JPH07506338A - 細胞毒性剤治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 惧且聾 本発明は、主に、選択された細胞をターゲットとすることが可能な細胞毒性剤、 および、特に、ガンの治療に使用される薬剤の作用に関する。

ガンのほとんどの形態は、初期の段階で体内に分散している傾向にあり、ガン治 療の最終目標は、好ましくはホストシステムに重大な毒性を示すことなく、ガン の除去を達成することである。細胞毒性剤を組み合わせると、比較的一般的では ないガンの狭い範囲においては冶瘉性が証明されているが、単独の細胞毒性剤お よびそれらの組み合わせでは、肺、胸、結腸、直腸、すい臓、前立腺などの一般 的なガン患皆にはほとんど、主な治療効果が見られないものである。

細胞毒性剤は、消化管の上皮および造血組織等の細胞再生を活性化する正常の組 織に影響を及ぼすため、断続的な投与スケジュールで投与されることのみ可能で ある。細胞毒性物質の影響からこれらの正常な組織を回復させるために必要な、 投与処理の中断期間は、細胞毒性剤の投与期間よりも、より長い傾向にある。

細胞分裂において含有される物質が、細胞毒性剤の最も一般的なターゲットであ り、これらのなかには、ＤＮＡおよびＲＮＡの基礎成分である、ヌクレオチドの 合成において含有される物質がある。リボヌクレオチドレダクターゼ、ジヒドロ フオレートレダクターゼ、およびチミジンシンセターゼ酵素が、典型的なターゲ ットである。ジヒドロ葉酸還元酵素は食物要因、葉酸に一作用し、活性補酵素、 ５，１０−メテニルテトラヒドロフオレートを合成するものである。この補酵素 は、ＤＮＡ合成に必要とされるピリミジンのそれを含有する種々の合成において ｌ炭素転移（カーボントランスファー）に必要である。広く使用されている薬剤 、メトトレキサート　（２，４−ジアミノ−Ｎ１０−メチルプテロイルグルタミ ン酸）は、活性テトラヒドロフオレートの再生を妨げ、ＤＮＡ合成を中断させ、 ＤＮＡが複製される細胞サイクルのＳフェーズに入る細胞を死に至らしめる、ジ ヒドロ葉酸還元酵素に、強力に結合することにより作用する。メトトレキサート は一般的にはたとえば、サイアナミドインコーポレーション（Ｃｙａｎａｍｉｄ 　Ｉｎｃ、）から入手可能である。

トリメトレキサート薬剤（ＮＳＣ３５２１２２；２，４−ジアミノ−５−メチル −６−［３，４，５−）リメトキシアニリノメチル］キナゾリン）もまた、ジヒ ドロ葉酸還元酵素に結合することにより作用する。ただし、メトトレキサートは フオレートレセプタを経由して細胞に入るが、トリメトレキサートは他のメカニ ズムによって入るものである。トリメトレキサートの合成は、ベーカー（１９６ ７）による、デザイン　オブ　サイトーディレクティソド　イリバーシブルエン ザイム　インヒビターズ、ワイレイ、ニューヨーク、および、エルスレーガーら （１９７４）による、レクチャーズ　イン　ヘテロサイクリック　ケミストリ、 ２巻、９７１５　１３３ページ（キャッスル　アンド　タウンセンド）に開示さ れている。トリメトレキサートは一般には、ＵＳ　バイオサイエンシーズ、ワン 　タワー　ブリッジ、１００フロント　ストリート、スート４００、ウェスト　 コンショホノケン、ＰＡ　１９４２８、米国がら、入手可能である。

メトトレキサートは、カルボキシペプチダーゼＧ２により切断可能な、末端グル タミン酸部を有する点で、天然フオレート　（ｆｏｌａｔｅ）に類似している。

一方、トリメトレキサートは、この酵素の作用を受けにくいものである（バノグ シャウ（１９８５）　クリニカル　ラジオール、３６巻、５４５−５５１ページ ）。

我々は以前に、インビトロで腸ガン細胞におけるトリメトレキサートの作用が、 酵素カルボキシペプチダーゼＧ２を分解するフオレートの培地に添加することに より増強可能であることを報告した（シールらによる文献：５ｅａｒｌｅ　ｅｔ ａｌ　（１９９０）バイオケミカル　ファーマコロジー、３９巻、１７８７−１ ７９１）。我々はまた、この酵素が、抗体または抗体フラグメントに接合したと き、活性を維持することを示した（シールらによる文献：５ｅａｒｌｅ　ｅｔａ ｌ　（１９８８）Ｂａｃｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、５３．３７７−３８４）。

メトトレキサートおよびトリメトレキサ−１・の双方の生物学的効果は、それら がブロックする反応の最終生成物を投与することにより、またはフォリン酸［５ −ポルミルテトラヒドロ葉酸］として知られているより入手可能な類似体により 、逆転させることが可能である。フォリン酸は広く入手可能であり、たとえば、 シアナミド　インコーポレーション、また、ウェルカム　インコーポレーション およびファルミタリアからロイコボリン（Ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）として、入手 可能である。フォリン酸が、メトトレキサートまたはトリメトレキサートどとも に十分な投与量で投与されると、これらの作用がブロックされる。フォリン酸を 、定められた時間で制９１１された投与量で、メトトレキサートとともに使用す ると、ある種のガンの治療に有用であることが見いだされている。メトトレキサ ートーフォリン酸の組み合わせは、ある種のガンに対しては、メトトレキサート 単独と比較して、治療率の向上が可能であり、一般的には、レスキューセラビー として知られているものである。ある種のガン細胞よりもより容易に正常なりロ ーン発生細胞を救うことは、フォリン酸の能力に依存するようである。ある実施 例は、ある種の栄養芽腫ようの治療に際して、メトトレキサートとフォリン酸を 使用して成功している（文献：Ｂａｇｓｈａｗｅ　ｅｔ　ａｌ　（１９８９）Ｂ ｒ　ｉｔ、Ｊ、ｏｂ、＆　Ｇｖｎａｅｃｏｌ、）ｏ　しかしながらこのアプロー チは、ガンの制限された範囲でのみ有用であることが証明されており、正常な細 胞を保護するのに必要なフォリン酸の濃度Ｘ時間もまた、アンチ−フオレートの 作用からある種のガン細胞を保護するようである。

さらに、アンチ−フオレートの作用の持続性が細胞毒性度を決定することが示さ れているため、メトトレキサート（ＭＴＸ）を長期間連続して投与するとより優 位ではある一方、このようなフォリン酸の使用においては、メトトレキサー）　 （ＭＴＸ）の断続投与が必要となる。類似のことが、他の細胞毒性剤にもいえる 。

本発明によれば、ターゲット細胞特異性部と、未変性状態において細胞毒性剤の 効果を抑制可能な物質を、前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に変 換することの可能な不活性部とからなる、化合物を提供する。

不活性部は、直接的または間接的に不活性であってもよい。

゛直接的に不活性゛°とは、その部分自体が、たとえば、それに結合することに より、またはそれを不活性な形態に変換することにより、前記物質を不活性にす ることができることを意味する。

′°間接的に不活性′°とは、ターゲット細胞にその部分を送達すると、細胞毒 性剤が不活性となることを意味する。たとえば、その部分は、核酸、ＤＮＡまた はＲＮＡのいずれかであってもよく、これは、たとえばそれに結合することによ り、またはそれを不活性な形態に変換することにより、前記物質を不活性にする ことができるポリペプチドをコード化するものである。

前記ポリペプチドは、細胞内的に発現されても、細胞表面に発現されても、また は細胞から分（シされてもよい。゛ポリペプチド°°とは、タンパク質および糖 タンパク質を含有する。

好ましくは、不活性部は、酵素的活性部である。

細胞毒性剤の効果を°゛抑制°“する物質は、ターゲット細胞を破壊する細胞毒 性剤の能力を、有用な範囲にまで減少させるものである。好ましくはこの能力は 、実質的にゼロまで減少させるものである。同様に、不活性部は、有用な範囲ま で抑制し、好ましくは実質的にゼロにまで減少させるものである。

ターゲット細胞−特異性部により認識されたエンティティ　（ｅｎｔｉｉｙ）は 、腫よう細胞、ウィルス感染細胞、病原性微生物、遺伝子治療の一部として導入 された細胞、または特別な理由から破壊したい生態の正常細胞により、発現され る、適当なエンティティならばなんでもよい。エンティティは好ましくは、他の 治療手段により機能的に置換できないホストの正常組織においてよりも、破壊さ れるべき細胞内または細胞上において、より濃度が高い状態で、ターゲット部に 近づきやすいまたは存在するべきものである。ガン細胞により発現されたターゲ ットの使用は、たとえば、内分泌組織または器官に等しくまたはより多く発現さ れることにより阻害されなくなるものである。存命状態においては、器官が犠牲 にされるが、その機能は、たとえば、テストの場合には、生存に本質的ではない 、またはホルモン置換治療により供給可能なもののいずれかである。このような 考え方は、たとえば、甲状腺、副甲状腺、副腎皮質、および卵巣に適用される。

認識されるエンティティはしばしば、抗原である。腫よう一接合抗原は、これら が細胞膜上に発現されるときまたは腫よう外細胞流動体に分泌する時、抗体用タ ーゲットに加わるものである。

