ES2241268T3 - Onconasa recombinante y proteinas de fusion de onconasa recombinante. - Google Patents

Abstract

Proteína de fusión expresada por recombinación que comprende una molécula que presenta la secuencia de ARNasa procedente de Rana pipiens fusionada con el extremo amino- terminal de la cadena ligera de un fragmento de anticuerpo de una cadena (scFv), en la que dicha molécula de ARNasa presenta piroglutamato como residuo N- terminal y dicho scFv es un LL2 scFv.

Description

Onconasa recombinante y proteínas de fusión de onconasa recombinante.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a moléculas de onconasa producidas por recombinación y a proteínas de fusión que las contienen.

La onconasa es una ribonucleasa de no mamífero (ARNasa) con un peso molecular de 12.000 que se purifica a partir de oocitos y embriones tempranos de Rana pipiens. La onconasa causa una inhibición potente de la síntesis proteica en el lisado de reticulocitos de conejo (IC_{50} 10^{-11} M) y cuando es microinyectada en oocitos de Xenopus (IC_{50} 10^{-10} M). Al contrario que otros miembros de la superfamilia de la ARNasa A, la onconasa no degrada el ARNr de los oocitos. Al unirse a los receptores celulares de superficie de células sensibles y ser internalizada en el citosol, la onconasa causa la muerte celular como resultado de la potente inhibición de la síntesis proteica mediante un mecanismo que implica la inactivación del ARN celular. La onconasa no es inhibida por el inhibidor placentario de la ribonucleasa de mamífero y esto podría explicar la mayor citotoxicidad de la onconasa en comparación con los enzimas de mamífero.

Los estudios de toxicología animal muestran que la onconasa muestra una toxicidad predecible, dosis-dependiente y reversible en ratas (intervalo de dosis comprendido entre 0,01 y 0,02 mg/kg) y en perros (entre 0,005 y 0,15 mg/kg). Los ratones inoculados con carcinoma pulmonar de Madison M109 agresivo y tratados bajo un programa diario y semanal de onconasa de administración intraperitoneal mostraron una supervivencia significativamente prolongada. Los resultados más sorprendentes se observaron en un grupo de ratones tratados en un programa semanal de onconasa en el que seis de entre dieciocho animales sobrevivieron a largo plazo y aparentemente fueron curados del cáncer.

Se ha demostrado en pruebas clínicas que la onconasa presenta actividad antitumoral frente a una diversidad de tumores sólidos. En este contexto se ha utilizado tanto sola como en combinación con otros agentes antitumorales, tales como el tamoxifeno, por ejemplo, en el tratamiento de pacientes con cáncer de páncreas. Al utilizarlo como agente antitumoral, la onconasa puede conjugarse con un marcador que lo dirige a un tipo celular específico.

En un estudio de fase I, unos pacientes que sufrían de una diversidad de tumores resistentes y recidivantes fueron tratados intravenosamente con onconasa. Una dosis de onconasa comprendida entre 60 y 690 g/m^{2} resultó en los posibles efectos secundarios de mialgias con crisis de rubor, mareos pasajeros y reducción del apetito en general. Las toxicidades observadas, incluyendo la toxicidad renal limitante de dosis manifestada por una proteinuria incrementada, edema periférico, azotemia, eliminación reducida de creatinina, así como fatiga, eran dosis-dependientes y reversibles, lo que está de acuerdo con los estudios de toxicología animal. No resultó evidente ninguna manifestación clínica de una sensibilización inmunológica verdadera, incluso tras dosis repetidas intravenosas semanales de onconasa. Se determinó la dosis máxima tolerada, principalmente debida a la toxicidad renal, en 960 \mug/m^{2}. También se observaron algunas respuestas objetivas en carcinomas de células no pequeñas pulmonares, esofágicos y colorrectales. Sin embargo, la onconasa es bien tolerada en animales y la mayoría de los pacientes humanos sometidos a ensayo demostraron un patrón de toxicidad clínica consistente y reversible y no indujo la mayor parte de las toxicidades asociadas con la mayoría de los agentes quimioterapéuticos, tales como la mielosupresión y la alopecia.

Así, la onconasa presenta muchas características deseables, incluyendo su pequeño tamaño, origen animal y efectos antitumorales in vitro e in vivo. Es bien tolerada y refractaria a los inhibidores de la ARNasa humana. Sin embargo, la onconasa purificada a partir de oocitos de Rana pipiens presenta propiedades no deseables. El hecho de que se obtiene a partir de una fuente natural hace todavía más difícil y caro obtener cantidades suficientes. Debido a que no se deriva del hombre, o incluso de mamíferos, típicamente estimula respuestas inmunológicas no deseables en el hombre. De acuerdo con lo anterior, sería ventajoso producir por recombinación onconasa nativa que conserve las propiedades citotóxicas de la onconasa que se purifica a partir de oocitos de Rana pipiens pero que no induzca las respuestas inmunológicas no deseables en el hombre.

Los intentos para producir onconasa nativa en E. coli mediante metodología de ADN recombinante han fracasado. La onconasa presenta un residuo piroglutamilo N-terminal que resulta necesario para el plegamiento correcto de la molécula. Este residuo forma parte del bolsillo de unión del fosfato en la onconasa y es esencial para su actividad ARNasa y antitumoral. El codón de inicio en E. coli inserta N-formil-metionina en los péptidos como residuo aminoácido N-terminal. Por lo tanto, la onconasa nativa producida por recombinación en E. coli no presenta piroglutamilo como residuo N-terminal.

La patente WO nº 97/3116 reivindica que ha resuelto el problema de la producción de una onconasa modificada que conserva la actividad citotóxica. Da a conocer una ribonucleasa recombinante que presenta un extremo amino-terminal que se inicia con una metionina seguida de un aminoácido que no es ácido glutámico, una cisteína en posiciones 26, 40, 58, 84, 95 y 110, una lisina en posición 41 y una histidina en posición 119 de la ARNasa A bovina y una secuencia de aminoácidos derivada de onconasa nativa. La patente WO nº 97/3116 no reconoce la importancia del piroglutamato como residuo N-terminal y no produce una molécula de onconasa con un piroglutamato N-terminal. Al contrario, la patente WO nº 97/3116 sugiere la adición de secuencias amino-terminales y/o fusión en el extremo N-terminal con una molécula de ligando.

