JP2003292458A - 細胞毒性剤治療 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞毒性剤の断続投与が必要とならない、腫
よう細胞抗原に特異的な化合物の提供。 【解決手段】 本発明の化合物は、腫よう細胞抗原に特
異的な抗体などの、ターゲット細胞特異性部と、未変性
状態において細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質を前記
細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換する
ことの可能な、酵素などの、不活性部とからなる。した
がって、腫よう部位における細胞毒性剤の作用は、細胞
毒性剤の効果から正常組織を保護しつつ、持続すること
が可能である。
よう細胞抗原に特異的な化合物の提供。 【解決手段】 本発明の化合物は、腫よう細胞抗原に特
異的な抗体などの、ターゲット細胞特異性部と、未変性
状態において細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質を前記
細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換する
ことの可能な、酵素などの、不活性部とからなる。した
がって、腫よう部位における細胞毒性剤の作用は、細胞
毒性剤の効果から正常組織を保護しつつ、持続すること
が可能である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、主に、選択された
細胞をターゲットとすることが可能な細胞毒性剤、およ
び、特に、ガンの治療に使用される薬剤の作用に関す
る。
細胞をターゲットとすることが可能な細胞毒性剤、およ
び、特に、ガンの治療に使用される薬剤の作用に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ガンのほとんどの形態は、初期の段階で
体内に分散している傾向にあり、ガン治療の最終目標
は、好ましくはホストシステムに重大な毒性を示すこと
なく、ガンの除去を達成することである。細胞毒性剤を
組み合わせると、比較的一般的ではないガンの狭い範囲
においては治癒性が証明されているが、単独の細胞毒性
剤およびそれらの組み合わせでは、肺、胸、結腸、直
腸、すい臓、前立腺などの一般的なガン患者にはほとん
ど、主な治療効果が見られないものである。
体内に分散している傾向にあり、ガン治療の最終目標
は、好ましくはホストシステムに重大な毒性を示すこと
なく、ガンの除去を達成することである。細胞毒性剤を
組み合わせると、比較的一般的ではないガンの狭い範囲
においては治癒性が証明されているが、単独の細胞毒性
剤およびそれらの組み合わせでは、肺、胸、結腸、直
腸、すい臓、前立腺などの一般的なガン患者にはほとん
ど、主な治療効果が見られないものである。
【０００３】細胞毒性剤は、消化管の上皮および造血組
織等の細胞再生を活性化する正常の組織に影響を及ぼす
ため、断続的な投与スケジュールで投与されることのみ
可能である。細胞毒性物質の影響からこれらの正常な組
織を回復させるために必要な、投与処理の中断期間は、
細胞毒性剤の投与期間よりも、より長い傾向にある。
織等の細胞再生を活性化する正常の組織に影響を及ぼす
ため、断続的な投与スケジュールで投与されることのみ
可能である。細胞毒性物質の影響からこれらの正常な組
織を回復させるために必要な、投与処理の中断期間は、
細胞毒性剤の投与期間よりも、より長い傾向にある。
【０００４】細胞分裂において含有される物質が、細胞
毒性剤の最も一般的なターゲットであり、これらのなか
には、ＤＮＡおよびＲＮＡの基礎成分である、ヌクレオ
チドの合成において含有される物質がある。リボヌクレ
オチド レダクターゼ、ジヒドロフォレート レダクター
ゼ、およびチミジン シンセターゼ酵素が、典型的なタ
ーゲットである。ジヒドロ葉酸還元酵素は食物要因、葉
酸に作用し、活性補酵素、５，１０−メテニルテトラヒ
ドロフォレートを合成するものである。この補酵素は、
ＤＮＡ合成に必要とされるピリミジンのそれを含有する
種々の合成において１炭素転移（カ−ボントランスファ
−）に必要である。広く使用されている薬剤、メトトレ
キサート（２，４−ジアミノ−Ｎ１０−メチルプテロイ
ルグルタミン酸）は、活性テトラヒドロフォレートの再
生を妨げ、ＤＮＡ合成を中断させ、ＤＮＡが複製される
細胞サイクルのＳフェーズに入る細胞を死に至らしめ
る、ジヒドロ葉酸還元酵素に、強力に結合することによ
り作用する。メトトレキサートは一般的にはたとえば、
サイアナミド インコーポレーション（Ｃｙａｎａｍｉ
ｄ Ｉｎｃ．）から入手可能である。
毒性剤の最も一般的なターゲットであり、これらのなか
には、ＤＮＡおよびＲＮＡの基礎成分である、ヌクレオ
チドの合成において含有される物質がある。リボヌクレ
オチド レダクターゼ、ジヒドロフォレート レダクター
ゼ、およびチミジン シンセターゼ酵素が、典型的なタ
ーゲットである。ジヒドロ葉酸還元酵素は食物要因、葉
酸に作用し、活性補酵素、５，１０−メテニルテトラヒ
ドロフォレートを合成するものである。この補酵素は、
ＤＮＡ合成に必要とされるピリミジンのそれを含有する
種々の合成において１炭素転移（カ−ボントランスファ
−）に必要である。広く使用されている薬剤、メトトレ
キサート（２，４−ジアミノ−Ｎ１０−メチルプテロイ
ルグルタミン酸）は、活性テトラヒドロフォレートの再
生を妨げ、ＤＮＡ合成を中断させ、ＤＮＡが複製される
細胞サイクルのＳフェーズに入る細胞を死に至らしめ
る、ジヒドロ葉酸還元酵素に、強力に結合することによ
り作用する。メトトレキサートは一般的にはたとえば、
サイアナミド インコーポレーション（Ｃｙａｎａｍｉ
ｄ Ｉｎｃ．）から入手可能である。
【０００５】トリメトレキサート薬剤（ＮＳＣ３５２１
２２；２，４−ジアミノ−５−メチル−６−［３，４，
５−トリメトキシアニリノメチル］キナゾリン）もま
た、ジヒドロ葉酸還元酵素に結合することにより作用す
る。ただし、メトトレキサートはフォレートレセプタを
経由して細胞に入るが、トリメトレキサートは他のメカ
ニズムによって入るものである。トリメトレキサートの
合成は、ベーカー（１９６７）による、デザイン オブ
サイト−ディレクティッド イリバーシブルエンザイ
ム インヒビターズ、ワイレイ、ニューヨーク、およ
び、エルスレーガーら（１９７４）による、レクチャー
ズ イン ヘテロサイクリック ケミストリ、２巻、９
７／５−１３３ページ（キャッスル アンド タウンセ
ンド）に開示されている。トリメトレキサートは一般に
は、ＵＳ バイオサイエンシーズ、ワン タワー ブリ
ッジ、１００ フロント ストリート、スート ４００、
ウエスト コンショホッケン、ＰＡ １９４２８、米国
から、入手可能である。
２２；２，４−ジアミノ−５−メチル−６−［３，４，
５−トリメトキシアニリノメチル］キナゾリン）もま
た、ジヒドロ葉酸還元酵素に結合することにより作用す
る。ただし、メトトレキサートはフォレートレセプタを
経由して細胞に入るが、トリメトレキサートは他のメカ
ニズムによって入るものである。トリメトレキサートの
合成は、ベーカー（１９６７）による、デザイン オブ
サイト−ディレクティッド イリバーシブルエンザイ
ム インヒビターズ、ワイレイ、ニューヨーク、およ
び、エルスレーガーら（１９７４）による、レクチャー
ズ イン ヘテロサイクリック ケミストリ、２巻、９
７／５−１３３ページ（キャッスル アンド タウンセ
ンド）に開示されている。トリメトレキサートは一般に
は、ＵＳ バイオサイエンシーズ、ワン タワー ブリ
ッジ、１００ フロント ストリート、スート ４００、
ウエスト コンショホッケン、ＰＡ １９４２８、米国
から、入手可能である。
【０００６】メトトレキサートは、カルボキシペプチダ
ーゼＧ２により切断可能な、末端グルタミン酸部を有す
る点で、天然フォレート（ｆｏｌａｔｅ）に類似してい
る。一方、トリメトレキサートは、この酵素の作用を受
けにくいものである（バッグシャウ（１９８５）クリニ
カル ラジオール、３６巻、５４５−５５１ページ）。
我々は以前に、インビトロで腸ガン細胞におけるトリメ
トレキサートの作用が、酵素カルボキシペプチダーゼＧ
２を分解するフォレートの培地に添加することにより増
強可能であることを報告した（シールらによる文献：Ｓ
ｅａｒｌｅ ｅｔ ａｌ（１９９０）バイオケミカル
ファーマコロジー、３９巻、１７８７−１７９１）。我
々はまた、この酵素が、抗体または抗体フラグメントに
接合したとき、活性を維持することを示した（シールら
による文献：Ｓｅａｒｌｅ ｅｔａｌ（１９８８）Ｂａ
ｃｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５３，３７７−３８４）。
ーゼＧ２により切断可能な、末端グルタミン酸部を有す
る点で、天然フォレート（ｆｏｌａｔｅ）に類似してい
る。一方、トリメトレキサートは、この酵素の作用を受
けにくいものである（バッグシャウ（１９８５）クリニ
カル ラジオール、３６巻、５４５−５５１ページ）。
我々は以前に、インビトロで腸ガン細胞におけるトリメ
トレキサートの作用が、酵素カルボキシペプチダーゼＧ
２を分解するフォレートの培地に添加することにより増
強可能であることを報告した（シールらによる文献：Ｓ
ｅａｒｌｅ ｅｔ ａｌ（１９９０）バイオケミカル
ファーマコロジー、３９巻、１７８７−１７９１）。我
々はまた、この酵素が、抗体または抗体フラグメントに
接合したとき、活性を維持することを示した（シールら
による文献：Ｓｅａｒｌｅ ｅｔａｌ（１９８８）Ｂａ
ｃｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５３，３７７−３８４）。
【０００７】メトトレキサートおよびトリメトレキサー
トの双方の生物学的効果は、それらがブロックする反応
の最終生成物を投与することにより、またはフォリン酸
［５−ホルミルテトラヒドロ葉酸］として知られている
より入手可能な類似体により、逆転させることが可能で
ある。フォリン酸は広く入手可能であり、たとえば、シ
アナミド インコーポレーション、また、ウエルカム
インコーポレーションおよびファルミタリアからロイコ
ボリン（Ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）として、入手可能であ
る。フォリン酸が、メトトレキサートまたはトリメトレ
キサートとともに十分な投与量で投与されると、これら
の作用がブロックされる。フォリン酸を、定められた時
間で制御された投与量で、メトトレキサートとともに使
用すると、ある種のガンの治療に有用であることが見い
だされている。メトトレキサート−フォリン酸の組み合
わせは、ある種のガンに対しては、メトトレキサート単
独と比較して、治療率の向上が可能であり、一般的に
は、レスキューセラピーとして知られているものであ
る。ある種のガン細胞よりもより容易に正常なクローン
発生細胞を救うことは、フォリン酸の能力に依存するよ
うである。ある実施例は、ある種の栄養芽腫ようの治療
に際して、メトトレキサートとフォリン酸を使用して成
功している（文献：Ｂａｇｓｈａｗｅ ｅｔ ａｌ（１
９８９）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｏｂ．＆ Ｇｖｎａｅｃｏ
ｌ．）。しかしながらこのアプローチは、ガンの制限さ
れた範囲でのみ有用であることが証明されており、正常
な細胞を保護するのに必要なフォリン酸の濃度 Ｘ 時間
もまた、アンチ−フォレートの作用からある種のガン細
胞を保護するようである。
トの双方の生物学的効果は、それらがブロックする反応
の最終生成物を投与することにより、またはフォリン酸
［５−ホルミルテトラヒドロ葉酸］として知られている
より入手可能な類似体により、逆転させることが可能で
ある。フォリン酸は広く入手可能であり、たとえば、シ
アナミド インコーポレーション、また、ウエルカム
インコーポレーションおよびファルミタリアからロイコ
ボリン（Ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）として、入手可能であ
る。フォリン酸が、メトトレキサートまたはトリメトレ
キサートとともに十分な投与量で投与されると、これら
の作用がブロックされる。フォリン酸を、定められた時
間で制御された投与量で、メトトレキサートとともに使
用すると、ある種のガンの治療に有用であることが見い
だされている。メトトレキサート−フォリン酸の組み合
わせは、ある種のガンに対しては、メトトレキサート単
独と比較して、治療率の向上が可能であり、一般的に
は、レスキューセラピーとして知られているものであ
る。ある種のガン細胞よりもより容易に正常なクローン
発生細胞を救うことは、フォリン酸の能力に依存するよ
うである。ある実施例は、ある種の栄養芽腫ようの治療
に際して、メトトレキサートとフォリン酸を使用して成
功している（文献：Ｂａｇｓｈａｗｅ ｅｔ ａｌ（１
９８９）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｏｂ．＆ Ｇｖｎａｅｃｏ
ｌ．）。しかしながらこのアプローチは、ガンの制限さ
れた範囲でのみ有用であることが証明されており、正常
な細胞を保護するのに必要なフォリン酸の濃度 Ｘ 時間
もまた、アンチ−フォレートの作用からある種のガン細
胞を保護するようである。
【０００８】さらに、アンチ−フォレートの作用の持続
性が細胞毒性度を決定することが示されているため、メ
トトレキサート（ＭＴＸ）を長期間連続して投与すると
より優位ではある一方、このようなフォリン酸の使用に
おいては、メトトレキサート（ＭＴＸ）の断続投与が必
要となる。類似のことが、他の細胞毒性剤にもいえる。
性が細胞毒性度を決定することが示されているため、メ
トトレキサート（ＭＴＸ）を長期間連続して投与すると
より優位ではある一方、このようなフォリン酸の使用に
おいては、メトトレキサート（ＭＴＸ）の断続投与が必
要となる。類似のことが、他の細胞毒性剤にもいえる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明によれば、ターゲット細胞特異性部と、
未変性状態において細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質
を、前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に
変換することの可能な不活性部とからなる、化合物を提
供する。不活性部は、直接的または間接的に不活性であ
ってもよい。”直接的に不活性”とは、その部分自体
が、たとえば、それに結合することにより、またはそれ
を不活性な形態に変換することにより、前記物質を不活
性にすることができることを意味する。”間接的に不活
性”とは、ターゲット細胞にその部分を送達すると、細
胞毒性剤が不活性となることを意味する。たとえば、そ
の部分は、核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであっ
てもよく、これは、たとえばそれに結合することによ
り、またはそれを不活性な形態に変換することにより、
前記物質を不活性にすることができるポリペプチドをコ
ード化するものである。
の手段】本発明によれば、ターゲット細胞特異性部と、
未変性状態において細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質
を、前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に
変換することの可能な不活性部とからなる、化合物を提
供する。不活性部は、直接的または間接的に不活性であ
ってもよい。”直接的に不活性”とは、その部分自体
が、たとえば、それに結合することにより、またはそれ
を不活性な形態に変換することにより、前記物質を不活
性にすることができることを意味する。”間接的に不活
性”とは、ターゲット細胞にその部分を送達すると、細
胞毒性剤が不活性となることを意味する。たとえば、そ
の部分は、核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであっ
てもよく、これは、たとえばそれに結合することによ
り、またはそれを不活性な形態に変換することにより、
前記物質を不活性にすることができるポリペプチドをコ
ード化するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】前記ポリペプチドは、細胞内的に
発現されても、細胞表面に発現されても、または細胞か
ら分秘されてもよい。”ポリペプチド”とは、タンパク
質および糖タンパク質を含有する。好ましくは、不活性
部は、酵素的活性部である。細胞毒性剤の効果を”抑
制”する物質は、ターゲット細胞を破壊する細胞毒性剤
の能力を、有用な範囲にまで減少させるものである。好
ましくはこの能力は、実質的にゼロまで減少させるもの
である。同様に、不活性部は、有用な範囲まで抑制し、
好ましくは実質的にゼロにまで減少させるものである。
発現されても、細胞表面に発現されても、または細胞か
ら分秘されてもよい。”ポリペプチド”とは、タンパク
質および糖タンパク質を含有する。好ましくは、不活性
部は、酵素的活性部である。細胞毒性剤の効果を”抑
制”する物質は、ターゲット細胞を破壊する細胞毒性剤
の能力を、有用な範囲にまで減少させるものである。好
ましくはこの能力は、実質的にゼロまで減少させるもの
である。同様に、不活性部は、有用な範囲まで抑制し、
好ましくは実質的にゼロにまで減少させるものである。
【００１１】ターゲット細胞−特異性部により認識され
たエンティティ（ｅｎｔｉｔｙ）は、腫よう細胞、ウイ
ルス感染細胞、病原性微生物、遺伝子治療の一部として
導入された細胞、または特別な理由から破壊したい生態
の正常細胞により、発現される、適当なエンティティな
らばなんでもよい。エンティティは好ましくは、他の治
療手段により機能的に置換できないホストの正常組織に
おいてよりも、破壊されるべき細胞内または細胞上にお
いて、より濃度が高い状態で、ターゲット部に近づきや
すいまたは存在するべきものである。ガン細胞により発
現されたターゲットの使用は、たとえば、内分泌組織ま
たは器官に等しくまたはより多く発現されることにより
阻害されなくなるものである。存命状態においては、器
官が犠牲にされるが、その機能は、たとえば、テストの
場合には、生存に本質的ではない、またはホルモン置換
治療により供給可能なもののいずれかである。このよう
な考え方は、たとえば、甲状腺、副甲状腺、副腎皮質、
および卵巣に適用される。
たエンティティ（ｅｎｔｉｔｙ）は、腫よう細胞、ウイ
ルス感染細胞、病原性微生物、遺伝子治療の一部として
導入された細胞、または特別な理由から破壊したい生態
の正常細胞により、発現される、適当なエンティティな
らばなんでもよい。エンティティは好ましくは、他の治
療手段により機能的に置換できないホストの正常組織に
おいてよりも、破壊されるべき細胞内または細胞上にお
いて、より濃度が高い状態で、ターゲット部に近づきや
すいまたは存在するべきものである。ガン細胞により発
現されたターゲットの使用は、たとえば、内分泌組織ま
たは器官に等しくまたはより多く発現されることにより
阻害されなくなるものである。存命状態においては、器
官が犠牲にされるが、その機能は、たとえば、テストの
