ES2284209T3 - Citolisis de celulas diana por conjugados de superantigenos que inducen la activacion de celulas t. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un procedimiento para inactivar células dianas en presencia de linfocitos T, poniendo estas dos células en contacto con un superantígeno (SAG) en presencia de un modulador inmunitario. Este procedimiento se caracteriza porque el superantígeno y/o el modulador inmunitario adoptan la forma de un conjugado de un superantígeno "libre" (Sag) y de una fracción que dirige este conjugado sobre células dianas. Además, la invención se refiere a un conjugado de superantígeno que responde a la fórmula (I) (T){sub,x}(Sag){sub,y}(IM){sub,z} en la que (a) T representa una fracción de orientación, Sag, un superantígeno libre, Im un modulador inmunitario que no es un superantígeno - estando T, Sag y IM reunidos por segmentos de enlace orgánicos B; (b) x, y y z representan números enteros generalmente comprendidos entre 0 y 10 y que corresponde al número de fracciones de T, Sag e IM, respectivamente, en una molécula de conjugado dada, siempre que y > 0 y que x y/o z > 0. El conjugado de superantígeno es preferentemente una proteína híbrida triple. Esta invención se refiere también a un modulador inmunitario caracterizado porque es un conjugado de una fracción de orientación (T'''''') y de un modulador inmunitario modificado (IM''''''). Este conjugado responde a la fórmula (I) salvo en los que se refiere a la presencia imperativa del modulador inmunitario. Puede contener una fracción de superantígeno. Finalmente la invención se refiere a una molécula de ADN que codifica un superantígeno y un modulador inmunitario.
Description
Citolisis de células diana por conjugados de
superantígenos que inducen la activación de células T.
La presente invención se refiere a la
inactivación/citolisis de células diana causada por células T
activadas por superantígenos funcionales. La citolisis se puede
aplicar en la terapéutica y en ensayos in vitro.
Superantígenos. De acuerdo con la primera
de todas las definiciones (en torno a 1.988-1.993),
los superantígenos son proteínas bacterianas o víricas capaces de
unirse a antígenos del MHC de clase II sin un procesamiento celular
previo y de activar a las células T uniéndose a la región variable
de la cadena V\beta (V\beta) del receptor de las células T
(TCR). Esta unión da lugar a la activación de una
proporción/subgrupo relativamente grande de células T, restringida
a la familia V\beta, y a la lisis de células que expresan el MHC
de Clase II (citolisis mediada por células y dependiente de
superantígenos = SDCC). Normalmente el subgrupo de células T
activadas por superantígenos constituye aproximadamente un 1% - 30%
de la cantidad total de células T de un individuo.
Superantígenos muy conocidos conforme a la
anterior definición son las enterotoxinas estafilocócicas SE (del
inglés, Staphylococcal Enterotoxins) (SEA, SEB,
SEC1, SEC2, SED, SEE y SEH). Otros ejemplos son la Toxina 1 de
síndrome de choque tóxico [TSST-1 (del inglés
"Toxic Shock Syndrome Toxin 1", también de origen
estafilocócico), Toxinas Exfoliantes (EXft), Exotoxinas Pirogénicas
estreptocócicas A, B y C (SPE A, B y C), Proteínas del Virus del
Tumor Mamario de Ratón (MMTV) (del inglés, " Mouse
Mammary Tumor Virus"), proteínas M
estreptocócicas, Enterotoxina de Clostridium Perfringens
(CPET), superantígenos de la artritis producida por micoplasmas,
etc. Para una revisión sobre los superantígenos y sus propiedades,
véase Kotzin y col., 1993.
Los superantígenos de tipo salvaje y los
superantígenos quiméricos se han sometido también a mutaciones para
que presenten una unión disminuida o una ausencia de unión al MHC de
clase II y/o a los TCRV\beta (Kappler y col., documento WO
9314264; Kappler y col., 1993; Blanco y col.; Abrahmsén y col.,
documento WO9601650; Antonsson y col., documento WO 9736932;
Antonsson y col., 1997). Este tipo de superantígenos se convierte
en menos tóxico. Cuando carecen por completo de la capacidad de
unirse al MHC de clase II o a los TCRV\beta, ya no son
superantígenos funcionales porque han perdido entonces su capacidad
para activar a las células T.
Mediante mutación de superantígenos de tipo
salvaje estructuralmente similares ha sido posible construir
superantígenos quiméricos y funcionalmente activos (superantígenos
híbridos) (Lamphaer y col., 1996 y Antonsson y col., documento WO
9736932).
Se ha descubierto que la activación y la
posterior lisis celular pueden tener lugar de una manera
independiente del MHC de clase II cuando el superantígeno de tipo
salvaje está conjugado con un resto buscador de células diana,
capaz de unirse a una estructura de superficie celular (Dohlsten y
col., documento WO9201470). A este nuevo mecanismo efector se le ha
llamado citolisis mediada por células y dependiente de
superantígenos y anticuerpos (= SADCC) (del inglés,
" Superantigen Antibody Dependent
Cell-mediated Cytolysis"). Este
mecanismo incluye mecanismos análogos para otros restos de
direccionamiento que no sean anticuerpos (Abrahmsén y col.,
documento WO9601650; Antonsson y col., documento WO 9736932).
Por consiguiente, el concepto actual de
superantígeno abarca cualquier compuesto (preferiblemente de
estructura polipeptídica) que sin experimentar procesamiento
intracelular es capaz de unirse a una estructura de superficie
celular (estructura diana) y a una o más cadenas polimórficas de
TCR, en particular a la cadena V\beta, activando con ellos a un
subgrupo de células T que expresan esa cadena de TCR específica
implicada en la unión. Las células T se convierten entonces en
citotóxicas y dirigen su citotoxicidad contra células que portan esa
estructura de superficie (estructura diana, células diana). La
definición de superantígeno (SAG), según se usa en el contexto de
esta invención y siempre que no se especifique lo contrario,
abarcará por lo tanto conjugados formados por un resto de
direccionamiento y un superantígeno libre según se ha expuesto
anteriormente en relación con la SADCC.
Por el término superantígeno se contemplan,
salvo que se especifique lo contrario, solamente superantígenos
funcionales.
Un superantígeno (Sag) libre es un
superantígeno de tipo salvaje, posiblemente mutado o de alguna otra
manera modificado, que no está conjugado con un resto de
direccionamiento ni con un inmunomodulador. La capacidad de los
superantígenos libres para unirse al MHC de clase II es una
propiedad inherente de direccionamiento. Debido a que los
superantígenos libres carecen de restos de direccionamiento
conjugados con ellos, únicamente ejercerán una SDCC.
Un superantígeno conjugado es un
conjugado formado por un superantígeno libre y un resto de
direccionamiento o un inmunomodulador. Un superantígeno conjugado
ejerce o una SDCC o una SADDC, o bien ejerce tanto una SDCC como
una SADDC.
Un inmunomodulador (IM) es un compuesto
capaz de regular el sistema inmunitario. En el contexto de esta
invención, los superantígenos se tratan aparte y no están incluidos
cuando se usa el término inmunomodulador. Un inmunomodulador
frecuentemente posee una capacidad de direccionamiento inherente,
como por ejemplo, hacia su correspondiente receptor linfocitario.
Salvo que se especifique lo contrario, un inmunomodulador está en
forma no conjugada.
Un resto de direccionamiento (T) es un
resto que es capaz de unirse a una estructura de superficie celular
y/o a una estructura tisular.
Un conjugado se compone de dos o más
restos Sag, IM, T, etc., que están unidos entre sí
covalentemente.
Por formas solubles de componentes
activos se indica formas que son solubles en fluidos corporales
tales como suero y plasma.
Se ha recomendado el uso de superantígenos no
conjugados, de tipo salvaje y mutados, en terapias con efectos
curativos que presumiblemente se llevan a cabo a través de una
activación del sistema inmunitario, ya sea localmente en células
que expresan la Clase II y que están vinculadas con la enfermedad
que ha de ser tratada, o ya sea en forma de una activación
sistémica (Kalland y col., documento WO9104053; Terman y col.,
documentos WO9110680 y WO9324136; Antonsson y col., documento WO
9736932; y Newell y col. 1991). Debido a la extrema toxicidad de
los superantígenos de tipo salvaje, esta estrategia, en relación con
el tratamiento del cáncer, sería aplicable solamente a una fracción
muy minoritaria de todos los cánceres.
Se ha recomendado también el uso de
superantígenos conjugados con restos buscadores de células diana
(Dohlsten y col., documento WO9201470; Abrahmsén y col., documento
WO9601650, Antonsson y col., documento WO 9736932 y Ochi y col.,
1993).
En relación con estudios sobre prevención de la
disminución inducida por superantígenos, de la actividad citotóxica
mediada por células T y producida por la IL-2 in
vivo, se ha especulado que debería ser beneficioso coadministrar
IL-2 con superantígenos de tipo salvaje no
conjugados y con superantígenos de tipo salvaje conjugados con
anticuerpos (Belfrage, Thesis agosto/septiembre de 1996;
Belfrage y col., 1994; Belfrage y col., 1995; Belfrage y col.,
1997a; Belfrage y col., 1997b (superantígenos de tipo salvaje)).
Se ha sugerido también que el CD80 anclado en
membranas celulares desempeña una función en la activación de las
células T producida por superantígenos, en ausencia de antígenos del
MHC de clase II (Lando y col., 1993 y 1996).
La figura 4 de la publicación de Lando y col.,
1996, muestra un experimento en el que se analiza la capacidad de
un superantígeno conjugado con un anticuerpo solo o en combinación
con IL-2, para inducir la proliferación de células
T humanas en reposo. En este experimento de 4 días, el superantígeno
conjugado se presentó sobre células CHO de la línea original y
sobre células CHO transfectadas para que expresasen la Clase II o
C215, o para que expresen la Clase II más C215. El efecto de la
IL-2 fue insignificante.
Kappler y col. (documento WO9314634) han
recomendado el uso de la SEB de tipo salvaje y no conjugada, mutada
de manera que ha perdido su capacidad de unión a V\beta o al MHC
de Clase II (en el contexto de las vacunas y como agente encargado
de neutralizar los efectos tóxicos de los superantígenos). Abrahmsén
y col., (documento WO9601650) han recomendado una terapia contra el
cáncer con superantígenos conjugados que poseen una capacidad
modificada, preferiblemente disminuida, para unirse a antígenos de
la Clase II. Antonsson y col., (documento WO 9736932) ha
recomendado una terapia con superantígenos quiméricos y con
superantígenos que poseen una serorreactividad disminuida (véase
también Abrahmsén y col.). Mutaciones como las descritas por
Abrahmsén y col. (documento WO9601650) y Antonsson y col.
(documento WO 9736932) implicarán que los superantígenos poseerán
una menor toxicidad sistémica, una menor inmunogenicidad y/o una
menor serorreactividad en el mamífero que ha de ser tratado.
Se ha recomendado una terapia con administración
de ácidos nucleicos que codifican superantígenos de tipo salvaje
(Terman y col., documento WO9110680; documento WO9324136) y Dow y
col., documento WO9636366). Dow y col. van aún más lejos y
recomiendan la coadministración de un ácido nucleico que codifica
una citoquina o una quimioquina con un ácido nucleico que codifica
un superantígeno. Sin facilitar el soporte experimental, el
documento WO9636366 también recomienda construcciones en forma de
una construcción génica bicistrónica en las que un cistrón contiene
el gen que codifica el superantígeno y el otro cistrón contiene el
gen que codifica una citoquina o una quimioquina.
Sin facilitar el soporte experimental, Pouletty
P. (Sangstat, documento EP510949) ha especulado que conjugados
formados por restos de direccionamiento, tales como
IL-2, y superantígenos de tipo salvaje, podrían ser
útiles para inactivar células que expresan el receptor para
IL-2.
En publicaciones previas se ha recomendado
conjugar anticuerpos con modificadores de respuestas biológicas,
por ejemplo, una quimioquina o una citoquina, tal como la
interleuquina 2 (Fell y col., documento EP 439095; Rosenblum y
col., documento EP 396387, Pancook y col., 1996; y Becker y col.,
1996).
La presente invención se propone proporcionar
mejoras en relación con una terapia con superantígenos que implica
la activación del sistema inmunitario con el fin de inactivar
células diana no deseadas en un mamífero que ha de ser tratado. En
particular las mejoras se refieren a: 1) prolongar el período de
activación localmente, por ejemplo en un tumor, durante en un
primer ciclo de tratamiento; 2) contrarrestar la aparición de una
hiporrespuesta debida a la tendencia de las células T activadas a
escapar hacia el estado de anergia; 3) facilitar la activación de
las células T, independiente del MHC de clase II, en la zona del
tumor; y 4) ampliar el intervalo terapéutico en relación con la
citolisis a través de una activación con superantígenos. En la
actualidad se ha descubierto que estas mejoras se pueden llevar a
cabo en su totalidad o parcialmente con la condición de que la
administración del superantígeno (SAG) se combine con la
administración de un inmunomodulador en forma soluble, estando al
menos uno de entre el superantígeno y el inmunomodulador en forma de
conjugado con un resto que posee propiedades de direccionamiento
hacia la célula que ha de ser inactivada.
Primer aspecto principal de la
invención
El primer aspecto de la invención cubre tanto la
terapéutica como los ensayos in vitro y es un método para
inactivar células diana no deseadas en presencia de células T,
poniendo en contacto estos dos tipos de células con un
superantígeno (SAG), en particular con un superantígeno que activa
las células T a través de su unión a TCRV\beta, en presencia de
un inmunomodulador (IM) que no es un superantígeno (Sag). En su
aspecto más amplio, el método se caracteriza porque al menos uno de
entre el superantígeno y el inmunomodulador está en forma de
conjugado con un resto (T) que posee propiedades de direccionamiento
hacia la célula que ha de ser inactivada.