Breve descripción del dibujo

La figura 1 muestra la secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos de la NfM-onconasa.

Sumario de la invención

Es un objetivo de la presente invención proporcionar un scFv de onconasa de producción recombinante, en el que dicha ARNasa incluya piroglutamato como el residuo N-terminal y dicho scFv sea un LL2 scFv, que conserve las propiedades citotóxicas de la onconasa eliminando simultáneamente los efectos secundarios no deseables.

Estos y otros objetivos se alcanzan según la invención mediante una molécula LL2 scFv de onconasa que presenta piroglutamato como el residuo N-terminal, en el que dicha molécula de onconasa se produce por recombinación en E. coli. La molécula de onconasa producida por recombinación presenta la secuencia y estructura de la onconasa purificada a partir de Rana pipiens.

La proteína de fusión puede prepararse mediante la expresión recombinante de una secuencia de ácidos nucleicos que codifique la onconasa y un grupo diana. El grupo diana es el fragmento de anticuerpo denominado scFv.

Se proporciona una composición que comprende proteína de fusión de onconasa de producción recombinante de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones resultan útiles en un método para el tratamiento de linfoma, que comprende la administración a un sujeto que necesita de dicho tratamiento de una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de fusión de onconasa de producción recombinante de acuerdo con la invención.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican las realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a título de ejemplo, debido a que diversos cambios y modificaciones comprendidas en el espíritu y alcance de la invención resultarán evidentes para los expertos en la materia a partir de la anterior descripción detallada.

Descripción de las realizaciones preferidas

Inesperadamente se ha descubierto que puede producirse por recombinación en E. coli una molécula de onconasa que (1) presenta la secuencia de la onconasa nativa, (2) conserva el plegamiento correcto de la onconasa nativa y (3) presenta una actividad citotóxica similar a la de la onconasa purificada a partir de oocitos de Rana pipiens. De acuerdo con la presente invención, el ADNc que codifica la onconasa es extendida por un triplete que codifica la N-formil-metionina. Al expresarse por recombinación, la onconasa mutante presenta la N-formil-metionina como el aminoácido N-terminal y el glutaminilo como el penúltimo residuo N-terminal. El producto de expresión producido de acuerdo con la presente invención se denomina en el presente documento NfM-onconasa. Tras la expresión, el residuo N-formil-metionina es cortado y los residuos glutaminilo penúltimos se ciclizan para producir onconasa con un residuo piroglutamato N-terminal, denominado en el presente documento r-onconasa. La r-onconasa presenta la misma estructura y función que la onconasa nativa.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto ordinario en la técnica. Para los fines de la presente invención, los términos siguientes se definen de la manera siguiente:

Se hace referencia a los aminoácidos por el nombre o por los símbolos de tres letras habitualmente conocidos o por los símbolos de una letra de la IUPAC. Los nucleótidos se denominan por los códigos de una letra habitualmente aceptados.

"Variaciones modificadas conservativamente" de una secuencia particular de ácidos nucleicos se refiere a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a que el código genético está degenerado, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. De esta manera, en todas las posiciones en las que un codón especifica una alanina, el codón puede ser alterado para formar cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido que codifica. Cada codón en un ácido nucleico excepto AUG, que codifica metionina, puede ser modificado para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. Las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en el presente documento también abarcan dichas alteraciones.

"Variaciones conservativamente modificadas" de una secuencia de aminoácidos incluye las sustituciones individuales que alteran un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada, en la que las alteraciones resultan en la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las sustituciones conservativas son bien conocidas por los expertos en la materia. Cada uno de los siguientes seis grupos contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas de otros aminoácidos en el mismo grupo:

1.

Alanina, serina, treonina

2.

Ácido aspártico, ácido glutámico

3.

Asparagina, glutamina

4.

Arginina, lisina

5.

Isoleucina, leucina, metionina, valina, y

6.

Fenilalanina, tirosina, triptófano.

"Variaciones conservativamente modificadas" de una secuencia de aminoácidos también incluye las deleciones o adiciones de un solo aminoácido o de un porcentaje pequeño de aminoácidos en una secuencia codificada, en la que las adiciones y deleciones resultan en la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las secuencias de aminoácidos indicadas en el presente documento también abarcan dichas variaciones.

Los términos "aislado" o "biológicamente puro" se refieren al material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su ambiente natural. El material aislado opcionalmente comprende material que no se encuentra con el material en su ambiente natural.

El término "ácido nucleico" se refiere a una desoxirribonucleasa o polímero de ribonucleótidos en forma de cadena única o doble y, a menos que esté limitado de otra manera, que abarca análogos conocidos de nucleótidos naturales que se hibridan con ácidos nucleicos de una manera similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácidos nucleicos incluye su secuencia complementaria.

Un "vector de expresión" incluye un cassette de expresión recombinante que incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con la invención que puede ser transcrito y traducido por una célula. El cassette de expresión recombinante es un constructo de ácidos nucleicos, generado por recombinación o sintéticamente, con una serie de elementos especificados de ácidos nucleicos que permite la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la parte de cassette de expresión recombinante del vector de expresión incluye un ácido nucleico a ser transcrito y un promotor operablemente ligado al mismo.

El término "recombinante" utilizado con referencia a una proteína indica que una célula expresa un péptido o proteína codificado por un ácido nucleico cuyo origen es exógeno a la célula. Las células recombinantes pueden expresar genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes también pueden expresar genes que se encuentran en la forma nativa de la célula, en la que los genes son reintroducidos en la célula por medios artificiales, por ejemplo bajo el control de un promotor heterólogo.

