JP5675638B2 - アレルギー反応を診断するための方法 - Google Patents
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Description
本願は、2008年12月4日に出願された米国特許出願第61/120,033号に係る優先権を主張する。米国特許出願第61/120,033号はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
本発明は、一部、米国立衛生研究所により付与された助成金番号5U19AI050864-07の下で米国政府による資金提供を受けた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、疾患の免疫学的プロファイルを作成する目的で、単一細胞から、複数の種類のサイトカインおよび相関関係にある表面発現した免疫表現型バイオマーカーを検出するための方法を提供する。
個々の細胞は外見が同じであっても、特定の遺伝子の発現、重要な代謝産物もしくはイオンの濃度、または所定の刺激に対する応答のパターンにばらつきがあるなど非常に多くの特徴の点で異なることがよく知られている。生細胞では、デオキシリボ核酸(DNA)および重要な調節分子を含む多くの成分のコピー数が非常に少ない。遺伝子発現の生化学的プロセスに特有の確率論的事象(内的ノイズ)および他の細胞成分の変動(外的ノイズ)のいずれもが、細胞間のばらつき全体に実質的に寄与している。細胞型、変異、および変動は全て体内の細胞の多様性に寄与している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【非特許文献1】 LOVE J C,A MICROENGRAVING METHOD FOR RAPID SELECTION OF SINGLE CELLS PRODUCING ANTIGEN-SPECIFIC ANTIBODIES,NATURE BIOTECHNOLOGY,米国,NATURE PUBLISHING GROUP,2006年 6月 1日,V24 N6,P703-707
【非特許文献2】 BRADSHAW E M,CONCURRENT DETECTION OF SECRETED PRODUCTS FROM HUMAN LYMPHOCYTES BY MICROENGRAVING: 以下備考,CLINICAL IMMUNOLOGY,米国,ACADEMIC PRESS,2008年10月 1日,V129 N1,P10-18,CYTOKINES AND ANTIGEN-REACTIVE ANTIBODIES
[本発明1001]
以下の工程を含む、被験体における免疫プロファイルを決定する方法:
少なくとも1つのマイクロウェルをマイクロウェルアレイに備える成形可能な平板(moldable slab)の上に堆積された、被験体由来の細胞の懸濁液を提供する工程であって、該マイクロウェルアレイにおける少なくとも1つのマイクロウェルは、ナノリットル以下の体積中に単一細胞を含有する、工程;
該細胞の分泌産物に結合する少なくとも1種類の検出剤で前処理された基板と、マイクロウェルアレイとを接触させる工程;および
該基板上にある該検出剤のレベルを測定する工程であって、該レベルは該単一細胞の分泌産物の量に対応し、それによって、免疫プロファイルを決定する、工程。
[本発明1002]
プロファイルが、Th 1 プロファイル、Th 2 プロファイル、Th 9 プロファイル、Th 17 プロファイル、Thプロファイル、または抗体アイソタイプレベルである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
第2の検出剤をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
第3の検出剤をさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
第4の検出剤をさらに含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
検出剤がT細胞分泌産物パネルを検出する、本発明1001の方法。
[本発明1007]
検出剤が、IL-17、IL-10、IL-4、およびIFN-γからなる群より選択される複数の種類のサイトカインを検出する、本発明1001の方法。
[本発明1008]
検出剤がTヘルパー2(Th 2 )分泌産物パネルを検出する、本発明1001の方法。
[本発明1009]