El primer aspecto principal de la invención
cubre nuevos conjugados que contienen superantígeno y que tienen la
fórmula:
a) de un triple conjugado (T) (Sag) (IM);
b) de un doble conjugado (T) (Sag) en
combinación con otro doble conjugado (T') (IM), en los que T y T'
son iguales o diferentes; o
c) un doble conjugado (T) (Sag) en combinación
con (IM), en el que T es un resto de direccionamiento, Sag es un
superantígeno, IM es un inmunomodulador que no es un
superantígeno.
El superantígeno y el inmunomodulador pueden
estar dirigidos hacia el mismo tipo de células, por ejemplo, hacia
estructuras/epítopos idénticos o que presentan reacciones cruzadas,
o hacia un tipo diferente de células dentro del mismo tejido. El
direccionamiento se puede realizar hacia células normales o hacia
células enfermas asociadas a ese mismo tejido. El superantígeno o
el inmunomodulador, o tanto el superantígeno como el
inmunomodulador, pueden ser dirigidos con uno o con varios
anticuerpos.
T es un resto de direccionamiento, Sag
corresponde a un superantígeno libre e IM es un inmunomodulador que
no es un superantígeno. T, Sag e IM están unidos entre sí a través
de fragmentos enlazadores B que pueden ser iguales o diferentes
dentro de la misma molécula o materia del conjugado. Los conjugados
abarcan conjugados químicos así como también conjugados producidos
mediante técnicas recombinantes (proteínas de fusión).
IM significa un inmunomodulador que no es un
superantígeno ni libre ni conjugado.
El inmunomodulador puede ser una citoquina o una
quimioquina. Son citoquinas ilustrativas el factor estimulador de
colonias de granulocitos-macrófagos
(GM-CSF) (del inglés, " Granulocyte
Macrophage Colony Stimulating
Factor"), factor \alpha o \beta de necrosis
tumoral (TNF\alpha o TNF\beta), factor estimulador de colonias
de macrófagos (M-CSF) (del inglés,
" Macrophage Colony Stimulating
Factor"), factor estimulador de granulocitos
(G-CSF), IL-1, IL-2,
IL-4, IL-6, IL-7,
IL-12, IL-15, IL-18
e IGF. Son quimioquinas ilustrativas C5a, IL-8, la
proteína 1 alfa quimiotáctica de monocitos (MIP1alpha) o la proteína
1\beta quimiotáctica de monocitos (MIP1\beta), la proteína 1
quimioatrayente de monocitos (MCP-1) (del inglés,
" Monocyte Chemoattractant Protein
1"), la proteína 2 quimioatrayente de monocitos
(MCP-2), la proteína 3 quimioatrayente de monocitos
(MCP-3), factor activador de plaquetas (PAFR),
N-formil-metionil-leucil-fenilalanina
(FMLPR) (del inglés,
"N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine"),
leucotrieno B_{4} (LTB_{4}R), péptido liberador de gastrina
(GRP) (del inglés, " Gastrin Releasing
Peptide"), RANTES, eotaxina, linfotactina, IP10,
I-309, ENA78, GCP-2,
NAP-2, MGSA/gro, DC-CK1, Flt3L
(dominio ectópico), fractalquina, PF-4, etc.
Otro tipo de inmunomoduladores son los derivados
de pares de receptor/ligando anclados a membranas celulares,
implicados en la modulación de una inmunorrespuesta desencadenada,
tal como una coestimulación (por ejemplo, receptores unidos a la
superficie de linfocitos y sus correspondientes ligando unidos a
células). Ejemplos ilustrativos son los miembros seleccionados
entre los pares CD40L/CD40,
4-BB1/4-BB1L, CD28/B7,
CTLA-4/B7, etc. B7 incluye variantes tales como
CD80 y CD86 con preferencia para la primera de ellas. Las formas
preferidas son solubles, contienen la parte extracelular (dominio
ectópico) y están desprovistas de la parte intracelular y de la
parte anclada a membrana.
Los inmunomoduladores particularmente preferidos
son capaces de potenciar los efectos de los superantígenos in
vivo, por ejemplo, contrarrestando el escape de las células T
activadas por superantígeno hacia el estado de anergia. Pares de
receptores/ligandos apropiados típicos, unidos a células, son
CD28/B27 incluyendo sus análogos y fragmentos según se ha definido
en lo que antecede. Las citoquinas típicas de este grupo son
IL-2, por ser el principal efector aguas abajo de la
señalización de CD28/B7, y las citoquinas IL-7 e
IL-15, similares a IL-2. Entre los
pares de receptor asociado a la superficie de células T/ligando, se
prefiere que el miembro no unido a la célula T que ha de ser
activada esté incorporado en un conjugado según la invención. En el
caso de CD40L/CD40, 4-BB1/4-BB1L y
CD28/B7 esto significa las formas solubles de CD40,
4-BB1L y B7, con preferencias según se ha definido
en lo que antecede. La parte experimental de este texto ilustra las
variantes de inmunomoduladores que en la fecha de prioridad se
encontraron óptimas en esta invención.
Los inmunomoduladores preferiblemente deben ser
originarios de la misma especie que el individuo que va a ser
tratado. Los inmunomoduladores naturales, tales como citoquinas y
quimioquinas, a menudo muestran una elevada toxicidad sistémica y
una semivida relativamente corta en mamíferos. Existe una extensa
literatura científica sobre cómo modificar los inmunomoduladores
para aumentar su estabilidad en relación con la oxidación, alargar
su semivida in vivo, disminuir su toxicidad, mejorar su
plegamiento cuando se producen mediante técnicas recombinantes,
etc. Por ejemplo, el documento US 5.229.109 (Grimm y col.) describe
análogos de IL-2 de baja toxicidad que poseen una
afinidad disminuida por el receptor para IL-2
(IL-2R) de alta afinidad, por ser deficientes en la
unión a la subunidad p55 \alpha del receptor. Los análogos se
preparan principalmente mutando el codón correspondiente a un
aminoácido situado en las posiciones 33 - 46 de IL-2
(por ejemplo, Arg38Ala y Phe42Lys o Phe42Ala). El mutante Asp20Lys
posee una afinidad disminuida 100 - 500 veces por p75/cadena \beta
del receptor de IL-2 sin que se afecte su unión a
p55 (Collins y col., 1988). Otras mutaciones, p. ej., Asp20Ser son
menos graves (Berndt y col., 1994). Estudios realizados sobre la
IL-2 murina indican que el Asp84 y el Asp88 de la
IL-2 humana están también implicados en la unión a
p75 (Zurawski y col., 1993). Esto está apoyado por los modelos de
la unión entre la IL-2 humana y su receptor
(Bamborough y col., 1994). La disminución en afinidad esperada de
estas mutaciones es
Asp20>Asp88>Asp84.
Asp20>Asp88>Asp84.
Al combinar las mutaciones en Arg38 y Phe42 con
mutaciones en las posiciones 88 y 20 se obtendría como resultado
una afinidad todavía más baja por IL-2R. Otra
potente mutación de IL-2, y en la fecha de prioridad
preferida, es Thr51Pro que da lugar a un análogo de
IL-2 que tiene una menor velocidad de
internalización celular y una duración prolongada de su efecto
inmunomodulador (Chang y col., 1996).
La numeración de las posiciones de los
aminoácidos se ha hecho conforme a Taniguchi y col., 1983.
Las publicaciones de Grimm y col.; Collins y
col., 1988; Berndt y col., 1994; Zurawski y col., 1993; Bamborough
y col., 1994; Chang y col., 1996; y Taniguchi y col. 1983 se
incorporan a modo de referencia.
El uso de análogos de citoquinas y quimioquinas
que poseen una menor afinidad por sus receptores normales en
conjugados como los anteriormente descritos, reforzará su
direccionamiento hacia la célula diana preseleccionada. Es
concebible que las citoquinas y quimioquinas mutadas muestren una
menor velocidad de internalización celular tras unirse a su
respectivo receptor celular e, incorporadas en un conjugado según la
fórmula 1, producirán una actividad prolongada del superantígeno
comparada con la de los correspondientes conjugados que contienen
la forma natural del inmunomodulador.
El término inmunomodulador (IM) abarca por lo
tanto cualquier forma modificada, por ejemplo cualquier forma
mutada, que es capaz de agonizar o antagonizar los efectos de la
correspondiente forma natural del inmunomodulador.
Sag representa un superantígeno según se ha
definido anteriormente para los superantígenos libres y en el
epígrafe "Técnica anterior-...", es decir, superantígenos de
tipo salvaje posiblemente modificados, por ejemplo, mediante
mutación,
a. para que posean una menor capacidad de unión
a un antígeno del MHC de clase II en comparación con el
correspondiente superantígeno de tipo salvaje (véase por ejemplo
Abrahmsén y col., (documento WO9601650));
b. para que posean una menor serorreactividad en
sueros humanos en comparación con el correspondiente superantígeno
de tipo salvaje (véase por ejemplo Abrahmsén y col., (documento
WO9601650) y Antonsson y col., documento WO 9736932 y Antonsson y
col., 1997);
c. para que posean una menor inmunogenicidad en
seres humanos en comparación con el correspondiente superantígeno
de tipo salvaje (véase por ejemplo Antonsson y col., documento WO
9736932 y Antonsson y col., 1997);
d. para que sean una quimera formada por dos o
más superantígenos análogos de tipo salvaje, en la que una región
de un primer superantígeno de tipo salvaje ha sido sustituida por la
correspondiente región de un segundo superantígeno análogo. La
región en cuestión puede ser una región determinante de la unión a
TCRV\beta, ej., según se ha definido para las quimeras SEE/SEA y
SEA/SEE) véase por ejemplo Antonsson y col., documento WO 9736932;
Antonsson y col., 1997; y Lamphaer y col., 1996).
También están incluidas otras
modificaciones/mutaciones que se puedan considerar apropiadas, por
ejemplo, para evitar una glicosilación no deseada cuando esas
modificaciones/mutaciones se producen en células eucariotas.
Mutaciones representativas para los
superantígenos similares a SEA/SEE en la fecha de prioridad fueron
(numeración según la usada por Antonsson y col., 1997 y Antonsson y
col., documento WO 9736932):
a. menor capacidad de unión al MHC de clase II:
Asp227Ala (= SEAm9), Phe47Ala y/o Asp70Arg. El mutante
Phe47Ala/Asp227Ala = SEAm23.
b. y d. quimeras formadas por SEA y SEE, que
tienen como objetivo disminuir la serorreactividad en seres humanos,
y al mismo tiempo conservar la capacidad de SADCC del
correspondiente superantígeno conjugado: SEE contiene las
siguientes sustituciones: Gly20Arg, Thr21Asn, Gly24Ser,
Lys27Arg.
Los mutantes usados en la parte experimental son
SEA(Asp227Ala) = SEAm9, SEA(Phe47Ala/Asp227Ala) =
SEAm23 y SEA(Phe47Ala/Asn102Q/Asn149Asp/Thr218Val/Asp227Ala)
= SEAm57.
En la presentación de prioridad los
super-antígenos preferidos se seleccionaron
entre:
1. superantígenos (Sag) que exhiben dos sitios
de unión al MHC de clase II (por ejemplo, las enterotoxinas A y E
estafilocócicas),
2. superantígenos (Sag) que en sus formas no
mutadas requirieron el ion Zn para su unión óptima al MHC de clase
II (por ejemplo, SEA, SEE y SEH),
3. enterotoxinas estafilocócicas.
Una molécula de Sag que se ha de incorporar a un
conjugado según la invención, no es necesario que sea un
superantígeno funcional, siendo la cuestión principal que el
conjugado final sí lo sea, ejerciendo una SADCC o una SDCC, o
ejerciendo tanto una SADCC como una SDCC según se han descrito en lo
que antecede.
T puede en principio ser cualquier estructura
capaz de unirse a una estructura de superficie celular,
preferiblemente a una estructura específica de una enfermedad. La
estructura contra la que T está dirigido usualmente difiere de: (a)
el epítopo de la cadena polimórfica del TCR al que el Sag se une, y
(b) los epítopos del MHC de clase II a los que el Sag se une. El
resto buscador de células diana se puede seleccionar entre
interleuquinas (p. ej., interleuquina 2), hormonas, anticuerpos
incluyendo fragmentos de anticuerpos que se unen antígenos,
factores de crecimiento, etc. Véase por ejemplo Woodworth 1993
(incorporado aquí como referencia).
El resto del direccionamiento puede ser por lo
tanto una proteína que contienen 1, 2, 3 ó 4 cadenas
polipeptídicas.
En la fecha de prioridad, se prefirió que T
fuera un anticuerpo (un anticuerpo de longitud completa, Fab,
F(ab)_{2}, Fv, ScFv (anticuerpo monocatenario) (del
inglés, " Single chain Fv"), múltiples
anticuerpos monocatenarios (ScFv)_{n} y cualquier otro
fragmento de anticuerpo que se una a antígenos), incluyendo
cualquier forma truncada y funcionalmente activa de las formas de
anticuerpos anteriormente mencionadas. Otras variantes son
monoespecíficas y biespecíficas. El anticuerpo en principio puede
estar dirigido hacia cualquier estructura de superficie celular
asociada/específica de una enfermedad, por ejemplo, estructuras
ligadas a cualquiera de las formas de cáncer anteriormente
mencionadas, con particular énfasis en los fragmentos activos de
anticuerpos (tales como Fab). Típicamente el anticuerpo puede estar
dirigido hacia un epítopo específico de colon y/o páncreas, por
ejemplo, el denominado epítopo C242 (Lindholm y col., documento
WO9301303), hacia un epítopo específico de cáncer de pulmón, por
ejemplo, el epítopo para el anticuerpo 5T4 (Stern col., documento
WO8907947), hacia un epítopo específico de linfomas, por ejemplo,
sobre CD19, hacia un epítopo específico de melanoma, por ejemplo,
HMW-MAA, etc.
El término "anticuerpo" comprende variantes
monoclonales así como también variantes policlonales, con
preferencia para las preparaciones monoclonales.
