WO2018179735A1 - 細胞の生産能力を分析するためのデバイス、細胞の生産能力を分析するための装置、細胞の生産能力を分析する方法及び細胞の生産能力を分析するためのシステム - Google Patents
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Definitions
- the present invention relates to a device, an apparatus, and a system for analyzing cell production capacity, and a method for analyzing cell production capacity.
- cytokines protein factors that are important for regulating immune responses. Examining the amount of cytokines secreted from cells and the cells themselves secreting cytokines is important for elucidating regulatory mechanisms, and many techniques for measuring substances secreted from cells have been devised.
- Examples of techniques for measuring cell secretion include ELISA, flow-cytometry (FCM), intracellular cytokine assay. These assays are so-called endpoint assays that measure secreted material after stimulating and activating cells.
- Enzyme-Linked ImmunoSpot can be cited as a technique for measuring the secretion of cells that has been frequently used in recent years (Patent Document 2).
- ELISpot Enzyme-Linked ImmunoSpot
- cells are stimulated by plating on a support to which secretions bind. Secretions from the cells are bound to the support. After a certain period of time, the cells are removed and the support is stained. The amount of secretions can be estimated from the spots revealed by staining.
- ELISpot is limited to evaluation at the end point as in ELISA and FCM, and cannot measure changes over time in secretion from cells. Furthermore, since feedback of secretion works in the same way as FCM intracellular cytokine assay, even if the amount of secretion is measured, there is doubt about the biological significance of the measurement result. Moreover, since cells are removed during analysis, identification, additional analysis, and the like cannot be performed for individual cells. Furthermore, contamination of the cell mass during the assay is unavoidable, and confirmation of the contamination is difficult.
- this technology A channel through which a sample containing cells flows, A cell capture section for capturing the cells; A cell product binding unit to which a cell product produced by the cells captured by the cell capturing unit is combined; A flow path through which the reagent flows, The cell product binding part intersects the flow path through which the reagent flows, A device for analyzing cell production capacity is provided.
- the cell may be a single cell and / or a cell mass. Moreover, the downstream side of the cell capture part is contracted, and the single cell and / or cell mass can be held.
- the cell capturing part may be connected to a cell stimulating substance introducing part for introducing a cell stimulating substance.
- the device of the present technology may include a plurality of the cell product binding units.
- the cell product may be a biological material selected from the group consisting of nucleic acids, proteins and exosomes.
- a molecule that specifically binds to a biological substance selected from the group consisting of the nucleic acid, protein, and exosome can be immobilized.
- the reagent may be a cell product detection reagent and / or a washing reagent.
- this technology A device for analyzing cell production capacity, A flow path through which a sample containing cells flows, a cell capture unit that captures the cells, a cell product binding unit that binds cell products produced by the cells captured by the cell capture unit, and a reagent A device for analyzing the production capacity of cells, wherein the cell product binding part intersects the flow channel through which the reagent flows,
- An apparatus comprising: a liquid flow control unit that controls a liquid flow of a cell capture unit and / or a cell product coupling unit of the device; and a detection unit that detects a cell product coupled to the cell product coupling unit of the device.
- the apparatus may further include an analysis unit that analyzes data acquired by the detection unit.
- this technology A method of analyzing cell production capacity, A flow path through which a sample containing cells flows, a cell capture unit that captures the cells, a cell product binding unit that binds cell products produced by the cells captured by the cell capture unit, and a reagent
- the cell product binding portion uses a device for analyzing the production capacity of the cells, wherein the flow channels through which the reagent flows intersect, and the following steps (A) to (G) : (A) introducing the sample containing the cells into the flow path; (B) capturing the cells in the cell capture unit; (C) introducing the cell product produced by the cell into the cell product binding unit while holding the cell in the cell capture unit; (D) introducing a cell product detection reagent bound to the cell product binding portion into the flow path through which the reagent flows; (E) detecting a cell product to which the detection reagent is bound; (F) A method including a step of analyzing the detection data acquired in the step (E), and (G) a step of repeatedly performing the step
- this technology A system for analyzing cell production capacity, A flow path through which a sample containing cells flows, a cell capture unit that captures the cells, a cell product binding unit that binds cell products produced by the cells captured by the cell capture unit, and a reagent
- a device for analyzing the production capacity of the cell, the cell capture unit and / or the cell product of the device, wherein the cell product binding unit intersects the channel through which the reagent flows A liquid flow control unit for controlling the liquid flow of the binding unit, and a device unit for analyzing the production capacity of the cell, including a detection unit for detecting the cell product coupled to the cell product coupling unit;
- An apparatus control unit having a program for causing the apparatus unit to execute liquid flow control and detection by the liquid flow control unit;
- a system is provided.
- the present technology it is possible to analyze the production capacity of various substances such as a single cell or a cell mass by measuring the secretion amount of a secretion from a cell over time.
- the effects described here are not necessarily limited, and may be any of the effects described in the present disclosure.
- FIG. 1 is a schematic diagram illustrating one embodiment of a device for analyzing cell production capacity of the present technology.
- FIG. 1 is a schematic diagram illustrating one embodiment of a device for analyzing cell production capacity of the present technology.
- FIG. 1 is a schematic view of an apparatus for analyzing cell production capacity of the present technology.
- FIG. It is a figure which shows the process of the method of analyzing the production capacity of the cell of this technique. It is a figure which shows the process of the method of analyzing the production capacity of the cell of this technique.
- 1 is a schematic diagram of a system for analyzing cell production capacity of the present technology.
- FIG. 1 is a schematic diagram illustrating one embodiment of a device for analyzing cell production capacity of the present technology.
- FIG. 1 is a schematic diagram illustrating one embodiment of a device for analyzing cell production capacity of the present technology.
- FIG. 1 is a schematic diagram illustrating one embodiment of a device for analyzing cell production capacity of the present technology.
- FIG. 1 is a schematic view
- the device of the present technology is a device for measuring various cell products secreted from cells.
- the device can also be used for repeated measurement, and a single device can follow changes in the amount of cell products secreted over time. Therefore, the production capacity of the cell can be analyzed based on the data of the change over time of the secretion amount from the cell.
- the cell may be a single cell or a cell mass in which a plurality of cells are collected. In the case of a single cell, production capacity can be analyzed for individual cells, so that the results of the analysis, for example, select cells with high production capacity, and further identification, analysis, proliferation, efficient production of cell products and The extraction or the like can be performed.
- a cell may refer to a single cell or a cell mass, or may refer to both.
- the device of the present technology can be formed of a material such as plastic, glass, or silicon.
- a transparent material is advantageous for observation and image acquisition with a magnifying glass, a microscope, a solid-state imaging device, and the like.
- Cell Products any substance produced by cells can be measured.
- cell products secreted from cells are preferable, and examples thereof include proteins, nucleic acids, carbohydrates, lipids, exosomes, and extracellular vesicles.
- proteins include cytokines, membrane proteins, extracellular matrix, enzymes, complements, antibodies, and the like.
- nucleic acid examples include genomic DNA, cDNA, genomic RNA, mRNA, ribosomal RNA, tRNA, ncRNA, tmRNA, miRNA, siRNA and the like.
- sugars include ribose, deoxyribose, galactose, mannose, glucosamine, galactosamine, acetyl or glycolyl derivatives of neuraminic acid, L-fucose, glucuronic acid, L-iduronic acid and the like.
- lipid examples include phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylinositol phosphate, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, and sphingolipid.
- Exosomes include many endosome-binding proteins and transmembrane protein families, and are composed of nucleic acids, proteins, and the like.
- extracellular vesicles include, in addition to exosomes, microvesicles composed of nucleic acids and proteins, and apoptotic bodies composed of nuclear fragments and organelles.
- This technology does not specifically limit cell products, but will be described below mainly using proteins and nucleic acids.
- Embodiment 1 (Basic configuration of device)
- the device for analyzing the cell production capacity of this technology is: (1) a flow path through which a sample containing cells flows, (2) a cell capture unit for capturing cells, (3) a cell product binding unit to which a cell product produced by the cells captured by the cell capturing unit is combined; (4) It has at least a flow path through which the reagent flows. Furthermore, (5) A lead-in flow path connected to a flow path through which the sample containing the cells of (1) flows, (6) It is possible to have an external channel connected to the pull-in channel of (5) above.
- FIG. 1 Basic configuration of device
- the device for analyzing the cell production capacity of this technology is: (1) a flow path through which a sample containing cells flows, (2) a cell capture unit for capturing cells, (3) a cell product binding unit to which a cell product produced by the cells captured by the cell capturing unit is combined; (4) It has at least a flow path through which the reagent flows. Furthermore, (5) A lead-in flow
- a sample introduction unit is installed upstream of the flow path 11 through which a sample containing cells flows.
- the cell 1 flows through the flow path 11 from left to right.
- This flow can be created, for example, by installing and opening and closing the liquid flow control units V1 and V2 outside or upstream of the channel 11 of the device.
- the liquid flow control unit is, for example, a valve.
- the cell capture part 12 is a site
- the pull-in channel 13 is connected to the external channel 16, and for example, a buffer or sample residual liquid may be flowed from the right to the left of the external channel 16 to generate a pull-in force.
- This flow can be created by installing and opening and closing the liquid flow control units V5 and V6 on the external upstream side or the external downstream side of the external flow path 16.
- the cell capturing unit 12 may use a force that allows cells to enter. For example, it is conceivable to generate an intrusion force by pressurizing the sample flowing through the flow path 11 using a liquid delivery device such as a pump.
- the size of the cell capture unit 12 can be appropriately changed according to the size of the cell or cell mass to be captured.
- the cells 1 captured by the cell capture unit 12 may be held and a cell stimulating substance or the like may be given by the cell capture unit 12.
- the cell stimulating substance can be introduced from upstream of the flow path 11.
- the cell stimulating substance introducing unit may be installed separately from the sample introducing unit upstream of the flow path 11, or the sample introducing unit may be used also as the cell stimulating substance introducing unit.
- Cells 1 stimulated with cell stimulants produce more cell product.
- the cell secretion stimulating substance varies depending on the type of cell, the type of secretion, and the like, and examples thereof include sugar, amino acid, fat, acid / alkali (pH adjusting agent).
- the cell 1 may eventually be lysed and destroyed after the cell 1 produces and / or secretes the cell product.
- the product present in the cell 1 can be further analyzed by lysis and destruction.
- the cell lysate may be introduced into the cell capture unit 12 by installing the cell lysate introduction unit separately from the sample introduction unit and the cell stimulating substance introduction unit. It may be combined with the introduction part or the cell stimulating substance introduction part.
- Examples of the cell lysate include a liquid containing a nonionic, anionic, cationic or amphoteric surfactant.
- the pH of the cell lysate, the salt concentration, the temperature at the time of cell lysis, and the like can be appropriately set according to the cells.
- the lysis solution for E. coli include a lysis solution containing 50 mM Tris-HCl or Phosphate (pH 8.0), 150 mM NaCl, and 1 mM PMSF.
- examples of the method for destroying cells include sonication, electroporation, and crushing with glass beads. After cell lysis, it is preferable to inhibit the action of proteolytic enzymes and nucleolytic enzymes so that proteins and nucleic acids are not denatured or degraded.
- the cell product coupling part 15 is connected to the drawing flow path 13.
- One or a plurality of the cell product coupling part 15 and the drawing channel 13 may be arranged.
- a flow path 14 through which the reagent flows is arranged separately.
- the flow path 14 through which the reagent flows is designed such that the cell 1 captured by the cell capture unit 12 does not pass and the reagent flows to the cell product coupling unit 15.
- the pull-in channel 13 intersects so that the channel 14 through which the reagent flows intersects at the cell product coupling portion 15.
- a cell product detection reagent, a cleaning reagent, a buffer, and the like flow through the flow path 14 through which the reagent flows.
- the cell detection reagent, the buffer, and the like By adopting a structure in which the flow of the flow channel 14 and the cell product coupling portion 15 is different from the flow of the flow channel 11 and the cell capturing portion 12, the cell detection reagent, the buffer, and the like Without passing through the capture unit 12, the cell product can be flowed to the cell product coupling unit 15.
- liquid flow controllers V3 and V4 can be installed upstream and downstream of the flow path 14 to control the flow of reagents and buffers by opening and closing.
- a gate may be provided at the boundary between the cell product coupling portion 15 and the flow path 14 with a film, a wall, or the like to control the flow of the reagent, the buffer, or the like.
- a substance to which the cell product is bound is fixed to the cell product binding unit 15.
- the substance may be a substance that non-specifically binds to a cell product or a substance that specifically binds.
- the substance to which the cell product is non-specifically bound include various polymer resins, ion exchange resins, silica, aminated cellulose, and cyclodextrin copolymers.
- substances to which cell products are specifically bound include antibodies, complements, aptamers, molecular recognition polymers, nucleic acids, and compounds having an oleyl group.
- the immobilization of these substances to the cell product binding part 15 is well-known such as covalent bonding to the device surface, immobilization via a polymer, stamping method, immobilization to a surface activation site by light or plasma, etc.