場合には、生存に本質的ではない、またはホルモン置換
治療により供給可能なもののいずれかである。このよう
な考え方は、たとえば、甲状腺、副甲状腺、副腎皮質、
および卵巣に適用される。
【００１２】認識されるエンティティはしばしば、抗原
である。腫よう−接合抗原は、これらが細胞膜上に発現
されるときまたは腫よう外細胞流動体に分泌する時、抗
体用ターゲットに加わるものである。”腫よう”とは、
肺、肝臓、血液細胞（白血球）、皮膚、すい臓、結腸、
前立腺、子宮、または胸の腫ようを含有する、腫よう性
細胞成長の形態をいう。
である。腫よう−接合抗原は、これらが細胞膜上に発現
されるときまたは腫よう外細胞流動体に分泌する時、抗
体用ターゲットに加わるものである。”腫よう”とは、
肺、肝臓、血液細胞（白血球）、皮膚、すい臓、結腸、
前立腺、子宮、または胸の腫ようを含有する、腫よう性
細胞成長の形態をいう。
【００１３】抗原−特異性部は、全抗体（通常、便宜
上、特に、モノクローナル抗体）、それらの部分（たと
えばＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２）、また
は合成抗体またはそれらの部分であってもよい。抗体の
部分のみからなる接合体は、血液からのクリアランスの
速度を見積ることによってより優位であり、Ｆｃ部によ
る非特異的結合を受けにくくなる可能性がある。選択さ
れた抗原に対する適当なモノクローナル抗体は、公知の
技術、たとえば、”モノクローナル アンチボディー
ズ：ア マニュアル オブ テクニックス”、Ｈ．ゾラ
（ＣＲＣプレス、１９８８）および、”モノクローナル
ハイブリドーマ アンチボディーズ：テクニックス
アンド アプリケーションズ”、Ｊ．Ｇ．Ｒ．ハーレル
（ＣＲＣプレス、１９８２）により調製可能である。本
明細書に記載されたすべての文献は、本明細書に組み入
れられているものである。二特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃ
ｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は、細胞融合、一価
フラグメントの再連合、または全抗体の化学交差結合に
より調製可能であり、得られた二特異性抗体の一部は細
胞特異性抗原に向い、他のものは酵素に向かう。この二
特異性抗体は、酵素に結合して投与しても、または、ま
ず抗体が投与されて次いで酵素が投与されてもよい。二
特異性抗体がまず投与され、腫よう細胞に局在化した
後、酵素が、腫よう局在化抗体により捕えられるように
投与されるのが好ましい。二特異性抗体の調製方法は、
コルバランらによる文献:（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２４，１２７
−１３２、および１３３−１３７、および１３８−１４
３、およびギルスランドらによる文献:（１９８８）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，
７７１９−７７２３に開示されている。
上、特に、モノクローナル抗体）、それらの部分（たと
えばＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２）、また
は合成抗体またはそれらの部分であってもよい。抗体の
部分のみからなる接合体は、血液からのクリアランスの
速度を見積ることによってより優位であり、Ｆｃ部によ
る非特異的結合を受けにくくなる可能性がある。選択さ
れた抗原に対する適当なモノクローナル抗体は、公知の
技術、たとえば、”モノクローナル アンチボディー
ズ：ア マニュアル オブ テクニックス”、Ｈ．ゾラ
（ＣＲＣプレス、１９８８）および、”モノクローナル
ハイブリドーマ アンチボディーズ：テクニックス
アンド アプリケーションズ”、Ｊ．Ｇ．Ｒ．ハーレル
（ＣＲＣプレス、１９８２）により調製可能である。本
明細書に記載されたすべての文献は、本明細書に組み入
れられているものである。二特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃ
ｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は、細胞融合、一価
フラグメントの再連合、または全抗体の化学交差結合に
より調製可能であり、得られた二特異性抗体の一部は細
胞特異性抗原に向い、他のものは酵素に向かう。この二
特異性抗体は、酵素に結合して投与しても、または、ま
ず抗体が投与されて次いで酵素が投与されてもよい。二
特異性抗体がまず投与され、腫よう細胞に局在化した
後、酵素が、腫よう局在化抗体により捕えられるように
投与されるのが好ましい。二特異性抗体の調製方法は、
コルバランらによる文献:（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２４，１２７
−１３２、および１３３−１３７、および１３８−１４
３、およびギルスランドらによる文献:（１９８８）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，
７７１９−７７２３に開示されている。
【００１４】抗体の可変重（ＶＨ）および可変軽
（ＶＬ）領域は、抗原認識に含有される。この事実は、
プロテアーゼ消化実験により最初に認識されたものであ
り、さらに、げっ歯類抗体の”ヒューマニゼーション”
により確信された。げっ歯類由来の可変領域は、得られ
た抗体がげっ歯類源抗体の抗原特異性を保持するよう
な、ヒト由来の定常領域に融合可能である（モリソンら
による文献：（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、６８５１−６８５５）。
（ＶＬ）領域は、抗原認識に含有される。この事実は、
プロテアーゼ消化実験により最初に認識されたものであ
り、さらに、げっ歯類抗体の”ヒューマニゼーション”
により確信された。げっ歯類由来の可変領域は、得られ
た抗体がげっ歯類源抗体の抗原特異性を保持するよう
な、ヒト由来の定常領域に融合可能である（モリソンら
による文献：（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、６８５１−６８５５）。
【００１５】抗原特異性は可変領域により与えられ、定
常領域に依存しないことが、１以上の可変領域を含有す
る抗体フラグメントのバクテリアの発現に関する実験か
ら知られている。これらの分子は、Ｆａｂ状分子（ベタ
ーら（１９８８）サイエンス２４０、１０４１）；Ｆｖ
分子（スケラら（１９８８）サイエンス ２４０、１０
３８）；単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子、ここでＶＨとＬＨ
パートナー領域は、フレキシブルなオリゴペプチドを介
して結合する（バードら（１９８８）サイエンス ２４
２、４２３；ヒューストンら（１９８８）による文献:
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８５、
５８７９）および、単離されたＶ領域からなるシングル
領域抗体（ｄＡｂｓ）（ワードら（１９８９）ネーチャ
ー ３４１、５４４）を含有する。特異結合部位を保持
する抗体フラグメントの合成において含有される一般的
な技術は、ウインター＆ミルステイン（１９９１）ネー
チャー ３４９、２９３−２９９に記載されている。
常領域に依存しないことが、１以上の可変領域を含有す
る抗体フラグメントのバクテリアの発現に関する実験か
ら知られている。これらの分子は、Ｆａｂ状分子（ベタ
ーら（１９８８）サイエンス２４０、１０４１）；Ｆｖ
分子（スケラら（１９８８）サイエンス ２４０、１０
３８）；単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子、ここでＶＨとＬＨ
パートナー領域は、フレキシブルなオリゴペプチドを介
して結合する（バードら（１９８８）サイエンス ２４
２、４２３；ヒューストンら（１９８８）による文献:
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８５、
５８７９）および、単離されたＶ領域からなるシングル
領域抗体（ｄＡｂｓ）（ワードら（１９８９）ネーチャ
ー ３４１、５４４）を含有する。特異結合部位を保持
する抗体フラグメントの合成において含有される一般的
な技術は、ウインター＆ミルステイン（１９９１）ネー
チャー ３４９、２９３−２９９に記載されている。
【００１６】”ＳｃＦｖ分子”とは、ＶＨおよびＶＬパ
ートナー領域がフレキシブルなオリゴペプチドを介して
結合する分子を意味する。
ートナー領域がフレキシブルなオリゴペプチドを介して
結合する分子を意味する。
【００１７】全抗体よりもむしろ抗体フラグメントを使
用すると何倍もの優位点が得られるものである。フラグ
メントがより小さいサイズであると、固体組織の良好な
浸透性などの、良好な薬理特性を示すことが可能とな
る。相補結合などの全抗体のエフェクター機能が除去さ
れる。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、およびｄＡｂフラグメ
ントは全て、発現されて、大腸菌から分泌可能であり、
これによって、大量の前記フラグメントが容易に製造可
能となる。全抗体、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント
は”２価”である。”２価”とは、前記抗体およびＦ
（ａｂ’）２フラグメントが部位を結合する２つの抗原
を有することを意味する。これに対して、Ｆａｂ、Ｆ
ｖ、ＳｃＦｖ、およびｄＡｂフラグメントは、部位を結
合する１つのみの抗原を有する１価である。Ｆ（ａ
ｂ’）２フラグメントを製造するための完全な免疫グロ
ブリンの断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、ハ
ルウッドら（１９８５）による文献:Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１、１５１５−１
５２２に開示されている。ＩｇＧクラス抗体が好まし
い。
用すると何倍もの優位点が得られるものである。フラグ
メントがより小さいサイズであると、固体組織の良好な
浸透性などの、良好な薬理特性を示すことが可能とな
る。相補結合などの全抗体のエフェクター機能が除去さ
れる。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、およびｄＡｂフラグメ
ントは全て、発現されて、大腸菌から分泌可能であり、
これによって、大量の前記フラグメントが容易に製造可
能となる。全抗体、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント
は”２価”である。”２価”とは、前記抗体およびＦ
（ａｂ’）２フラグメントが部位を結合する２つの抗原
を有することを意味する。これに対して、Ｆａｂ、Ｆ
ｖ、ＳｃＦｖ、およびｄＡｂフラグメントは、部位を結
合する１つのみの抗原を有する１価である。Ｆ（ａ
ｂ’）２フラグメントを製造するための完全な免疫グロ
ブリンの断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、ハ
ルウッドら（１９８５）による文献:Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１、１５１５−１
５２２に開示されている。ＩｇＧクラス抗体が好まし
い。
【００１８】また、認識されるエンティティは、抗原性
であってもなくてもよいが、認識可能で、他の方法で選
択的に結合可能なものである。たとえば、メラノーマ細
胞において多く発現されるメラノシト−刺激ホルモン
（ＭＳＨ）用レセプタなどの特性細胞表面レセプタであ
ってもよい。細胞特異性部は、たとえば、メッセンジャ
として、または、細胞表面酵素用物質またはその類似体
として、非免疫センスにおいて、特異的にエンティティ
に結合する、化合物またはその一部である可能性があ
る。
であってもなくてもよいが、認識可能で、他の方法で選
択的に結合可能なものである。たとえば、メラノーマ細
胞において多く発現されるメラノシト−刺激ホルモン
（ＭＳＨ）用レセプタなどの特性細胞表面レセプタであ
ってもよい。細胞特異性部は、たとえば、メッセンジャ
として、または、細胞表面酵素用物質またはその類似体
として、非免疫センスにおいて、特異的にエンティティ
に結合する、化合物またはその一部である可能性があ
る。
【００１９】ウイルス直接酵素プロドラッグ治療（ＶＤ
ＥＰＴ）が、プロドラッグを細胞毒性剤に変換可能な酵
素を選択的に発現するために、正常な細胞と腫よう性細
胞との転写差異を用いて腫よう性細胞を選択的に殺すと
して記載されている（ハーバーらの文献（１９９１）：
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８８、８
０３９−８０４３）。同様に、正常な細胞と腫よう物性
の細胞との転写差異は、ここに開示されたインヒビター
物質を不活性にすることの可能な酵素の発現を選択的に
行うのに使用可能である。酵素は腫よう細胞により分泌
されることが好ましく、これによって、インヒビター物
質が自由に不活性となるものである。
ＥＰＴ）が、プロドラッグを細胞毒性剤に変換可能な酵
素を選択的に発現するために、正常な細胞と腫よう性細
胞との転写差異を用いて腫よう性細胞を選択的に殺すと
して記載されている（ハーバーらの文献（１９９１）：
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８８、８
０３９−８０４３）。同様に、正常な細胞と腫よう物性
の細胞との転写差異は、ここに開示されたインヒビター
物質を不活性にすることの可能な酵素の発現を選択的に
行うのに使用可能である。酵素は腫よう細胞により分泌
されることが好ましく、これによって、インヒビター物
質が自由に不活性となるものである。
【００２０】細胞間の転写における差異は、組織特異性
プロモータと関連づけることが可能であり、または、腫
よう性状態におけるアクティベータまたはレプレッサ分
子の変化によるものである可能性がある。したがって、
ある実施例においては、肝臓関連アルブミン転写調節配
列が、肝細胞ガン腫を有する患者の治療において、酵素
を含有するインヒビター不活性タンパク質を発現するの
に有用である。正常な細胞と腫よう性細胞とのさらなる
転写差異は、常に発見されており、これらの差異の多く
は、本発明の方法において開発可能であると考えられ
る。
プロモータと関連づけることが可能であり、または、腫
よう性状態におけるアクティベータまたはレプレッサ分
子の変化によるものである可能性がある。したがって、
ある実施例においては、肝臓関連アルブミン転写調節配
列が、肝細胞ガン腫を有する患者の治療において、酵素
を含有するインヒビター不活性タンパク質を発現するの
に有用である。正常な細胞と腫よう性細胞とのさらなる
転写差異は、常に発見されており、これらの差異の多く
は、本発明の方法において開発可能であると考えられ
る。
【００２１】ターゲット細胞に対して遺伝子構成物を送
達するのに適当な組み替え、複製−欠陥レトロウイルス
（すなわち、プロモータプラス遺伝子コード化インヒビ
タ−不活性タンパク質）が開示されている（（ハーバー
らの文献（１９９１）：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．米国８８、８０３９−８０４３）。ウイル
スまたは他の核タンパク質粒子、またはリポソームは、
間接的に不活性部を前記細胞に送達するのに適当なター
ゲット細胞−特異性部を提供可能である。インヒビター
不活性タンパク質は、前記インヒビターを不活性形態に
代謝可能な酵素であってもよいし、また、前記インヒビ
ターと結合可能で不活性にすることの可能なタンパク質
であってもよい。
達するのに適当な組み替え、複製−欠陥レトロウイルス
（すなわち、プロモータプラス遺伝子コード化インヒビ
タ−不活性タンパク質）が開示されている（（ハーバー
らの文献（１９９１）：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．米国８８、８０３９−８０４３）。ウイル
スまたは他の核タンパク質粒子、またはリポソームは、
間接的に不活性部を前記細胞に送達するのに適当なター
ゲット細胞−特異性部を提供可能である。インヒビター
不活性タンパク質は、前記インヒビターを不活性形態に
代謝可能な酵素であってもよいし、また、前記インヒビ
ターと結合可能で不活性にすることの可能なタンパク質
であってもよい。
【００２２】腫よう関連抗原に対する抗体およびそれら
のフラグメントに関して、かなりの研究が既に行われて
おり、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）に対する抗体またはそ
れらのフラグメント、および、ヒトじゅう毛性腺刺激ホ
ルモン（ｈＣＧ）に対する抗体またはそれらのフラグメ
ントは、カルボキシペプチダーゼＧ２に接合可能で、得
られた接合体は、抗原結合および触媒機能の双方を保持
しているものである。これらの接合体を静脈注射した
後、これらはそれぞれ、ＣＥＡまたはｈＣＧ発現腫よう
に局在する。他の抗体は、対応する抗原を発現する腫よ
うに局在することが知られている。これらの腫ようは、
ヒトにおける原発性転移直腸ガン（ＣＥＡ）およびじゅ
う毛性ガン腫（ｈＣＧ）、またはその他の形態のガンで
ある可能性がある。このような抗体−酵素接合体はま
た、各々の抗原を発現する正常組織に局在可能である
が、抗原発現は、正常組織においてより分散するもので
ある。このような抗体−酵素接合体は、各々の抗原を介
して細胞膜に結合可能であり、または細胞間に分泌され
た抗原によりトラップ可能である。腫よう関連、免疫細
胞関連、および感染薬剤関連抗原の例を表１に示す。
のフラグメントに関して、かなりの研究が既に行われて
おり、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）に対する抗体またはそ
れらのフラグメント、および、ヒトじゅう毛性腺刺激ホ
ルモン（ｈＣＧ）に対する抗体またはそれらのフラグメ
ントは、カルボキシペプチダーゼＧ２に接合可能で、得
られた接合体は、抗原結合および触媒機能の双方を保持
しているものである。これらの接合体を静脈注射した
後、これらはそれぞれ、ＣＥＡまたはｈＣＧ発現腫よう
に局在する。他の抗体は、対応する抗原を発現する腫よ
うに局在することが知られている。これらの腫ようは、
ヒトにおける原発性転移直腸ガン（ＣＥＡ）およびじゅ
う毛性ガン腫（ｈＣＧ）、またはその他の形態のガンで
ある可能性がある。このような抗体−酵素接合体はま
た、各々の抗原を発現する正常組織に局在可能である
が、抗原発現は、正常組織においてより分散するもので
ある。このような抗体−酵素接合体は、各々の抗原を介
して細胞膜に結合可能であり、または細胞間に分泌され
た抗原によりトラップ可能である。腫よう関連、免疫細
胞関連、および感染薬剤関連抗原の例を表１に示す。
【００２３】
表１
１．腫よう関連抗原
抗原 抗体 使用
ガン胎児性抗原 ｛Ｃ４６（アメルシャム） 結腸／直腸腫ようの
｛８５Ａ１２（ユニパス） イメージング＆セラピー
胎盤アルカリ Ｈ１７Ｅ２（ＩＣＲＦ、 精巣および卵巣ガンの
ホスファターゼ トラベラーズ＆ボドマー） イメージング＆セラピー