検出剤が、IL-4、IL-5、IL-13、およびIL-9からなる群より選択される複数の種類のサイトカインを検出する、本発明1001の方法。
[本発明1010]
検出剤が、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)細胞またはTh 1 の分泌産物パネルを検出する、本発明1001の方法。
[本発明1011]
検出剤が、IFNγ、MIP-1β、TNFα、パーフォリン、およびIL-2からなる群より選択される複数の種類のCTLまたはTh 1 パネル産物を検出する、本発明1001の方法。
[本発明1012]
検出剤が、IgE、IgG 1 、IgG 4 、およびIgAからなる群より選択される抗体アイソタイプを検出する、本発明1001の方法。
[本発明1013]
検出剤が、IgG 3 、IgG 1 、IgM、およびIgAからなる群より選択される抗体アイソタイプを検出する、本発明1001の方法。
[本発明1014]
細胞が、被験体由来の全血細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
細胞が末梢血単核球(PBMC)である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
細胞を成形可能な平板上に堆積させる前に刺激する、本発明1001の方法。
[本発明1017]
疑いのあるアレルゲンまたは既知のアレルゲンで細胞を刺激する、本発明1001の方法。
[本発明1018]
細胞からの分泌産物の分泌速度を決定する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1019]
細胞の表現型を決定する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
CD4またはCD8が細胞表面上に発現している、本発明1001の方法。
[本発明1021]
以下の工程を含む、個々の生細胞のプロファイルを決定する方法:
少なくとも1つのマイクロウェルをマイクロウェルアレイに備える成形可能な平板の上に堆積された、被験体由来の細胞の懸濁液を提供する工程であって、該マイクロウェルアレイにおける少なくとも1つのマイクロウェルは、ナノリットル以下の体積中に単一細胞を含有する、工程;
該細胞の分泌産物に結合する少なくとも1種類の検出剤で前処理された基板と、マイクロウェルアレイとを接触させて、プリントされたマイクロアレイを得る工程;
該プリントされたアレイを画像化して、データセットを得る工程;
該データセットをフィルタリングして、単一細胞からなる該アレイ上の位置を特定する工程;および
該位置を、該単一細胞の位置から検出された分泌産物のレベルと突き合わせる工程であって、それによって、個々の生細胞の免疫プロファイルを決定する、工程。
[本発明1022]
単一細胞の表現型または系列を特定する工程をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
表現型または系列を、分泌産物レベルと突き合わせる工程をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1024]
以下の工程を含む、被験体におけるアレルゲンに対する感受性を評価する方法:
少なくとも1つのマイクロウェルをマイクロウェルアレイに備える成形可能な平板の上に堆積された、被験体由来の細胞の懸濁液を提供する工程であって、該マイクロウェルアレイにおける少なくとも1つのマイクロウェルは単一細胞を有し、該細胞は試験アレルゲンと接触したことがある、工程;
該アレルゲンに対する感受性を示す少なくとも1種類の検出剤で前処理された基板と、マイクロウェルアレイとを接触させる工程;および
該検出剤のレベルを測定する工程であって、それによって、アレルゲンの感受性を評価する、工程。
[本発明1025]
検出剤が抗体アイソタイプを特定する、本発明1024の方法。
[本発明1026]
他の抗体アイソタイプと比較したIgEアイソタイプのレベルの増加が、被験体がアレルゲンに対するアレルギーを有するか、または該アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクを有することを示す、本発明1024の方法。
[本発明1027]
IgG 4 アイソタイプのレベルと比較したIgEアイソタイプのレベルの増加が、被験体がアレルゲンに対するアレルギーを有するか、または該アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクを有することを示す、本発明1024の方法。
[本発明1028]