- Technology can be used. For example, first, a polyethylene glycol solution having an amine reactive group at an appropriate concentration at the terminal is drawn into the passage 13 to coat the surface of the cell product binding portion 15. Next, for example, a preparation solution containing an antibody specific for the target cell product is passed through the flow path 14 through which the reagent flows. Thereby, an antibody can be fixed to the cell product binding part 15 coated with polyethylene glycol via polyethylene glycol.
- the secreted protein 31 binds to the antibody 21 immobilized on the cell product binding portion 15. Secreted proteins other than the target flow out to the external channel 16 through the drawing channel 13 downstream of the cell product binding unit 15.
- Secreted protein 31 is detected with a cell product detection reagent.
- the cell product detection reagent flows through the flow path 14 through which the reagent flows. The flow is adjusted by the liquid flow controllers V3 and V4. In FIG. 1, the cell product detection reagent flows through the flow path 14 from right to left.
- the reagent for detecting a cell product contains, for example, a detection compound such as a labeled detection antibody or nucleic acid for detecting the secreted protein 31.
- a detection compound such as a labeled detection antibody or nucleic acid for detecting the secreted protein 31.
- the label include fluorescent dyes, biotin, enzymes, bioluminescent compounds, chemiluminescent compounds, and radioisotopes, and are not particularly limited, but those that do not affect the cell 1 are preferable.
- the detection with the label can be performed using, for example, a known label detection device, an image acquisition device, or the like.
- a washing reagent is allowed to flow through the flow path 14 to remove the cell product 13 bound to the cell product binding portion 15, and further, the cell product 13 produced from the cell 1 is removed.
- the detection with a label by binding to the cell product binding unit 14 may be repeated a plurality of times.
- Embodiment 2 (Applied configuration of device)
- the first embodiment is a device for analyzing one kind of cell product
- the second embodiment is an example of a device for analyzing two kinds of cell products.
- secreted proteins and mRNA fragments will be described as examples. Needless to say, three or more types of cell products can be analyzed by applying the present technology.
- the cell 1, the flow channel 11, the liquid flow control units V1 and V2, the cell capture unit 12, the drawing flow channel 13, the external flow channel 16, and the liquid flow control units V5 and V6 are the same as in the first embodiment.
- the cell product coupling part 15 is divided into two parts 15a and 15b along the flow direction of the flow path 14 through which the reagent flows.
- An antibody 21 that specifically binds to the secreted protein 31 is immobilized on the cell product binding portion 15a, and an RNA fragment 22 complementary to the mRNA fragment 32 or a specific aptamer or the like is fixed to the cell product binding portion 15b. Is fixed.
- the substance to be immobilized may be applied separately, or may be physically separated by installing a wall or a membrane. Accordingly, the flow path 14 through which the reagent flows may be divided into two.
- the cell 1 captured by the cell capturing unit 12 is naturally or stimulated by a cell stimulating substance to produce and release a secreted protein 31.
- the secreted protein 31 reaches the cell product binding portion 15a through the drawing channel 13.
- the secreted protein 31 specifically binds to the antibody immobilized on the cell product binding portion 15a.
- the secreted protein 31 other than the target flows out to the external channel 16 through the drawing channel 13 downstream of the cell product binding portion 15a.
- the cell 1 captured by the cell capturing unit 12 is preferably lysed or destroyed, and the mRNA fragment 32 is taken out.
- the mRNA fragment 32 reaches the cell product binding portion 15b through the drawing channel 13.
- the mRNA fragment 32 binds to an RNA fragment or the like immobilized on the cell product binding portion 15b.
- the mRNA fragment 32 other than the target flows out to the external channel 16 through the drawing channel 13 downstream of the cell product binding portion 15b.
- a labeled detection antibody for detecting the secreted protein 31 and a labeled compound for detecting the mRNA fragment 32 flow.
- the labeled detection antibody and the labeled compound may be flowed simultaneously in the flow path 14 through which the reagent flows, or may be flowed separately.
- the label detection antibody and the label compound bind to the secreted protein 31 and the mRNA fragment 32, respectively, and the excess is washed away to the external channel 16 with a buffer or a washing reagent. Thereafter, the secreted protein 31 and the mRNA fragment 32 are detected by a label detection device, an image acquisition device or the like.
- the label is a fluorescent dye
- the detection antibody and the compound are preferably labeled with a dye that emits excitation / fluorescence at different wavelengths.
- the secreted protein 31 and the mRNA fragment 32 are detected, they can be clearly distinguished and detected. Further, it is also possible to detect the excited location by irradiating with excitation light. According to this, it becomes possible to distinguish the detected object.
- the target cell product is a nucleic acid such as the mRNA fragment 32
- the mRNA fragment 32 bound to the cell product binding portion 15b may be amplified. Therefore, it is preferable to install a temperature control unit that performs temperature control in a known PCR technique. After amplification by PCR, nucleic acid may be further extracted by an installed nucleic acid extraction unit.
- An apparatus for analyzing cell production capacity of the present technology includes the device, a liquid flow control unit installed outside a flow path of the device, and a cell product coupled to a cell product coupling unit of the device. And a detecting unit for detecting. Further, an analysis unit may be included.
- FIG. 1 An example of the overall configuration of the apparatus is shown in FIG.
- a device 101 for analyzing the production capacity of cells is connected to a flow path through which a sample containing cells flows, a flow path through which a reagent flows, and an external flow path.
- a sample introduction unit 102 is installed on the upstream side (left side in FIG. 3) of the device 101, and an outflow unit 103 is installed on the downstream side (right side in FIG. 3).
- a reagent introduction unit 104 is installed on the upstream side (right side in FIG. 3) of the device 101, and an outflow unit 103 is installed on the downstream side (left side in FIG. 3).
- a liquid flow control unit is installed on the upstream side and the downstream side of the device 101 in the flow path for the sample containing cells, the flow path for the reagent, and the external flow path.
- a valve V is adopted, and the flow path is pressurized and / or depressurized by opening and closing the valve to create a liquid flow.
- the device 101 for analyzing the cell production capacity is connected to the detection unit 105.
- the detection unit 105 is, for example, an apparatus that detects fluorescence in the device 101, an image acquisition apparatus, or the like. Specific examples of the apparatus include a phase contrast microscope, a fluorescence microscope, a CCD, and a CMOS.
- the detection unit 105 may scan the device 101 to detect each cell capture unit 12 and each cell product coupling unit 14 in a one-dimensional manner, or may include all the cell capture units 12 or all the cell product coupling units 14. May be detected at once, or the entire device 101 may be detected at once in a two-dimensional manner.
- the detection unit 105 is connected to the analysis unit 106.
- the analysis unit 106 analyzes the data obtained by the detection unit 105. For example, if the data obtained by the detection unit 105 is fluorescence image data, image processing of the data can be performed. Specifically, the image processing includes contrast adjustment, image threshold segmentation, noise processing, border elimination, and the like.
- the analysis unit 106 calculates the cell production capability of the cell 1 captured by the cell capture unit 12 based on the obtained data.
- the data and analysis results obtained here may be further accumulated in a storage unit installed.
- the device for analyzing the cell production capacity of the present technology can easily replace the device 101.
- the device 101 has, for example, a chip shape or a cassette shape, and may be disposable or recycled.
- a cell preselection unit and a cell post-selection unit may be included in addition to the above configuration.
- the cell preselection unit selects a cell based on the size and type of the cell before flowing the sample containing the cell through the flow path 11. For example, cells can be selected using flow cytometry.
- the cell post-selection unit selects a cell having a desired ability based on the data after detection and analysis. For example, a desired cell is identified, and the cell is marked with a reagent that can be selected by light. Thereafter, the flow of the sample channel 11 is controlled by a valve operation, and all the cells captured by the cell capture unit 12 are discharged and collected from the cell capture unit 12, and the collected liquid is subjected to flow cytometry to obtain desired cells. Can be obtained. Alternatively, unnecessary cells captured by the cell capture unit 12 are destroyed by irradiating a laser, the unnecessary cells are caused to flow through the external flow path 16, and the flow of the desired flow path in the sample flow path 11 is controlled by valve operation.
- desired cells captured by the cell capture unit 12 can be discharged from the cell capture unit 12 and collected.
- desired cells captured by the cell capture unit 12 can be discharged from the cell capture unit 12 and collected.
- all the cells captured by the cell capturing unit 12 are discharged from the cell capturing unit 12
- only desired cells are traced.
- the flow is controlled by valve operation so that desired cells and unnecessary cells can be sorted into two ways of the Y-shaped flow path. And can be recovered.
- the cell pre-selection unit and the cell post-selection unit may exist separately from the device for analyzing the cell production capability of the present technology, or may be incorporated in a device for analyzing the cell production capability. It may be connected to the device 101.
- the method for analyzing the cell production capacity of the present technology includes the following steps (A) to (G): (A) a step of introducing a sample containing the cells into the flow path (sample introduction step S101), (B) a step of capturing the cells in the cell capture unit (cell capture step S102), (C) a step of introducing a cell product produced by the cell into the cell product binding unit while maintaining the cell in the cell capture unit (cell product introduction step S104), (D) introducing a reagent for detecting a cell product bound to the cell product binding portion into a flow path through which the reagent flows (detection reagent introducing step S105); (E) a step of detecting a cell product to which the detection reagent is bound (cell product detection step S106), (F) a step of analyzing the detection data acquired in the step (E) (detection data analysis step S107), and (G) a step of repeating the steps (C) to (
- Embodiment 3 (S101 Sample introduction process) A sample containing cells is put into the sample introduction section 102 and introduced into the flow path 11 through which the sample containing cells flows.
- the cells can be, for example, lymphocytes, leukocytes, macrophages, granulocytes and the like sorted by flow cytometry, which is a cell preselection unit.
- the cells flowing in the flow path 11 through which the sample containing cells flows are captured by the cell capture unit 12.
- the capture is performed, for example, by applying a reduced pressure to the drawing channel 13 and sucking the cells into the cell capture unit 12.
- Cells that have not been captured are removed by washing the flow path 11 and the cell capture unit 12 with a buffer, a washing reagent, or the like. It is preferable to continue to apply a reduced pressure, for example, to the cell capture unit 12 so that the captured cells 1 do not flow out of the cell capture unit 12 during washing.
- a cell stimulation step can be performed in which a cell stimulating substance is allowed to act on the captured cells 1.
- Cell stimulation is performed by flowing a cell stimulating substance through the flow path 11.
- the captured cells 1 produce and secrete cell products over time, either naturally or by stimulation with cell stimulants.
- the secreted cell product enters the cell product coupling unit 15 from the cell capturing unit 12 through the drawing channel 13.
- An antibody or the like that specifically binds to the cell product is immobilized on the cell product binding unit 15, and the cell product binds to the cell product binding unit 15.
- the cell 1 when the cell 1 is a lymphocyte, interleukin-2 is secreted, and the interleukin-2 binds to the anti-interleukin-2 antibody immobilized on the cell product binding portion 15 through the drawing channel 13. To do. During this time, the lymphocytes of the cell capture unit 12 are preferably held in the cell capture unit 12 by suction as described above.
- cell products that have not been bound to the cell product coupling portion 15 are removed, for example, by flowing a buffer or a washing reagent through the pull-in channel 13 or the channel 14 through which the reagent flows.
- the cell product introduction step is preferably performed at a predetermined time T1 after cell stimulation. Thereby, the production ability and secretion ability with time of the captured cell 1 can be measured.
- a labeled antibody which is a detection reagent
- the labeled antibody specifically binds to the cell product bound to the cell product binding portion 15 to form an immobilized antibody-cell product-labeled antibody sandwich.
- the labeled antibody that has not been bound is removed, for example, by flowing a buffer or a washing reagent through the drawing channel 13 or the channel 14 through which the reagent flows.
- the cell product binding unit 15 is irradiated with excitation light, and fluorescence emitted from the labeled antibody is detected.
- the detection of fluorescence may be performed while scanning the cell product binding unit 15 or may be performed in a two-dimensional manner.
- the data obtained in the cell product detection process is analyzed. For example, the fluorescence intensity of each cell product binding portion is measured from the fluorescence image. Based on the measurement data, the production capacity and secretion capacity of the corresponding captured cells 1 are calculated. For the calculation, a calibration curve representing the relationship between the cell product concentration obtained in advance and the fluorescence intensity may be used, or evaluation may be performed by looking at the change in fluorescence intensity over time in each cell 1.
- a washing reagent is introduced into the drawing channel 13 or the channel 14 through which the reagent flows so as to leave the immobilized antibody in the cell product binding portion 15 and remove the bound cell product and labeled antibody.
- You may perform a binder removal process.
- a stripping buffer 100 mM 2-mercaptoethanol, 2% SDS, 62.5 mM Tris-HCl pH 6.7
- a washing reagent for removing cell products and labeled antibodies.