パン ガン腫 ＮＲ−ＬＵ−１０（ネオラ 小細胞肺ガンを含有する
（Ｐａｎ ックスコーポレーション） 種々のガンのイメージンＣ
ａｒｃｉｎｏｍａ） グ＆セラピー
多形性上皮ムチン ＨＭＦＧ１（テイラー 卵巣ガン、胸膜流出の
（ヒト乳脂肪小球） パパジミトリオウ、 イメージング＆セラピー
ＩＣＲＦ）
β−ヒトじゅう毛膜 Ｗ１４ ヌードマウスにおけるヒ
ゴナドトロピン ト異種移植片に対する酵
じゅう毛ガン 素（ＣＰＧ２）（シール
ら（１９８１）Ｂｒ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ ４４、１
３７−１４４）
ヒトガンにおける Ｌ６（ＩｇＧ２ａ）１ アルカリホスファターゼ
炭水化物 のターゲッティング（セ
ンサーら（１９８８）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５、４８４２−４８４
６）
Ｂリンパ球における １Ｆ５（ＩｇＧ２ａ）２ アルカリホスファターゼ
ＣＤ２０抗原 のターゲッティング（セ
（正常および新生物性） ンサーら（１９８８）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５、４８４２−４８４
６）
１ ヘルストロームら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６、３９１７
−３９２３
２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２、１７６６−１７７０
他の抗原としては、アルファフォエトプロテイン（ａｌｐｈａｆｏｅｔｏｐｒ
ｏｔｅｉｎ）、Ｃａ−１２５および前立腺特異性抗原が含まれる。
２．免疫細胞抗原
パンＴリンパ球表面 ＯＫＴ−３（オルソ） 腎臓移植用抗拒絶反応治療
抗原（ＣＤ３）
Ｂリンパ球表面抗原 ＲＦＢ４（ジャノシー、 Ｂ細胞リンパ球の免疫毒性
（ＣＤ２２） ローヤル フリー 治療
ホスピタル）
パンＴリンパ球表面 Ｈ６５（ボドマー、ノー 慢性関節リウマチ、ホスト
抗原（ＣＤ５） レルズ ＩＣＲＦ、 疾患に対する急性移植の免
ゾーマコーポレション、 疫毒性治療
米国にライセンス有り）
３．感染薬剤−関連抗原
ムンプスビール アンチ−ムンプス ムンプス治療用ジフテリア
ス−関連 ポリクローナル抗体 毒に接合した抗体
Ｂ型肝炎表面抗原 アンチＨＢｓ Ａｇ ヘパトームに対する免疫毒
性
【００２４】腫よう関連抗原に対する抗体との接合体の
投与の前に、腫よう部位における抗原の発現を増加させ
ることが優位である。というのは、これによって、腫よ
う部位に保持されている接合体の量を増加させることが
可能であるからである。いくつかの薬剤は、腫よう壊死
ファクタ（ＴＮＦ）（フォルシらによる文献（１９８
８）：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８、３６０７−３６１
２）およびインターフェロン（ボーデンの文献（１９８
８）：Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０、１
４８−１４９）を含有する抗体取り込みを増加させるこ
とが可能であるとされている。したがって、腫よう細胞
抗原の発現を、本発明の化合物の投与前または投与中、
１以上の薬剤を使用して促進することが好ましい。
投与の前に、腫よう部位における抗原の発現を増加させ
ることが優位である。というのは、これによって、腫よ
う部位に保持されている接合体の量を増加させることが
可能であるからである。いくつかの薬剤は、腫よう壊死
ファクタ（ＴＮＦ）（フォルシらによる文献（１９８
８）：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８、３６０７−３６１
２）およびインターフェロン（ボーデンの文献（１９８
８）：Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０、１
４８−１４９）を含有する抗体取り込みを増加させるこ
とが可能であるとされている。したがって、腫よう細胞
抗原の発現を、本発明の化合物の投与前または投与中、
１以上の薬剤を使用して促進することが好ましい。
【００２５】抗体、抗体フラグメントの取り込み、また
はそれらの種々の取り込みもまた、毛細管透過性を変え
ることにより、または、腫よう血流の変化による血管作
用性剤により、変更可能である。このような薬剤として
は、ヒスタミンおよびインターロイキン−２（ヘニガン
らによる文献：（１９９１）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅ
ｒ ６４、８７２−８７４））、フラボン酢酸（ビビー
らによる文献：（１９８９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ８１、２１６−２１９）が挙
げられるが、保護代謝物により腫よう部位の透過を阻害
する、または腫よう部位における酵素保持の増加を助力
するように、腫よう血流または毛細管透過性を変化させ
るのに、他の薬剤も使用可能である。したがって、腫よ
う血流を、本発明の化合物の投与中、または投与前に、
１以上の薬剤を用いて変化させることがさらに好まし
い。
はそれらの種々の取り込みもまた、毛細管透過性を変え
ることにより、または、腫よう血流の変化による血管作
用性剤により、変更可能である。このような薬剤として
は、ヒスタミンおよびインターロイキン−２（ヘニガン
らによる文献：（１９９１）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅ
ｒ ６４、８７２−８７４））、フラボン酢酸（ビビー
らによる文献：（１９８９）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ８１、２１６−２１９）が挙
げられるが、保護代謝物により腫よう部位の透過を阻害
する、または腫よう部位における酵素保持の増加を助力
するように、腫よう血流または毛細管透過性を変化させ
るのに、他の薬剤も使用可能である。したがって、腫よ
う血流を、本発明の化合物の投与中、または投与前に、
１以上の薬剤を用いて変化させることがさらに好まし
い。
【００２６】未変性状態で細胞毒性剤の効果を阻害する
ことの可能な物質は、前記細胞毒性剤における効果をよ
り示さない物質に変換可能である、十分に無毒な物質で
あってもよい。適当な化合物は、フォリン酸である。フ
ォリン酸は、たとえばジヒドロフォレートレドクターゼ
酵素に作用する、トリメトレキサート細胞毒性剤の生物
学的効果を逆にするものである。フォリン酸は、脱グル
タミン化されて、カルボキシペプチダーゼＧ２および他
の脱グルタミン化酵素により、トリメトレキサートに対
して不活性にするものである。同様の原理が、他の抗細
胞毒性剤に対しても適用可能である。たとえば、チミジ
ンは、チミジレートシンセターゼ酵素に作用する、ＣＢ
３７１７およびＩＣＩＤ１６９４（ジョドレルらによる
文献：（１９９１）ＢＪＣ６４、８３３−８；ジョーン
ズらの文献（１９８６）：Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２
９、４６８−４７２）などの細胞毒性剤の効果をブロッ
クする。したがって、チミジン分解酵素（たとえばジヒ
ドロチミン デヒドロゲナーゼ、シオタニおよびウエバ
ーによる文献（１９８１）：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５６、２１９−２２４）、またはチミジンキナーゼ
（シオタニらによる文献（１９８９）：Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．４９、１０９０−１０９４））が、細胞毒性剤
に対して、チミジンを効果的でなくするため、本発明の
化合物の不活性部として使用可能である。同様の考え方
が、ＤＮＡまたはＲＮＡへのヌクレオチド取り込みの正
常なプロセスを妨げる、他の薬剤に関しても適用され
る。というのは、腫よう部位をターゲットとする適当な
酵素により次いで分解可能である正常な代謝物によっ
て、この取り込みは可逆的であるからである。
ことの可能な物質は、前記細胞毒性剤における効果をよ
り示さない物質に変換可能である、十分に無毒な物質で
あってもよい。適当な化合物は、フォリン酸である。フ
ォリン酸は、たとえばジヒドロフォレートレドクターゼ
酵素に作用する、トリメトレキサート細胞毒性剤の生物
学的効果を逆にするものである。フォリン酸は、脱グル
タミン化されて、カルボキシペプチダーゼＧ２および他
の脱グルタミン化酵素により、トリメトレキサートに対
して不活性にするものである。同様の原理が、他の抗細
胞毒性剤に対しても適用可能である。たとえば、チミジ
ンは、チミジレートシンセターゼ酵素に作用する、ＣＢ
３７１７およびＩＣＩＤ１６９４（ジョドレルらによる
文献：（１９９１）ＢＪＣ６４、８３３−８；ジョーン
ズらの文献（１９８６）：Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２
９、４６８−４７２）などの細胞毒性剤の効果をブロッ
クする。したがって、チミジン分解酵素（たとえばジヒ
ドロチミン デヒドロゲナーゼ、シオタニおよびウエバ
ーによる文献（１９８１）：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５６、２１９−２２４）、またはチミジンキナーゼ
（シオタニらによる文献（１９８９）：Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．４９、１０９０−１０９４））が、細胞毒性剤
に対して、チミジンを効果的でなくするため、本発明の
化合物の不活性部として使用可能である。同様の考え方
が、ＤＮＡまたはＲＮＡへのヌクレオチド取り込みの正
常なプロセスを妨げる、他の薬剤に関しても適用され
る。というのは、腫よう部位をターゲットとする適当な
酵素により次いで分解可能である正常な代謝物によっ
て、この取り込みは可逆的であるからである。
【００２７】たとえば、広く使用されている細胞毒性５
−フルオロウラシル（ロッシュ プロダクツ インコー
ポレーションから入手可能）の細胞毒性効果は、少なく
とも部分的にウリジンにより減ずることが可能である
（グロアニンゲンらによる文献：（１９８９）Ｊ．Ｎａ
ｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１、１５７−１６
２）。ウリジン分解酵素と抗腫よう抗体の接合は、５−
フルオロウラシルおよびウリジンとの接合において使用
可能である。このような組み合わせは特に、５−フルオ
ロウラシルが最も効果的な細胞毒性剤の１つであるた
め、直腸および肺ガン腫に関連するものである。このよ
うな薬剤の組み合わせは、５−フルオロウラシルの細胞
毒性を増すフォリン酸と、またはさらには、チミジンお
よびチミジン不活性酵素と組み合わせることが可能であ
る。この化合物の不活性部は、抗細胞毒性剤物質に関し
て選択される。
−フルオロウラシル（ロッシュ プロダクツ インコー
ポレーションから入手可能）の細胞毒性効果は、少なく
とも部分的にウリジンにより減ずることが可能である
（グロアニンゲンらによる文献：（１９８９）Ｊ．Ｎａ
ｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１、１５７−１６
２）。ウリジン分解酵素と抗腫よう抗体の接合は、５−
フルオロウラシルおよびウリジンとの接合において使用
可能である。このような組み合わせは特に、５−フルオ
ロウラシルが最も効果的な細胞毒性剤の１つであるた
め、直腸および肺ガン腫に関連するものである。このよ
うな薬剤の組み合わせは、５−フルオロウラシルの細胞
毒性を増すフォリン酸と、またはさらには、チミジンお
よびチミジン不活性酵素と組み合わせることが可能であ
る。この化合物の不活性部は、抗細胞毒性剤物質に関し
て選択される。
【００２８】カルボキシペプチダーゼＧ２以外の酵素お
よびその等価体が使用可能である。これらは、ターゲッ
トとした代謝物に特異的であるべきであるが、ヒトまた
は非ヒト起源のものであってもよい。従来の酵素を使用
することは必ずしも必要ではない。触媒能力を有する抗
体が開発されており（トラモンタノら、サイエンス ２
３４、１５６６−１５７０）、”アブザイム（ａｂｚｙ
ｍｅｓ）”として知られている。これらは、ヒューマナ
イズさせて免疫原性を減少させることが可能であるとい
う優位性を有する。ヒトリンパ球から誘導され、チミジ
ンを分解可能な酵素が、開示されている（シオタニらに
よる文献：（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９、
１０９０−１０９４）。ジヒドロチミン デヒドロゲナ
ーゼおよびチミジン キナーゼが、チミジン シンセタ
ーゼのインヒビターとともに使用される、ここに開示さ
れているようなタイプのシステムにおいて使用可能であ
る。
よびその等価体が使用可能である。これらは、ターゲッ
トとした代謝物に特異的であるべきであるが、ヒトまた
は非ヒト起源のものであってもよい。従来の酵素を使用
することは必ずしも必要ではない。触媒能力を有する抗
体が開発されており（トラモンタノら、サイエンス ２
３４、１５６６−１５７０）、”アブザイム（ａｂｚｙ
ｍｅｓ）”として知られている。これらは、ヒューマナ
イズさせて免疫原性を減少させることが可能であるとい
う優位性を有する。ヒトリンパ球から誘導され、チミジ
ンを分解可能な酵素が、開示されている（シオタニらに
よる文献：（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９、
１０９０−１０９４）。ジヒドロチミン デヒドロゲナ
ーゼおよびチミジン キナーゼが、チミジン シンセタ
ーゼのインヒビターとともに使用される、ここに開示さ
れているようなタイプのシステムにおいて使用可能であ
る。
【００２９】チミジン分解およびリン酸化酵素が、チミ
ジン再利用経路をブロックすることにより、ここに開示
されているようなアンチ−フォレート治療におけるさら
なる要素として使用可能である。これらはまた、細胞毒
性剤、５−フルオロウラシルを用いたウリジン触媒酵素
とともに使用可能である。細菌酵素、カルボキシペプチ
ダーゼＧ１およびＧ２（ＣＰＧ１およびＣＰＧ２）は、
末端グルタミン酸の切断により、メトトレキサートを含
有するフォレートを分解する。これら２つの酵素の作用
は、同じであると考えられる。本発明の好ましい例は、
ＣＰＧ２に関するものであるが、ＣＰＧ１にも同様に適
応可能であり、同じ物質に作用する他の酵素にも、同じ
物質に作用するアブザイムにも、適用可能である。
ジン再利用経路をブロックすることにより、ここに開示
されているようなアンチ−フォレート治療におけるさら
なる要素として使用可能である。これらはまた、細胞毒
性剤、５−フルオロウラシルを用いたウリジン触媒酵素
とともに使用可能である。細菌酵素、カルボキシペプチ
ダーゼＧ１およびＧ２（ＣＰＧ１およびＣＰＧ２）は、
末端グルタミン酸の切断により、メトトレキサートを含
有するフォレートを分解する。これら２つの酵素の作用
は、同じであると考えられる。本発明の好ましい例は、
ＣＰＧ２に関するものであるが、ＣＰＧ１にも同様に適
応可能であり、同じ物質に作用する他の酵素にも、同じ
物質に作用するアブザイムにも、適用可能である。
【００３０】プソイゾモナスｓｐ．株ＲＳ−１６からの
カルボキシペプチダーゼＧ２の単離、精製、およびいく
らかの特性が、シェルウッドらの文献：（１９８４）
Ｅ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４８、４４７−４５３に開
示されている。前記カルボキシペプチダーゼＧ２をコー
ド化する遺伝子のクローン化、そのヌクレオチド配列、
およびその大腸菌における発現は、ミントンらによる文
献：（１９８４）Ｇｅｎｅ３１、３１−３８およびミン
トンらによる文献：（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１５６、１２２２−１２２７に開示されている。Ｃ
Ｐ２Ｇ２は、バイオテクノロジ部、センター オブ ア
プライド ミクロバイオロジカル リサーチ、ポートン
ダウン、サリスバリ、英国から入手可能である。カルボ
キシペプチダーゼＧ１（ＣＰＧ１）は、チャブナーらに
よる文献：（１９７２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３２、
２１１４−２１１９に開示されている。化合物の不活性
部が、酵素的に活性部である場合には、細胞特異性部か
らの単離の際に、酵素的に活性であるが、（ａ）細胞特
異性部と組み合わせる、および（ｂ）化合物がターゲッ
ト細胞に接着または隣接するとき、酵素的に活性となる
ことが必要である。
カルボキシペプチダーゼＧ２の単離、精製、およびいく
らかの特性が、シェルウッドらの文献：（１９８４）
Ｅ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４８、４４７−４５３に開
示されている。前記カルボキシペプチダーゼＧ２をコー
ド化する遺伝子のクローン化、そのヌクレオチド配列、
およびその大腸菌における発現は、ミントンらによる文
献：（１９８４）Ｇｅｎｅ３１、３１−３８およびミン
トンらによる文献：（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１５６、１２２２−１２２７に開示されている。Ｃ
Ｐ２Ｇ２は、バイオテクノロジ部、センター オブ ア
プライド ミクロバイオロジカル リサーチ、ポートン
ダウン、サリスバリ、英国から入手可能である。カルボ
キシペプチダーゼＧ１（ＣＰＧ１）は、チャブナーらに
よる文献：（１９７２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３２、
２１１４−２１１９に開示されている。化合物の不活性
部が、酵素的に活性部である場合には、細胞特異性部か
らの単離の際に、酵素的に活性であるが、（ａ）細胞特
異性部と組み合わせる、および（ｂ）化合物がターゲッ
ト細胞に接着または隣接するとき、酵素的に活性となる
ことが必要である。
【００３１】本発明の化合物の２つの部分は、オスリヴ
ァンらによる文献：（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１００、１００−１０８に一般的に記載されてい
るような、ポリペプチド架橋の常法により、ともに結合
可能である。たとえば、抗体部には、チオール基が多く
存在し、酵素部は、たとえば、ヨード酢酸（ＮＨＩＡ）
またはＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルなどの、これらのチオール基と反応
可能な二官能性剤と反応することが可能である。たとえ
ばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルなどの、アミドおよびチオエステル結合
は、一般的に、ジスルフィド結合よりも生体内でより安
定である。酵素全体が、本発明の化合物に存在する必要
はかならずしもないが、無論、触媒部は存在しなければ
ならないものである。
ァンらによる文献：（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１００、１００−１０８に一般的に記載されてい
