CN103555667A - 利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法，具体为收集小鼠外周血，分离单核细胞，然后用PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬后分离CD4+CD45RO+T细胞；然后将CD4+CD45RO+T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161、CCR6三种抗体染色，用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23R-CD161-CCR6-细胞；所得IL23R-CD161-CCR6-细胞用小鼠CD3抗体和重组人IL-26刺激细胞，得小鼠Th17细胞，获得的小鼠Th17细胞具有活性功能，并且纯度高，其纯度达87%，为体外研究Th17细胞奠定了基础。

Description

利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法。
背景技术
辅助性T细胞17（Th17）是CD4+的免疫细胞亚群，它与多种免疫性疾病和炎症性疾病有密切关系，Th17细胞主要通过分泌人白介素17A（IL-17A）、人白介素17F（IL-17F）等细胞因子参与炎症的发生，这些细胞因子主要刺激血管内皮细胞分泌黏附分子，进而介导炎细胞对组织的浸润；Th17细胞也可以分泌人白介素21（IL-21）、人白介素22（IL-22）、人白介素26（IL26）等细胞因子并参与炎症影响炎症的进程。RORγt、CD4+是Th17细胞的重要标志之一。因此，通常利用IL-17+CD4+和RORγt+CD4+作为Th17细胞的标记用于流式检测，但是由于体内Th17细胞的数量有限，现有的分选方法并不能获得数量较多的Th17细胞。并且，由于RORγt、IL-17均为细胞内分泌因子，因此分选前需要先对细胞打孔然后染色，这使得细胞的活性无法保障，严重影响后续体外实验。
因此，急需一种分选Th17细胞的方法，其获得量多，并分选的细胞活力，为进一步研究Th17细胞奠定了基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法，能够在短时间内获得大量功能性的Th17细胞，方法简单，易于操作，节省时间。
为实现上述发明目的，技术方案为：
利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法，包括如下步骤：
B.收集小鼠外周血，加入PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/4-2倍，然后在转速为2000-2500rpm条件下离心20-30分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层体积1-20倍的PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬细胞后分离CD4+CD45RO+T细胞；
B.将步骤A分离的CD4+CD45RO+T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161和CCR6三种抗体染色，用PBS洗涤细胞后在800-1600rpm条件下离心8-15分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23R-CD161-CCR6-细胞；
C.将步骤B所得IL23R-CD161-CCR6-细胞加入含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清体积分数为10%，然后置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养5-8小时，再加入100-2000ng/mL的小鼠CD3抗体和30-400ng/mL的重组人IL-26刺激细胞2-24小时，收集细胞，得为小鼠Th17细胞。
优选的，所述步骤A为收集小鼠外周血，加入等体积的0.01mol/L、pH7.2的PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/3，然后在转速为2000rpm条件下离心20分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层10倍体积的PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬细胞后分离CD4+CD45RO+T细胞。
优选的，所述步骤B为将步骤A所得CD4+CD45RO+T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161和CCR6三种抗体在10℃下染色30分钟，用PBS洗涤细胞三次后在800rpm条件下离心10分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23R-CD161-CCR6-细胞。
优选的，所述步骤C是将步骤B所得IL23R-CD161-CCR6-细胞收集于96孔板中，每孔加入200μL含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清的体积百分比为10%，然后置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养5小时，再加入500ng/mL的小鼠CD3抗体和100ng/mL的重组人IL-26刺激细胞10小时。
本发明的有益效果在于：本发明公开了利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法，利用同种荧光标记的IL23R、CD161和CCR6三种抗体染色，通过流式分选IL23R-CD161-CCR6三阴性细胞，再在CD3抗体和IL-26共同作用下，刺激IL23R-CD161-CCR6-三阴性细胞群分化为Th17细胞，因此，利用本发明公开的方法能够获得纯度较高的Th17细胞，其纯度达到87%，并且利用此方法分选Th17细胞不需要染色前对细胞打孔，能够获得有活性功能的细胞，为体外研究Th17细胞奠定了基础。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为利用RORγt为标记物分选细胞的结果图。
图2为重组人IL-26刺激前后IL-17基因的表达结果。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中重组人IL-26购自英国abcame公司（货号为：ab163231）；人淋巴细胞分离液购自天津TBD公司（货号为：LTS1092）；逆转录试剂盒
Figure BDA0000397639500000031
qPCR RT Kit购自日本TOYOBO公司（货号为：FSQ-101）；荧光定量检测试剂盒SYBR GREEN Realtime PCRMaster Mix购自日本TOYOBO公司（货号为：FSQ-101）
实施例1
利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法，具体步骤如下：
A.收集小鼠外周血，加入等体积的0.01mol/L，pH为7.2的PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/3，然后在转速为2000rpm条件下离心20分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层体积10倍的PBS洗涤，离心收集细胞，再用500μL的PBS液重悬细胞，最后用试剂盒（美国STEMCELL，货号：19767）分离CD4+CD45RO+T细胞；
B.将步骤A所得CD4+CD45RO+T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161、CCR6三种抗体10℃条件下，染色30分钟，用3mL PBS洗涤细胞三次后在800rpm条件下离心10分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23R-CD161-CCR6-细胞；
C.将步骤B所得IL23R-CD161-CCR6-细胞收集于96孔板中，每孔加入200μL含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清体积分数为10%，然后置于37℃，体积分数5%的CO2培养箱内培养5小时，再加入500ng/mL的小鼠CD3抗体和100ng/mL的重组人IL-26刺激细胞10小时，得小鼠Th17细胞。
本实施例为本发明的最佳实施例，将收集细胞上流式细胞仪分选，结果如图1所示。结果显示，经重组人IL-26刺激后小鼠Th17细胞达到87%。
取IL-26刺激前和刺激后的细胞，用细胞计数取数量相同的细胞，然后用TRIZOL裂解液分别提取细胞总RNA，然后使用逆转录试剂盒
Figure BDA0000397639500000032
qPCR RT Kit合成cDNA。再根据IL-17基因设计荧光定量引物，并以GAPDH基因为内参，其荧光定量使用的引物如下：
IL-17Forward：5’-agcacacccgtcttctctc-3’（SEQ ID NO.1）；
IL-17Reverse：5’-gctggagttcgcactgtcc-3’（SEQ ID NO.2）；
GAPDH Forward：5’-aatggatttggacgcattggt-3’（SEQ ID NO.3）；
GAPDH Reverse：5’-tttgcactggtacgtgttgat-3’（SEQ ID NO.4）。
将合成的cDNA和荧光定量引物按照荧光定量检测试剂盒SYBR GREEN Realtime PCRMaster Mix说明书配制PCR反应体系，用荧光定量PCR仪（美国安捷伦MX3000P），反应条件为94℃预热30秒；94℃变性5秒，60℃退火15秒，72℃延伸20秒，进行35个循环，最后72℃延伸10分钟进行实时监测，将检测结果通过Applicatio软件统计分析结果，结果由图2所示。结果显示，经重组人IL-26刺激后的细胞IL-17表达量升高10倍，表明重组人IL-26刺激IL23R-CD161-CCR6-三阴性细胞群分化为Th17细胞。
实施例2
利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法，具体步骤如下：
A.收集小鼠外周血，加入等体积的PBS（0.01mol/L，pH7.2）稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/4，然后在转速为2500rpm条件下离心30分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层体积20倍的PBS洗涤，离心收集细胞，再用2000μL的PBS液重悬细胞，最后用试剂盒(美国STEMCELL，货号：19767）分离CD4+CD45RO+T细胞；
B.将步骤A所得CD4+CD45RO+T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161、CCR6三种抗体28℃条件下，染色30分钟，用10mL PBS洗涤细胞三次后在1200rpm条件下离心15分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23R-CD161-CCR6-细胞；
C.将步骤B所得IL23R-CD161-CCR6-细胞收集于96孔板中，每孔加入200μL含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清体积分数为10%，然后置于37℃，体积分数为5%的CO2培养箱内培养8小时，再加入100ng/mL的小鼠CD3抗体和30ng/mL的重组人IL-26刺激细胞24小时，得小鼠Th17细胞。
本实施例获得的小鼠Th17细胞检测结果与实施例1相同。
实施例3
利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法，具体步骤如下：
A.收集小鼠外周血，加入等体积的PBS（0.01mol/L，pH7.2）稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的2倍，然后在转速为2200rpm条件下离心25分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层体积1倍的PBS洗涤，离心收集细胞，再用100μL的PBS液重悬细胞，最后用试剂盒（美国STEMCELL，货号：19767）分离CD4+CD45RO+T细胞；
B.将步骤A所得CD4+CD45RO+T细胞用同种荧光记的IL23R、CD161、CCR6三种抗体在20℃条件下染色30分钟，用10mL PBS洗涤细胞三次后在1600rpm条件下离心8分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23R-CD161-CCR6-细胞；
C.将步骤B所得IL23R-CD161-CCR6-细胞收集于96孔板中，每孔加入200μL含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清体积分数为10%，然后置于37℃，体积分数为5%的CO2培养箱内培养7小时，再加入2000ng/mL的小鼠CD3抗体和400ng/mL的重组人IL-26刺激细胞24小时，得小鼠Th17细胞。
本实施例获得的小鼠Th17细胞检测结果与实施例1相同。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Figure IDA0000397639590000011
Figure IDA0000397639590000021