El término "identidad sustancial" o "similitud sustancial" con referencia a un polipéptido indica que un polipéptido comprende una secuencia con una identidad de por lo menos el 80%, más preferiblemente del 90%, y con la mayor preferencia de por lo menos el 95% con una secuencia de referencia. Que dos polipéptidos sean sustancialmente idénticos significa que uno de los polipéptidos es inmunológicamente reactivo con anticuerpos cultivados contra el segundo péptido. Dos ácidos nucleicos son sustancialmente idénticos si las dos moléculas se hibridan entre sí bajo condiciones restrictivas. En general, las condiciones restrictivas se seleccionan como una temperatura aproximada de 5ºC a 20ºC inferior al punto de fusión térmica (T_{m}) para una secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La T_{m} es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda de correspondencia perfecta. Sin embargo, los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí bajo condiciones restrictivas todavía son sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente
idénticos.

Un "anticuerpo" incluye anticuerpos completos y fragmentos de anticuerpos, tales como F(ab')_{2}, F(ab)_{2}, Fab', Fab, Fv y similares, incluyendo los fragmentos de híbrido. También resulta útil cualquier subfragmento que conserve la región hipervariable de unión a antígeno de una inmunoglobulina.

Un "grupo diana" es un anticuerpo, citoquina o factor de crecimiento que es específico para un marcador en un tipo celular dado. Un grupo diana puede utilizarse para transportar específicamente una molécula unida a un tipo celular determinado, al asociarse preferentemente con el marcador asociado con dicho tipo celular.

Una "proteína de fusión" es una molécula quimérica formada por la unión de dos o más polipéptidos, más particularmente, onconasa y un grupo diana. La onconasa y el grupo diana están unidos a través de un enlace peptídico formado entre el extremo amino-terminal del grupo diana y el extremo carboxilo terminal de la onconasa y se expresan por recombinación mediante una secuencia de ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión. Una proteína de fusión de una sola cadena es una proteína de fusión que presenta un único esqueleto polipeptídico contiguo.

Un "conjugado químico" es un conjugado formado por el acoplamiento químico de la onconasa y un grupo diana.

Un "portador farmacéuticamente aceptable" es un material que puede utilizarse como vehículo para administrar la onconasa o proteína de fusión debido a que el material es inerte o, de otra manera, médicamente aceptable, así como compatible con la proteína de fusión o ligando armado.

De acuerdo con la presente invención, puede prepararse el ácido nucleico que codifica la onconasa nativa mediante el clonado y restricción de secuencias apropiadas, o utilizando la amplificación de ADN con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La secuencia de aminoácidos de la onconasa puede obtenerse en Ardelt et al., J. Biol. Chem. 256:245 (1991) y las secuencias de ADNc que codifican la onconasa nativa, o una variación conservativamente modificada de la misma, pueden sintetizarse génicamente mediante métodos similares al ensamblaje en bloque del gen V en la humanización de hLL2. Leung et al., Mol. Immunol. 32:1413 (1995). Para la expresión en E. coli, se introduce un codón ATG de inicio de la traducción dentro del marco antes de la secuencia de ADNc de la onconasa. La proteína traducida contiene entonces una Met adicional en la posición -1.

Alternativamente, el ácido nucleico que codifica la onconasa nativa puede sintetizarse in vitro. La síntesis química produce un oligonucleótido de una sola cadena. Esta puede convertirse en un ADN de cadena doble mediante hibridación con una secuencia complementaria, o mediante polimerización con una ADN polimerasa utilizando la cadena única como molde. Aunque la síntesis química se limita a secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias más largas ligando entre sí las secuencias más cortas.

Tal como se ha indicado, se modifica un gen que codifica onconasa nativa, o una variación conservativamente modificada del mismo para que incluya un codón para la N-formil-metionina en el extremo N-terminal. El gen NfM-onconasa obtenido de esta manera se encuentra operablemente ligado a un promotor adecuado de E. coli, tal como el promotor T7, trp ó lambda y se inserta en un cassette de expresión. Preferiblemente también se incluyen en el cassette de expresión un sitio de unión de ribosomas y una señal de final de transcripción. Se transfiere un vector de expresión que contiene el cassette a un huésped de expresión E. coli mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. Las células transformadas pueden seleccionarse mediante resistencias a antibióticos conferidas por genes marcadores contenidos en el vector de expresión.

El huésped transformado E. coli expresa NfM-onconasa-LL2-SCW, que puede estar contenida en un cuerpo de inclusión. Aunque la onconasa posee una potente actividad ARNasa, la NfM-onconasa no la posee. Esto se debe a que el piroglutamato N-terminal en la onconasa es parte del sitio activo, tal como demuestra la estructura cristalina de la onconasa. La naturaleza misma del sistema de expresión bacteriano, que requiere una metionina N-terminal, implica que el producto de expresión bacteriano está inactivo. Esto permite la expresión recombinante de la NfM-onconasa-LL2-SCW en los sistemas de expresión bacterianos. Aunque la NfM-onconasa no es tóxica, también puede expresarse como cuerpos de inclusión inactivos.

La NfM-onconasa puede aislarse y purificarse de acuerdo con procedimientos estándar, incluyendo la precipitación con sulfato amónico, las columnas de afinidad, la cromatografía de columna y la electroforesis en gel. Son preferentes las composiciones sustancialmente puras con una homogeneidad mínima aproximada comprendida entre 90% y 95% y preferiblemente comprendida entre 98% y 99%.

Tras la purificación de la NfM-onconasa, y el replegamiento de la molécula si se había expresado en un cuerpo de inclusión, se eliminó la N-formil-metionina mediante digestión con aminopeptidasa. Una aminopeptidasa adecuada es la aminopeptidasa de Aeromonas, tal como dan a conocer Shapiro et al., Anal. Biochem. 175:450-461 (1988). La incubación del producto resultante da lugar a la ciclización espontánea del residuo glutamina N-terminal, formando una molécula que presenta la estructura y función de la onconasa nativa.

La onconasa producida por recombinación puede utilizarse como alternativa o como complemento de toxinas existentes.