るような、ポリペプチド架橋の常法により、ともに結合
可能である。たとえば、抗体部には、チオール基が多く
存在し、酵素部は、たとえば、ヨード酢酸（ＮＨＩＡ）
またはＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルなどの、これらのチオール基と反応
可能な二官能性剤と反応することが可能である。たとえ
ばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルなどの、アミドおよびチオエステル結合
は、一般的に、ジスルフィド結合よりも生体内でより安
定である。酵素全体が、本発明の化合物に存在する必要
はかならずしもないが、無論、触媒部は存在しなければ
ならないものである。
【００３２】または、化合物は、ＤＮＡ組み替え法によ
り融合化合物として製造可能であり、ここで、ＤＮＡの
長さは、互いに隣接する本発明の化合物の２つの部分を
コード化する各々の領域からなり、化合物の所望の特性
を破壊しないリンカーペプチドをコード化する領域によ
り分離される。考えられるところでは、本願化合物の２
つの部分は、全体的に、または部分的にオーバーラップ
可能である。融合体の抗体成分は、少なくとも１つの結
合部位により表される。抗体（または抗体フラグメン
ト）−酵素融合体の構成例は、ノイベルガーらによる
（１９８４）ネイチャー ３１２、６０４により開示さ
れている。ＤＮＡは次いで、本発明の化合物からなるポ
リペプチドを製造するため、適当なホストに発現され
る。本発明の化合物からなるポリペプチドをコード化す
るＤＮＡは、ここに含有された教示を考慮して適当に変
更された公知の方法にしたがって発現ベクターを構成す
べく使用可能である。この発現ベクターは次いで、本発
明のポリペプチドの製造と発現用の適当なホスト細胞に
形質転換するのに使用される。このような方法は、以下
の文献：ラッターらによる１９８４年４月３日付けの米
国特許第４４４０８５９号、バイスマンによる１９８５
年７月２３日付けの米国特許第４５３０９０１号、クロ
ールらによる１９８６年４月１５日付けの米国特許第４
５８２８００号、マークらによる１９８７年６月３０日
付けの米国特許第４６７７０６３号、ゴードレルによる
１９８７年７月７日付けの米国特許第４６７８７５１
号、イタクラらによる１９８７年１１月３日付けの米国
特許第４７０４３６２号、マレイによる１９８７年１２
月１日付けの米国特許第４７１０４６３号、ツール，Ｊ
ｒ．らによる１９８８年７月１２日付けの米国特許第４
７５７００６号、ゴエデルらによる１９８８年８月２３
日付けの米国特許第４７６６０７５号、およびスタルカ
ーによる１９８９年３月７日付けの米国特許第４８１０
６４８号、に記載されたものを含むものであり、これら
は全て、ここに参照されるものである。
り融合化合物として製造可能であり、ここで、ＤＮＡの
長さは、互いに隣接する本発明の化合物の２つの部分を
コード化する各々の領域からなり、化合物の所望の特性
を破壊しないリンカーペプチドをコード化する領域によ
り分離される。考えられるところでは、本願化合物の２
つの部分は、全体的に、または部分的にオーバーラップ
可能である。融合体の抗体成分は、少なくとも１つの結
合部位により表される。抗体（または抗体フラグメン
ト）−酵素融合体の構成例は、ノイベルガーらによる
（１９８４）ネイチャー ３１２、６０４により開示さ
れている。ＤＮＡは次いで、本発明の化合物からなるポ
リペプチドを製造するため、適当なホストに発現され
る。本発明の化合物からなるポリペプチドをコード化す
るＤＮＡは、ここに含有された教示を考慮して適当に変
更された公知の方法にしたがって発現ベクターを構成す
べく使用可能である。この発現ベクターは次いで、本発
明のポリペプチドの製造と発現用の適当なホスト細胞に
形質転換するのに使用される。このような方法は、以下
の文献：ラッターらによる１９８４年４月３日付けの米
国特許第４４４０８５９号、バイスマンによる１９８５
年７月２３日付けの米国特許第４５３０９０１号、クロ
ールらによる１９８６年４月１５日付けの米国特許第４
５８２８００号、マークらによる１９８７年６月３０日
付けの米国特許第４６７７０６３号、ゴードレルによる
１９８７年７月７日付けの米国特許第４６７８７５１
号、イタクラらによる１９８７年１１月３日付けの米国
特許第４７０４３６２号、マレイによる１９８７年１２
月１日付けの米国特許第４７１０４６３号、ツール，Ｊ
ｒ．らによる１９８８年７月１２日付けの米国特許第４
７５７００６号、ゴエデルらによる１９８８年８月２３
日付けの米国特許第４７６６０７５号、およびスタルカ
ーによる１９８９年３月７日付けの米国特許第４８１０
６４８号、に記載されたものを含むものであり、これら
は全て、ここに参照されるものである。
【００３３】本発明の化合物からなるポリペプチドをコ
ード化するＤＮＡは、適当なホストに導入するための他
の種々のＤＮＡ配列に結合可能である。これらの他のＤ
ＮＡ（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ＤＮＡ）は、ホストの特
性、ＤＮＡのホストへの導入方法、およびエピソーム保
持または組み込みが所望であるかいなかに依存する。一
般的には、ＤＮＡは、プラスミドなどの、発現の正しい
読み枠と正確な方向で、発現ベクターに挿入される。必
要であれば、ＤＮＡは、所望のホストにより認識され
た、適当な転写および翻訳調節ヌクレオチド配列に結合
可能であるが、これらの調節は一般的には、発現ベクタ
ーに有用である。このベクターは次いで標準法によりホ
ストに導入される。一般的には、全てのホストがベクタ
ーにより形質転換されるわけではない。したがって、形
質転換されたホスト細胞用に選択することが必要であ
る。ある選択法によれば、抗生物質耐性などの、形質転
換された細胞における選択可能な形質用にコード化す
る、必要な調節エレメントとともに発現ベクターにＤＮ
Ａ配列を組み入れるものである。または、選択可能な形
質用遺伝子が他のベクターに存在可能であり、このベク
ターは、所望のホスト細胞を同時形質転換するために使
用されるものである。
ード化するＤＮＡは、適当なホストに導入するための他
の種々のＤＮＡ配列に結合可能である。これらの他のＤ
ＮＡ（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ＤＮＡ）は、ホストの特
性、ＤＮＡのホストへの導入方法、およびエピソーム保
持または組み込みが所望であるかいなかに依存する。一
般的には、ＤＮＡは、プラスミドなどの、発現の正しい
読み枠と正確な方向で、発現ベクターに挿入される。必
要であれば、ＤＮＡは、所望のホストにより認識され
た、適当な転写および翻訳調節ヌクレオチド配列に結合
可能であるが、これらの調節は一般的には、発現ベクタ
ーに有用である。このベクターは次いで標準法によりホ
ストに導入される。一般的には、全てのホストがベクタ
ーにより形質転換されるわけではない。したがって、形
質転換されたホスト細胞用に選択することが必要であ
る。ある選択法によれば、抗生物質耐性などの、形質転
換された細胞における選択可能な形質用にコード化す
る、必要な調節エレメントとともに発現ベクターにＤＮ
Ａ配列を組み入れるものである。または、選択可能な形
質用遺伝子が他のベクターに存在可能であり、このベク
ターは、所望のホスト細胞を同時形質転換するために使
用されるものである。
【００３４】本発明の組み替えＤＮＡにより形質転換さ
れたホスト細胞は次いで、回収可能なポリペプチド発現
を許容するため、ここに記載された教示によって、当業
者に公知の適当な条件下、十分な時間、培養された。バ
クテリア（たとえば大腸菌および枯草菌）、酵母菌（た
とえばサッカロミセス セレヴィジエ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸状菌（た
とえばアスペルギルス）、植物細胞、動物細胞および昆
虫細胞を含む、多くの発現システムが知られている。
れたホスト細胞は次いで、回収可能なポリペプチド発現
を許容するため、ここに記載された教示によって、当業
者に公知の適当な条件下、十分な時間、培養された。バ
クテリア（たとえば大腸菌および枯草菌）、酵母菌（た
とえばサッカロミセス セレヴィジエ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸状菌（た
とえばアスペルギルス）、植物細胞、動物細胞および昆
虫細胞を含む、多くの発現システムが知られている。
【００３５】ベクターは、たとえベクターが、他の非原
核細胞タイプにおける発現に使用されるべきものであっ
ても、ＣｏｌＥｌ ｏｒｉなどの、原核における伝播用
原核レプリコンを含有する。ベクターはまた、それを用
いて形質転換された、大腸菌などの、細菌性ホスト細胞
における遺伝子の発現（転写および翻訳）原核プロモー
ターなどの適当なプロモーターを含有可能である。プロ
モーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と転写がおこる
ことを許容するＤＮＡ配列により形成された発現調節エ
レメントである。典型的な細菌性ホストと適合可能なプ
ロモーター配列は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメ
ントの挿入に関して有利に制限された部位を含有するプ
ラスミドベクターに存在するものである。典型的な原核
ベクタープラスミドは、バイオラド ラボラトリーズ
（リッチモンド、ＣＡ、米国）から入手可能な、ｐＵＣ
１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３３２、およびｐＢＲ３２
９、ファルマシア、ピスカタウエイ、ＮＪ、米国から入
手可能なｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３であ
る。
核細胞タイプにおける発現に使用されるべきものであっ
ても、ＣｏｌＥｌ ｏｒｉなどの、原核における伝播用
原核レプリコンを含有する。ベクターはまた、それを用
いて形質転換された、大腸菌などの、細菌性ホスト細胞
における遺伝子の発現（転写および翻訳）原核プロモー
ターなどの適当なプロモーターを含有可能である。プロ
モーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と転写がおこる
ことを許容するＤＮＡ配列により形成された発現調節エ
レメントである。典型的な細菌性ホストと適合可能なプ
ロモーター配列は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメ
ントの挿入に関して有利に制限された部位を含有するプ
ラスミドベクターに存在するものである。典型的な原核
ベクタープラスミドは、バイオラド ラボラトリーズ
（リッチモンド、ＣＡ、米国）から入手可能な、ｐＵＣ
１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３３２、およびｐＢＲ３２
９、ファルマシア、ピスカタウエイ、ＮＪ、米国から入
手可能なｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３であ
る。
【００３６】典型的なほ乳類細胞ベクタープラスミド
は、ファルマシア、ピスカタウエイ、ＮＪ、米国から入
手可能なｐＳＶＬである。このベクターは、クローン化
された遺伝子を発現させるために、ＳＶ４０後期プロモ
ーターを使用し、発現の最高レベルは、ＣＯＳ−１細胞
などのＴ−抗原形成細胞において見られるものである。
誘導可能なほ乳類発現ベクターの例は、ｐＭＳＧであ
り、これもまたファルマシアから入手可能である。この
ベクターは、クローン化された遺伝子を発現するため、
マウスほ乳類腫ようウイルス長末端重複のグルココルチ
コイド誘導性プロモーターを使用する。
は、ファルマシア、ピスカタウエイ、ＮＪ、米国から入
手可能なｐＳＶＬである。このベクターは、クローン化
された遺伝子を発現させるために、ＳＶ４０後期プロモ
ーターを使用し、発現の最高レベルは、ＣＯＳ−１細胞
などのＴ−抗原形成細胞において見られるものである。
誘導可能なほ乳類発現ベクターの例は、ｐＭＳＧであ
り、これもまたファルマシアから入手可能である。この
ベクターは、クローン化された遺伝子を発現するため、
マウスほ乳類腫ようウイルス長末端重複のグルココルチ
コイド誘導性プロモーターを使用する。
【００３７】有用な酵母菌プラスミドベクターは、ｐＲ
Ｓ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、
一般的には、ストラタジーン クローンニング システ
ムズ、ラ ジョラ、ＣＡ ９２０３７、米国から入手可
能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐ
ＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は、イースト インテグ
レーティング プラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母菌
選択可能な標識ｈｉｓ３、ｔｒｐ１、ｌｅｕ２、および
ｕｒａ３を取り込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３−
４１６は、イースト セントロメール プラスミド（Ｙ
Ｃｐｓ）である。相補的付着末端を経由してＤＮＡをベ
クターに結合させるために、種々の方法が開発されてい
る。たとえば、相補的ホモポリマートラクトは、ベクタ
ーＤＮＡに挿入されるべきＤＮＡセグメントに添加可能
である。ベクターおよびＤＮＡセグメントは次いで、組
み替えＤＮＡ分子を形成するため、相補的ホモポリマー
末端間における水素結合により結合する。
Ｓ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、
一般的には、ストラタジーン クローンニング システ
ムズ、ラ ジョラ、ＣＡ ９２０３７、米国から入手可
能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐ
ＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は、イースト インテグ
レーティング プラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母菌
選択可能な標識ｈｉｓ３、ｔｒｐ１、ｌｅｕ２、および
ｕｒａ３を取り込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３−
４１６は、イースト セントロメール プラスミド（Ｙ
Ｃｐｓ）である。相補的付着末端を経由してＤＮＡをベ
クターに結合させるために、種々の方法が開発されてい
る。たとえば、相補的ホモポリマートラクトは、ベクタ
ーＤＮＡに挿入されるべきＤＮＡセグメントに添加可能
である。ベクターおよびＤＮＡセグメントは次いで、組
み替えＤＮＡ分子を形成するため、相補的ホモポリマー
末端間における水素結合により結合する。
【００３８】１以上の制限部位を含有する合成リンカー
は、ＤＮＡセグメントをベクターに結合させる他の方法
を提供する。上記したようなエンドヌクレアーゼ制限消
化により得られたＤＮＡセグメントは、３’−５’−エ
キソヌクレオリティックな活性を有する３’−シングル
鎖末端の突出を除去し、重合活性を有する凹んだ３’−
末端を埋める酵素、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたは
バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理され
る。これらの活性の組み合わせはしたがって、平滑断端
ＤＮＡセグメントを形成する。平滑断端セグメントは次
いで、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼなどの平
滑断端ＤＮＡ分子の連結反応を触媒することの可能な酵
素の存在下、過剰モルのリンカー分子でインキュベート
される。この反応により得られたプロダクトは、末端に
おいて重合性リンカー配列を運ぶＤＮＡセグメントであ
る。これらのＤＮＡセグメントは次いで、適当な制限酵
素により分解され、ＤＮＡセグメントのそれらと適合す
る末端を製造する酵素で既に分解された発現ベクターに
結合する。
は、ＤＮＡセグメントをベクターに結合させる他の方法
を提供する。上記したようなエンドヌクレアーゼ制限消
化により得られたＤＮＡセグメントは、３’−５’−エ
キソヌクレオリティックな活性を有する３’−シングル
鎖末端の突出を除去し、重合活性を有する凹んだ３’−
末端を埋める酵素、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたは
バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理され
る。これらの活性の組み合わせはしたがって、平滑断端
ＤＮＡセグメントを形成する。平滑断端セグメントは次
いで、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼなどの平
滑断端ＤＮＡ分子の連結反応を触媒することの可能な酵
素の存在下、過剰モルのリンカー分子でインキュベート
される。この反応により得られたプロダクトは、末端に
おいて重合性リンカー配列を運ぶＤＮＡセグメントであ
る。これらのＤＮＡセグメントは次いで、適当な制限酵
素により分解され、ＤＮＡセグメントのそれらと適合す
る末端を製造する酵素で既に分解された発現ベクターに
結合する。
【００３９】種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有
する合成リンカーは、たとえばインターナショナル バ
イオテクノロジーズ インコーポレーション、ニューヘ
ブン、ＣＮ、米国等、種々のところから商業的に入手可
能である。本発明のポリペプチドをコード化するＤＮＡ
を修飾する所望の方法は、サイキら（１９８８）、サイ
エンス ２３９、４８７−４９１に記載されたようなポ
リメラーゼ鎖反応を使用することである。
する合成リンカーは、たとえばインターナショナル バ
イオテクノロジーズ インコーポレーション、ニューヘ
ブン、ＣＮ、米国等、種々のところから商業的に入手可
能である。本発明のポリペプチドをコード化するＤＮＡ
を修飾する所望の方法は、サイキら（１９８８）、サイ
エンス ２３９、４８７−４９１に記載されたようなポ
リメラーゼ鎖反応を使用することである。
【００４０】この方法においては、酵素的に増殖するＤ
ＮＡは、それ自身が増殖したＤＮＡに取り込まれる２つ
の特異性オリゴヌクレオチドプライマーに隣接する。前
記特異性プライマーは、常法を用いて、発現ベクターへ
のクローン化に使用可能な制限エンドヌクレアーゼ認識
部位を含有可能である。本発明の実施において有用であ
ると考えられる酵母菌の典型的な属は、ピシア（Ｐｉｃ
ｈｉａ）、サッカロミセス、クルイブエロミセス（Ｋｌ
ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ、トルロプシス、
ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、シゾサッカロミセ
