅助性T细胞检测用标志物，其含具有由选自L1CAM、MCAM及PTPRM的至少1个表示的基因的碱基序列的多核苷酸或其变异型或片段。
2.权利要求1所述的产生人IL-17的辅助性T细胞检测用标志物，其再含具有由选自CCR6及CXCR3的至少1个表示的基因的碱基序列的多核苷酸或其变异型或片段。
3.产生人IL-17的辅助性T细胞检测用标志物，其含由选自L1CAM、MCAM及PTPRM的至少1个表示的基因编码的蛋白质或其功能上同等的变异型或片段。
4.权利要求3所述的产生人IL-17的辅助性T细胞检测用标志物，其再含由选自CCR6及CXCR3的至少1个表示的基因编码的蛋白质或其功能上同等的变异型或片段。
5.产生人IL-17的辅助性T细胞的检测方法，其包括：
在含细胞的样品中，取得权利要求1～4之任一项所述的产生人IL-17的辅助性T细胞检测用标志物的表达水平的步骤，以及
基于取得的上述标志物的表达水平，检测上述样品中的产生人IL-17的辅助性T细胞的步骤。
6.权利要求5所述的检测方法，其中取得上述标志物的表达水平的步骤是以下步骤：
使由标记物质标记的标记化抗体与上述含细胞的样品接触而制备测定用样品，所述标记化抗体与上述产生人IL-17的辅助性T细胞检测用标志物特异性地反应，
在得到的测定用样品中，经上述产生人IL-17的辅助性T细胞检测用标志物检测与产生人IL-17的辅助性T细胞结合的上述标记化抗体的标记。
7.权利要求6所述的检测方法，其中
取得上述标志物的表达水平的步骤是取得互相不同的多个产生人IL-17的辅助性T细胞检测用标志物的表达水平的步骤，
上述标记化抗体是与上述多个产生人IL-17的辅助性T细胞检测用标志物各自特异性地反应的、互相不同的抗体，并且由可互相识别的标记物质标记。
8.权利要求6或7所述的检测方法，其中上述标记化抗体是由荧光标记物质标记的抗体。
9.权利要求8所述的检测方法，其中将由上述荧光标记化抗体发出的荧光使用流式细胞仪检测。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555667A (zh) * 2013-10-17 2014-02-05 中国人民解放军第三军医大学 利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法
CN108761054A (zh) * 2017-04-11 2018-11-06 希森美康株式会社 免疫细胞免疫刺激应答性的测定、免疫细胞免疫突触形成能力的判定、以及细胞分析装置

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI660972B (zh) * 2012-09-10 2019-06-01 愛爾蘭商尼歐托普生物科學公司 抗ｍｃａｍ抗體及相關使用方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010024289A1 (ja) * 2008-08-27 2010-03-04 シスメックス株式会社 Il-17産生ヘルパーt細胞検出用マーカー及びil-17産生ヘルパーt細胞の検出方法
WO2011013753A1 (ja) * 2009-07-29 2011-02-03 シスメックス株式会社 ヒトil-17産生ヘルパーt細胞検出用マーカーおよび試薬、並びにヒトil-17産生ヘルパーt細胞の検出方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000186046A (ja) 1998-10-14 2000-07-04 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 慢性関節リウマチ治療剤及び診断方法
ATE491953T1 (de) 2003-09-15 2011-01-15 Oklahoma Med Res Found Verfahren zur verwendung von cytokintests zur diagnose, behandlung und beurteilung von ankyloider spondylitis
JPWO2009107785A1 (ja) * 2008-02-28 2011-07-07 シスメックス株式会社 Ｉｌ−１７産生ヘルパーｔ細胞検出用マーカー及びｉｌ−１７産生ヘルパーｔ細胞の検出方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010024289A1 (ja) * 2008-08-27 2010-03-04 シスメックス株式会社 Il-17産生ヘルパーt細胞検出用マーカー及びil-17産生ヘルパーt細胞の検出方法
WO2011013753A1 (ja) * 2009-07-29 2011-02-03 シスメックス株式会社 ヒトil-17産生ヘルパーt細胞検出用マーカーおよび試薬、並びにヒトil-17産生ヘルパーt細胞の検出方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAILEY SD ET AL.: "NM_001105244", 《GENBANK》 *
HUGHES LB ET AL.: "NM_004367", 《GENBANK》 *
SCHAFER MK ET AL.: "NM_000425", 《GENBANK》 *
STRIJBOS MH ET AL.: "NM_006500", 《GENBANK》 *
VERENA BRUCKLACHER-WALDERT ET AL.: "Phenotypical and functional characterization of T helper 17 cells in multiple sclerosis", 《BRAIN》 *
ZHOU J ET AL.: "NM_001504", 《GENBANK》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555667A (zh) * 2013-10-17 2014-02-05 中国人民解放军第三军医大学 利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法
CN103555667B (zh) * 2013-10-17 2015-06-03 中国人民解放军第三军医大学 利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法
CN108761054A (zh) * 2017-04-11 2018-11-06 希森美康株式会社 免疫细胞免疫刺激应答性的测定、免疫细胞免疫突触形成能力的判定、以及细胞分析装置
US11808761B2 (en) 2017-04-11 2023-11-07 Sysmex Corporation Method for measuring immunostimulatory response of immune cell, method for determining ability to form immune synapse in immune cell, and cell analyzer

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