”腫よう”とは、肺、肝臓、血液細胞（白血球）、皮膚、すい臓、結腸、前立腺 、子宮、または胸の腫ようを含有する、腫よう性細胞成長の形態をいう。

抗原−特異性部は、全抗体（通常、便宜上、特に、モノクローナル抗体）、それ らの部分（たとえばＦａｂフラグメントまたはＦ　（ａｂ’　）２）　、または 合成抗体またはそれらの部分であってもよい。抗体の部分のみからなる接合体は 、血液からのクリアランスの速度を見積ることによってより優位であり、Ｆｃ部 による非特異的結合を受けにくくなる可能性がある。選択された抗原に対する適 当なモノクローナル抗体は、公知の技術、たとえば、”モノクローナル　アンチ ボディーズ：ア　マニュアル　オブ　テクニックス”、Ｈ，シラ（ＣＲＣプレス 、１９８８）および、°゛モノクローナルハイブリドーマ　アンチボディーズ： テクニノクス　アンド　アプリケーションズ＋、Ｊ、Ｇ、Ｒ，ハーレル（ＣＲＣ プレス、１９８２）により調製可能である。本明細書に記載されたすべての文献 は、本明細書に組み入れられているものである。二特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉ ｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は、細胞融合、−価フラグメントの再連合、ま たは全抗体の化学交差結合により調製可能であり、得られた二特異性抗体の一部 は細胞特異性抗原に向い、池のものは酵素に向かう。この二特異性抗体は、酵素 に結合して投与しても、または、まず抗体が投与されて次いで酵素が投与されて もよい。二特異性抗体がまず投与され、腫よう細胞に局在化した後、酵素が、腫 よう局在化抗体により捕えられるように投与されるのが好ましい。二特異性抗体 の調製方法は、コルバランらによる文献：（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕ ｎ。

１、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２４，１２７−１３２、および１３３−１３７、お よび１３８−１４３、およびギルスラントらによる文献：　（１９８８）Ｐｒｏ ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８５．７７１９−７７２３に開示されてい る。

抗体の可変型（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）領域は、抗原認識に含有される。

この事実は、プロテアーゼ消化実験により最初に認識されたものであり、さらに 、げっ歯頚抗体の”ヒューマニゼーション”により確信された。げっ歯頚由来の 可変領域は、得られた抗体がげっ歯頚源抗体の抗原特異性を保持するような、ヒ ト由来の定常領域に融合可能である（モリワンらによる文献：　（１９８４）Ｐ ｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８１．６８５１−６８５５） 。

抗原特異性は可変領域により与えられ、定常領域に依存しないことが、１以上の 可変領域を含有する抗体フラグメントのバクテリアの発現に関する実験から知ら れている。これらの分子は、Ｆａｂ状分子（ペターら（１９８８）サイエンス　 ２４０．１０４１）：Ｆｖ分子（スケグら（１９８８）サイエンス　２４０、１ ０３８）；単鎖Ｆ　ｖ　（Ｓ　ｃ　Ｆ　ｖ）分子、ここでｖＨとＬＨパートナ− 領域は、フレキシブルなオリゴペプチドを介して結合する（バードら（１９８８ ）サイエンス　２４２．４２３：ヒユーストンら（１９８８）による文献：Ｐｒ ｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、米国、８５．５８７９）および、単 離されたＶ領域からなるシングル領域抗体（ｄＡｂｓ）　（ワードら（１９８９ ）ネーチャー　３４１．５４４）を含有する。特異結合部位を保持する抗体フラ グメントの合成において含有される一般的な技術は、ウィンター及ミルスティン （１９９１）ネーチャー　３４９，２９３−２９９に記載されている。

゛５ｃＦｖ５ｃＦｖとは、ｖＨおよびＶＬパートナ−領域がフレキシブルなオリ ゴペプチドを介して結合する分子を意味する。

全抗体よりもむしろ抗体フラグメントを使用すると何倍もの優位点が得られるも のである。フラグメントがより小さいサイズであると、固体組織の良好な浸透性 などの、良好な薬理特性を示すことが可能となる。相補結合などの全抗体のエフ ェクター機能が除去される。Ｆａｂ、Ｆｖ、５ｃＦｖ、およびｄＡｂフラグメン トは全て、発現されて、大腸菌から分泌可能であり、これによって、大量の前記 フラグメントが容易に製造可能となる。

フラグメントは、部位を結合する１つのみの抗原を有する１価である。Ｆ（ａｂ ’）２フラグメントを製造するための完全な免疫グロブリンの断片化（ｆｒａｇ ｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、ハルウッドら　（１９８５）による文献：Ｅｕｒ、Ｊ 、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｌ１ｎ、０ｎｃｏ１．２１．１５１５−１５２２に開示され ている。

ＩｇＧクラス抗体が好ましい。

また、認識されるエンティティは、抗原性であってもなくてもよいが、認識可能 で、他の方法で選択的に結合可能なものである。たとえば、メラノーマ細胞にお いて多く発現されるメラノシトー刺ｊ敏ホルモン（ＭＳＨ）用レセプタなどの特 性細胞表面レセプタであってもよい。細胞特異性部は、たとえば、メツセンジャ として、または、細胞表面酵素用物質またはその類似体として、非免疫センスに おいて、特異的にエンティティに結合する、化合物またはその一部である可能性 がある。

ウィルス直接酵素プロドラッグ治療（ＶＤＥＰＴ）が、プロドラッグを細胞毒性 剤に変換可能な酵素を選択的に発現するために、正常な細胞と腫よう性細胞との 転写差異を用いて腫よう性細胞を選択的に殺すとして記載されている（ハーバ− らの文献（１９９１）：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、米国８８．８ ０３９−８０４３）。

同様に、正常な細胞と腫よう物性の細胞との転写差異は、ここに開示されたイン ヒビター物質を不活性にすることの可能な酵素の発現を選択的に行うのに使用可 能である。酵素は腫よう細胞により分泌されることが好ましく、これによって、 インヒビター物質が自由に不活性となるものである。

細胞間の転写における差異は、組織特異性プロモータと関連づけることが可能で あり、または、腫よう性状態におけるアクティベータまたはレプレッサ分子の変 化によるものである可能性がある。したがって、ある実施例においては、肝臓関 連アルブミン転写調節配列が、肝細胞ガン腫を有する患者の治療において、酵素 を含有するインヒビター不活性タンパク質を発現するのに有用である。正常な細 胞と腫よう性細胞とのさらなる転写差異は、常に発見されており、これらの差異 の多くは、本発明の方法において開発可能であると考えられる。

ターゲット細胞に対して遺伝子構成物を送達するのに適当な組み替え、複製−欠 陥レトロウィルス（すなわち、プロモータプラス遺伝子コード化インヒビター不 活性タンパク質）が開示されている（（ハーバ−らの文献（１９９１）：Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、米国８８．８０３９−８０４３）。

ウィルスまたは他の核タンパク質粒子、またはリポソームは、間接的に不活性部 を前記細胞に送達するのに適当なターゲット細胞−特異性部を提供可能である。

インヒビター不活性タンパク質は、前記インヒビターを不活性形態に代謝可能な 酵素であってもよいし、また、前記インヒビターと結合可能で不活性にすること の可能なタンパク質であってもよい。

腫よう関連抗原に対する抗体およびそれらのフラグメントに関して、かなりの研 究が既に行われており、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）に対する抗体またはそれらの フラグメント、および、ヒトじゆう毛性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）に対する抗体 またはそれらのフラグメントは、カルボキシペプチダーゼＧ２に接合可能で、得 られた接合体は、抗原結合および触媒機能の双方を保持しているものである。

これらの接合体を静脈注射した後、これらはそれぞれ、ＣＥＡまたはｈＣＧ発現 腫ように局在する。他の抗体は、対応する抗原を発現する腫ように局在すること が知られている。これらの腫ようは、ヒトにおける原発性転移直腸ガン（ＣＥＡ ）およびじゆう柔性ガン腫（ｈＣＧ）、またはその他の形態のガンである可能性 がある。このような抗体−酵素接合体はまた、各々の抗原を発現する正常組織に 局在可能であるが、抗原発現は、正常組織においてより分散するものである。こ のような抗体−酵素接合体は、各々の抗原を介して細胞膜に結合可能であり、ま たは細胞間に分泌された抗原によりトラップ可能である。

腫よう関連、免疫細胞関連、および感染薬剤関連抗原の例を表１に示す。

紅 上−ｍ陵１仄爪 人里　人生　便里 ガン胎児性抗原　１ｃ４６（アメルシャム）　結腸／直腸腫ようの１８５Ａ１２ （ユニパス）　イメージング＆セラピー胎盤アルカリ　Ｈ１７Ｅ２　（ＩＣＲＦ 、　精巣および卵巣ガンのホスファターゼ　トラベラーズ＆ボドマー）　イメー ジング及セラビーパン　ガン腫　ＮＲ−ＬＵ−１０（ネオラ　小細胞肺ガンを含 有する（Ｐａｎ　ノクスコーポレーション）　種々のガンのイメージンＣａ　ｒ ｃ　ｉ　ｎｏｍａ）　グ＆セラビー多形性上皮ムチン　ＨＭＦＧＩ（ティラー　 卵巣ガン、胸膜流出の（ヒト乳脂肪小球）　ババジミトリオウ、　イメージング ＆セラビーＩＣＲＦ） β−ヒトじゆう上膜　Ｗ１４　ヌードマウスにおけるヒゴナドトロピン　ト異種 移植片に対する酵じゆう毛ガン　素（ＣＰＧ２）　（シールら（１９８１）　Ｂ ｒ、　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　４４．１ ヒトガンにおける　Ｌ６　（ＩｇＧ２ａ）１　アルカリホスファターゼ炭水化物 　のターゲツティング（セ ンサーら（１９８８） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８５．４８４２−４８４ Ｂリンパ球における　ＩＦ５　（ＩｇＧ２ａ）２　アルカリホスファターゼＣＤ ２０抗原　のターゲツティング（セ（正常および新生物性）　ンサーら（１９８ ８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８５．４８４２−４８４ １　ヘルストロームら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４６．３９１７２　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８２．１７６６−１７７０他の抗原と しては、アルファフォエトプロテイン（ａｌｐｈａｆｏｅＬｏｐｒｏＬｅｉｎ） 、Ｃａ−１２５および前立腺特異性抗原が含まれる。