検出剤がサイトカインを特定する、本発明1024の方法。
[本発明1029]
Th1サイトカインのレベルと比較したTh2サイトカインのレベルの増加が、被験体がアレルゲンに対するアレルギーを有するか、または該アレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクを有することを示す、本発明1028の方法。
[本発明1030]
Th2サイトカインがIL-4を含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
Th1サイトカインがIFNγを含む、本発明1029の方法。
[本発明1032]
アレルゲンが食品である、本発明1024の方法。
[本発明1033]
食品が、乳、卵、ピーナッツ、ツリーナッツ(tree nut)、魚、貝・甲殻類、ダイズ、またはコムギ、卵製品、豆果、海産物、または貝・甲殻類である、本発明1032の方法。
[本発明1034]
アレルゲンが薬物である、本発明1024の方法。
[本発明1035]
薬物が、アモキシシリン、ペニシリン、サルファ剤、バルビツレート、抗痙攣剤、インシュリン、またはヨウ素である、本発明1034の方法。
[本発明1036]
アレルゲンが、塵埃、花粉、ペットの鱗屑、ラテックス、もしくは塩素、または昆虫刺咬に関連する毒液である、本発明1024の方法。
[本発明1037]
昆虫刺咬が、スズメバチ、ヒアリ(fire ant)、またはハチ刺されによるものである、本発明1024の方法。
[本発明1038]
以下の工程を含む、自己免疫疾患または感染症を示す被験体におけるサイトカインプロファイルを決定する方法:
少なくとも1つのマイクロウェルをマイクロウェルアレイに備える成形可能な平板の上に堆積された、被験体由来の細胞の懸濁液を提供する工程であって、該マイクロウェルアレイにおける少なくとも1つのマイクロウェルは単一細胞を有する、工程;
少なくとも1種類のサイトカイン検出剤で前処理された基板と、マイクロウェルアレイとを接触させる工程;および
該サイトカイン検出剤を検出する工程;および
サイトカインプロファイルを形成する工程;および
自己免疫疾患または感染症を示すサイトカインプロファイルを定める工程。
[本発明1039]
自己免疫疾患または感染症を示すサイトカインプロファイルが、IFNγまたはIL-2の正常レベルと比較したIFNγまたはIL-2のレベルの増加を含む、本発明1038の方法。
本発明は、多重サイトカイン捕捉の方法を提供する。本発明はまた、データの次元を高めるために、サイトカインを、系列を区別する細胞上の表面発現マーカーと突き合わせる工程、および分泌速度を定量する工程も提供する。接触領域は、ディファレンシャルラベリング(differential labeling)によって特定される。
過去数十年間にわたって、個々の細胞の分子機構のハイスループット研究のために一連の技法が開発されてきた。ELISPot(酵素結合免疫スポット)は、単一細胞レベルでサイトカイン産生細胞を検出するための一般的な方法である(Czerkinsky, et al., 1983 J Immunol Methods, 65:109-121)。この技術では、細胞が負荷され、特異的抗体で機能化した膜上で増殖される。培養中に、それぞれの細胞によって産生されたサイトカインは、細胞の周囲にある抗体によって捕捉される。個々の細胞からの分泌産物は別の抗体により検出された後に、視覚化される。この方法は、分泌タンパク質の定性結果と、応答細胞の頻度の半定量結果の両方を提供する。この技法の欠点は、毎回、1種類または2種類の分泌タンパク質しか検出できず、それぞれの細胞から複数の分泌パターンは評価しないことである。また、実験後に特異的細胞が失われる。
マイクロエングレービングは、個々の細胞の迅速なハイスループットの多重スクリーニングのために最近開発された技法である。この技法は、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするために用いられている(Love, et al., 2006 Nat Biotechnol, 24:703-707)。これはまた、1型糖尿病患者に由来する個々のヒト末梢血単核球の集団を、分泌型サイトカイン(IFN-γおよびIL-6)、抗原特異的抗体、ならびに系列特異的表面マーカーについて多重に調べるように適合された(Bradshaw, et al., 2008 Clin Immunol, 129:10-18)。