Un ejemplo de antígeno para el direccionamiento son los antígenos glucosilados de superficie celular que se expresan en tumores sólidos, tales como el antígeno carcinoembriónico (CEA). El CEA representa una diana antigénica atractiva por varios motivos. Es un antígeno asociado a tumores que se encuentra ausente o es pobremente expresado en tejidos normales mientras que es altamente expresado en la amplia mayoría de carcinomas de mama, colon, pulmón, páncreas, ovarios y carcinomas de origen medular tiroideo. Las elevadas tasas de mortalidad, junto con las opciones diagnósticas y terapéuticas subóptimas existentes para estos cánceres resultan en un problema de salud pública grave y persistente. En el presente documento se describe una proteína de fusión de la onconasa que comprende ARNasa del LL2-SCW de Rana pipiens.

El CEA es una proteína glucosilada de superficie celular de aproximadamente 180 kDa que es un antígeno de tumor sólido que ha sido estudiado clínicamente de manera extensiva, como marcador tumoral circulante y como diana antigénica para mAbs marcados radioactivamente, en la formación de imágenes y para la terapia. Se han estudiado varios anticuerpos anti-CEA en ensayos clínicos diagnósticos y terapéuticos de fase I-III. Un ejemplo de un mAb anti-CEA es el mAb MN14. Se ha construido y expresado una versión humanizada de este mAb, el hMN-14, en el que regiones constantes y estructurales humanas sustituyen las secuencias de ratón correspondientes, y es el mAb utilizado en estos ensayos clínicos. Un Fab' marcado con ^{99m}Tc que es un fragmento de otro mAb anti-CEA relacionado, el Immu-4, resulta de utilidad en la detección y clasificación de estadio del cáncer de colon.

Otros ejemplos de antígenos para el direccionamiento incluyen diferentes antígenos CD (grupos de diferenciación) restringidos a células B, incluyendo los CD19-22, CD37 y HLA-DR. Los antígenos preferidos son CD20, que se expresan a una densidad antigénica elevada en un amplio abanico de tumores de las células B, abarcando desde la leucemia linfocítica aguda (ALL) hasta las células B (B-CLL) más diferenciadas al linfoma no Hodgkin (NHL) e incluso la leucemia de células peludas (HCL) y el CD22, un antígeno de internalización eficiente que se asocia con prácticamente todos los linfomas no Hodgkin.

Un anticuerpo para el direccionamiento de la onconasa al linfoma no Hodgkin es LL2 (IgG2a/kappa), un anticuerpo monoclonal murino. Los resultados muestran que LL2 es rápidamente internalizado tras la unión a la superficie celular, con IgG dimérico o con F(ab')_{2} mostrando una tasa más rápida que el Fab' monomérico. El anticuerpo aparentemente es degradado en lisosomas principalmente, debido a que la degradación se ve significativamente inhibida en presencia de inhibidores lisosomales tales como el cloruro amónico o la leupeptina.

Las secuencias VK y VH para LL2 pueden clonarse utilizando la amplificación por PCR, utilizando el método y cebadores descritos por Orlandi et al., PNAS 86:3833 (1989).

Entre los fragmentos adecuados de anticuerpos frente a estos antígenos se incluyen F(ab')_{2}, F(ab)_{2}, Fab', Fab, Fv y similares, incluyendo los fragmentos híbridos. También resulta útil cualquier subfragmento de una inmunoglobulina que conserve la región hipervariable de unión a antígeno, incluyendo las proteínas de ingeniería genética y/o recombinantes, sea de cadena única o cadena múltiple, que incorporan un sitio de unión a antígeno y que de otra manera funcio-
nan in vivo como grupos diana de sustancialmente la misma manera que los fragmentos de inmnoglobulina natural.

Las moléculas de unión de cadena única se dan a conocer en la patente US nº 4.946.778. Los fragmentos de anticuerpo Fab' pueden prepararse convenientemente mediante corte reductivo de fragmentos F(ab')_{2}, los cuales pueden prepararse mediante digestión con pepsina de inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos de anticuerpo Fab pueden prepararse mediante digestión con papaína de inmunoglobulinas intactas, bajo condiciones reductoras, o mediante corte de fragmentos F(ab)_{2} que resultan de la digestión suave con papaína de Ig enteros. Los fragmentos también pueden producirse mediante ingeniería genética.

Los receptores de citoquina, tales como IL-1R, IL-2R, IL-4R, IL-6R, IL-7R, IL-9R, IL-13R e IL-15R, también pueden direccionarse mediante grupos diana. En una realización, los receptores citoquina pueden direccionarse a la superficie de células que normalmente carecen de tales receptores mediante la utilización de conjugados mAb-receptor, tal como se describe en la solicitud en tramitación nº de serie 08/949.758, presentada el 14 de octubre de 1997. Los receptores de factores de crecimiento como la insulina y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) también pueden utilizarse para direccionar la r-onconasa a un tipo celular específico.

Las proteínas de fusión, incluyendo la ARNasa de LL2-SCW de Rana pipiens de acuerdo con la presente invención, pueden producirse por recombinación, utilizando la misma metodología básica descrita anteriormente. Por ejemplo, el ADNc que codifica la NfM-onconasa puede insertarse en un plásmido que también contenga ADNc que codifique un fragmento de anticuerpo de una cadena (scFv). Debido a que el residuo piroglutamilo N-terminal es esencial para la ARNasa y para la actividad citotóxica de la onconasa, el ADNc de la NfM-onconasa se inserta de manera que el producto de expresión sea [NfM-onconasa]-[scFv]. Las proteínas de fusión producidas por recombinación pueden purificarse, eliminarse la N-formil-metionina y el residuo terminal glutaminilo ciclizarse para producir piroglutamato, tal como se ha descrito anteriormente para la onconasa producida por recombinación.

Las proteínas de fusión de onconasa producidas por recombinación de acuerdo con la invención se formulan en composiciones farmacéuticas para el tratamiento del linfoma. En este contexto, las composiciones comprenden una solución de la proteína de fusión de la onconasa disuelta en un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un portador acuoso, tal como solución salina tamponada. Estas soluciones son estériles y pueden contener sustancias auxiliares, tales como agentes de ajuste del pH y agentes tamponadores y agentes de ajuste de la toxicidad.