Ｉ−免斑槻血人里 パンＴリンパ球表面　０ＫＴ−３（オルソ）　腎臓移植用抗拒絶反応治療抗原（ ＣＤ３） Ｂリンパ球表面抗原　ＲＦＢ４　（シャツシー、Ｂ細胞リンパ球の免疫毒性（Ｃ Ｄ２２）　ローヤル　フリー　治療ポスピタル） パ〉Ｔリンパ球表面　Ｈ６５（ボドマー、ノー　慢性関節リウマチ、ホスト抗原 （ＣＤ５）　レルズ　ＩＣＲＦ、　疾思に対する急性移植の免ゾーマコーボレン ヨン、疫毒性治療 米国にライセンス有り） Ｊ−３５１電［」４４及里 ムンプスビール　アンチ−ムンプス　ムンプス治療用ジフテリアスー関連　ポリ クローナル抗体　毒に接合した抗体Ｂ型肝炎表面抗原　アンチＨＢｓ　Ａｇ　へ バトームに対する免疫毒性 ａ、＋、う関連抗原に対する抗体との接合体の投写の前：こ、腫よう部位におけ る抗原の発現を増加させることが優１ヶである。というのは、これによって、腫 よう部位に保持されている接合体の量を増加させることが可能であるからである 。いくつかの薬剤は、腫よう壊死ファクタ（ＴＮＦ）（フォルシらによる文献（ １９８８）：Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４８．３６０７−３６１２）およびインタ ーフェロン（ボーデンの文献（１９８８）：Ｊ、Ｎａｔ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ ｔ、８０．１４８−１４９）を含有する抗体取り込みを増加させることが可能で あるとされている。

したがって、腫よう細胞抗原の発現を、本発明の化合物の投与前または投与中、 １以上の薬剤を使用して促進することが好ましい。

抗体、抗体フラグメントの取り込み、またはそれらの種々の取り込みもまた、毛 細管透過性を変えることにより、または、腫よう血流の変化による血管作用性剤 により、変更可能である。このような薬剤としては、ヒスタミンおよびインター ロイキン−２（ヘニガンらによる文献：　（１９９１）Ｂｒｉｔ、Ｊ、Ｃａｎｅ ｅｒ　６４．８７２−８７４））、フラボン酢酸（ビビーらによる文献：（１９ ８９）Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　８１．２１６−２１ ９）が挙げられるが、保護代謝物により腫よう部位の透過を阻害する、または腫 よう部位における酵素保持の増加を助力するように、腫よう血流または毛細管透 過性を変化させるのに、他の薬剤も使用可能である。

したがって、腫よう血流を、本発明の化合物の投与中、または投与前に、１以上 の薬剤を用いて変化させることがさらに好ましい。

未変性状態で細胞毒性剤の効果を阻害することの可能な物質は、前記細胞毒性剤 における効果をより示さない物質に変換可能である、十分に無毒な物質であって もよい。適当な化合物は、フォリン酸である。フォリン酸は、たとえばジヒドロ フォレートレドクターゼ酵素に作用する、トリメトレキサート細胞毒性剤の生物 学的効果を逆にするものである。フォリン酸は、脱グルタミン化されて、カルボ キシペプチダーゼＧ２および他の脱グルタミン化酵素により、トリメトレキサー トに対して不活性にするものである。

同様の原理が、他の抗細胞毒性剤に対しても適用可能である。たとえば、チミジ ンは、チミジレートシンセターゼ酵素に作用する、ＣＢ５７１７およびＩＣＩ　 Ｄ１６９４　（ジョドレルらによる文献：　（１９９１）ＢＪＣ６４，８３３− ８：ジョーンズらの文献（１９８６）：Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、２９．４６８− ４７２）などの細胞毒性剤の効果をブロックする。したがって、チミジン分解酵 素（たとえばジヒドロチミン　デヒドロゲナーゼ、シオタニおよびウニバーによ る文献（１９８１）：Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６．２１９−２２４）、ま たはチミジンキナーゼ（シオタニらによる文献（１９８９）：ＣａｎｃｅｒＲｅ ｓ、４９．１０９０−１０９４＞　）が、細胞毒性剤に肘して、チミジンを効果 的でなくするため、本発明の化合物の不活性部として使用可能である。

同様の考え方が、ＤＮＡまたはＲＮＡへのヌクレオチド取り込みの正常なプロセ スを妨げる、他の薬剤に関しても適用される。というのは、腫よう部位をターゲ ットとする適当な酵素により次いで分解可能である正常な代謝物によって、この 取り込みは可逆的であるからである。

たとえば、広く使用されている細胞毒性５−フルオロウラシル（ロノシュブロダ クソ　インコーポレーションから入手可能）の細胞期性効果は、少なくとも部分 的にウリジンにより減することが可能である（グロアニンゲンらによる文献：　 （１９８９）Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、８１．１５７−１６２） 。ウリジン分解酵素と抗腫よう抗体の接合は、５−フルオロウラシルおよびウリ ジンとの接合において使用可能である。このような組み合わせは特に、５−フル オロウラシルが最も効果的な細胞毒性剤の１つであるため、直腸および肺ガン腫 に関連するものである。このような薬剤の組み合わせは、５−フルオロウラシル の細胞毒性を増すフォリン酸と、またはさらには、チミジンおよびチミジン不活 性酵素と組み合わせることが可能である。

この化合物の不活性部は、抗細胞毒性剤物質に関して選択される。

カルボキシペプチダーゼＧ２以外の酵素およびその等個体が使用可能である。

これらは、ターゲットとした代謝物に特異的であるべきであるが、ヒトまたは非 ヒト起源のものであってもよい。

従来の酵素を使用することは必ずしも必要ではない。触媒能力を有する抗体が開 発されており　（トラモンタノら、サイエンス　２３４．１５６６−１５７０＞ 、°゛アブザイムａ　ｂ　ｚ　ｙｍｃ　ｓ）　”として知られている。これらは 、ヒューマナイズさせて免疫原性を減少させることが可能であるという優位性を 有する。

ヒトリンパ球から誘導され、チミジンを分解可能な酵素が、開示されている（シ オタニらによる文献：　（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４９．１０９０− １０９４）。ジヒドロチミン　デヒドロゲナーゼおよびチミジン　キナーゼが、 チミジン　シンセターゼのインヒビターとともに使用される、ここに開示されて いるようなタイプのシステムにおいて使用可能である。

チミジン分解およびリン酸化酵素が、チミジン再利用経路をブロックすることに より、ここに開示されているようなアンチ−フオレート治療におけるさらなる要 素として使用可能である。これらはまた、細胞毒性剤、５−フルオロウラシルを 用いたウリジン触媒酵素とともに使用可能である。

細菌酵素、カルボキシペプチダーゼＧ１およびＧ２　（ＣＰＧＩおよびＣＰＧ２ ）は、末端グルタミン酸の切断により、メトトレキサートを含有するフオレート を分解する。これら２つの酵素の作用は、同じであると考えられる。本発明の好 ましい例は、ＣＰＧ２に関するものであるが、ＣＰＧ　１にも同様に適応可能で あり、同じ物質に作用する他の酵素にも、同じ物質に作用するアブザイムにも、 適用可能である。

プソイゾモナスｓｐ１株Ｒ５−１６からのカルボキシペプチダーゼＧ２の単離、 精製、およびいくらかの特性が、シェルウッドらの文献：　（１９８４）Ｅ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４８．４４７−４５３に開示されている。前記カルボキ シペプチダーゼＧ２をコード化する遺伝子のクローン化、そのヌクレオチド配列 、およびその大腸菌における発現は、ミントンらによる文献：　（１９８４）Ｇ ｅｎｅ３１．３１−３８およびミントンらによる文献：　（１９８３）Ｊ、Ｂａ ｃｔｅｒｉａｌ、１５６．１２２２−１２２７に開示されている。ＣＰ’２Ｇ２ は、バイオテクノロジ部、七ンター　オブ　アプライド　ミクロバイオロジカル 　リサーチ、ポートンダウン、サリスバリ、英国から入手可能である。カルボキ シペプチダーゼＧｌ　（ＣＰＧＩ）は、チャブナ−らによる文献：　（１９７２ ）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、３２．２１１４−２１１９に開示されている。

化合物の不活性部が、酵素的に活性部である場合には、細胞特異性部からの単離 の際に、酵素的に活性であるが、（ａ）細胞特異性部と組み合わせる、および（ ｂ）化合物がターゲット細胞に接着または隣接するとき、酵素的に活性となるこ とが必要である。

本発明の化合物の２つの部分は、オスリヴアンらによる文献：　（１９７９）Ａ ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１００．１００−１０８に一般的に記載されているよ うな、ポリペプチド架橋の常法により、ともに結合可能である。たとえば、抗体 部には、チオール基が多く存在し、酵素部は、たとえば、ヨード酢酸（ＮＨＩＡ ）またはＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ ＳＰＤＰ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの、これらのチオール 基と反応可能な二官能性剤と反応することが可能である。たとえばｍ−マレイミ ドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの、アミドおよび千 オニステル結合は、一般的に、ジスルフィド結合よりも生体内でより安定である 。