ス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シテ
ロミセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン（Ｐ
ａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍ
ｙｃｅｓ）、メトシュニコビア（Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋ
ｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉ
ｄｉｕｍ）、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒ
ｉｄｉｕｍ）、ボトリオアスクス（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃ
ｕｓ）、スポリドボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕ
ｓ）、エンドマイコプシス（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉ
ｓ）、などである。好ましい属は、ピシア（Ｐｉｃｈｉ
ａ）、サッカロミセス、クルイブエロマイシス（Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉ
ａ）、およびハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）からな
る群から選択されたものである。サッカロミセスの例と
しては、サッカロミセス セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミ
セス イタリクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｉｔ
ａｌｉｃｕｓ）、サッカロミセス ロキシ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）があげられる。クル
イブエロミセスの例としては、クルイブエロミセス フ
ラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌ
ｉｓ）およびクルイブエロミセス ラクチス（Ｋｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）があげられる。ハ
ンセヌラの例としては、ハンセヌラ ポリモルファ（Ｈ
ａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ハンセヌラ
アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ）、
およびハンセヌラ カプスアタ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
ｃａｐｓｕｌａｔａ）があげられる。
ＮＡは、それ自身が増殖したＤＮＡに取り込まれる２つ
の特異性オリゴヌクレオチドプライマーに隣接する。前
記特異性プライマーは、常法を用いて、発現ベクターへ
のクローン化に使用可能な制限エンドヌクレアーゼ認識
部位を含有可能である。本発明の実施において有用であ
ると考えられる酵母菌の典型的な属は、ピシア（Ｐｉｃ
ｈｉａ）、サッカロミセス、クルイブエロミセス（Ｋｌ
ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ、トルロプシス、
ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、シゾサッカロミセ
ス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シテ
ロミセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン（Ｐ
ａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍ
ｙｃｅｓ）、メトシュニコビア（Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋ
ｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉ
ｄｉｕｍ）、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒ
ｉｄｉｕｍ）、ボトリオアスクス（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃ
ｕｓ）、スポリドボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕ
ｓ）、エンドマイコプシス（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉ
ｓ）、などである。好ましい属は、ピシア（Ｐｉｃｈｉ
ａ）、サッカロミセス、クルイブエロマイシス（Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉ
ａ）、およびハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）からな
る群から選択されたものである。サッカロミセスの例と
しては、サッカロミセス セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミ
セス イタリクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｉｔ
ａｌｉｃｕｓ）、サッカロミセス ロキシ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）があげられる。クル
イブエロミセスの例としては、クルイブエロミセス フ
ラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌ
ｉｓ）およびクルイブエロミセス ラクチス（Ｋｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）があげられる。ハ
ンセヌラの例としては、ハンセヌラ ポリモルファ（Ｈ
ａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ハンセヌラ
アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ）、
およびハンセヌラ カプスアタ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
ｃａｐｓｕｌａｔａ）があげられる。
【００４１】Ｓ．セレビジアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）の形質転換方法は、一般的には、ＥＰ２５１７４
４、ＥＰ２５８０６７、およびＷＯ９０／０１０６３に
教示されており、これらの文献全ては、ここに組み入れ
られるものである。Ｓ．セレビジアエ（ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）用の適当なプロモータは、ＰＧＫ１遺伝子、Ｇ
ＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣ１、ＰＨＯ５、
ＴＲＰ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−
３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナー
ゼ、ピルベイト デカルボキシラーゼ、ホスホフラクト
キナーゼ、トリオース ホスフェート イソメラーゼ、
ホスホグルコース イソメラーゼ、グルコキナーゼ、α
−メーティングファクターフェロモン、およびａ−メー
ティングファクターフェロモンの遺伝子を連合したプロ
モーター、ＰＲＢ１プロモーター、ＧＵＴ２プロモータ
ー、および、他のプロモーターの５’調節領域を有する
または上流活性部を有する（たとえばＥＰ−Ａ−２５８
０６７のプロモータ）５’調節領域の部分のハイブリッ
ドを含有するハイブリッドプロモーターを含有する。
ｅ）の形質転換方法は、一般的には、ＥＰ２５１７４
４、ＥＰ２５８０６７、およびＷＯ９０／０１０６３に
教示されており、これらの文献全ては、ここに組み入れ
られるものである。Ｓ．セレビジアエ（ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）用の適当なプロモータは、ＰＧＫ１遺伝子、Ｇ
ＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣ１、ＰＨＯ５、
ＴＲＰ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−
３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナー
ゼ、ピルベイト デカルボキシラーゼ、ホスホフラクト
キナーゼ、トリオース ホスフェート イソメラーゼ、
ホスホグルコース イソメラーゼ、グルコキナーゼ、α
−メーティングファクターフェロモン、およびａ−メー
ティングファクターフェロモンの遺伝子を連合したプロ
モーター、ＰＲＢ１プロモーター、ＧＵＴ２プロモータ
ー、および、他のプロモーターの５’調節領域を有する
または上流活性部を有する（たとえばＥＰ−Ａ−２５８
０６７のプロモータ）５’調節領域の部分のハイブリッ
ドを含有するハイブリッドプロモーターを含有する。
【００４２】転写終結シグナルは好ましくは、ポリアデ
ニル化および転写終用の正確なシグナルを含有する真核
遺伝子の３’隣接配列である。適当な３’隣接配列は、
たとえば、使用された発現制御配列に自然に結合した遺
伝子のものであってもよく、すなわち、プロモーターに
相当するものである。または、これらは、Ｓ．セレビジ
アエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨＤ１遺伝子の終結シ
グナルが好ましい場合には、異なっていてもよい。
ニル化および転写終用の正確なシグナルを含有する真核
遺伝子の３’隣接配列である。適当な３’隣接配列は、
たとえば、使用された発現制御配列に自然に結合した遺
伝子のものであってもよく、すなわち、プロモーターに
相当するものである。または、これらは、Ｓ．セレビジ
アエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨＤ１遺伝子の終結シ
グナルが好ましい場合には、異なっていてもよい。
【００４３】本発明によればさらに、ホストにおけるタ
ーゲット細胞の破壊方法が提供され、この方法は、ホス
トに、（ｉ）本発明による化合物、（ｉｉ）細胞毒性
剤、および、（ｉｉｉ）未変性状態において前記細胞毒
性剤の効果を抑制可能で、前記不活性部により前記細胞
毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換されるこ
との可能な物質を投与することからなる。
ーゲット細胞の破壊方法が提供され、この方法は、ホス
トに、（ｉ）本発明による化合物、（ｉｉ）細胞毒性
剤、および、（ｉｉｉ）未変性状態において前記細胞毒
性剤の効果を抑制可能で、前記不活性部により前記細胞
毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換されるこ
との可能な物質を投与することからなる。
【００４４】好ましくは、本発明の化合物が投与され、
一旦、腫ように接合した化合物の絶対レベルと化合物の
正常細胞に対する腫ようの比率との間の最適バランスが
生じると、細胞毒性剤の効果をブロック可能な物質とと
もに細胞毒性剤が投与される。しかしながら、他の投与
方法も適用可能である。血液で循環する本発明の化合物
の量は、酵素部の活性を測定することにより定めること
ができる。
一旦、腫ように接合した化合物の絶対レベルと化合物の
正常細胞に対する腫ようの比率との間の最適バランスが
生じると、細胞毒性剤の効果をブロック可能な物質とと
もに細胞毒性剤が投与される。しかしながら、他の投与
方法も適用可能である。血液で循環する本発明の化合物
の量は、酵素部の活性を測定することにより定めること
ができる。
【００４５】好ましくは、本発明は、腫ようを有するほ
乳類の治療方法を提供する。適当には、ほ乳類をまず、
本発明による化合物を投与し、ターゲット細胞に結合し
ていない化合物に対するターゲット細胞に結合する化合
物の比率を所望の値にすることにより、腫よう治療用に
調製する。この方法はさらに、ほ乳類に、細胞毒性剤、
および、未変性状態に於て前記細胞毒性剤の効果を抑制
可能で、前記化合物の不活性部により前記細胞毒性剤に
対してより効果を示さない物質を発生可能な、物質を投
与することからなる。
乳類の治療方法を提供する。適当には、ほ乳類をまず、
本発明による化合物を投与し、ターゲット細胞に結合し
ていない化合物に対するターゲット細胞に結合する化合
物の比率を所望の値にすることにより、腫よう治療用に
調製する。この方法はさらに、ほ乳類に、細胞毒性剤、
および、未変性状態に於て前記細胞毒性剤の効果を抑制
可能で、前記化合物の不活性部により前記細胞毒性剤に
対してより効果を示さない物質を発生可能な、物質を投
与することからなる。
【００４６】本発明の化合物は、適当な方法で、通常は
非経口で、たとえば、静脈内、腹腔内に、またはぼうこ
う内に、希釈剤およびキャリアの標準無菌、非発熱原性
製剤で、たとえば等張塩類溶液（静脈内投与の場合）で
投与される。本発明はしたがって、ターゲットガンによ
り発現された細胞毒性剤の効果から正常組織を保護しつ
つ、腫よう部位における細胞毒性剤の連続した作用を保
持する手段を提供する。未変性状態に於て細胞毒性剤の
効果を抑制可能である物質が、正常な組織を保護するの
に十分な投与レベルで投与される。しかしながら、腫よ
うに至る物質は、それが細胞に入り、細胞毒性剤から細
胞を保護することが可能となる前に、不活性となる。こ
のように、保護分子は迅速に腫よう部位で分解される一
方、正常な組織は細胞毒性剤の効果から保護される。細
胞毒性剤およびインヒビターは、本発明の化合物用に記
載された種々のルートにより投与され、経口投与も可能
である。
非経口で、たとえば、静脈内、腹腔内に、またはぼうこ
う内に、希釈剤およびキャリアの標準無菌、非発熱原性
製剤で、たとえば等張塩類溶液（静脈内投与の場合）で
投与される。本発明はしたがって、ターゲットガンによ
り発現された細胞毒性剤の効果から正常組織を保護しつ
つ、腫よう部位における細胞毒性剤の連続した作用を保
持する手段を提供する。未変性状態に於て細胞毒性剤の
効果を抑制可能である物質が、正常な組織を保護するの
に十分な投与レベルで投与される。しかしながら、腫よ
うに至る物質は、それが細胞に入り、細胞毒性剤から細
胞を保護することが可能となる前に、不活性となる。こ
のように、保護分子は迅速に腫よう部位で分解される一
方、正常な組織は細胞毒性剤の効果から保護される。細
胞毒性剤およびインヒビターは、本発明の化合物用に記
載された種々のルートにより投与され、経口投与も可能
である。
【００４７】抗体−酵素接合体が、一般的には腫ように
おいてピーク濃度になるのは、２４時間以内であり、酵
素活性は、腫よう部位において７−８日まで存続するも
のである。抗体−酵素接合体はまた、数日間、血液およ
び非腫よう組織において持続する。非腫よう組織におけ
る酵素は、インヒビター物質を分解するため、その保護
効果が減少するかまたはその必要性が増す傾向にある。
血液からの酵素のクリアランスは促進可能であり、また
は、酵素を、いくつかの方法により腫よう部位における
酵素レベルを大きく変えることなしに不活性にすること
が可能である。これらの技術は、他の成分に、添加的に
および有用に使用可能である。抗体−酵素接合体におい
て使用された抗体または抗体フラグメントは、（モリソ
ンらの文献（１９８４）：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａａ
ｄ．Ｓｃｉ．米国、８１、６８５１−６８５５およびリ
ーシュマンらによる文献（１９８８）：ネーチャー、３
３２、３２３−３２７に開示されているように）これら
の免疫原性を減少させるために’ヒューマナイズ’され
ることが可能であるが、細菌性酵素ＣＰＧ１およびＣＰ
Ｇ２は、ヒト類似体を有さず、人間において繰り返し使
用するためには、免疫抑制または免疫寛容性を誘導する
手段を使用するべくまたは免疫原性を減少させるべくそ
れらを変性することが望まれる。抗体−酵素接合体に適
用可能な、異質の蛋白質の免疫原性を減少させる方法と
しては、ポリエチレングリコールの形態に接合するもの
を含有する（ウイルキンソンらの文献（１９８７）：
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９、３２６−３３１）。
おいてピーク濃度になるのは、２４時間以内であり、酵
素活性は、腫よう部位において７−８日まで存続するも
のである。抗体−酵素接合体はまた、数日間、血液およ
び非腫よう組織において持続する。非腫よう組織におけ
る酵素は、インヒビター物質を分解するため、その保護
効果が減少するかまたはその必要性が増す傾向にある。
血液からの酵素のクリアランスは促進可能であり、また
は、酵素を、いくつかの方法により腫よう部位における
酵素レベルを大きく変えることなしに不活性にすること
が可能である。これらの技術は、他の成分に、添加的に
および有用に使用可能である。抗体−酵素接合体におい
て使用された抗体または抗体フラグメントは、（モリソ
ンらの文献（１９８４）：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａａ
ｄ．Ｓｃｉ．米国、８１、６８５１−６８５５およびリ
ーシュマンらによる文献（１９８８）：ネーチャー、３
３２、３２３−３２７に開示されているように）これら
の免疫原性を減少させるために’ヒューマナイズ’され
ることが可能であるが、細菌性酵素ＣＰＧ１およびＣＰ
Ｇ２は、ヒト類似体を有さず、人間において繰り返し使
用するためには、免疫抑制または免疫寛容性を誘導する
手段を使用するべくまたは免疫原性を減少させるべくそ
れらを変性することが望まれる。抗体−酵素接合体に適
用可能な、異質の蛋白質の免疫原性を減少させる方法と
しては、ポリエチレングリコールの形態に接合するもの
を含有する（ウイルキンソンらの文献（１９８７）：
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９、３２６−３３１）。
【００４８】または、免疫原性の問題は、免疫サプレッ
サーまたは免疫寛容誘導剤を投与することにより、解決
可能することができる。シクロスポリンおよびＦＫ５０
６は、組織移植において免疫抑制を行うために広く使用
される薬剤である。シクロスポリンは、異質の蛋白質へ
のホスト抗体反応を遅らせることが示されている（レー
ダーマンらによる文献（１９８８）：Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ、５８、５６２−５６６および６５４−６５
７）。ホストが、リンパ球におけるＣＤ４エピトープに