免疫系における細胞の多様性および細胞の多機能性のために、マイクロエングレービング技術は、免疫系の単一細胞を研究するための有用な技法となっている。マイクロエングレービングを用いると、末梢血単核球(PBMC)から以下の情報が測定される:1)全集団における、それぞれの細胞型の頻度;2)全集団における、ある特定のサイトカインまたは抗体を分泌する細胞の頻度;3)単一細胞レベルでのサイトカインプロファイルおよびその動的変化;4)検出後の、生存能力のある関心対象のクローン;5)疾患における様々な種類の免疫細胞の機能ネットワーク。
本発明は高い検出感度を提供する。大量細胞培養を用いるELISAと比較したマイクロエングレービングの利点の1つは、細胞が少量(〜0.1nl/細胞)でトラップされ、その結果、標的タンパク質の局所濃度が高くなることである。本明細書に記載の方法は、分泌型サイトカインの表面ベースの捕捉(例えば、Millipore)の約10倍の感度がある。他方で、蛍光と検出抗体との直接標識は、シグナルが酵素触媒反応によって増幅されるELISAと比較して低い感度を示す。検出感度は、同じ抗体ペアを用いたELISAの約10分の1から100分の1である。マイクロエングレービングにおける分泌タンパク質の高い局所濃度および低いシグナル増幅のために、全体の検出感度はELISAより劇的には高くならない。
ソフトリソグラフィーによって製造されたマイクロウェルアレイから分泌型サイトカインを検出するためのプロトコールを最適化した。様々なスライド、ブロッキング緩衝液、および捕捉抗体濃度を試験した。
前記の方法が、細胞から分泌された複数の種類のサイトカインを検出する感度を有するかどうか試験するために、PBMCをPHAで24時間、刺激し、マイクロウェルに負荷した。一部のスポットの画像は、2時間のプリント後に観察された。スライド上には1色のスポットしか見られず、このことから、これらの4色が互いに良好に区別されることが分かる。また、二重陽性スポットおよび多数陽性スポットもあり、このことから、それぞれの細胞の機能プロファイルが異なることが実証される。
初代細胞がプリント後でも生きているかどうか、マイクロエングレービングによって検出された機能プロファイルに再現性があるかどうか確かめるために、CD4+T細胞をマイクロウェルに負荷し、IFN-γおよびIL-17の分泌を測定した。IFN-γ陽性、IL-17陽性、およびIFN-γ/IL17二重陽性の3種類のシグナルが検出された。プリント中に、ウェルの大部分は1〜2個の細胞を含み、これらの一部は3個の細胞を含んだ。プリント後に、マイクロウェル内の細胞をさらに2日間培養した。細胞の大部分は分裂した。代表的な細胞の一部をウェルから取り出し、96ウェル内で培養した。細胞増殖させた後に、細胞内染色を行い、FACSを用いて表現型を検出した。
マイクロウェルアレイを作製するための、特注の射出成形用鋳型
前記のように、本発明の方法は、標準的なガラススライドに取り付けられたポリ(ジメチルシロキサン)の中に成形された薄い(1mm)ナノウェルアレイを作製するための射出成形プロセスを含む。この標準化された製造プロセスによって、アッセイおよびデータ収集の再現性が改善された。
関心対象のサイトカインを検出するための適切な抗体ペアの検証を以下で説明する。以下で説明する簡単な無細胞アッセイは、候補抗体ペアを試験するのに用いられるマイクロエングレービングプロセスを模倣する。この順応性のあるアッセイによって、Th応答の偏りならびに特異的なTh2応答およびTh1応答を示すサイトカインセットを検出するための4つの特異なパネル(IL-4/IL-10/IL-17/IFNγ;IL-4/IL-5/IL-9;IFNγ/MIP-1β/TNFα/パーフォリン;IFNγ/IL-10/IL-17/IL-22)が特定された。2つの抗体パネル(IgG1/IgA/IgE/IgG4;IgG1/IgA/IgG3/IgM)のための検出抗体が検証された。
単一細胞からの2つのサイトカインセットの四重検出を以下で説明する。図3は、T細胞応答の偏り(IFNγ/IL-4/IL-10/IL-17)を示すアッセイ結果を示す。この実験では、抗CD3および抗CD28を用いてPBMCを刺激した。CD4+T細胞を負の選択によって分離し、蛍光表面マーカー(αCD4-Alexa647)によって染色し、マイクロウェルアレイに負荷した。このアレイを、IL-4、IL-10、IL-17、およびIFNγの捕捉抗体で機能化したガラススライドと接触させた。2時間のインキュベーション後に、アレイを取り出し、画像化した。スライドを染色し、Genepixマイクロアレイスキャナーによって画像化した。それぞれのウェルについて、画像を補正した。それぞれのウェルは50μm×50μm×50μmである。図4は、Th2応答(IL-4/IL-5/IL-13/IL-9)の幅を示すアッセイ結果を示す。この実験では、抗CD3および抗CD28を用いて、PBMCを刺激した。CD4+T細胞を負の選択によって分離し、マイクロウェルアレイに負荷した。このアレイを、IL-4、IL-5、IL-13、およびIL-9の捕捉抗体で機能化したガラススライドと接触させた。2時間のインキュベーション後に、アレイを取り出し、画像化した。スライドを染色し、Genepixマイクロアレイスキャナーによって画像化した。それぞれのウェルについて、画像を補正する。それぞれのウェルは50μm×50μm×50μmである。