La dosificación de la proteína de fusión de la molécula de onconasa de acuerdo con la invención es de aproximadamente 0,1 a 10 mg por paciente por día, aunque pueden utilizarse dosis de hasta 100 mg por paciente por día, particularmente cuando el fármaco se administra localmente y no en el flujo sanguíneo. Al igual que la onconasa nativa, la onconasa producida por recombinación de acuerdo con la invención es fácilmente internalizada en las células, presenta efectos antitumorales in vivo y preferentemente elimina rápidamente las células tumorales en división. Los conjugados químicos y proteínas de fusión proporcionan un direccionamiento más específico de la onconasa producida por recombinación hacia células particulares.

En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que sufre de una enfermedad, en una cantidad citotóxica, que se define como una cantidad suficiente para eliminar las células de interés. Una cantidad que consiga lo anterior se define como una "cantidad terapéuticamente efectiva". La cantidad exacta dependerá de la severidad de la enfermedad y del estado general de salud del paciente. Pueden administrarse dosificaciones únicas o múltiples de las composiciones dependiendo de la dosis requerida.

Las proteínas de fusión de la onconasa de acuerdo con la invención también pueden utilizarse para tratar poblaciones de células in vitro. Por ejemplo, puede utilizarse selectivamente para eliminar tipos celulares no deseados en la médula ósea previamente al trasplante en un paciente que se somete a ablación de médula.

Los ejemplos siguientes son ilustrativos de la presente invención, pero no deben interpretarse como limitativos.

Ejemplo 1 Síntesis del ADN amplificado por PCR que codifica la NfM-onconasa

Se sintetizó un polinucleótido de ADN de 139 nucleótidos, ONCO-N, con la secuencia de cadena sentido [5'-TGG CTA ACG TTT CAG AAG AAA CAT ATG ACG AAT ACA CGA GAT GTA GAC TGG GAC AAT ATA ATG TCT ACG AAT CTG TTT CAC TGT AAG GAT AAG AAT ACC TTT ATA TAC AGT CGG CCA GAG CCT GTA AAG GCT ATC TGT A-3'] que codificaba una secuencia N-terminal (46 aminoácidos) de onconasa recombinante mediante un sintetizador automático de ADN (Applied Biosystem 392 DNA/RNA Synthesizer) y se utilizó como molde para la amplificación por PCR con los cebadores flanqueantes ONNBACK [5'-AAG CTT CAT ATG CAG GAT TGG CTA ACG TTT CAG AAG AAA-3', y ONFOR [5'-CTT ACT CGC GAT AAT GCC TTT ACA GAT AGC CTT TAC AGG CTC TG-3']. El producto PCR de doble cadena resultante contenía una secuencia de ADNc que codificaba 54 residuos aminoácido de la mitad N-terminal de la onconasa. ONNBACK contenía los sitios de restricción HindIII (AAAGCTT) y NdeI (CATATG) para facilitar el subclonado en vectores de identificación de estadio o para el ligamiento dentro del marco (sitio NdeI) en el vector de expresión bacteriano. El sitio NruI (TCGCGA) se incorporó en el cebador ONNFOR para facilitar el ligamiento dentro del marco con el ADNc que codifica la mitad C-terminal de la
onconasa.

De manera similar, se sintetizó un polinucleótido de ADN de 137 nucleótidos, ONCO-C, con la secuencia de cadena sentido [TGC TGA CTA CTT CCG AGT TCT ATC TGT CCG ATT GCA ATG TGA CTT CAC GGC CCT GCA AAT ATA AGC TGA AGA AAA GCA CTA ACA AAT TTT GCG TAA CTT GCG AGA ACC AGG CTC CTG TAC ATT TCG TTG GAG TCG GG-3'] que codificaba la secuencia C-terminal (46 aminoácidos) de la onconasa y se amplificó por PCR con los cebadores ONCBACK [5'-ATT ATC GCG AGT AAG AAC GTG CTG ACT ACT TCC GAG TTC TAT-3'] y ONCFOR [5'-TTA GGA TCC TTA GCA GCT CCC GAC TCC AAC GAA ATG TAC-3']. El producto PCR de doble cadena final contenía una secuencia de ADNc que codificaba 51 aminoácidos del resto de la mitad C-terminal de la onconasa. Un sitio NruI permitió el ligamiento dentro del marco de la mitad N-terminal del ADN amplificado por PCR incorporado en ONCBACK. En la secuencia ONCFOR se incluyeron un codón de parada (mostrado en negrita itálica) y los sitios de restricción BamHI (subrayados) para el subclonado en vectores de identificación de estadio o en vectores de expresión.

El ADN amplificado por PCR que codificaba la mitad N-terminal y C-terminal de la NfM-onconasa, tras tratarlo con los enzimas de restricción apropiados, se unió en los sitios NruI y se subclonó en un vector de identificación de estadio, por ejemplo pBluescript de Stratagene. La secuencia ligada debería codificar un polipéptido de 105 aminoácidos con una Met N-terminal.

Ejemplo 2 Clonado de regiones V de LL2 y MN14 y humanización de LL2 y MN14

Las secuencias de la región V de hLL2 y hMN14 han sido publicadas. Leung et al., Mol. Immunol., 32:1413 (1995); patente US nº 5.874.540. Las secuencias VK y VH para LL2 y MN14 se amplificaron por PCR utilizando métodos y cebadores publicados.

El análisis de secuencias de los ADN amplificados por PCR indicó que codificaban proteínas típicas de los dominios de los anticuerpos VK y VH. Un anticuerpo quimérico construido basándose en las secuencias LL2 y MN14 amplificadas por PCR mostró inmunorreactividad comparable a los anticuerpos parentales, confirmando la autenticidad de la secuencia obtenida.

El análisis de secuencias del anticuerpo LL2 reveló la presencia de un sitio de glucosilación N-ligado unido a VK en la región del marco-1 (FR-1). Los estudios de mutaciones indicaban que la glucosilación en el sitio unido a VK no eran necesarios para mantener la inmunorreactividad del anticuerpo. Sin la inclusión del sitio de glucosilación FR-1, se utilizaron las secuencias de marco REI como andamiaje para injertar los CDRs de cadena ligera y EU/NEWM para injertar los CDRs de cadena pesada de LL2. La inmunorreactividad del LL2 humanizado (hLL2) se demostró que era comparable a la del LL2 murino quimérico. La tasa de internalización de LL2 no se vio afectada por la quimerización o humanización del anticuerpo.