En caso de que el resto diana sea un fragmento
Fab, los residuos de cisteína que normalmente unen entre sí las
cadenas pesadas y ligera de Fab, preferiblemente han sido
sustituidos por un aminoácido que no permite la formación de
enlaces disulfuro, por ejemplo, serina. Véase también Antonsson y
col., documento WO 9736932.
Lo anteriormente dicho incluye también que T
puede estar dirigido hacia estructuras únicas dispuestas sobre
células más o menos sanas, que regulan o controlan el desarrollo de
una enfermedad.
El fragmento enlazador B se puede seleccionar de
la manera descrita en trabajos previos (Dohlsten y col., documento
WO9201470; Abrahmsén y col., documento WO9601650; y Antonsson y
col., documento WO 9736932), es decir, B será preferiblemente
hidrófilo y exhibirá una o más estructura(s) seleccionadas
entre amida, tioéter, disulfuro, etc. Los fragmentos enlazadores
más destacados son los obtenidos mediante técnicas recombinantes,
es decir, la conjugación tiene lugar a un nivel genómico,
obteniéndose como resultado fragmentos en enlazadores
oligopeptídicos. Los fragmentos enlazadores oligopeptídicos
típicamente contienen 1 - 30, tal como 1 - 20, residuos de
aminoácido que preferiblemente se seleccionan de manera que el
fragmento enlazador en su totalidad es hidrófilo. Los residuos del
fragmento enlazador por lo tanto se seleccionan preferiblemente
entre residuos de aminoácidos hidrófilos, tales como Gln, Ser, Gly,
Glu, Pro, His y Arg. Fragmentos enlazadores oligopeptídicos típicos
comprenden el tripéptido GlyGlyPro o el denominado fragmento
enlazador Q (Wootton y col., 1989, incorporado aquí como
referencia) posiblemente modificado con gly-pro en
el extremo amino terminal.
Los conjugados químicos típicamente contendrán
una mezcla de moléculas conjugadas que difieren en las posiciones
de las uniones. La materia del conjugado contendrá heteroconjugados
así como homoconjugados.
En el caso de los conjugados recombinantes
(proteínas de fusión), la materia del conjugado obtenido será
uniforme con respecto a la posición de los enlaces. En cada
subunidad individual (T, Sag, IM) la terminación amino está
fusionada con la terminación carboxi de otra subunidad, o viceversa,
preferiblemente a través de un puente oligopeptídico insertado. Las
combinaciones cuando el conjugado contiene una cadena de cada una de
las partes T, IM y Sag serán
T-IM-Sag,
IM-T-Sag,
Sag-IM-T,
Sag-T-IM,
T-Sag-IM,
IM-Sag-T (la presencia de la
estructura enlazadora de B no se muestra). Cuando una o más de las
subunidades contiene dos o más cadenas polipeptídicas, el número de
posibilidades aumentan En el caso en el que T sea un fragmento Fab
de un anticuerpo, las posibilidades serán (los fragmentos
enlazadores oligopeptídicos B no se muestran):
1. Sag-Fab (cadena ligera)-IM | 2. Fab (cadena ligera) |
Fab (cadena pesada) | Sag-Fab (cadena pesada)-IM |
3. Sag-Fab (cadena ligera) | 4. Fab (cadena ligera)-IM |
Fab (cadena pesada)-IM | Sag-Fab (cadena pesada) |
5. Sag-Fab (cadena ligera) | 6. IM-Fab (cadena ligera) |
IM-Fab (cadena pesada) | Sag-Fab (cadena pesada) |
7. Fab (cadena ligera)-Sag | 8. Fab (cadena ligera)-IM |
Fab (cadena pesada)-IM | Fab (cadena pesada)-Sag |
En otras variantes, el inmunomodulador y el
superantígeno pueden estar fusionados uno al lado del otro por
cualquiera de los extremos de cualquiera de las cadenas del
anticuerpo.
En la fecha de prioridad se prefirieron los
conjugados recombinantes, con máxima preferencia por los fragmentos
Fab como restos de direccionamiento y por la unión de la terminación
amino del superantígeno libre con el primer dominio constante de la
cadena pesada (C_{H}l) o de la cadena ligera del anticuerpo, y por
la unión del inmunomodulador con la terminación carboxi restante
(válido para las fórmulas I-IV).
Para una producción y función óptimas la
proteína de fusión se expresa mediante técnicas recombinantes en
forma de un producto de dos cadenas en el que el superantígeno está
fusionado por el extremo C-terminal al dominio
C_{H}1 del fragmento Fab del anticuerpo a través de un fragmento
enlazador flexible de aminoácidos hidrófilos de
3-11 residuos. Este fragmento enlazador puede tener
la secuencia Gly-Gly-Pro o
Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro
(SEQ ID NO: 19) o puede tener 4-9 residuos basados
en SEQ ID NO: 19, siendo preferido SEQ ID NO: 19. El resto del
inmunomodulador está fusionado por el extremo
C-terminal a la cadena ligera a través de un
fragmento enlazador hidrófilo y con carga neutra o con carga
positiva, de 10-20 residuos (fragmento enlazador
Q). Preferiblemente, el fragmento enlazador Q puede tener las
siguientes secuencias:
Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg
(SEQ ID NO: 23),
Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg
(SEQ ID NO: 20),
Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg
(SEQ ID NO: 21) o
Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr
(SEQ ID NO: 22), siendo los más preferidos los SEQ ID NO: 20 y 21
(para mayor información, véase el Ejemplo 2).
Las combinaciones análogas por la terminación
amino o la combinación de uniones por las terminaciones amino y
carboxi del dominio VH y del dominio VL se pensó en este momento que
producían conjugados activos pero menos eficaces.
Superantígenos (Sag) libres: Véase en el
epígrafe "Definición". En los epígrafes "Técnica
Anterior-..." y "B. La parte del superantígeno Sag" se
proporcionan Sag típicos.
Inmunomoduladores no conjugados: Véase en
el epígrafe "Definición". En principio, se pueden usar los
mismos inmunomoduladores mencionados en el epígrafe "A. El
inmunomodulador IM". Son preferidas las citoquinas y
quimioquinas, con énfasis en la IL-2 y en las
citoquinas similares a IL-2.
Inmunomoduladores dirigidos (conjugados de T,
IM): Estos conjugados satisfacen la fórmula general:
Fórmula
III(T{'})_{x}(IM{'})_{z}
en la que T' e IM' están unidos
entre sí por un fragmento enlazador orgánico B'. T', IM' y B' se
seleccionan entre los mismos grupos de compuestos/estructuras que
T, IM y B. Las letras x y z son números enteros que se seleccionan
típicamente entre 0-10, tales como
0-5, y representan el número de restos de T e IM,
respectivamente, presentes en una molécula de conjugado
determinada, con preferencia por uno o dos IM' por cada T' y por
molécula de conjugado. Los puntos para las uniones entre T' e IM'
son según se han definido en lo que antecede. Véase también en el
epígrafe "E. Puntos para las uniones entre..." en el que las
fórmulas 1-8 y los comentarios a ellas son también
aplicables a los conjugados de T, IM excepto que Sag se ha omitido.
Los conjugados de la fórmula III se pueden preparar conforme a
técnicas conocidas, es decir, técnicas convencionales de formación
de enlaces químicos o técnicas recombinantes (proteínas de fusión),
con preferencia para estas últimas (Fell y col., documento EP
439095; Rosenblum y col., documento EP 396387). De manera
particularmente importante, los conjugados formados por T e IM
comprenden un resto IM' que ha sido modificado, por ejemplo, ha sido
mutado, para disminuir la afinidad y/o para disminuir la velocidad
de internalización según se ha definido en los
antecede.
Superantígenos dirigidos (conjugados formados
por T y Sag): Estos conjugados satisfacen la fórmula
general:
Fórmula
IV(T{''})_{x}(Sag{''})_{y}
en la que T'' y Sag'' están unidos
entre sí por fragmentos enlazadores B'' orgánicos. T'', Sag'' y B''
se seleccionan entre los mismos grupos de compuestos/estructuras
que T, IM y B. Las letras x e y son números enteros que se
seleccionan típicamente entre 0-10, tales como
0-5, y representan el número de restos de T e IM,
respectivamente, presentes en una molécula de conjugado determinada,
con preferencia por uno o dos Sag'' por cada T'' y por molécula de
conjugado. Los puntos de unión entre T'' y Sag'' son según se han
definido en lo que antecede. Véase también en el epígrafe "E.
Puntos de unión entre..." en el que las fórmulas 1 - 8 y los
comentarios a ellas son también aplicables a los conjugados formados
por T y Sag excepto que IM está omitido en la fórmula. Los
conjugados de la fórmula II se pueden preparar conforme a técnicas
conocidas, es decir, técnicas convencionales de formación de
enlaces químicos o técnicas recombinantes (proteínas de fusión),
con preferencia por las primeras. Véanse por ejemplo Dohlsten y
col., documento WO9201470; Abrahmsén y col., documento WO 9601650;
Antonsson y col., documento
WO 9736932.
WO 9736932.
Las enfermedades a tratar son en principio las
mismas que las previamente sugeridas en relación con los
superantígenos. Véase, por ejemplo, en los anteriores epígrafes
"Técnica anterior-...". Ejemplos ilustrativos son cánceres,
enfermedades autoinmunitarias, infestaciones parasitarias,
infecciones víricas y otras enfermedades asociadas a células que
expresan en sus superficies antígenos del MHC de clase II y/u otras
estructuras que son específicas de la enfermedad respectiva y que
se unen al resto buscador de células diana incorporado en el
superantígeno de acuerdo con el planteamiento teórico de la
invención (fórmula I). También se pueden combatir infecciones
bacterianas con el uso de esta invención.
Formas importantes de cáncer en el contexto de
la invención son: melanomas, carcinomas, neoplasias hematopoyéticas
y fibrosarcomas, e incluyen formas específicas tales como carcinoma
de células escamosas, cánceres de mama, carcinomas de cabeza y
cuello, carcinomas de tiroides, carcinomas de tejidos blandos,
sarcomas óseos, cáncer testicular, cáncer prostático, cánceres
ováricos, cánceres de vejiga, cánceres de piel, cánceres de mama,
angiosarcomas, hemangiosarcomas, tumores de células cebadas,
cánceres hepáticos primarios, cánceres del pulmón, cánceres de
cérvix, carcinomas de células renales, leucemias y linfomas. Están
incluidos cualquier todos los tipos de tumores benignos o malignos
así como también cánceres resistentes a multitud de fármacos,
cánceres metastásicos, formas diversas de cánceres inducidos
mediante métodos químicos o por virus (herpes, SV40, HIV,
etc.).
La preparación de los conjugados se puede llevar
a cabo en principio conforme a dos rutas principales:
1. Formación de enlaces químicos entre las
subunidades individuales T, Sag e IM. Cada una de las subunidades
individuales o cada combinación de las mismas se puede haber
producido mediante técnicas recombinantes.
2. Técnicas recombinantes que proporcionan
directamente un conjugado como los definidos en cualquiera de las
fórmulas anteriormente mencionadas.
Los métodos factuales son muy conocidos por el
experto medio y comprenden una gran cantidad de variantes.
La formación de enlaces químicos típicamente
utiliza grupos funcionales (por ejemplo, grupos amino primarios,
grupos carboxi, grupos mercapto, grupos carbohidrato) que
típicamente están presentes de manera natural en varias posiciones
de los superantígenos, de los inmunomoduladores proteínicos y de los
restos proteínicos de direccionamiento. Estos métodos son muy
conocidos en la técnica.
La principal célula hospedadora para una
producción recombinante a gran escala de los conjugados de la
invención formados por un superantígeno y un inmunomodulador
(formas fusionadas así como también formas no conjugadas) es E.
coli. Este hospedador proporciona en principio dos rutas: la de
producción intracelular y la de secreción. Se prefiere esta última
variante ya que ofrece la purificación de las proteínas
correctamente plegadas a partir del periplasma y del medio de
cultivo. Lo anteriormente dicho no excluye que sea posible producir
conjugados activos también en otras células hospedadoras, por
ejemplo, en células eucariotas, tales como levaduras o células de
mamíferos. Los resultados preliminares hasta ahora han indicado que
las células eucariotas, tales como las células de mamíferos, se
pueden preferir para incorporar inmunomoduladores que interaccionen
con CD28, por ejemplo, B7 y sus
análogos.
análogos.
Segundo aspecto de la
invención
Un segundo aspecto de la invención lo constituye
una molécula de ácido nucleico recombinante, preferiblemente DNA,
tal como cDNA o RNA, que codifica un superantígeno y un
inmunomodulador según se ha definido en lo que antecede, con
preferencia por IL-2, IL-7,
IL-12, IL-15, IL-18,
RANTES, dominio ectópico de CD80, dominio ectópico de CD86,
4-BB1L y Flt3L, y sus análogos según se han definido
en lo que antecede. En este aspecto de la invención, el ácido
nucleico típicamente debería contener secuencias reguladoras de
control, tales como secuencias reguladoras de la traducción, un
origen de replicación, secuencias señal de secreción, ya sea para el
inmunomodulador o para el superantígeno, o para ambos de ellos,
etc., que sean compatibles con la célula hospedadora en la que el
inmunomodulador y el superantígeno se han de expresar. La región
situada entre las secuencias de las partes que codifican el
superantígeno y el inmunomodulador puede comprender una secuencia
que codifica sitios de entrada para el ribosoma tal como sucede en
construcciones génicas bicistrónicas. Estas últimas permitirán la
expresión independiente de cada una de las cadenas polipeptídicas
comprendidas en el conjugado. En el caso de combinaciones
multicatenarias de los conjugados que contienen un conjugado formado
por IM, Sag y el resto de direccionamiento, y las secuencias señal
apropiadas, las construcciones bicistrónicas facilitarán el
plegamiento y ensamblaje de los conjugados plenamente activos, con
el IM unido a una de las cadenas. Esto será importante en los casos
en los que el resto de direccionamiento es una molécula de
anticuerpo bicatenaria y al menos uno de entre el superantígeno
(Sag) y el inmunomodulador está fusionado a un extremo terminal de
la cadena del anticuerpo. Véase lo que
antecede.
antecede.
