EA002688B1 - Способы инактивации клеток-мишеней, агенты и композиции, вызывающие цитолиз, и соединения, используемые для получения этих агентов - Google Patents

Способы инактивации клеток-мишеней, агенты и композиции, вызывающие цитолиз, и соединения, используемые для получения этих агентов Download PDF

Info

Publication number
EA002688B1
EA002688B1 EA200000144A EA200000144A EA002688B1 EA 002688 B1 EA002688 B1 EA 002688B1 EA 200000144 A EA200000144 A EA 200000144A EA 200000144 A EA200000144 A EA 200000144A EA 002688 B1 EA002688 B1 EA 002688B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
superantigen
antibody
immunomodulator
conjugate
group
Prior art date
Application number
EA200000144A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200000144A1 (ru
Inventor
Мортен Согорд
Ларс Абрахмсен
Петер Ландо
Геран Форсберг
Терье Калланд
Микаэль Дохлстен
Original Assignee
Фармациа Энд Апджон Аб
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from SE9704170A external-priority patent/SE9704170D0/xx
Application filed by Фармациа Энд Апджон Аб filed Critical Фармациа Энд Апджон Аб
Publication of EA200000144A1 publication Critical patent/EA200000144A1/ru
Publication of EA002688B1 publication Critical patent/EA002688B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Способ инактивации клеток-мишеней в присутствии Т-клеток, путем приведения этих двух типов клеток в контакт с суперантигеном (SAG) в присутствии иммуномодулятора, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один из элементов - суперантиген или иммуномодулятор - находятся в форме конъюгата между «свободным» суперантигеном (Sag) и частью, обеспечивающей связывание конъюгата с клетками-мишенями. Конъюгат суперантигена соответствует формуле (I): (T)x(Sag)y(IM)z, а) Т представляет собой часть, обеспечивающую связывание с мишенью. Sag, соответствует свободному антигену, IM представляет собой иммуномодулятор, не являющийся суперантигеном, и Т, Sag и IM связаны вместе через органические линкеры В; б) х, у и z представляют собой целые числа, которые, как правило, выбирают из чисел от 0 до 10, и представляют собой количество частей Т, Sag и IM соответственно в молекуле данного конъюгата, при условии, что y > 0, и одно из чисел х и z или оба эти числа также > 0. Конъюгат суперантигена предпочтительно представляет собой тройной слитый белок. Иммуномодулятор по настоящему изобретению отличается тем, что он представляет собой конъюгат между обеспечивающей связывание с мишенью частью (Т''') и модифицированным иммуномодулятором (IM'''). Этот конъюгат соответствует формуле, аналогичной формуле (I), за исключением того, что обязательно присутствие модифицированного иммуномодулятора. Может присутствовать часть, представленная суперантигеном. Молекула ДНК кодирует суперантиген и иммуномодулятор.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение касается инактивации/цитолиза клеток-мишеней, вызываемых Т-клетками (Т-лимфоцитами), активированными функциональными суперантигенами. Цитолиз можно использовать в терапии и в проводимых ίη νίίτο исследованиях.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Суперантигены. Согласно самому первому определению (примерно в 1988-1993 гг.), суперантигены представляют собой бактериальные или вирусные белки, способные к связыванию с антигенами ГКГ (главного комполекса гистосовместимости) класса II без предварительного осуществления внутриклеточных процессов, и активирующие Т-клетки посредством связывания с вариабельной областью (νβ) νβцепи рецептора Т-клетки (ТСН). Это связывание ведет к ограниченной активации νβ-семейства у относительно большой части/субпопуляции Тклеток и к лизису клеток, экспрессирующих ГКГ класса II (т.е. к цитолизу, опосредованному зависимыми от суперантигена клетками 8ЭСС). Обычно активируемая суперантигеном субпопуляция Т-клеток составляет около 1-30% от общего числа Т-клеток индивидуума.
Хорошо известные суперантигены дикого типа, согласно вышеприведенному определению, представляют собой стафилококковые энтеротоксины (8ЕА, 8ЕВ, 8ЕС1, 8ЕС2, 8ЕЭ. 8ЕЕ и 8ЕН). Другими их примерами являются токсин синдрома токсического шока 1 (Т88Т-1, также стафилококкового происхождения), отслаивающие токсины (Ехй), стрептококковый пирогенный экзотоксин А, В и С (8РЕ А, В, С), вирус опухоли молочной железы мышей (ΜΜΤν), стрептококковые М-белки, энтеротоксин клостридиального озноба (СРЕТ), суперантигены микоплазменного артрита и т.п. Обзор суперантигенов и их свойств см. в публикации Κοΐζίη е! а1. 1993.
Суперантигены дикого типа и химерные суперантигены также могут быть подвергнуты мутагенезу, чтобы придать им свойства уменьшенного или отсутствующего связывания с ГКГ класса II и/или связывания с Τί,’Βνβ ( Карр1ег е! а1., АО 9314264; Карр1ег е! а1. 1993; В1апсо е! а1.; АЬтайтзеп е! а1., АО 9601650; Ап!оп88оп е! а1., АО 9736932; Ап!опвзоп е! а1., 1997). Этот тип суперантигенов становится менее токсичным. В случае, если они полностью теряют способность связываться с ГКГ класса II или с ΤΟΚ.νβ, то они больше не являются функциональными суперантигенами, поскольку в этом случае они теряют свою способность к активации Т-клеток.
Посредством мутирования структурно подобных суперантигенов дикого типа оказалось возможным сконструировать химерные функционально активные суперантигены (гибридные суперантигены) (Ьатрйаег е! а1., 1996 и Ап!опз8оп е! а1., АО 9736932).
Было установлено, что активация и последующий лизис клеток могут происходить независимо от ГКГ класса II, в случае, если суперантиген дикого типа был конъюгирован с частью, обеспечивающей связывание с мишенью, способной связываться со структурами поверхности клетки (ЭоЫ8!еп е! а1., АО 9201470). Этот новый эффекторный механизм получил название «цитолиз, опосредованный клетками, зависимыми от суперантигена и антитела» (=8АЭСС). Он включает аналогичные механизмы для обеспечивающих связывание с мишенями частей, иных чем антитела (АЬтайтзеп е! а1., АО 9601650; Ап!опвзоп е! а1., АО 9736932).
В соответствии с принятой в настоящее время концепцией суперантигенов, она охватывает любые соединения (предпочтительно полипептидной структуры), которые без осуществления внутриклеточных процессов способны связываться со структурой клеточной поверхности (структурой-мишенью) и с одной или более полиморфными ТСВ-цепями, в частности с νβцепью, активируя тем самым субпопуляцию Тклеток, экспрессирующих конкретную ТСНцепь, участвующую в связывании. После этого Т-клетки становятся цитотоксичными и направляют свою цитотоксичность против клеток, несущих поверхностные структуры (структурымишени, клетки-мишени). Определение суперантигена (8АО), как оно используется в контексте настоящего изобретения, кроме особо оговоренных случаев, таким образом, охватывает конъюгаты между частью, обеспечивающей связывание с мишенью, и свободным суперантигеном, как описано выше для 8АЭСС.
Под термином «суперантиген» подразумеваются, кроме особо оговоренных случаев, только функциональные суперантигены.
Свободный суперантиген (8ад) представляет собой суперантиген дикого типа, возможно мутированный или другим образом модифицированный, который не конъюгирован с частью, обеспечивающей связывание с мишенью или с иммуномодулятором. Способность свободных суперантигенов к связыванию с ГКГ класса II является наследственным свойством связывания с мишенью. Поскольку у свободных суперантигенов отсутствуют конъюгированные части, обеспечивающие связывание с мишенью, то они могут использовать только механизм 8ЭСС (цитолиза, опосредованного зависимыми от суперантигена клетками).
Коньюгированный суперантиген представляет собой конъюгат между свободным суперантигеном и частью, обеспечивающей связывание с мишенью, или с иммуномодулятором. Конъюгированный суперантиген использует механизмы как 8ЭСС (цитолиза, опосредованного зависимыми от суперантигена клетками), так и 8АЭСС (цитолиза, опосредованного клет3 ками, зависимыми от суперантигена и антитела).
Иммуномодулятор (ΙΜ) представляет собой соединение, обладающее способностью регулировать иммунную систему. В контексте настоящего изобретения суперантигены рассматриваются отдельно и не охватываются термином «Иммуномодулятор», когда он используется здесь. Иммуномодулятор часто имеет наследственно обусловленную способность к связыванию с мишенью, такую, как для соответствующего рецептора лимфоцита. Кроме особо оговоренных случаев, иммуномодулятор находится в неконъюгированной форме.
Обеспечивающая связывание с мишенью часть (Т) представляет собой часть, способную связываться со структурой клеточной поверхности и/или со структурой ткани.
Коньюгат состоит из двух или более частей 8ад, ΙΜ, Т и т.п., которые ковалентно соединены друг с другом.
Под растворимыми формами активных ингредиентов имеются в виду такие формы, которые растворимы в текучих средах, существующих в организме, таких как сыворотка и плазма крови.
Известный уровень техники терапевтическое использование суперантигенов
Неконъюгированные суперантигены дикого типа и мутантные суперантигены предложены для использования в терапии, при этом их лечебный эффект преимущественно осуществляется посредством активации иммунной системы либо локальной активации по отношению к клеткам, экспрессирующим класс II, связанным с подлежащей лечению болезнью либо посредством системной активации (Ка11аиб е! а1., АО 9104053; Тегтап е! а1., АО 9110680 и АО 9324136; Лп1оп88оп е! а1., АО 9736932; и Иете11 а! а1., 1991). Из-за очень сильной токсичности суперантигенов дикого типа, этот подход в отношении лечения рака может применяться только для очень малой части от всех форм рака.
Было также предложено использовать суперантигены, конъюгированные с частями, обеспечивающими связывание с мишенью (ЭоЫйеаа е! а1., АО 9201470; АЬгайткеп е! а1., АО 9601650; АиЮи^ои е! а1., АО 9736932 и Ое1п е! а1., 1993), причем все эти три публикации включены в настоящее описание в качестве ссылок.
В связи с исследованиями по предотвращению индуцированной суперантигенами регуляции опосредованной Т-клетками цитотоксической активности по типу обратной связи, проявляемой 1Ь-2 ш νί\Ό. было высказано предположение, что было бы полезно вводить 1Ь-2 совместно с неконъюгированными суперантигенами дикого типа и с суперантигенами дикого типа, конъюгированными с антителами (Ве1Ггаде Т1аеМь Аиди811/8ер!етЬег 1996; Ве1Ггаде е! а1., 1994; ВеИгаде е! а1., 1995; ВеИгаде е! а1.,
1997а; ВеИгаде е! а1., 1977Ь (суперантигены дикого типа)).
Предположили также, что заякоренный на клеточной мембране СЭ80 играет роль в активации суперантигеном Т-клеток в отсутствие антигенов ГКГ класса II (Бааабо е! а1., 1993 и 1996).
Фиг. 4 в публикации Бапбо е! а1., 1996, иллюстрирует эксперимент, в котором анализировали способность суперантигена, конъюгированного только с антителом или с антителом в комбинации с ГБ-2, индуцировать пролиферацию покоящихся Т-клеток человека. В этом продолжавшемся 4 суток эксперименте конъюгированный суперантиген присутствовал на исходной СНО-клетке и СНО-клетках, трансфецированных для экспрессии класса II или С215 или класса II плюс С215. Эффект Ш-2 был незначительным.
Карр1ег е! а1. (АО 9314264) предположили, что неконъюгированные 8ЕВ дикого типа мутировали, потеряв в результате этого свою способность связываться с νβ или ГКГ класса II (в контексте вакцин и в качестве агента, нейтрализующего токсические эффекты суперантигенов). АЬгайткеп е! а1. (АО 9601650) предложили способ терапии рака с помощью конъюгированных суперантигенов, обладающих модифицированной, предпочтительно уменьшенной способностью связывать антигены класса II. Айопккоп е! а1. (АО 9736932) предложили способ терапевтического лечения рака с помощью химерных суперантигенов и суперантигенов с уменьшенной серологической реактивностью (см. также АЬгайткеп е! а1). Мутации, такие как описанные в публикациях АЬгайткеп е! а1. ((АО 9601650) и Ап!оп88оп е! а1. (АО 9736932), включают суперантигены с пониженной системной токсичностью, с пониженной иммуногенностью и/или с пониженной серологической реактивностью у подвергавшихся лечению млекопитающих.
Предложен также способ терапии с помощью введения нуклеиновых кислот, кодирующих суперантигены дикого типа (Тегтап е! а1., АО 9110680; АО 9324136; и Эом е! а1., АО 9636366). Эом е! а1. пошли дальше и предложили совместное введение нуклеиновой кислоты, кодирующей цитокин или хемокин, с нуклеиновой кислотой, кодирующей суперантиген. Без экспериментального подтверждения в публикации АО 9636366 предлагаются также конструкции в форме бисцистронных генных конструкций, в которых один цистрон содержит ген, кодирующий суперантиген, а другой цистрон содержит ген, кодирующий цитокин или хемокин.
Без экспериментального подтверждения,
Рои1е!!у Р. (8апд51а1 ЕР 510949) высказал предположение, что конъюгаты между частями, обеспечивающими связывание с мишенью, такими как
Ш-2, и суперантигенами дикого типа могут быть полезны для инактивации клеток, экспрессирующих рецептор Ш-2.
Известный уровень техники - терапевтическое использование иммуномодуляторов в комбинации с антителами, специфичными для клеток, подлежащих инактивации
Ранее было предложено конъюгировать антитела с модификаторами биологических реакций, например с хемокином или цитокином, такими как интерлейкин-2 (Ее11 а! а1., ЕР 439095; КокепЫит е! а1., ЕР 396387; Рапсоок е! а1., 1996; и Вескег е! а1., 1996).
Проблемы, решение которых является целью настоящего изобретения
Настоящее изобретение имеет целью добиться улучшений в суперантигенной терапии, включающих активацию иммунной системы, для того, чтобы инактивировать нежелательные клетки-мишени у млекопитающего, подвергаемого лечению. В частности, эти улучшения касаются следующего: 1) продления периода активации локально, например в опухоли, во время первого цикла лечения; 2) противодействия появлению сверхчувствительности из-за тенденции активированных Т-клеток приобретать толерантность; 3) усиления активации Т-клеток, независимых от ГКГ класса II, в области опухоли; и 4) расширения терапевтического окна для цитолиза посредством активации суперантигенов. В настоящее время установлено, что эти улучшения можно осуществить полностью или частично, в случае если введение суперантигена (8ЛС) объединяют с введением иммуномодулятора в растворимой форме, причем по, меньшей мере, один из них (суперантиген или иммуномодулятор) находится в форме конъюгата с частью, обладающей свойством связывания с мишенью для подлежащей инактивации клетки.
Первый важный аспект изобретения: способ инактивации клеток-мишеней
Первый аспект изобретения касается как терапии, так и исследований ίη νίίτο и представляет собой способ инактивации нежелательных клеток-мишеней в присутствии Т-клеток посредством приведения этих двух типов клеток в контакт с суперантигеном (8ЛС), в частности с суперантигеном, активирующим Т-клетки путем связывания с ТОР νβ, в присутствии иммуномодулятора (ΙΜ), не являющегося суперантигеном (8ад). В своем наиболее широком аспекте этот способ отличается тем, что, по меньшей мере, один элемент: либо суперантиген, либо иммуномодулятор, находится в форме конъюгата с частью (Т), обладающей свойством связывания с мишенью для клетки, подлежащей инактивации. В своем подаспекте данный способ отличается тем, что
a) суперантиген (8ЛС) и иммуномодулятор используют в форме тройного конъюгата, включающего суперантиген (8ад), обеспечивающую связывание с клетками-мишенями часть (Т) и иммуномодулятор (ΙΜ) (Т, ΙΜ, Зад-конъюгат);
b) суперантиген (8ЛС) используют в форме двойного конъюгата между суперантигеном (Зад) и обеспечивающей связывание с клеткамимишенями частью (Т), в комбинации с двойным конъюгатом между иммуномодулятором (ΙΜ) и обеспечивающей связывание с клеткамимишенями частью (Т') (Т,Зад-конъюгат + Τ,ΙΜконъюгат);
с) суперантиген (8ЛС) используют в форме двойного конъюгата между суперантигеном (Зад) и обеспечивающей связывание с клеткамимишенями частью (Т), а иммуномодулятор (ΙΜ) используют в свободной форме, т. е. не конъюгированным с обеспечивающей связывание с клетками-мишенями частью (Т,Зад-конъюгат + ΙΜ);
ά) суперантиген (ЗЛС) используют в свободной форме (Зад). а иммуномодулятор используют в форме конъюгата, т.е. двойного конъюгата между иммуномодулятором (ΙΜ) и суперантигеном (Зад) (Зад + Т,1М-конъюгат); и
е) суперантиген (ЗЛС) и иммуномодулятор используют в форме двойного конъюгата между суперантигеном (Зад) и иммуномодулятором (ΙΜ) (8ад/1М-конъюгат).
Мишенями для суперантигена и иммуномодулятора могут быть клетки одного и того же типа, например идентичные или реагирующие друг с другом структуры/эпитопы, или разные типы клеток в пределах одной и той же ткани. Мишенями могут быть нормальные клетки или больные клетки, связанные с одной и той же тканью. Любой элемент - суперантиген или иммуномодулятор - или они оба могут связываться с мишенью с помощью одного или нескольких антител.
Болезни, которые можно лечить с помощью способа но настоящему изобретению
Болезни, которые можно лечить с помощью данного способа, в принципе те же самые, которые ранее было предложено лечить с помощью суперантигенов. См., например, выше, в разделе под заголовком «Известный уровень техники...». В качестве иллюстрирующих примеров можно назвать различные формы рака, аутоиммуные болезни, паразитарные инфекции, вирусные инфекции и прочие заболевания, связанные с клетками, экспрессирующими на своей поверхности антигены ГКГ класса ΙΙ и/или или другие структуры, специфичные для соответствующей болезни и связывающиеся с обеспечивающими связывание с мишенями частями, включенными в суперантиген в соответствии с концепцией настоящего изобретения (формула Ι). С помощью настоящего изобретения можно также бороться с бактериальными инфекциями.