向かう抗体を受容後、最初に外的問題に出くわした時の
異質蛋白質への許容が開示されている（ウオルドマンら
による文献（１９８８）、１６−３０ページ、プログレ
ス イン アレルギー（シザタ アンド ウオクスマ
ン、ニューヨーク）。これを達成するためのさらなる手
段は、他のところにも開示されており、異質抗原へのホ
スト抗体反応の制御において改善がおこるとき、変化可
能である。触媒抗体（アブジムズ）は、これらの免疫原
性を減少または除去するために’ヒューマナイズ’可能
である。抗体−酵素接合体または抗原に結合した腫よう
に向かう抗体が、適当な腫ようを有するホストに投与さ
れると、抗体または接合体の小さいフラクション部のみ
が、腫よう部位に局在し、そのほとんどは、数日間、血
液中および他の正常組織に残存する。酵素の腫ようにお
ける濃度は、正常組織においてよりも高いが、正常組織
の容量はより大きいものである。したがって、正常組織
および血液に残存する酵素の量を最小限にするために、
血液から過剰の抗原−酵素接合体を不活性化してクリア
にするための、国際出願８９／１０１４０；バグシャウ
の文献（１９８９）：Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６
０、２７５−２８１；およびシャルマらの文献（１９９
０）：Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６１、６５９−６
６２に記載された方法とともに、本発明の方法を用いる
ことが望ましい。
サーまたは免疫寛容誘導剤を投与することにより、解決
可能することができる。シクロスポリンおよびＦＫ５０
６は、組織移植において免疫抑制を行うために広く使用
される薬剤である。シクロスポリンは、異質の蛋白質へ
のホスト抗体反応を遅らせることが示されている（レー
ダーマンらによる文献（１９８８）：Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ、５８、５６２−５６６および６５４−６５
７）。ホストが、リンパ球におけるＣＤ４エピトープに
向かう抗体を受容後、最初に外的問題に出くわした時の
異質蛋白質への許容が開示されている（ウオルドマンら
による文献（１９８８）、１６−３０ページ、プログレ
ス イン アレルギー（シザタ アンド ウオクスマ
ン、ニューヨーク）。これを達成するためのさらなる手
段は、他のところにも開示されており、異質抗原へのホ
スト抗体反応の制御において改善がおこるとき、変化可
能である。触媒抗体（アブジムズ）は、これらの免疫原
性を減少または除去するために’ヒューマナイズ’可能
である。抗体−酵素接合体または抗原に結合した腫よう
に向かう抗体が、適当な腫ようを有するホストに投与さ
れると、抗体または接合体の小さいフラクション部のみ
が、腫よう部位に局在し、そのほとんどは、数日間、血
液中および他の正常組織に残存する。酵素の腫ようにお
ける濃度は、正常組織においてよりも高いが、正常組織
の容量はより大きいものである。したがって、正常組織
および血液に残存する酵素の量を最小限にするために、
血液から過剰の抗原−酵素接合体を不活性化してクリア
にするための、国際出願８９／１０１４０；バグシャウ
の文献（１９８９）：Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６
０、２７５−２８１；およびシャルマらの文献（１９９
０）：Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６１、６５９−６
６２に記載された方法とともに、本発明の方法を用いる
ことが望ましい。
【００４９】ガン撲滅を達成する試みにおいて、腫よう
ターゲット（骨髄サプレッション）における効果は、こ
こに記載したシステムを用いるとより少なくなると予測
されるが、造血機能の抑制を妨害することは不可能であ
る。同様に、ある程度の骨髄サプレッションには、より
多くの腫よう効果が予想される。造血組織に作用する成
長ファクタは通常、ここに記載されたシステムと組み合
わせて使用可能である。ここに記載されたシステムは、
他の治療形態とともに使用可能である。これらとして
は、従来の細胞毒性剤、および１より多い代謝生成物を
不活性にするための多酵素送達の使用を含むものであ
る。同様に、抗体により腫よう部位に運ばれた酵素は、
正常組織を保護する代謝生成物を不活性にし、かつ、プ
ロドラッグを活性化するために、機能可能である。ここ
に記載したようなカルボキシペプチダーゼＧ２は、トリ
メトレキサートに対して保護されていない腫よう細胞を
残すために、腫よう部位におけるフォリン酸を不活性に
するものである。同様の腫よう局在酵素は、（バグシャ
ウの文献（１９８９）：Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、
６０、２７５−２８１に記載されているように）細胞毒
性マスタードを形成すべく、安息香酸プロドラッグを活
性化することが可能である。
ターゲット（骨髄サプレッション）における効果は、こ
こに記載したシステムを用いるとより少なくなると予測
されるが、造血機能の抑制を妨害することは不可能であ
る。同様に、ある程度の骨髄サプレッションには、より
多くの腫よう効果が予想される。造血組織に作用する成
長ファクタは通常、ここに記載されたシステムと組み合
わせて使用可能である。ここに記載されたシステムは、
他の治療形態とともに使用可能である。これらとして
は、従来の細胞毒性剤、および１より多い代謝生成物を
不活性にするための多酵素送達の使用を含むものであ
る。同様に、抗体により腫よう部位に運ばれた酵素は、
正常組織を保護する代謝生成物を不活性にし、かつ、プ
ロドラッグを活性化するために、機能可能である。ここ
に記載したようなカルボキシペプチダーゼＧ２は、トリ
メトレキサートに対して保護されていない腫よう細胞を
残すために、腫よう部位におけるフォリン酸を不活性に
するものである。同様の腫よう局在酵素は、（バグシャ
ウの文献（１９８９）：Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、
６０、２７５−２８１に記載されているように）細胞毒
性マスタードを形成すべく、安息香酸プロドラッグを活
性化することが可能である。
【００５０】むろん、１以上のプロドラッグが活性薬剤
に変換され、１以上の保護剤が腫よう部位において分解
されるように、１以上の酵素が、同じ又は異なった抗体
により、腫よう部位に向かうことが可能である。したが
って、２以上の酵素が同じ抗体に結合可能である。抗体
−酵素接合体は一般的には、１２−２４時間以内に腫よ
う部位において最大濃度に達し、プラズマおよび他の体
液からなくなるのに数日かかるので、抗体−酵素接合体
をクリアにすることを促進し、血液中に存在する特異性
酵素を不活性にするのに、優位であることを示してい
る。達成可能ないくらかの手段が開示されている（国際
出願８９／１０１４０）。
に変換され、１以上の保護剤が腫よう部位において分解
されるように、１以上の酵素が、同じ又は異なった抗体
により、腫よう部位に向かうことが可能である。したが
って、２以上の酵素が同じ抗体に結合可能である。抗体
−酵素接合体は一般的には、１２−２４時間以内に腫よ
う部位において最大濃度に達し、プラズマおよび他の体
液からなくなるのに数日かかるので、抗体−酵素接合体
をクリアにすることを促進し、血液中に存在する特異性
酵素を不活性にするのに、優位であることを示してい
る。達成可能ないくらかの手段が開示されている（国際
出願８９／１０１４０）。
【００５１】抗体−酵素接合体をクリアにする、または
不活性にするために使用された抗体は、抗腫よう抗体に
おける抗原結合部位、または酵素の活性部位、または抗
原−酵素接合体における他の部位に向かうことが可能で
ある。このような抗体は、さらなるガラクトース残基ま
たは他のクリアランスを促進するために添加された糖を
有することが可能であり、または脱シアル酸することが
可能である。抗体のガラクトシル化によって、肝細胞に
おけるガラクトースリセプターによる取り込みを通し
て、血液からの早急なクリアランスをおこなうこととな
る。または、抗体−酵素接合体がガラクトシル化され、
肝ガラクトースリセプターが、アジアロ−ボビンの上顎
の下の唾液腺のムコ蛋白質または、肝ガラクトースリセ
プターに向かう抗体、またはガラクトースリセプターと
の高いアフィニティを有する他の分子によりブロックさ
れている。このブロック物質は、抗体−酵素複合体が腫
よう部位に局在するように２４時間までの時間、プラズ
マに保持されるが、ガラクトースリセプターブロックの
停止後、ガラクトシル化された抗体−酵素が即座に、有
効なガラクトースリセプターを経由してクリアにされ
る。
不活性にするために使用された抗体は、抗腫よう抗体に
おける抗原結合部位、または酵素の活性部位、または抗
原−酵素接合体における他の部位に向かうことが可能で
ある。このような抗体は、さらなるガラクトース残基ま
たは他のクリアランスを促進するために添加された糖を
有することが可能であり、または脱シアル酸することが
可能である。抗体のガラクトシル化によって、肝細胞に
おけるガラクトースリセプターによる取り込みを通し
て、血液からの早急なクリアランスをおこなうこととな
る。または、抗体−酵素接合体がガラクトシル化され、
肝ガラクトースリセプターが、アジアロ−ボビンの上顎
の下の唾液腺のムコ蛋白質または、肝ガラクトースリセ
プターに向かう抗体、またはガラクトースリセプターと
の高いアフィニティを有する他の分子によりブロックさ
れている。このブロック物質は、抗体−酵素複合体が腫
よう部位に局在するように２４時間までの時間、プラズ
マに保持されるが、ガラクトースリセプターブロックの
停止後、ガラクトシル化された抗体−酵素が即座に、有
効なガラクトースリセプターを経由してクリアにされ
る。
【００５２】本発明を、トリメトレキサートおよびフォ
リン酸レスキューを用いた細胞毒性治療に関する実施例
によって、図面と共に例解する。
リン酸レスキューを用いた細胞毒性治療に関する実施例
によって、図面と共に例解する。
【００５３】実施例１：トリメトレキサートおよびフォ
リン酸レスキュを用いた細胞毒性治療 本発明は、正常な組織を抗葉酸剤効果から保護しつつ、
腫よう部位において連続して抗葉酸剤を保持し続ける手
段を提供する。第１ステップは、免疫抑制または免疫耐
性誘導剤をイニシエートさせることであり、これは通
常、本発明の化合物が投与される２日以上前に行なわれ
るものである。抗体−酵素接合体が非免疫原性である場
合には、このステップは省略される。抗体−ＣＰＧ２接
合体、または化学的にまたはＤＮＡ組み替えによりＣＰ
Ｇ２または類似の酵素に接合した抗体フラグメントは、
静脈に投与、または他の適当なルートで投与され、抗体
はターゲットであるガンにより発現された腫よう抗原に
向かう。数時間で腫よう部位に接合体が局在した後、第
２抗体が与えられる。これは、酵素の活性部位に直接向
かうことが可能であり、この場合、ガラクトース残基が
第２抗体に結合し、肝細胞ガラクトースレセプタを経由
してその早急なクリアランスがおこなわれる。他の、非
腫よう部位からの接合体の早急なクリアランスのメカニ
ズムは、すでに記載されている。酵素レベルが、プラズ
マにおいて、非常に低くなったり、または検知不可能な
レベルになると、トリメトレキサートが、一定のプラズ
マ濃度を保持する目的で、ボーラスまたは連続注入によ
り投与される。トリメトレキサートとともに、フォリン
酸が、トリメトレキサート毒性から正常な細胞を保護す
るのに十分な投与レベルで、静脈注入により投与され
る。ＣＰＧ２が局在する腫よう部位に達するフォリン酸
は、細胞に入り、トリメトレキサート毒性から細胞を保
護する前に、脱グルタミン化されて不活性にされる。こ
のようにして、保護分子が腫よう部位において急速に分
解される一方、正常な組織は、トリメトレキサートの作
用から、フォリン酸によって保護されることが可能であ
る。トリメトレキサートがＣＰＧ２によって分解されな
いような、他の抗葉酸剤が、トリメトレキサートにとっ
てかわってもよい。
リン酸レスキュを用いた細胞毒性治療 本発明は、正常な組織を抗葉酸剤効果から保護しつつ、
腫よう部位において連続して抗葉酸剤を保持し続ける手
段を提供する。第１ステップは、免疫抑制または免疫耐
性誘導剤をイニシエートさせることであり、これは通
常、本発明の化合物が投与される２日以上前に行なわれ
るものである。抗体−酵素接合体が非免疫原性である場
合には、このステップは省略される。抗体−ＣＰＧ２接
合体、または化学的にまたはＤＮＡ組み替えによりＣＰ
Ｇ２または類似の酵素に接合した抗体フラグメントは、
静脈に投与、または他の適当なルートで投与され、抗体
はターゲットであるガンにより発現された腫よう抗原に
向かう。数時間で腫よう部位に接合体が局在した後、第
２抗体が与えられる。これは、酵素の活性部位に直接向
かうことが可能であり、この場合、ガラクトース残基が
第２抗体に結合し、肝細胞ガラクトースレセプタを経由
してその早急なクリアランスがおこなわれる。他の、非
腫よう部位からの接合体の早急なクリアランスのメカニ
ズムは、すでに記載されている。酵素レベルが、プラズ
マにおいて、非常に低くなったり、または検知不可能な
レベルになると、トリメトレキサートが、一定のプラズ
マ濃度を保持する目的で、ボーラスまたは連続注入によ
り投与される。トリメトレキサートとともに、フォリン
酸が、トリメトレキサート毒性から正常な細胞を保護す
るのに十分な投与レベルで、静脈注入により投与され
る。ＣＰＧ２が局在する腫よう部位に達するフォリン酸
は、細胞に入り、トリメトレキサート毒性から細胞を保
護する前に、脱グルタミン化されて不活性にされる。こ
のようにして、保護分子が腫よう部位において急速に分
解される一方、正常な組織は、トリメトレキサートの作
用から、フォリン酸によって保護されることが可能であ
る。トリメトレキサートがＣＰＧ２によって分解されな
いような、他の抗葉酸剤が、トリメトレキサートにとっ
てかわってもよい。
【００５４】ジヒドロ葉酸還元酵素のトリメトレキサー
ト妨害は、少なくとも部分的に、チミジンの内因性要因
により回避することが可能であるため、チミジン−分解
酵素は、抗体または他のリガンドによる腫よう部位をタ
ーゲットとすることも可能である。
ト妨害は、少なくとも部分的に、チミジンの内因性要因
により回避することが可能であるため、チミジン−分解
酵素は、抗体または他のリガンドによる腫よう部位をタ
ーゲットとすることも可能である。
【００５５】細胞膜における腫よう−連合抗原の発現は
不均一であるので、腫ようにおける抗体−酵素接合体の
分布が均一ではないことが認識される。抗原の細胞外ス
ペースへの分秘は、ターゲット抗原のより均一な分布を
与えることとなり、分泌された抗原は、ターゲットとさ
れた抗体−酵素接合体と複合体を形成する。腫よう細胞
による抗体−酵素接合体の内在化は必要ではなく、必ず
しも所望されるものでもない。
不均一であるので、腫ようにおける抗体−酵素接合体の
分布が均一ではないことが認識される。抗原の細胞外ス
ペースへの分秘は、ターゲット抗原のより均一な分布を
与えることとなり、分泌された抗原は、ターゲットとさ
れた抗体−酵素接合体と複合体を形成する。腫よう細胞
による抗体−酵素接合体の内在化は必要ではなく、必ず
しも所望されるものでもない。
【００５６】本発明による方法は、腫よう部位における
葉酸アンタゴニストではなく、通常の代謝物（葉酸）お
よびレスキュ剤（フォリン酸）を分解する手段を導入す
ることにより、フォリン酸レスキュおよびメトトレキサ
ートを用いる通常の細胞毒性化学療法とは異なるもので
ある。
葉酸アンタゴニストではなく、通常の代謝物（葉酸）お
よびレスキュ剤（フォリン酸）を分解する手段を導入す
ることにより、フォリン酸レスキュおよびメトトレキサ
ートを用いる通常の細胞毒性化学療法とは異なるもので
ある。
【００５７】ターゲット抗原からの抗体の解離による、
および生物学的分解による、腫よう部位からの酵素の損
失は、幾日かの後、それらの部位において酵素のレベル
が減少することとして現われる。酵素活性の減少速度
は、腫ようおよび酵素のタイプによって様々である；カ
ルボキシペプチダーゼ活性は、ＣＥＡに向かう抗体に結
合した投与後、７日間、ヌードマウスにおけるヒト直腸
ガン腫異種移植腫ようにおいて検知されるものである。
したがって、約５日間、約２４−４８時間の中断を設け
たトリメトレキサート治療を続けることは可能であるべ
きである。この間、さらなる抗体−酵素接合体が投与さ
れ、さらなるサイクルを用いて非腫よう部位からクリア
にされる。ホスト抗体反応の効果的な制御または回避が
行われるものである。
および生物学的分解による、腫よう部位からの酵素の損
失は、幾日かの後、それらの部位において酵素のレベル
が減少することとして現われる。酵素活性の減少速度
は、腫ようおよび酵素のタイプによって様々である；カ
ルボキシペプチダーゼ活性は、ＣＥＡに向かう抗体に結
合した投与後、７日間、ヌードマウスにおけるヒト直腸
ガン腫異種移植腫ようにおいて検知されるものである。
したがって、約５日間、約２４−４８時間の中断を設け
たトリメトレキサート治療を続けることは可能であるべ
きである。この間、さらなる抗体−酵素接合体が投与さ
れ、さらなるサイクルを用いて非腫よう部位からクリア
にされる。ホスト抗体反応の効果的な制御または回避が
行われるものである。
【００５８】したがって、この提案は、断続的でない治
療という結果にはならないが、従来の治療においては、
治療期間の治療中断期間に対する比率が約１：７であっ
たものが、約２−３：１に改善可能である。
療という結果にはならないが、従来の治療においては、
治療期間の治療中断期間に対する比率が約１：７であっ
たものが、約２−３：１に改善可能である。
【００５９】実施例２：チミジレートシンセターゼイン
ヒビターおよびチミジンレスキューを用いる細胞毒性治
療 同様の原理が、他の抗代謝物治療に対して適用可能であ
る。たとえば、ＣＢ３７１７およびＩＣＩＤ１６９４
（ジョッドレルらの文献（１９９１）、ＢＪＣ、６４、
８３３−８）などのキー酵素のチミジレートシンセター
ゼをブロックする薬剤の開発に、近年、かなりの研究が
なされている。このような薬剤は、正常な細胞における
チミジレートシンセターゼもブロックする、従来の細胞
毒性剤と同様の限定を受けやすい。これらの作用は、チ
ミジンにより可逆性である。チミジン投与はしたがっ
て、チミジレートシンセターゼインヒビターから正常な
組織を保護するのに使用可能である一方、チミジンおよ
び内因性チミジンの保護効果が、腫よう細胞内にチミジ
ンが入るのを抑制するチミジンキナーゼ、またはジヒド
ロチミン デヒドロゲナーゼなどのチミジン分解酵素に
より腫よう部位に限定可能である。チミジンインヒビタ
ー酵素または薬剤は、抗体または他の適当なベクターに
より送達される。
ヒビターおよびチミジンレスキューを用いる細胞毒性治
療 同様の原理が、他の抗代謝物治療に対して適用可能であ
る。たとえば、ＣＢ３７１７およびＩＣＩＤ１６９４
（ジョッドレルらの文献（１９９１）、ＢＪＣ、６４、
８３３−８）などのキー酵素のチミジレートシンセター
ゼをブロックする薬剤の開発に、近年、かなりの研究が
なされている。このような薬剤は、正常な細胞における
チミジレートシンセターゼもブロックする、従来の細胞
毒性剤と同様の限定を受けやすい。これらの作用は、チ
ミジンにより可逆性である。チミジン投与はしたがっ