Ejemplo 3 Construcción de gen que codifica proteína de fusión de LL2 humanizada y NfM-onconasa

Las secuencias VH y VK de hLL2 se utilizaron como moldes para ensamblar el gen hLL2 scFv mediante procedimientos PCR estándar. La configuración del gen era Met(-1)-VL-(GGGS)_{4}-VH(His)_{6}. Se incorporó un codón de inicio Met (ATG) en la posición -1 en el extremo N-terminal del gen VL, que se ligó mediante un línker de 16 aminoácidos (GGGS)_{6} al dominio VH. Una cola que consistía en seis residuos histidilo se incluyó en el extremo carboxilo de la cadena VH para facilitar la purificación de la proteína de fusión mediante cromatografía de metal-quelato.

Se construyó el gen de la proteína de fusión inmunotoxina para la NfM-onconasa-hLL2scFv de una manera similar mediante métodos de digestión con enzimas de restricción y métodos de ligamiento. La secuencia de ADNc, al expresarse, codificaba una proteína de fusión con la estructura siguiente:

NfM-onconasa-[\text{línker}]-VL(GGGS)_{4}-VH-(His)_{6}\cdot

Existe una diversidad de línkers que pueden insertarse entre el extremo C-terminal de la NfM-onconasa y el dominio N-terminal de VL. Un línker preferible es la secuencia de aminoácidos TRHRQPRGW de la posición C-terminal 273-281 de la exotoxina de Pseudomonas (PE). Esta secuencia se ha demostrado que es un sitio de reconocimiento para el corte intracelular de PE en fragmentos activos mediante subtilisinas, produciéndose el corte entre los residuos G y W de la secuencia. Chiron et al., J. Biol. Chem. 269:18167 (1994). La incorporación de esta secuencia facilita la liberación de la r-onconasa activa tras la internalización de la inmunotoxina de fusión. Alternativamente, un espaciador de 13 residuos aminoácidos que consiste en los residuos aminoácidos 48-60 del fragmento B de la proteína A de estafilococo, utilizada en la construcción de una fusión EDN-scFv, puede utilizarse en lugar de permitir el ligamiento flexible entre la r-onconasa y la scFv. Tai et al., Biochemistry 29:8024 (1990) y Rybak et al., Tumor Targeting 1:141 (1995).

Ejemplo 4 Construcción del gen que codifica la proteína de fusión de MN14 humanizada y la NfM-onconasa

Se produjo scFv de MN14 mediante amplificación por PCR del ADNc a partir de transfectoma humanizado de MN14. El línker utilizado para el scFv de MN14 presentaba 15 aminoácidos (GGSGS)_{3} y la orientación era V_{L}-línker-V_{H}. Tras confirmar las secuencias de ADN, se subclonó el constructo de cadena única en un plásmido de expresión apropiadamente sometido a enzimas de restricción utilizado para otros scFv. A continuación, este constructo se transformó en E. coli BL21 (\lambdaDE3) para expresarlo.

También se preparó otro constructo de cadena única. Dicho constructo se preparó con orientación 5'-3' opuesta de cadenas pesada y ligera, se ensambló en pCANTABE5E (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y se expresó en un fago. Se demostró mediante ELISA la unión específica del fago recombinante que expresaba dicho scFv.

La secuencia V_{L}-línker-V_{H} se utilizó para la construcción de la proteína de fusión onconasa-MN14, tal como se muestra en el diagrama posteriormente. El fragmento de ADN que codificaba la onconasa se obtuvo de acuerdo con el Ejemplo 1. Se utilizó un línker de 23 aminoácidos entre la secuencia de onconasa y el scFv. Kurucz et al. (1995). Alternativamente, se utilizó el línker (GGSGS)_{3} utilizado en la construcción del scFv de MN14 descrito anteriormente. Una configuración preferida de la proteína de fusión era:

Onconasa-\text{línker}--V_{L}-(GGSGS)_{3}-V_{H}

Ejemplo 5 Expresión y purificación de hLL2 scFv, hMN14-scFv, inmunotoxina NfM-onconasa-hLL2 scFv e inmunotoxina NfM-onconasa-hMN14-scFv

Un vector para la expresión del scFv de hMN14 y del scFv de hLL2 es el vector pET controlado por el promotor de T7 comercialmente disponible (Novagen, Madison, WI). Los vectores de expresión de ADN scFvhMN14-pET y scFvhLL2-pET se derivaron de pET y contienen la secuencia scFv de hMN14 ó hLL2 en fusión con PE40, que se destruyó mediante una deleción SalI/XhoI, con un promotor de T7.

El ADNc de la NfM-onconasa se digirió con NdeI/BamHI y se clonó en los sitios correspondientes en los vectores scFvhMN14-pET y scFvhLL2-pET y las secuencias se confirmaron. Se eliminó una secuencia redundante entre los sitios BamHI y EagI dentro del vector de expresión scFvhMN14-pET mediante digestión con enzimas de restricción, purificación en gel y religamiento. El fragmento extraído se descubrió que contenía parte de scFvMN14 y el gen PE40 defectivo. El vector de expresión final scFvhMN14-NfM-onconasa se secuenció adicionalmente y se denominó rOnpET.

La expresión a gran escala de la proteína recombinante del vector rOnpET regulado por T7 requiere un E. coli huésped apropiado, tal como BL21, que contiene un lisógeno \lambdaDE3, tal como se ha indicado anteriormente. Se utilizó el vector rOnpET para transformar células BL21/\lambdaDE3 competentes mediante electroporación. Se escogieron las colonias que sobrevivieron la selección en placas de agar con Amp y se cultivaron en un incubador bajo agitación a 37ºC en 3 ml de LB-Amp. Tras la incubación durante 8 a 10 horas, se transfirieron 100 \mul del cultivo a 25 ml de supercaldo (LB suplementado con 0,5% de glucosa, MgSO_{4} 1,6 mM y 100 \mug/ml de ampicilina) en un matraz E de 500 ml para incrementar la aireación durante la agitación. El cultivo se incubó durante la noche en un incubador-agitador a 37ºC. A continuación, el cultivo se transfirió a un litro de supercaldo y se incubó adicionalmente en un incubador con agitación a 37ºC. Se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM al cultivo cuando la OD650 de éste había alcanzado un valor de 1 (aproximadamente tras 2,5 horas). Se dejó transcurrir la inducción durante 1 a 3 horas antes de finalizar el cultivo para el aislamiento de los cuerpos de inclusión. Se analizaron 10 \mul del cultivo bajo condiciones reductoras en gel SDS-PAGE al 15%. Las colonias con el nivel más alto de inducción se conservaron como cultivo madre y se almacenaron congeladas a -70ºC.