Важными формами рака в контексте настоящего изобретения являются следующие: меланомы, карциномы, новообразования кроветворной системы и фибросаркомы, а также такие специфические формы рака, как плоскоклеточная карцинома, различные формы рака молочной железы, карциномы головы и шеи, карциномы щитовидной железы, карциномы мяг002688 ких тканей, костные саркомы, тестикулярный рак, рак простаты, раковые заболевания яичников, раковые заболевания мочевого пузыря, раковые заболевания кожи, раковые заболевания мозга, ангиосаркомы, гемангиосаркомы, опухоли клеток молочной железы, первичные раковые заболевания печени, раковые заболевания легких, раковые заболевания шеи, карциномы клеток почек, лейкозы и лимфомы. Сюда входят также и любые типы злокачественных или доброкачественных опухолей, а также формы рака, устойчивые ко многим лекарствам, метастатические формы рака, различные формы рака, индуцированные химическим или вирусным путем (герпес, 8У40, ВИЧ и др.)
Второй важный аспект изобретения: конъюгаты суперантигена по настоящему изобретению
Этот аспект изобретения включает конъюгаты, соответствующие формуле (Т)х(8ад)у(1М)г I
Т представляет собой часть, обеспечивающую связывание с мишенью, 8ад соответствует свободному суперантигену, а 1М представляет собой иммуномодулятор, не являющийся суперантигеном. Т, 8а§ и 1М связаны вместе с помощью органических линкеров В, которые могут быть разными или одинаковыми в пределах одной и той же молекулы конъюгата или вещества. Конъюгаты в соответствии с формулой I охватывают химические конъюгаты, а также конъюгаты, полученные путем рекомбинации (слитые белки), х, у и ζ представляют собой целые числа, которые обычно выбирают среди чисел от 0 до 10, такие как 0-5, и представляют собой количество частей Т, 8а§ и 1М соответственно в молекуле данного конъюгата, при условии, что у > 0 и каждое из чисел х и ζ или оба эти числа > 0. Химические конъюгаты обычно представляют собой конъюгированные вещества, содержащие смесь различных молекул конъюгата. Соответственно в химических конъюгированных веществах х, у и ζ могут также представлять собой нецелые числа в диапазоне от 0 до 10, такие как в диапазоне от 0 до 5.
В первом подаспекте формулы I, 8ад, 1М и Т присутствуют в конъюгате (х, у и ζ >0; Т 8а§. 1М-конъюгаты), х, у и ζ обычно представляют собой целые числа от 1 до 3, предпочтительно 1-2. Типичные взаимоотношения между х, у и ζ следующие: х=у=ζ; х=у=0^; х=0,5у=0^; и х=0,5у=ζ.
Во втором подаспекте конъюгатов в соответствии с формулой I, обеспечивающая связывание с мишенью часть отсутствует (ГМ, 8а§конъюгаты, х=0), у и ζ обычно представляют собой целые числа от 1 до 3. Предпочтительные взаимоотношения между х и у следующие: ζ=у; ζ=0^; 0,5ζ=γ; ζΜ/Зу; и 1/3ζ=γ.
В обоих подаспектах целые числа или соотношения прежде всего относятся к слитым белкам, в которых часть, обеспечивающая связывание с мишенью, может представлять собой белок, содержащий 1, 2, 3 или 4 полипептидных цепи и в котором имеется одна часть Т в каждой молекуле конъюгата.
Формула I для конъюгатов в соответствии со вторым подаспектом сокращается до нижеследующего:
(За^ДМ^ II
Этот тип конъюгатов главным образом подходит для лечения болезней, связанных с клетками, экспрессирующими антигены ГКГ класса II, в частности класс 11-экспрессирующих форм рака, такие как раковые заболевания кроветворной системы, а также некоторые аутоиммунные болезни, вирусные инфекции и паразитарные инфекции, но также и подходит для лечения болезней, связанных с заякоренными на клеточной мембране рецепторами иммуномодуляторов, например Т-клеточной лимфомы, экспрессирующей, например, рецептор ^-2. А. ИММУНОМОДУЛЯТОР ΙΜ В ФОРМУЛЕ I
ХМ обозначает иммуномодулятор, который не является свободным или конъюгированным суперантигеном.
Этот иммуномодулятор может представлять собой цитокин или хемокин. Примерами цитокинов являются: стимулирующий фактор (6М-С8Е) колонии зернистого макрофага, факторы α или β некроза опухолей (ΤΝΡα или ΤΝΡβ), стимулирующий фактор (М-С8Е) колонии макрофага, стимулирующий фактор (6С8Е) зернистого лейкоцита, Ш-1, [И-2, [И-4, ΣΕ6, Ш-7, Ш-12, ТЬ-15, ТЬ-18 и ЮЕ. Примерами хемокинов являются С5а, !И-8. моноцитный хемотаксический белок 1альфа (М!Р1а1рНа) или моноцитный хемотаксический белок 1β (МШв), моноцитный хемоаттрактантный белок 1 (МСР1 ), моноцитный хемоаттрактантный белок 2 (МСР-2), моноцитный хемоаттрактантный белок 3 (МСР-3), фактор активации тромбоцитов (РАЕК), Ν-формил-метионил-лейцилфенилаланин (ЕМЬРК), лейкотриен В4 (ЬТВ4К), высвобождающий гастрин пептид (СКР), ΚΑΝТЕ8, эотаксин, лимфотактин, №10, ^309,
ΕΝΑ78, 6СР-2, ΝΑΡ-2, М68А/§то, ЭС-СК1, Е1Г3Ь (эктопический домен), фракталькин, РЕ-4 и т. п.
Другой тип иммуномодуляторов представляют собой такие иммуномодуляторы, которые происходят из заякоренных на клеточной мембране пар рецептор/лиганд, участвующих в модуляции запускаемого иммунного ответа, такого как костимуляция (например, рецепторы, связанные с поверхностью лимфоцитов и связанные с соответствующими клетками лиганды). В качестве примеров можно привести элементы, выбранные из пар СП40Ь/С040, 4-ВВ1/4-ВВ1Ь, СЭ28/В7, СТЬА-4/В7 и т.п. В7 включает варианты, такие как СЭ80 и СЭ86. причем предпочтение отдается первому из них. Предпочтительными формами являются растворимые, содержащие внеклеточную часть (эктопический до9 мен) и не имеющие внутриклеточных и заякоренных на мембране частей.
Особо предпочтительные иммуномодуляторы способны обеспечивать действие супермутагенов ίη νΐνο, например, путем противодействия приобретению толерантности активированными супермутагеном Т-клетками. Типичными подходящими связанными с клетками рецепторами/лигандами являются СЭ28/В7. включая аналоги и фрагменты, как указано выше. Типичными цитокинами этой группы являются Ш2, поскольку он представляет собой главный расположенный в прямом направлении считывания эффектор передачи сигнала СЭ28/В7. и подобные ГЬ-2 цитокины 1Ь-7 и ΣΠ-15. В парах. связанных с поверхностью Т-клеток рецепторов/лигандов. тот элемент, который не связан с Т-клеткой, подлежащей активированию, является предпочтительным для включения в конъюгат в соответствии с настоящим изобретением. Для 0401./040. 4-ВВ1/4-ВВ1Ь и СБ28/В7 это означает растворимые формы СБ40. 4-ВВ1Ь и В7 с указанными выше предпочтениями. В экспериментальной части настоящего описания приводятся примеры вариантов иммуномодуляторов, для которых было установлено, что они являются оптимальными для данного изобретения на момент даты приоритета.
Иммуномодуляторы предпочтительно должны происходить из того же самого биологического вида, что и индивидуум, подлежащий лечению. Нативные иммуномодуляторы, такие как цитокины и хемокины, часто проявляют высокую системную токсичность и относительно короткий период полураспада у млекопитающих. Существуют многочисленные публикации, посвященные тому, как модифицировать иммуномодуляторы, чтобы они приобрели повышенную устойчивость к окислению, более длительный период полураспада ίη νΐνο, более низкую токсичность и улучшенную способность к разворачиванию при получении с помощью рекомбинантных технологий и т. п. Например, в патенте США № 5229109 (Спт е! а1.) описываются малотоксичные аналоги Ш-2, имеющие уменьшенное сродство к рецептору Ш-2 с высоким сродством (Ш-2К.) за счет того, что у них отсутствует связывание с субъединицей р55 α этого рецептора. Эти аналоги получают в основном посредством мутирования кодона, кодирующего аминокислоту в позиции 33-46 в Ш-2 (например, Агд38А1а и Р11с42Ьу5 или Р11с42Л1а). Мутант А8р20Ьу8 имеет уменьшенное в 100-500 раз сродство к р75ф-цепи рецептора Ш-2. без изменения его связывания с р55 (СоШпк е! а1.. 1988). Другие мутации, например, А§р208ег. менее жесткие (Ветб! е! а1.. 1994). Изучение мышиного Ш-2 указывает на то, что А§р84 и А§п88 человеческого Ш-2 также участвуют в связывании р75 (ΖιιπινδΚί е! а1.. 1993). Это предположение подтверждается моделированием связывания между человеческим Ш-2 и его рецептором (ВатЬогоидй е! а1.. 1994). Ожидаемое уменьшение сродства этих мутаций выражается как А§р20>А8п88>А8р84.
Объединение мутаций в Агд38 и Р11с42 с мутациями в положениях 88 и 20 приводит к еще более низкому сродству к Ш-2К.. Другая возможная и на дату приоритета предпочтительная мутация Ш-2 - мутация Тйг51Рго, в результате которой образуется аналог Ш-2 с пониженной скоростью интернализации клеток и с увеличенной продолжительностью его иммуномодулирующего эффекта (Сйапд е! а1.. 1996).
Нумерация аминокислотных позиций приведена в соответствии с ТашдцсЫ е! а1.. 1983.
Публикации авторов Спт е! а1.. СоШпк е! а1.. 1988; Ветб! е! а1.. 1994; Ζωην^ е! а1.. 1993; ВатЬогоидй е! а1.. 1994; Сйапд е! а1.. 1996 и ТатдцсЫ е! а1.. 1983. включены в данное описание в качестве ссылки.
Использование аналогов цитокинов и хемокинов с уменьшенным сродством к их нормальным рецепторам в описанных выше конъюгатах усиливает их связывание с предварительно выбранной клеткой-мишенью. Понятно, что цитокины и хемокины, в результате мутаций проявляющие уменьшенную скорость интернализации клеток в отношении связывания с их соответствующим клеточным рецептором и включенные в конъюгат в соответствии с формулой I. приводят к продлению активности суперантигенов по сравнению с соответствующими конъюгатами с нативной формой иммуномодулятора.
Термин «иммуномодулятор» (ΙΜ). таким образом, охватывает любые модифицированные формы, например любые мутированные формы, которые способны агонизировать или антиагонизировать эффекты соответствующей нативной формы иммуномодулятора.
В. 8ад-ЧАСТЬ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩАЯ СУПЕРАНТИГЕН В ФОРМУЛЕ I
8ад в формуле I представляет суперантиген, как это определено выше для свободных суперантигенов и в разделе под заголовком «Известный уровень техники...». т.е. суперантигены дикого типа. возможно модифицированные, например, путем мутации, для того, чтобы они
a) имели уменьшенную способность связываться с антигенами ГКГ класса II по сравнению с соответствующим суперантигеном дикого типа (см., например, в публикации АЬгайткеп е! а1. (АО 96/01650));
b) имели уменьшенную серологическую реактивность в сыворотке крови человека, по сравнению с соответствующим суперантигеном дикого типа (см., например, АЬгайткеп е! а1. (АО 96/01650) и Ап1оп55оп е! а1.. АО 97/36932 и Ап!оп§8оп е! а1.. 1997);
c) имели уменьшенную иммуногенность для человека по сравнению с соответствующим суперантигеном дикого типа (см., например,
Άηΐοηκκοη е! а1., ΥΟ 97/36932 и Άηΐοηκκοη е! а1., 1997);
б) являлись химерами между двумя или более аналогичными суперантигенами дикого типа, в которых одна область в одном первом суперантигене дикого типа заменена соответствующей областью второго аналогичного суперантигена. Область, о которой идет речь, может представлять собой область, определяющую связывание с ΤΟΚ.νβ, например, как это определено для химер 8ЕЕ/8ЕА и 8ЕА/8ЕЕ (см. например, и Αηΐοηκκοη е! а1., ΥΟ 9736932; Αηΐοηκκοη е! а1., 1997; и Ьатрйаег е! а1., 1996).
Сюда входят также и другие модификации/мутации, которые могут быть признаны пригодными, например, для того, чтобы не допустить нежелательного гликозилирования при продуцировании в эукариотных клетках.
Типичными мутациями для суперантигенов, подобных 8ЕА/8ЕЕ, в порядке их очередности, были следующими (нумерация согласно использованной ΑηΙοηκκοη е! а1., 1997 и ΑηΙοηκκοη е! а1., ΥΟ 9736932):
а) уменьшенное связывание с ГКГ класса II: Акт227А1а (=8ЕАт9), Р1е47А1а и/или Акр70Атд. Мутант Рйе47А1а/Акр227А1а = 8ЕАт23.
Ь и б) химеры между 8ЕА и 8ЕЕ, направленные на уменьшение серологической реактивности у человека и в то же время сохраняющие возможности 8АЭСС соответствующего конъюгированного суперантигена: 8ЕЕ с нижеследующими замещениями: С1у20Атд,
Т11г21Акп. С1у248ет, Ьук27Атд.
В экспериментальной части использовали следующие мутанты: 8ЕА (Акр227А1а) =
8ЕАт9, 8ЕА(Рйе47А1а/Акр227А1а) = 8ЕАт23 и 8ЕА(Рйе47А1а/Акп102р/Акп149Акр/Тйг2^а1/ Акр227А1а) = 8ЕАт57.
Предпочтительные суперантигены в названном порядке первоочередности выбирали из нижеследующих:
1) суперантигены (8ад). проявляющие сайты связывания с ГКГ класса II (например, стафилококковые энтеротоксины А и Е),
2) суперантигены (8ад), которые в своей немутированной форме требуют ионов Ζη для оптимального связывания с ГКГ класса II (например, 8ЕА, 8ЕЕ и 8ЕН),
3) стафилококковые энтеротоксины.
Нет необходимости в том, чтобы молекула 8ад, которая должна быть включена в конъюгат по настоящему изобретению, была функциональным суперантигеном, главное требование чтобы конечный конъюгат был способен использовать механизмы 8АОСС и/или 8ЭСС, как описано выше.
С. Т-часть, обеспечивающая связывание с мишенью, в формуле I
Т в принципе может представлять из себя любую структуру, способную связываться с поверхностными структурами клетки, предпочтительно со структурами, специфичными для болезни.
Структура, против которой направлена Т, обычно отличается (а) от эпитопа полиморфной цепи ТСК, с которым связывается 8ад, и (б) от эпитопов ГКГ класса II, с которыми связывается 8;щ. Часть, обеспечивающую связывание с мишенью, можно выбрать среди интерлейкинов (например, интерлейкин-2), гормонов, антител, включая связывающиеся с гормонами фрагменты антител, ростовых факторов и т.п. См., например, публикацию \νοο6\νοΠ1ι 1993 (включенную в данное описание в качестве ссылки).
Часть, обеспечивающая связывание с мишенью, может, таким образом, представлять собой белок, содержащий 1, 2, 3 или 4 полипептидных цепи.
На момент даты приоритета предпочтительным являлось, чтобы Т представляла собой антитело (полноразмерное антитело, РаЬ, Р(аЬ)2, Εν, 8сРу (одноцепочечное антитело), множественные одноцепочечные антитела (8сЕ\')п и любой другой связывающий антиген фрагмент антитела), включая любые функционально активные усеченные формы антител, упомянутые выше. Другие варианты являются моноспецифичными и биспецифичными. Антитело в принципе может быть направлено против любой болезни, связанной с/специфичной для поверхностных структур клетки, например для структур, связанных с любыми вышеприведенными формами рака, при этом особое значение имеют активные фрагменты антител (такие как РаЬ). Обычно антитело может быть направлено против эпитопа, специфичного для толстой кишки и/или поджелудочной железы, например против так называемого эпитопа С242 (Ыпб1ю1т е! а1,. ΥΟ 93/01303), против специфичного для рака легких эпитопа, например эпитопа для антитела 5Т4 (8!ет е! а1., ΥΟ 89/07947), против специфичного для лимфомы эпитопа, например СЭ19, против специфичного для меланомы эпитопа, например ΗΜΥ-МАА, и т.п.
Термин «антитело» включает как моноклональные, так и поликлональные варианты, причем предпочтение отдается моноклональным препаратам.
В случае, если часть, обеспечивающая связывание с мишенью, представляет собой фрагмент РаЬ, предпочтительно, чтобы остатки цистерны, в норме связывающие между собой тяжелые и легкие цепи РаЬ, были замещены аминокислотой, предотвращающей образование дисульфида, например серином. См. также АпΙοηκκοη е! а1., ΥΟ 97/36932.
Вышесказанное также включает в себя то, что Т может быть направлена и против необычных структур на более или менее здоровых клетках, которые регулируют или контролируют развитие болезни.
I). ЛИНКЕР В.
Линкер В может быть выбран так, как описано ранее (ЭойГЮп е! а1., \¥О 92/01470; АЬгайткеп е! а1. \¥О 96/01650; и Αηΐοηκδοη е! а1., XV О 97/36932), т.е. В предпочтительно должен быть гидрофильным и иметь одну или более структур, выбранных из амида, тиоэфира, дисульфида и т.п. Наиболее эффективными линкерами являются те, которые получены с помощью рекомбинантных технологий, т.е. конъюгация у них происходит на геномном уровне, приводя к получению олигопептидных линкеров. Как правило, олигопептидные линкеры содержат 1-30, например 1-20, аминокислотных остатков, которые предпочтительно выбирают так, чтобы линкер в целом был гидрофильным. Линкерные остатки поэтому предпочтительно выбирают из остатков гидрофильных аминокислот, таких как 61η, 8ег, 61у, 61и, Рго, Ηίδ и Лтд. Типичные олигопептидные линкеры включают трипептид 61у61уРго или так называемый Ωлинкер (публикация ХУооИоп е! а1., 1989, включенная в настоящее описание в качестве ссылки), который может быть модифицирован с помощью д1у-рго на аминном конце.
Е. ТОЧКИ ПРИСОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ Т, 8ад и ΙΜ.
Химические конъюгаты обычно содержат смесь молекул конъюгата, различающихся позициями связывания. Вещество конъюгата со держит как гетеро-, так и гомоконъюгаты.