酵素全体が、本発明の化合物に存在する必要はがならずしもないが、無論、触媒 部は存在しなければならないものである。

または、化合物は、ＤＮＡ組み替え法により融合化合物として製造可能であり、 ここで、ＤＮＡの長さは、互いに隣接する本発明の化合物の２つの部分をコード 化する各々の領域からなり、化合物の所望の特性を破壊しないリンカ−ペプチド をコード化する領域により分離される。考えられるところでは、本願化合物の２ つの部分は、全体的に、または部分的にオーバーラツプ可能である。融合体の抗 体成分は、少なくとも１つの結合部位により表される。抗体（または抗体フラグ メント）−酵素融合体の構成例は、ノイベルガーらによる（１９８４）ネイチャ ー　３１２．６０４により開示されている。

ＤＮＡは次いで、本発明の化合物からなるポリペプチドを製造するため、適当な ホストに発現される。本発明の化合物からなるポリペプチドをコード化するＤＮ Ａは、ここに含有された教示を考慮して適当に変更された公知の方法にしたがっ て発現ベクターを構成すべく使用可能である。この発現ベクターは次いで、本発 明のポリペプチドの製造と発現用の適当なホスト細胞に形質転換するのに使用さ れる。このような方法は、以下の文献ニラツタ−らによる１９８４年４月３日付 けの米国特許第４４４０８５９号、バイスマンによる１９８５年７月２３日付け の米国特許第４５３０９０１号、クロールらによる１９８６年４月１５日付けの 米国特許第４５８２８００号、マークらによる１９８７年６月３０日付けの米国 特許第４６７７０６３号、ゴードレルによる１９８７年７月７日付けの米国特許 第４６７８７５１号、イタクラらによる１９８７年１１月３日付けの米国特許第 ４７０４３６２号、マレイによる１９８７年１２月１日付けの米国特許第４７１ ０４６３号、ツール、Ｊｒ、らによる１９８８年７月１２日付けの米国特許第４ ．７５７００６号、ゴエデルらによる１９８８年８月２３日付けの米国特許第４ ７６６０７５号、およびスタルカーによる１９８９年３月７日付けの米国特許第 ４８１０６４８号、に記載されたものを含むものであり、これらは全て、ここに 参照されるものである。

本発明の化合物からなるポリペプチドをコード化するＤＮＡは、適当なホストに 導入するための他の種々のＤＮＡ配列に結合可能である。これらの他のＤＮＡ　 （ｃｏｍｐａｎｉｏｎ　ＤＮＡ）は、ホストの特性、ＤＮＡのホストへの導入方 法、およびエビソーム保持または組み込みが所望であるがいなかに依存する。

一般的には、ＤＮＡは、プラスミドなどの、発現の正しい読み枠と正確な方向で 、発現ベクターに挿入される。必要であれば、ＤＮＡは、所望のポストにより認 識された、適当な転写および翻訳調節ヌクレオチド配列に結合可能であるが、こ れらの調節は一般的には、発現ベクターに有用である。このベクターは次いで標 準法によりホストに導入される。一般的には、全てのホストがベクターにより形 質転換されるわけではない。したがって、形質転換されたホスト細胞用に選択す ることが必要である。ある選択法によれば、抗生物質耐性などの、形質転換され た細胞における選択可能な形質用にコード化する、必要な調節エレメントととも に発現ベクターにＤＮＡ配列を組み入れるものである。またぼ、選択可能な形質 用遺伝子が他のベクターに存在可能であり、このベクターは、所望のホスト細胞 を同時形質転換するために使用されるものである。

本発明の組み替えＤＮＡにより形質転換されたホスト細胞は次いで、回収可能な ポリペプチド発現を許容するため、ここに記載された教示によって、当業者に公 知の適当な条件下、十分な時間、培養された。

バクテリア（たとえば大腸菌および枯草菌）、酵母菌（たとえばサツカロミセス 　セレヴイジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸 状菌（たとえばアスペルギルス）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞全含む、 多くの発現システムが知られている。

ベクターは、たとえベクターが、他の非原核細胞タイプにおける発現に使用され るべきものであっても、Ｃｏ１Ｅｌ　ｏｒｉなとの、原核における伝播用原核レ プリコンを含有する。ベクターはまた、それを用いて形質転換された、大腸菌な どの、細菌性ホスト細胞における遺伝子の発現（転写および翻訳）原核プロモー ターなどの適当なプロモーターを含有可能である。

プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と転写がおこることを許容するＤＮ Ａ配列により形成された発現調節エレメントである。典型的な細菌性ホストと適 合可能なプロモーター配列は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に 関して有利に制限された部位を含有するプラスミドベクターに存在するものであ る。

典型的な原核ベクタープラスミドは、バイオラド　ラボラトリーズ（リノチモノ ド、ＣＡ、米国）から入手可能な、ｐＵｃ＋８、ｐＵｃ１９、ｐＢＲ３３２、お よびｐＢＲ３２９、ファルマシア、ビスカタウエイ、ＮＪ、米国から入手可能な ｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３である。

典型的なは乳類細胞ベクタープラスミドは、ファルマシア、ビス力タウエイ、Ｎ Ｊ、米国から入手可能なｐｓｖｔ、である。このベクターは、クローン化された 遺伝子を発現させるために、ＳＶ４０後期プロモーターを使用し、発現の最高レ ベルは、ＣＯ５−１細胞などのＴ−抗原形成細胞において見られるものである。

誘導可能なは乳類発現ベクターの例は、ｐＭＳＧであり、これもまたファルマシ アから入手可能である。このベクターは、クローン化された遺伝子を発現するた め、マウスは乳類腫ようウィルス長末端重複のグルココルチコイド誘導性プロモ ーターを使用する。

有用な酵母菌プラスミドベクターは、ｐＲ５４０３−４０６およびｐＲ５４１３ −４１６であり、一般的には、ストラタジーン　クローンニング　システムズ、 ラ　ジヨウ、ＣＡ　９２０３７、米国から入手可能である。プラスミドｐＲ８４ ０３、ｐＲ５４０４、ｐＲ３４０５およびｐＲ５４０６は、イースト　インチグ レーティング　プラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母菌選択可能な標識ｈｉｓ３ 、ｔｒｐｌ、Ｉｅｕ２、およびｕ　ｒ　ａ　３を取り込んでいる。プラスミドｐ Ｒ５４１３−４１６は、イースト　セントロメール　プラスミド（ＹＣｐｓ）で ある。

相補的付着末端を経由してＤＮＡをベクターに結合させるために、種々の方法が 開発されている。たとえば、相補的ホモポリマートラクトは、ベクターＤ’ＮＡ に挿入されるべきＤＮＡセグメントに添加可能である。ベクターおよびＤＮＡセ グメントは次いで、組み替えＤＮＡ分子を形成するため、相補的ホモポリマー末 端間における水素結合により結合する。

１以上の制限部位を含有する合成リンカ−は、ＤＮＡセグメントをベクターに結 合させる他の方法を提供する。上記したようなエンドヌクレアーゼ制限消化によ り得られたＤＮＡセグメントは、３’　−５’　−エキソヌクレオリテインクな 活性を有する３゛−シングル鎖末端の突出を除去し、重合活性を有する凹んだ３ ゜−末端を埋める酵素、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■またはバクテリオファージ Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理される。

これらの活性の組み合わせはしたがって、平滑断１ＤＮＡセグメントを形成する 。平滑断端セグメントは次いで、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼなどの 平滑断端ＤＮＡ分子の連結反応を触媒することの可能な酵素の存在下、過剰モル のりンカー分子でインキュベートされる。この反応により得られたプロダクトは 、末端において重合性リンカ−配列を運ぶＤＮＡセグメントである。これらのＤ ＮＡセグメントは次いで、適当な制限酵素により分解され、ＤＮＡセグメントの それらと適合する末端を製造する酵素で既に分解された発現ベクターに結合する 。

種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカ−は、たとえばインタ ーナショナル　バイオチクノロシーズ　インコーポレーション、ニューヘブン、 ＣＮ、米国等、種々のところから商業的に入手可能である。

本発明のポリペプチドをコード化するＤＮＡを修飾する所望の方法は、サイキら （１９８８）、サイエンス　２３９．４８７−４９１に記載されたようなポリメ ラーゼ鎖反応を使用することである。

この方法においては、酵素的に増殖するＤＮＡは、それ自身が増殖したＤＮＡに 取り込まれる２つの特異性オリゴヌクレオチドプライマーに隣接する。前記特異 性プライマーは、常法を用いて、発現ベクターへのクローン化に使用可能な制限 エンドヌクレアーゼ認識部位を含有可能である。

本発明の実施において有用であると考えられる酵母菌の典型的な属は、ビシア（ Ｐｉｃｈｉａ）、サツカロミセス、クルイブエロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒ。

ｍｙｃｅｓ）、カンジダ、トルロプシス、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、 シゾサツカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）　、シテロミ 七ス（Ｃｉ　ｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）　、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）　 、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）　、メトシュニコビア（Ｍｅｔｓｃ ｈｕｎｉｋｏｗｉａ）、ロドスボリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｒｎ） 、ロイコスボリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ボトリオアスクス（ Ｂｏｔｒｙ。