- Cycle of S104-S107 A series of steps from the S103 cell stimulation step or S104 cell product introduction step to the S107 detection data analysis step may be repeated. Alternatively, a series of steps from the S103 cell stimulation step or S104 cell product introduction step to the S106 cell product detection step may be repeated, and finally the S107 detection data analysis step may be performed. In these cycles, the binder removal step may be included. Note that the cycle of S104 to S107 is an example. For example, in the cycle of S106-S107, it is possible to obtain the cell productivity per unit time by differentiating from the increase of the fluorescence signal.
- a desired cell 1 is identified based on the analysis result obtained in the S107 detection data analysis step.
- the desired cell 1 is, for example, a cell whose detection results before and after cell stimulation have changed significantly.
- the desired cell 1 identified by the S108 cell identification step is collected from the cell capture unit 12.
- an address is given to each cell capture unit in advance, and the capillary faces the address where the desired cell 1 is captured, and the desired cell 1 is sequentially sucked by the capillary to obtain individual containers.
- Embodiment 4 is obtained by adding a cell lysis step and the like to Embodiment 3. First, the steps from the S101 sample introduction process to the S107 detection data analysis process of Embodiment 3 are performed. Through the steps so far, analysis of the secreted protein from the capture cell 1 and the correlation between the secreted protein and the cell are performed.
- a cell lysate is introduced into the channel 11 in order to lyse the captured cells 1.
- the cell lysate flows from the flow path 11 to the cell capture unit 12, and the cells 1 are lysed to extract a nucleic acid, for example, mRNA.
- the S111 nucleic acid introduction step is a step corresponding to the S104 cell product introduction step of Embodiment 3.
- the extracted mRNA binds complementarily or specifically to the nucleic acid, aptamer or the like immobilized on the cell product binding portion 15b. During binding, enzyme addition and temperature control can be performed.
- the mRNA is amplified.
- an amplification reagent such as a DNA polymerase can be introduced into the flow path 14 through which the reagent flows, and the temperature can be controlled for amplification.
- S113 Nucleic acid recovery process Collect the amplified mRNA.
- a known technique can be used for the recovery.
- nucleic acid recovery beads, nucleic acid precipitation methods, and the like can be used.
- the recovered mRNA can be sequenced by a known sequencing method. By sequencing, proteins and the like that are highly expressed in the cell 1 can be estimated.
- the type of mRNA is determined by comparing the sequence data of mRNA with a nucleic acid sequence database.
- a so-called bar coding technique can be applied from the S111 cell nucleic acid introduction step to the S116 cell productivity analysis step.
- the nucleic acid immobilized on the cell product binding unit 15b includes a nucleic acid sequence corresponding to the address so that the address of the cell can be specified.
- a nucleic acid including a unique code is immobilized on each of the cell product binding portions 15b.
- the mRNA fragment 32 is bound to the cell product binding portion 15b.
- a nucleic acid in which the unique code and the sequence contained in the mRNA fragment 32 are connected is synthesized.
- bond part 15b, and the nucleic acid containing the unique code fixed to it are tied.
- sequencing the mRNA bound to the immobilized nucleic acid it can be seen which cells 1 can express many types of proteins.
- the system 301 for analyzing the cell production capacity of the present technology includes the device 201 including the device 101 and the detection unit 105, preferably the analysis unit 106, and the apparatus control for controlling the apparatus 201 to analyze the cell production capacity. And a display unit 203 that shows data detected by the detection unit 105 and / or an analysis result of the analysis unit 106.
- the apparatus control unit 202 controls the movement of the liquid flow control unit V, the sample introduction unit 102, the reagent introduction unit 104, and the like of the device 101. Further, it is possible to feed back to the apparatus 201 based on the detection result and the analysis result.
- the device control unit 202 is a computer, for example.
- the computer is loaded with a program, and the program may be stored in a recording medium such as a magnetic disk, an optical disk, a magneto-optical disk, or a flash memory, or distributed via a network to execute control of the apparatus 201. To do.
- Display unit 203 displays detection data, analysis results, and the like.
- the display unit 203 is a display, a printer, or the like.
- the display unit 203 may be equipped with a storage medium to record data with time.
- this technique can also take the following structures.
- the cell product is a biological material selected from the group consisting of nucleic acids, proteins, and exosomes.
- the cell product binding part is any one of [1] to [6], wherein a molecule that specifically binds to a biological substance selected from the group consisting of the nucleic acid, protein, and exosome is immobilized. Device described in.
- reagent is a cell product detection reagent and / or a washing reagent.
- An apparatus for analyzing cell production capacity A flow path through which a sample containing cells flows, a cell capture unit that captures the cells, a cell product binding unit that binds cell products produced by the cells captured by the cell capture unit, and a reagent
- the apparatus further including an analysis unit that analyzes data acquired by the detection unit.
- a method for analyzing cell production capacity A flow path through which a sample containing cells flows, a cell capture unit that captures the cells, a cell product binding unit that binds cell products produced by the cells captured by the cell capture unit, and a reagent
- the cell product binding portion uses a device for analyzing the production capacity of the cells, wherein the flow channels through which the reagent flows intersect, and the following steps (A) to (G) : (A) introducing the sample containing the cells into the flow path; (B) capturing the cells in the cell capture unit; (C) introducing the cell product produced by the cell into the cell product binding unit while holding the cell in the cell capture unit; (D) introducing a cell product detection reagent bound to the cell product binding portion into the flow path through which the reagent flows; (E) detecting a cell product to which the detection reagent is bound; (F) The method including the step of analyzing