Для рекомбинатных конъюгатов (слитых белков) полученное вещество конъюгата явля ется однородным в отношении позиции связывания. Для каждой отдельной субъединицы (Т, 8ад, ΙΜ) аминный конец слит с карбоксильным концом другой субъединицы или наоборот, предпочтительно через встроенный олигопептидный мостик. Комбинации для случаев, когда конъюгат содержит по одной субъединице Т, ΙΜ, 8ад, могут быть следующими: Т-1М-8ад, 1М-Т-8ад, 8ад-1М-Т, 8ад-Т-1М, Т-8ад-1М, ΙΜ8ад-Т (наличие линкерной структуры В не показано). В случае если одна или более субъединиц содержат две или более полипептидных цепей, количество возможностей увеличивается. Для случая, когда Т представляет собой фрагмент антитела РаЬ, эти возможности таковы (олиго пептидные линкеры В не показаны):
1. 8ад-РаЬ (легкая цепь)1М
РаЬ (тяжелая цепь)
3. 8ад-РаЬ (легкая цепь) РаЬ (тяжелая цепь)-1М
5. 8ад-РаЬ (легкая цепь) 1М-РаЬ (тяжелая цепь)
7. 8ад-РаЬ (легкая цепь)8ад
РаЬ (тяжелая цепь)-1М
2. РаЬ (легкая цепь) 8ад-РаЬ (тяжелая цепь)1М
4. РаЬ (легкая цепь)-1М 8ад-РаЬ (тяжелая цепь)
6. 1М-РаЬ (легкая цепь) 8ад-РаЬ (тяжелая цепь)
8. РаЬ (легкая цепь)-1М
РаЬ (тяжелая цепь)-8ад
На момент даты приоритета были предпочтительными рекомбинантные конъюгаты, причем наибольшее предпочтение отдавалось РаЬфрагментам в качестве частей, обеспечивающих связывание с мишенью, и связыванию аминного конца свободного суперантигена с первым константным доменом тяжелой (Сн1) или легкой цепи антитела, а иммуномодулятора - с оставшимся карбоксильным концом (это справедливо для формул ι-ιν).
Для оптимального продуцирования и функционирования, слитый белок экспрессируется рекомбинантно как двухцепочечный продукт, в котором суперантиген слит на С-конце с Сн1-доменом Рай-фрагмента антитела через гибкий гидрофильный аминокислотный линкер, состоящий из 3-11 остатков. Этот линкер может иметь последовательность 61у-61у-Рго или РгоА1а-8ег-61у-61у-61у-61у-А1а-61у-61у-Рго (Последов. № 19), либо 4-9 остатков, основанных на Последов. № 19, при этом Последов. № 19 предпочтительна. Часть, представляющая собой иммуномодулятор, сливается на С-конце с легкой цепью с помощью гидрофильного и нейтрального или положительно заряженного линкера, состоящего из 10-20 остатков (линкер О). Предпочтительно, чтобы линкер О имел следующие последовательности: 61у-Рго-Агд-61пА1а-А5п-61и-Теи-Рго-61у-А1а-Рго-8ег-61п-61и61и-Агд (Последов. № 23), 61у-Рго-Агд-61п-8егА5п-61и-Тйг-Рго-61у-8ег-Рго-8ег-61п-61и-61иАгд (Последов. № 20), 61у-Рго-Агд-61п-А1а-Ьу8Тйг-Теи-Рго-61у-А1а-Рго-8ег-61п-Тйг-Тйг-Агд (Последов. № 21) или 61у-Рго-Тйг-61и-А1а-А8р61и-Теи-Рго-61у-А1а-Рго-8ег-61и-61и-61и-Тйг (Последов. № 22), причем Последов. № 20 и 21 являются наиболее предпочтительными (подробности см. в примере 2).
Лналогичные комбинации в аминном конце или комбинацию мест присоединения в аминном и карбоксильном концах домена νΗ и νΚ на данной стадии исследований авторы считают приводящими к получению активных, но менее эффективных конъюгатов.
Е. АКТИВНЫЕ ЧАСТИ, НЕ СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ФОРМУЛЕ I, НО ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОГЛАСНО ВЫШЕУКАЗАННЫМ КОМБИНАЦИЯМ А-Е В СПОСОБЕ ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ
Свободные суперантигены (8ад): см. в разделе под заголовком «Определения». Типичные 8ад приведены в разделах под заголовками «Существующий уровень техники» и «В. 8адчасть, представляющая суперантиген в формуле I».
Неконъюгированные иммуномодуляторы: см. в разделе под заголовком «Определения». В принципе можно использовать те же самые иммуномодуляторы, которые приведены в разделе под заголовком «Л. Иммуномодулятор
1М в формуле I». Предпочтительны цитокины и
В дополнительных вариантах иммуномодулятор и суперантиген могут быть слиты последовательно на любом конце любой из цепей антитела.
хемокины, особенно Ш-2 и подобные Ш-2 цитокины.
Иммуномодуляторы по настоящему изобретению (Т, 1М-конъюгаты): эти конъюгаты соответствуют общей формуле αΜΜζ ιιι в которой Т' и ΙΜ' связаны между собой с помощью органического линкера В'. Т', 1М' и В' выбирают из тех же самых групп соединений/структур, что и Т, ΙΜ и В, х и ζ определяются таким же образом, как и в формуле I (у=0), при этом предпочтительно, чтобы приходилось по одному или два ΙΜ' на каждую Т' и каждую молекулу конъюгата. Места соединения между Т' и ΙΜ' таковы, как они определены для формулы I. См. также раздел под заголовком «Е. Точки присоединения...», в котором формулы 1-8 и комментарии к ним применимы также и к Т, ΙΜконъюгатам, за исключением того, что опускается Зад. Конъюгаты формулы III можно получить в соответствии с известными способами, т. е. путем обычного химического связывания или с помощью рекомбинатных технологий (слитые белки), причем предпочтительно последнее (Ее11 е! а1., ЕР 439095; КозепЫит е! а1., ЕР 396387). Особо важные Т, 1М-конъюгаты включают ΙΜ'-часть, которая является модифицированной, например мутированной, получив в результате этого свойство уменьшенного сродства и/или уменьшенной скорости интернализации, как определено выше.
Суперантигены по настоящему изобретению (Т, 8ад-конъюгаты).
Эти конъюгаты соответствуют общей формуле (Т)х(8ад)у IV в которой Т'' и ΙΜ'' связаны между собой с помощью органических линкеров В''. Т'', Зад'' и В'' выбирают из тех же самых групп соединений/структур, что и Т, ΙΜ и В, х и у определяются таким же образом, как и в формуле I (ζ=0), при этом предпочтительно, чтобы приходилось по одному или два Зад'' на каждую Т'' и каждую молекулу конъюгата. Места соединения между Т' и Зад'' такие же, как они определены для формулы Ι. См. также раздел под заголовком «Е. Точки присоединения...», в котором формулы 18 и комментарии к ним применимы также и к Т, Зад-конъюгатам, за исключением того, что в формуле опускается ΙΜ. Конъюгаты формулы ΙΙ можно получить в соответствии с известными способами, т. е. путем обычного химического связывания или с помощью рекомбинатных технологий (слитые белки), причем предпочтительно первое. См., например, Оо11151еп е! а1., АО 92/01470; АЬгайтзеп е! а1., АО 96/01650; Лп!оп88оп е! а1., АО 97/36932.
Третий важный аспект изобретения:
конъюгаты, содержащие модифицированный иммуномодулятор
Эти новые конъюгаты соответствуют формуле (Т''')х(Зад''')¥(1М'Ь V в которой Т''' и Зад''' выбирают из тех же самых соединений, что и Т и Зад для формулы I. ΙΜ''' представляет собой иммуномодулятор, который был модифицирован, например, посредством мутации, таким образом, что он получил свойство проявлять пониженное сродство к своему заякоренному на клеточной мембране рецептору и/или пониженную скорость интернализации путем связывания с его рецептором (по сравнению с соответствующими нативными формами). ΙΜ''' предпочтительно представляет собой цитокин или хемокин. См. также раздел под заголовком «А. Иммуномодулятор ΙΜ в формуле I». Одним из важных иммуномодуляторов для этого аспекта изобретения является модифицированный Ш-2, х, у и ζ определяются таким же образом, как и в формуле I.
В первом подаспекте конъюгатов в соответствии с формулой V, Т''', Зад''' и ΙΜ''' всегда присутствуют (все х, у и ζ > 0), т.е. Т, Зад, ΙΜконъюгаты, х, у и ζ обычно представляют собой целые числа от 1 до 3, предпочтительно 1-2. Обычные взаимосвязи между х, у и ζ таковы: х=у=ζ; х=у=0^; х=0,5у=0^; и х=0,5у=ζ.
Во втором подаспекте конъюгатов в соответствии с формулой V часть, представленная суперантигеном, отсутствует (у=0), т.е. Т, ΙΜконъюгаты, х и ζ обычно представляют собой целые числа от 1 до 3. Предпочтительные взаимосвязи между х и ζ следующие: х=ζ; ,\=0.5ζ; 0,5\=ζ; х=1^ и 1/3\=ζ.
В обоих подаспектах конъюгатов в соответствии с формулой V диапазоны, приведенные для целых чисел и их взаимосвязей, в первую очередь, относятся к слитым белкам, в которых часть, обеспечивающая связывание с мишенью, может представлять собой белок, содержащий 1, 2, 3 или 4 полипептидных цепи, и в которых имеется одна Т в каждой молекуле конъюгата. Точки присоединения в слитых белках формулы V те же самые, что и для соответствующих слитых белков формулы Ι. См. также раздел под заголовком «Е. Точки присоединения...», в котором формулы 1-8 и комментарии к ним применимы также и к Т, 1М-конъюгатам, за исключением того, что для второго подаспекта Зад опускается.
Получение описанных выше конъюгатов
Конъюгаты можно в принципе получать двумя основными способами.
1. Химическое связывание между собой отдельных субъединиц Т, Зад и ΙΜ. Каждую отдельную субъединицу или комбинацию их можно получить с помощью рекомбинантных технологий.
2. С помощью рекомбинантных технологий непосредственно получают конъюгат, описанный в любой из вышеприведенных формул.
Фактически применяемые способы хорошо известны специалистам средней квалификации и включают большое количество вариантов.
При химическом связывании обычно используют функциональные группы (например первичные аминогруппы, карбоксильные группы, меркаптогруппы, углеводородные группы), которые, как правило, нативно присутствуют в нескольких позициях в суперантигенах, белковых иммуномодуляторах и белковых частях, обеспечивающих связывание с мишенью. Эти способы хорошо известны в данной области техники.
Основной клеткой-хозяином для крупномасштабного рекомбинантного получения конъюгатов между суперантигеном и иммуномодулятором по настоящему изобретению (как слитых форм, так и неконъюгированных форм) является Е.сой. Этот хозяин в принципе обеспечивает получение рекомбинантов двумя путями: внутриклеточное продуцирование и секреция. Последний вариант предпочтителен, поскольку он предлагает выделение правильно уложенных складками белков из периплазмы и из культуральной среды. Вышесказанное не исключает того, что активные конъюгаты можно получать также и при использовании других клетокхозяев, например клеток эукариотов, таких как дрожжи или клетки млекопитающих. Предварительные результаты указывают на то, что эукариотные клетки, такие как клетки млекопитающих, могут быть предпочтительными для встраивания иммуномодуляторов, взаимодействующих с СЭ28. например В7 и его аналогов.
Четвертый аспект изобретения: генные конструкции, кодирующие новые конъюгаты по настоящему изобретению
Четвертый аспект изобретения представляет собой рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно ДНК, такой, как кДНК или РНК, кодирующую описанные выше суперантиген и иммуномодулятор, предпочтительно Ш-2, Ш-7, Ш-12, ТЬ-15, ТЬ-18, ВАИТЕЗ, эктопический домен ί.Ό80. эктопический домен ί.Ό86. 4-ВВ1Ь и Е1!3Ь и их аналоги, описанные выше. В этом аспекте изобретения нуклеиновая кислота обычно содержит регуляторные регулярные последовательности, такие как трансляционные регуляторные последовательности, область начала репликации, последовательности секреторного сигнала, либо для одной из субъединиц - иммунорегулятора или суперантигена, либо для обеих этих субъединиц и т.п., совместимых с клеткой-хозяином, в котором должны экспрессироваться суперантиген и иммуномодулятор. Область между частями последовательностей, кодирующих суперантиген и иммуномодулятор, может включать последовательность, кодирующую аминоацильные сайты рибосом, такие как бисцистронная генная конструкция. Последнее позволяет осуществлять отдельную экспрессию каждой полипептидной цепи, включенной в конъюгат. В случае многоцепочечных комбинаций конъюгатов, содержащих ^^адД-конъюгат и соответствующие сигнальные последовательности, бисцистронные конструкции облегчают складчатое сворачивание и сборку до полностью активных конъюгатов с ΣΜ, присоединенным к одной из цепей. Это важно для случаев, когда часть, обеспечивающая связывание с мишенью, представляет собой двухцепочечную молекулу антитела, и, по меньшей мере, один из суперантигенов (Зад) и иммуномодулятор сливают с терминальным концом цепи антитела (см. выше).
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, ДОЗИРОВКИ И СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ Четвертый аспект настоящего изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую комбинацию по данному изобретению суперантигена (Зад), обеспечивающую связывание с мишенью части (Т) и иммуномодулятора (ΣΜ). Характерным признаком этого аспекта изобретения является то, что, по меньшей мере, одна субъединица - суперантиген или иммуномодулятор - находится в форме конъюгата, позволяющего осуществлять связывание с клетками-мишенями, которые подлежат инактивации, как описано выше.
Рассматриваемые композиции известны в данной области техники, за исключением того, что в данном случае они содержат комбинацию конъюгата по настоящему изобретению. В конкретной композиции эта комбинация может включать:
a) тройной конъюгат, включающий суперантиген (Зад), обеспечивающую связывание с клетками-мишенями часть (Т) и иммуномодулятор 0Μ) (Т, 1М, 8ад-конъюгат);
b) два двойных конъюгата - один между обеспечивающим связывание с мишенью антителом (Т) и суперантигеном, а второй - между обеспечивающим связывание с мишенью антителом (Т') и иммуномодулятором (т.е. Т, Задконъюгат + Т', ΙΜ-конъюгат). Т и Т' могут быть разными или одинаковыми, в зависимости от конкретного эпитопа;
c) один двойной конъюгат между суперантигеном (Зад), обеспечивающей связывание с мишенью частью (Т) и иммуномодулятором (ΣΜ) в свободной форме (Т, Зад-конъюгат + Ш);
б) один двойной конъюгат между иммуномодулятором (ΣΜ), обеспечивающей связывание с мишенью частью (Т) и суперантигеном в свободной форме (Зад) (Т, ΙΜ-конъюгат + Зад); или
е) суперантиген (Зад) и иммуномодулятор (ΞΜ) в форме двойного конъюгата (Зад, ΞΜконъюгат).
См. также выше, в контексте способов по настоящему изобретению. В случае если композиции содержат два активных компонента (Ь-б выше), то такая композиция позволяет поддерживать компоненты отдельными друг от друга вплоть до ее введения.
Композиции могут быть в форме состоящего из частиц лиофилизированного материала, стерильного или асептически изготовленного раство19 ра, таблеток, ампул и т.п. Могут также присутствовать носители, такие как вода, или другие, предпочтительно забуференные до физиологически приемлемого значения рН, например с помощью РВ8 (физиологического раствора с фосфатным буфером), или другие инертные твердые или жидкие материалы. Как правило, композиции готовят из конъюгата, можно в комбинации с неконъюгированным активным компонентом, которые смешивают, растворяют, связывают или иным способом соединяют с одним или более водорастворимых или нерастворимых в воде водным или неводным носителем, если требуется, то вместе с подходящими добавками и адъювантами. Эти носители и условия ни в коем случае не должны отрицательно влиять на активность активных компонентов, определенных выше в пунктах а-е.
Как правило, суперантигены (8АС) для использования по настоящему изобретению продают и вводят в виде предварительно диспергированных дозировок, каждая из которых содержит эффективное количество 8ЛС, которое основано на представленных в настоящем описании результатах и которое находится в диапазоне от 1 пг до 50 мг. Точные дозировки разные для разных случаев и зависят от веса и возраста пациента, а также от пре-титра антител, специфичных для используемого 8ЛС. способа введения, типа заболевания, от части, обеспечивающей связывание с мишенью, суперантигена, типа соединения (-В-), иммуномодулятора и т. п.
Важным фактором, который следует принимать во внимание при определении дозы для комбинации, используемой в соответствии со способом по настоящему изобретению, является то, что суперантигены и иммуномодуляторы имеют оптимальные диапазоны концентраций. Слишком низкая доза приведет к отсутствию эффекта или к эффекту ниже оптимального, а слишком высокая доза приведет к нежелательным побочным действиям, таким как токсичность, которая может быть летальной. Таким образом, необходимо заострить внимание на том, что вышеприведенный широкий диапазон представляет собой лишь попытку охватить все возможные диапазоны для всех вариантов способа по настоящему изобретению. Таким образом, каждая конкретная комбинация в соответствии со способом по настоящему изобретению имеет свой субдиапазон доз в пределах диапазона от 0,1 пг до 50 мг. Это не исключает того, что будущие исследования и результаты могут привести к дозировкам, выходящим за пределы этого диапазона.
Способы введения такие же, какие обычно используются в данной области, т.е. уничтожающее мишень эффективное количество или терапевтически активное количество комбинации суперантигена и иммуномодулятора в соответствии с настоящим изобретением приводят в контакт с клетками-мишенями. В соответствии с вышеуказанным, это чаще всего означает парентеральное введение, такое как инъекции или вливания (подкожно, внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, внутрибрюшинно) млекопитающему, такому как человек. Комбинацию конъюгата по настоящему изобретению можно вводить локально или системно.
Под термином «уничтожающее мишень эффективное количество» имеется в виду такое количество, которое эффективно для активации Т-клеток и стимулирования их к разрушению клеток-мишеней.
Предпочтительные способы введения на момент даты приоритета такие же самые, как и для конъюгатов суперантигенов согласно ΌοΐιΐЧеп е! а1., νθ 92/01470; АЬгайткеп е! а1., νθ 96/01650; и Άηΐοηδδοη е! а1., РСТ 97/00537. Это означает 1-5-ти часовое внутривенное вливание (предпочтительно 4-х часовое) в день с жаропонижающим средством (парацетамолом). Введение повторяют в течение нескольких дней, например 5-8 дней, при этом тщательно учитывают возможный риск бустеринга антител, направленных против конъюгата. Оптимальным является проведение нескольких циклов терапии, причем каждый цикл включает введение лекарства в течение одного или более дней, за которым следует период отдыха, составляющий один или более дней, например циклы с введением лекарства и отдыхом, длящиеся 2 и 5 дней соответственно.