Claims (4)

1.利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A.收集小鼠外周血，加入PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/4-2倍，然后在转速为2000-2500rpm条件下离心20-30分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层体积1-20倍的PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬细胞后分离CD4+CD45RO+T细胞；
B.将步骤A分离的CD4+CD45RO+T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161和CCR6三种抗体染色，用PBS洗涤细胞后在800-1600rpm条件下离心8-15分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23R-CD161-CCR6-细胞；
C.将步骤B所得IL23R-CD161-CCR6-细胞加入含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清体积分数为10%，然后置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养5-8小时，再加入100-2000ng/mL的小鼠CD3抗体和30-400ng/mL的重组人IL-26刺激细胞2-24小时，收集细胞，得为小鼠Th17细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤A为收集小鼠外周血，加入等体积的0.01mol/L、pH7.2的PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/3，然后在转速为2000rpm条件下离心20分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层10倍体积的PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬细胞后分离CD4+CD45RO+T细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤B为将步骤A所得CD4+CD45RO+T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161和CCR6三种抗体在10℃下染色30分钟，用PBS洗涤细胞三次后在800rpm条件下离心10分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23R-CD161-CCR6-细胞。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤C是将步骤B所得IL23R-CD161-CCR6-细胞收集于96孔板中，每孔加入200μL含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清的体积百分比为10%，然后置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养5小时，再加入500ng/mL的小鼠CD3抗体和100ng/mL的重组人IL-26刺激细胞10小时。
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