多重サイトカインアッセイを検証するために、健康ドナーに由来する末梢血単核球(PBMC)を、サイトカイン応答を誘導することが知られている一対のマイトジェン(ポークウィードおよびフィトヘマグルチニン、PHA)ならびにT細胞に対するポリクローナル刺激(抗CD3/CD8)により刺激した。特定の期間の刺激の後に、マイクロエングレービングによって作製されたサイトカインマイクロアレイ上で検出されたスポットの数を評価した(図5)。これらのデータから、刺激薬および曝露時間の関数としての検出された応答間で特異な差があることが分かった。これらの活性化条件について従来のELISpotアッセイと比較してもデータが裏付けられた。
リンパ球によって放出されるサイトカインは、細胞機能および免疫応答の発展に及ぼす影響の尺度である。下記で説明するように、数値シミュレーションおよび実験検証を介して、単一細胞からの分泌を捕捉する技法であるマイクロエングレービングは、個々の生細胞から同時に放出された4種類までのサイトカインの頻度および分泌速度の分布を定量的に測定する。これらの多次元測定は、単一パラメータ機能アッセイよりさらに詳細に、かつさらに高い感度で、刺激に曝露された細胞の応答の規模および強度を分解する。このアプローチを用いると、IFNγの中央値分泌速度は、2種類または3種類のサイトカインを同時に産生するリンパ球において増加するが、他のサイトカイン(IL-2およびTNFα)は同様の増加を示さないことが分かる。さらに、IFNγおよびIL-2の分泌速度は両サイトカインを産生する細胞において相関関係がないのに対して、IL-2およびTNFαは正の相関関係を示す。
マイクロウェル内の分析物の濃度を計算するために、下記の仮説を立てた:
ある特定の分析物について一定の分泌速度があり、その分析物は、機能化したガラス表面にしか特異的に結合しない。
式中、Cは、培地中の分析物の濃度であり、Dは、分析物の拡散係数であり、tは、インキュベーション時間である。COMSOL Multiphysics 3.3(COMSOL AB. Stockholm, Sweden)を用いて、特異的捕捉Abを用いた分析物の分泌、拡散、および結合に関連する偏微分方程式を解いた。表2は、このシミュレーションにおいて用いられたシステムパラメータを列挙する。
施設の内部倫理審査委員会の承認を得て、健康対照から静脈血を採取して、緑の蓋の付いたリチウムヘパリンチューブ(Kendall)に入れた。Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)上での密度遠心分離を用いて、PBMCを分離した。PBMCを、106/mLで、10%FBS、2mM L-グルタミン、10mM HEPES、100Uペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、0.1mM非必須アミノ酸、および1mMピルビン酸ナトリウムを添加したRPMI 1640培地(Mediatech)に懸濁した。
実験は、以前に説明されたように、述べられたようにいくつかの変更を加えて行った(Love, et al., 2006 Nat Biotechnol, 24:703-707; Bradshaw, et al., 2008 Clin Immunol, 129:10-18)。簡単に述べると、マイクロウェルアレイは、シリコーンエラストマー(ポリジメチルシロキサン、PDMS; Dow Corning)を特注の鋳型に注入することによって製造し、80℃で1時間、硬化させた。アレイは、84,672個のマイクロウェル(それぞれ50×50×50μm3)を含んだ(Ogunniyi, et al., 2009 Nat Protoc, 4:767-782)。アレイを酸素プラズマ(Harrick PDC-32G)に30秒間、曝露した後に、細胞懸濁液(約2×105/mL)をアレイの表面上に置き、細胞を、〜1細胞/ウェルの密度で、重力によってウェルの中に沈澱させた。アレイ表面から余分な細胞を培地でリンスした後に、次いで、負荷された装置を、捕捉Abでコーティングされたガラススライド上に置いた。それぞれのアッセイの具体的な詳細を下記で説明する。