ａｓｃｕｓ）、スボリドボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、エンドマイコ ブシス（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓ　ｉ　ｓ）　、などである。好ましい属は、ビシ ア（Ｐｉｃｈｉａ）、サツカロミセス、クルイブエロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒ ｏｍｙｃｅｓ）、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、およびハンセヌラ（Ｈａｎｓ ｅｎｕＩａ）からなる群から選択されたものである。サツカロミセスの例として は、サツカロミセス　セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）、サツカロミセス　イタリクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　１ ｔａｌｉｃｕｓ）、サツカロミセス　ロキシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒ ｏｕｘ　ｉＩ）があげられる。クルイブエロミセスの例としては、タルイブエロ ミセス　フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）および クルイブエロミセス　ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　Ｉａｃｔｉｓ） があげられる。ハンセヌラの例としては、ハンセヌラ　ポリモルファ（Ｈａｎｓ ｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ＞、ハンセヌラ　アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌ ａ　ａｎｏｍａ　Ｉ　ａ）、およびハンセヌラ　カプスアタ（Ｈａｎｓｅｎｕｌ ａ　ｃａｐｓｕ　Ｉ　ａ　ｔ　ａ）があげられる。

Ｓ、七しビジアエ（ｃｅｒｅｖ　ｉ　ｓ　１ａｃ）の形質転換方法は、一般的に は、ＥＰ２５１７４４、ＥＰ２５８０６７、およびＷ１８Ｏ４９，１０６３に教 示されており、これらの文献全ては、ここに組み入れられるものである。

Ｓ、七しビジアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）用の適当なプロモータは、ＰＧＫ１ 遺伝子、ＧＡＬＩまたはＧＡＬＩＯ遺伝子、ＣＹＣｌ、ＰＨ０５、ＴＲＰＩ、Ａ ＤＨｌ、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート　デヒドロゲナーゼ 、ヘキソキナーゼ、ピルベイト　デカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ 、トリオース　ホスフェート　イソメラーゼ、ホスホグルコース　イソメラーゼ 、グルコキナーゼ、α−メーティングファクターフェロモン、およびａ−メーテ ィングファクターフェロモンの遺伝子を連合したプロモーター、ＰＲＢＩプロモ ーター、ＧＵＴ２プロモーター、および、他のプロモーターの５゛調節領域を有 するまたは上流活性部を有する（たとえばＥＰ−Ａ−２５８０６７のプロモータ ）５’ｍｋｒ領域の部分のハイブリッドを含有するハイブリッドプロモーターを 含有する。

転写終結シグナルは好ましくは、ポリアデニル化および転写終用の正確なシグナ ルを含有する真核遺伝子の３゛隣隣接列である。適当な３°隣隣接列は、たとえ ば、使用された発現制御配列に自然に結合した遺伝子のものであってもよく、す なわち、プロモーターに相当するものである。または、これらは、Ｓ、セレビジ アエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨＤＩ遺伝子の終結シグナルが好ましい場合に は、異なっていてもよい。

本発明によればさらに、ホストにおけるターゲット細胞の破壊方法が提供され、 この方法は、ホストに、（ｉ）本発明による化合物、（冒）細胞毒性剤、および 、（ｉ　ｉ　ｉ）未変性状態において前記細胞毒性剤の効果を抑制可能で、前記 不活性部により前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換されるこ との可能な物質を投与することからなる。

好ましくは、本発明の化合物が投与され、一旦、腫ように接合した化合物の絶対 レベルと化合物の正常細胞に対する腫ようの比率との間の最適バランスが生じる と、細胞毒性剤の効果をブロック可能な物質とともに細胞毒性剤が投与される。

しかしながら、他の投与方法も適用可能である。血液で循環する本発明の化合物 の量は、酵素部の活性を測定することにより定めることができる。

好ましくは、本発明は、腫ようを有するは乳類の治療方法を提供する。適当には 、は乳類をまず、本発明による化合物を投与し、ターゲット細胞に結合していな い化合物に対するターゲット細胞に結合する化合物の比率を所望の値にすること により、腫よう治療用に調製する。この方法はさらに、は乳類に、細胞毒性剤、 および、未変性状態に於て前記細胞毒性剤の効果を抑制可能で、前記化合物の不 活性部により前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質を発生可能な、物 質を投与することからなる。

本発明の化合物は、適当な方法で、通常は非経口で、たとえば、静脈内、腹腔内 に、またはぼうこう内に、希釈剤およびキャリアの探準無菌、非発熱原性製剤で 、たとえば等張塩類＋８液（静脈内投与の場合）で投与される。本発明はしたが って、ターゲットガンにより発現された細胞毒性剤の効果から正常組織を保護し つつ、腫よう部位における細胞毒性剤の連続した作用を保持する手段を提供する 。未変性状態に於て細胞毒性剤の効果を抑制可能である物質が、正常な組織を保 護するのに十分な投与レベルで投与される。しかしながら、腫ように至る物質は 、それが細胞に入り、細胞毒性剤から細胞を保護することが可能となる前に、不 活性となる。このように、保護分子は迅速に腫よう部位で分解される一方、正常 な組織は細胞毒性剤の効果から保護される。

細胞毒性剤およびインヒビターは、本発明の化合物用に記載された種々のルート により投与され、経口投与も可能である。

抗体−酵素接合体が、一般的には腫ようにおいてピーク濃度になるのは、２４時 間以内であり、酵素活性は、腫よう部位において７−８日まで存続するものであ る。抗体−酵素接合体はまた、数日間、血液および非腫よう組織において持続す る。非腫よう組織における酵素は、インヒビター物質を分解するため、その保護 効果が減少するかまたはその必要性が増す傾向にある。血液からの酵素のクリア ランスは促進可能であり、または、酵素を、いくつかの方法により腫よう部位に おける酵素レベルを大きく変えることなしに不活性にすることが可能である。

これらの技術は、他の成分に、添加的におよび有用に使用可能である。

抗体−酵素接合体において使用された抗体または抗体フラグメントは、（モリマ ンらの文献（１９８４）：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａａｄ、Ｓｃｉ、米国、８１． ６８５１　６８５５およびリーシュマンらによる文献（１９８８）：ネーチャー 、３３２．３２３−３２７に開示されているように）これらの免疫原性を減少さ せるために゛　ヒューマナイズされることが可能であるが、細菌性酵素ＣＰＧ１ およびＣＰＧ２は、ヒト類似体を有さず、人間において繰り返し使用するために は、免疫抑制または免疫寛容性を誘導する手段を使用するべくまたは免疫原性を 減少させるべくそれらを変性することが望まれる。

抗体−酵素接合体に適用可能な、異質の蛋白質の免疫原性を減少させる方法とし ては、ポリエチレングリコールの形態に接合するものを含有する（ウィルキンソ ンらの文献（１９８７）：Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３９．３２６−３３１）。

または、免疫原性の問題は、免疫サプレッサーまたは免疫寛容誘導剤を投与する ことにより、解決可能することができる。シクロスポリンおよびＦＫ５０６は、 組織移植において免疫抑制を行うために広く使用される薬剤である。シクロスポ リンは、異質の蛋白質へのホスト抗体反応を遅らせることが示されている（レー ダーマンらによる文献（１９，８８）：Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、５８．５６２ −５６６および６５４−６５７）。ホストが、リンパ球におけるＣＤ４エピトー プに向かう抗体を受容後、最初に外的問題に出くわした時の異質蛋白質への許容 が開示されている（ウオルドマンらによる文！　（１９８８＞、１６−３０ペー ジ、プログレス　イン　アレルギー（シザタ　アンド　ゥオクスマン、ニューヨ ーク）。これを達成するためのさらなる手段は、他のところにも開示されており 、異質抗原へのホスト抗体反応の制御において改善がおこるとき、変化可能であ る。触媒抗体（アブジムズ）は、これらの免疫原性を減少または除去するために ゛ヒューマナイズ可能である。

抗体−酵素接合体または抗原に結合した腫ように向かう抗体が、適当な腫ようを 有するホストに投与されると、抗体または接合体の小さいフラクション部のみが 、腫よう部位に局在し、そのほとんどは、数日間、血液中および他の正常組織に 残存する。酵素の腫ようにおける濃度は、正常組織においてよりも高いが、正常 組織の容量はより大きいものである。したがって、正常組織および血液に残存す る酵素の量を最小限にするために、血液から過剰の抗原−酵素接合体を不活性化 してクリアにするための、国際出願８９／１０１４０；バグシャウの文献（１９ ８９）：Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、６０．２７５−２８１；およびシャルマ らの文献（１９９０）：Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、６１．６５９−６６２に 記載された方法とともに、本発明の方法を用いることが望ましい。

ガン撲滅を達成する試みにおいて、腫ようターゲット（骨髄サプレッション）に おける効果は、ここに記載したシステムを用いるとより少なくなると予測される が、造血機能の抑制を妨害することは不可能である。同様に、ある程度の骨髄サ プレッションには、より多くの腫よう効果が予想される。造血組織に作用する成 長ファクタは通常、ここに記載されたシステムと組み合わせて使用可能である。

ここに記載されたシステムは、他の治療形態とともに使用可能である。これらと しては、従来の細胞毒性剤、および１より多い代謝生成物を不活性にするための 多酵素送達の使用を含むものである。

同様に、抗体により腫よう部位に運ばれた酵素は、正常組織を保護する代謝生成 物を不活性にし、かつ、プロドラッグを活性化するために、機能可能である。

ここに記載したようなカルボキシペプチダーゼＧ２は、トリメトレキサートに対 して保護されていない腫よう細胞を残すために、腫よう部位におけるフォリン酸 を不活性にするものである。同様の腫よう局在酵素は、（バグシャウの文献（１ ９８９）：Ｂｒ　ｉ　ｔ、’　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、６０．２７５−２８１に記載 されているように）細胞毒性マスタードを形成すべく、安息香酸プロドラッグを 活性化することが可能である。

むろん、１以上のプロドラッグが活性薬剤に変換され、１以上の保護剤が腫よう 部位において分解されるように、１以上の酵素が、同じ又は異なった抗体により 、腫よう部位に向かうことが可能である。したがって、２以上の酵素が同じ抗体 に結合可能である。