- a system for analyzing cell production capacity A flow path through which a sample containing cells flows, a cell capture unit that captures the cells, a cell product binding unit that binds cell products produced by the cells captured by the cell capture unit, and a reagent
- a liquid flow control unit for controlling the liquid flow of the binding unit, and a device unit for analyzing the production capacity of the cell, including a detection unit for detecting the cell product coupled to the cell product coupling unit;
- An apparatus control unit having a program for causing the apparatus unit to execute liquid flow control and detection by the liquid flow control unit;
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Abstract
本発明は、細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試料が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイスを提供する。
Description
本発明は、細胞の生産能力を分析するためのデバイス、装置及びシステム、並びに細胞の生産能力を分析する方法に関する。
細胞から分泌される物質の中には、細胞間コミュニケーションに重要な物質が種々ある。例えば、サイトカインと呼ばれるタンパク性因子は、免疫応答の調節等に重要である。サイトカイン等が細胞から分泌される量やサイトカイン等を分泌する細胞そのものを調べることは調節機構の解明に重要であり、細胞から分泌される物質を測定するための技術が多く考案されてきた。
細胞の分泌を測るための技術として、例えばELISA、Flow-cytometry (FCM) intracellular cytokine assayが挙げられる。これらのアッセイ法は、細胞を刺激して活性化させた後、分泌された物質を測定する、いわゆるエンドポイントアッセイである。
FCM intracellular cytokine assayのアッセイ法では、分泌物の細胞からの排出を抑えるため又は分泌物を細胞近辺に留めるために「カプセル化」することで、個々の細胞が所定の時間内に生産した分泌物を測定することができる（特許文献１）。
また、近年よく使われている細胞の分泌を測るための技術として、Enzyme-Linked ImmunoSpot (ELISpot) も挙げられる（特許文献２）。このアッセイ法では、細胞を、分泌物が結合する支持体上に撒いて刺激する。細胞からの分泌物は支持体に結合される。一定時間の経過後、細胞を除去し、支持体を染色する。染色により表れたスポットから分泌物の量を推定することができる。
しかしながら、ELISAやFCM intracellular cytokine assayでは、前述のようにエンド ポイントアッセイであるため、細胞からの分泌の経時的変化を測定することはできない。
特に、FCM intracellular cytokine assayは、カプセル化により分泌物を細胞の近辺に留めることになるため、フィードバックも働いてしまうので、細胞の分泌メカニズムに影響する。
特に、FCM intracellular cytokine assayは、カプセル化により分泌物を細胞の近辺に留めることになるため、フィードバックも働いてしまうので、細胞の分泌メカニズムに影響する。
また、ELISpotも、ELISAやFCMと同様にエンドポイントでの評価に限られ、細胞からの分泌の経時的変化を測定することができない。更に、FCM intracellular cytokine assayと同様に分泌のフィードバックが働くので、分泌量を測定したとしても、該測定結果の生物学的意義について疑義が生じる。また、分析時に細胞を除去するため、個々の細胞について、同定や追加の解析等を行うことができない。また更に、アッセイ時の細胞塊の混入が避けられず、その混入の確認も困難である。
上記課題解決のため、本技術は、
細胞を含有する試料が流れる流路と、
前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、
前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、
試薬が流れる流路と
を有し、
前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、
細胞の生産能力を分析するためのデバイスを提供する。
前記細胞は、単一細胞及び／又は細胞塊であり得る。
また、前記細胞捕獲部は、下流側が縮流しており、前記単一細胞及び／又は細胞塊を保持することができる。
前記細胞捕獲部は、細胞刺激物質を導入する細胞刺激物質導入部と連結していてもよい。
また、本技術のデバイスは、前記細胞生産物結合部を複数有してもよい。
また、前記細胞生産物は、核酸、タンパク質及びエクソソームからなる群から選択される生体物質であり得る。
そして前記細胞生産物結合部は、前記核酸、タンパク質及びエクソソームからなる群から選択される生体物質と特異的に結合する分子が固定化され得る。
更に、前記試薬は、細胞生産物検出用試薬及び／又は洗浄用試薬であり得る。
細胞を含有する試料が流れる流路と、
前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、
前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、
試薬が流れる流路と
を有し、
前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、
細胞の生産能力を分析するためのデバイスを提供する。
前記細胞は、単一細胞及び／又は細胞塊であり得る。
また、前記細胞捕獲部は、下流側が縮流しており、前記単一細胞及び／又は細胞塊を保持することができる。
前記細胞捕獲部は、細胞刺激物質を導入する細胞刺激物質導入部と連結していてもよい。
また、本技術のデバイスは、前記細胞生産物結合部を複数有してもよい。
また、前記細胞生産物は、核酸、タンパク質及びエクソソームからなる群から選択される生体物質であり得る。
そして前記細胞生産物結合部は、前記核酸、タンパク質及びエクソソームからなる群から選択される生体物質と特異的に結合する分子が固定化され得る。
更に、前記試薬は、細胞生産物検出用試薬及び／又は洗浄用試薬であり得る。
また、本技術は、
細胞の生産能力を分析するための装置であって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイス、
前記デバイスの細胞捕獲部及び／又は細胞生産物結合部の液流を制御する液流制御部、及び
前記デバイスの細胞生産物結合部に結合された細胞生産物を検出する検出部
を有する装置を提供する。
前記装置は、前記検出部により取得されたデータを解析する解析部を更に有してもよい。
細胞の生産能力を分析するための装置であって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイス、
前記デバイスの細胞捕獲部及び／又は細胞生産物結合部の液流を制御する液流制御部、及び
前記デバイスの細胞生産物結合部に結合された細胞生産物を検出する検出部
を有する装置を提供する。
前記装置は、前記検出部により取得されたデータを解析する解析部を更に有してもよい。
また、本技術は、
細胞の生産能力を分析する方法であって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイスを用い、以下の工程（Ａ）～（Ｇ）：
（Ａ）前記細胞を含有する試料を前記流路に導入する工程、
（Ｂ）前記細胞を前記細胞捕獲部に捕獲する工程、
（Ｃ）前記細胞を前記細胞捕獲部に保持したまま、前記細胞が生産した細胞生産物を前記細胞生産物結合部に導入する工程、
（Ｄ）前記細胞生産物結合部に結合した細胞生産物の検出用試薬を前記試薬が流れる流路に導入する工程、
（Ｅ）前記検出用試薬が結合した細胞生産物を検出する工程、
（Ｆ）前記工程（Ｅ）で取得された検出データを解析する工程、及び
（Ｇ）前記工程（Ｃ）から工程（Ｆ）を繰り返し行う工程
を含む方法を提供する。
ここで、前記工程（Ｂ）と工程（Ｃ）との間に、前記工程（Ｂ）で捕獲された細胞に細胞刺激物質を適用する工程を更に含んでもよい。
細胞の生産能力を分析する方法であって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイスを用い、以下の工程（Ａ）～（Ｇ）：
（Ａ）前記細胞を含有する試料を前記流路に導入する工程、
（Ｂ）前記細胞を前記細胞捕獲部に捕獲する工程、
（Ｃ）前記細胞を前記細胞捕獲部に保持したまま、前記細胞が生産した細胞生産物を前記細胞生産物結合部に導入する工程、
（Ｄ）前記細胞生産物結合部に結合した細胞生産物の検出用試薬を前記試薬が流れる流路に導入する工程、
（Ｅ）前記検出用試薬が結合した細胞生産物を検出する工程、
（Ｆ）前記工程（Ｅ）で取得された検出データを解析する工程、及び
（Ｇ）前記工程（Ｃ）から工程（Ｆ）を繰り返し行う工程
を含む方法を提供する。
ここで、前記工程（Ｂ）と工程（Ｃ）との間に、前記工程（Ｂ）で捕獲された細胞に細胞刺激物質を適用する工程を更に含んでもよい。
更に、本技術は、
細胞の生産能力を分析するためのシステムであって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイス、前記デバイスの細胞捕獲部及び／又は細胞生産物結合部の液流を制御する液流制御部、並びに前記細胞生産物結合部に結合された細胞生産物を検出する検出部を有する、細胞の生産能力を分析するための装置部と、
前記液流制御部による液流制御及び前記検出を前記装置部に実行させるためのプログラムを有する装置制御部と、
前記装置により得られた検出データ及び／又は検出データの解析結果を表示する表示部と、
を有するシステムを提供する。
細胞の生産能力を分析するためのシステムであって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイス、前記デバイスの細胞捕獲部及び／又は細胞生産物結合部の液流を制御する液流制御部、並びに前記細胞生産物結合部に結合された細胞生産物を検出する検出部を有する、細胞の生産能力を分析するための装置部と、
前記液流制御部による液流制御及び前記検出を前記装置部に実行させるためのプログラムを有する装置制御部と、
前記装置により得られた検出データ及び／又は検出データの解析結果を表示する表示部と、
を有するシステムを提供する。
本技術によれば、細胞からの分泌物の分泌量等を経時的に測定して、単一細胞や細胞塊の各種物質の生産能力を分析することができる。
なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．細胞の生産能力を分析するためのデバイス
１－１．細胞生産物
１－２．実施態様１（デバイスの基本構成）
１－３．実施態様２（デバイスの応用構成）
２．細胞の生産能力を分析するための装置
３．細胞の生産能力を分析する方法
３－１．実施態様３
３－２．実施態様４
４．細胞の生産能力を分析するためのシステム
１．細胞の生産能力を分析するためのデバイス
１－１．細胞生産物
１－２．実施態様１（デバイスの基本構成）
１－３．実施態様２（デバイスの応用構成）
２．細胞の生産能力を分析するための装置
３．細胞の生産能力を分析する方法
３－１．実施態様３
３－２．実施態様４
４．細胞の生産能力を分析するためのシステム
＜１．細胞の生産能力を分析するためのデバイス＞
本技術のデバイスは、細胞から分泌される各種細胞生産物の測定用デバイスである。該デバイスは繰り返し測定に使用することもでき、１個のデバイスで、細胞生産物の分泌量の変化を経時的に追うことができる。よって、細胞からの分泌量の経時的変化のデータに基づいて、細胞の生産能力を分析することができる。細胞は、単一細胞でもよいし、複数の細胞が集まった細胞塊でもよい。単一細胞の場合、個々の細胞について生産能力を分析できるので、分析の結果、例えば生産能力の高い細胞を選択し、該細胞について更なる同定、分析、増殖、細胞生産物の効率的生産及びその抽出等を行うことができる。
なお、本技術において細胞とは、単一細胞又は細胞塊を指すこともあるし、両方を指すこともある。
本技術のデバイスは、細胞から分泌される各種細胞生産物の測定用デバイスである。該デバイスは繰り返し測定に使用することもでき、１個のデバイスで、細胞生産物の分泌量の変化を経時的に追うことができる。よって、細胞からの分泌量の経時的変化のデータに基づいて、細胞の生産能力を分析することができる。細胞は、単一細胞でもよいし、複数の細胞が集まった細胞塊でもよい。単一細胞の場合、個々の細胞について生産能力を分析できるので、分析の結果、例えば生産能力の高い細胞を選択し、該細胞について更なる同定、分析、増殖、細胞生産物の効率的生産及びその抽出等を行うことができる。
なお、本技術において細胞とは、単一細胞又は細胞塊を指すこともあるし、両方を指すこともある。
本技術のデバイスは、例えば、プラスチック、ガラス、シリコン等の材料のもので形成され得る。また、透明材料であれば、拡大鏡、顕微鏡、固体撮像素子等での観察や画像取得に有利である。
１－１．細胞生産物
本技術においては、細胞が生産するあらゆる物質を測定対象とすることができる。特に、細胞から分泌される細胞生産物が好ましく、例えば、タンパク質、核酸、糖質、脂質、エクソソーム、細胞外小胞が挙げられる。
本技術においては、細胞が生産するあらゆる物質を測定対象とすることができる。特に、細胞から分泌される細胞生産物が好ましく、例えば、タンパク質、核酸、糖質、脂質、エクソソーム、細胞外小胞が挙げられる。
タンパク質としては、例えば、サイトカイン、膜タンパク質、細胞外マトリックス、酵素、補体、抗体等が挙げられる。
核酸としては、例えば、ゲノムDNA、cDNA、ゲノムRNA、mRNA、リボソームRNA、tRNA、ncRNA、tmRNA、miRNA、siRNA等が挙げられる。
糖質としては、例えば、リボース、デオキシリボース、ガラクトース、マンノース、グルコサミン、ガラクトサミン、ノイラミン酸のアセチル又はグリコリル誘導体、L-フコース、グルクロン酸、L-イズロン酸等が挙げられる。
脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールホスフェイト、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴ脂質等が挙げられる。
エクソソームは、エンドソーム結合タンパク質や膜貫通タンパク質ファミリーが多く含まれ、核酸、タンパク質等で構成される。
細胞外小胞としては、エクソソームの他に、核酸、タンパク質で構成される微小小胞体や、核断片、細胞小器官で構成されるアポトーシス小体が挙げられる。
本技術は細胞生産物を特に限定するものではないが、以下、タンパク質及び核酸を主例として説明する。
１－２．実施態様１（デバイスの基本構成）
本技術の細胞の生産能力を分析するためのデバイスは、
（１）細胞を含有する試料が流れる流路、
（２）細胞を捕獲する細胞捕獲部、
（３）細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部、
（４）試薬が流れる流路
を少なくとも有する。更に、