て、チミジレートシンセターゼインヒビターから正常な
組織を保護するのに使用可能である一方、チミジンおよ
び内因性チミジンの保護効果が、腫よう細胞内にチミジ
ンが入るのを抑制するチミジンキナーゼ、またはジヒド
ロチミン デヒドロゲナーゼなどのチミジン分解酵素に
より腫よう部位に限定可能である。チミジンインヒビタ
ー酵素または薬剤は、抗体または他の適当なベクターに
より送達される。
【００６０】ジヒドロチミン デヒドロゲナーゼは、正
常なヒトのリンパ球から得ることが可能であり（シオタ
ニおよびウエーバー（１９８９）の文献：Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．４９、１０９０−１０９４）、したがって、
低い免疫原性の抗体−酵素接合体が、ヒトまたは’ヒュ
ーマナイズ’された抗体に接合することにより製造可能
である。アンチフォレート剤およびアンチ−チミジン剤
の双方が、効果的な細胞毒性組み合わせとなる、適当な
インヒビターおよびインヒビター分解酵素を用いて使用
可能である。
常なヒトのリンパ球から得ることが可能であり（シオタ
ニおよびウエーバー（１９８９）の文献：Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．４９、１０９０−１０９４）、したがって、
低い免疫原性の抗体−酵素接合体が、ヒトまたは’ヒュ
ーマナイズ’された抗体に接合することにより製造可能
である。アンチフォレート剤およびアンチ−チミジン剤
の双方が、効果的な細胞毒性組み合わせとなる、適当な
インヒビターおよびインヒビター分解酵素を用いて使用
可能である。
【００６１】実施例３：ＡＤＥＰＴを用いた組み合わせ
治療 ＡＤＥＰＴコンセプトは、腫よう部位における不活性プ
リカーサーから細胞毒性薬剤を発生させるために、抗体
−酵素接合体を使用する。本発明は、ＡＤＥＰＴととも
に使用可能であり、この結果、組み合わせ化学療法の形
態で、両活性薬物は、腫よう部位に閉じ込められている
が、ある場合には活性剤を製造するために、および、そ
の他の場合には保護剤を破壊するために、同じ又は異な
った酵素を使用する。ＡＤＥＰＴ処理の場合には、じゅ
う毛上皮ガン腫（ＣＣ３）腫ようを有するヌードマウス
が、抗ＨＣＧ（国際出願８８／０７３７８に開示されて
いるような、Ｗ１４Ｆａｂ２）に結合したＣＰＧ２の２
９単位を摂取し、２４又は４８時間後、プロドラッグ
（４１μＭ／ｋｇ）を摂取した。保護剤の量は、抑制剤
なしで最適な保護効果が得られるように調節される。
治療 ＡＤＥＰＴコンセプトは、腫よう部位における不活性プ
リカーサーから細胞毒性薬剤を発生させるために、抗体
−酵素接合体を使用する。本発明は、ＡＤＥＰＴととも
に使用可能であり、この結果、組み合わせ化学療法の形
態で、両活性薬物は、腫よう部位に閉じ込められている
が、ある場合には活性剤を製造するために、および、そ
の他の場合には保護剤を破壊するために、同じ又は異な
った酵素を使用する。ＡＤＥＰＴ処理の場合には、じゅ
う毛上皮ガン腫（ＣＣ３）腫ようを有するヌードマウス
が、抗ＨＣＧ（国際出願８８／０７３７８に開示されて
いるような、Ｗ１４Ｆａｂ２）に結合したＣＰＧ２の２
９単位を摂取し、２４又は４８時間後、プロドラッグ
（４１μＭ／ｋｇ）を摂取した。保護剤の量は、抑制剤
なしで最適な保護効果が得られるように調節される。
【００６２】実施例４：肝転移および腹部腺ガン腫を有
する患者の治療 大きな肝転移および直腸の再発腹部腺ガン腫を有する患
者が、−２日目に、連続静脈注入により、免疫抑制剤、
シクロスポリンを摂取した。０日目には、細菌性酵素カ
ルボキシペプチダーゼＧ２に化学的に結合した、ガン胎
児性抗原（ＣＥＡ）を結合するＡ５Ｂ７として知られて
いるモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’） ２部を含有する
化合物を摂取した。投与された酵素の量は、２時間かけ
て、静脈注入により、２００００酵素単位（１００００
Ｕ／ｍ２）であった。２４時間（１日）後、酵素は、血
液プラズマ中に１．０ユニット／ｍｌ存在し、次いで、
そのクリアランスを促進するためにガラクトシル化され
たモノクローナル抗体ＳＢ４３を８０ｍｇ（４０ｍｇ／
ｍ２）摂取した。これは２４時間かけて連続静脈注入す
ることにより投与され、注入の最後の１時間、非ガラク
トシル化されたＳＢ４３、１０ｍｇを注入液に添加し
た。ＳＢ４３（２日）注入が完了した後、ＣＰＧ２活性
がプラズマ内に検知されなくなったとき、トリメトレキ
サートが、静脈ボーラスにより５％デキストローズに入
れられた。フォリン酸、１００ｍｇの注入は、連続２４
時間注入により、この時点で開始された。トリメトレキ
サートは、４日間（２、３、４、５日目）、毎日投与さ
れた。
する患者の治療 大きな肝転移および直腸の再発腹部腺ガン腫を有する患
者が、−２日目に、連続静脈注入により、免疫抑制剤、
シクロスポリンを摂取した。０日目には、細菌性酵素カ
ルボキシペプチダーゼＧ２に化学的に結合した、ガン胎
児性抗原（ＣＥＡ）を結合するＡ５Ｂ７として知られて
いるモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’） ２部を含有する
化合物を摂取した。投与された酵素の量は、２時間かけ
て、静脈注入により、２００００酵素単位（１００００
Ｕ／ｍ２）であった。２４時間（１日）後、酵素は、血
液プラズマ中に１．０ユニット／ｍｌ存在し、次いで、
そのクリアランスを促進するためにガラクトシル化され
たモノクローナル抗体ＳＢ４３を８０ｍｇ（４０ｍｇ／
ｍ２）摂取した。これは２４時間かけて連続静脈注入す
ることにより投与され、注入の最後の１時間、非ガラク
トシル化されたＳＢ４３、１０ｍｇを注入液に添加し
た。ＳＢ４３（２日）注入が完了した後、ＣＰＧ２活性
がプラズマ内に検知されなくなったとき、トリメトレキ
サートが、静脈ボーラスにより５％デキストローズに入
れられた。フォリン酸、１００ｍｇの注入は、連続２４
時間注入により、この時点で開始された。トリメトレキ
サートは、４日間（２、３、４、５日目）、毎日投与さ
れた。
【００６３】抗体酵素接合体で始まるサイクルは、７日
目と１４日目に再開された。毒性は、血清クレアチンの
一時的な上昇、シクロスポリンを用いた公知の治療の複
合により、確認される。細菌性酵素と腫よう抗体へのホ
スト抗体反応は、処理の３サイクルの完了後まで検知不
可能である。
目と１４日目に再開された。毒性は、血清クレアチンの
一時的な上昇、シクロスポリンを用いた公知の治療の複
合により、確認される。細菌性酵素と腫よう抗体へのホ
スト抗体反応は、処理の３サイクルの完了後まで検知不
可能である。
【００６４】抹消血管白細胞および血小板計数は、この
処理中および処理後、正常または正常以上のレベルのま
まである。その後の患者は、トリメトレキサートを多量
に、またはフォリン酸を少量投与される。
処理中および処理後、正常または正常以上のレベルのま
まである。その後の患者は、トリメトレキサートを多量
に、またはフォリン酸を少量投与される。
【００６５】ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するマウス
に発生した、モノクローナル抗体Ａ ５Ｂ７は、キャンサ
ー リサーチ キャンペーン テクノロジー、ケンブリ
ッジハウス、５−１０ケンブリッジ テラス、リージェ
ンツ パーク、ロンドンＮＷ１ ４ＪＬから入手可能で
あり、ハルウッドらによる文献（１９８６）：Ｂｒｉ
ｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５４、７５−８２および実施例
５により開示された方法により調製されたものである。
マウスのモノクローナル抗体ＳＢ４３は、キャンサー
リサーチ キャンペーン テクノロジーから入手可能で
あり、シャーマらによる文献（１９９０）：Ｂｒｉｔ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１、６５９−６６２および実施例
８により開示された方法により調製されたものである。
に発生した、モノクローナル抗体Ａ ５Ｂ７は、キャンサ
ー リサーチ キャンペーン テクノロジー、ケンブリ
ッジハウス、５−１０ケンブリッジ テラス、リージェ
ンツ パーク、ロンドンＮＷ１ ４ＪＬから入手可能で
あり、ハルウッドらによる文献（１９８６）：Ｂｒｉ
ｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５４、７５−８２および実施例
５により開示された方法により調製されたものである。
マウスのモノクローナル抗体ＳＢ４３は、キャンサー
リサーチ キャンペーン テクノロジーから入手可能で
あり、シャーマらによる文献（１９９０）：Ｂｒｉｔ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１、６５９−６６２および実施例
８により開示された方法により調製されたものである。
【００６６】実施例５：ガン胎児性抗原に対して反応す
るモノクローナル抗体の調製 精製したＣＥＡが、結腸腫ようの転移部から調製され
た。６μＣｉμｇ−１の特異活性の１２５Ｉ標識が、ヨ
ードゲン（ｉｏｄｏｇｅｎ）法により行われた。希釈緩
衝液が、０．１％ウシ血清アルブミンを含有する０．１
５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４として調製さ
れた。低いイオン強度における研究が、ｐＨ７．４で、
０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液において行われた。
るモノクローナル抗体の調製 精製したＣＥＡが、結腸腫ようの転移部から調製され
た。６μＣｉμｇ−１の特異活性の１２５Ｉ標識が、ヨ
ードゲン（ｉｏｄｏｇｅｎ）法により行われた。希釈緩
衝液が、０．１％ウシ血清アルブミンを含有する０．１
５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４として調製さ
れた。低いイオン強度における研究が、ｐＨ７．４で、
０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液において行われた。
【００６７】免疫化スケジュール：以下の方法を用い
て、精製、加熱処理したＣＥＡに対して、モノクローナ
ル抗体Ａ５Ｂ７を発生させた。１ｍｇの精製ＣＥＡが、
１ｍｇｍｌ−１の濃度で、０．０５Ｍリン酸塩緩衝液
（ｐＨ７）中、８５ｏＣで３５分間加熱された。１０％
の硫酸アルミニウムカリウム水溶液、１ｍｌと混合した
後、ｐＨが、一定撹はんしながら、水酸化ナトリウム溶
液を滴下することにより、６．５−７に調整された。室
温で３０分間撹はんした後、得られた沈殿は食塩水で３
回洗浄された。次いで１０１０ホルマライズ（ｆｏｒｍ
ａｌｉｓｅｄ）された百日咳菌（ウエルカム リサーチ
ラボラトリーズから供給された）と混合した。３つの
異なった免疫化スケジュールが使用された。
て、精製、加熱処理したＣＥＡに対して、モノクローナ
ル抗体Ａ５Ｂ７を発生させた。１ｍｇの精製ＣＥＡが、
１ｍｇｍｌ−１の濃度で、０．０５Ｍリン酸塩緩衝液
（ｐＨ７）中、８５ｏＣで３５分間加熱された。１０％
の硫酸アルミニウムカリウム水溶液、１ｍｌと混合した
後、ｐＨが、一定撹はんしながら、水酸化ナトリウム溶
液を滴下することにより、６．５−７に調整された。室
温で３０分間撹はんした後、得られた沈殿は食塩水で３
回洗浄された。次いで１０１０ホルマライズ（ｆｏｒｍ
ａｌｉｓｅｄ）された百日咳菌（ウエルカム リサーチ
ラボラトリーズから供給された）と混合した。３つの
異なった免疫化スケジュールが使用された。
【００６８】免疫化されたマウスからのひ臓細胞が、次
いで、ＳＰ２／０−Ａｇ１４またはＰ３−ＮＳ／１−Ａ
ｇ４−１ミエローマ細胞（フロー ラボラトリーズ、英
国）のいずれか、および、単細胞トランスファによりク
ローン化されたアンチ−ＣＥＡを産出するハイブリドー
マを用いて、融合された。
いで、ＳＰ２／０−Ａｇ１４またはＰ３−ＮＳ／１−Ａ
ｇ４−１ミエローマ細胞（フロー ラボラトリーズ、英
国）のいずれか、および、単細胞トランスファによりク
ローン化されたアンチ−ＣＥＡを産出するハイブリドー
マを用いて、融合された。
【００６９】実施例６：Ａ５Ｂ７のＦ（ａｂ’）２フラ
グメントの調製 この研究において使用されたモノクローナルアンチ−Ｃ
ＥＡ（Ａ５Ｂ７）は、前に開示されており、ＮＣＡとの
その低い交差反応性、および、免疫精製および放射能標
識におけるその安定性の観点から選択されるものであ
る。Ｆ（ａｂ’） ２フラグメントは、ラモイおよびニソ
ノフによる文献（１９８３）：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ５６、２３５−２４３の方法により調製
された。セファクリルＳ−２００において混合物を分離
した後、フラクションは、７．５％ゲルを用いてＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより分析された。Ｆ（ａｂ’）２を含有す
るフラクションは、濃縮され、０．１５Ｍリン酸塩緩衝
液、ｐＨ７に対して透析された。完全なＡ５Ｂ７および
フラグメントの双方は、ニトロセルロース紙上のＳＤＳ
ゲルのエレクトロブロッティングし、１２５Ｉで標識化
されたＣＥＡを用いて上乗せすることにより、免疫学的
に活性であり、比較的均一であることが示された。完全
なＡ５Ｂ７およびそのＦ（ａｂ’）２フラグメントは、
クロラミルＴ方法により、放射能標識化し、それぞれ、
５．６および５．２μＣｉ／μｇの比活性とした。標識
化された標品双方は、アミノ−セルロースに結合したＣ
ＥＡを用いて固相放射能線免疫検定により、免疫学的活
性を保持することが示された（ロジャースらによる文献
（１９８３）：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ．
Ｏｎｃｏｌ．１９、６２９−６３９）。６０％を越える
活性が、各ケースにおいて保持された。
グメントの調製 この研究において使用されたモノクローナルアンチ−Ｃ
ＥＡ（Ａ５Ｂ７）は、前に開示されており、ＮＣＡとの
その低い交差反応性、および、免疫精製および放射能標
識におけるその安定性の観点から選択されるものであ
る。Ｆ（ａｂ’） ２フラグメントは、ラモイおよびニソ
ノフによる文献（１９８３）：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ５６、２３５−２４３の方法により調製
された。セファクリルＳ−２００において混合物を分離
した後、フラクションは、７．５％ゲルを用いてＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより分析された。Ｆ（ａｂ’）２を含有す
るフラクションは、濃縮され、０．１５Ｍリン酸塩緩衝
液、ｐＨ７に対して透析された。完全なＡ５Ｂ７および
フラグメントの双方は、ニトロセルロース紙上のＳＤＳ
ゲルのエレクトロブロッティングし、１２５Ｉで標識化
されたＣＥＡを用いて上乗せすることにより、免疫学的
に活性であり、比較的均一であることが示された。完全
なＡ５Ｂ７およびそのＦ（ａｂ’）２フラグメントは、
クロラミルＴ方法により、放射能標識化し、それぞれ、
５．６および５．２μＣｉ／μｇの比活性とした。標識
化された標品双方は、アミノ−セルロースに結合したＣ
ＥＡを用いて固相放射能線免疫検定により、免疫学的活
性を保持することが示された（ロジャースらによる文献
（１９８３）：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ．
Ｏｎｃｏｌ．１９、６２９−６３９）。６０％を越える
活性が、各ケースにおいて保持された。
【００７０】実施例７：Ａ５Ｂ７−Ｆ（ａｂ’）２のＣ
ＰＧ２への接合 リン酸塩緩衝液（２．５ｍｌ、ｐＨ＝７．６、１ｍＭの
ＥＤＴＡ含有）におけるＣＰＧ２（２．１５ｍｇ）の溶
液に、カルボキシペプチダーゼに対して１５モル過剰の
エステルに相当する、４−（ｐ−マレイミドフェニル）
洛酸Ｎ−ヒドロキシスシンイミドエステル（１３８μ
ｇ）のＤＭＦ（１３．５μｌ）溶液を添加した。溶液
は、２時間放置した後、ゲルろ過（ＰＤ１０カラム）に
より過剰なエステルを取り除き、３．２ｃｍリン酸塩／
ＥＤＴＡ緩衝液により溶出された−溶液１。リン酸塩／
ＥＤＴＡ緩衝液（１．２ｍｌ）中のＡ５Ｂ７−Ｆ（ａ
ｂ’）２（２．６ｍｇ）が、ＤＭＦ（１０μｌ）中のＳ
−アセチルチオグリコール酸−Ｎ−ヒドロキシスシンイ
ミドエステル（ＳＡＴＡ）（９０μｇ）で処理され、こ
の混合物は、室温で１時間放置された。過剰のＳＡＴＡ
が、ゲルろ過（ＰＤ１０カラム、３．２ｃｍリン酸塩緩
衝液により溶出）により除去された。使用の３０分前
に、ヒドロキシルアミン溶液（３．４７ｇ、Ｎａ３ＰＯ
４Ｈおよび水酸化ナトリウム溶液により中性化され、９
３０ｍｇのＥＤＴＡを含有する水により１００ｍｌまで
にする）が添加された−溶液２。上記溶液１および２が
次いで混合され、４℃で一昼夜放置された。濃縮（１０
倍）（ミニコン）後、接合体が、ＦＰＬＣ（フェルマシ
ア）上でゲル−ろ過（Ｓ−１２カラム）により単離され
た。接合体は、ミリポア０．２２μｍフィルターを通し
てろ過された。蛋白質濃度が測定され、酵素活性が使用
される前に分光光度検定法で測定された。
ＰＧ２への接合 リン酸塩緩衝液（２．５ｍｌ、ｐＨ＝７．６、１ｍＭの
ＥＤＴＡ含有）におけるＣＰＧ２（２．１５ｍｇ）の溶
液に、カルボキシペプチダーゼに対して１５モル過剰の
エステルに相当する、４−（ｐ−マレイミドフェニル）
洛酸Ｎ−ヒドロキシスシンイミドエステル（１３８μ
ｇ）のＤＭＦ（１３．５μｌ）溶液を添加した。溶液
は、２時間放置した後、ゲルろ過（ＰＤ１０カラム）に
より過剰なエステルを取り除き、３．２ｃｍリン酸塩／
ＥＤＴＡ緩衝液により溶出された−溶液１。リン酸塩／
ＥＤＴＡ緩衝液（１．２ｍｌ）中のＡ５Ｂ７−Ｆ（ａ
ｂ’）２（２．６ｍｇ）が、ＤＭＦ（１０μｌ）中のＳ
−アセチルチオグリコール酸−Ｎ−ヒドロキシスシンイ
ミドエステル（ＳＡＴＡ）（９０μｇ）で処理され、こ
の混合物は、室温で１時間放置された。過剰のＳＡＴＡ
が、ゲルろ過（ＰＤ１０カラム、３．２ｃｍリン酸塩緩
衝液により溶出）により除去された。使用の３０分前
に、ヒドロキシルアミン溶液（３．４７ｇ、Ｎａ３ＰＯ
４Ｈおよび水酸化ナトリウム溶液により中性化され、９
３０ｍｇのＥＤＴＡを含有する水により１００ｍｌまで
にする）が添加された−溶液２。上記溶液１および２が
次いで混合され、４℃で一昼夜放置された。濃縮（１０
倍）（ミニコン）後、接合体が、ＦＰＬＣ（フェルマシ
ア）上でゲル−ろ過（Ｓ−１２カラム）により単離され
た。接合体は、ミリポア０．２２μｍフィルターを通し
てろ過された。蛋白質濃度が測定され、酵素活性が使用
される前に分光光度検定法で測定された。
【００７１】実施例８：ＣＰＧ２に対して反応性のある
モノクローナル抗体の調製 ＣＰＧ２に対して発生したモノクローナル抗体（ＳＢ４
３）が、二特異性抗体（次の実施例参照）を製造するた
めに、および非腫よう部位における残余酵素活性のクリ
アランスと不活性化のために、使用される。モノクロー
ナル抗体は以下のように製造される。Ｂａｌｂ／Ｃマウ
ス（６−８週令）が、不完全フロイントアジュバントに
おける５０μｇＣＰＧ２ｉ．ｐ．の２注入、次いで、完
全フロイントアジュバントにおけるＣＰＧ２の２注入