抗体−酵素接合体は一般的には、１２−２４時間以内に腫よう部位において最大 濃度に達し、プラズマおよび他の体液からなくなるのに数日かかるので、抗体− 酵素接合体をクリアにすることを促進し、血液中に存在する特異性酵素を不活性 にするのに、優位であることを示している。達成可能ないくらかの手段が開示さ れている（国際出願８９／１０１４０）。

抗体−酵素接合体をクリアにする、または不活性にするために使用された抗体は 、抗腫よう抗体における抗原結合部位、または酵素の活性部位、または抗原−酵 素接合体における他の部位に向かうことが可能である。このような抗体は、さら なるガラクトース残基または他のクリアランスを促進するために添加された糖を 有することが可能であり、または脱シアル酸することが可能である。抗体のガラ クトシル化によって、肝細胞におけるガラクトースリセプターによる取り込みを 通して、血液からの早急なりリアランスをおこなうこととなる。または、抗体− 酵素接合体がガラクトシル化され、肝ガラクトースリセプターが、アジアローボ ビンの上顎の下の唾液腺のムコ蛋白質または、肝ガラクトースリセブターに向か う抗体、またはガラクトースリセプターとの高いアフィニテイを有する他の分子 によりブロックされている。このブロック物質は、抗体−酵素複合体が腫よう部 位に局在するように２４時間までの時間、プラズマに保持されるが、ガラクトー スリセプターブロックの停止後、ガラクトシル化された抗体−酵素が即座に、有 効なガラクトースリセブターを経由してクリアにされる。

本発明を、トリメトレキサートおよびフォリン酸レスキューを用いた細胞毒性治 療に関する実施例によって、図面と共に例解する。

図１は、トリメトレキサート、メトトレキサート、フォリン酸、ＣＢ５７１７、 およびＩＣＩＤ１６９４の構造を示す。

図２は、ターゲット細胞特異性部が抗体であり、カルボキシペプチダーゼＧ２に 結合し；フォリン酸が細胞毒性剤のインヒビターであり；トリメトレキサートが 前記細胞毒性剤である、本発明を示す図である。

施例１ニトリメトレキサートおよびフォリン酸レスキュを用いた細　性」 本発明は、正常な組織を抗薬酸剤効果から保護しつつ、腫よう部位において連続 して抗葉酸剤を保持し続ける手段を提供する。第１ステツプは、免疫抑制または 免疫耐性誘導剤をイニシエートさせることであり、これは通常、本発明の化合物 が投与される２日以上前に行なわれるものである。抗体−酵素接合体が非免疫原 性である場合には、このステップは省略される。抗体−ＣＰＧ２接合体、または 化学的にまたはＤＮＡ組み替えによりＣＰＧ２または類似の酵素に接合した抗体 フラグメントは、静脈に投与、または他の適当なルートで投与され、抗体はター ゲットであるガンにより発現された腫よう抗原に向かう。数時間で腫よう部位に 接合体が局在した後、第２抗体が与えられる。これは、酵素の活性部位に直接向 かうことが可能であり、この場合、ガラクトース残基が第２抗体に結合し、肝細 胞ガラクトースレセプタを経由してその早急なりリアランスがおこなわれる。

他の、非腫よう部位からの接合体の重層なりリアランスのメカニズムは、すでに 記載されている。酵素レベルが、プラズマにおいて、非常に低くなったり、また は検知不可能なレベルになると、トリメトレキサートが、一定のプラズマ濃度を 保持する目的で、ポーラスまたは連続注入により投与される。トリメトレキサー トとともに、フォリン酸が、トリメトレキサート毒性から正常な細胞を保護する のに十分な投与レベルで、静脈注入により投与される。ＣＰＧ２が局在する腫よ う部位に達する７オリン酸は、細胞に入り、トリメトレキサート毒性がら細胞を 保護する前に、脱グルタミン化されて不活性にされる。このようにして、保護分 子が腫よう部位において急速に分解される一方、正常な組織は、トリメトレキサ ートの作用から、フォリン酸によって保護されることが可能である。トリメトレ キサートがＣＰＧ２によって分解されないような、他の抗葉酸剤が、トリメトレ キサートにとってかわってもよい。

ジヒドロ葉酸還元酵素のトリメトレキサート妨害は、少なくとも部分的に、チミ ジンの内因性要因により回避することが可能であるため、チミジン−分解酵素は 、抗体または他のリガンドによる腫よう部位をターゲットとすることも可能であ る。

細胞膜における腫よう一連合抗原の発現は不均一であるので、腫ようにおける抗 体−酵素接合体の分布が均一ではないことが認識される。抗原の細胞外スペース への分りは、ターゲット抗原のより均一な分布を与えることとなり、分泌された 抗原は、ターゲットとされた抗体−酵素接合体と複合体を形成する。腫よう細胞 による抗体−酵素接合体の内在化は必要ではなく、必ずしも所望されるものでも ない。

本発明による方法は、腫よう部位における葉酸アンタゴニストではなく、通常の 代謝物（葉酸）およびレスキュ剤（フォリン酸）を分解する手段を導入すること により、フォリン酸レスキュおよびメトトレキサートを用いる通常の細胞毒性化 学療法とは異なるものである。

ターゲット抗原からの抗体の解離による、および生物学的分解による、腫よう部 位からの酵素の損失は、幾日かの後、それらの部位において酵素のレベルが減少 することとして現われる。酵素活性の減少速度は、腫ようおよび酵素のタイプに よって様々である；カルボキシペプチダーゼ活性は、ＣＥＡに向かう抗体に結合 した投与後、７日間、ヌードマウスにおけるヒト直腸ガン腫異種移植腫ようにお いて検知されるものである。したがって、約５日間、約２４−４８時間の中断を 設けたトリメトレキサート治療を続けることは可能であるべきである。この間、 さらなる抗体−酵素接合体が投与され、さらなるサイクルを用いて非腫よう部位 からクリアにされる。ホスト抗体反応の効果的な制御または回避が行われるもの である。

したがって、この提案は、断続的でない治療という結果にはならないが、従来の 治療においては、治療期間の治療中断期間に対する比率が約ｌニアであったもの が、約２−３　：　１に改善可能である。

同様の原理が、他の抗代謝物治療に対して適用可能である。たとえば、ＣＢ５７ １７およびＩＣＩＤ１６９４　（ジョノドレルらの文献（１９９１）、ＢＪＣ１ ６４，８３３−８）などのキー酵素のチミンレートシンセターゼをブロックする 薬剤の開発に、近年、かなりの研究がなされている。このような薬剤は、正常な 細胞におけるチミンレートシンセターゼもブロックする、従来の細胞毒性剤と同 様の限定を受けやすい。これらの作用は、チミジンにより可逆性である。チミジ ン投与はしたがって、チミンレートシンセターゼインヒビターから正常な組織を 保護するのに使用可能である一方、チミジンおよび内因性チミジンの保護効果が 、腫よう細胞内にチミジンが入るのを抑制するチミジンキナーゼ、またはジヒド ロチミン　デヒドロゲナーゼなどのチミジン分解酵素により腫よう部位に限定可 能である。チミジンインヒビター酵素または薬剤は、抗体または他の適当なベク ターにより送達される。

ジヒドロチミン　デヒドロゲナーゼは、正常なヒトのリンパ球から得ることが可 能であり（シオタニおよびウェーバ−（１９８９）の文献：ＣａｎｃｅｒＲｅｓ 、４９．１０９０−１０９４）、したがって、低い免疫原性の抗体−酵素接合体 が、ヒトまたは゛ヒューマナイズされた抗体に接合することにより製造可能であ る。

アンチフオレート剤およびアンチ−チミジン剤の双方が、効果的な細胞毒性組み 合わせとなる、適当なインヒビターおよびインヒビター分解酵素を用いて使用可 能である。

例３　：ＡＤＥＰＴを用いた組み合わせ冶。

ＡＤＥＰＴコンセプトは、腫よう部位における不活性プリカーサ−から細胞毒性 薬剤を発生させるために、抗体−酵素接合体を使用する。本発明は、ＡＤＨＰＴ とともに使用可能であり、この結果、組み合わせ化学療法の形態で、再活性薬物 は、腫よう部位に閉じ込められているが、ある場合には活性剤を製造するために 、および、その他の場合には保護剤を破壊するために、同じ又は異なった酵素を 使用する。

ＡＤＨＰＴ処理の場合には、じゅう毛上皮ガン腫（ＣＣ３）腫ようを有するヌー ドマウスが、抗ＨＣＧ　（国際出ＩＰｉ８８１０７３７８に開示されているよう な、Ｗ１４Ｆａｂ２）に結合したＣＰＧ２の２９単位を摂取し、２４又は４８時 間後、プロドラッグ（４１ｇＭ／ｋｇ）を摂取した。保護剤の量は、抑制剤なし で最適な保護効果が得られるように調節される。

−例４：肝転移および腹音腺ガン腫を　する患者の治療大きな肝転移および直腸 の再発腹部腺ガン腫を有する患者が、−２日目に、連続静脈注入により、免疫抑 制剤、シクロスポリンを摂取した。０日目には、細菌性酵素カルボキシペプチダ ーゼＧ２に化学的に結合した、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）を結合するＡ、Ｂ、と して知られているモノクローナル抗体のＦ　（ａｂ’　）２部を含有する化合物 を摂取した。投与された酵素の量は、２時間かけて、静脈注入により、２０００ ０酵素単位（１００ＯＯＵ／ｍ勺であった。２４時間（１日）後、酵素は、血液 プラズマ中に１．０ユニット／ｍｌ存在し、次いで、そのクリアランスを促進す るためにガラクトシル化されたモノクローナル抗体５８４３を８０ｍｇ　（４０ ｍｇ／ｍ２）摂取した。これは２４時間かけて連続静脈注入することにより投与 され、注入の最後の１時間、非ガラクトシル化された５Ｂ４３．１０ｍｇを注入 液に添加した。５Ｂ４３（２日）注入が完了した後、ＣＰＧ２活性がプラズマ内 に検知されなくなったとき、トリメトレキサートが、静脈ポーラスにより５％デ キストローズに入れられた。フォリン酸、１００ｍｇの注入は、連続２４時間注 入により、この時点で開始された。トリメトレキサートは、４日間（２，３，４ ，５日目）、毎日投与された。