Композиции по настоящему изобретению можно вводить либо в качестве основной терапии, либо в предпочтительных режимах в виде дополнительной терапии в комплексе с хирургическим лечением или с другими лекарствами.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Пояснения к фигурам
Фиг. 1. РЛС8-анализ клеток СНО-СЭ28, окрашенных с СЭ80-С215РаЬ. СЭ80-С215РаЬ8ЕЛт57 или С215РаЬ-8ЕЛ с последующей инкубацией с антимышиным каппа-цепочечным моноклональным антителом, меченным РЕ. Окрашивание проводили при 4°С без промывок. Ордината: главный канал.
Фиг. 2. РЛС8-анализ клеток Со1о205, окрашенных с СЭ80-С215РаЬ, СЭ80-С215РаЬ8ЕЛт57 или С215РаЬ-8ЕЛ с последующей инкубацией с антимышиным каппа-цепочечным моноклональным антителом, меченным РЕ. Окрашивание проводили при 4°С с тремя промывками между стадиями окрашивания. Ордината: главный канал. Абсцисса: отношение эффекторных клеток (Е) к клеткам-мишеням (Т).
Фиг. 3. Пролиферация. Т-клетки инкубировали с клетками Со1о205 и 4мкМ С242РаЬ8ЕА, а также с различными количествами СЭ80-С215РаЬ в течение 4 суток, после чего подсчитывали количество включенного 3Нтимидина. Активность, полученная без СЭС215-РаЬ, составила 20039 импульсов/мин. +/1750.
Фиг. 4. Продуцирование 1Ь-2. Т-клетки инкубировали с клетками Со1о205 и 4мкМ С242ЕаЬ-8ЕА, а также с различными количествами СИ80-С215ЕаЬ в течение 4 суток, после чего собирали надосадочную жидкость и определяли количество 1Ь-2. Количество 1Ь-2, полученное без СО80-С215-ЕаЬ, составило 2849 пг/мл.
Фиг. 5. Пролиферация. Т-клетки инкубировали с клетками Со1о205 и с различными количествами СИ80-С215ЕаЬ-8ЕАт57 или С215ЕаЬ-8ЕАт23 в течение 4 суток, после чего подсчитывали количество включенного 3Нтимидина.
Фиг. 6. Продуцирование 1Ь-2. Т-клетки инкубировали с клетками Со1о205 и с различными количествами СИ80-С215ЕаЬ-8ЕАт-57 или С215ЕаЬ-8ЕАт23 в течение 4 суток, после чего собирали надосадочную жидкость и определяли содержание 1Ь-2.
Фиг. 7. Пролиферативная способность Тклеток крови человека, инкубированных в течение 7 суток с указанными белками и с облученными трансфецированными клетками СНО (для представления 8ЕА). Ордината: включение 3Нтимидина (импульсов/мин.).
Фиг. 8. Одновременное введение 8ЕА и 1Ь2 ведет к повышению активации Т-клеток ίη νινο. Цитотоксичность (выраженная в процентах) против покрытых 8ЕА Ра) ί-клеток ГКГ класса II* спленоцитов, взятых у мышей, получивших от 1 до 3 инъекций С215ЕаЬ8ЕА (Е8), С215-ЕаЬ-Р-ЫЬ2 (ΕΙ), комбинации (Ε8+ΕΙ) или С215ЕаЬ8ЕА-Р-ЫЬ2 (Ε8Ι). Отношение эффекторных клеток к клеткаммишеням составляло 30:1, а цитотоксичность измеряли с помощью стандартного анализа высвобождения 51 Сг за 4 ч.
Фиг. 9. Терапия 5-суточных опухолей В16С21- у мышей линии С57В1/6, осуществлявшаяся с помощью трех инъекций (сутки 5, 6 и 7 после инокуляции опухоли) С215ЕаЬ8ЕА (Е8), С215ЕаЬ-Р-ЫЬ2 (И), С215ЕаЬ8ЕА + С215ЕаЬ0-11II. 2 (Ε8+ΕΙ) или С215ЕаЬ8ЕА-Р-ЫЬ2 (Ε8Ι). Использовали эквимолярные количества ЕаЬ8ЕА и ЕаЬ-Р-ЫЬ2. Абсцисса: количество инъецированного белка. Ордината: уменьшение опухоли, выраженное в процентах.
Фиг. 10. Увеличенная инфильтрация опухоли Т-клетками СЭ-25' после обработки С215ЕаЬ8ЕА (Е8), С21 .ЧаЬ-О-НП.З (И) или С215ЕаЬ8ЕА-Р-ЫЬ2. С 025-положительные клетки, инфильтрирующие легкие мышей, имеющих индуцированные опухоли легких В16СА733. определяли биоиммуногистохимически. Ордината: процент окрашенной области. Абсцисса: 1 = РВ8; 2 = первая инъекция; 3 = вторая инъекция; 4 = третья инъекция; 5 = четвертая инъекция.
Фиг. 11. Уровни окрашивания γинтерферона после проведения до 4 инъекций, один раз в день (37 мг на инъекцию),
С215ЕаЬ8ЕА-Р-ЫЬ2 (Ε8Ι) (37 мг/инъекццю).
Через четыре часа после последней инъекции брали пробы крови и определяли содержание γинтерферона (показано на ординате) с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), с использованием в качестве стандарта рекомбинантного мышиного γ-интерферона (Рйатттдеп). Подобный эксперимент выполнили и с эквимолярными количествами (30 мг на инъекцию) С215ЕаЬ8ЕА (Е8).
Фиг. 12. Цитотоксичность (выраженная в процентах и показанная на ординате) против покрытых 8ЕА Еар-клеток ГКГ класса ΙΙ+ спленоцитов, взятых у мышей, получивших РВ8 или 1, 4 или 6 инъекций С215ЕаЬ8ЕАС227А-Р-ЫЬ2 (=Е8т9-П2). Цитотоксичность измеряли с помощью стандартного анализа высвобождения 51 Сг за 4 ч. РВ8 использовали в качестве отрицательного контроля.
Фиг. 13. Терапия 3-х суточных опухолей В16-С215 у мышей линии С57 В1/6, после введения 8 инъекций С215ЕаЬ8ЕАС227А (=Е8т9) или С215ЕаЬ8ЕАС227А-Р-ЫЬ2 (=Е8т9-П2). Лечение проводили ежедневно в течение 8 последовательных дней. На 21 сутки животных умертвили и подсчитали легочные метастазы. Ордината: уменьшение опухоли, выраженное в процентах.
Фиг. 14. Терапия 3-х суточных опухолей В16-С215 у трансгенных мышей линии УЬ3 ТСК после введения 8 инъекций С215ЕаЬ8ЕАп227А-р-ЫЬ2Р42А (=Е8т9-П2 (Е42А)), С215ЕаЬ8ЕАС227А-Р-ЫЬ2 (=Е8т9-П2) или С215ЕаЬ8ЕАС227А (=Е8т9). Лечение проводили ежедневно в течение 8 последовательных дней. На 21 сутки животных умертвили и подсчитали легочные метастазы. Ордината: уменьшение опухоли, выраженное в процентах.
Фиг. 15. Терапия 3-суточных опухолей
В16-С215 у трансгенных мышей линии УЬ3
ТСК, после введения
С215ЕаЬ8ЕАп227А-р-ЫЬ2Р42А
С215ЕаЬ8ЕАС227А-Р-ЫЕ2р42к инъекций (Е42А), (Е42К) или
С215ЕаЬ8ЕА£>227л^ЫЕ2р42А/Е>208 (Е42А/О208).
Лечение проводили ежедневно в течение 8 последовательных дней. На 21 сутки животных умертвили и подсчитали легочные метастазы. Ордината: уменьшение опухоли, выраженное в процентах.
ПРИМЕР 1. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СЛИТЫХ БЕЛКОВ СБ80-С215ЕаЬ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КОСТИМУЛЯЦИИ ТЕРАПИИ ОПУХОЛИ С ПОМОЩЬЮ ЕаЬ, СВЯЗЫВАНИЕ КОТОРОГО С МИШЕНЬЮ БЫЛО ОБЕСПЕЧЕНО С ПОМОЩЬЮ 8а§.
Резюме: сконструировали слитые белки СИ80-С215ЕаЬ и СО80-С215ЕаЬ-8ЕАт57, содержащие внеклеточный домен человеческого СЭ80. Эти слитые белки продуцировали в клетках млекопитающего и испытывали на связывание с СЭ28 с помощью клеточных трансфектантов СНО и антигена С215, а также с помощью клеток Со1о205. Оба слитых белка связывались с СО28 и антигеном С215, причем связывание с последним было уменьшенным в 100 раз по сравнению со связыванием с С215ЕаЬ-8ЕА. Поскольку СБ80 присоединяется к Ν-концевой части Ь-цепи, то возможно, что СБ80 препятствует связыванию с С215ЕаЬ. Оба слитых белка костимулировали 8АО-активированные Тклетки человека, что указывает на то, что растворимый СБ 80 сохраняет свои биологические функции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Технологии рекомбинантной ДНК и ферменты: получение плазмидной ДНК и другие операции выполняли, по существу, согласно Сэмбруку и др. (БатЬгоок е! а1., 1989). В качестве штамма-хозяина использовали Е. со11 НВ 101 (Воуег е! а1., 1969). Рестрикционные эндонуклеазы и фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I получили от ВоеЕгтдег МаппМт из Ые^ Епд1апб Вю1аЬз и использовали согласно рекомендациям поставщика. Тац-полимеразу получили от Регкт Е1тег. кДНК получали из тотальной РНК с помощью набора ОепеАтр КЫА РСК к1! (Регкт Е1тег). Олигонуклеотиды синтезировали на установке Оепе АззетЫег (РЕагтата Вю!есЕ АВ) или на синтезаторе АВI 392 ВЫА/КЫА (АррПеб Вю8у8!етз) и очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой на системе ТРЬС (Рйагтас1а Вю!есЕ). Секвенирование осуществляли в соответствии с принципом дидезокситерминирования цепей (Запдег е! а1., 1977) с помощью набора АррПеб Вюзу8!ет8 ОуеПеоху Тегттабоп Сус1е Зедиепстд Кй, а полученные продукты разделяли и определяли на секвенаторе ДНК модели АВI 373А (АррПеб Вю8у8!етз). Бактерии, несущие различные плазмиды, отбирали в чашках, содержащих среду 2 х УТ и 15 г агаровой основы на литр, с добавкой 70 мг/л канамицина или 100 мг/л амплимицина. Жидкая питательная среда представляла собой 2 х УТ (с содержанием на литр: 10 г дрожжевого экстракта (ОЛсо), 16 г триптона (ВИсо) и 5 г ЫаС1).
Таблица 1 1АК<2 5 ΑΤΑ ТАА ССТ ТСС АСС АТС ССС САС АСА ССС АСС (ПОСЛЕДОВ. » 1)
ДАК<27 АСС САС АТС ТТТ АСТ ТАТ САС САА ААТ ССТ СТТ
СС (ПОСЛЕДОВ. № 2)
ДАКфЗО ТСА ААС СТТ СТС САС ССС ССТ СТТ АТС АСС ААА
АТС СТС (ПОСЛЕДОВ. № 3)
ДАКО37 ССС ССС ТСА ССС ТАА ССА АСТ ССС АСС ССС ССС
СТС АСА САС АСС А (ПОСЛЕДОВ. № 4)
ΙΛΚΟ38 АСС ТТС СТС ТСА ССС ССС ССС тсс ССС САС ТТС ТТС ТТС СТТ СТС АСС ТСА СТС ССС АСС
(ПОСЛЕДОВ. № 5)
ΙΑΚΟ8 8 ТСС ТАС АСС АСА САА САС АСС ТТС ТАТ СТА ТС
(ПОСЛЕДОВ. . № 6)
ДАК089 САТ АСА ТАС ААС СТС ТСТ ТСТ СТС СТС ТАС СА
(ПОСЛЕДОВ. № 7)
ЬАКОЭО ССА АТА АСА ААС АСС ТСА СТС ТТС АСС АСТ ТСС
(ПОСЛЕДОВ . № 8)
ΙΑΚ091 ССА АСТ ССТ САА САС ТСА ССТ ςττ ТСТ ТАТ ТСС
(ПОСЛЕДОВ. № 9)
ДАКО92 САС АТА АТА ААС ТТА ТТА АСТ САС ААА АСА тс
(ПОСЛЕДОВ. № 10)
ПАКО93 САТ СТТ ТТС ТСА СТТ ААТ ААС ТТТ АТТ АТС тс
(ПОСЛЕДОВ . № 11)
ДАКОЮ 8 ССС ССА ТСС ССС ССС САС САС ССС ССТ СТТ АТС
ССС ААА АТС СТС ТТС С (ПОСЛЕДОВ. № 12)
ΙΛΚ0117 ССС САТ ААС АСС ССС ССТ САС СТА АСС ААС тсс
АСС ССС ССС СТС АСА ССА АСАА ССС ССС САС СТС САА СТС СА . (ПОСЛЕДОВ. № 13) '
ПАКО118 СТТ ССА ССТ ССС ССС СТТ СТТ ССТ СТС АСС ССС ССС СТС ССА СТТ ССТ ТАС ССТ САС ССС ССС ТСТ ТАТ (ПОСЛЕДОВ. №14)
Плазмидные конструкции
Гены, кодирующие фрагмент ЕаЬ, содержащий вариабельные домены мышиного антитела С215, собрали, как описано выше (ВоЫ8!еп е! а1., 1994). Клонирование и мутагенез гена стафилококкового энтеротоксина А (8ЕА), которое привело к получению замен Е47А и О227А, описано ранее (АЬгаЕткеп е! а1., 1995). Три другие мутации ввели в ген 8ЕА с помощью праймеров ЕАКР88-93 (все использованные олигонуклеотиды представлены в табл. 1) и получили мутант 8ЕА, которому дали номер 57. ЕАКР5 и ЕАКР7 использовали в реакции ПЦР с обратной транскриптазой для введения в обратном направлении рамки Козака и для клонирования гена, кодирующего сигнальный пептид и внеклеточную часть человеческого СО80 из тотальной РНК селезенки человека. Было установлено, что эта нуклеотидная последовательность соответствует последовательности СО80 из банка генов (номер образца М27533). Получили два варианта гена СО80, имеющие различные сайты клонирования на 3' конце: в отдельных реакциях ПЦР использовали праймеры ЕАКР30 и ЕАКР108 для получения сайтов В88НП или МпЯ соответственно. Группу слитых генов, кодирующих СО80, слитых перед каппацепью с помощью ρ-линкера (Аоо!!оп е! а1., 1989), сконструировали путем встраивания ДНК-линкера ЕАКР37/38 В88НII-Е8р3I между соответствующим геном СО80 и сайтом ОкаД расположенным непосредственно перед геном каппа. Плазмиду рКОЕ987 получили путем встраивания слитых генов, кодирующих СО80(Р-линкер)-каппа, перед которым находится сигнальный пептид СО80, в вектор, который в дополнение к промотору СΜV и поли-А-хвосту, содержит ген неомицина, используемый для отбора трансформантов. Последнюю версию гена СО80 использовали для конструирования группы слитых генов, в которой он предшествует группе слитых генов мутанта Е6-8ЕА за но мером 57: фрагмент ДНК (ЬАКр117/118), кодирующий Ο-линкер, встроили между сайтом Мго! в гене СО80 и сайтом РкЙ в кодоне 4 и 5 в гене С215 УН. Эту группу слитых генов встроили во второй вектор СМУ-промотора и получили плазмиду рМВ189, таким образом закодировав сигнальный пептид ί.Ό80 и внеклеточную часть, вслед за которыми идет мутант Ей и 8ЕА за номером 57, соединенный с помощью состоящего из трех остатков спейсера ССР. В плазмиде рКСЕ961 ген Ей вставили после сигнальной последовательности (происходящей из другого мышиного гена УН). Плазмида рМВ165 кодирует нативную каппа-цепь, которой предшествует ее нативный сигнальный пептид, и содержит ген неомицина.
Продуцирование
Клетки эмбриональной почки 293 хомяка трансфецировали либо плазмидами рКСЕ961 и рК6Е987, либо рМВ156 и рМВ189, в результате чего получили клеточные линии, продуцирующие СО80-С215ЕаЬ и СО80-С215ЕаЬ-8ЕАт57 соответственно. Для того, чтобы получить стабильные клеточные линии, использовали среду для отбора ЭМЕМ без красителя фенолового красного (Рйагтас1а по М8 0127) с добавкой Ьглютамина (СШС0 ВКЬ по 25030-24), 10% телячьей сыворотки и 1 мг/л генетицина. Средой для продуцирования была ЭМЕМ без фенолового красного с добавкой Ь-глютамина и 0,1% Н8А (сывороточного альбумина человека) (Рйагтааа & Ьр)ойп АВ, Швеция). Слитые белки выделяли из отфильтрованной (8аг1оЬгап 0,65-0,4 ит) культуральной среды с помощью аффинной хроматографии на протеин Ссефарозе ЕЕ (Рйагтааа Вю1есй АВ), вслед за чем осуществляли анти-СО80 аффинную очистку (иммобилизованное антитело против человеческого СО80, СатЕойо Ь307.4) или ионнообменную хроматографию на 8Р-сефарозе ЕЕ (Рйагтааа Вю1есй).
Реагенты. Среду КРМП 1640 (С1Ьсо, М1йй1екех, ИК) с добавкой 2 мМ Ь-глютамина (61Ьсо, М1йй1екех, ИК), 0,01М НЕРЕ8 (Вю1о§1са1 Мийлек, [згае!), 1 мМ №-1НСО3 (Вюсйгот К6, Ветки, Оегтапу), 0,1 мг/л сульфата гентамицина (Вю1одюа1 Микитек, К1ЬЬп1х Вей Наетек, Нгае^, 1 мМ пирувата натрия (ГКН Вюкаепаек Мийлек, И8А) и 10% инактивированной высокой температурой фетальной телячьей сыворотки (61Ьсо М1йй1екех, ИК) использовали в качестве полной среды для всех клеточных культур.
Антитела. Моноклональные антитела (тАВ), направленные против человеческого СО57 (НЯК1) и СО56 (НВ55), получили из продуцирующих тАВ клеток гибридомы (Американская коллекция тканевых культур (АТСС), КоскуШе, МО). Антимышиные каппацепочечные моноклональные антитела, меченные РЕ, получили от ВесЮп ОЬкткоп (8ап .Токе, СА).