Un tercer aspecto de la presente invención lo
constituye una composición farmacéutica que contiene la combinación
de la invención formada por un superantígeno (Sag), un resto de
direccionamiento (T) y un inmunomodulador (IM). El rasgo
característico de este aspecto de la invención es que al menos uno
de entre el superantígeno y el inmunomodulador está en forma de un
conjugado que permite el direccionamiento hacia las células que han
de ser inactivadas según se ha descrito en lo que antecede.
Las composiciones contempladas son conocidas en
éste campo técnico, a excepción de que ahora contienen la
combinación de conjugados de la invención. En una composición
particular la combinación puede comprender:
a. un conjugado triple que comprende un
superantígeno (Sag), un resto de direccionamiento (T) específico
para las células diana y un inmunomodulador (IM) (conjugado formado
por T, IM y Sag);
\newpage
b. dos conjugados dobles, uno formado por un
anticuerpo encargado del direccionamiento (T) y un superantígeno, y
otro formado por un anticuerpo encargado del direccionamiento (T') y
un inmunomodulador (es decir, un conjugado de T y Sag + un
conjugado de T' e IM). T y T' pueden ser iguales o diferentes en
cuanto a la especificidad de
epítopo.
epítopo.
c. un conjugado doble formado por un
superantígeno (Sag) y un resto de direccionamiento (T), y por un
inmunomodulador (IM) en forma libre (conjugado de T y Sag +
IM).
Véase más arriba en lo referente a los
conjugados de la invención. Cuando las composiciones contienen dos
componentes activos (anteriores apartados b-c), la
composición pueden permitir guardar los componentes por separado
hasta el momento de su administración.
Las composiciones pueden estar en forma de un
material en partículas y liofilizado, de una disolución esterilizada
o producida en condiciones asépticas, de un comprimido, una
ampolla, etc. Pueden estar presentes vehículos tales como agua
(preferiblemente agua tamponada a un valor de pH fisiológicamente
aceptable, por ejemplo, PBS) u otros materiales sólidos o líquidos
inertes. En términos generales, las composiciones se preparan con
el conjugado, posiblemente en combinación con un componente activo
no conjugado, mezclándolas con, disolviéndolas en, uniéndolas a, o
combinándolas de alguna otra manera con uno o más vehículos acuosos
o no acuosos, solubles o no solubles en agua, junto con aditivos y
adyuvantes adecuados en caso necesario. Es imperativo que los
vehículos y las condiciones no afecten adversamente la actividad de
los componentes activos según se han definido en los anteriores
apartados
a-c.
a-c.
Normalmente los superantígenos (SAG) que han de
ser usados en la invención se comercializarán y administrarán en
dosificaciones previamente preparadas, conteniendo cada una de ellas
una cantidad efectiva de SAG que, sobre la base de los resultados
que aquí se presentan, se piensa que esté en el intervalo de 1 pg -
50 mg. La dosificación exacta variará de un caso a otro dependiendo
del peso y la edad del paciente y del título previo de anticuerpos
específicos para el SAG usado, de la vía de administración, del tipo
de enfermedad, del resto buscador de células diana, del
superantígeno, de las uniones (-B-), del inmunomodulador, etc.
Un factor importante a tener en cuenta al
determinar la dosis de una combinación que se ha de usar en el
método de la invención es que los superantígenos y los
inmunomoduladores se empleen en intervalos de dosis óptimos. Una
dosis demasiado baja dará como resultado la ausencia de efecto o un
efecto subóptimo, y una dosis demasiado alta dará lugar a efectos
secundarios inaceptables, tales como una toxicidad que puede ser
letal. Por ello se ha de hacer hincapié en que el amplio intervalo
de dosis anteriormente mencionado es un intento para abarcar todos
los intervalos posibles para todas las variantes del método de la
invención. Así pues, cada una de las combinaciones específicas
según el método de la invención tiene un subintervalo de dosis
dentro del intervalo desde 0,1 pg hasta 50 mg. Esto no excluye que
progresos y resultados futuros puedan conducir a niveles de dosis
fuera de este
intervalo.
intervalo.
Las vías de administración serán las comúnmente
contempladas dentro de este campo técnico, es decir, una cantidad
efectiva o terapéuticamente activa para matar células diana, de una
combinación de superantígeno-inmunomodulador según
la invención, se pone en contacto con las células diana. Para las
indicaciones anteriormente especificadas, esto quiere decir en la
mayoría de los casos una administración parenteral, tal como una
inyección o infusión (por vía subcutánea, intravenosa,
intra-arterial, intramuscular, intraperitoneal) a un
mamífero, tal como un ser humano. La combinación de conjugados de
la invención se puede administrar localmente o por vía
sistémica.
Con la expresión "cantidad efectiva para matar
células diana" se contempla que esa cantidad es efectiva para
activar y dirigir las células T para que destruyan las células
diana.
Las vías de administración preferidas en la
fecha de prioridad son las mismas que las contempladas para los
conjugados con superantígenos según Dohlsten y col., documento
WO9201470; Abrahmsén y col., documento WO9601650 y Antonsson y
col., documento PCT/97/00537. Esto significa una infusión
intravenosa durante 1 - 5 horas (preferiblemente durante 4 horas)
cada día, combinada con un agente antipirético (paracetamol). La
administración se ha de repetir durante algunos días, por ejemplo,
durante 5 - 8 días, teniendo en especial consideración el riesgo de
estimular anticuerpos dirigidos contra el conjugado. Óptimamente, se
administrarán varios ciclos de terapia, conteniendo cada ciclo el
tratamiento durante uno o más días, seguidos de un período de
descanso durante uno o más días, p. ej., ciclos de tratamiento y
descanso durante 5 días y 2 días respectivamente.
Las composiciones de la invención se pueden
administrar ya sea como terapia principal o, en las modalidades
preferidas, como terapia adyuvante en conexión con una cirugía o con
otros fármacos.
Figura 1. Análisis de FACS de células
CHO-CD28 inmunoteñidas con
CD80-C215Fab,
CD80-C215Fab-SEAm57 o
C215Fab-SEA seguido de incubación con un mAb
anti-cadena kappa de ratón, marcado con PE. La
inmunotinción se realizó a 4ºC sin lavados. Ordenadas: canal
principal.
Figura 2. Análisis de FACS de células Colo205
inmunoteñidas con CD80-C215Fab,
CD80-C215Fab-SEAm57 o
C215Fab-SEA seguido de incubación con un mAb
anti-cadena kappa de ratón, marcado con PE. La
inmunotinción se realizó a 4ºC con tres lavados entre cada etapa de
inmunotinción. Ordenadas: canal principal. Abcisas: Proporción entre
células efectoras (E) y células diana (T).
Figura 3. Proliferación. Se incubaron células T
con células Colo205 y con C242Fab-SEA 4 \muM y con
cantidades variables de CD80-C215Fab, durante 4
días, después de los cuales se midieron las cuentas de la
^{3}H-timidina incorporada. La actividad obtenida
en ausencia de CD80-C215Fab fue 20.039 cpm +/- 1.750
cpm.
Figura 4. Producción de IL-2.
Se incubaron células T con células Colo205 y con
C242Fab-SEA 4 \muM y con cantidades variables de
CD80-C215Fab, durante 4 días, después de los cuales
el sobrenadante se recogió y se determinó la cantidad de
IL-2. La actividad de IL-2 obtenida
en ausencia de CD80-C215Fab fue 2.849 pg/ml.
Figura 5. Proliferación. Se incubaron células T
con células Colo205 y con cantidades variables de
CD80-C215Fab-SEAm57 o
C215Fab-SEAm23 durante 4 días, después de los cuales
se midieron las cuentas de la ^{3}H-timidina
incorporada.
Figura 6. Producción de IL-2. Se
incubaron células T con células Colo205 y con cantidades variables
de CD80-C215Fab-SEAm57 o
C215Fab-SEAm23, durante 4 días, después de los
cuales se recogieron los sobrenadantes y se determinó el contenido
en IL-2.
Figura 7. Capacidad proliferativa de células T
de sangre humana, incubadas durante 7 días con las proteínas
indicadas y con células CHO transfectadas e irradiadas (para la
presentación de SEA). Ordenadas: Incorporación de
^{3}H-timidina (cpm).
Figura 8. La administración simultánea de la SEA
dirigida y de IL-2 da lugar a un aumento de la
activación de las células T in vivo. Citotoxicidad
(expresada en forma de porcentaje) contra células Raji, MHC de
clase II^{+}, revestidas con SEA, por parte de esplenocitos de
ratones tratados con 1 ó 3 inyecciones de C215FabSEA (FS),
C215Fab-Q-hIL2 (FI), con una
combinación de los dos (FS + FI) o con
C215FabSEA-Q-hIL2 (FSI). La
proporción células efectoras:células diana fue 30:1 y la
citotoxicidad se midió en un ensayo estándar de liberación de
^{51}Cr en
4 h.
4 h.
Figura 9. Terapia de tumores
B16-C215 en el día 5, en ratones C57Bl/6, con tres
inyecciones (en los días 5, 6 y 7 después de la inoculación del
tumor) de C215FabSEA (FS),
C215Fab-Q-hIL2 (FI), C215FabSEA +
C215Fab-Q-hIL2 (FS + FI) o
C215Fab-Q-hIL2 (FSI). Se usaron
cantidades equimolares de FabSEA y
Fab-Q-hIL2. Abcisas: cantidad de
proteína inyectada. Ordenadas: disminución del tumor expresada en
porcentaje.
Figura 10. Aumento de la infiltración de células
T CD25^{+} en el tumor después de un tratamiento con
C215Fab-SEA (FS),
C215Fab-Q-IL2 (FI) o
C215FabSEA-Q-IL2. Las células
CD25^{+} que se infiltraron en el pulmón de ratones portadores de
los tumores de pulmón B16-GA733 establecidos, se
estimaron mediante estudio inmunohistoquímico. Ordenadas:
porcentaje del área inmunoteñida. Abscisas: 1 = PBS; 2 = primera
inyección; 3 = segunda inyección; 4 = tercera inyección; 5 = cuarta
inyección.
Figura 11. Niveles mantenidos de Interferón
\gamma después de hasta cuatro inyecciones, una vez al día (37
mg/inyec-
ción), de C215FabSEA-Q-hIL2 (FSI) (37 mg). La sangre ser recogió cuatro horas después de la última inyección y el contenido en interferón \gamma (en ordenadas) se determinó mediante medida por ELISA usando como estándar Interferón \gamma murino recombinante (Pharmingen). Se realizó un experimento similar con cantidades equimolares (30 mg/inyección) de C215FabSEA (FS).
ción), de C215FabSEA-Q-hIL2 (FSI) (37 mg). La sangre ser recogió cuatro horas después de la última inyección y el contenido en interferón \gamma (en ordenadas) se determinó mediante medida por ELISA usando como estándar Interferón \gamma murino recombinante (Pharmingen). Se realizó un experimento similar con cantidades equimolares (30 mg/inyección) de C215FabSEA (FS).
Figura 12. Citotoxicidad (expresada en forma de
porcentaje en ordenadas), contra células Raji, MHC de clase
II^{+}, revestidas con SEA, por parte de esplenocitos de ratones
tratados con PBS o con 1, 4 ó 6 inyecciones de
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2 (=
FSm9-IL2). La citotoxicidad se midió en un ensayo
estándar de liberación de ^{51}Cr en 4 h. Se usó PBS como control
negativo.
Figura 13. Terapia de tumores
B16-C215 en el día 3, en ratones C57 Bl/6 después de
un tratamiento con 8 inyecciones de C215FabSEA_{D227A} (= FSm9) o
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2 (=
FSm9-IL2). El tratamiento se administró diariamente
durante 8 días consecutivos. Los animales fueron sacrificados en el
día 21 y se efectuó el recuento de las metástasis pulmonares.
Ordenadas: disminución del tumor expresada en porcentaje.
Figura 14. Terapia de tumores
B16-C215 en el día 3, en ratones transgénicos Vb3
TCR después de un tratamiento con 8 inyecciones de
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2_{F42A}
(= FSm9-IL2 (F42A)),
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2 (=
FSm9-IL2) o C215FabSEA_{D227A} (=
FSm9-IL2). El tratamiento se administró diariamente
durante 8 días consecutivos. Los animales fueron sacrificados en el
día 21 y se efectuó el recuento de las metástasis pulmonares.
Ordenadas: disminución del tumor expresada en porcentaje.
Figura 15. Terapia de tumores
B16-C215 en el día 3, en ratones transgénicos Vb3
TCR después de un tratamiento con 8 inyecciones de
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2_{F42A}
(F42A),
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2_{F42E}
(F42K) o C215Fab
SEA_{D227A}-Q-hIL2_{F42A/D20S} (F42A/D20S). El tratamiento se administró diariamente durante 8 días consecutivos. Los animales fueron sacrificados en el día 21 y se efectuó el recuento de las metástasis pulmonares. Ordenadas: disminución del tumor expresada en porcentaje.
SEA_{D227A}-Q-hIL2_{F42A/D20S} (F42A/D20S). El tratamiento se administró diariamente durante 8 días consecutivos. Los animales fueron sacrificados en el día 21 y se efectuó el recuento de las metástasis pulmonares. Ordenadas: disminución del tumor expresada en porcentaje.
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Ejemplo
1
Sumario: Se han construido las proteínas
de fusión CD80-C215Fab y
CD80-C215Fab-SEAm57 de manera que
contienen el dominio extracelular del CD80 humano. Las proteínas de
fusión se produjeron en células de mamífero y se ensayaron, con
respecto a su unión a CD28 usando transfectantes de células CHO, y
con respecto a su unión al antígeno C215 usando células Colo205.
Ambas proteínas de fusión se unieron a CD28 y al antígeno C215,
siendo esta última unión 100 veces menor en comparación con la de
C215Fab-SEA. Debido a que CD80 está unido a la
parte N-terminal de la cadena L, es posible el resto
de CD80 interfiera con la unión de C215Fab. Ambas proteínas de
fusión coestimulan a las células T humanas activadas por SAG,
demostrando que el CD80 soluble conserva su función biológica.