抗体酵素接合体で始まるサイクルは、７日目と１４４日目再開された。毒性は、 血清クレアチンの一時的な上昇、シクロスポリンを用いた公知の治療の複合によ り、確認される。細菌性酵素と腫よう抗体へのホスト抗体反応は、処理の３サイ クルの完了後まで検知不可能である。

抹消血管白細胞および血小板計数は、この処理中および処理後、正常または正常 以上のレベルのままである。その後の患者は、トリメトレキサートを多量に、ま たはフォリン酸を少量投与される。

ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するマウスに発生した、モノクローナル抗体Ａ５ Ｂ、は、キャンサー　リサーチ　キャンペーン　テクノロジー、ケンブリッジ　 ハウス、５−１０ケンブリツジ　テラス、リージエンッ　パーク、ロンドンＮＷ Ｉ　４ＪＬから入手可能であり、ハルウッドらによる文献（１９８６）：Ｂｒ１ ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　５４．７５−８２および実施例５により開示された方法 により調製されたものである。マウスのモノクローナル抗体５Ｂ４３は、キャン サー　リサーチ　キャンペーン　テクノロジーから入手可能であり、シャーマら による文献（１９９０）：Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　６１．６５９−６６２ および実施例８により開示された方法により調製されたものである。

、例５：ガン胎吃性抗原に文・して反応するモノクローナル抗体の調」精製した ＣＥＡが、結腸腫ようの転移部から調製された。６μＣｉ　ｐ　ｇ−’の特異活 性の１２′Ｉ探識が、ヨードゲン　（ｉｏｄｏｇｅｎ）法により行われた。希釈 緩衝液が、０．１％ウシ血清アルブミンを含有する０、１５’Ｍリン酸ナトリウ ム緩衝液、ｐＨ７，４として調製された。低いイオン強度における研究が、ｐＨ ７，４で、０．０２Ｍ）リス−ＨＣｌ緩衝液において行われた。

免疫化スケジュール：以下の方法を用いて、精製、加熱処理したＣＥＡに対して 、モノクローナル抗体Ａ、Ｂ　、を発生させた。１ｍｇの精製ＣＥＡが、１ｍｇ ｍド１の濃度で、０．０５Ｍリン酸塩緩衝ａ　（ｐＨ７）中、８５°Ｃで３５分 間加熱された。１０％の硫酸アルミニウムカリウム水溶液、１ｍｌと混合した後 、ｐＨが、一定撹はんしながら、水酸化ナトリウム溶液を滴下することにより、 ６゜５−７に調整された。室温で３０分間撹はんした後、得られた沈殿は食塩水 で３回洗浄された。次いで１０１０ホルマライズ（ｆｏｒｍａｌ　１ｓｅｄ）さ れた百日咳菌（ウェルカム　リサーチ　ラボラトリーズから供給された）と混合 した。

３つの異なった免疫化スケジュールが使用された。

免疫化されたマウスからのび腫細胞が、次いで、ＳＰ２１０−Ａｇ１４またはＰ ３−ＮＳ／１−Ａｇ４−１ミエローマ細胞（フロー　ラボラトリーズ、英国）の いずれか、および、単細胞トランスファによりクローン化されたアンチ−ＣＥＡ を産出するハイブリドーマを用いて、融合された。

Ｃｌｉ例６：Ａ、Ｂ−のＦ（ａｂ゛　、フラグメントの調製この研究において使 用されたモノクローナルアンチ−ＣＥＡ　（Ａ５Ｂ、）は、前に開示されており 、ＮＣＡとのその低い交差反応性、および、免疫精製および放射能標識における その安定性の観点から選択されるものである。Ｆ（ａｂ”）２フラグメントは、 ラモイおよびニソノフによる文献（１９８３）：　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　５６．２３５−２４３の方法により調製された。セファクリルＳ−２ ００において混合物を分離した後、フラクションは、７．５％ゲルを用いて５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥにより分析された。Ｆ（ａｂ’）２を含有するフラクションは、濃 縮され、０．１５Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７に対して透析された。完全なＡ、Ｂ 、およびフラグメントの双方は、ニトロセルロース紙上のＳＤＳゲルのエレクト ロブロノテインクし、′：′■で標識化されたＣＥＡを用いて上乗せすることに より、免疫学的に活性であり、比較的均一であることが示された。

完全なＡ、Ｂ、およびそのＦ　（ａｂ’　）　２フラグメントは、フロラミル下 方法により、放射能標識化し、それぞれ、５．６および５２μＣｉ／□ｇの比活 性とした。標識化された標品双方は、アミノ−セルロースに結合したＣＥＡを用 いて固相放射能線免疫検定により、免疫学的活性を保持することが示された（ロ ジャースらによる文献（１９８３）：Ｅｕｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃ１ｉｎ、Ｏ ｎｃ。

１．１９．６２９−６３９）。６０％を越える活性が、各ケースにおいて保持さ れた。

、施例７　：Ａ　Ｂ−−Ｆ　（ａｂ’　、のＣＰＧ２への接合リン酸塩緩衝液（ ２，５ｍｌ、ｐＨ＝７．６．１ｍＭのＥＤＴＡ含有）におけるＣＰＧ２　（２， １５ｍｇ＞の溶液に、カルボキシペプチダーゼに対して１５モル過剰のエステル に相当する、４−（ｐ−マレイミドフェニル）洛酸Ｎ−ヒドロキシスシンイミド エステル（１３８μｇ）のＤＭＦ　（１３，５μｌ）溶液を添加した。溶液は、 ２時間放置した後、ゲルろ過（ＰＤＩＯカラム）により過剰なエステルを取り除 き、３．２ｃｍリン酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液により溶出されたー溶液１゜ リン酸塩／ＥＤＴＡｍａ液（１，２ｍ１）中のＡ、Ｂ、−Ｆ　（ａｂ’　）　２ （２゜６ｍｇ）が、ＤＭＦ（１０μ＋）中のＳ−ア七チルチオグリコール酸−Ｎ −ヒドロキシスシンイミドエステル（ＳＡＴＡ）（９０Ｍｇ）で処理され、この 混合物は、室温で１時間放置された。過剰の５ＡＴＡが、ゲルろ過（ＰＤＩＯカ ラム、３．２ｃｍリン酸塩緩衝液により溶出）により除去された。

使用の３０分前に、ヒドロキシルアミン溶液（３，４７ｇ、Ｎａ、ＰＯ４Ｈおよ び水酸化ナトリウム溶液により中性化され、９３０ｍｇのＥＤ’ＴＡを含有する 水により１００ｍ１までにする）が添加されたー溶液２゜上記溶液１および２が 次いで混合され、４℃で一昼夜放置された。濃縮（１０倍）　（ミニコン）後、 接合体が、ＦＰＬＣ（フエルマシア）上でゲル−ろ過（Ｓ−１２カラム）により 単離された。接合体は、ミリボア０．２２□ｍフィルターを通してろ過された。

蛋白質濃度が測定され、酵素活性が使用される前に分光光度検定法で測定された 。

例８°ＣＰＧ２に文・して　応性のあるモノクローナル抗　の＝　”ＣＰＧ２に 対して発生したモノクローナル抗体（ＳＢ４３）が、二特異性抗体（次の実施例 参照）を製造するために、および非腫よう部位における残余酵素活性のクリアラ ンスと不活性化のために、使用される。

モノクローナル抗体は以下のように製造される。Ｂａ１ｂ／Ｃマウス（６−８週 令）が、不完全フロインドアジュバントにおける５０μｇＣＰＧ２ｉ、ｐ。

の２注入、次いで、完全７０インドアジユバントにおけるＣＰＧ２の２注入（５ ０μｇＣＰＧ２、各ｉ、ｐ、）を１箇月おきに、および融合の前２日間、２つの 毎日注入（ＰＢＳ、１．ｖ、で５０μｇおよび１０１００ｐによって免疫化され た。免疫すい臓細胞は、ケーラーおよびミルスタインの文献（１９７５）ネーチ ャー　２５６，４９５のハイブリドーマ方法にしたがって、Ｓ　Ｐ　２１０ミエ ローマ細胞を分泌する非免疫グロブリンを用いて融合された。

アンチ−ＣＰＧ２抗体の存在は、固相間接放射線免疫検定により検知された。

０．０５Ｍリン酸緩衝液におけるＣＰＧ２の１７’ｇｍ！−’溶液が、ポリビニ ルミクロタイタープレート（］ウウニあたり１００　ｎ　ｇ）に置かれ、乾燥さ れて、メタノールを用いて固定し、０．０５％トウイーン（Ｔｗｅｅｎ）および ０．１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ緩衝液で洗浄された。上澄み液ま たは精製した抗体ザンプルは、ＰＢＳで希釈され、ＣＰＧ２コートミクロタイタ ープレート（１ウエルあたり１００μｇ）において、３７℃で４時間、次いでｌ 　２５　ｒで律識化されたラビットアンチ−マウスＩｇＧを用いて１時間、培養 された。ウェルは、３回、ＰＢＳ−）ウィーン緩衝直で、各ステージ間に洗浄さ れ、最終洗浄後、各ウェルは、カットされ、ガンマ−カウンターでカウントされ た。