El lisógeno \lambdaDE3 incluía el gen inducible de la ARN polimerasa de T7. Los resultados demostraron que la expresión de la T7 polimerasa fue inducida por la adición de IPTG y que la polimerasa T7 que se había expresado a su vez activaba la transcripción de la proteína recombinante regulada por T7. La transcripción regulada por el promotor de T7 era tan eficiente que la proteína era expresada abundantemente y precipitaba en el citoplasma en forma de cuerpos de inclusión.

El aislamiento de los cuerpos de inclusión involucraba la lisis de las células mediante homogeneización en presencia de lisozimas para liberar los cuerpos de inclusión como pellets insolubles. Los cuerpos de inclusión lavados se disolvieron en tampón desnaturalizante que contenía guanidina-HCl 7 M. Los enlaces disulfuro se redujeron con ditioeritritol y después se replegaron mediante la dilución gota a gota de la proteína desnaturalizada en tampón renaturalizante que contenía arginina-HCl y glutatión oxidado.

Ejemplo 6 Expresión y purificación de NfM-onconasa

Se purificó un equivalente de 6 litros de cultivo de cuerpos de inclusión renaturalizados del Ejemplo 5. La pasta celular recogida se resuspendió utilizando un triturador de tejidos Tisuemizer (Thomas, Swedesboro, NJ) en tampón TES (Tris 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM y EDTA 20 mM) que contenía 180 \mug/ml de lisozima. Tras incubar a 22ºC durante una hora, las células se resuspendieron nuevamente y se centrifugaron a 27.000g durante 50 minutos. El pellet se lavó mediante resuspensión y centrifugación tres o cuatro veces con tampón TES que contenía Triton-X-100 al 2,5% y después cuatro veces con TES. Los cuerpos de inclusión se resuspendieron en 5 a 10 ml de tampón de desnaturalización (guanidina:HCl 7 M, Tris 0,1 M, pH 8,0 y EDTA 5 mM) mediante sonicación o trituración del tejido y se diluyó a una concentración de proteínas de 10 mg/ml.

La proteína se redujo con ditioeritritol (65 mM) durante 4 a 24 horas a 22ºC y se diluyó rápidamente en un flujo suave en tampón de replegamiento (Tris 0,1 M, pH 8,0, arginina:HCl 0,5, EDTA 2 mM y glutatión oxidado 0,9 mM). Tras incubar a 10ºC durante 36 a 72 horas, la NfM-onconasa replegada se dializó frente a acetato sódico 0,15 M (pH 5) y se cargó en una columna FPLC de intercambio catiónico HiLoad 16/20 SP. Tras el intercambio de tampón con el acetato sódico 0,15 M (pH 5), se formaron precipitados. Éstos se eliminaron mediante centrifugación. Se utilizó una elución con un gradiente lineal 0-1 M de cloruro sódico y las fracciones correspondientes a los picos de absorción se analizaron mediante SDS-PAGE (15%). La mayoría de las proteínas unidas a la columna fueron eluídas con NaCl a 0,5 M.

Los productos eluídos se dividieron ampliamente en tres fracciones. La fracción I constituía el pico principal. Las fracciones II y III eran picos relativamente menores que eluyeron por delante de la fracción I, siendo la fracción II un pico secundario de la fracción I.

Ejemplo 7 Eliminación de la Met de NfM-onconasa y de la proteína de fusión NfM-onconasa

Los residuos Met N-terminales de NfM-onconasa, NfM-onconasa-hMN14-scFv y NfM-onconasa-hLL2 scFv se eliminaron de acuerdo con Shapiro et al. (1988). Se purificaron 100 a 200 \mug/ml y las proteínas renaturalizadas se incubaron con 0,5 \mug/ml de aminopeptidasa de Aeromonas proteolytica (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) en fosfato sódico 200 mM, pH 7,5, durante 18 horas a 37ºC.

Ejemplo 8 Preparación de los conjugados de anticuerpo r-onconasa

Se prepararon conjugados con enlaces disulfuro tal como describen Newton et al., J. Biol. Chem. 267:19572 (1992), con algunas modificaciones. Se incubó anticuerpo 2-iminotiolano-modificado durante la noche a 23ºC con un exceso de 40 veces de r-onconasa modificada con N-succinimidil-3-(2-piridiltio)-propionato (SPDP) (1,1 a 1,3 moles de SPDP/mol de r-onconasa). Rybak et al., J. Biol. Chem. 266:21202 (1991). Se prepararon conjugados ligados por tioéter de acuerdo con procedimientos estándar, utilizando éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxilsuccinimida (MBS). Gulberg et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 139:1239 (1986). Se incubaron dos tubos separados que contenían 2 mg de anticuerpo con un exceso molar de 5 veces de MBS (solución madre, 30 mM en dimetilformamida) durante 10 minutos a 23ºC. Los tubos se agruparon y se aplicaron a una columna PD 10 equilibrada con tampón A (NaPO_{4} 0,1 M, pH 7,5, que contenía NaCl 0,1 M). Se agruparon las fracciones de los picos, conteniendo cada una 1,5 ml. El tampón A se intercambió con el tampón B (acetato Na 0,1 M, pH 4,5, que contenía NaCl 0,1 M) mediante concentración repetida seguida de reconstitución del retenido recuperado con el tampón B utilizando microconcentradores Centricon 10 (Amicon). La r-onconasa modificada con SPDP se redujo durante 30 minutos a 23ºC con ditiotreitol 23 mM y se filtró en gel en una columna PD 10 equilibrada con tampón A. Las fracciones de los picos, con 1,5 ml cada una aproximadamente, se añadieron a tubos que contenían 750 \mul de anticuerpo MBS-modificado y se incubaron durante la noche a 23ºC. Al día siguiente, los conjugados se incubaron con 0,5 mM de N-etilmaleimida (20 mM) en dimetilformamida durante por lo menos una hora previamente a la purificación mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaños en una columna TSK 3000 (Toso Haas Corp., PA) equilibrada y eluída con tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4. El caudal era de 0,5 ml/minuto y se recogieron fracciones cada minuto. Las fracciones de los picos se agruparon y se analizaron mediante SDS-PAGE para determinar la cantidad de ligando libre y de r-onconasa en los conjugados.