（５）上記（１）の細胞を含有する試料が流れる流路と連接する引き込み流路、
（６）上記（５）の引き込み流路と連結する外部流路
を有することができる。
以下、実施態様１を示す図１を参照しながら説明する。
本技術の細胞の生産能力を分析するためのデバイスは、
（１）細胞を含有する試料が流れる流路、
（２）細胞を捕獲する細胞捕獲部、
（３）細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部、
（４）試薬が流れる流路
を少なくとも有する。更に、
（５）上記（１）の細胞を含有する試料が流れる流路と連接する引き込み流路、
（６）上記（５）の引き込み流路と連結する外部流路
を有することができる。
以下、実施態様１を示す図１を参照しながら説明する。
（１）試料が流れる流路
細胞を含有する試料が流れる流路１１の上流には、試料導入部が設置されており、図１では、細胞１が流路１１を左から右へと流れる。この流れは、例えば、デバイスの流路１１の外部上流又は外部下流に液流制御部Ｖ１及びＶ２を設置して開閉することにより、作ることができる。液流制御部は、例えばバルブである。
細胞を含有する試料が流れる流路１１の上流には、試料導入部が設置されており、図１では、細胞１が流路１１を左から右へと流れる。この流れは、例えば、デバイスの流路１１の外部上流又は外部下流に液流制御部Ｖ１及びＶ２を設置して開閉することにより、作ることができる。液流制御部は、例えばバルブである。
（２）細胞捕獲部
細胞捕獲部１２は、流路１１に流れている細胞を捕獲する部位である。細胞を効率的に捕獲するには、細胞捕獲部１２に細胞を引き込む力を生じさせればよい。例えば、細胞捕獲部１２の下流側を縮流させて引き込み流路１３と連接させ、細胞捕獲部１２から引き込み流路１３へと試料の液を流すことにより、細胞が細胞捕獲部１２に引き込まれて保持される。
細胞捕獲部１２は、流路１１に流れている細胞を捕獲する部位である。細胞を効率的に捕獲するには、細胞捕獲部１２に細胞を引き込む力を生じさせればよい。例えば、細胞捕獲部１２の下流側を縮流させて引き込み流路１３と連接させ、細胞捕獲部１２から引き込み流路１３へと試料の液を流すことにより、細胞が細胞捕獲部１２に引き込まれて保持される。
更に、引き込み流路１３は、外部流路１６と連結しており、例えば、外部流路１６の右から左にバッファーや試料残液等を流して、引き込む力を生じさせてもよい。この流れは、外部流路１６の外部上流又は外部下流に液流制御部Ｖ５及びＶ６を設置して開閉することにより、作ることができる。
又は、他の細胞捕獲方法としては、細胞捕獲部１２において、細胞が入り込むような力を働かせてもよい。例えば、ポンプ等の送液装置を用いて流路１１を流れる試料に加圧することにより、入り込む力を生じさせることが考えられる。
なお、細胞捕獲部１２の大きさは、捕獲したい細胞又は細胞塊の大きさに合わせて適宜変更できる。
細胞捕獲部１２に捕獲された細胞１は保持されつつ、細胞捕獲部１２で細胞刺激物質等を与えられてもよい。細胞刺激物質は、流路１１の上流から導入することができる。例えば、流路１１の上流に細胞刺激物質導入部を試料導入部とは別に設置してもよいし、前記試料導入部を細胞刺激物質導入部との兼用としてもよい。
細胞刺激物質で刺激された細胞１は、細胞生産物をより多く生産する。
細胞分泌刺激物質は、細胞の種類や分泌物の種類等によって異なるが、例えば、糖、アミノ酸、脂肪、酸・アルカリ（pH調整剤）が挙げられる。
細胞分泌刺激物質は、細胞の種類や分泌物の種類等によって異なるが、例えば、糖、アミノ酸、脂肪、酸・アルカリ（pH調整剤）が挙げられる。
細胞１は、最終的には、細胞１が細胞生産物を生産及び／又は分泌した後に溶解、破壊してもよい。溶解、破壊により、細胞１内に存在する生産物について、更に分析することができる。
例えば、細胞溶解液は、細胞溶解液導入部を試料導入部や細胞刺激物質導入部とは別に設置して、細胞捕獲部１２に導入してもよいし、細胞溶解液導入部を、前記試料導入部又は前記細胞刺激物質導入部との兼用としてもよい。
例えば、細胞溶解液は、細胞溶解液導入部を試料導入部や細胞刺激物質導入部とは別に設置して、細胞捕獲部１２に導入してもよいし、細胞溶解液導入部を、前記試料導入部又は前記細胞刺激物質導入部との兼用としてもよい。
細胞溶解液として、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性又は両イオン性の界面活性剤を含む液が挙げられる。細胞溶解液のpH、塩濃度、及び細胞溶解時の温度等は、細胞に応じて適宜設定できる。
例えば、哺乳動物細胞用の細胞溶解液として、25 mM Tris-HCl（pH 7.6）、150 mM NaCl、1% NP-40、1% デオキシコール酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む溶解液、あるいは50mM Tris-HCl（pH 8.0）、150mM NaCl、1% IGEPAL(登録商標) CA-630、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDSを含む溶解液が挙げられる。大腸菌用の溶解液として、例えば、50 mM Tris-HCl or Phosphate（pH 8.0）、150 mM NaCl、1 mM PMSFを含む溶解液が挙げられる。
例えば、哺乳動物細胞用の細胞溶解液として、25 mM Tris-HCl（pH 7.6）、150 mM NaCl、1% NP-40、1% デオキシコール酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む溶解液、あるいは50mM Tris-HCl（pH 8.0）、150mM NaCl、1% IGEPAL(登録商標) CA-630、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDSを含む溶解液が挙げられる。大腸菌用の溶解液として、例えば、50 mM Tris-HCl or Phosphate（pH 8.0）、150 mM NaCl、1 mM PMSFを含む溶解液が挙げられる。
この他に、細胞を破壊するには、例えば、超音波処理、電気穿孔法、ガラスビーズによる破砕が挙げられる。
なお、細胞溶解後は、タンパク質や核酸を変性、分解等しないように、タンパク質分解酵素や核酸分解酵素の働きを阻害することが好ましい。
なお、細胞溶解後は、タンパク質や核酸を変性、分解等しないように、タンパク質分解酵素や核酸分解酵素の働きを阻害することが好ましい。
（３）細胞生産物結合部、及び（４）試薬が流れる流路
細胞生産物結合部１５は引き込み流路１３と連接している。細胞生産物結合部１５及び引き込み流路１３は、１つ又は複数配置されていてもよい。
一方、試薬が流れる流路１４が別に配置される。試薬が流れる流路１４は、細胞捕獲部１２に捕獲されている細胞１は通さず、試薬が細胞生産物結合部１５に流れるように設計されている。
例えば、引き込み流路１３には、試薬が流れる流路１４が細胞生産物結合部１５で交わるように交差している。試薬が流れる流路１４には、細胞生産物検出用試薬や洗浄用試薬、バッファー等が流れる。流路１４及び細胞生産物結合部１５の一連の流れが、流路１１及び細胞捕捉部１２の一連の流れと異なる流れになる構造を採用することにより、細胞検出用試薬やバッファー等は、細胞捕獲部１２を通らずに、細胞生産物結合部１５に流すことができる。
細胞生産物結合部１５は引き込み流路１３と連接している。細胞生産物結合部１５及び引き込み流路１３は、１つ又は複数配置されていてもよい。
一方、試薬が流れる流路１４が別に配置される。試薬が流れる流路１４は、細胞捕獲部１２に捕獲されている細胞１は通さず、試薬が細胞生産物結合部１５に流れるように設計されている。
例えば、引き込み流路１３には、試薬が流れる流路１４が細胞生産物結合部１５で交わるように交差している。試薬が流れる流路１４には、細胞生産物検出用試薬や洗浄用試薬、バッファー等が流れる。流路１４及び細胞生産物結合部１５の一連の流れが、流路１１及び細胞捕捉部１２の一連の流れと異なる流れになる構造を採用することにより、細胞検出用試薬やバッファー等は、細胞捕獲部１２を通らずに、細胞生産物結合部１５に流すことができる。
また、流路１４の外部上流及び外部下流に、液流制御部Ｖ３、Ｖ４を設置して、開閉により試薬やバッファー等の流れを制御することができる。また、細胞生産物結合部１５と流路１４の境目に膜や壁等でゲートを設け、試薬やバッファー等の流れを制御してもよい。
細胞生産物結合部１５には、細胞生産物が結合される物質が固定化されている。該物質は、細胞生産物と非特異的に結合する物質でも、特異的に結合する物質でもよい。
細胞生産物が非特異的に結合される物質として、例えば、各種高分子樹脂、イオン交換樹脂、シリカ、アミノ化セルロース、シクロデキストリン共重合体等が挙げられる。
また、細胞生産物が特異的に結合される物質として、例えば、抗体、補体、アプタマー、分子認識ポリマー、核酸、オレイル基を有する化合物が挙げられる。
細胞生産物が非特異的に結合される物質として、例えば、各種高分子樹脂、イオン交換樹脂、シリカ、アミノ化セルロース、シクロデキストリン共重合体等が挙げられる。
また、細胞生産物が特異的に結合される物質として、例えば、抗体、補体、アプタマー、分子認識ポリマー、核酸、オレイル基を有する化合物が挙げられる。
これらの物質の細胞生産物結合部１５への固定化は、デバイス表面への共有結合や、ポリマーを介した固定化、スタンピング法、光又はプラズマ等による表面活性化箇所への固定化等の公知技術を用いればよい。
例えば、まず、適切な濃度のアミン反応基を末端に有するポリエチレングリコール液を引き込み通路１３に流し、細胞生産物結合部１５の表面をコーティングする。次に、例えば標的の細胞生産物に特異的な抗体を含む調製液を、試薬が流れる流路１４に流す。これにより、ポリエチレングリコールでコーティングされた細胞生産物結合部１５に、ポリエチレングリコールを介して抗体を固定化できる。
例えば、まず、適切な濃度のアミン反応基を末端に有するポリエチレングリコール液を引き込み通路１３に流し、細胞生産物結合部１５の表面をコーティングする。次に、例えば標的の細胞生産物に特異的な抗体を含む調製液を、試薬が流れる流路１４に流す。これにより、ポリエチレングリコールでコーティングされた細胞生産物結合部１５に、ポリエチレングリコールを介して抗体を固定化できる。
このようにして製造された細胞生産物結合部１５には、標的の細胞生産物の例えば分泌タンパク質３１と特異的に結合する物質、例えば抗体２１が固定化されている。細胞捕獲部１２に保持された細胞１は、分泌タンパク質３１を放出し、該細胞生産物３１は引き込み流路１３を通って細胞生産物結合部１５に到達する。分泌タンパク質３１は、細胞生産物結合部１５に固定化された抗体２１に結合する。標的以外の分泌タンパク質等は、細胞生産物結合部１５の下流の引き込み流路１３を通って、外部流路１６に流出する。
分泌タンパク質３１は、細胞生産物検出用試薬で検出される。細胞生産物検出用試薬は、試薬が流れる流路１４を流れる。流れは液流制御部Ｖ３及びＶ４で調節される。図１では、細胞生産物検出用試薬は流路１４を右から左へと流れる。
細胞生産物検出用試薬は、例えば、分泌タンパク質３１検出用の標識した検出用抗体、核酸等の検出用化合物を含有する。標識物として、例えば蛍光色素、ビオチン、酵素、生物発光化合物、化学発光化合物、放射性同位体等が挙げられ、特に限定されないが、細胞１に影響を与えないものが好ましい。
標識物による検出は、例えば、公知の標識検出装置、画像取得装置等を用いて行うことができる。
標識物による検出は、例えば、公知の標識検出装置、画像取得装置等を用いて行うことができる。
なお、標識物による検出後、流路１４に洗浄用試薬を流し、細胞生産物結合部１５に結合していた細胞生産物１３を除去し、更に、細胞１から生産された細胞生産物１３を細胞生産物結合部１４に結合させて標識物で検出することを、複数回繰り返してもよい。
１－３．実施態様２（デバイスの応用構成）
以下、実施態様２を示す図２を参照しながら説明する。なお、前記実施態様１は１種類の細胞生産物を分析するためのデバイスであり、実施態様２は２種類の細胞生産物を分析するためのデバイスの例である。実施態様２における２種類の分析対象の細胞生産物として、分泌タンパク質、mRNA断片を例にして説明する。なお、いうまでもないが、本技術を応用して３種類以上の細胞生産物を分析することも可能である。
以下、実施態様２を示す図２を参照しながら説明する。なお、前記実施態様１は１種類の細胞生産物を分析するためのデバイスであり、実施態様２は２種類の細胞生産物を分析するためのデバイスの例である。実施態様２における２種類の分析対象の細胞生産物として、分泌タンパク質、mRNA断片を例にして説明する。なお、いうまでもないが、本技術を応用して３種類以上の細胞生産物を分析することも可能である。
細胞１、流路１１、液流制御部Ｖ１及びＶ２、細胞捕獲部１２、引き込み流路１３、外部流路１６、液流制御部Ｖ５及びＶ６は、前記実施態様１と同様である。
細胞生産物結合部１５は、試薬が流れる流路１４の流れ方向に沿って、１５ａと１５ｂの２つに分かれている。細胞生産物結合部１５ａには分泌タンパク質３１と特異的に結合する抗体２１が固定化されており、細胞生産物結合部１５ｂにはmRNA断片３２と相補的なRNA断片２２又は特異的なアプタマー等が固定化されている。細胞生産物結合部１５を２つに分けるには、このように固定化する物質を塗り分けてもよいし、壁や膜を設置して物理的に分けてもよい。
これに伴い、試薬が流れる流路１４も２つに分かれていてもよい。
細胞生産物結合部１５は、試薬が流れる流路１４の流れ方向に沿って、１５ａと１５ｂの２つに分かれている。細胞生産物結合部１５ａには分泌タンパク質３１と特異的に結合する抗体２１が固定化されており、細胞生産物結合部１５ｂにはmRNA断片３２と相補的なRNA断片２２又は特異的なアプタマー等が固定化されている。細胞生産物結合部１５を２つに分けるには、このように固定化する物質を塗り分けてもよいし、壁や膜を設置して物理的に分けてもよい。
これに伴い、試薬が流れる流路１４も２つに分かれていてもよい。
細胞捕獲部１２に捕獲された細胞１は、自然に又は細胞刺激物質で刺激されて、分泌タンパク質３１を生産、放出する。分泌タンパク質３１は、引き込み流路１３を通って細胞生産物結合部１５ａに到達する。分泌タンパク質３１は細胞生産物結合部１５ａに固定化された抗体と特異的に結合する。標的以外の分泌タンパク質３１は、細胞生産物結合部１５ａの下流の引き込み流路１３を通って外部流路１６に流出する。
また、細胞捕獲部１２に捕獲された細胞１を、好ましくは溶解又は破壊して、mRNA断片３２を取り出す。mRNA断片３２は、引き込み流路１３を通って細胞生産物結合部１５ｂに到達する。mRNA断片３２は細胞生産物結合部１５ｂに固定化されたRNA断片等と結合する。標的以外のmRNA断片３２は、細胞生産物結合部１５ｂの下流の引き込み流路１３を通って外部流路１６に流出する。
試薬が流れる流路１４には、分泌タンパク質３１検出用の標識した検出用抗体や、mRNA断片３２検出用の標識した化合物が流れる。標識検出用抗体や標識化合物は、試薬が流れる流路１４に同時に流してもよいし、別々に流してもよい。標識検出用抗体、標識化合物は、それぞれ分泌タンパク質３１、mRNA断片３２に結合し、余剰分はバッファーや洗浄用試薬で外部流路１６に洗い流される。その後、標識検出装置、画像取得装置等で分泌タンパク質３１、mRNA断片３２が検出される。
なお、標識物が例えば蛍光色素であれば、検出用抗体と化合物とには、別の波長で励起・蛍光を発する色素で標識することが好ましい。分泌タンパク質３１とmRNA断片３２を検出する際、明確に区別して検出することができる。
また、励起光を照射してスキャニングし、励起した箇所を特異的に検出することもできる。これによれば、検出物の区別が可能となる。
また、励起光を照射してスキャニングし、励起した箇所を特異的に検出することもできる。これによれば、検出物の区別が可能となる。