Técnicas de DNA recombinante y enzimas:
Las preparaciones de DNA plasmídico y el resto de las operaciones
se realizaron esencialmente según Sambrook y col., (Sambrook y col.,
1989). E. coli HB101 (Boyer y col., 1969) se usó como cepa
hospedadora. Las endonucleasas de restricción y el fragmento de
Klenow de la DNA-polimerasa I se obtuvieron
procedentes de Boehringer Mannheim o de New England
Biolabs y se usaron conforme a las recomendaciones de los
proveedores. La Taq-polimerasa se obtuvo procedente
de Perkin Elmer. Se preparó cDNA a partir de RNA total
usando el kit GeneAmp para PCR de RNA
(Perkin-Elmer). Los oligonucleótidos se
sintetizaron en un sintetizador de DNA/RNA Gene Assembler
(Pharmacia Biotech AB) o ABI 392 (Applied
Biosystems) y se purificaron mediante cromatografía en fase
inversa en un sistema de FPLC (Pharmacia Biotech.). La
secuenciación se realizó según el principio de terminación didesoxi
de las cadenas (Sanger y col., 1977) usando el kit de
secuenciación Taq DyeDeoxy Termination Cycle de Applied
Biosystems y los productos se separaron y se detectaron en un
secuenciador de DNA ABI 373A (Applied Biosystems). Se
seleccionaron las bacterias que albergaban plásmidos diferentes
sobre placas que contenían YT 2X y 15 g de agar base por litro,
suplementado con kanamicina 70 mg/l, o con ampicilina 100 mg/l. El
caldo líquido fue YT 2X (por cada litro: 10 g de extracto de
levadura (Difco), 16 g de triptona (Difco) y 5 g de NaCl).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los genes que codifican un fragmento Fab que
contiene los dominios variables del anticuerpo C215 murino se
ensamblaron según ha sido descrito previamente (Dohlsten y col.,
1994). La clonación y mutagénesis del gen de la enterotoxina A
estafilocócica (SEA) que produce las sustituciones F47A y D227A ha
sido descrita previamente (Abrahmsén y col., 1995). Otras tres
mutaciones se introdujeron en el gen de la SEA usando los cebadores
LAKQ88-93 (todos los oligonucleótidos están
reunidos en la Tabla I) para obtener el mutante 57 de SEA. LAKQ5 y
LAKQ7 se usaron en la RT-PCR pata introducir una
caja de Kozak en dirección aguas arriba y para clonar el gen que
codifica el péptido señal y la parte extracelular de CD80 humano a
partir de RNA total de bazo humano. Se encontró que la secuencia de
nucleótidos correspondía a la secuencia de CD80 del banco de genes
(Número de registro M27533). Se prepararon dos variantes del gen de
CD80 que tienen diferentes sitios de clonación en el extremo 3': en
PCR independientes los cebadores LAKQ30 y LAKQ108 se usaron para
obtener un sitio BssHII o un sitio MroI respectivamente. Una fusión
génica que codifica un CD80 fusionado delante de la cadena kappa
por medio de un fragmento enlazador Q (Wooton y col., 1989), se
construyó insertando el DNA enlazador LAKQ37/38
BssHII-Esp3I, entre el gen de CD80 relevante y un
sitio DsaI que precede inmediatamente al gen kappa. El plásmido
pKGE987 se obtuvo insertando la fusión génica que codifica
CD80-(fragmento enlazador Q)-kappa, precedida por
el péptido señal de CD80, en un vector que, además de un promotor de
CMV y una cola de poli A, contiene un gen de neomicina para ser
usado en la selección de los transformantes. Esta última versión del
gen de CD80 se usó para construir una fusión génica en la que este
gen precede a la fusión génica Fd-mutante 57 de SEA:
un fragmento de DNA (LAKQ117/118) que codifica un fragmento
enlazador Q se insertó entre un sitio MroI del gen CD80 y un sitio
PstI situado en el codón 4 y 5 del gen de C215 VH. Esta fusión
génica se insertó en un segundo vector que contiene el promotor de
CMV para obtener el plásmido pMB189, que codifica por lo tanto el
péptido señal y la porción extracelular de CD80 seguida de Fd y del
mutante 57 de SEA, conectados por el espaciador de tres residuos
GGP. En el plásmido pKGE961, el gen de Fd se ha insertado detrás de
una secuencia señal (derivada de otro gen de VH murino). El
plásmido pMB156 codifica la cadena kappa natural, precedida por su
péptido señal natural, y contiene el gen de la
neomicina.
neomicina.
Células 293 de riñón embrionario de hámster se
transfectaron o con pKGE961 y pKGE987, o con pMB156 y pMB189, para
obtener líneas celulares que producen CD80-C215Fab y
CD80-C215Fab-SEAm57,
respectivamente. Para obtener líneas celulares estables, el medio
de selección fue DMEM sin rojo de fenol (Pharmacia Núm. MS
0127) suplementado con L-glutamina (GIBCO BRL, Núm.
25030-24), suero bovino de ternera al 10% y
Geneticina 1 mg/ml. El medio de producción fue DMEM sin rojo de
fenol, suplementado con L-glutamina y HSA al 0,1%
(Pharmacia & Upjohn AB, Suecia). Las proteínas de fusión
se purificaron a partir del medio de cultivo filtrado (Sartobran
0,65 \mum - 0,4 \mum) mediante cromatografía de afinidad sobre
Sepharose FF con proteína G (Pharmacia Biotech, AB),
seguida de una purificación por afinidad a anti-CD80
(anticuerpo anti-CD80 humano inmovilizado; Camfolio
L307.4) o mediante cromatografía de intercambio iónico sobre SP
Sepharose FF (Pharmacia Biotech.).
Reactivos. El Medio RPMII 1640 (Gibco,
Middlesex, UK) suplementado con L-glutamina 2 mM
(Gibco, Middlesex, UK), HEPES 0,01 M (Biological Industries,
Israel), NaHCO_{3} 1 mM (Biochrom KG, Berlín, Alemania),
sulfato de gentamicina 0,1 mg/ml, (Biological Industries,
Kibbutz Beit Haemek, Israel), piruvato sódico 1 mM (JRH
Biosciences Industries, EE. UU.) y suero bovino fetal,
inactivado con calor, al 10% (Gibco Middlesex, UK) se usó
como medio completo para todos los cultivos celulares.
Anticuerpos. Los mAb dirigidos contra
CD57 (HNK1) y contra CD56 (HB55) humanos se obtuvieron a partir de
células de hibridoma productoras de mAb (American Type Culture
Collection, Rockville, MD.). El mAb anti-cadena
kappa de ratón, marcado con PE, se obtuvo procedente de Becton
Dickinson (San Jose, CA).
Células. Células K1 de ovario de hámster
chino (CHO) se transfectaron con el cDNA humano que codifica el gen
CD28, en Pharmacia and Upjohn, Estocolmo, Suecia. Los
transfectantes se analizaron mediante métodos de rutina con
respecto a la expresión de CD28 y se mantuvieron mediante la técnica
de clasificación celular FACS en niveles de expresión de antígeno
similares. La línea celular Colo205 de carcinoma de colon humano se
obtuvo procedente de la ATCC. Todas las líneas celulares se
encontraban libres de micoplasmas.
Ensayo de proliferación de linfocitos T.
Las células T se obtuvieron a partir de células mononucleares
humanas de sangre periférica (PBM) (del inglés, "human
Peripheral Blood Mononuclear cells")
según ha sido descrito previamente (Lando y col., 1996) mediante el
método de selección negativa de tapizado (del inglés,
"panning") de una superficie con mAb específicos para
CD57, HLA-DR4, CD14 y CD56. Todos los ensayos con
células T se realizaron con 0,1 x 10^{6} células/pocillo, en
volúmenes de 200 \mul, utilizando placas de 96 pocillos de fondo
plano (Nunc, Roskilde, Dinamarca). La síntesis de DNA se estudió
después de exponer los cultivos a
[^{3}H]-timidina [^{3}H]TdR (0,5
mCi/pocillo) según ha sido descrito con anterioridad (10).
Análisis mediante citometría de flujo. La
clasificación y análisis mediante citometría de flujo se realizaron
conforme a un montaje estándar en un citómetro de flujo
FACStar^{Plus} (Becton Dickinson, Mountain View,
CA). Debido a la baja afinidad de CD80 por CD28, la inmunotinción
de las células CHO-CD28 con las proteínas de fusión
CD80-C215Fab se hizo omitiendo los lavados de las
células.
Ensayo de determinación citoquina. La
producción de IL-2 se analizó usando un kit
de ELISA de determinación de IL-2
(huIL-2 Duoset, Genzyme).
Descripción de las proteínas de fusión
CD80-Fab. El resto de Fab es un isotipo IgG1/k
murino aunque contiene los dominios variables del anticuerpo
monoclonal C215, IgG2A/k (Dohlsten y col., 1995). La secuencia del
tripéptido GGP va a continuación de la cisteína que forma el enlace
disulfuro intercatenario en el dominio CH1. En la proteína de
triple fusión CD80-C215Fab-SEAm57,
este tripéptido actúa como espaciador entre Fd y un mutante de la
enterotoxina A estafilocócica (SEA; Betley y col., 1988) que
contiene cinco sustituciones. Las sustituciones F47A y D227A se
introdujeron para disminuir la afinidad por el MHC de clase II
(Abrahamsén y col., 1995) y las sustituciones N102Q, N149D y T218V
se introdujeron para evitar una glicosilación fortuita cuando las
proteínas se producen en células eucariotas. Estas últimas
sustituciones se seleccionaron con la ayuda de la estructura
obtenida con rayos X (Sundström y col., 1996). Al
penta-mutante final se le denominó mutante 57 de
SEA. Ambas proteínas de fusión contienen el dominio extracelular
del CD80 humano (definido de manera que finaliza en FPDN). Se usó
el péptido señal natural de CD80 y se encontró que la proteína
madura comenzaba con VIHV, según se determinó mediante
secuenciación de aminoácidos de la CD80-C215Fab
purificada. Un espaciador de 18 aminoácidos conecta CD80 con la
cadena kappa presente en CD80-C215Fab, o con la
porción Fd del fragmento Fab en la proteína de triple fusión
CD80-C215Fab-SEAm57. Los
espaciadores se asemejan a un fragmento enlazador Q (Wooton y col.,
1996) y tienen las secuencias SARQANELPGAPSQEERA (SEQ ID NO 15) y
SARQANELPGAPSQEERP (SEQ ID NO 16)
respectivamente.
respectivamente.
Células CD28 positivas: Células
CHO-CD28 se inmunotiñeron con
CD80-C215Fab,
CD80-C215Fab-SEAm57 o
C215Fab-SEA seguido de incubación con un mAb
anti-cadena kappa de ratón, marcado con PE. La
inmunotinción se realizó a 4ºC sin lavados.
Tanto la proteína de fusión
CD80-C215Fab como la proteína de triple fusión se
unieron a CD28 expresado sobre células CHO en una manera
dependiente de la dosis. No se observó inmunotinción, como era de
esperar, con la proteína de fusión C215Fab-SEA de
control.
Células C215 positivas. La unión de las
proteínas de fusión frente al antígeno C215 se evaluó frente a
células Colo205. Las células Colo205 se inmunotiñeron con
CD80-C215Fab,
CD80-C215Fab-SEAm57 o
C215Fab-SEA seguido de incubación con un mAb
anti-cadena kappa de ratón, marcado con PE. La
inmunotinción se realizó a 4ºC con tres lavados entre cada una de
las etapas de la inmunotinción.
Resultados (figuras 1-2):
Tanto CD80-C215Fab como
CD80-C215Fab-SEAm57 se unieron a las
células Colo205 positivas al antígeno C215 en una manera
dependiente de la dosis. Esta unión fue 50 - 100 veces menor que la
de C215Fab-SEA. Esto indica que la introducción de
CD80 en la parte N-terminal de la proteína de fusión
pudiera interferir con la unión de la parte C215Fab al antígeno
C215.
Para determinar la actividad biológica de las
proteínas de fusión, éstas se ensayaron con respecto a la
coestimulación de células T activadas por superantígeno.
Proliferación: Las células T se incubaron
con células Colo205 y con C242Fab-SEA 4 \muM y
cantidades variables de CD80-C215Fab durante 4
días, pasados los cuales se midió la proliferación en forma de las
cuentas de la ^{3}H-timidina incorporada. La
actividad obtenida en ausencia de CD80-C215Fab fue
de 20.039 cpm +/- 1.750 cpm.
Producción de IL-2: Las
células T se incubaron con células Colo205 y con
C242Fab-SEA 4 \muM y cantidades variables de
CD80-C215Fab durante 4 días, pasados los cuales se
recogió el sobrenadante y se determinó la cantidad de
IL-2. La cantidad de IL-2 obtenida
en ausencia de CD80Fab-C215Fab fue de 2.849
pg/ml.
Resultados (figuras 3-4):
CD80-C215Fab coestimuló la activación de las células
T inducida por C242Fab-SEA en una manera
dependiente de la dosis, observada tanto en cuanto a la
proliferación como en cuanto a la producción de
IL-2.
Para determinar la actividad biológica de las
proteínas de triple fusión, células T purificadas se incubaron con
C215Fab-SEAm23 (siendo m23 la misma SEA mutante que
afecta a la unión al MHC de clase II, que se usó en la proteína de
triple fusión, es decir, Phe47Ala/Asp227Ala) o con
CD80-C215Fab-SEAm57 presentada sobre
células Colo205. Proliferación: Las cuentas de la
^{3}H-timidina incorporada se midieron después de
4 días. Producción de IL-2: Los sobrenadantes se
recogieron y el contenido de IL-2 se determinó
después de 4 días.