Ejemplo 9 Actividad in vitro de r-onconasa y de inmunotoxinas de r-onconasa

Se evaluó la capacidad de la r-onconasa de inhibir la síntesis de proteínas en un lisado de reticulocitos de conejo utilizando los protocolos descritos por St. Clair et al., PNAS USA 84:8330 (1987). Todas las fracciones se pasaron a través de FPLC Superose 12 antes de analizar la actividad, aunque, debido a que la aminopeptidasa presenta un peso molecular de 29 kD y la NfM-onconasa presenta un peso molecular de 12 kD, los dos no pudieron separarse mediante cromatografía de exclusión por tamaños utilizando FPLC Superose 12. Sin embargo, los resultados confirmaron que la r-onconasa inhibía la síntesis de proteínas.

Se añadieron onconasa nativa (AlfaCell), fracción I no tratada con aminopeptidasa (control negativo), y las fracciones I, II y III tratadas con aminopeptidasa (AP) a diferentes concentraciones molares al sistema de traducción in vitro. La incorporación de ^{32}Met se midió tras incubar la mezcla con o sin ribonucleasas en un contador de centelleo, con el fin de evaluar la tasa de síntesis proteica. Las concentraciones de proteína de las diferentes muestras se determinaron simultáneamente mediante ensayo BCA (Pierce) utilizando BSA como estándar.

Los resultados demostraron que la fracción I (AP) y la onconasa (AlfaCell) presentaban idénticas actividades ARNasa. La fracción II (AP) y la fracción III (AP) también mostraron actividad ARNasa, aunque a un nivel más bajo, indicando que estas fracciones comprendían r-onconasa que no se había re-plegado correctamente. La actividad en las fracciones II (AP) y III (AP) es probable que fuese un remanente de la fracción I (AP). La fracción I (control negativo) mostraba una actividad sustancialmente más baja que la fracción I (AP). La adición de un exceso de aminopeptidasa al sistema de traducción no modificó los resultados, demostrando que la actividad más baja de la fracción I en comparación con la fracción I (AP) no era debida a la eliminación incompleta de la aminopeptidasa tras la eliminación de la Met N-terminal y que era la Met N-terminal que estaba inhibiendo la actividad ARNasa.

También se evaluó la capacidad de la r-onconasa de inhibir la síntesis de proteínas de tres líneas celulares de linfoma B, Daudi, Raji y CA-46, y de una línea de células T humanas, Hut 102. Las células se cultivaron en placa a concentraciones de 2 x 10^{5} células/ml en placas de microtitración de 96 pocillos en el medio completo apropiado. El medio completo se sustituyó con medio libre de suero y de leucina que contenía concentraciones crecientes de r-onconasa y de inmunotoxina r-onconasa, producidas por recombinación y conjugadas químicamente, durante 16 horas seguido de un pulso de 1 hora con 0,1 \muCi de [^{14}C]-leucina. Las células se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio utilizando un recolector de células (Skaron), se lavaron con agua, se secaron con etanol y se contaron. Los efectos citotóxicos/citostáticos sobre las células se evaluaron mediante un método que sólo difería en que se utilizó un pulso de 1 hora con 0,5 \muCi de [^{3}H]-timidina.

Los resultados demostraron que la r-onconasa y todas las inmunotoxinas de r-onconasa producidas por recombinación y químicamente conjugadas inhibían la síntesis de proteínas (IC_{50} de 10 a 100 pM) y producían efectos citotóxicos/citostáticos en células de linfoma humano. La monensina incrementó la citotoxicidad in vitro del inmunoconjugado hasta una IC_{50} de 0,9 pM. En comparación, los conjugados de LL2 con EDN (ARNasa eosinófila) o con ARNasa A pancréatica (hpanc) resultaron considerablemente menos citotóxicos, con IC_{50} para hLL2-EDN de 70 nM y para hLL2-hpanc superior a 50 nM, respectivamente. La citotoxicidad de los conjugados LL-2 frente a sus proteínas componentes se resumen en la tabla 1.

TABLA 1

1

Los conjugados de hLL2-r-onconasa mostraron resultados similares, con una IC_{50} de 400 a 500 pM al analizarla sobre células Daudi.

Ejemplo 10 Actividad in vivo de r-onconasa y de inmunotoxinas de r-onconasa

Se trataron ratones SCID con enfermedad mínima y con linfoma de Daudi más avanzado con LL2-r-onconasa (100 \mug de QD x 5). Los ratones mostraron una esperanza de vida incrementada del 216% y del 135%, respectivamente.

Claims (5)

1. Proteína de fusión expresada por recombinación que comprende una molécula que presenta la secuencia de ARNasa procedente de Rana pipiens fusionada con el extremo amino-terminal de la cadena ligera de un fragmento de anticuerpo de una cadena (scFv), en la que dicha molécula de ARNasa presenta piroglutamato como residuo N-terminal y dicho scFv es un LL2 scFv.

2. Proteína de fusión según la reivindicación 1, que presenta la estructura ARNasa-línker VL-línker VH.

3. Proteína de fusión según la reivindicación 2, en el que LL2 scFv está humanizado.

4. Composición que comprende una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador farmacéuticamente aceptable.

5. Utilización de una proteína de fusión expresada por recombinación según la reivindicación 1 ó 2, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de linfoma.