Клетки. Клетки К1 яичников китайского хомячка (СНО) трансфецировали человеческой кДНК, кодирующей ген СЭ28, в Рйагтааа апй
Ир^ою, 8Юскйо1т, Швеция. Трансфектанты обычным способом проанализировали на экспрессию СЭ28 и поддерживали путем ЕАС8сортинга на близких уровнях экспрессии антигена. Клеточную линию карциномы толстой кишки человека Со1о205 получили из АТСС. Все клеточные линии были свободны от микоплазмы.
Анализ на пролиферацию Т-лимфоцитов.
Т-клетки получали из мононуклеаров периферической крови (РВМ), как описано ранее (Ьапйо е! а1., 1996), путем пэннинга с негативным отбором с моноклональными антителами СО57, НЬА-ОКД, СО 14 и СО56. Все испытания на Т-клетках проводили при 0,1 х 106 клеток/лунку в объемах по 200 мкл в плоскодонных 96-луночных планшетах (Νιιπα Коккййе, Дания). Синтез ДНК изучали после экспозиции культур с [3Н]-тимидином [3Н]ТйК (0,5 тС1/лунку), как описано ранее (10).
Анализ с помощью проточной цитометрии. Проточный цитометрический анализ и сортинг осуществляли в соответствии со стандартной настройкой на проточном цитометре модели ЕАС81агР1 к (ВесЮп ОюИпкоп, Моип(ат У1е\\\ СА). Из-за низкого сродства ί.Ό80 к СЭ28 окрашивание клеток СН0-С028 со слитыми белками СО215ЕаЬ осуществляли, опуская промывку клеток.
Анализ на цитокины. Продуцирование ^-2 анализировали методом ИФА, с помощью набора ^-2 ЕЬЕА кй (111.1^-2 Опоке!, Сепхуте).
Результаты.
Описание слитых белков СО80-Еа1). ЕаЬчасть представляет собой изотип мышиного IдС1/к, хотя она содержит вариабельные домены IдС2Α/к-моноклонального антитела С215 (Оой1к!еп е! а1., 1995). Трипептидная последовательность ССР следует за внутрице-почечным дисульфидом, образуя цистеин в домене СН1. В тройном слитом белке СО80-С215ЕаЬ-8ЕАт57 это функционирует как спейсер между Ей и мутантом стафилококкового энтеротоксина А (8ЕА; Ве!1еу е! а1., 1988), имеющий шесть замещений. Замены Е47А и О227А встроили для того, чтобы уменьшить сродство к ГКГ класса II (АЬгайткеп е! а1., 1995), а замены Ν102Ρ, Ν149Ό и Т218У ввели для того, чтобы не допустить гликозилирования при продуцировании в эукариотных клетках. Эти последние замены выбраны с помощью рентгеновской структуры (8ипйк(тот е! а1., 1996). Окончательный пентамутант обозначили как 8ЕА-мутант 57. Оба слитых белка содержат внеклеточный домен СО80 человека (обозначенный как ЕРОЩ. Использовали нативный сигнальный пептид СО80 и установили, что зрелый белок запускает УШУ, что определили с помощью секвенирования аминокислот очищенного СО80-С215ЕаЬ.
Состоящий из 18 аминокислот спейсер соединяет СИ80 с каппа-цепью в СЭ80-С215РаЬ или с Рб-частью РаЬ-фрагмента в тройном слитом белке СИ80-СО215РаЬ-8ЕАт57. Эти спейсеры напоминают О-линкер (\Уоо1оп е! а1., 1996) и имеют последовательности 8ΑΡΟΑΝΕΡ·ΡΟΑΡ8ОЕЕРА (Последов. № 15) и 8АР0ΑΝΕΡ·ΡΟΑΡ80ΕΕΡΡ (Последов. № 16), соответственно.
Расз-анализ: Связывание слитых белков СБ80-С215ЕаЬ с СБ28-положительными клетками и с С215-положительными клетками.
СО-28-положительные клетки: Клетки СНО-СИ28 окрашивали с СО80-С215РаЬ, СЭ80С215РаЬ-8ЕАт57 или с С215РаЬ-8ЕА, а затем инкубировали с антимышиным каппацепочечным моноклональным антителом, меченным РЕ. Окрашивание проводили при 4°С без промывок.
Как СЭ80-С215РаЬ, так и тройной слитый белок связывались с СО28, экспрессируемым на клетках СНО, при этом связывание зависело от дозы. Как и ожидалось, не наблюдалось окрашивания с контрольным слитым белком С215РаЬ-8ЕА.
С215-положительные клетки. Связывание слитых белков против антигена С215 оценивали против клеток Со1о205. Клетки Со1о205 окрашивали с СЭ-80-С215РаЬ, СЭ80-С215РаЬ8ЕАт57 или с С215ЕаЬ-8ЕА. а затем инкубировали с антимышиным каппа-цепочечным моноклональным антителом, меченным РЕ. Окрашивание проводили при 4°С с тремя промывками между стадиями окрашивания.
Результаты (фигуры 1-2): Как СЭ80 С215РаЬ, так и СЭ80-С215РаЬ-8ЕАт57 связывались с антиген С215-положительными клетками Со1о205, при этом связывание зависело от дозы. Связывание было в 50-100 раз ниже, чем для С215РаЬ-8ЕА. Это указывает на то, что встраивание СЭ80 в Ν-концевую часть слитого белка может препятствовать связыванию С215РаЬ с антигеном С215.
Двойные слияния. Костимуляция активированных суперантигеном Т-клеток.
Для того, чтобы определить биологическую активность слитых белков, их испытывали на костимуляцию активированных суперантигеном Т-клеток.
Пролиферация: Т-клетки инкубировали с клетками Со1о201 и с 4 мкМ С242РаЬ-8ЕА, а также с различными количествами СЭ80С215РаЬ, в течение 4 суток, после чего измеряли пролиферацию, по количеству включенного 3Нтимидина. Активность, полученная без СЭ80С215РаЬ составляла 20039 отсчетов/мин. +/1750.
Продуцирование 1Ь-2: Т-клетки инкубировали с клетками Со1о205 и с 4 мкМ С242РаЬ8ЕА, а также с различными количествами
СЭ80-С215РаЬ в течение 4 суток, после чего собирали надосадочную жидкость и определяли количество 1Ь-2. Количество 1Ь-2, полученное без СИ80-С215РаЬ, составляло 2849 пг/мл.
Результаты (фигуры 3-4): СЭ80-С215РаЬ оказывал костимулирующее действие на индуцированную С242РаЬ-8ЕА активацию Т-клеток, причем степень стимуляции зависела от дозы, как для пролиферации, так и для продуцирования 1Ь-2.
Тройные слияния. Костимуляция активированных суперантигеном Т-клеток.
Для того, чтобы определить биологическую активность тройного слитого белка, очищенные Т-клетки инкубировали с С215РаЬ8ЕАт23 (причем т23 представлял собой такой же мутант 8ЕА. влияющий на связывание с ГКГ класса II, как и тот, что использовался для тройного слитого белка, т.е. Рйе47А1а/А§р227А1а), или с СЭ80-С215РаЬ-8ЕАт57, представленным на клетках Со1о205. Пролиферация: количество включенного 3Н-тимидина подсчитывали через 4 дня. Продуцирование 1Ь-2: Собирали надосадочную жидкость и определяли содержание 1Ь-2 через 4 дня.
Результаты (фигуры 5-6): Тройной слитый белок индуцировал активацию Т-клеток и продуцирование 1Ь-2, когда он присутствовал на клетках Со1о205. Подобной активности с С215РаЬ-8ЕАт23 не наблюдалось, что указывает на важность костимуляции с помощью СЭ80 для активации. Из-за более низкого сродства тройного слитого белка (в 50-100 раз ниже, чем для С215РаЬ-8ЕА, см. данные анализа РАС8), фактическое количество С215РаЬ-8ЕАт23, связанного с клетками, существенно выше, чем количество тройного слитого белка.
ПРИМЕР 2. 1Ь-2 по настоящему изобретению усиливает и продлевает действие РаЬ8ЕА на активацию Т-клеток и на лечение опухолей
Методы и материалы:
Конструирование плазмид, экспрессирующих 1Ь2. кДНК 1Ь2 клонировали с помощью ПЦР с обратной транскрипцией, используя мРНК, изолированную из мононуклеаров периферической крови человека (РВМ), которые были простимулированы суперантигеном 8ЕА в течение 24 ч. мРНК выделяли из 5х106 клеток, с помощью набора тКТА Эйес1 кй Оупа1, О§1о, в соответствии с инструкциями изготовителя. мРНК, отожженную до покрытых олиго (бТ)26 магнитных шариков, элюировали путем нагревания до 95°С. Вслед за этим с помощью ПЦР с обратной транскрипцией получали продукт ПЦР, обладающий преимуществами обратнотранскрип-тазной и ДНК-полимеразной активности Тас.|-полимеразы. 1/10 элюированной мРНК смешивали с ПЦР-праймерами 1Ь2-1 и 1Ь2-2 и проводили стандартную реакцию ПЦР (30 раундов). Продукт ПЦР подвергали электрофорезу в агарозном геле, полосу извлекали из геля и очищали с помощью набора Ргер-а29 депе к1! (Вю-Каф. После расщепления с помощью ЕсоК и ВатН1 фрагмент клонировали в рВЫезспр! К8 II, расщепленный с помощью ЕсоК1/ВатН1. Эту вставку секвенировали и подтверждали ее идентичность кДНК 1Б2, ранее описанной ТашдисЫ е! а1.(1983). Однако в результате ПЦР-реакции сегмент ДНК, кодирующий О1у-Рго-Агд-О1п-А1а-А8п-О1и-Ееи-Рго-О1уА1а-Рго-8ег-С1п-С1и-С1и-Агд (Последов. № 23) «О1у-Рго-0-линкер» - был добавлен в позиции 5' к сегменту, кодирующему зрелый человеческий 1Б-2. 0ЫЕ2 клонировали в плазмиду из собственной коллекции (разрезанную с помощью Кзг11-ХЬа1) в виде фрагмента КгИ-ИИеЕ Полученная плазмида рМ8306 направляет секрецию С215РаЬ8ЕА-О-ЫЕ2 в периплазму Е.сой. Линкеры между этими частями далее оптимизировали следующим образом. Кодирующую линкер область, которая кодирует последовательность Рго-А1а-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-А1а-С1у-С1у-Рго (Последов. № 19) (заменяющую исходную О1уО1у-Рго), встроили между суперантигеном и областями, кодирующими РаЬ-части, с помощью сайт-направленного мутагенеза. Подобным же образом, линкеры О1у-Рго-Агд-О1п-8ег-АзпО1и-Тйг-Рго-О1у-8ег-Рго-8ег-О1п-О1и-О1и-Агд (Последов. № 20), О1у-Рго-Агд-О1п-А1а-Еуз-ТйгЕеи-Рго-С1у-А1а-Рго-8ег-С1п-ТБг-ТБг-Агд (Последов. № 21) или О1у-Рго-Тйг-О1и-А1а-А8р-О1иЕеи-Ргр-О1у-А1а-Рго-8ег-О1и-О1и-О1и-Тйг (Последов. № 22) заменили оригинальный 0-линкер между 1Б-2 и РаЬ-частью. Для комбинаций двойных слитых белков сравнивали также конструкции с 1Б-2, слитым с тяжелой и легкой цепью, соответственно.
Праймеры:
Ш-1:
5' -ССС САТ ССС ССТ ССС ССТ САС ССТ ААС САА СТС ССА
ССА ССТ ССС ТСТ САС САА САС ССТ ССА ССТ АС ТТС
ААС ТТС ТАС ААА С-3' (ПОСЛЕДОВ. № 17)
Ш-2:
5’ -ССС ААТ ТСС СТА ССТ ТАТ САА СТТ АСТ СТТ САС АТС АТ-3' (ПОСЛЕДОВ. № 18)
Экспрессия слитых белков в ферментере. Слитые белки экспрессировали в Е.сой К-12, штамм и1 635 (ху1-7, ага-14, Т4К, йеНаотрТ), с помощью плазмиды с геном устойчивости к канамицину и 1асИУ5-промотором. Бактерии из замороженного образца инкубировали при 25°С примерно в течение 21 ч на встряхивателе, в колбах, содержащих, г/л: (ΝΗ4)28Ο4, 2,5;
КН2РО4, 4,45; К2НРО4, 11,85; цитрат натрия, 0,5; Мд8О4.7Н2О, 1; моногидрат глюкозы, 11, 0,11 мМ канамицина и 1 мг/л раствора микроэлементов (РогзЬегд е! а1., 1989), но без №2МоО4-2Н2О. Клетки выращивали до оптической плотности ОП600, равной 1-2, и 450 мл культуральной среды использовали для инокуляции ферментера (СБетар, Швейцария), доведя до окончательного объема в 5 л. Среда в ферментере содержала, г/л: (ИН4)28О4, 2,5; КН2РО4, 9; К2НРО4, 6; цит рат натрия; 0,5, моногидрат глюкозы, 22;
Мд8О4-7Н2О, 1; 0,11 мМ канамицина; 1 мл адеканола (АзаЫ Эепка Кодуо К.К., Япония) и 1 мг/л раствора микроэлементов. рН поддерживали на уровне 7,0, с помощью титрования 25%ным аммонием, температура составляла 25°С, а аэрацию осуществляли с помощью атмосферного воздуха, со скоростью 5 л/мин. Парциальное давление растворенного О2 доводили до 30% путем увеличения скорости перемешивания с 300 до 1000 оборот./мин во время периодической фазы культивирования и регулирования подачи 60% (по объему) глюкозы во время фазы дозирования. Образование продукта индуцировали при ОП600, равном 50, путем добавления 0,1 мМ изопропил-β-Ό-тиогалактопиранозида (1РТС). После ферментации клетки удаляли путем центрифугирования при 8000х§ в течение 40 мин при 4°С. Осветленную среду либо анализировали и осуществляли выделение сразу, либо хранили при -20°С.
Выделение слитых белков. ДНК, присутствующую в осветленной среде, удаляли из нее с помощью осаждения 0,19%-ным полиэтиленимином и 0,2М №С1 в течение 30 мин (А!ктзоп апй 1аск, 1973). После центрифугирования, как описано выше, собирали над-осадочную жидкость, а концентрацию №С1 доводили до 0,5М. Эту среду использовали для колонки с протеин С-сефарозой (РБагтас1а Вю!есБ АВ, Ирр8а1а, Швеция), уравновесив ее с помощью 10 мМ фосфата натрия, 150 мМ №С1 с рН 7,4 и с РВ8Т с 0,05%-ным содержанием Твина 80. Затем колонку дважды промывали РВ8Т в количестве 5 объемов колонки, и связанный белок элюировали 0,1М уксусной кислотой с 0,02% Твина при рН 3,2. рН образца доводили до 5,0 с помощью 1М ТГ18-НС1 с рН 8,0, а затем помещали в НР-колонку с 8Р-сефарозой (РБагтас1а Вю!есф, уравновешенную с помощью 50 мМ ацетата аммония, 0,02% Твина 80. Затем колонку промывали уравновешивающим буфером в количестве 2 объемов колонки, и слитый белок элюировали, используя линейный градиент от 50 до 500 мМ ацетата аммония, количество которого составляло свыше 10 объемов колонки. Для слитых белков С215БаЬ-Ш2 использовали рН 6,0, а для тройных слитых белков С215РаЬ8ЕА-Ш2 значение рН во время разделения составляло 5,7. Слитые белки фильтровали через фильтр 0,22 ит и хранили при -70°С. Если элюат был недостаточно концентрированным, его концентрировали до окончательной концентрации в 0,5-1 мг/мл с помощью устройства Сеп!псоп 30 (Аписон) в соответствии с инструкциями изготовителя.
Анализы на цитотоксичность. Анализы на цитотоксичность, зависимую и независимую от ГКГ класса II, проводили как описано ранее (ЭоЫ^еп е! а1., 1990). Вкратце, для анализов на зависимую от ГКГ класса II цитотоксичность меченные 51 Сг клетки Кар (по 2500 клеток на лунку в окончательном объеме в 200 мкл) смешивали с 8ЕА-зависимой линией эффекторных клеток, полученной путем инкубации РВМ человека в присутствии низких уровней рекомбинантного ЫЬ-2. Отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням (Е:Т) составляло 30:1. Для анализов на независимую от ГКГ класса II цитотоксичность меченные 51 Сг клетки С215* со1о205 (2500) инкубировали с 8ЕАзависимыми эффекторными клетками при соотношении Е:Т, составлявшем 45:1. Количество выделившегося в среду 51 Сг определяли после 4 ч инкубации с помощью сцинтилляционного счетчика.
Анализ костимуляции ΐη νΐΐΓθ на очищенных Т-клетках человека. Не подвергавшиеся воздействиям Т-клетки человека очищали в основном так, как описано в публикации Ьапбо е! а1. (1993). Вкратце, не подвергавшиеся воздействиям Т-клетки человека очищали от РВМ человеческой крови с помощью центрифугирования с градиентом фиколла, с последующим разделением на желатиновых колонках, и, наконец, путем пэннинга с негативной селекцией в чашках Петри, содержащих моноклональные антитела ΗΝΚ1 и НЬА-ЭК. Эксперименты по пролиферации с использованием не подвергавшихся воздействиям Т-клеток человека проводили в основном так, как описано в публикации Ьаибо е! а1. (1993). Вкратце, не подвергавшиеся воздействиям Т-клетки (по 100000 клеток на лунку) объединяли с облученными СНОтрансфектантами (по 10000 клеток на лунку) в общем объеме в 200 мкл среды КРМ1-1640, с добавками (Ьаибо е! а1., 1993). Для экспериментов со слитыми белками, содержащими 1Ь-2, клетки инкубировали в течение 7 суток в присутствии 1 нМ указанных веществ. В последний день эксперимента клетки метили 3Ηтимидином, чтобы измерить включение его в ДНК делящихся клеток.
Терапия опухолей В16-С215. Терапию проводили по существу так, как описано ранее (ЭойМсп е! а1., 1994; Напззоп е! а1., 1997). В нулевой день эксперимента мышам линии С57В1/6 внутривенно (в хвостовую вену) инъецировали 75000-150000 сингенных клеток меланомы В16Е10. Эти клетки В-16 экспрессировали человеческий антиген ОА-733, распознаваемый моноклональными антителами С215. В дни 1, 3 или 5 начинали лечение белками С215ЕаЬ. На 21-й день эксперимент закончили, и в этот день удалили легкие и подсчитали количество рассеянных опухолей легких.