Resultados (figuras 5-6):
La proteína de triple fusión indujo activación de células T y
producción de IL-2 cuando se presentó sobre células
Colo205. No se observó esa actividad con la
C215Fab-SEAm23 lo que indica la importancia de la
coestimulación producida por CD80 para la activación. Debido a la
menor afinidad de unión de la proteína de triple fusión
(50-100 veces menor que la de
C215Fab-SEA, véanse los datos de FACS), la cantidad
real de la C215Fab-SEAm23 unida a las células es
probable que sea sustancialmente más alta que la de la proteína de
triple
fusión.
fusión.
\newpage
Ejemplo
2
Construcción de plásmidos de expresión de
IL-2. El cDNA de IL-2 se clonó
mediante RT-PCR usando un mRNA aislado de células
mononucleares de sangre periférica (PBM) humana que habían sido
estimuladas con el superantígeno SEA durante 24 horas. El mRNA se
aisló a partir de 5 x 10^{6} células usando un kit mRNA
Direct procedente de Dynal, Oslo, conforme a las instrucciones
del fabricante. El mRNA hibridado sobre bolitas magnéticas
revestidas con oligo(dT)_{26}, se eluyó calentando
a 95ºC. Posteriormente, se obtuvo un producto de PCR mediante una
RT-PCR, aprovechando las actividades de RT y
DNA-polimerasa de la Taq polimerasa. Una fracción
1/10 del mRNA eluido se mezcló con los cebadores
IL2-1 e IL2-2 de PCR y se llevó a
cabo una reacción de PCR estándar (30 ciclos). El producto
resultante de la PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa,
la banda se cortó en el gel y se purificó usando el kit
Prep-a-gene kit
(Bio-Rad). Después de una digestión con EcoRI y
BamHI, el fragmento se clonó en pBluescript KS II digerido con
EcoRI/BamHI. El inserto se secuenció y se confirmó que era idéntico
al cDNA de IL-2 previamente publicado por Taniguchi
y col., 1983). Sin embargo, como resultado de la reacción de PCR,
un segmento de DNA que codifica
Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg
(SEQ ID NO: 23),
"Gly-Pro-fragmento enlazador
Q", se había añadido en 5' al segmento que codifica la
IL-2 humana madura. Q-hIL2 se clonó
en un plásmido procedente de una colección de una casa comercial
(cortado con RsrII-KbaI) en forma de un fragmento
RsrII-NheI. El plásmido resultante, pMS306, dirige
la secreción de C215FabSEA-Q-hIL2
hacia el periplasma de E. coli. Los fragmentos enlazadores
situados entre los restos se optimizaron más de la siguiente
manera. Una región codificadora de un fragmento enlazador, que
codifica
Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Pro
(SEQ ID NO: 19) (que sustituye el
Gly-Gly-Pro original) se introdujo
entre las regiones que codifican el resto del superantígeno y el
resto de Fab usando una mutagénesis dirigida a sitio específico. De
manera similar, los fragmentos enlazadores
Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Prol-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg
(SEQ ID NO: 20),
Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg
(SEQ ID NO: 21) o
Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr
(SEQ ID NO: 22) sustituyeron el fragmento enlazador Q original
situado entre IL-2 y el resto del Fab. En el caso
de las combinaciones de las proteínas de doble fusión, también se
compararon las construcciones que llevaban la con
IL-2 fusionada a la cadena ligera o a la cadena
pesada,
respectivamente.
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Expresión de las proteínas de fusión en
fermentador. Las proteínas de fusión se expresaron en la cepa UL 635
de E. coli K-12 (xyl-7,
ara-14, T4^{R}, deltaompT) usando un plásmido que
contiene un gen de resistencia a kanamicina y el promotor lacUV5.
Bacterias procedentes de la preparación de reserva congelada se
incubaron a 25ºC durante aproximadamente 21 h en matraces provistos
de agitación que contenían (NH_{4})_{2}SO_{4} 2,5 g/l;
KH_{2}PO_{4} 4,45 g/l; K_{2}HPO_{4} 11,85 g/l; citrato
sódico 0,5 g/l; MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O 1 g/l; glucosa
monohidrato 11 g/l, kanamicina 0,11 mM y una disolución de elementos
traza en concentración de 1 ml/l (Forsberg y col., 1989), aunque
sin Na_{2}MoO_{4}\cdot2 H_{2}O. Las células se hicieron
crecer hasta alcanzar una OD_{600} de 1 - 2 y 450 ml del medio de
cultivo se usaron para inocular un fermentador (Chemap, Suiza)
hasta un volumen final de 5 litros. El medio de fermentación
contenía (NH_{4})_{2}SO_{4} 2,5 g/l; KH_{2}PO_{4}
9 g/l; K_{2}HPO_{4} 6 g/l; citrato sódico 0,5 g/l; glucosa
monohidrato 22 g/l; MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O 1 g/l; kanamicina
0,11 mM; 1 ml de adecanol (Asahi Denka Kogyo K. K., Japón) y
una disolución de elementos traza en concentración de 1 ml/l. El pH
se mantuvo en 7,0 mediante valoración con amoníaco al 25%, la
temperatura fue 25ºC y la aireación con aire atmosférico fue de 5
l/min. La presión parcial de O_{2} disuelto se controló para que
fuera del 30% aumentando la agitación desde 300 rpm hasta 1.000 rpm
durante la fase en discontinuo y regulando la alimentación de
glucosa al 60% (p/v) durante la fase alimentada en discontinuo. La
formación de producto se indujo a una OD_{600} de 50 añadiendo
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido,
IPTG, 0,1 mM. Después de la fermentación, las células se retiraron
mediante centrifugación a 8.000 x g durante 40 min a 4ºC. El medio
clarificado o se analizó y purificó directamente o se almacenó
a
-20ºC.
-20ºC.
Purificación de las proteínas de fusión.
El DNA presente en el medio clarificado se separó usando una
precipitación con polietilenimina al 0,19% y NaCl 0,2 M durante 30
min (Atkinson y Jack, 1973). Después de una centrifugación en las
condiciones anteriormente mencionadas, el sobrenadante se recogió y
la concentración de NaCl se ajustó a 0,5 M. Este medio se aplicó a
una columna de Sepharose-Proteína G (Pharmacia Biotech.
AB, Uppsala, Suecia) equilibrada con fosfato sódico 10 mM, NaCl
150 mM, pH 7,4, que contenía Tween 80 al 0,05%, PBST. La columna se
lavó luego con un volumen de PBST igual a 5 veces el volumen de la
columna y la proteína unida se eluyó con ácido acético 0,1 M, Tween
80 al 0,02%, pH 3,2. El pH de la muestra se ajustó a 5,0 usando
Tris-HCl 1 M, pH 8,0, y se aplicó a una columna de
SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech.) equilibrada con
acetato amónico 50 mM, Tween 80 al 0,02%. La columna se lavó luego
con un volumen de tampón de equilibrado igual a 2 veces el volumen
de la columna y la proteína de fusión se eluyó usando un gradiente
lineal de acetato amónico desde 50 mM hasta 500 mM durante el paso
de 10 volúmenes de la columna. Para las proteínas de fusión
C215Fab-IL2 se utilizó un pH de 6,0, mientras que
para las proteínas de triple fusión
C215Fab-SEA-IL2 el pH fue 5,7
durante la separación. Las proteínas de fusión se filtraron a
través de un filtro de 0,22 \mum y se guardaron a -70ºC. En caso
de estar más diluido, el eluido se concentra hasta una concentración
final de 0,5 mg/ml - 1 mg/ml usando un Centricon 30 (Amicon)
conforme a las instrucciones del fabricante.
Ensayos de citotoxicidad. Los ensayos de
citotoxicidad dependientes e independientes del MHC de clase II se
realizaron de la manera previamente descrita (Dohlsten y col.,
1990). Brevemente expuesto, en el caso de los ensayos dependientes
del MHC de clase II, células Raji marcadas con ^{51}Cr (2.500
células por pocillo en un volumen final de 200 \mul) se mezclaron
con una línea de células efectoras dependiente de SEA, generada
mediante incubación de células PBM humanas en presencia de niveles
bajos de hIL-2 recombinante. La proporción células
efectoras:células diana fue 30:1. En el caso de los ensayos
independientes del MHC de clase II, células colo205 C215^{+},
marcadas con ^{51}Cr (2.500 células), se incubaron con células
efectoras dependientes de SEA en una proporción E:T (células
efectoras:células diana) 45:1. El ^{51}Cr liberado en el medio se
determinó después de 4 horas de incubación mediante medida de las
cuentas por centelleo.
Ensayo de coestimulación in vitro en
células T humanas purificadas. Células T humanas naturales se
purificaron esencialmente de la manera descrita por Lando y col.,
(1993). Brevemente expuesto, se purificaron células T humanas
naturales a partir de células PBM de sangre humana mediante
centrifugación en gradiente de Ficoll, seguida de separación a lo
largo de columnas de gelatina, y por último de un método de
selección negativa mediante tapizado en placas de Petri que
contienen los mAb HNK1 y HLA-DR. Los experimentos de
proliferación en los que se usan células T humanas naturales se
realizaron esencialmente de la manera descrita por Lando y col.,
(1996). Brevemente expuesto, las células T naturales (100.000
células por pocillo) se mezclaron con células transfectantes CHO
irradiadas (10.000 células por pocillo) en un volumen total de 200
\mul de RPMI-1640 con suplementos (Lando y col.,
1993). En los experimentos con proteínas de fusión que contienen
IL-2, las células se incubaron durante 7 días en
presencia de una concentración 1 nM de las sustancias indicadas. En
el último día del experimento las células recibieron pulsos de
^{3}H-Timidina para medir su incorporación en el
DNA de las células en división.
Terapia contra tumores
B16-C215. La terapia se realizó esencialmente de
la manera previamente descrita (Dohlsten y col., 1994; Hansson y
col., 1997). En el día 0, los ratones C57Bl/6 recibieron una
inyección i.v. en la vena caudal con 75.000 - 150.000 células
B16-F10 singeneicas de melanoma. Estas células B16
expresaban el antígeno GA-733 humano reconocido por
el mAb de C215. En el día 1, 3 ó 5 se inició la terapia con
proteínas C215Fab. El experimento finalizó en el día 21, momento en
el que los pulmones se extirparon y se efectuó el recuento de los
tumores pulmonares diseminados.
Se realizaron estudios
inmunohistoquímicos de los pulmones de los animales que portaban
tumores B16-C215 en el día 18, esencialmente de la
manera previamente descrita (Dohlsten y col., 1995). Las muestras se
extrajeron 4 horas después de la última inyección. La zona
inmunoteñida se determinó manualmente.
Se realizaron estudios
inmunofarmacológicos esencialmente de la manera que se encuentra
descrita (Rosendahl y col., 1996). Los bazos procedentes de los
ratones C57Bl/6 que habían recibido 1 ó 3 inyecciones, una vez al
día, se extirparon 48 horas después de la última inyección y se
determinó la citotoxicidad dependiente de SEA, usando células Raji
como células diana en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr
según se ha descrito en lo que antecede. La proporción E:T (células
efectoras:células diana) fue 100:1.
Producción y purificación de proteínas de
fusión que contienen IL-2. Se construyó un
vector de expresión en E. coli que codifica una proteína de
triple fusión C215FabSEA-Q-hIL2.
Este vector codifica las dos subunidades de la proteína de triple
fusión en un mRNA bicistrónico transcrito desde el promotor LacUV5.
Cada una de esas dos subunidades está precedida por un péptido
señal que dirige la exportación hacia el espacio periplásmico de
E. coli. La primera subunidad es la VH de C215Fab seguida por
un fragmento enlazador Gly-Gly-Pro
(VH-C_{H}l-Gly-Gly-Pro-SEA).
La otra subunidad es la VK de C215Fab seguida por la CK de C242Fab,
que está unida a la IL-2 humana a través de un
fragmento enlazador
Gly-Pro-fragmento enlazador Q
(Vk-Ck-Gly-Pro-Q-hIL2).
La secuencia Gly-Pro-fragmento
enlazador Q (SEQ ID NO: 23) es una versión ligeramente modificada de
un fragmento enlazador natural encontrado en la proteína OmpR de
E. coli (Wootton y col., 1989). Véase el apartado de
materiales y métodos para una información más completa. También se
produjo una proteína de fusión
C215Fab-Q-hIL2. Esta proteína es
idéntica a C215FabSEA-Q-hIL2
excepto en que el resto de
Gly-Gly-Pro-SEA de
esta última proteína ha sido retirado. La secuencia de DNA
correspondiente está por consiguiente delecionada en el vector de
expresión. Se generaron derivados mutados de
C215FabSEA-Q-hIL2 mediante una
mutagénesis dirigida a sitio específico y mediada por PCR, con
métodos estándar, para producir una serie de proteínas tales como
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2 y
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2_{F42A}.
En variantes de la proteína de triple fusión generadas
posteriormente, la cisteína situada entre las subunidades está
sustituida por dos residuos de serina. Este cambio no afecta a la
actividad biológica.
Los plásmidos que codificaban proteínas que
contenían IL-2 se utilizaron para transformar la
cepa productora UL635 de E. coli y posteriormente se realizó
una fermentación. Las proteínas de fusión se purificaron a partir
del medio de cultivo usando una cromatografía de afinidad a proteína
G. Las variantes degradadas de las proteínas de fusión se retiraron
usando una cromatografía de intercambio iónico. Los productos
obtenidos fueron la proteína de fusión de longitud completa en al
menos el 90%, según se determinó mediante SDS-PAGE
(materiales y métodos). Usando el diseño óptimo de la proteína de
fusión, se obtiene una concentración de la proteína de fusión en el
medio de crecimiento de hasta 130 mg/l y por lo general se
obtuvieron 70 mg de la proteína de triple fusión por 1 litro de
medio.
Caracterización funcional de proteínas de
fusión con Fab que contienen IL-2. La capacidad
de las proteínas de fusión que contienen IL-2,
tales como C215FabSEA-Q-hIL2 y
C215Fab-Q-hIL2, para inducir la
proliferación de la línea CTLL-2 de células
murinas, dependiente de IL-2, fue esencialmente
similar a la de la IL-2 humana recombinante sobre
la base de una relación en concentración molar (datos no mostrados).