また、標的の細胞生産物がmRNA断片３２のような核酸の場合、細胞生産物結合部１５ｂに結合したmRNA断片３２を増幅してもよい。そのため、公知のPCR技術における温度制御を行う温度制御部を設置することが好ましい。PCRによる増幅後、更に設置された核酸抽出部により核酸抽出してもよい。
＜２．細胞の生産能力を分析するための装置＞
本技術の細胞の生産能力を分析するための装置は、前記デバイスと、デバイスの流路の外側に設置された液流制御部と、デバイスの細胞生産物結合部に結合された細胞生産物を検出する検出部と、を含む。更に解析部を含めてもよい。
本技術の細胞の生産能力を分析するための装置は、前記デバイスと、デバイスの流路の外側に設置された液流制御部と、デバイスの細胞生産物結合部に結合された細胞生産物を検出する検出部と、を含む。更に解析部を含めてもよい。
装置の全体的構成の例を図３に示す。
細胞の生産能力を分析するためのデバイス１０１は、細胞を含有する試料が流れる流路、試薬が流れる流路及び外部流路と連結している。細胞を含有する試料が流れる流路には、デバイス１０１の上流側（図３の左側）に試料導入部１０２、下流側（図３の右側）に流出部１０３が設置されている。試薬が流れる流路には、デバイス１０１の上流側（図３の右側）に試薬導入部１０４、下流側（図３の左側）に流出部１０３が設置されている。
また、細胞を含有する試料が流れる流路、試薬が流れる流路及び外部流路には、デバイス１０１の上流側、下流側に液流制御部が設置される。液流制御部として、例えばバルブＶを採用し、バルブの開閉で流路を加圧及び／又は減圧して液体の流れを作る。
細胞の生産能力を分析するためのデバイス１０１は、細胞を含有する試料が流れる流路、試薬が流れる流路及び外部流路と連結している。細胞を含有する試料が流れる流路には、デバイス１０１の上流側（図３の左側）に試料導入部１０２、下流側（図３の右側）に流出部１０３が設置されている。試薬が流れる流路には、デバイス１０１の上流側（図３の右側）に試薬導入部１０４、下流側（図３の左側）に流出部１０３が設置されている。
また、細胞を含有する試料が流れる流路、試薬が流れる流路及び外部流路には、デバイス１０１の上流側、下流側に液流制御部が設置される。液流制御部として、例えばバルブＶを採用し、バルブの開閉で流路を加圧及び／又は減圧して液体の流れを作る。
また、細胞の生産能力を分析するためのデバイス１０１は検出部１０５と連結する。検出部１０５は、例えば、デバイス１０１における蛍光等を検出する装置、画像取得装置等である。具体的な装置として、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、CCD、CMOS等が挙げられる。
検出部１０５は、デバイス１０１を走査して、各細胞捕獲部１２や各細胞生産物結合部１４を一次元的に検出してもよいし、細胞捕獲部１２全部又は細胞生産物結合部１４全部を一括で検出してもよいし、あるいはデバイス１０１全体を一括で二次元的に検出してもよい。
検出部１０５は、デバイス１０１を走査して、各細胞捕獲部１２や各細胞生産物結合部１４を一次元的に検出してもよいし、細胞捕獲部１２全部又は細胞生産物結合部１４全部を一括で検出してもよいし、あるいはデバイス１０１全体を一括で二次元的に検出してもよい。
更に、検出部１０５は解析部１０６と連結する。解析部１０６は、検出部１０５で得られたデータを解析する。
例えば、検出部１０５で得られたデータが蛍光画像データであれば、データの画像処理を行うことができる。画像処理は、具体的にはコントラスト調整、画像閾値セグメンテーション、ノイズ処理、ボーダー排除等が挙げられる。
解析部１０６は、得られたデータに基づいて、細胞捕獲部１２に捕獲された細胞１の細胞生産能力を算出する。
ここで得られたデータや解析結果は、更に設置された記憶部に蓄積されるようにしてもよい。
例えば、検出部１０５で得られたデータが蛍光画像データであれば、データの画像処理を行うことができる。画像処理は、具体的にはコントラスト調整、画像閾値セグメンテーション、ノイズ処理、ボーダー排除等が挙げられる。
解析部１０６は、得られたデータに基づいて、細胞捕獲部１２に捕獲された細胞１の細胞生産能力を算出する。
ここで得られたデータや解析結果は、更に設置された記憶部に蓄積されるようにしてもよい。
本技術の細胞の生産能力を分析するための装置は、デバイス１０１を容易に交換することができる。デバイス１０１は、例えばチップ状、カセット状になっており、ディスポーザブルにしてもよいし、リサイクルしてもよい。
また、図３には示していないが、上記構成の他に、細胞事前選択部、細胞事後選択部を含めてもよい。
細胞事前選択部は、流路１１に細胞を含有する試料を流す前に、細胞の大きさや種類等に基づいて細胞を選択する。例えばフローサイトメトリーを用いて細胞を選択することができる。
細胞事前選択部は、流路１１に細胞を含有する試料を流す前に、細胞の大きさや種類等に基づいて細胞を選択する。例えばフローサイトメトリーを用いて細胞を選択することができる。
細胞事後選択部は、検出、解析後、データに基づいて所望の能力を有する細胞を選択する。
例えば、所望の細胞を特定し、光で選択できる試薬を用いてその細胞にマーキングする。その後、バルブ操作で試料用流路１１の流れを制御して、細胞捕獲部１２に捕獲された細胞を全て細胞捕獲部１２から排出して回収し、回収液をフローサイトメトリーにかけて、所望の細胞を得ることができる。
又は、細胞捕獲部１２に捕獲された不要の細胞にレーザーを照射して破壊し、不要の細胞を外部流路１６に流し、所望の細胞をバルブ操作で試料用流路１１の流れを制御して、細胞捕獲部１２に捕獲された所望の細胞を細胞捕獲部１２から排出して回収することができる。
或いは、細胞捕獲部１２に捕獲された細胞を全て細胞捕獲部１２から排出する際、所望の細胞のみを追跡する。そして、例えばＹ字型の流路を設けた事後選択部に細胞が流入する際、所望の細胞と不要の細胞とをＹ字型の流路の二手に選別できるよう、バルブ操作で流れを制御して回収することもできる。
例えば、所望の細胞を特定し、光で選択できる試薬を用いてその細胞にマーキングする。その後、バルブ操作で試料用流路１１の流れを制御して、細胞捕獲部１２に捕獲された細胞を全て細胞捕獲部１２から排出して回収し、回収液をフローサイトメトリーにかけて、所望の細胞を得ることができる。
又は、細胞捕獲部１２に捕獲された不要の細胞にレーザーを照射して破壊し、不要の細胞を外部流路１６に流し、所望の細胞をバルブ操作で試料用流路１１の流れを制御して、細胞捕獲部１２に捕獲された所望の細胞を細胞捕獲部１２から排出して回収することができる。
或いは、細胞捕獲部１２に捕獲された細胞を全て細胞捕獲部１２から排出する際、所望の細胞のみを追跡する。そして、例えばＹ字型の流路を設けた事後選択部に細胞が流入する際、所望の細胞と不要の細胞とをＹ字型の流路の二手に選別できるよう、バルブ操作で流れを制御して回収することもできる。
なお、細胞事前選択部、細胞事後選択部は、本技術の細胞の生産能力を分析するための装置とは別に存在してもよいし、細胞の生産能力を分析するための装置に組み込まれ、デバイス１０１と連結していてもよい。
＜３．細胞の生産能力を分析する方法＞
本技術の細胞の生産能力を分析する方法は、以下の工程（Ａ）～（Ｇ）：
（Ａ）前記細胞を含有する試料を前記流路に導入する工程（試料導入工程S101）、
（Ｂ）前記細胞を前記細胞捕獲部に捕獲する工程（細胞捕獲工程S102）、
（Ｃ）前記細胞を前記細胞捕獲部に保持したまま、前記細胞が生産した細胞生産物を前記細胞生産物結合部に導入する工程（細胞生産物導入工程S104）、
（Ｄ）前記細胞生産物結合部に結合した細胞生産物の検出用試薬を前記試薬が流れる流路に導入する工程（検出用試薬導入工程S105）、
（Ｅ）前記検出用試薬が結合した細胞生産物を検出する工程（細胞生産物検出工程S106）、
（Ｆ）前記工程（Ｅ）で取得された検出データを解析する工程（検出データ解析工程S107）、及び
（Ｇ）前記工程（Ｃ）から工程（Ｆ）を繰り返し行う工程
を含む。
また、工程（Ｂ）の細胞捕獲工程S102の後に、細胞刺激用試薬にて細胞を刺激する細胞刺激工程S103を加えてもよい。
本技術の細胞の生産能力を分析する方法の一例を図４に示す。
本技術の細胞の生産能力を分析する方法は、以下の工程（Ａ）～（Ｇ）：
（Ａ）前記細胞を含有する試料を前記流路に導入する工程（試料導入工程S101）、
（Ｂ）前記細胞を前記細胞捕獲部に捕獲する工程（細胞捕獲工程S102）、
（Ｃ）前記細胞を前記細胞捕獲部に保持したまま、前記細胞が生産した細胞生産物を前記細胞生産物結合部に導入する工程（細胞生産物導入工程S104）、
（Ｄ）前記細胞生産物結合部に結合した細胞生産物の検出用試薬を前記試薬が流れる流路に導入する工程（検出用試薬導入工程S105）、
（Ｅ）前記検出用試薬が結合した細胞生産物を検出する工程（細胞生産物検出工程S106）、
（Ｆ）前記工程（Ｅ）で取得された検出データを解析する工程（検出データ解析工程S107）、及び
（Ｇ）前記工程（Ｃ）から工程（Ｆ）を繰り返し行う工程
を含む。
また、工程（Ｂ）の細胞捕獲工程S102の後に、細胞刺激用試薬にて細胞を刺激する細胞刺激工程S103を加えてもよい。
本技術の細胞の生産能力を分析する方法の一例を図４に示す。
３－１．実施態様３
（S101 試料導入工程）
細胞を含有する試料を、試料導入部１０２に入れ、細胞を含有する試料が流れる流路１１に導入する。細胞は、例えば、細胞事前選択部であるフローサイトメトリーにより分取されたリンパ球、白血球、マクロファージ、顆粒球等であり得る。
（S101 試料導入工程）
細胞を含有する試料を、試料導入部１０２に入れ、細胞を含有する試料が流れる流路１１に導入する。細胞は、例えば、細胞事前選択部であるフローサイトメトリーにより分取されたリンパ球、白血球、マクロファージ、顆粒球等であり得る。
（S102 細胞捕獲工程）
細胞を含有する試料が流れる流路１１に流れる細胞を、細胞捕獲部１２に捕獲する。捕獲は、例えば、引き込み流路１３に減圧をかけて細胞を細胞捕獲部１２に吸引することにより行う。
捕獲されなかった細胞は、バッファーや洗浄用試薬等で流路１１及び細胞捕獲部１２を洗浄することにより除去する。洗浄中、捕獲された細胞１が細胞捕獲部１２から流出しないよう、細胞捕獲部１２に、例えば減圧をかけ続けることが好ましい。
細胞を含有する試料が流れる流路１１に流れる細胞を、細胞捕獲部１２に捕獲する。捕獲は、例えば、引き込み流路１３に減圧をかけて細胞を細胞捕獲部１２に吸引することにより行う。
捕獲されなかった細胞は、バッファーや洗浄用試薬等で流路１１及び細胞捕獲部１２を洗浄することにより除去する。洗浄中、捕獲された細胞１が細胞捕獲部１２から流出しないよう、細胞捕獲部１２に、例えば減圧をかけ続けることが好ましい。
（S103 細胞刺激工程）
次に、捕獲された細胞１に細胞刺激物質を作用させる細胞刺激工程を行うことができる。細胞刺激は、流路１１に細胞刺激物質を流すことにより行う。
次に、捕獲された細胞１に細胞刺激物質を作用させる細胞刺激工程を行うことができる。細胞刺激は、流路１１に細胞刺激物質を流すことにより行う。
（S104 細胞生産物導入工程）
捕獲された細胞１は、経時的に、自然に又は細胞刺激物質の刺激により、細胞生産物を生産及び分泌する。分泌された細胞生産物は、細胞捕獲部１２から引き込み流路１３を通って細胞生産物結合部１５に入る。細胞生産物結合部１５には細胞生産物と特異的に結合する抗体等が固定化されており、細胞生産物は、細胞生産物結合部１５に結合する。
捕獲された細胞１は、経時的に、自然に又は細胞刺激物質の刺激により、細胞生産物を生産及び分泌する。分泌された細胞生産物は、細胞捕獲部１２から引き込み流路１３を通って細胞生産物結合部１５に入る。細胞生産物結合部１５には細胞生産物と特異的に結合する抗体等が固定化されており、細胞生産物は、細胞生産物結合部１５に結合する。
例えば、細胞１がリンパ球の場合、インターロイキン－２が分泌され、インターロイキン－２は引き込み流路１３を通って、細胞生産物結合部１５に固定化された抗インターロイキン－２抗体に結合する。この間、細胞捕獲部１２のリンパ球は、上述のように吸引により細胞捕獲部１２に保持されることが好ましい。
その後、細胞生産物結合部１５に結合しなかったその他の細胞生産物は、例えば引き込み流路１３又は試薬が流れる流路１４にバッファーや洗浄用試薬を流して除去する。
なお、細胞生産物導入工程は、細胞刺激後、予め定められた時間T1で行うことが好ましい。これにより、捕獲された細胞１の経時的な生産能、分泌能を測定することができる。
（S105 検出用試薬導入工程）
検出用試薬である、例えば標識抗体を、試薬が流れる流路１４に流して細胞生産物結合部１５に導入する。標識抗体は、細胞生産物結合部１５に結合した細胞生産物と特異的に結合し、固定化抗体－細胞生産物－標識抗体のサンドイッチを形成する。
結合しなかった標識抗体は、例えば引き込み流路１３又は試薬が流れる流路１４にバッファー又は洗浄用試薬を流して除去する。
検出用試薬である、例えば標識抗体を、試薬が流れる流路１４に流して細胞生産物結合部１５に導入する。標識抗体は、細胞生産物結合部１５に結合した細胞生産物と特異的に結合し、固定化抗体－細胞生産物－標識抗体のサンドイッチを形成する。
結合しなかった標識抗体は、例えば引き込み流路１３又は試薬が流れる流路１４にバッファー又は洗浄用試薬を流して除去する。
（S106 細胞生産物検出工程）
細胞生産物結合部１５に励起光を照射し、標識抗体から発光される蛍光を検出する。蛍光の検出は、細胞生産物結合部１５をスキャンしながら行ってもよいし、二次元的に一括で行ってもよい。
細胞生産物結合部１５に励起光を照射し、標識抗体から発光される蛍光を検出する。蛍光の検出は、細胞生産物結合部１５をスキャンしながら行ってもよいし、二次元的に一括で行ってもよい。
（S107 検出データ解析工程）
細胞生産物検出工程で得られたデータを解析する。例えば、蛍光画像から各細胞生産物結合部の蛍光強度を測定する。測定データに基づいて、対応する捕獲された細胞１の生産能力、分泌能力を算出する。
算出には、予め得られた細胞生産物濃度と蛍光強度との関係を表す検量線を用いてもよいし、各細胞１における経時的な蛍光強度の変化をみて評価してもよい。
細胞生産物検出工程で得られたデータを解析する。例えば、蛍光画像から各細胞生産物結合部の蛍光強度を測定する。測定データに基づいて、対応する捕獲された細胞１の生産能力、分泌能力を算出する。
算出には、予め得られた細胞生産物濃度と蛍光強度との関係を表す検量線を用いてもよいし、各細胞１における経時的な蛍光強度の変化をみて評価してもよい。
その後、細胞生産物結合部１５に固定化された抗体を残しかつ結合していた細胞生産物及び標識抗体を除去すべく、引き込み流路１３又は試薬が流れる流路１４に洗浄用試薬を導入する結合物除去工程を行ってもよい。細胞生産物及び標識抗体を除去する洗浄用試薬として、例えばストリッピングバッファー（100 mM 2-mercaptoethanol、2% SDS、62.5 mM Tris-HCl pH 6.7）を用いることができる。
（S104－S107のサイクル）
S103細胞刺激工程又はS104細胞生産物導入工程から、S107検出データ解析工程までの一連の工程は、繰り返し行ってもよい。
あるいは、前記S103細胞刺激工程又はS104細胞生産物導入工程から、S106細胞生産物検出工程までの一連の工程を繰り返し行い、最後にS107検出データ解析工程を行ってもよい。
これらのサイクルにおいては、前記結合物除去工程を含めてもよい。
なお、S104－S107のサイクルは一例である。例えば、S106－S107のサイクルでは、蛍光信号の増加から微分し、単位時間あたりの細胞の生産能を求めることができる。
S103細胞刺激工程又はS104細胞生産物導入工程から、S107検出データ解析工程までの一連の工程は、繰り返し行ってもよい。