公表されたプロトコールに従ってポリ-L-リジンスライドを調製し、捕捉Abを固定化するのに使用した。抗ヒトIL-6(40μg/mL, MAB206, R&D)および抗ヒトIgG(10μg/mL, 81-7100, Invitrogen)をホウ酸緩衝液で希釈し(Ogunniyi, et al., 2009 Nat Protoc, 4:767-782)、スライドに25℃で1時間、適用し、PBSでリンスし、乾燥させた。IL-6分泌を刺激するために、LPS(10μg/mL)、PHA(5μg/mL)、およびPWM(5μg/mL)を個々に丸底96ウェルプレートの中にあるPBMCに添加し、5%CO2、37℃で望ましい時間インキュベートした。マイクロウェルアレイを負荷する前に、PBMCをカルセインバイオレットAM(Invitrogen)で染色した。次いで、生細胞の画像化(温度およびCO2制御)のための装備がある自動倒立落射蛍光顕微鏡(Zeiss)によって、細胞が負荷されたアレイを画像化した。アレイを上向きにして、(特定の刺激を含む培地と共に)カバーガラスを付けて顕微鏡にのせた。次いで、ウェルアレイを、(ヒトIgによって全てのマイクロウェルの位置を標識するために)微量のヒト血清(1:40,000)を含む培地で穏やかにリンスし、直ぐに、捕捉Abを含むガラススライド上に適用した。組み合わされたアレイおよびガラススライドを軽く加圧して一緒に保持して、ハイブリダイゼーションチャンバーに入れ(Agilent Technologies, G2534A)、37℃でインキュベートした。経時的に行われた測定中に、それぞれの時点で、mRNA定量用に細胞の半分を集めた。プリント後、検出のために、Alexa Fluor488標識抗ヒトIL-6(R&D)およびAlexa Fluor 700標識抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch)を使用した。マイクロエングレービング後に細胞を標識するために、10μg/mlのCD3-Alexa Fluor488、CD11b-Alexa Fluor568、およびCD14-Alexa Fluor 660をウェルアレイに添加した。4℃で30分の後に、ウェルアレイをPBSで洗浄し、画像化した。(全てのAbは、示したようにAlexa Fluor-NHSエステル(Invitrogen)で標識した)。
absolutely RNA microprepキット(Stratagene)を用いて、PBMCからのRNAを精製した。Taqmanキットと、供給されたランダムヘキサマー(Applied Biosystems)を用いて、cDNAを作った。IL-6プライマーおよびプローブはApplied Biosystemsから入手し、推奨された手順に従って使用した。
多重サイトカイン検出に用いられたAbペアは、IFNγ(MABTECH)、IL-17(eBioscience)、IL-2(R&D)、およびTNFα(BD)であった。捕捉のために、捕捉Ab(それぞれ10μg/ml)の混合物をガラススライドに適用した。PBMCを、PMA(10ng/mL)およびイオノマイシン(1μg/mL)によって6時間、刺激し、次いで、カルセインバイオレットAMで染色し、前記のようにマイクロウェル中で画像化した。ウェルアレイを無血清培地でリンスし、直ぐに、捕捉Abを有するガラススライド上に適用した。プリント後、検出のために、Ab-IL-17(Alexa Fluor 488)、IFNγ(Alexa Fluor 555)、IL-2(Alexa Fluor 594)、TNFα(Alexa Fluor 700)の混合物を使用した。マイクロエングレービング後に細胞を標識するために、10μg/mLのCD3(Alexa Fluor 488)、CD8(Alexa Fluor 568)、およびCD4(Alexa Fluor 660)をウェルアレイに添加した。4℃で30分の後に、ウェルアレイをPBSで洗浄し、画像化した。