Ｗ°ＣＰＧ２およびＣＥ　Ａに文・して「応性欠宣土玉二豆艮惟坑生ＡＢ−産出 ハイブリドーマ、ＣＥＡに対して反りロ、性を有するモノクローナル抗体は、ハ ルウッドらによる文献（１９８６）：Ｂｒ　ｉ　ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、５４． ７５−８２に開示されており、および、ＣＰＧ２に対して反応性を存するモノク ローナル抗体、ＳＢ４３産出ハイブリドーマの発生方法は、実施例に開示されて いる。

融合プロトコールは、いずれか２つの抗体−産出ハイブリドーマを融合させるも のであり、これは前に開示されている（クラークおよびウオルドマン（１９８７ ）による文献：Ｊ、Ｎａ［１，Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、７９．１３９３−１４ ０１）。ヒボキサンチン　ホスホリボシルトランスフェラーゼ−陰性変異体を選 択することによりヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）感受性 をあらかじめ与えられた、１つの親（ｐａｒｅｎｔａｌ）ハイブリドーマの５Ｘ 　１０’から３．５Ｘ１０”細胞が、１０ｍＭヨードアセトアミドの致死量であ らかじめ処理された第２親ハイブリドーマ細胞を用いて、５０％（ｗｔ／ｖｏｆ ）のポリエチレングリコール、１ｍｌを用いて、１１；１又は１０：１の比率で 融合した。過剰のポリエチレングリコールが洗浄除去され、細胞が、１ｍｌあた り５ｘｉｏ’から２Ｘ　１０′の濃度で、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清 を用いて補助された、重炭酸塩緩衝イスコブズ変性ダルベノコズ媒体（Ｉ　ｓ　 ｃｏｖｅ’　ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　ｍｅｄｉｕｍ、 ＩＭＤＭ）における２４−ウェルプレートにプレートされた。培養して２４時間 後、ハイブリッドハイブリドーマが、ＨＡＴを含有する媒体において選択された 。

例１０：ノ腫よう部位におけるグ余　素活性の減／゛腫よう部位ではなく、非腫 よう部位における酵素−抗体接合体の酵素部を不活性にすることが望ましい。こ の効果を達成するある方法は、ガラクトース残基と接合した酵素部に対して発現 する本発明の抗体の化合物を用いて処理されている患者に投与することである。

ＣＰＧ２に向かうモノクローナル抗体（ＳＢ４３）は、酵素を不活性にする。

抗体が腫よう部位における酵素を不活性にするのを防除するために、さらなるガ ラクトース残基が、肝細胞上のプラズマおよびガラクトースリセプターから早急 に不活性抗体を除去するが、静脈ルートにより与えられる時、プラズマ内におい て酵素を不活性にしておくことの可能なように、それに接合する。

ガラクトシル化５Ｂ４３が、プラズマにおいて酵素活性を除去し、次いで、他の 非組織における残余酵素活性を不活性にするための、非ガラクトシル化５Ｂ４３ の量を与えるために投与される。

モノクローナル抗体５Ｂ４３は、以下のプロトコールを用いてガラクトシル化さ れる。活性化された誘導体の株溶液は以下のようにして調製された。無水メタノ ール（１０ｍｌ）中のシアノメチル　２，３，４．６−チトラー○−アセチルー １−ヂオーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（シグマＣ−４１４１）［４００ｍｇ］ が、１ｍｌの無水メタノール中の５．４ｍｇのナトリウムメトキシドにより、室 温で４８時間処理された。この混合物は、グリースのついたストッパ付き２５ｍ １クイツクフイツト（商欅）コニカルフラスコに保持された。

５Ｂ４３　（１，３ｍｇ／ｍｌ）の株溶液が、０．２５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝 液、ｐＨ８，５中で調製された。活性化されたガラクトシル誘導体の必要量の分 割量（８０，４０，２０，１０μｍ）が、３ｍｌのガラスアンプル内に分散され 、窒素気流内でガラス状残さとなるまで乾燥された。抗体（２００ｐ　ｇ）溶液 が、残さが溶解するまで添加された。室温にて２時間後、その溶液は、ＰＢＳの ３回変化に対して、透析された。

上記容量を掛は合わせることによって、スケールアップして調製が行われた。

ト１ノ／Ｉ−レ柿−ト ＡトトレＡ゛ワ“−１ ＦＩＧＪＲＥ　１ ＣＢ５７１７ 国際調査報告 一、、、Ｎ、ＰＣＴ／ＧＢ　９３１０００３９フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８／４５　 ＡＤＯ ４５１００　８４１５−４Ｃ ４８１００８３１４−４Ｃ ＣＯ７Ｈ２１１０４Ｚ　８６１５−４ＣＣＯ７Ｋ　１６／２８　８３１８−４Ｈ １９１００８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１５１０２ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　９１６１−４Ｂ８３１４−４Ｃ ９２８１−４Ｂ Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１０２ Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ｃ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ターゲット細胞特異性部と、未変性状態において細胞毒性剤の効果を抑制可 能な物質を前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換することの可 能な不活性部とからなる、化合物。 ２、前記不活性部が、酵素的活性部である、請求項１に記載の化合物。 ３、前記ターゲット細胞特異性部が、抗体または抗体の一部からなる、請求項１ または２に記載の化合物。 ４、前記ターゲット細胞特異性部が、選択的に細胞表面エンティティ（ｅｎｔｉ ｔｙ）に結合可能である、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の化合物。 ５、前記細胞表面エンティティが腫よう連合抗原である、請求項４に記載の化合 物。 ６、前記細胞表面エンティティが細胞表面リセプタである、請求項４に記載の化 合物。 ７、前記物質が、ジヒドロ葉酸還元酵素に作用する細胞毒性剤の効果を抑制可能 な、フォリン酸またはその類似体である、請求項１ないし６のいずれか一項に記 載の化合物。 ８、前記不活性部が、少なくともカルボキシペプチダーゼＧ２の触媒部である、 請求項７に記載の化合物。 ９、前記物質が、チミジレートシンセターゼ酵素に作用する細胞毒性剤の効果を 抑制可能な、チミジンまたはその類似体である、請求項１ないし６のいずれか一 項に記載の化合物。 １０、前記不活性部が、チミジン分解酵素またはチミジンキナーゼの少なくとも 触媒部である、請求項９に記載の化合物。 １１、前記物質が、５−フルオロウラシルまたはその類似体の効果を抑制可能な 、ウリジンまたはその類似体である、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の 化合物。 １２、前記不活性部が、ウリジン分解酵素またはウリジンキナーゼの少なくとも 触媒部である、請求項１１に記載の化合物。 １３、前記不活性部が、（１）ターゲット細胞特異性プロモータと、（２）未変 性状態において細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質を前記細胞毒性剤に対してよ り効果を示さない物質に変換することの可能なポリペプチドをコード化するＤＮ Ａセグメントとからなる、請求項１項に記載の化合物。 １４、前記ＤＮＡセグメントが、カルボキシペプチダーゼＧ２の少なくとも触媒 部をコード化する、請求項１３に記載の化合物。 １５、前記ＤＮＡセグメントが、チミジン分解酵素またはチミジンキナーゼの少 なくとも触媒部をコード化する、請求項１３に記載の化合物。 １６、前記ＤＮＡセグメントが、ウリジン分解酵素またはウリジンキナーゼの少 なくとも触媒部をコード化する、請求項１３に記載の化合物。 １７、前記ターゲット細胞特異性部が、レトロウイルスからなる、請求項１３な いし１６のいずれか一項に記載の化合物。 １８、ターゲット細胞特異性抗原と、未変性状態において細胞毒性剤の効果を抑 制可能な物質を前記細胞毒性剤に対してより効果を示さないものに変換すること の可能な不活性な分子とに結合可能な、二特異性抗体。 １９、非経口投与に適した、請求項１−１７のいずれか一項に記載の化合物から なる薬剤組成物。 ２０、請求項１−１７のいずれか一項に記載の化合物、細胞毒性剤、および、未 変性状態において前記細胞毒性剤の効果を抑制可能で、前記不活性部によリ前記 細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換されることの可能な物質とか らなる、治療システム。 ２１、前記細胞毒性剤が、葉酸アンタゴニストおよび前記細胞毒性剤の効果を抑 制可能な物質がフォリン酸またはその類似体であるか、または、前記細胞毒性剤 が、チミジンアンタゴニストおよび前記細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質がチ ミジンまたはその類似体であるか、または、前記細胞毒性剤が、前記２つのアン タゴニストの組み合わせである、請求項２０に記載の治療システム。 ２２、ホストにおけるターゲット細胞の破壊方法であり、ホストに、（ｉ）請求 項１−１７のいずれか一項に記載の化合物、（ｉｉ）細胞毒性剤、および、（ｉ ｉｉ）未変性状態において前記細胞毒性剤の効果を抑制可能で、前記不活性部に より前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換されることの可能な 物質を投与することからなる、方法。 ２３、腫ようを有するほ乳類の治療方法であり、前記ほ乳類には、請求項１−１ ７のいずれか一項に記載の化合物が投与され、ターゲット細胞に結合する化合物 のターゲット細胞に結合しない化合物に対する比率を所望の値にすることにより 治療の準備がなされたものであり、前記治療方法は、前記ほ乳類に、細胞毒性剤 、および、未変性状態に於て前記細胞毒性剤の効果を抑制可能で、前記化合物の 不活性部により、前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換される ことの可能な、物質を投与することからなる、治療方法。