あるいは、前記S103細胞刺激工程又はS104細胞生産物導入工程から、S106細胞生産物検出工程までの一連の工程を繰り返し行い、最後にS107検出データ解析工程を行ってもよい。
これらのサイクルにおいては、前記結合物除去工程を含めてもよい。
なお、S104－S107のサイクルは一例である。例えば、S106－S107のサイクルでは、蛍光信号の増加から微分し、単位時間あたりの細胞の生産能を求めることができる。
（S108 細胞特定工程）
S107検出データ解析工程で得られた解析結果に基づいて、所望の細胞１を特定する。所望の細胞１は、例えば、細胞刺激の前後における検出結果が有意に変化した細胞である。
S107検出データ解析工程で得られた解析結果に基づいて、所望の細胞１を特定する。所望の細胞１は、例えば、細胞刺激の前後における検出結果が有意に変化した細胞である。
（S109 細胞回収工程）
S108細胞特定工程によって特定された所望の細胞１を、細胞捕獲部１２から回収する。
細胞捕獲部１２は、予め、各細胞捕獲部にアドレスが付与されており、所望の細胞１が捕獲されているアドレスにキャピラリーが向かい、該キャピラリーにより所望の細胞１を順次吸引し、個別の容器に回収する。
また、前述の細胞回収方法により回収してもよい。
S108細胞特定工程によって特定された所望の細胞１を、細胞捕獲部１２から回収する。
細胞捕獲部１２は、予め、各細胞捕獲部にアドレスが付与されており、所望の細胞１が捕獲されているアドレスにキャピラリーが向かい、該キャピラリーにより所望の細胞１を順次吸引し、個別の容器に回収する。
また、前述の細胞回収方法により回収してもよい。
３－２．実施態様４
実施態様４は、実施態様３に細胞溶解工程等を追加したものである。
まず、実施態様３のS101試料導入工程からS107検出データ解析工程までを行う。ここまでの工程で、捕獲細胞１から分泌タンパク質の分析、分泌タンパク質と細胞との関連づけ等の解析を行う。
実施態様４は、実施態様３に細胞溶解工程等を追加したものである。
まず、実施態様３のS101試料導入工程からS107検出データ解析工程までを行う。ここまでの工程で、捕獲細胞１から分泌タンパク質の分析、分泌タンパク質と細胞との関連づけ等の解析を行う。
（S110 細胞溶解工程）
捕獲された細胞１を溶解するため、細胞溶解液を流路１１に導入する。細胞溶解液は流路１１から細胞捕獲部１２に流れ、細胞１が溶解され、核酸、例えばmRNAを抽出できる。
捕獲された細胞１を溶解するため、細胞溶解液を流路１１に導入する。細胞溶解液は流路１１から細胞捕獲部１２に流れ、細胞１が溶解され、核酸、例えばmRNAを抽出できる。
（S111 核酸導入工程）
S111核酸導入工程は、実施態様３のS104細胞生産物導入工程に対応する工程である。抽出されたmRNAは、細胞生産物結合部１５ｂに固定化された核酸やアプタマー等と相補的又は特異的に結合する。結合の際に、酵素の添加や温度の制御を行うことができる。
S111核酸導入工程は、実施態様３のS104細胞生産物導入工程に対応する工程である。抽出されたmRNAは、細胞生産物結合部１５ｂに固定化された核酸やアプタマー等と相補的又は特異的に結合する。結合の際に、酵素の添加や温度の制御を行うことができる。
（S112 核酸増幅工程）
mRNAが細胞生産物結合部１５ｂに結合後、mRNAを増幅する。例えば、PCR技術を適用して、試薬が流れる流路１４にDNAポリメラーゼ等の増幅用試薬を導入し、温度制御を行って増幅することができる。
mRNAが細胞生産物結合部１５ｂに結合後、mRNAを増幅する。例えば、PCR技術を適用して、試薬が流れる流路１４にDNAポリメラーゼ等の増幅用試薬を導入し、温度制御を行って増幅することができる。
（S113 核酸回収工程）
増幅したmRNAを回収する。回収には公知の技術を用いることができる。例えば核酸回収用ビーズ、核酸沈殿方法等を用いることができる。
増幅したmRNAを回収する。回収には公知の技術を用いることができる。例えば核酸回収用ビーズ、核酸沈殿方法等を用いることができる。
（S114 核酸配列決定工程）
回収したmRNAは、公知のシークエンス法により配列決定することができる。配列決定により、細胞１で多く発現されるタンパク質等を推測することができる。
回収したmRNAは、公知のシークエンス法により配列決定することができる。配列決定により、細胞１で多く発現されるタンパク質等を推測することができる。
（S115 核酸解析工程）
mRNAの配列データを核酸配列データベースに照らし合わせてmRNAの種類を決定する。
mRNAの配列データを核酸配列データベースに照らし合わせてmRNAの種類を決定する。
（S116 細胞生産能力分析工程）
最終的に、細胞１と、S107検出データ解析工程の結果と、S115核酸解析工程の結果を結び付ける。データは経時的に取得でき、単一細胞レベルでの細胞の生産能力や特性を分析することができる。
最終的に、細胞１と、S107検出データ解析工程の結果と、S115核酸解析工程の結果を結び付ける。データは経時的に取得でき、単一細胞レベルでの細胞の生産能力や特性を分析することができる。
なお、S111細胞核酸導入工程からS116細胞生産能力分析工程において、いわゆるバーコーディング技術を適用することができる。
予め、細胞生産物結合部１５ｂに固定化された核酸には、細胞のアドレスを特定できるようにアドレスに対応した核酸配列を含めておく。このようなバーコーディング技術により、どの細胞に何のmRNAが多く発現したか等を解析することができる。
予め、細胞生産物結合部１５ｂに固定化された核酸には、細胞のアドレスを特定できるようにアドレスに対応した核酸配列を含めておく。このようなバーコーディング技術により、どの細胞に何のmRNAが多く発現したか等を解析することができる。
例えば、細胞生産物結合部１５ｂのそれぞれに、ユニークなコードを含めた核酸を固定化しておく。ユニークなコードとmRNA断片３２に含まれる配列との塩基対形成を利用し、mRNA断片３２を細胞生産物結合部１５ｂに結合させる。固定化してある核酸をプライマーとしてcDNA合成することにより、ユニークなコードとmRNA断片３２に含まれる配列がつながった核酸を合成する。これにより、各細胞１と、各細胞生産物結合部１５ｂと、それに固定化されたユニークなコードを含む核酸とが、紐付けされる。固定化核酸に結合したmRNAの配列決定をすれば、どの細胞１が、何の種類のタンパク質を多く発現可能かが分かる。
なお、前述のように、細胞生産物結合部１５ｂに固定化した核酸にmRNAが結合した後にmRNAを増幅した場合、各種タンパク質に対応する各種mRNAによって増幅率が異なる。よって、mRNAの配列決定の結果からは、増幅後の各種mRNA分子の数を正確に導き出すことはできない。
そこで、細胞生産物結合部１５ｂに固定化する核酸に分子識別子（UMI: Unique Molecular Identifilers）を組み込んでおき、複数の、好ましくは各種mRNA分子数以上の核酸を、細胞生産物結合部１５ｂに固定化する。
細胞１の溶解により抽出されたmRNA１個は、固定化された核酸１個に相補的に結合する。その後増幅して配列決定してmRNAの種類が分かる。そして、細胞生産物結合部１５ｂには各種mRNA分子数以上の核酸が固定化されているので、mRNAの種類毎に分子識別子を数えれば、増幅前の各種mRNA分子数を知ることができる。
そこで、細胞生産物結合部１５ｂに固定化する核酸に分子識別子（UMI: Unique Molecular Identifilers）を組み込んでおき、複数の、好ましくは各種mRNA分子数以上の核酸を、細胞生産物結合部１５ｂに固定化する。
細胞１の溶解により抽出されたmRNA１個は、固定化された核酸１個に相補的に結合する。その後増幅して配列決定してmRNAの種類が分かる。そして、細胞生産物結合部１５ｂには各種mRNA分子数以上の核酸が固定化されているので、mRNAの種類毎に分子識別子を数えれば、増幅前の各種mRNA分子数を知ることができる。
＜４．細胞の生産能力を分析するためのシステム＞
本技術の細胞の生産能力を分析するためのシステム３０１は、細胞の生産能力を分析するためデバイス１０１及び検出部１０５、好ましくは解析部１０６を含む装置２０１と、装置２０１の制御を行う装置制御部２０２、検出部１０５で検出されたデータ及び／又は解析部１０６の解析結果を示す表示部２０３とを備える。
本技術の細胞の生産能力を分析するためのシステム３０１は、細胞の生産能力を分析するためデバイス１０１及び検出部１０５、好ましくは解析部１０６を含む装置２０１と、装置２０１の制御を行う装置制御部２０２、検出部１０５で検出されたデータ及び／又は解析部１０６の解析結果を示す表示部２０３とを備える。
装置制御部２０２は、デバイス１０１の液流制御部Ｖや試料導入部１０２、試薬導入部１０４等の動きを制御する。また、検出結果や解析結果に基づいて装置２０１にフィードバックすることができる。
装置制御部２０２は、例えばコンピュータである。コンピュータには、プログラムが搭載されており、プログラムは磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、フラッシュメモリ等の記録媒体に格納されていてもよいし、ネットワークを介して配信し、装置２０１の制御を実行する。
装置制御部２０２は、例えばコンピュータである。コンピュータには、プログラムが搭載されており、プログラムは磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、フラッシュメモリ等の記録媒体に格納されていてもよいし、ネットワークを介して配信し、装置２０１の制御を実行する。
表示部２０３は、検出データ、解析結果等を表示する。表示部２０３はディスプレイやプリンター等である。表示部２０３には、記憶媒体を搭載し、経時的データを記録させてもよい。
なお、本技術は、以下のような構成も採ることができる。
〔１〕 細胞を含有する試料が流れる流路と、
前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、
前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、
試薬が流れる流路と
を有し、
前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、
細胞の生産能力を分析するためのデバイス。
〔２〕 前記細胞は、単一細胞及び／又は細胞塊である、〔１〕に記載のデバイス。
〔３〕 前記細胞捕獲部は下流側が縮流し、前記単一細胞及び／又は細胞塊が保持される、〔１〕又は〔２〕に記載のデバイス。
〔４〕 前記細胞捕獲部は細胞刺激物質を導入する細胞刺激物質導入部と連結している、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のデバイス。
〔５〕 前記細胞生産物結合部を複数有する、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のデバイス。
〔６〕 前記細胞生産物は核酸、タンパク質及びエクソソームからなる群から選択される生体物質である、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のデバイス。
〔７〕 前記細胞生産物結合部は、前記核酸、タンパク質及びエクソソームからなる群から選択される生体物質と特異的に結合する分子が固定化されている、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のデバイス。
〔８〕 前記試薬は細胞生産物検出用試薬及び／又は洗浄用試薬である、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載のデバイス。
〔９〕 細胞の生産能力を分析するための装置であって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイス、
前記デバイスの細胞捕獲部及び／又は細胞生産物結合部の液流を制御する液流制御部、及び
前記デバイスの細胞生産物結合部に結合された細胞生産物を検出する検出部
を有する、前記装置。
〔１０〕 前記検出部により取得されたデータを解析する解析部を有する、〔９〕に記載の装置。
〔１１〕 細胞の生産能力を分析する方法であって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイスを用い、以下の工程（Ａ）～（Ｇ）：
（Ａ）前記細胞を含有する試料を前記流路に導入する工程、
（Ｂ）前記細胞を前記細胞捕獲部に捕獲する工程、
（Ｃ）前記細胞を前記細胞捕獲部に保持したまま、前記細胞が生産した細胞生産物を前記細胞生産物結合部に導入する工程、
（Ｄ）前記細胞生産物結合部に結合した細胞生産物の検出用試薬を前記試薬が流れる流路に導入する工程、
（Ｅ）前記検出用試薬が結合した細胞生産物を検出する工程、
（Ｆ）前記工程（Ｅ）で取得された検出データを解析する工程、及び
（Ｇ）前記工程（Ｃ）から工程（Ｆ）を繰り返し行う工程
を含む、前記方法。
〔１２〕 前記工程（Ｂ）で捕獲された細胞に細胞刺激物質を適用する工程を更に含む、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕 細胞の生産能力を分析するためのシステムであって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイス、前記デバイスの細胞捕獲部及び／又は細胞生産物結合部の液流を制御する液流制御部、並びに前記細胞生産物結合部に結合された細胞生産物を検出する検出部を有する、細胞の生産能力を分析するための装置部と、
前記液流制御部による液流制御及び前記検出を前記装置部に実行させるためのプログラムを有する装置制御部と、
前記装置により得られた検出データ及び／又は検出データの解析結果を表示する表示部と、
を有する、前記システム。
〔１〕 細胞を含有する試料が流れる流路と、
前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、
前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、
試薬が流れる流路と
を有し、
前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、
細胞の生産能力を分析するためのデバイス。
〔２〕 前記細胞は、単一細胞及び／又は細胞塊である、〔１〕に記載のデバイス。
〔３〕 前記細胞捕獲部は下流側が縮流し、前記単一細胞及び／又は細胞塊が保持される、〔１〕又は〔２〕に記載のデバイス。
〔４〕 前記細胞捕獲部は細胞刺激物質を導入する細胞刺激物質導入部と連結している、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のデバイス。
〔５〕 前記細胞生産物結合部を複数有する、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のデバイス。
〔６〕 前記細胞生産物は核酸、タンパク質及びエクソソームからなる群から選択される生体物質である、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のデバイス。
〔７〕 前記細胞生産物結合部は、前記核酸、タンパク質及びエクソソームからなる群から選択される生体物質と特異的に結合する分子が固定化されている、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のデバイス。
〔８〕 前記試薬は細胞生産物検出用試薬及び／又は洗浄用試薬である、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載のデバイス。
〔９〕 細胞の生産能力を分析するための装置であって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイス、