操作中に、図20を見ると、分泌産物を分析するためのプロセス10は、示された段階を含む。しかしながら、プロセス10は例示に過ぎず、限定するものではない。プロセス10は、例えば、段階を加える、取り除く、または再編成することによって変更することができる。サイトカインのプリントされたマイクロアレイ14は、マイクロアレイスキャナー15(例えば、GenePix 4200AL, MDS)において画像化し、添付のソフトウェア(例えば、GenePix6.1)を用いて分析することができる。顕微鏡から集められた透過光顕微鏡写真および落射蛍光顕微鏡写真を分析して16、各ウェル12に存在する細胞の数および系列を決定することができる18。細胞アレイおよびプリントされたマイクロアレイの両方について抽出されたデータを、アレイ内の各ウェルに割り当てられた固有の識別子を用いて(例えば、MS Excelにおいて)突き合わせることができる20。後の分析のために、データセットをフィルタリングして、(例えば、ExcelまたはMATLAB(Mathworks, Natick, MA)において)対応するマイクロアレイ14の上にある分泌タンパク質と突き合わされた単一細胞のみを含む、アレイ12における位置を含めることができる22。速度の分布は、コルモゴルフ‐スミルノフ(Kolmogorov-Smirnov)の二標本検定を用いて比較することができ、同時分泌の相関係数は、スピアマンの順位相関を用いて計算することができる24。
マイクロエングレービングは、最小限の撹乱で、ナノリットル以下の体積中に生細胞を一時的に閉じ込めるために、微細加工により作られたウェルからなるアレイを用いる。細胞から分泌されたタンパク質を捕捉するために、1つの体積内面がAbを支持する(図6A)。インキュベーション(〜1から2時間)の後に、捕捉表面が取り出され、次いで、蛍光Abを適用することによって調べられる(Bradshaw, et al., 2008 Clin Immunol, 129:10-18)。マイクロエングレービングによって分泌の定量測定が可能になる最適条件を決定するために、一連の微分方程式および数値シミュレーションを用いて、個々の体積に閉じ込められた単一細胞についての質量輸送をモデル化する。このシミュレーションによって、表面上に捕捉されたタンパク質の量と、体積中のタンパク質の量との時間的関係を説明する3つの体制が分かった(図6B)。中間の体制(〜30分から>20時間)では、表面上に捕捉されたタンパク質の量は、細胞が分泌したタンパク質の総量に近い。
本発明者らの測定の感度を評価するために、LPSによる3回の刺激間隔(3時間、6時間、および12時間)の後に、ヒトPBMCから放出されたIL-6の頻度および分泌速度を測定した。測定された応答から、IL-6分泌細胞の頻度および細胞1個あたりの平均分泌速度は3〜12時間(特に、3〜6時間)まで単調に増加することが分かった(図6C)。しかしながら、IL-6をコードするmRNAの発現は6時間でピークに達した(図6D)。この観察から、転写のタイミングは必ずしもタンパク質分泌のタイミングと相関するとは限らない場合があることが確かめられた。IL-6分泌細胞のほとんどはCD11b+(44.8%)およびCD11b+CD14+(26.9%)であるのに対して、小さな集団はCD3+(4.7%)であった。これらの細胞間の分泌速度の分布には有意差が無かった。このことから、これらは全て分泌能力が類似することが示唆される。
マイクロエングレービング用の分析モデルから、捕捉および検出に使用したそれぞれのAbペアに十分な特異性があると仮定して、同じ細胞から独立して複数の種類のサイトカインを検出できることが示唆された。IL-17、IFNγ、IL-2、およびTNFαを同時に検出するために4種類の市販のAbペアを検証し、次いで、ヒトPBMCをPMA/イオノマイシンで刺激した後に、定量マイクロエングレービングによって応答の幅を測定した。アレイ内の生細胞は、1種類、2種類、または3種類のサイトカインを含む広範囲の機能応答を示した(図10Aおよび図11)。サイトカイン組み合わせを分泌する細胞については(100,000個の細胞あたり最低48個)、それぞれのサイトカインの分泌速度を分析した(図10B)。IFNγの放出が最も動的であったが(3.8〜120分子/s)、他のサイトカインの速度は、典型的に、20分子/s未満であった。IFNγおよびIL-2+細胞はCD4 T細胞およびCD8 T細胞の両方を含んだ。すなわち、それぞれの系列の頻度は異なったが、これらの分泌速度の分布は類似していた(図12)。予想通り、これらのデータから、CD4 T細胞およびCD8 T細胞の分泌能力には有意差が無いことが分かる。
それぞれの検出抗体に対して用いられた特定のフルオロフォアについて検出限界を求めた。検出限界は、平均バックグラウンドを上回る標準偏差(SD)の3倍と定義した。これらの値は、人工受容体アッセイについて以前に計算された値の少なくとも10分の1より低く、ほとんどの場合、カプセル化アッセイの値より低い。
異なる種類のTh細胞のサイトカイン分泌プロファイルならびに異なるIgサブタイプを分泌するB細胞の頻度を求める。この情報を用いてアレルゲン感受性を診断し、アレルギー免疫療法中の免疫変化をモニタリングする。