Иммуногистохимические исследования проводили на легких животных, несущих опухоли В16-С215 18-го дня, по существу так, как описано ранее (ЭойМеп е! а1., 1995). Образцы брали через 4 ч после последней инъекции. Окрашенные области определяли вручную.
Иммунофармакологические исследования проводили по существу так, как описано в публикации КозепбаЫ е! а1. (1996). Селезенки мышей линии С57 В1/6, получивших от 1 до 3 инъекций, по одной в день, удаляли через 48 ч после последней инъекции и определяли 8ЕАзависимую цитотоксичность, используя Карклетки в качестве мишеней, в стандартном анализе выделения 51 Сг, как описано выше. Отношение Е:Т составляло 100:1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ:
Продуцирование и выделение 1Ь-2содержащих слитых белков.
Сконструировали вектор экспрессии Е.еоН, кодирующий тройной слитый белок С215ЕаЬ8ЕА-Р-ЫЬ2. Этот вектор кодирует две субъединицы тройного слитого белка на бицистронной мРНК, транскрибированной с промотора ЬаеиУ5. Каждой из этих субъединиц предшествует сигнальный пептид, направляющий экспорт к периплаз-матическому пространству Е.соИ. Первая субъединица представляет собой УН белка С215ЕаЬ, за которым следует линкер 01у-01у-Рго (УН-СН1-О1у-б1у-Рго-8ЕА). Другая субъединица представляет собой УК белка С242ЕаЬ, за которым следует СК белка С242ЕаЬ, который связан с 1Ь2 человека с помощью О1у-Рго-0-линкера (Ук-С’к-С1у-Рго-0Ы12). О1у-Рго-0-линкерная последовательность (Последов. № 23) представляет собой слегка модифицированную версию естественного линкера, найденного в белке ОтрК Е.сой (УооИоп е! а1., 1989). Более полную информацию см. в разделе «Материалы и методы». Получили также слитый белок С215ЕаЬ-Р-ЫЬ2. Он идентичен слитому белку С215ЕаЬ8ЕА-Р-ЫЬ2, за исключением того, что часть О1у-О1у-Рго-8ЕА из этого белка удалена. Соответствующую последовательность ДНК в векторе экспрессии также удалили. Мутантные производные слитого белка С215ЕаЬ8ЕА-Р-ЫЬ2 получили с помощью опосредованного реакцией ПЦР сайтнаправленного мутагенеза, с помощью стандартных способов, при этом получили ряд белков, таких как С215ЕаЬ8ЕАС227А-Р-ЫЬ2 и С215ЕаЬ8ЕАв227А-Р-ЫЬ2Р42А. В более поздних вариантах тройного слитого белка внутрисубъединичный цистеин заменили двумя остатками серина. Это изменение не повлияло на биологическую активность.
Плазмидами, кодирующими 1Ь2содержащие белки, трансформировали продуцирующий штамм Е.соИ ЦЕ635, а затем осуществили ферментацию. Слитые белки выделили из культуральной среды с помощью протеин Оаффинной хроматографии. Деградированные варианты слитых белков удалили с помощью ионообменной хроматографии. Полученные продукты представляли собой, по меньшей мере, на 90% полноразмерный слитый белок, что определили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (δΌδ-РАбЕ) (см. раздел «Материалы и методы»). С помощью оптимальной схемы получения слитого белка в ростовой среде получали до 130 мг/л слитого белка и, как правило, из 1 л среды получали 70 мг тройного слитого белка.
Функциональная характеризация 1Ь-2содержащих ТаЬ-слитых белков. Способность 1Ь2-содержащих слитых белков, таких как слитые белки С215ЕаЬ8ЕА-О-ЫБ2 и С215ЕаЬ-ОЫЕ2, индуцировать пролиферацию 1Ь-2зависимой линии СТЬЬ-2 клеток мышей была, по существу, такой же, как у рекомбинантного человеческого 1Ь2 на молярной основе (данные не показаны). Более того, связывание с антигеном и 8ЕА-активность С'.’215ЕаЬ8ЕА-О-111Е2 и С215ЕаЬ8ЕА оказались неразличимыми в ряде анализов, что подтверждает, что введение 1Ь2 в молекулу не оказывает отрицательного действия. Эти анализы включали исследование возможности индуцировать независимое от ГКГ класса II уничтожение клеточной линии со1о205 рака толстой кишки человека С215* с помощью 8ЕА-реактивной эффекторной клеточной линии Т-клеток, в анализе четырехчасового выделения 51 Сг. Зависимое от ГКГ класса II уничтожение Кар-клеток (клеток лимфомы крыс) ГКГ класса П+ 8ЕА-реактивными эффекторными Тклетками также происходило с подобной же эффективностью (данные не показаны). Более прямые доказательства безусловного связывания антигена С215 и ГКГ класса II получили с помощью ЕАС8-анализа. Установили, что степень зависимости от дозы связывания С215ЕаЬ8ЕА и С215ЕаЬ8ЕА-Р-ЫЬ2 с КаДклетками подобны между собой на молярной основе (данные не показаны). Установили также, что зависимое от дозы связывание С215ЕаЬ8ЕА-Р-ЫЬ2 и С215ЕаЬ-О-ЫЕ2 с клетками со1о205 подобно наблюдавшемуся для С215ЕаЬ8ЕА (данные не показаны), что указывает на то, что связывание с антигеном в 1Ь2содержащих слитых белках не вызывает сомнений.
ГЬ-2-зависимая пролиферация, индуцированная Га1)8ЕА. Для запуска оптимальной пролиферации и активации Т-клеток человека, покоящимся Т-клеткам требуются как сигнал 1, так и сигнал 2 (8е11\\аг1/, 1990). Суперантигены, если они присутствуют на клетке, могут доставить сигнал 1. При этом предполагают, что ГБ-2, будучи основным расположенным в прямом направлении считывания генетического кода эффектором сигнализации В7/СЭ28, подает сигнал 2.
В данном разделе авторы показывают с помощью покоящихся Т-клеток, выделенных из крови человека, что тройной слитый белок
С215ЕаЬ8ЕА-О-ЫБ2 или С215ЕаЬ8ЕА в комбинации с С215ЕаЬ-О-ЫБ2 или с рекомбинантным человеческим Ш2 действительно индуцирует пролиферацию Т-клеток ίη νίίτο (фиг. 7).
Покоящиеся Т-клетки человека инкубировали с 8ЕА по настоящему изобретению (С215ЕаЬ8ЕА или С215ЕаЬ8ЕА-Р-ЫЬ2) в присутствии Ш2 (в форме С215ЕаЬ-О-ЫБ2, С215ЕаЬ8ЕА-О-ЫБ2 или рекомбинантного человеческого Τ-2). 8ЕА был представлен на облученных клетках СНО, трансфецированных антигеном С215 (через ЕаЬ-часть), с ГКГ класса И/Эг. который связывает 8ЕА. Контролем служили нетрансфецированные СНО-клетки. После 7 суток инкубации Т-клеток с трансфектантами СНО и с упомянутыми выше веществами измеряли пролиферацию путем включения 3Нтимидина в ДНК.
С215ЕаЬ8ЕА-О-ЫБ2 индуцировал пролиферацию Т-клеток человека, когда он присутствовал на СНО-клетках, трансфецированных антигеном С215 человека (СНО-С215), против которых направлено действие ЕаЬ (фиг. 7). Подобным же образом пролиферация индуцировалась, когда белок присутствовал на СНО-Эт (ГКГ человека, класс II), в то время как в присутствии нетрансфецированных СНО-клеток (СНО) или в отсутствие СНО-клеток (К10) пролиферации не наблюдалось. С215ЕаЬ8ЕА или С215ЕаЬ-О-ЫЕ2 не индуцировали скольконибудь заметной пролиферации сами по себе, когда они присутствовали на СНО-клетках, что указывает на то, что как 8ЕА, так и [И-2 действительно необходимы для индукции пролиферации. Это было подтверждено тем, что комбинация С215ЕаЬ8ЕА и С215ЕаЬ-О-ЫБ2 или С215ЕаЬ8ЕА и рекомбинантного [И2 человека индуцировали эффект, качественно подобный эффекту, индуцируемому С215ЕаЬ8ЕА-О-ЫЕ2. Это также показывает, что в данном исследовании ΣΕ-2 является необходимым, но в отличие от 8ЕА, он не обязательно должен быть связанным с клеткой.
С215ЕаЬ8ЕА-О-ЫЬ2 так же, как и комбинация С215ТаЬ8ЕА и С215ТаЬ-О-ЫЬ2, вызывают усиленную и длительную активацию Т-клеток и улучшенную инфильтрацию опухолей ΐη νίνο. Как С215ЕаЬ-О-ЫБ2 + С215ЕаЬ8ЕА, так и С215ЕаЬ8ЕА-О-ЫБ2 гораздо более эффективно индуцировали активацию Тклеток, чем С215ЕаЬ8ЕА, что измерялось способностью индуцировать 8ЕА-зависимое уничтожение клеток-мишеней (фиг. 8). Вкратце, мыши получали от 1 до 3 инъекций указанных белков в сутки. Через 2 суток после последней инъекции у подвергавшихся лечению мышей извлекали селезенки и определяли цитотоксическую активность против Ка)|-клеток, покрытых 8ЕА, с помощью стандартного анализа, основанного на четырехчасовом выделении 51 Сг.
Как С215ЕаЬ8ЕА-Р-ЫЬ2, так и 215ЕаЬ8ЕА/
С215ЕаЬ-О-ЫЕ2 индуцировали не только повышенную, но и более длительную активацию Тклеток. Уровень содержания сывороточных цитокинов, таких как Тратта, содержание которого резко падало после четвертой инъекции
С215РаЬ8ЕА, оставалось на очень высоком уровне даже после четвертой инъекции С215РаЬ8ЕА-ОЫЬ2 (данные не показаны). Как правило, уровни содержания ГРЫдатта и ΤΝΡαΙρΙια были гораздо выше (до 10 раз), чем в случае С215РаЬ8ЕА.
Улучшенная терапия индуцированных опухолей В16-С215 при лечении с помощью комбинации С215РаЬ8ЕА и С215РаЬ-О-ЫЬ2.
Влияние 1Ь-2 на повышение эффективности РаЬ8ад-терапии опухолей исследовали на модели мышиной меланомы В16 (фиг. 9). В показанном примере 8-12-недельных самок мышей линии С57 В1/6 в нулевые сутки эксперимента инокулировали клетками В16 (150000 шт.), трансфецированными антигеном ОА-733 опухоли человека, против которого направлено антитело С215 (ниже называемыми В16-С215). Указанные вещества инъецировали на 5, 6 и 7 сутки. На каждую дату обработано по 7 животных. На 21 сутки животных умертвили и подсчитали количество пигментированных меланином опухолей В-16, колонизировавших легкие. В нескольких экспериментах показали, что комбинация С215РаЬ8ЕА и С215РаЬ-О-ЫЬ2 оказывает более высокий терапевтический эффект, чем С215РаЬ8ЕА, по сравнению с не получавшими лечения контрольными животными (фиг. 9). В указанном эксперименте комбинация С215РаЬ8ЕА/С215РаЬ-О-ЫЬ2 давала более высокий терапевтический эффект, чем тройной слитый белок С215РаЬ8ЕА-О-ЫЬ2.
Последующие иммунохимические исследования показали, что С215РаЬ8ЕА в отдельности или в комбинации С215РаЬ8ЕА и С215РаЬ0-ЫЬ2 приводил к образованию близких количеств СЭ4- и СЭ8-Т-клеток. инфильтрующих опухоль В16-С215. Однако интересно отметить, что количество СЭ25 (1Ь2К.а)-положительных клеток - хороший маркер активации Т-клеток резко увеличивалось между 3-ей и 4-ой инъекциями С215РаЬ8ЕА/С215РаЬ-О-ЫЬ2 (фигура 10). В противоположность этому, это количество уменьшалось в случае, если появлялись признаки того, что С215РаЬ8ЕА начинает вызывать толерантность. Таким образом, качество инфильтрующих Т-клеток, по-видимому, выше в случае комбинационного лечения, чем при применении одного только С215РаЬ8ЕА, что может служить объяснением улучшенного терапевтического эффекта. Подобным же образом, количество сывороточных цитокинов, таких как γинтерферон, продуцируемых вторично по отношению к активации Т-клеток, заметно уменьшалось после четвертой инъекции С215РаЬ8ЕА (фиг. 11). Однако при применении тройного слитого белка РаЬ8ЕА-О-ЫЬ2 содержание интерферона оставалось на высоком уровне даже после четвертой инъекции. Это наблюдение дает дополнительные доказательства того, что включение 1Ь-2 в конструкцию может противодействовать появлению толерантности Т-клеток, индуцируемых РаЬ-8ЕА.
Улучшенная терапия опухолей В16С215 с помощью С215РаЬ8ЕАП227А-О-ЫЬ2. Суперантигены гораздо более токсичны для человека, чем для мышей, в частности из-за того, что сродство к ГКГ класса II у человека значительно выше (Нап88оп е! а1., 1997). Поэтому вполне вероятно, что системная токсичность белков РаЬ8ЕА является главным ограничением для лечения человека.
Одним из способов усиления локальной активации в опухоли (РаЬ-зависимой) в противовес системной иммуноактивации (зависимой от 8ЕЛ-ГКГ класса II) является уменьшение сродства 8ЕА к ГКГ класса II. Основываясь на кристаллической структуре 8ЕА, авторы настоящего изобретения получили мутант С215РаЬ8ЕА, получивший название С215РаЬ8ЕАС227А, с уменьшенным в 100 раз сродством к ГКГ класса II. В отличие от дикого типа С215РаЬ8ЕА этот мутант не обладает свойством поперечно связываться с молекулами ГКГ класса II, что считают основной причиной опосредованной 8ЕА системной токсичности (Напзкоп е! а1., 1997).
Окно между эффективной терапией и токсичностью в первые сутки лечения опухолей В16-С215 у трансгенных мышей линии УЬ3 ТСК. было, по меньшей мере, в 50 раз шире для мутанта С215РаЬ8ЕАС227А по сравнению с С215РаЬ8ЕА (Нап^оп е! а1., 1997). В соответствии с этим наблюдением иммуногистохимически установили, что при дозах этих двух белков, приводящих к близким терапевтическим результатам, наблюдалась сравнимая иммуноактивация в опухоли, в то время как при применении С215РаЬ8ЕАС227А наблюдалась намного меньшая системная иммуноактивация в селезенке (Нап88оп е! а1., 1997). Кроме того, фармакокинетические исследования на кроликах показали резкое уменьшение связывания С215РаЬ8ЕАС227А с мишенями в селезенке и других лимфоидных органах, где расположено большинство клеток ГКГ класса II*, по сравнению с С215РаЬ8ЕА (данные не показаны).
Полагают, что для клинического использования тройной слитый белок РаЬ-ЗЕА-ШТ должен содержать мутированный суперантиген. Поэтому авторы настоящего изобретения получили тройной слитый белок С215РаЬ8ЕАС227А0-ЫТ2. Полученный белок был способен индуцировать пролиферацию покоящихся Т-клеток человека (данные не показаны) и индуцировал длительную активность 8ЕА-зависимых ЦТЛ у мышей в продолжение до 6 инъекций (фиг. 12). В противоположность этому фоновая активность ЦТЛ наблюдалась при применении С215РаЬ8ЕЛС227А (<10% - данные не показаны) и С215РаЬ-О-ЫЬ2 (<15% - данные не показаны). Терапия индуцированных опухолей В16-СА733 (3-и сутки) у нормальных мышей линии С57 В1/6, получивших по 8 инъекций этого белка, вводимых ежедневно, привела к таким же хо37 рошим терапевтическим результатам, как и при оптимальной дозе С215РаЬ8ЕА (фиг. 13). В этой системе С215РаЬ8ЕАС227А, который предназначен для получения максимальной активности у человека, а не у мышей, давал только очень невысокий эффект (фиг. 13). Однако при самых высоких дозах была отмечена некоторая токсичность С215РаЬ8ЕАС227А-Р-ЫЬ2. В противоположность этому несколько экспериментов по лечению указывают на то, что комбинация С215РаЬ8ЕАС227А и С215ЕаЬ-О-Ы С2 (8 инъекций) также ведет к существенно улучшенному терапевтическому эффекту на 3-и сутки для опухолей В16-СА733 у трансгенных мышей линии νΒ3 ТСН по сравнению с применением только одного С215РаЬ8ЕАС227А (данные не показаны). У трансгенных мышей линии νΒ3 ТСН >90% Т-клеток реагировали с 8ЕА по сравнению с 10-20% у нормальных мышей. Интересно отметить, что для кроликов повторные инъекции (до 8 инъекций) С215РаЬ8ЕАС227А-Р-ЫЬ2 (0 из 4 кроликов погибли после повторных инъекций в дозе 20 мкг/кг), по-видимому, не более токсичны, чем С215РаЬ8ЕАС227А без !И-2 (0 из 4 кроликов погибли после повторных инъекций в дозе 20 мкг/кг; 4 из 4 погибли при дозе 20 мкг/кг), и гораздо менее токсичны, чем С215РаЬ8ЕА (1 из 4 кроликов погиб после повторных инъекций в дозе 1 мкг/кг). В то же самое время длительная им-муноактивация (эффект повторного связывания лимфоцитов) наблюдалась только после лечения с помощью С215РаЬ8ЕАС227А-Р-ЫЬ2, но не с помощью С215РаЬ8ЕАС227 или С215РаЬ8ЕА, что указывает на то, что включение ГР-2 действительно помогает противодействовать индуцируемой РаЬ8ЕА толерантности Т-клеток (данные не показаны).
Терапия опухолей В16-С215 с помощью мутированных по 1Ь-2 белков С215ЕаЬ 8ЕАП227А-О-ЫЬ2. Более высокая токсичность, а в случае с С215РаЬ8ЕАС227А-Р-ЫЬ2 и более низкая терапевтическая эффективность тройных слитых белков, содержащих !И-2. может быть частично обусловлена «перенацеливанием» активности 8ЕА на лимфоидные ткани. Этот эффект перенацеливания приписывают высокому сродству Ш2 (Кб = 10 пМ) к его рецептору, который в основном находится на Т-клетках в селезенке и в других лимфоидных тканях. Чтобы изучить этот вопрос, авторы настоящего изобретения получили производные от С215РаЬ8ЕАС227А-р-ЫЬ2, в которых [Б-2-часть является мутированной, для того, чтобы уменьшить сродство к клеткам ^2^' и таким образом уменьшить системную активацию. В принципе, это такой же самый подход, какой был использован для улучшения терапевтического окна для белка С215РаЬ8ЕАС227А.