（５０μｇＣＰＧ２、各ｉ．ｐ．）を１箇月おきに、お
よび融合の前２日間、２つの毎日注入（ＰＢＳ、ｉ．
ｖ．で５０μｇおよび１００μｇ）によって免疫化され
た。免疫すい臓細胞は、ケーラーおよびミルスタインの
文献（１９７５）ネーチャー ２５６、４９５のハイブ
リドーマ方法にしたがって、ＳＰ２／０ミエローマ細胞
を分泌する非免疫グロブリンを用いて融合された。アン
チ−ＣＰＧ２抗体の存在は、固相間接放射線免疫検定に
より検知された。０．０５Ｍリン酸緩衝液におけるＣＰ
Ｇ２の１μｇｍｌ−１溶液が、ポリビニルミクロタイタ
ープレート（１ウエルあたり１００ｎｇ）に置かれ、乾
燥されて、メタノールを用いて固定し、０．０５％トウ
イーン（Ｔｗｅｅｎ）および０．１％ウシ血清アルブミ
ンを含有するＰＢＳ緩衝液で洗浄された。上澄み液また
は精製した抗体サンプルは、ＰＢＳで希釈され、ＣＰＧ
２コートミクロタイタープレート（１ウエルあたり１０
０μｇ）において、３７℃で４時間、次いで１２５Ｉで
標識化されたラビットアンチ−マウスＩｇＧを用いて１
時間、培養された。ウエルは、３回、ＰＢＳ−トウイー
ン緩衝液で、各ステージ間に洗浄され、最終洗浄後、各
ウエルは、カットされ、ガンマーカウンターでカウント
された。
モノクローナル抗体の調製 ＣＰＧ２に対して発生したモノクローナル抗体（ＳＢ４
３）が、二特異性抗体（次の実施例参照）を製造するた
めに、および非腫よう部位における残余酵素活性のクリ
アランスと不活性化のために、使用される。モノクロー
ナル抗体は以下のように製造される。Ｂａｌｂ／Ｃマウ
ス（６−８週令）が、不完全フロイントアジュバントに
おける５０μｇＣＰＧ２ｉ．ｐ．の２注入、次いで、完
全フロイントアジュバントにおけるＣＰＧ２の２注入
（５０μｇＣＰＧ２、各ｉ．ｐ．）を１箇月おきに、お
よび融合の前２日間、２つの毎日注入（ＰＢＳ、ｉ．
ｖ．で５０μｇおよび１００μｇ）によって免疫化され
た。免疫すい臓細胞は、ケーラーおよびミルスタインの
文献（１９７５）ネーチャー ２５６、４９５のハイブ
リドーマ方法にしたがって、ＳＰ２／０ミエローマ細胞
を分泌する非免疫グロブリンを用いて融合された。アン
チ−ＣＰＧ２抗体の存在は、固相間接放射線免疫検定に
より検知された。０．０５Ｍリン酸緩衝液におけるＣＰ
Ｇ２の１μｇｍｌ−１溶液が、ポリビニルミクロタイタ
ープレート（１ウエルあたり１００ｎｇ）に置かれ、乾
燥されて、メタノールを用いて固定し、０．０５％トウ
イーン（Ｔｗｅｅｎ）および０．１％ウシ血清アルブミ
ンを含有するＰＢＳ緩衝液で洗浄された。上澄み液また
は精製した抗体サンプルは、ＰＢＳで希釈され、ＣＰＧ
２コートミクロタイタープレート（１ウエルあたり１０
０μｇ）において、３７℃で４時間、次いで１２５Ｉで
標識化されたラビットアンチ−マウスＩｇＧを用いて１
時間、培養された。ウエルは、３回、ＰＢＳ−トウイー
ン緩衝液で、各ステージ間に洗浄され、最終洗浄後、各
ウエルは、カットされ、ガンマーカウンターでカウント
された。
【００７２】実施例９：ＣＰＧ２およびＣＥＡに対して
反応性を有する二特異性抗体 Ａ５Ｂ７産出ハイブリドーマ、ＣＥＡに対して反応性を
有するモノクローナル抗体は、ハルウッドらによる文献
（１９８６）：Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５４、７
５−８２に開示されており、および、ＣＰＧ２に対して
反応性を有するモノクローナル抗体、ＳＢ４３産出ハイ
ブリドーマの発生方法は、実施例に開示されている。融
合プロトコールは、いずれか２つの抗体−産出ハイブリ
ドーマを融合させるものであり、これは前に開示されて
いる（クラークおよびウオルドマン（１９８７）による
文献：Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．７９、
１３９３−１４０１）。ヒポキサンチン ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ−陰性変異体を選択することによ
りヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡ
Ｔ）感受性をあらかじめ与えられた、１つの親（ｐａｒ
ｅｎｔａｌ）ハイブリドーマの５Ｘ１０６から３．５Ｘ
１０７細胞が、１０ｍＭヨードアセトアミドの致死量で
あらかじめ処理された第２親ハイブリドーマ細胞を用い
て、５０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリエチレングリコー
ル、１ｍｌを用いて、１１：１又は１０：１の比率で融
合した。過剰のポリエチレングリコールが洗浄除去さ
れ、細胞が、１ｍｌあたり８Ｘ１０５から２Ｘ１０５の
濃度で、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清を用いて
補助された、重炭酸塩緩衝イスコブズ変性ダルベッコズ
媒体（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＩＭＤＭ）における２４
−ウエルプレートにプレートされた。培養して２４時間
後、ハイブリッドハイブリドーマが、ＨＡＴを含有する
媒体において選択された。
反応性を有する二特異性抗体 Ａ５Ｂ７産出ハイブリドーマ、ＣＥＡに対して反応性を
有するモノクローナル抗体は、ハルウッドらによる文献
（１９８６）：Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５４、７
５−８２に開示されており、および、ＣＰＧ２に対して
反応性を有するモノクローナル抗体、ＳＢ４３産出ハイ
ブリドーマの発生方法は、実施例に開示されている。融
合プロトコールは、いずれか２つの抗体−産出ハイブリ
ドーマを融合させるものであり、これは前に開示されて
いる（クラークおよびウオルドマン（１９８７）による
文献：Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．７９、
１３９３−１４０１）。ヒポキサンチン ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ−陰性変異体を選択することによ
りヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡ
Ｔ）感受性をあらかじめ与えられた、１つの親（ｐａｒ
ｅｎｔａｌ）ハイブリドーマの５Ｘ１０６から３．５Ｘ
１０７細胞が、１０ｍＭヨードアセトアミドの致死量で
あらかじめ処理された第２親ハイブリドーマ細胞を用い
て、５０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリエチレングリコー
ル、１ｍｌを用いて、１１：１又は１０：１の比率で融
合した。過剰のポリエチレングリコールが洗浄除去さ
れ、細胞が、１ｍｌあたり８Ｘ１０５から２Ｘ１０５の
濃度で、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清を用いて
補助された、重炭酸塩緩衝イスコブズ変性ダルベッコズ
媒体（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＩＭＤＭ）における２４
−ウエルプレートにプレートされた。培養して２４時間
後、ハイブリッドハイブリドーマが、ＨＡＴを含有する
媒体において選択された。
【００７３】実施例１０：非腫よう部位における残余酵
素活性の減少 腫よう部位ではなく、非腫よう部位における酵素−抗体
接合体の酵素部を不活性にすることが望ましい。この効
果を達成するある方法は、ガラクトース残基と接合した
酵素部に対して発現する本発明の抗体の化合物を用いて
処理されている患者に投与することである。ＣＰＧ２に
向かうモノクローナル抗体（ＳＢ４３）は、酵素を不活
性にする。抗体が腫よう部位における酵素を不活性にす
るのを防除するために、さらなるガラクトース残基が、
肝細胞上のプラズマおよびガラクトースリセプターから
早急に不活性抗体を除去するが、静脈ルートにより与え
られる時、プラズマ内において酵素を不活性にしておく
ことの可能なように、それに接合する。ガラクトシル化
ＳＢ４３が、プラズマにおいて酵素活性を除去し、次い
で、他の非組織における残余酵素活性を不活性にするた
めの、非ガラクトシル化ＳＢ４３の量を与えるために投
与される。モノクローナル抗体ＳＢ４３は、以下のプロ
トコールを用いてガラクトシル化される。活性化された
誘導体の株溶液は以下のようにして調製された。無水メ
タノール（１０ｍｌ）中のシアノメチル ２，３，４，
６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド（シグマＣ−４１４１）［４００ｍｇ］
が、１ｍｌの無水メタノール中の５．４ｍｇのナトリウ
ムメトキシドにより、室温で４８時間処理された。この
混合物は、グリースのついたストッパ付き２５ｍｌクイ
ックフィット（商標）コニカルフラスコに保持された。
ＳＢ４３（１．３ｍｇ／ｍｌ）の株溶液が、０．２５Ｍ
ホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５中で調製された。
活性化されたガラクトシル誘導体の必要量の分割量（８
０、４０、２０、１０μｌ）が、３ｍｌのガラスアンプ
ル内に分散され、窒素気流内でガラス状残さとなるまで
乾燥された。抗体（２００μｇ）溶液が、残さが溶解す
るまで添加された。室温にて２時間後、その溶液は、Ｐ
ＢＳの３回変化に対して、透析された。上記容量を掛け
合わせることによって、スケールアップして調製が行わ
れた。
素活性の減少 腫よう部位ではなく、非腫よう部位における酵素−抗体
接合体の酵素部を不活性にすることが望ましい。この効
果を達成するある方法は、ガラクトース残基と接合した
酵素部に対して発現する本発明の抗体の化合物を用いて
処理されている患者に投与することである。ＣＰＧ２に
向かうモノクローナル抗体（ＳＢ４３）は、酵素を不活
性にする。抗体が腫よう部位における酵素を不活性にす
るのを防除するために、さらなるガラクトース残基が、
肝細胞上のプラズマおよびガラクトースリセプターから
早急に不活性抗体を除去するが、静脈ルートにより与え
られる時、プラズマ内において酵素を不活性にしておく
ことの可能なように、それに接合する。ガラクトシル化
ＳＢ４３が、プラズマにおいて酵素活性を除去し、次い
で、他の非組織における残余酵素活性を不活性にするた
めの、非ガラクトシル化ＳＢ４３の量を与えるために投
与される。モノクローナル抗体ＳＢ４３は、以下のプロ
トコールを用いてガラクトシル化される。活性化された
誘導体の株溶液は以下のようにして調製された。無水メ
タノール（１０ｍｌ）中のシアノメチル ２，３，４，
６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド（シグマＣ−４１４１）［４００ｍｇ］
が、１ｍｌの無水メタノール中の５．４ｍｇのナトリウ
ムメトキシドにより、室温で４８時間処理された。この
混合物は、グリースのついたストッパ付き２５ｍｌクイ
ックフィット（商標）コニカルフラスコに保持された。
ＳＢ４３（１．３ｍｇ／ｍｌ）の株溶液が、０．２５Ｍ
ホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５中で調製された。
活性化されたガラクトシル誘導体の必要量の分割量（８
０、４０、２０、１０μｌ）が、３ｍｌのガラスアンプ
ル内に分散され、窒素気流内でガラス状残さとなるまで
乾燥された。抗体（２００μｇ）溶液が、残さが溶解す
るまで添加された。室温にて２時間後、その溶液は、Ｐ
ＢＳの３回変化に対して、透析された。上記容量を掛け
合わせることによって、スケールアップして調製が行わ
れた。
【図１ａ】 図１ａは、トリメトレキサート、メトト
レキサート、フォリン酸、ＣＢ３７１７、およびＩＣＩ
Ｄ１６９４の構造を示す。
レキサート、フォリン酸、ＣＢ３７１７、およびＩＣＩ
Ｄ１６９４の構造を示す。
【図１ｂ】 図１ｂは、トリメトレキサート、メトト
レキサート、フォリン酸、ＣＢ３７１７、およびＩＣＩ
Ｄ１６９４の構造を示す。
レキサート、フォリン酸、ＣＢ３７１７、およびＩＣＩ
Ｄ１６９４の構造を示す。
【図２】 図２は、ターゲット細胞特異性部が抗体で
あり、カルボキシペプチダーゼＧ２に結合し；フォリン
酸が細胞毒性剤のインヒビターであり；トリメトレキサ
ートが前記細胞毒性剤である、本発明を示す図である。
あり、カルボキシペプチダーゼＧ２に結合し；フォリン
酸が細胞毒性剤のインヒビターであり；トリメトレキサ
ートが前記細胞毒性剤である、本発明を示す図である。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 38/46 Ａ６１Ｐ 35/00
45/06 39/02
Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １２１
39/02 １２３
43/00 １２１ Ｃ０７Ｋ 16/46
１２３ Ａ６１Ｋ 37/52
Ｃ０７Ｋ 16/46 37/54
// Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 DA02 DA06
DA12 EA04
4C084 AA22 AA23 NA05 NA06 NA07
ZB261 ZB262 ZB372 ZC752
4C085 AA21 BB01 BB02 BB31 BB36
BB43 CC23 DD62 DD63 EE03
4C086 AA01 AA02 BC46 CB09 GA03
GA07 MA03 MA04 MA07 ZB26
ZC37 ZC75
4H045 AA11 AA30 BA41 DA75 EA20
FA74
Claims (23)
- 【請求項１】 ターゲット細胞特異性部と、未変性状態
において細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質を前記細胞
毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換すること
の可能な不活性部とからなる、化合物。 - 【請求項２】 前記不活性部が、酵素的活性部である、
請求項１に記載の化合物。 - 【請求項３】 前記ターゲット細胞特異性部が、抗体ま
たは抗体の一部からなる、請求項１または２に記載の化
合物。 - 【請求項４】 前記ターゲット細胞特異性部が、選択的
に細胞表面エンティティ（ｅｎｔｉｔｙ）に結合可能で
ある、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の化合
物。 - 【請求項５】 前記細胞表面エンティティが腫よう連合
抗原である、請求項４に記載の化合物。 - 【請求項６】 前記細胞表面エンティティが細胞表面リ
セプタである、請求項４に記載の化合物。 - 【請求項７】 前記物質が、ジヒドロ葉酸還元酵素に作
用する細胞毒性剤の効果を抑制可能な、フォリン酸また
はその類似体である、請求項１ないし６のいずれか一項
に記載の化合物。 - 【請求項８】 前記不活性部が、少なくともカルボキシ
ペプチダーゼＧ２の触媒部である、請求項７に記載の化
合物。 - 【請求項９】 前記物質が、チミジレートシンセターゼ
酵素に作用する細胞毒性剤の効果を抑制可能な、チミジ
ンまたはその類似体である、請求項１ないし６のいずれ
か一項に記載の化合物。 - 【請求項１０】 前記不活性部が、チミジン分解酵素ま
たはチミジンキナーゼの少なくとも触媒部である、請求
項９に記載の化合物。 - 【請求項１１】 前記物質が、５−フルオロウラシルま
たはその類似体の効果を抑制可能な、ウリジンまたはそ
の類似体である、請求項１ないし６のいずれか一項に記
載の化合物。 - 【請求項１２】 前記不活性部が、ウリジン分解酵素ま
たはウリジンキナーゼの少なくとも触媒部である、請求
項１１に記載の化合物。 - 【請求項１３】 前記不活性部が、（１）ターゲット細
胞特異性プロモータと、（２）未変性状態において細胞
毒性剤の効果を抑制可能な物質を前記細胞毒性剤に対し
てより効果を示さない物質に変換することの可能なポリ
ペプチドをコード化するＤＮＡセグメントとからなる、
請求項１項に記載の化合物。 - 【請求項１４】 ＤＮＡセグメントが、カルボキシペプ
チダーゼＧ２の少なくとも触媒部をコード化する、請求
項１３に記載の化合物。 - 【請求項１５】 前記ＤＮＡセグメントが、チミジン分
解酵素またはチミジンキナーゼの少なくとも触媒部をコ
ード化する、請求項１３に記載の化合物。 - 【請求項１６】 前記ＤＮＡセグメントが、ウリジン分
解酵素またはウリジンキナーゼの少なくとも触媒部をコ
ード化する、請求項１３に記載の化合物。 - 【請求項１７】 前記ターゲット細胞特異性部が、レト
ロウイルスからなる、請求項１３ないし１６のいずれか
一項に記載の化合物。 - 【請求項１８】 ターゲット細胞特異性抗原と、未変性
状態において細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質を前記
細胞毒性剤に対してより効果を示さないものに変換する
ことの可能な不活性な分子とに結合可能な、二特異性抗
体。 - 【請求項１９】 非経口投与に適した、請求項１−１７
のいずれか一項に記載の化合物からなる薬剤組成物。 - 【請求項２０】 請求項１−１７のいずれか一項に記載
の化合物、細胞毒性剤、および、未変性状態において前
記細胞毒性剤の効果を抑制可能で、前記不活性部により
前記細胞毒性剤に対してより効果を示さない物質に変換
されることの可能な物質とからなる、治療システム。 - 【請求項２１】 前記細胞毒性剤が、葉酸アンタゴニス
トおよび前記細胞毒性剤の効果を抑制可能な物質がフォ
リン酸またはその類似体であるか、または、前記細胞毒
性剤が、チミジンアンタゴニストおよび前記細胞毒性剤
の効果を抑制可能な物質がチミジンまたはその類似体で
あるか、または、前記細胞毒性剤が、前記２つのアンタ
ゴニストの組み合わせである、請求項２０に記載の治療
システム。 - 【請求項２２】 ホストにおけるターゲット細胞の破壊
方法であり、ホストに、（ｉ）請求項１−１７のいずれ
か一項に記載の化合物、（ｉｉ）細胞毒性剤、および、
（ｉｉｉ）未変性状態において前記細胞毒性剤の効果を
抑制可能で、前記不活性部により前記細胞毒性剤に対し
てより効果を示さない物質に変換されることの可能な物
質を投与することからなる、方法。 - 【請求項２３】 腫ようを有するほ乳類の治療方法であ
り、前記ほ乳類には、請求項１−１７のいずれか一項に
記載の化合物が投与され、ターゲット細胞に結合する化
合物のターゲット細胞に結合しない化合物に対する比率
を所望の値にすることにより治療の準備がなされたもの
であり、前記治療方法は、前記ほ乳類に、細胞毒性剤、
および、未変性状態に於て前記細胞毒性剤の効果を抑制
可能で、前記化合物の不活性部により、前記細胞毒性剤
に対してより効果を示さない物質に変換されることの可
能な、物質を投与することからなる、治療方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9200417.5 | 1992-01-09 | ||
| GB929200417A GB9200417D0 (en) | 1992-01-09 | 1992-01-09 | Cytotoxic drug therapy |
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