前記デバイスの細胞捕獲部及び／又は細胞生産物結合部の液流を制御する液流制御部、及び
前記デバイスの細胞生産物結合部に結合された細胞生産物を検出する検出部
を有する、前記装置。
〔１０〕 前記検出部により取得されたデータを解析する解析部を有する、〔９〕に記載の装置。
〔１１〕 細胞の生産能力を分析する方法であって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイスを用い、以下の工程（Ａ）～（Ｇ）：
（Ａ）前記細胞を含有する試料を前記流路に導入する工程、
（Ｂ）前記細胞を前記細胞捕獲部に捕獲する工程、
（Ｃ）前記細胞を前記細胞捕獲部に保持したまま、前記細胞が生産した細胞生産物を前記細胞生産物結合部に導入する工程、
（Ｄ）前記細胞生産物結合部に結合した細胞生産物の検出用試薬を前記試薬が流れる流路に導入する工程、
（Ｅ）前記検出用試薬が結合した細胞生産物を検出する工程、
（Ｆ）前記工程（Ｅ）で取得された検出データを解析する工程、及び
（Ｇ）前記工程（Ｃ）から工程（Ｆ）を繰り返し行う工程
を含む、前記方法。
〔１２〕 前記工程（Ｂ）で捕獲された細胞に細胞刺激物質を適用する工程を更に含む、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕 細胞の生産能力を分析するためのシステムであって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイス、前記デバイスの細胞捕獲部及び／又は細胞生産物結合部の液流を制御する液流制御部、並びに前記細胞生産物結合部に結合された細胞生産物を検出する検出部を有する、細胞の生産能力を分析するための装置部と、
前記液流制御部による液流制御及び前記検出を前記装置部に実行させるためのプログラムを有する装置制御部と、
前記装置により得られた検出データ及び／又は検出データの解析結果を表示する表示部と、
を有する、前記システム。
１１ 試料用流路
１２ 細胞捕獲部
１３ 引き込み流路
１４ 試薬用流路
１５、１５ａ、１５ｂ 細胞生産物結合部
１６ 外部流路
３１ 分泌タンパク質
３２ mRNA断片
１０１ 細胞生産能分析用デバイス
１０２ 試料導入部
１０３ 流出部
１０４ 試薬導入部
１０５ 検出部
１０６ 解析部
２０１ 細胞生産能分析装置
２０２ 装置制御部
２０３ 表示部
３０１ 細胞生産能分析用システム
Ｖ、Ｖ１～Ｖ６ 液流制御部
１２ 細胞捕獲部
１３ 引き込み流路
１４ 試薬用流路
１５、１５ａ、１５ｂ 細胞生産物結合部
１６ 外部流路
３１ 分泌タンパク質
３２ mRNA断片
１０１ 細胞生産能分析用デバイス
１０２ 試料導入部
１０３ 流出部
１０４ 試薬導入部
１０５ 検出部
１０６ 解析部
２０１ 細胞生産能分析装置
２０２ 装置制御部
２０３ 表示部
３０１ 細胞生産能分析用システム
Ｖ、Ｖ１～Ｖ６ 液流制御部
Claims (13)
- 細胞を含有する試料が流れる流路と、
前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、
前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、
試薬が流れる流路と
を有し、
前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、
細胞の生産能力を分析するためのデバイス。 - 前記細胞は、単一細胞及び／又は細胞塊である、請求項１に記載のデバイス。
- 前記細胞捕獲部は下流側が縮流し、前記単一細胞及び／又は細胞塊が保持される、請求項２に記載のデバイス。
- 前記細胞捕獲部は細胞刺激物質を導入する細胞刺激物質導入部と連結している、請求項１に記載のデバイス。
- 前記細胞生産物結合部を複数有する、請求項１に記載のデバイス。
- 前記細胞生産物は核酸、タンパク質及びエクソソームからなる群から選択される生体物質である、請求項１に記載のデバイス。
- 前記細胞生産物結合部は、前記核酸、タンパク質及びエクソソームからなる群から選択される生体物質と特異的に結合する分子が固定化されている、請求項６に記載のデバイス。
- 前記試薬は細胞生産物検出用試薬及び／又は洗浄用試薬である、請求項１に記載のデバイス。
- 細胞の生産能力を分析するための装置であって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイス、
前記デバイスの細胞捕獲部及び／又は細胞生産物結合部の液流を制御する液流制御部、及び
前記デバイスの細胞生産物結合部に結合された細胞生産物を検出する検出部を有する、前記装置。 - 前記検出部により取得されたデータを解析する解析部を有する、請求項９に記載の装置。
- 細胞の生産能力を分析する方法であって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイスを用い、以下の工程（Ａ）～（Ｇ）：
（Ａ）前記細胞を含有する試料を前記流路に導入する工程、
（Ｂ）前記細胞を前記細胞捕獲部に捕獲する工程、
（Ｃ）前記細胞を前記細胞捕獲部に保持したまま、前記細胞が生産した細胞生産物を前記細胞生産物結合部に導入する工程、
（Ｄ）前記細胞生産物結合部に結合した細胞生産物の検出用試薬を前記試薬が流れる流路に導入する工程、
（Ｅ）前記検出用試薬が結合した細胞生産物を検出する工程、
（Ｆ）前記工程（Ｅ）で取得された検出データを解析する工程、及び
（Ｇ）前記工程（Ｃ）から工程（Ｆ）を繰り返し行う工程
を含む、前記方法。 - 前記工程（Ｂ）で捕獲された細胞に細胞刺激物質を適用する工程を更に含む、請求項１１に記載の方法。
- 細胞の生産能力を分析するためのシステムであって、
細胞を含有する試料が流れる流路と、前記細胞を捕獲する細胞捕獲部と、前記細胞捕獲部に捕獲された細胞により生産された細胞生産物が結合される細胞生産物結合部と、試薬が流れる流路とを有し、前記細胞生産物結合部は前記試薬が流れる流路が交差している、細胞の生産能力を分析するためのデバイス、前記デバイスの細胞捕獲部及び／又は細胞生産物結合部の液流を制御する液流制御部、並びに前記細胞生産物結合部に結合された細胞生産物を検出する検出部を有する、細胞の生産能力を分析するための装置部と、
前記液流制御部による液流制御及び前記検出を前記装置部に実行させるためのプログラムを有する装置制御部と、
前記装置により得られた検出データ及び／又は検出データの解析結果を表示する表示部と、
を有する、前記システム。
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|---|---|
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| WO (1) | WO2018179735A1 (ja) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0214A (ja) * | 1988-11-17 | 1990-01-05 | Seiko Epson Corp | 液晶表示装置 |
| JP2004516029A (ja) * | 2000-12-20 | 2004-06-03 | アルタナ ファルマ アクチエンゲゼルシャフト | タンパク質の製造方法および精製方法ならびにタンパク質アレイの製造方法 |
| JP2004290875A (ja) * | 2003-03-27 | 2004-10-21 | Jsr Corp | 液体プロセッサーによる液体処理方法 |
| JP2008539711A (ja) * | 2005-05-03 | 2008-11-20 | オックスフォード・ジーン・テクノロジー・アイピー・リミテッド | 個々に細胞を解析するための装置及び方法 |
| JP2009505634A (ja) * | 2005-08-31 | 2009-02-12 | 日産化学工業株式会社 | 細胞応答評価用マイクロチップ |
| JP2012511155A (ja) * | 2008-12-04 | 2012-05-17 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | アレルギー反応を診断するための方法 |
| JP2015527588A (ja) * | 2012-08-24 | 2015-09-17 | イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ | ハイスループット多重検出用システム、装置及び方法 |
| WO2016065242A1 (en) * | 2014-10-24 | 2016-04-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Microfluidic qrt-pcr analysis of single cells |
| WO2017057234A1 (ja) * | 2015-09-29 | 2017-04-06 | 東京応化工業株式会社 | 基板、構造体、構造体の製造方法、細胞の選別方法、細胞の製造方法、及び分泌物の産生方法 |
| WO2017056362A1 (en) * | 2015-09-30 | 2017-04-06 | Sony Corporation | Method for analyzing cell, chip for cell analysis, reagent for cell analysis, kit for cell analysis, and apparatus for cell analysis |
-
2018
- 2018-01-24 WO PCT/JP2018/002037 patent/WO2018179735A1/ja active Application Filing
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0214A (ja) * | 1988-11-17 | 1990-01-05 | Seiko Epson Corp | 液晶表示装置 |
| JP2004516029A (ja) * | 2000-12-20 | 2004-06-03 | アルタナ ファルマ アクチエンゲゼルシャフト | タンパク質の製造方法および精製方法ならびにタンパク質アレイの製造方法 |
| JP2004290875A (ja) * | 2003-03-27 | 2004-10-21 | Jsr Corp | 液体プロセッサーによる液体処理方法 |
| JP2008539711A (ja) * | 2005-05-03 | 2008-11-20 | オックスフォード・ジーン・テクノロジー・アイピー・リミテッド | 個々に細胞を解析するための装置及び方法 |
| JP2009505634A (ja) * | 2005-08-31 | 2009-02-12 | 日産化学工業株式会社 | 細胞応答評価用マイクロチップ |
| JP2012511155A (ja) * | 2008-12-04 | 2012-05-17 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | アレルギー反応を診断するための方法 |
| JP2015527588A (ja) * | 2012-08-24 | 2015-09-17 | イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ | ハイスループット多重検出用システム、装置及び方法 |
| WO2016065242A1 (en) * | 2014-10-24 | 2016-04-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Microfluidic qrt-pcr analysis of single cells |
| WO2017057234A1 (ja) * | 2015-09-29 | 2017-04-06 | 東京応化工業株式会社 | 基板、構造体、構造体の製造方法、細胞の選別方法、細胞の製造方法、及び分泌物の産生方法 |
| WO2017056362A1 (en) * | 2015-09-30 | 2017-04-06 | Sony Corporation | Method for analyzing cell, chip for cell analysis, reagent for cell analysis, kit for cell analysis, and apparatus for cell analysis |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| CHENG, Y.-H. ET AL.: "Scaling and automation of a high-throughput single- cell -derived tumor sphere assay chip", LAB CHIP, vol. 16, no. 19, 2016, pages 3708 - 3717 * |
| DENG, Y. ET AL.: "An integrated microfluidic chip system for single- cell secretion profiling of rare circulating tumor cells", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 4, no. 7499, 2014, pages 1 - 8, XP055423007 * |
| ELITAS, M. ET AL.: "A microchip platform for interrogating tumor-macrophage paracrine signaling at the single- cell level", LAB CHIP, vol. 14, no. 18, 2014, pages 3582 - 3588, XP055257109 * |
| HEATH, J.R. ET AL.: "Single cell analytic tools for drug discovery and develeopment", NATURE REVIEWS. DRUG DISCOVERY , AUTHOR MANUSCRIPT, vol. 15, no. 3, 27 May 2016 (2016-05-27), pages 1 - 28, XP055556579 * |
| LINDSTROM, S. ET AL.: "Overview of single- cell analyses:microdevices and applications", LAB CHIP, vol. 10, no. 24, 2010, pages 3363 - 3372, XP055000729, DOI: doi:10.1039/c0lc00150c * |
| MA, C. ET AL.: "A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells", NAT. MED., vol. 17, no. 6, 2011, pages 738 - 743, XP055243826, DOI: doi:10.1038/nm.2375 * |
| SON, K.J. ET AL.: "Microfluidic compartments with sensing microbeads for dynamic monitoring of cytokine and exosome release from single cells", ANALYST, vol. 141, no. 2, 2016, pages 679 - 688, XP055610963 * |
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