Взаимодействие между ^-2 и его высокоаффиным рецептором изучено очень хорошо.
Этот рецептор состоит из трех субъединиц: а, Ь и д. Для биологической активности требуется поперечное связывание Ь и д, а субъединица а необходима для оптимального связывания. Стратегия авторов изобретения состояла в том, чтобы уменьшить сродство ^-2 к его высокоафинному рецептору (аЬд) путем устранения связывания с а-субъединицей, а затем уменьшения, но не устранения, связывания с субъединицами Ь и д по мере необходимости.
Три таких мутанта белка
С215РаЬ8ЕАС227А-Р-ЫЬ2 создали с целью устранить связывание с ШКа (Р42А, Р42К) и, кроме того, чтобы ослабить связывание с ^2^6 (Р42А/Э208). Эти белки имеют в 100 раз (Р42А), в 1000 раз (Р42К) и в 3000 раз (Е42А/Э208) уменьшенную активность соответственно в отношении индукции пролиферации 1Ь-2-зависимой мышиной клеточной линии СТЬЬ-2. В настоящее время продолжаются эксперименты, направленные на более подробное изучение свойств этих белков, в частности, в отношении их сродства и интенсивности связывания с активированными Т-клетками человека и с рецептором Ш2. Первые эксперименты по терапии показывают, что такая стратегия является перспективной (фиг. 14, 15). В показанных примерах по 8 инъекций ввели трансгенным мышам линии Ш3-ТСК (где >90% Т-клеток были активированы 8ЕА), несущим 3-х суточные опухоли В16-СА733.
Хотя при самой высокой дозе все же наблюдалась некоторая токсичность при использовании С215РаЬ8ЕАС227А-Р-ЫЬ2Р42А или С215РаЬ8ЕАС227А-Р-ЫЬ2Р42К, она отмечалась позже (8-ая инъекция), чем при использовании С215РаЬ8ЕАС227А-Р-ЫЬ2 (6-ая инъекция), а лечение с использованием самой высокой дозы постоянно приводило к уменьшению опухолей более чем на 90% по сравнению с контрольными животными, получавшими РВ8 (физиологический раствор с фосфатным буфером) (фиг. 14). Авторы изобретения в настоящее время применяют этот многообещающий подход путем введения дополнительных мутаций в части 8ЕА и 1Ь2 для того, чтобы еще более улучшить окно между терапевтическими и токсичными дозировками.
Кроме того, в настоящее время проводится работа по созданию тройных слитых белков С215РаЬ8ЕА-Р-ЫЬ2, включающих мутацию ТНг51Рго в 1Ь-2-части (С1апд е! а1., 1996). Эта мутация может служить для блокировки опосредованной ^2« интернализации слитых белков без снижения биоактивности ^-2. Это представляется очень важным, поскольку при этом уменьшится удаление слитого белка этим путем и за счет этого увеличится локальная концентрация и эффективность лекарства. Белки с мутацией ТНг51Рго могут также содержать и другие мутации в частях 8ЕА и ^-2, которые уменьшают сродство к ГКГ класса II и к рецептору Ш2 соответственно.
ПРИМЕР 3. Эксперименты для подтверждения действия (8ад,1М)-конъюгатов. ΙΜ-рецептор-положительные клеткимишени или ГКГ класс 11-положительные клетки.
Молекула 8ад-ЙМ может связываться с клетками, экспрессирующими ГКГ класса II. таким образом способствуя 8ЭСС. И наоборот, клетки, экспрессирующие рецептор для ΓΜ, могут быть мишенями. Поэтому возможно, что молекула 8ад-ЙМ может быть полезной для индуцирования уничтожения нежелательных клеток, экспрессирующих рецептор для [Μ.
Тройной слитый белок С215ЕаЬ8ЕА-ЫЬ2 можно рассматривать как молекулу 8ад-ГМ. в случае, если ни эффектор, ни клетка-мишень не экспрессируют антиген, который С215ЕаЬ может распознать. Эффекторные клетки должны быть Т-клетками правого субтипа νβ. Клеткимишени могут быть, например, аберрантными кроветворными клетками, экспрессирующими рецептор ГБ-2, например, такими, которые имеются в некоторых лейкозах или лимфомах.
Эксперимент А: Доказательство концепции ш \л(го: Эффекторные Т-клетки (Т-клетки человека, неоднократно стимулированные 8ЕА) и клетки-мишени (например, «Ка_р» В-клетки лимфомы человека) инкубируют с тройным слитым белком С215ЕаЬ8ЕА4Б2, подвергнутым мутагенезу для уменьшения связывания с ГКГ класса I. Это стандартный набор для анализов на 8БСС (эффекторные Т-клетки, Кар-клетки, экспериментальное вещество). Авторы настоящего изобретения установили, что белок С215ГаЬ8ЕАС227АЫБ2 с резко уменьшенным сродством к ГКГ класса II имеет примерно в 10 раз более высокую эффективность уничтожения Кар-клеток, чем С215ЕаЬ8ЕА0227А. Очевидное объяснение этой повышенной эффективности состоит в том, что тройной слитый белок представлен на рецепторах КЭ. экспрессируемых на Ка_р-клетках.
Эксперимент В: Доказательство концепции ш νί\Ό. Модели лимфомы мышей (такие, как лимфома КВБ-5 мышей линии С57 В1/6) хорошо разработаны (Нод1ипб е! а1.. 1. Ехр. Меб. 168. 1469-1474). Связывание с мишенями рецептора Κ-2 или другого ^-К с белком 8ад4М в таких моделях может обеспечить доказательство концепции о связывании с мишенями ΣΜрецепторположитель-ных клеток ш νί\Ό.
Связывание с 8ад4М IΜ-К-положительных клеток осложняется тем фактом, что как эффекторные клетки, так и клетки-мишени часто экспрессируют рецептор для ЙМ. Тем не менее, в определенных обстоятельствах такой режим терапии может быть эффективным. Повидимому, имеют значение такие факторы, как плотность экспрессии ЙМ-К на клеткахмишенях, количество и расположение клетокмишеней и т. п. Следует также подчеркнуть, что, например, ЙБ2К а1рйа регулируется позитивно только в отношении активации Т-клеток, и, та ким образом, может существовать временное окно, во время которого ЙМ-К экспрессируется в высокой степени на клетках-мишенях, но не на эффекторных клетках.
Слитые белки 8ад-ЙМ, в которых 8ад используется вместо суперантигена дикого типа, который был подвергнут мутагенезу для уменьшения сродства с ГКГ класса II. могут также использоваться подобным образом.
ССЫЛКИ
Статьи, отмеченные знаком *. можно считать в большей степени относящимися к иммуномодуляторам, чем другие.
АЬгайткеп Б. е! а1. (1995) Сйагас1епха1юп оГ 1\то бйкбпс! МНС С1акк II Ьйпбйпд кйек т !йе кирегапйдеп к!арйу1ососса1 еп!ето!охт А. ЕМВО 1 14:2978-86.
АЬгайткеп е! а1. (1996) АО/9601650 (ра!еп! аррйсайоп). А соп)ида!е Ье!^ееп а тоббтеб киретапйдеп апб а йатде!-кеекйпд сотроипб апб !йе ике оГ !йе соп)ида!е.
Ап!опккоп Р. е! а1. (1996) 8!арйу1ососса1 еп!ето!охйп А апб Е сййтета \\йй гебисеб кегогеасймйу апб тейайпеб аЬШйу !о !агде! су!о!охйс Т се11к Гог ике ш !итог !йегару. АВКГ '96:
Вюто1еси1ат Тесйпйциек. Нойбау
Со1беп Са1е\\ау. 8ап Гтапсйксо. СайГогша. Магсй 30-Артб 2. 1996.
Ап!опккоп е! а1. (1996) 1. Iттиηο1.
158:4245-4251.
Ап!опккоп е! а1. (1997) АО 9736932 (ра!еп! арр1йса!юп)
Айкйпкоп е! а1. (1973) Вюсййт. Вюрйук. Асйа 308:41-52.
*ВатЬогоидй е! а1. (1994) 8!гис!иге 2:839 *Вескег е! а1. (1996) Егабйса!юп оГ Йитап Йерабс апб ри1топагу те1апота те!акйакек т 8СШ тйсе Ьу апбЬобу-т!ег1еикйп 2 йикюп рго!ешк. Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сй. И8А 93:2702-2707.
*Ве1Ггаде Тйекйк (1996) Асбмабоп оГ типпе су!о!охйс се11к \\йй т!ег1еикйп-2 апб !йе Ьас!епа1 киретапйдеп к1арйу1ососса1 еп!ето!охш А. Бшмегкйу оГ Бипб. 8\\ебеп (Аидикй/8ер!етЬет 1996).
*Ве1Ггаде е! а1. (1994) СотЬшеб асймабоп оГ типпе 1утрйосу!ек \\йй к!арйу1ососса1 еп!его!охш апб т!ет1еикт-2 геки1!к ш аббйайуе су!о!охйс асбмйу. Сапсег Iттипο1. Iттипο!йе^ 38:265-271).
*Ве1Ггаде е! а1. (1995) Епйапсеб апб рго1опдеб еГбсасу оГ кирегапбдеп-йпбисеб су!о!охйс Т-1утрйосу!е асбуйу Ьу Ш-2 т νί\Ό. Сапсег 611типо1. 41:87-94.
*Ве1Ггаде е! а1. (1997а) Ргемепйоп о Г кирегапбдеп тбисеб бо\\пгеди1а1юп оГ Т се11 тебйа!еб су!о!охйс асбмйу Ьу Ш-2 т νί\Ό. Iттипο1οду 90:183-188.
*Ве1Ггаде е! а1. (1997Ь) Ргемепбоп оГ кирегапбдеп тбисеб !о1егапсе т νί\Ό Ьу Ш-2 !геа!теп!.
8иЬтййеб 1996.
*Вегпб! е! а1. (1994) Вюсйетйкбу 33:6571.
Ве!1еу е! а1. (1988) Иис1ео!1бе 8ес.|иепсе оГ !Не !уре А 81арНу1ососса1 еп!его!ох1п депе.
1.Вас!егю1. 170:34-41.
Воуег е! а1. (1969) А сотр1етеп!а!юп апа1у818 оГ (Не геУпсНоп апб тобШсайоп оГ ΩΝΛ т ЕзсйепсЫа сой. I. Μο1. Вю1. 41:459-472.
В1апсо е! а1. (1990) ΜνιΡιπΡ оГ 8!арНу1ососса1 !ох1с 8Носк 8упбготе !охш 1: Μ^!οдешс^ίу апб гесодшйоп Ьу а пеи!га^тд топос1опа1 апбЬобу. Шес!. Iттип. 58 (1990) 3020-3028.
Саг188оп е! а1. (1985) Ктейс8 оГ !Ь-2 апб т!егкегоп-датта ргобисНоп, ехрге88юп оГ !Ь-2 гесер!ог8, апб се11 рго11Гега!юп т Нитап топопис1еаг се118 ехро8еб !о 81арНу1ососса1 еп!его!охш А. Се11. Iттиηο1. 96:175-183.
*СНеп е! а1. (1992) Со8!1ти1а!юп оГ ап!1!итог 1ттипНу Ьу !Не В7 соип!ег гесер!ог Гог !Не Т 1утрНосу!е то1еси1е8 СЭ28 апб СТЬА. Се11 71:1093-102.
*СНапд е! а1. (1996) А рот! ти!аНоп т Ш!ег1еикт-2 !На! а1!ег8 Ндапб т!ета^аНоп. I. Вю1. СНет. 271:13349-13355.
*СоШп8 е! а1. (1988) Ргос. Иа!1. Асаб. Зск ИЗА 85:7709.
ЭоН181еп е! а1. (1988) Т\уо 8иЬ8е!8 оГ Нитап репрНега1 Ь1ооб СЭ4+ Т Не1рег се118 бШеппд т 1Не сарасйу !о ргобисе !Ь-2 апб т!егГегоп-датта сап Ье беПпеб Ьу !Не Ьеи-18 апб топос1опа1 ап!1Ьоб1е8. Еиг. I. Iттипο1. 18:1173-1178.
ЭоН181еп е! а1. (1990) Iттипο1οду 71:96100.
ЭоН181еп Μ. е! а1. (1991) Μοпοс1οпа1 ап!1Ьобу-!агде!еб 8ирегапНдеп8: А бкГГегеп! с1а88 оГ апН-!итог адеп!8. Ргос. Иа!1 Асаб. Зск ИЗА 88:9287-9291.
ЭоН181еп е! а1. (1992) АО9201470 (ра!еп! аррйсабоп). Тагде! 8ресШс апНЬобу -8ирегапбдеп соп)ида!е8 апб 1Не1г ргерагабоп.
ЭоН181еп Μ. е! а1. (1994) Μοпοс1οпа1 ап!1Ьобу-8ирегапбдеп Ги81оп рго!еш8: Титог 8ресШс адеп!8 Гог Т се11 Ьа8еб !итог !Негару. Ргос. Иа!1. Зск. ИЗА 91:8945-8949.
ЭоН181еп е! а1. (1995) Ргос. Иа!1. Асаб. Зск и.З.А. 92:9791-9795.
*Эо\у е! а1. (1996) АО9636366 (ра!еп! аррйсабоп) СотЬтеб депе !Негару \уНН !Не депе Гог а 8ирегапбдеп апб !Не депе Гог а су!окте ог сНетокте.
*Ре11 е! а1. ЕР 439095 (ра!еп! аррйсабоп).
Иеигу З. е! а1. (1991) Μиίаί^οпа1 апа1у818 оГ !Не т!егасНоп Ье!^ееп СЭ4 апб с1а88 II ΜΗΟ с1а88 II ап!1деп8. Се11 66:1037-49.
Рог8Ьегд 6. е! а1. (1989) ВтРас!ог8, 2, 105112.
Нап88оп I. е! а1. (1997) Ргос. Иа!1. Асаб.
Зск-И.З.А. 94 (т рге88).
Ка11апб е! а1. (1991) АО 9104053 (ра!еп!
аррйсабоп). РНагтасеийса1 сотро8Йтп !На!
таке8 се118 ехрге88тд ΜΗΓ С1а88 II апНдеп8 !агде!8 Гог су!о!ох1с се118.
Карр1ег 1А е! а1. (1992) Μη^ΐώ^ бейтпд ГипсНопа1 гедтп8 оГ !Не 8ирегапНдеп 81арНу1ососса1 еп!его!охт В. I. Ехр. Μеб. 175:387-396.
Карр1ег е! а1. (1993) АО9314634 (ра!еп! аррНсаНоп).
Рго!ес!ке еГГес!8 оГ ти!а!еб 8ирегапбдеп8.
Корт ВЬ е! а1. (1993) Зирегапбдеп8 апб 1Не1г ро!епба1 го1е т Нитап б18еа8е. Абν. Iттипо1. 54:99-166.
ЬатрНеаг 1С е! а1. (1996) Ве81бие8 пеаг !Не атто апб сагЬоху !егт1ш оГ 81арНу1ососса1 еп!его!охт Е тберепбеп!1у теб1а!е ТСК-νβ 8ресШс т!егас!юп8. I. Iттипο1. 156: 2178-2185 (ΜηγΛ 15, 1996) *Ьапбо РА е! а1 (1993) Со-8Йти1аНоп \уНН В7 апб !агде!еб 8ирегап!1деп 18 гес.|тгеб Гог ΜΗί’ с1а88 П-тберепбеп! Т-се11 ргоНкегаНоп Ьи! по! су!о!ох1сНу. Iттипο1οду 80: 236-241.
*Ьапбо е! а1. (1996) Веди1а!юп оГ 8ирегапНдеп-тбисеб Т се11 ас!ка!юп т !Не аЬ8епсе апб !Не рге8епсе оГ ΜНС с1а88 II. I. Iттипο1. 157:28572863.
ЬтбНо1т е! а1. (1993) 9301302 (ра!еп! арр11са!юп). Титог, сагЬоНубга!е апНдеп 8рес1Пс топос1опа1 ап!1Ьобу апб се11 1те.
Ие\уе1 е! а1. (1991) Ш νί\Ό Т-се11 асЖа!юп Ьу 8!арНу1ососса1 еп!его!охт В рге\геп18 ои!дго^!Н оГ а таНдпап! !итог. Ргос. Иа!1. Асаб. Зск ИЗА 88:1074-1078.
ОсН1 е! а1. (1993) I. Iттипο1. 151:31803186.
*Рапсоок е! а1 (1996) ЕгабкаНоп оГ е81аЬ118Неб НераНс Нитап пеигоЬ1а8!ота те!а81а8е8 т тке \уНН 8е\геге сотЬтеб пптипобеПс1епсу Ьу ап!1Ьобу !агде!еб т!ег1еикт-2. Сапсег Iттипο1. IттипοίНе^. 42:88-92.
*Рои1е!!у (1993) ЕР 510949 (ра!еп! аррНса!юп) Тагде!еб су!о1у818.
*Во8епЬ1ит е! а1. ЕР 396387 (ра!еп! аррНсаНоп).
*Во8епбаН1 е! а1. (1996) Ш!. I. Сапсег 68, 109-113.
Запдег е! а1. (1977) ЭИА 8ес.|иепстд ^НН сНат-!егтта!тд 1пН1ЬНог8. Ргос. Иа!1. Асаб. Зск ИЗА 74: 5463-5467, 1977.
ЗатЬгоок е! а1. (1989) Μο1еси1а^ С1ошпд, А 1аЬога!огу тапиа1, 2пб еб. Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬога!огу Рге88.
*ЗсН\уагР (1990) Зс1епсе 248:1349-1356.
З!ет е! а1 (1989) АО/8907947 (ра!еп! аррНсаНоп). Ипргсл'етепР ге1аНпд !о ап!1деп8.
Зипб81гот е! а1. (1996) I. Вю1. СНет. 271:32212-32216.
*ТашдисН1 е! а1. (1983) З!гис!иге апб ехрге881оп оГ а с1опеб сЭИА Гог Нитап [п1ег1еикт-2. книге 302:305-310.
*Тегтап е! а1. (1991) АО/9110680 (ра!еп!