Además, la actividad de unión a antígeno y la actividad de SEA
presentadas por C215FabSEA-Q-hIL2 y
por C215FabSEA, se encontró que eran indistinguibles en varios
ensayos, lo que indica que no se producían efectos adversos por
introducir IL-2 en la molécula. Estos ensayos
incluyeron el de la capacidad para inducir la muerte de la línea
celular colo205 de cáncer de colon humano, C215^{+},
independiente del MHC de clase II, por acción de una línea celular
efectora de células T reactivas frente a SEA, en un ensayo de
liberación de ^{51}Cr en 4 horas. También la muerte de células
Raji (linfoma de rata) MHC de clase II^{+}, dependiente del MHC de
clase II, por acción de células T efectoras reactivas frente a SEA,
tuvo lugar con eficiencias similares (datos no mostrados). Una
evidencia más directa de que la capacidad de unión al antígeno C215
y al MHC de clase II no se alteraba se obtuvo mediante análisis de
FACS. La dependencia de la dosis que presentaba la capacidad de
unión de C215FabSEA y de
C215FabSEA-Q-hIL2 a las células Raji
se encontró que era similar sobre la base de una relación en
concentración molar (datos no mostrados). También se encontró que
la unión dependiente de la dosis de
C215FabSEA-Q-hIL2 y
C215Fab-Q-hIL2 a células colo205,
era similar a la observada en el caso de C215FabSEA (datos no
mostrados), lo que indica que la capacidad de unión a antígeno no
estaba alterada en las proteínas de fusión que contienen
IL-2.
Proliferación dependiente de
IL-2 e inducida por FabSEA. Las células T
humanas en reposo requieren una señal 1 y una señal 2, para iniciar
la activación y proliferación óptimas de las células T (Schwartz,
1990). Los superantígenos pueden aportar la señal 1, cuando se
presentan sobre a una célula. La IL-2, que es el
principal efector aguas abajo de la señalización B7/CD28, se espera
que proporcione la señal 2.
En la presente invención, usando células T en
reposo purificadas de sangre humana, se muestra que una proteína de
triple fusión C215FabSEA-Q-hIL2, o
una proteína C215FabSEA en combinación con
C215Fab-Q-hIL2 o con
IL-2 recombinante humana, efectivamente induce la
proliferación de células T in vitro (figura 7).
Células T humanas en reposo se incubaron con SEA
dirigida (C215FabSEA o
C215FabSEA-Q-hIL2) en presencia de
IL-2 (en forma de
C215Fab-Q-hIL2,
C215FabSEA-Q-hIL2 o de
IL-2 humana recombinante). La SEA se presentó sobre
células CHO irradiadas, transfectadas con el antígeno C215 (a través
de la parte del Fab), MHC de clase II/Dr, que se une a SEA. Células
CHO no transfectadas hicieron de control. A los 7 días de incubar
las células T con los transfectantes de células CHO y con las
sustancias en cuestión, se midió la proliferación por medio de la
incorporación de ^{3}H-Timidina al DNA.
C215FabSEA-Q-hIL2
indujo la proliferación de las células T humanas cuando se presentó
sobre células CHO transfectadas con el antígeno C215 humano
(CHO-C215), contra el que el Fab está dirigido
(figura 7). Así mismo, se indujo proliferación cuando la proteína
se presentó sobre CHO-Dr (MHC de clase II humano),
mientras que no se observó proliferación en presencia de células
CHO no transfectadas (CHO) o en ausencia de células CHO (R10).
C215FabSEA o C215Fab-Q-hIL2 no
indujeron una proliferación significativa por sí solas cuando se
presentaron sobre células CHO, lo que indica que tanto SEA como
IL-2 son efectivamente necesarias para inducir la
proliferación. Esto se confirmó, ya que la combinación de
C215FabSEA y C215Fab-Q-hIL2 o de
C215FabSEA e IL-2 humana recombinante, indujo un
efecto cualitativamente similar al inducido por
C215FabSEA-Q-hIL2. Esto también
demuestra que en este ensayo la IL-2 es necesaria
pero que, a diferencia de la SEA, no necesita estar unida a
células.
células.
C215FabSEA-Q-hIL2,
así como la combinación de C215FabSEA y
C215Fab-Q-hIL2, produce una
activación aumentada y mantenida de células T y una mejor
infiltración del tumor in vivo . Tanto
C215Fab-Q-hIL2+C215FabSEA como
C215FabSEA-Q-hIL2 fueron inductores
de la activación de las células T mucho más potentes que C215FabSEA,
según se midió por la capacidad de inducir la muerte de las células
diana de manera dependiente de SEA (figura 8). Brevemente expuesto,
los ratones recibieron 1 ó 3 inyecciones, administradas diariamente,
de las proteínas indicadas. Dos días después de la última
inyección, se extrajeron los bazos de los ratones tratados y se
determinó la actividad citotóxica contra células Raji revestidas
con SEA en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr en 4
h.
Tanto
C215FabSEA-Q-hIL2 como
C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2 indujeron
no sólo una activación de las células T aumentada sino también
mantenida. Los niveles de citoquinas séricas tales como el
IFN-gamma, que desciende drásticamente después de
la cuarta inyección de C215FabSEA, permanecen a un nivel muy alto
incluso después de la cuarta inyección de
C215FabSEA-Q-hIL2 (datos no
mostrados). En general, los niveles de IFN-gamma y
TNF-alpha fueron mucho más altos (hasta 10 veces
más altos) que en el caso de C215FabSEA.
Mejora en la terapia contra tumores
B16-C215 establecidos con un tratamiento combinado
con C215FabSEA y C215Fab-Q-hIL2.
El efecto de potenciación de la terapia antitumoral con FabSag, por
acción de IL-2, se investigó en el modelo del
melanoma B16 murino (Fig. 9). En el ejemplo mostrado, ratones C57
Bl/6 hembras, de 8 - 12 semanas de edad, se inocularon en el día 0
con 150.000 células B16 transfectadas con el antígeno
GA-733 de tumores humanos, contra el que el mAb
C215 está dirigido (en lo sucesivo B16-C215). Las
sustancias indicadas se inyectaron en los días 5, 6 y 7. Cada uno
de los puntos de datos corresponde a 7 animales. En el día 21 los
animales se sacrificaron y se efectuó el recuento de los tumores
B16 pigmentados con melanina que colonizaban los pulmones. En
varios experimentos se demostró que la combinación de C215FabSEA y
C215Fab-Q-hIL2 inducía una terapia
mejor que C215FabSEA en comparación con un control no tratado
(figura 9). En el experimento indicado, el tratamiento combinado
con C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2
proporcionó un mejor efecto terapéutico que el proporcionado por la
proteína de triple fusión
C215FabSEA-Q-hIL2.
Estudios inmunohistoquímicos posteriores
revelaron que la C215FabSEA sola o la combinación de C215FabSEA y
C215Fab-Q-hIL2 daba lugar a
cantidades similares de células T CD4 y T CD8 infiltrantes del tumor
B16-C215. Curiosamente sin embargo, el número de
células positivas a CD25 (IL2Ra), un buen marcador de la activación
de las células T, aumentó considerablemente entre la 3ª y la 4ª
inyección de
C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2 (figura
10). En cambio, disminuyó en el caso de C215FabSEA, lo que indica el
comienzo de la anergia. La calidad de las células T infiltrantes
parece por lo tanto ser más alta en el caso del tratamiento
combinado que en el caso del tratamiento con C215FabSEA sola, lo
cual puede ayudar a explicar el efecto terapéutico mejorado. Así
mismo, citoquinas séricas tales como el Interferón \gamma,
producidas de manera secundaria a la activación de las células T,
disminuyen notablemente después de la cuarta inyección de FabSEA
(Fig. 11). Con una proteína de triple fusión
FabSEA-Q-hIL2, sin embargo, los
niveles del Interferón permanecen en un nivel alto incluso después
de la cuarta inyección. Esta observación proporciona una indicación
adicional de que incluir IL-2 en la construcción
puede contrarrestar la anergia de las células T inducida por
Fab-SEA.
Mejora en la terapia contra tumores
B16-C215 con
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2. Los
superantígenos son mucho más tóxicos en seres humanos que en
ratones, en parte debido a que su afinidad por el MHC de clase II en
seres humanos es considerablemente más alta (Hansson y col., 1997).
La toxicidad sistémica de las proteínas FabSEA se prevé por lo
tanto que sea la principal limitación para la terapia en seres
humanos. Una de las maneras de aumentar la activación local en el
tumor (dependiente de Fab) frente a la inmunoactivación sistémica
(dependiente de SEA-MHC de clase II) consistiría en
disminuir la afinidad de SEA por el MHC de clase II. Tomando como
base la estructura cristalina de SEA, los autores de la invención
han hecho un mutante de C215FabSEA, el C215FabSEA_{D227A}, que
posee una afinidad 100 veces disminuida por el MHC de clase II. A
diferencia de la C215Fab-SEA de tipo salvaje, este
mutante no posee la capacidad de formar enlaces cruzados con las
moléculas del MHC de clase II, lo que se cree que es uno de los
motivos principales de la toxicidad sistémica mediada por SEA
(Hansson y col., 1997).
El intervalo entre la terapia eficiente y la
toxicidad en el tratamiento de tumores B16-C215 en
el día 1, en ratones transgénicos Vb3 TCR, fue al menos 50 veces
más amplio para el mutante C215FabSEA_{D227A} comparado con
C215FabSEA (Hansson y col., 1997). En conformidad con esta
observación, los estudios inmunohistoquímicos revelaron que a las
dosis en las que estas dos proteínas producían una terapia similar,
se observaba una inmunoactivación comparable en el tumor, mientras
que se observaba una inmunoactivación sistémica mucho menor en el
bazo con el tratamiento con C215FabSEA_{D227A} (Hansson y col.,
1997). Además, los estudios farmacodinámicos realizados en conejos
mostraron una disminución considerable en el direccionamiento de
C215FabSEA_{D227A} hacia el bazo o hacia otros órganos
linfáticos, en los que se localizan la mayoría de las células del
MHC de clase II^{+}, en comparación con el direccionamiento de
C215FabSEA (datos no mostrados).
Para uso clínico, se espera que una proteína de
triple fusión Fab-SEA-IL2 contenga
un superantígeno mutado. Los autores de la invención construyeron
por lo tanto una proteína de triple fusión
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2. La
proteína producida fue capaz de inducir la proliferación de células
T humanas en reposo (datos no mostrados) e indujo una actividad
mantenida de los CTL, dependiente de SEA, en ratones durante hasta 6
inyecciones (Figura 12). Por el contrario, se observó la actividad
de fondo de los CTL cuando se usó C215FabSEA_{D227A} (<10%,
datos no mostrados) y cuando se usó
C215Fab-Q-hIL2 (<15%, datos no
mostrados). La terapia contra tumores B16-G733
establecidos (día 3), en ratones C57 Bl/6 normales, con 8
inyecciones de esta proteína administrada diariamente, proporcionó
una terapia tan buena como la proporcionada por una dosis óptima de
C215FabSEA (figura 13). En este sistema, la C215FabSEA_{D227A},
que está diseñada para obtener una actividad óptima en seres
humanos y no en ratones, solamente presenta efectos poco importantes
(figura 13). Sin embargo, a la dosis más alta, se encontró cierta
toxicidad de la
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2. Por el
contrario, varios experimentos terapéuticos indican que la
combinación de C215FabSEA_{D227A} y
C215Fab-Q-hIL2 (8 inyecciones)
también da como resultado una terapia sustancialmente mejorada de
tumores B16-GA733 en el día 3, en ratones
transgénicos Vb3 TCR, cuando se compara con la de
C215FabSEA_{D227A} sola (datos no mostrados). En ratones Vb3 TCR
transgénicos, >90% de las células T reaccionan con SEA, a
diferencia del 10% - 20% que lo hacen en ratones normales.
Curiosamente, inyecciones repetidas (hasta 8) hechas a conejos, de
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2, (0/4
conejos muertos después de inyecciones repetidas de dosis de 20
\mug/kg) no resultaron ser más tóxicas que las de
C215FabSEA_{D227A} sin IL-2 (0/4 conejos muertos
después de inyecciones repetidas de dosis de 20 \mug/kg; 4/4
conejos muertos con dosis de 20 \mug/kg) y mucho menos tóxicas que
las de C215FabSEA (1/4 conejos muertos después de inyecciones
repetidas de dosis de 1 \mug/kg). Al mismo tiempo, se observa una
inmunoactivación mantenida (efecto rebote de los linfocitos)
solamente después del tratamiento con
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2 pero no
después del tratamiento con C215FabSEA_{D227A} ni con C215FabSEA,
lo que indica que efectivamente la inclusión de
IL-2 ayuda a contrarrestar la anergia de las células
T inducida por FabSEA (datos no mostrados).
Terapia contra tumores
B16-C215 con proteínas
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2 mutadas
en IL-2. La mayor toxicidad y, en el caso de la
C215FabSEA-Q-hIL2, la menor eficacia
terapéutica, de las proteínas de triple fusión que contienen
IL-2, se puede deber en parte a un
"redireccionamiento" de la actividad de SEA hacia tejidos
linfáticos. Este efecto de redireccionamiento se atribuye a la
elevada afinidad de la IL-2 (Kd = 10 pM) por su
receptor, el cual se encuentra principalmente sobre las células T
del bazo y de otros tejidos linfáticos. Para tratar esta cuestión,
los autores de la invención han preparado derivados de
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2 en los
que el resto de la IL-2 se ha mutado con el fin de
disminuir la afinidad por las células IL2R^{+} y así disminuir la
activación sistémica. En principio se usó la misma estrategia que la
utilizada para mejorar el intervalo terapéutico de la proteína
C215FabSEA_{D227A}.
La interacción entre IL-2 y su
receptor de alta afinidad está perfectamente estudiada. El receptor
consiste en tres subunidades a, b y g. La formación de enlaces
cruzados entre b y g se requiere para su actividad biológica,
mientras que la subunidad a se requiere para la unión óptima. La
estrategia de los autores de la invención consiste en disminuir la
afinidad de la IL-2 por su receptor de alta afinidad
(abg) eliminando la unión a la subunidad a, y en disminuir después,
pero sin eliminar, la unión a las subunidades b y g cuando sea
necesario.
Se diseñaron tres mutantes de este tipo de
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2 para
eliminar la unión IL2Ra (F42A, F42K) y para además alterar la unión
IL2Rb (F42A/D20S). Estas proteínas presentan una actividad 100 veces
disminuida (F42A), 1.000 veces disminuida (F42K) y 3.000 veces
disminuida (F42A/D20S) respectivamente, en cuanto a inducir la
proliferación de la línea celular CTLL-2 murina
dependiente de IL-2. Se están llevando a cabo
experimentos para determinar con más detalle las propiedades de
estas proteínas, en particular en lo que respecta a la afinidad y a
parámetros de asociación de la unión a células T humanas activadas y
al receptor de IL-2. Los experimentos terapéuticos
iniciales indican que esta estrategia es prometedora (figura 14;
figura 15). En los ejemplos mostrados, se administraron 8
inyecciones a ratones transgénicos Vb3 TCR (en los que >90% de
las células T se activan por acción de SEA) que portan tumores
B16-GA733 en el día 3. Aunque todavía se observó
cierta toxicidad a la dosis más alta, ésta sobrevino más tarde
cuando se usó
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2_{F42A}
o
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2_{F42K}
(8ª inyección) en lugar de
C215FabSEA_{D227A}-Q-hIL2 (6ª
inyección) y el tratamiento a la dosis más alta consecuentemente
conduce a una disminución del tamaño del tumor de más del 90%
cuando se compara con un control tratado con PBS (figura 14). Los
autores de la invención en la actualidad están explorando esta
estrategia tan prometedora, introduciendo mutaciones adicionales en
las partes correspondientes a la SEA y a la IL-2
para mejorar aún más el intervalo terapéutico frente al intervalo de
toxicidad.
Además, existe un trabajo en curso para
construir proteínas de triple fusión
C215FabSEA-Q-hIL2 que comprenden
una mutación Thr51Pro en la parte correspondiente a la
IL-2 (Chang y col., 1996). Esta mutación puede
servir para bloquear la internalización de la proteína de fusión,
mediada por IL2R, sin disminuir la bioactividad de la
IL-2. Esto va a ser probablemente importante porque
disminuirá la retirada de la proteína de fusión por esta ruta e
incrementará por lo tanto la concentración local y la eficacia de
este fármaco. Las proteínas que contienen la mutación Thr51Pro
pueden contener otras mutaciones en las partes correspondientes a la
SEA y a la IL-2 que disminuyen su afinidad por el
MHC de clase II y por el receptor de IL-2
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Una molécula Sag-IM se puede
unir a células que expresan el MHC de clase II, facilitando así la
SDCC. Como alternativa, el direccionamiento se puede realizar hacia
células diana que expresan el receptor específico para el IM. Es
por lo tanto posible que una molécula Sag-IM pueda
ser útil para inducir la muerte de células no deseadas que expresan
el receptor específico para el IM.
Se puede considerar que una proteína de triple
fusión C215FabSEA-hIL2 es una molécula
Sag-IM en el caso en el que ni la célula efectora
ni la célula diana expresen el antígeno reconocido por el C215Fab.
Las células efectoras serían células T del subtipo V\beta
correcto. Las células diana podrían ser, p. ej., células
hematopoyéticas aberrantes que expresan el receptor para
IL-2, tales como las presentes en determinadas
leucemias o linfomas.
Exp. A: Demostración del planteamiento
teórico in vitro : Células T efectoras (células T humanas
estimuladas de manera repetida con SEA) y células diana (p. ej.,
células "Raji" de linfoma de células B humanas) se incubarán
con la proteína de triple fusión C215FabSEA-IL2
mutada para disminuir su unión al MHC de clase I. Este es el
montaje estándar para los ensayos de SDCC (células T efectoras,
células Raji, sustancia experimental). Los autores de la presente
invención han encontrado realmente que una proteína
C215FabSEA_{D227A}-hIL2 que posee una afinidad
enormemente disminuida por el MHC de clase II, posee una potencia
aproximadamente 10 veces mayor que C215FabSEA_{D227A} para matar
a las células Raji. Una explicación obvia para este aumento de
potencia es que la proteína de triple fusión es presentada sobre
los receptores para la IL-2, expresados sobre las
células Raji.
Exp. B: Demostración del planteamiento
teórico in vivo : Los modelos murinos de linfoma (tal como
el linfoma RBL-5 en ratones C57 Bl/6 mice) están
perfectamente establecidos (Hoglund y col., J. Exp. Med. 168,
1469-1474). Un direccionamiento hacia el receptor
de la IL-2 o hacia otro receptor
R-IM (receptor del inmunomodulador) con una
proteína Sag-IM en esos modelos podría proporcionar
la demostración del planteamiento teórico del direccionamiento
hacia células positivas al receptor del IM in vivo.
El direccionamiento hacia células positivas al
R-IM efectuado con Sag-IM es
complicado por el hecho de que tanto las células efectoras como las
células diana expresan frecuentemente el receptor del IM. No
obstante, en determinadas circunstancias esta modalidad de terapia
puede ser eficaz. Es probable que factores tales como la densidad
de expresión del R-IM sobre las células diana, el
número y la localización de las células diana, etc., desempeñen una
función. Se debe también hacer hincapié en que, p. ej., IL2R alpha
solamente aumenta tras la activación de las células T, y habría por
lo tanto un intervalo temporal durante el cual el
R-IM se expresa a un nivel de alta abundancia sobre
las células diana, pero no sobre las células efectoras.
Las proteínas de fusión Sag-IM
en las que Sag representa un superantígeno de tipo salvaje mutado
para que presente una menor afinidad por el MHC de Clase II, se
pueden utilizar de manera similar.
- los artículos marcados con * se pueden
encontrar más relacionados con los inmunomoduladores que el resto
de los artículos.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Pharmacia & Upjohn AB
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Lindhagensgatan 133
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Estocolmo
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suecia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: S-112 87
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +46 8 695 80 00
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Citolisis dirigida de células diana, agentes y composiciones causantes de la citolisis y compuestos que se pueden usar para producir esos agentes.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 23
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release Núm. 1.0,
\hskip6cmVersión 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATATAAGCTT CCACCATGGG CCACACACGG AGG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGCAGATCT TTAGTTATCA GGAAAATGCT CTTGC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAAAGCTTC TCGAGCGCGC TGTTATCAGG AAAATGCTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGCGTCAG GCTAACGAAC TGCCAGGCGC CCCGRCACAG AGACGA
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTTCGTCT CACGCGCGTT CTTCCTGTGA CGGGGCGCCT GGCAGTTCGT TAGCCTGACG
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGTACACCA CAGAAGACAG CTTGTATGTA TG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATACATACA AGCTGTCTTC TGTGGTGTAC CA
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAATAAGAA AGACGTCACT GTTCAGGAGT TGG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAACTCCTG AACAGTGACG TCTTTCTTAT TCG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGATAATAA AGTTATTAAC TCAGAAAACA TG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGTTTTCT GAGTTAATAA CTTTATTATC TC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCG CGCGGCACCA GGCCGCTGTT ATCCGGAAAA TGCTCTTGC
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 84 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc.= "cebador oligonucleotídico de DNA".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAATTCGC TAGCTTATCA AGTTAGTGTT GAGATGAT
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:
23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (26)
1. Una composición farmacéutica que comprende
una combinación de un superantígeno (Sag), un resto de
direccionamiento (T) y un inmunomodulador (IM) que no es un
superantígeno, combinación que se elige entre:
a) un conjugado triple (T) (Sag) (IM);
b) una combinación de un conjugado doble (T)
(Sag) y otro conjugado doble (T')(IM), en la que T y T' son iguales
o diferentes; o
c) una combinación de un conjugado doble (T)
(Sag) y un (IM) libre.
2. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que el resto de direccionamiento (T y T')
se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo, un
fragmento de unión a antígeno perteneciente a un anticuerpo, un
fragmento Fab de un anticuerpo, un fragmento Fab_{2} de un
anticuerpo o un anticuerpo monocatenario.
3. Una composición farmacéutica según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2, en la que el superantígeno
(Sag) ha sido modificado para que posea una menor capacidad de
unión a un antígeno del MHC de clase II en comparación con el
correspondiente superantígeno de tipo salvaje.
4. Una composición farmacéutica según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2, en la que el superantígeno
(Sag) ha sido modificado para que presente una menor
serorreactividad y/o inmunogenicidad en sueros humanos en
comparación con el correspondiente superantígeno de tipo
salvaje.
5. Una composición farmacéutica según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en la que el superantígeno
es quimérico y comprende regiones derivadas de dos o más
superantígenos libres.
6. Una composición farmacéutica según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en la que el
inmunomodulador (IM) se selecciona entre el grupo que consiste en
citoquinas, quimioquinas y partes extracelulares de receptores y
ligandos unidos a la superficie de los linfocitos.
7. Una composición farmacéutica según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en la que el
inmunomodulador (IM) es una IL-2 natural o
mutante.
8. Una composición farmacéutica según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en la que el
inmunomodulador (IM) es una parte de la molécula B7 seleccionada
entre el grupo que consiste en CD80 y CD86.
9. Un conjugado que contiene un superantígeno,
que tiene la fórmula:
a) de un conjugado triple (T) (Sag) (IM);
b) de un conjugado doble (T) (Sag) en
combinación con otro conjugado doble (T')(IM), en el que T y T' son
iguales o diferentes; o
c) de un conjugado doble (T) (Sag) en
combinación con (IM), en el que T es un resto de direccionamiento,
Sag es un superantígeno e IM es un inmunomodulador que no es un
superantígeno.
10. Un conjugado que contiene un superantígeno
según la reivindicación 9, en el que T comprende al menos un resto
de direccionamiento T' y un resto de direccionamiento T'', el
superantígeno Sag está fusionado por el extremo
C-terminal a T' y el inmunomodulador (IM) está
fusionado por el extremo C-terminal a T''.
11. Un conjugado que contiene un superantígeno
según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 10, en el que el
resto de direccionamiento se selecciona entre el grupo que consiste
en un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno perteneciente a
un anticuerpo, un fragmento Fab de un anticuerpo, un fragmento
Fab_{2} de un anticuerpo o un anticuerpo monocatenario.
12. Un conjugado que contiene un superantígeno
según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 11, en el que el
superantígeno ha sido modificado para que posea una menor capacidad
de unión a un antígeno del MHC de clase II en comparación con el
correspondiente superantígeno de tipo salvaje.
13. Un conjugado que contiene un superantígeno
según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 11, en el que el
superantígeno ha sido modificado para que presente una menor
serorreactividad y/o inmunogenicidad en sueros humanos en
comparación con el correspondiente superantígeno de tipo
salvaje.
14. Un conjugado que contiene un superantígeno
según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 13, en el que el
superantígeno es quimérico y comprende regiones derivadas de dos o
más superantígenos libres.
15. Un conjugado que contiene un superantígeno
según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 14, en el que el
inmunomodulador se selecciona entre el grupo que consiste en
citoquinas, quimioquinas y partes extracelulares de receptores y
ligandos unidos a la superficie de los linfocitos.
16. Un conjugado que contiene un superantígeno
según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 15, en el que el
inmunomodulador es una IL-2 natural o mutante.
17. Un conjugado que contiene un superantígeno
según una cualquiera de las reivindicaciones 12 - 14, en el que el
inmunomodulador es una parte extracelular de una molécula B7.
18. Un conjugado que contiene un superantígeno
según la reivindicación 17, en el que la parte de la molécula B7 se
selecciona entre el grupo que consiste en CD80 y CD86.
19. Un conjugado que contiene un superantígeno
según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 18, en el que el
inmunomodulador ha sido modificado para que presente una menor
afinidad por un receptor linfocitario, en comparación con la
afinidad de la correspondiente forma natural.
20. Un conjugado que contiene un superantígeno
según la reivindicación 10, en el que el superantígeno es la
enterotoxina A estafilocócica, T' es el dominio C_{H}1 de C215Fab,
T'' es la cadena ligera del anticuerpo C215 y el inmunomodulador es
una IL-2 natural o mutante.
21. Un conjugado que contiene un superantígeno
de la reivindicación 10, en el que el superantígeno está fusionado
a T' a través de un fragmento enlazador B' flexible de aminoácidos
hidrófilos, de 3 - 11 residuos de aminoácidos, y el inmunomodulador
está fusionado a T'' a través de un fragmento enlazador Q de
aminoácidos hidrófilos con carga neutra o positiva, de 10 - 20
residuos de aminoácidos.
22. Un conjugado que contiene un superantígeno
de la reivindicación 21, en el que B' se selecciona entre el grupo
que consiste en Gly-Gly-Pro y
Pro-Ala-Ser-
Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro
(SEQ ID NO: 19) y Q se selecciona entre el grupo que consiste en
Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg
(SEQ ID NO: 23),
Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg
(SEQ ID NO: 20),
Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg
(SEQ ID NO: 21) y
Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-
Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr
(SEQ ID NO: 22).
23. Un conjugado que contiene un superantígeno
según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 22, para usar como
medicamento.
24. Uso de un conjugado que contiene un
superantígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 22,
para fabricar un medicamento para el tratamiento de cánceres,
enfermedades autoinmunitarias, infestaciones parasitarias,
infecciones víricas o infecciones bacterianas.
25. Uso según la reivindicación 24, para el
tratamiento de melanomas, carcinomas, neoplasias hematopoyéticas o
fibrosarcomas.
26. Uso según la reivindicación 25, para el
tratamiento de tumores benignos o malignos, cánceres resistentes a
multitud de fármacos, cánceres metastásicos o diversas formas de
cánceres inducidos por métodos químicos o inducidos por virus.
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