サイトカイン検出感度の増大およびアッセイ1回あたりのサイトカイン数の拡大
アッセイの感度を増大させるために、ローリングサークル増幅(RCA)(Schweitzer, et al., 2002 Nat Biotechnol, 20:359-365)を用いて、アッセイ1回あたり複数の種類のサイトカインを検出する。RCAの利点は、抗体からの単一シグナルを増幅可能なDNA分子に変換することである(図14)。検出抗体を異なる蛍光色で標識する代わりに、検出抗体を異なるプライマーで標識する(図15)。環状DNAは、2つの部分を用いて構築される。1つの部分は保存配列であり、全ての環状DNAにおいて同一である。別の部分は、それぞれのサイトカインの検出抗体に結合している特異的プライマーに相補的である。
Claims (20)
- 以下の工程を含む、被験体における分泌型サイトカインプロファイルを決定する方法:
少なくとも1つのマイクロウェルをマイクロウェルアレイに備える成形可能な平板(moldable slab)の上に堆積された、被験体由来の生きた末梢血単核球細胞の懸濁液を提供する工程であって、該マイクロウェルアレイにおける少なくとも1つのマイクロウェルは、ナノリットル以下の体積中に単一細胞を含有する、工程;
該細胞の分泌型サイトカインにそれぞれが結合する少なくとも2種類の検出剤で前処理された基板と、該マイクロウェルアレイとを接触させる工程;
該基板上にある該分泌型サイトカインのレベルを測定する工程であって、該レベルは該単一細胞の分泌型サイトカインの量に対応する、工程;および
該単一細胞由来のそれぞれの分泌型サイトカインの分泌速度を決定し、それによって、分泌型サイトカインプロファイルを決定する、工程;
該分泌型サイトカインプロファイルにおける動的変化を測定する工程をさらに含む、方法。 - 分泌型サイトカインが、Th1、Th2、Th9、Th17、またはThサイトカインである、請求項1記載の方法。
- 基板が少なくとも3種類の検出剤で前処理された基板である、請求項1記載の方法。
- 基板が少なくとも4種類の検出剤で前処理された基板である、請求項3記載の方法。
- 分泌型サイトカインが、IL-17、IL-10、IL-4、およびIFN-γからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 分泌型サイトカインがTヘルパー2(Th2)サイトカインである、請求項1記載の方法。
- 分泌型サイトカインが、IL-4、IL-5、IL-13、およびIL-9を含む、請求項1記載の方法。
- 分泌型サイトカインが、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)またはTh1 サイトカインである、請求項1記載の方法。
- 分泌型サイトカインが、IFNγ、MIP-1β、TNFα、パーフォリン、およびIL-2を含む、請求項1記載の方法。
- 末梢血単核球細胞を成形可能な平板上に堆積させる前に刺激する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 疑いのあるアレルゲンまたは既知のアレルゲンで末梢血単核球細胞を刺激する、請求項10記載の方法。
- 単一細胞の表現型または系列を決定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- CD4またはCD8が単一細胞の表面上に発現しているか否かを決定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- アレルゲンが食品である、請求項11記載の方法。
- 食品が、乳、卵、ピーナッツ、ツリーナッツ(tree nut)、魚、ダイズ、コムギ、卵製品、豆果、海産物、または貝・甲殻類である、請求項14記載の方法。
- アレルゲンが薬物である、請求項11記載の方法。
- 薬物が、アモキシシリン、ペニシリン、サルファ剤、バルビツレート、抗痙攣剤、インシュリン、またはヨウ素である、請求項16記載の方法。
- アレルゲンが、塵埃、花粉、ペットの鱗屑、ラテックス、塩素、または昆虫刺咬に関連する毒液である、請求項11記載の方法。
- アレルゲンが、スズメバチ、ヒアリ(fire ant)、またはハチ刺されに由来する、請求項11記載の方法。
- 分泌型サイトカインが4つの異なるサイトカインまでの分泌型サイトカインである、請求項1記載の方法。
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