аррНсаНоп). Титог к1Шпд еГГес!8 оГ еп!его!охт8 апб ге1а!еб сотроипб8.
*Тегтап е! а1. (1993) АО/9324136 (ра!еп!
аррНсаНоп). Титог к1Шпд еГГес!8 оГ еп!его!охт8 апб ге1а!еб сотроипб8.
\Уооб\уог1й (1993) Ргесйп1са1 апб Сйп1са1 беуе1ортеп! оГ Су!окте !охт§ рге§еп!еб а! !йе сопГегепсе Мо1еси1аг арргоасйез !о сапсег 1ттипо!йегару, АзйуШе, Ыойй Сагойпа, ЫоуетЬег 7-11, 1993.
ХУооИоп е! а1. (1989) Рго!. Епд. 2:535-543. ф/игам8к1 е! а1. (1993) ЕМВО 1. 12:5113.

Claims (35)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ инактивации клеток-мишеней в присутствии Т-клеток, включающий контактирование клеток мишеней и Т-клеток с суперантигеном в присутствии иммуномодулятора, когда, по меньшей мере, один из элементов - суперантиген или иммуномодулятор - конъюгирован с нацеливающим компонентом, причем нацеливающий компонент выбран из группы, состоящей из антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела, Рай-фрагмента антитела, Рай2-фрагмента антитела или одноцепочечного антитела, а указанный суперантиген модифицирован, таким образом, чтобы он имел уменьшенную способность к связыванию с антигеном ГКГ класса II и уменьшенную серологическую реактивность и иммуногенность в сыворотке крови человека по сравнению с соответствующим суперантигеном дикого вида, и указанный иммуномодулятор выбирают из группы, содержащей цитокины, хемокины и внеклеточные части связанных с поверхностью лимфоцита рецепторов и лигандов.
  2. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что суперантиген и иммуномодулятор оба конъюгированы с одним и тем же компонентом мишени в форме тройного конъюгата.
  3. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конъюгированы только суперантиген и нацеливающий компонент, в то время как иммуномодулятор не конъюгирован.
  4. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетки-мишени инактивируют 1п у1уо в индивидууме, страдающем заболеванием, ассоциированным с клетками-мишенями.
  5. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что заболеванием является рак.
  6. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что суперантиген представляет собой химеру, содержащую последовательность, производную из двух или более суперантигенов дикого вида.
  7. 7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что иммуномодулятор представляет собой 1Ь-2.
  8. 8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что иммуномодулятор представляет собой внеклеточную часть молекулы В7.
  9. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что внеклеточную часть молекулы В7 выбирают из группы, содержащей СЭ80 и СЭ86.
  10. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что иммуномодулятор модифицирован с целью уменьшения сродства рецепторов лимфоцитов по сравнению со сродством соответствующей нативной формы.
  11. 11. Конъюгат суперантигена, имеющий формулу (Т)х(8ад)у(1М)/, где у>0 и ζ>0;
    Т представляет собой нацеливающий компонент, выбран из группы, состоящей из антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела, РаЬ-фрагмента антитела, Рай2-фрагмента антитела или одноцепочечного антитела,
    8ад представляет собой суперантиген, который модифицирован таким образом, чтобы он имел уменьшенную способность к связыванию с антигеном ГКГ класса II и уменьшенную серологическую реактивность и иммуногенность в сыворотке крови человека по сравнению с соответствующим суперантигеном дикого вида,
    1М представляет собой иммуномодулятор, выбранный из группы, содержащей цитокины, хемокины и внеклеточные части связанных с поверхностью лимфоцита рецепторов и лигандов.
  12. 12. Конъюгат суперантигена по п. 11, где 1 0>х>0, 1 0>у>1 и 1 0>ζ>1.
  13. 13. Конъюгат суперантигена по п. 12, где х, у и ζ представляют собой целые числа 1-3.
  14. 14. Конъюгат суперантигена по п.11, где Т содержит, по крайней мере, Т' и Т, суперантиген слит С-концом с Т', а иммуномодулятор слит С-концом с Т.
  15. 15. Конъюгат суперантигена по п. 11, где суперантиген представляет собой химеру, содержащую последовательность, производную из двух или более суперантигенов дикого вида.
  16. 16. Конъюгат суперантигена по п. 11, где иммуномодулятор представляет собой 1Ь-6.
  17. 17. Конъюгат суперантигена по п. 11, где иммуномодулятор представляет собой внеклеточную часть молекулы В7.
  18. 18. Конъюгат суперантигена по п. 17, где внеклеточная часть молекулы В7 выбирают из группы, содержащей СЭ80 и СЭ86.
  19. 19. Конъюгат суперантигена по п. 11, где иммуномодулятор модифицирован с целью уменьшения сродства рецепторов лимфоцитов по сравнению со сродством соответствующей нативной формы.
  20. 20. Конъюгат суперантигена по п.14, где суперантиген представляет собой стафилококковый энтеротоксин Л, Т' является Сн1 доменом С215 РаЬ, Т является легкой цепью антитела С215, а иммуномодулятор представляет собой Ш-2.
  21. 21. Конъюгат суперантигена по п.14, где суперантиген слит с Т' с помощью гибкого гидрофильного аминокислотного линкера В из 3-11 аминокислотных остатков, а иммуномодулятор слит с Т через гидрофильный нейтральный или положительно заряженный аминокислотный линкер О из 10-20 аминокислотных остатков.
  22. 22. Конъюгат суперантигена по п.21, где В выбирают из группы, состоящей из С1у-С1у-Рго и Рго-А1а-8ег-61у-61у-61у-61у-А1а-61у-61у-Рго (8ЕО ΙΌ N 19), а О выбирают из группы, состоящей из 61у-Рго-Агд-61п-А1а-А8п-61и-ЬеиРго-61у-А1а-Рго-8ег-61п-61и-61и-Агд (8ЕО ΙΌ N 23), С1у-Рго-Лг§-С1п-8ег-А5п-С1и-ТНг-Рго-С1у8ег-Рго-8ег-61п-61и-61и-Агд (8ЕО ΙΌ N 20), 61уРго-Агд-61п-А1а-Еу8-Ткг-Ееи-Рго-61у-А1а-Рго8ег-61п-Ткг-Ткг-Агд (8ЕО ΙΌ N 21) и С1у-РгоТ11^-С1и-Л1а-Л5ρ-С1и-^еи-Р^о-С1у-Л1а-Р^о-8е^61и-61и-61и-Ткг (8ЕО ΙΌ N 22).
  23. 23. Конъюгат суперантигена по п.11, где х=0, у=1-3, а ζ=1-3.
  24. 24. Молекула ДНК, кодирующая суперантиген и иммуномодулятор не являющийся суперантигеном, которая находится в форме бицистронной конструкции, в которой первый цистрон содержит последовательность, кодирующую суперантиген, модифицированный таким образом, чтобы он имел уменьшенную способность к связыванию с антигеном ГКГ класса II и уменьшенную серологическую реактивность и иммуногенность в сыворотке крови человека по сравнению с соответствующим суперантигеном дикого вида, и второй цистрон содержит последовательность, кодирующую иммуномодулятор, выбранный из группы, содержащей цитокины, хемокины и внеклеточные части связанных с поверхностью лимфоцита рецепторов и лигандов.
  25. 25. Молекула ДНК по п.24, где иммуномодулятором является 1Ь-2.
  26. 26. Молекула ДНК по п.24, где указанный кодируемый иммуномодулятор представляет собой внеклеточную часть молекулы В7, выбранную из группы состоящей из СЭ80 и СЭ86.
  27. 27. Молекула ДНК, кодирующая суперантиген модифицированный таким образом, чтобы он имел уменьшенную способность к связыванию с антигеном ГКГ класса II и уменьшенную серологическую реактивность и иммуногенность в сыворотке крови человека по сравнению с соответствующим суперантигеном дикого вида; иммуномодулятор, выбранный из группы, содержащей цитокины, хемокины и внеклеточные части связанных с поверхностью лимфоцита рецепторов и лигандов, нацеливающий компонент, выбранный из группы, состоящей из антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела, РаЬ-фрагмента антитела, РаЬ2-фрагмента антитела или одноцепочечного антитела.
  28. 28. Молекула ДНК по п.27, где иммуномодулятор является 1Ь-2.
  29. 29. Молекула ДНК по п.27, где иммуномодулятор представляет собой внеклеточную часть молекулы В7 и выбран из группы, содержащей ΟΌ80 и СО86.
  30. 30. Фармацевтическая композиция для инактивации клеток-мишеней, содержащая суперантиген, иммуномодулятор и нацеливающий компонент, где, по меньшей мере, один из элементов - суперантиген или иммуномодулятор конъюгирован с нацеливающим компонентом, причем указанный нацеливающий компонент выбран из группы, состоящей из антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела, РаЬфрагмента антитела, РаЬ2-фрагмента антитела или одноцепочечного антитела, а указанный суперантиген модифицирован таким образом, чтобы он имел уменьшенную способность к связыванию с антигеном ГКГ класса II и уменьшенную серологическую реактивность и иммуногенность в сыворотке крови человека по сравнению с соответствующим суперантигеном дикого вида, и указанный иммуномодулятор выбирают из группы, содержащей цитокины, хемокины и внеклеточные части связанных с поверхностью лимфоцита рецепторов и лигандов, причем указанная композиция взята в эффективном количестве.
  31. 31. Фармацевтическая композиция по п.30, в которой суперантиген представляет собой химеру, содержащую последовательность, производную из двух или более суперантигенов дикого вида.
  32. 32. Фармацевтическая композиция по п.30, в которой иммуномодулятором является 1Ь-2.
  33. 33. Фармацевтическая композиция по п.30, в которой иммуномодулятор представляет собой внеклеточную часть молекулы В7.
  34. 34. Фармацевтическая композиция по п.33, в которой внеклеточная часть молекулы В7 выбрана из группы, содержащей СЭ80 и СЭ86.
  35. 35. Фармацевтическая композиция по п.30, в которой иммуномодулятор модифицирован таким образом, чтобы уменьшить сродство рецепторов лимфоцитов по сравнению со сродством соответствующей нативной формы.
EA200000144A 1997-07-21 1998-07-02 Способы инактивации клеток-мишеней, агенты и композиции, вызывающие цитолиз, и соединения, используемые для получения этих агентов EA002688B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5321197P 1997-07-21 1997-07-21
SE9704170A SE9704170D0 (sv) 1997-11-14 1997-11-14 Directed cytolysis of target cells, agents and compositions causing cytolysis, and compounds that can be used to produce the agents
PCT/EP1998/004219 WO1999004820A2 (en) 1997-07-21 1998-07-02 Cytolysis of target cells by superantigen conjugates inducing t-cell activation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200000144A1 EA200000144A1 (ru) 2000-08-28
EA002688B1 true EA002688B1 (ru) 2002-08-29

Family

ID=26663128

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200000144A EA002688B1 (ru) 1997-07-21 1998-07-02 Способы инактивации клеток-мишеней, агенты и композиции, вызывающие цитолиз, и соединения, используемые для получения этих агентов

Country Status (19)

Country Link
US (2) US6962694B1 (ru)
EP (1) EP0998305B1 (ru)
JP (1) JP2001510687A (ru)
KR (1) KR20010022075A (ru)
CN (1) CN1275085A (ru)
AR (1) AR013230A1 (ru)
AT (1) ATE361102T1 (ru)
AU (1) AU748097B2 (ru)
BR (1) BR9815493A (ru)
CA (1) CA2296798A1 (ru)
DE (1) DE69837706T2 (ru)
EA (1) EA002688B1 (ru)
ES (1) ES2284209T3 (ru)
ID (1) ID24097A (ru)
IL (1) IL133883A0 (ru)
NO (1) NO20000265L (ru)
NZ (1) NZ502745A (ru)
PL (1) PL338338A1 (ru)
WO (1) WO1999004820A2 (ru)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010023288A1 (en) 1999-07-07 2001-09-20 Wilbur D. Scott Trifunctional reagent for conjugation to a biomolecule
WO2000002050A1 (en) * 1998-07-07 2000-01-13 Department Of Radiation Oncology, University Of Washington Trifunctional reagent for conjugation to a biomolecule
SE0102327D0 (sv) * 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy
SE0402025D0 (sv) * 2004-08-13 2004-08-13 Active Biotech Ab Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
US7885841B2 (en) * 2006-01-05 2011-02-08 Oracle International Corporation Audit planning
DE102007004855B4 (de) * 2007-01-31 2014-03-27 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Vorrichtung und Verfahren zur Deposition von biologischem Material in einem Zielsubstrat
US8748371B2 (en) 2007-02-28 2014-06-10 Yeda Research And Development Co. Ltd. Nuclear targeting sequences
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US20120237975A1 (en) 2010-10-01 2012-09-20 Jason Schrum Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
EP3626739A1 (en) * 2011-06-24 2020-03-25 Stephen D. Gillies Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP4015005A1 (en) 2011-10-03 2022-06-22 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
SG11201402666WA (en) 2011-12-16 2014-10-30 Moderna Therapeutics Inc Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243955B2 (en) 2012-04-02 2018-02-22 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
PT2922554T (pt) 2012-11-26 2022-06-28 Modernatx Inc Arn modificado nas porções terminais
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
ES2717446T3 (es) 2013-09-17 2019-06-21 Yeda Res & Dev Péptidos derivados de ERK y usos de los mismos
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CN105980401A (zh) 2013-10-03 2016-09-28 现代治疗公司 编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸
CA3010678A1 (en) 2016-01-10 2017-07-20 Neotx Therapeutics Ltd. Methods and compositions for enhancing the potency of superantigen mediated cancer immunotherapy
WO2018067461A1 (en) * 2016-10-05 2018-04-12 The Regents Of The University Of California Viral disk assemblies and methods of use thereof
JP7554742B2 (ja) * 2018-07-03 2024-09-20 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｔｃｒ抗体分子およびその使用
WO2020230142A1 (en) 2019-05-15 2020-11-19 Neotx Therapeutics Ltd. Cancer treatment
JP2023517011A (ja) 2020-03-05 2023-04-21 ネオティーエックス セラピューティクス リミテッド 免疫細胞を用いて癌を治療するための方法および組成物

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993024136A1 (en) * 1991-01-17 1993-12-09 Terman David S Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
US5545716A (en) * 1992-09-08 1996-08-13 University Of Florida Superantigen agonist and antagonist peptides
US5635599A (en) * 1994-04-08 1997-06-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Fusion proteins comprising circularly permuted ligands
IL113484A0 (en) * 1994-04-28 1995-07-31 Immunex Corp Viral proteins pharmaceutical compositions containing them their preparation and use
SE9402430L (sv) * 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
US5541087A (en) * 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US5716623A (en) * 1994-12-07 1998-02-10 Immunex Corporation Isolated Herpesvirus saimiri proteins that bind MHC Class II molecules
US5935568A (en) * 1995-05-18 1999-08-10 National Jewish Medical & Research Center Gene therapy for effector cell regulation
US5705151A (en) * 1995-05-18 1998-01-06 National Jewish Center For Immunology & Respiratory Medicine Gene therapy for T cell regulation
SE9601245D0 (sv) * 1996-03-29 1996-03-29 Pharmacia Ab Chimeric superantigens and their use
TW517061B (en) * 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
US6340461B1 (en) * 1996-12-17 2002-01-22 David Stephen Terman Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases
US6075119A (en) * 1997-04-07 2000-06-13 The Rockefeller University Peptides useful for reducing symptoms of toxic shock syndrome
SE0102327D0 (sv) * 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy

Also Published As

Publication number Publication date
NO20000265D0 (no) 2000-01-19
EA200000144A1 (ru) 2000-08-28
ES2284209T3 (es) 2007-11-01
WO1999004820A2 (en) 1999-02-04
KR20010022075A (ko) 2001-03-15
EP0998305A2 (en) 2000-05-10
US6962694B1 (en) 2005-11-08
CA2296798A1 (en) 1999-02-04
EP0998305B1 (en) 2007-05-02
AU8441598A (en) 1999-02-16
DE69837706D1 (de) 2007-06-14
ATE361102T1 (de) 2007-05-15
AR013230A1 (es) 2000-12-13
IL133883A0 (en) 2001-04-30
US20050226885A1 (en) 2005-10-13
PL338338A1 (en) 2000-10-23
ID24097A (id) 2000-07-06
DE69837706T2 (de) 2008-01-10
AU748097B2 (en) 2002-05-30
NZ502745A (en) 2003-02-28
CN1275085A (zh) 2000-11-29
BR9815493A (pt) 2000-10-31
NO20000265L (no) 2000-03-15
WO1999004820A3 (en) 1999-08-12
JP2001510687A (ja) 2001-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA002688B1 (ru) Способы инактивации клеток-мишеней, агенты и композиции, вызывающие цитолиз, и соединения, используемые для получения этих агентов
EP0754192B1 (en) Circularly permuted ligands and circularly permuted chimeric molecules
US5602095A (en) Recombinant pseudomonas exotoxin with increased activity
EP0261671B1 (en) Recombinant pseudomonas exotoxin: construction of an active immunotoxin with low side effects
Chen et al. Potent antitumour activity of a new class of tumour-specific killer cells
CA2095836C (en) Cytokine immunoconjugates
EP0835266B1 (en) Modified/chimeric superantigens and their use
RU2129018C1 (ru) Иммуноконьюгат, способ получения иммуноконьюгата и фармацевтическая композиция
AU702184B2 (en) Immunoconjugates II
JP2017503498A (ja) Ｉｌ−１５ヘテロ二量体タンパク質及びその用途
WO1996010089A1 (fr) Modification d&#39;un peptide et d&#39;une proteine
JP2012036216A (ja) 病理学的病変における脈管形成の処理のための組成物及び方法
EP1499730B1 (en) Immunoconjugates for the treatment of tumours
AU2005203173A1 (en) Super-antigen fusion proteins and the use thereof
Mousavi et al. In vivo tumor therapy with novel immunotoxin containing programmed cell death protein-1 and diphtheria toxin
ES2241268T3 (es) Onconasa recombinante y proteinas de fusion de onconasa recombinante.
MXPA00000643A (en) Directed cytolysis of target cells, agents and compositions causing cytolysis, and compounds that can be used to produce the agents
Courtenay-Luck et al. Immunotherapeutic Antibody Fusion Proteins
WO2008025990A1 (en) Biological materials and uses thereof
IE84490B1 (en) Recombinant pseudomonas exotoxin: construction of an active immunotoxin with low side effects

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU