JP3266276B2 - 二重特異性抗体断片の簡易化した製造 - Google Patents
二重特異性抗体断片の簡易化した製造Info
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- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
Description
【発明の詳細な説明】 本発明はヒトおよび動物における腫瘍の免疫療法のた
めの二重特異性抗体断片の製造に関する。
めの二重特異性抗体断片の製造に関する。
悪性疾患に対する身体固有の免疫系の活性化は、古く
からの治療目標であったが、現在のところまだ実現して
いない。最近の２、３年間で、科学者たちは実質的にこ
の目的の達成に要求される必要条件の改善に成功した。
Ｔ細胞表面上で免疫系を活性化する基本的な構造を同定
および特徴付けた。本質において、これらの基本的な構
造は、抗原−検出Ｔ細胞受容体/CD3複合体および潜在的
に最も重要な共刺激受容体としてのCD28分子である。
からの治療目標であったが、現在のところまだ実現して
いない。最近の２、３年間で、科学者たちは実質的にこ
の目的の達成に要求される必要条件の改善に成功した。
Ｔ細胞表面上で免疫系を活性化する基本的な構造を同定
および特徴付けた。本質において、これらの基本的な構
造は、抗原−検出Ｔ細胞受容体/CD3複合体および潜在的
に最も重要な共刺激受容体としてのCD28分子である。
特異的にその半分は腫瘍細胞に結合し、残りの半分は
免疫系の中枢「分子トリガー（molecular trigger）」
を活性化するような二重特異性抗体を構築することは可
能である。活性化された細胞は、効果的に腫瘍細胞を殺
傷することができる（ユング（Jung）およびミューラー
−エバーハルド（Muller−Eberhard）、Immunol.Today
9（1988）、257）。
免疫系の中枢「分子トリガー（molecular trigger）」
を活性化するような二重特異性抗体を構築することは可
能である。活性化された細胞は、効果的に腫瘍細胞を殺
傷することができる（ユング（Jung）およびミューラー
−エバーハルド（Muller−Eberhard）、Immunol.Today
9（1988）、257）。
同時に、二重特異性抗体の抗−腫瘍効果を多大なイン
・ビトロ試験セットアップおよびいくつかのマウス腫瘍
モデルにおいても示した（ベウン（Beun）ら、Immunol.
Today 21（1994）、2413）。
・ビトロ試験セットアップおよびいくつかのマウス腫瘍
モデルにおいても示した（ベウン（Beun）ら、Immunol.
Today 21（1994）、2413）。
ヒトの最初の局所的適用で、卵巣癌および神経膠芽腫
の腹膜増殖は好ましく影響を及ぼされることができた
（ニッタ（Nitta）ら、Lancet 335（1990）、368;カネ
バリ（Canevari）ら、JNCl 87（1995）、1463）。
の腹膜増殖は好ましく影響を及ぼされることができた
（ニッタ（Nitta）ら、Lancet 335（1990）、368;カネ
バリ（Canevari）ら、JNCl 87（1995）、1463）。
それゆえ、二重特異性抗体がある臨床的状況におい
て、少なくともヒトの腫瘍の有効な免疫療法を可能にす
るであろうというもっともな期待が存在する。
て、少なくともヒトの腫瘍の有効な免疫療法を可能にす
るであろうというもっともな期待が存在する。
使用した抗体のFc部位を介して免疫細胞の非特異的な
活性化を避けるため、Fc部位を欠如した二重特異性抗体
断片を使用する必要がある。先行技術において、ブレン
ナン（Brennan）ら（Science 229（1985）、81−83）は
二重特異性抗体断片を製造する方法を報告しており、そ
こでは完全状態の抗体をペプシン消化によって断片化し
てＦ（ab'）２断片とし、ついで得たＦ（ab'）２断片を
カラムクロマトグラフィーによって精製する。ついで、
精製したＦ（ab'）２分子のヒンジ領域のジスルフィド
結合を亜砒酸塩の存在下で還元することによって消化
し、得たＦ（ab'）−SH断片を再度カラムクロマトグラ
フィーにかけて精製し、エルマン試薬（DTNB）を含む還
元したSH基をＦ（ab'）−TNBに修飾する。さらにカラム
クロマトグラフィーによって精製した後、２つの抗体断
片のうちの１つをＦ（ab'）−SHに還元し、カラムクロ
マトグラフィーによって精製し、ついで他のＦ（ab'）
−TNB断片とハイブリダイズさせて二重特異性Ｆ（ab'）
２断片を得る。最終的にこのようにして得た、二重特異
性抗体断片をゲルクロマトグラフィーにより精製した。
活性化を避けるため、Fc部位を欠如した二重特異性抗体
断片を使用する必要がある。先行技術において、ブレン
ナン（Brennan）ら（Science 229（1985）、81−83）は
二重特異性抗体断片を製造する方法を報告しており、そ
こでは完全状態の抗体をペプシン消化によって断片化し
てＦ（ab'）２断片とし、ついで得たＦ（ab'）２断片を
カラムクロマトグラフィーによって精製する。ついで、
精製したＦ（ab'）２分子のヒンジ領域のジスルフィド
結合を亜砒酸塩の存在下で還元することによって消化
し、得たＦ（ab'）−SH断片を再度カラムクロマトグラ
フィーにかけて精製し、エルマン試薬（DTNB）を含む還
元したSH基をＦ（ab'）−TNBに修飾する。さらにカラム
クロマトグラフィーによって精製した後、２つの抗体断
片のうちの１つをＦ（ab'）−SHに還元し、カラムクロ
マトグラフィーによって精製し、ついで他のＦ（ab'）
−TNB断片とハイブリダイズさせて二重特異性Ｆ（ab'）
２断片を得る。最終的にこのようにして得た、二重特異
性抗体断片をゲルクロマトグラフィーにより精製した。
先行技術において、ユングら（Eur.J.Immunol.21（19
91）、24331−2435）は、上記方法の修飾をＦ（ab'）２
分子のヒンジ領域におけるジスルフィド結合の消化およ
び得たSH基の保護基での阻害を同時に行うことによっ
て、ブレンナンらにより記載された方法の精製の１工程
を省略することができることを報告した。いずれにせ
よ、二重特異性抗体の製造に関するこの方法により必要
とされる時間と費用の支出は非常に多大であるので、こ
れまでのところは、ヒトまたは動物における全身適用に
必要とされる内容量を製造することができなかった。こ
れらの見込みある試薬の臨床試験は、この事実によって
ひどく妨害される。二重特異性抗体断片の製造を簡易化
する方法の開発は、それゆえ、さらにそのような二重特
異性抗体断片の主要量を提供し、腫瘍の免疫療法におい
て使用可能であろう。
91）、24331−2435）は、上記方法の修飾をＦ（ab'）２
分子のヒンジ領域におけるジスルフィド結合の消化およ
び得たSH基の保護基での阻害を同時に行うことによっ
て、ブレンナンらにより記載された方法の精製の１工程
を省略することができることを報告した。いずれにせ
よ、二重特異性抗体の製造に関するこの方法により必要
とされる時間と費用の支出は非常に多大であるので、こ
れまでのところは、ヒトまたは動物における全身適用に
必要とされる内容量を製造することができなかった。こ
れらの見込みある試薬の臨床試験は、この事実によって
ひどく妨害される。二重特異性抗体断片の製造を簡易化
する方法の開発は、それゆえ、さらにそのような二重特
異性抗体断片の主要量を提供し、腫瘍の免疫療法におい
て使用可能であろう。
本発明の根底にある問題は、それゆえ上記の先行技術
の不利点を克服し、かつ二重特異性抗体断片を製造する
ための簡易化された方法である。
の不利点を克服し、かつ二重特異性抗体断片を製造する
ための簡易化された方法である。
問題の解決は、請求の範囲において特徴付けられた態
様によって達成される。
様によって達成される。
驚くべきことに、ペプシン消化後得られた抗体断片の
還元および修飾は、先行技術において、これまでのとこ
ろ必要であるとみなされていた工程なしに１つの工程で
実行できることがわかった。その発見は、二重特異性抗
体断片の製造の工程数を少なくすることができ、さらに
その方法は、所望の目的製造物の一層高い総収率によっ
てさらに特徴付けられる。本発明による方法は、完全な
抗体からの二重特異性Ｆ（ab'）２断片の製造に関して
記載している。基本的に、この方法は、TBNによって還
元することができるジスルフィド結合を含む限り、異な
るタンパク質のカップリングに使用することができる。
還元および修飾は、先行技術において、これまでのとこ
ろ必要であるとみなされていた工程なしに１つの工程で
実行できることがわかった。その発見は、二重特異性抗
体断片の製造の工程数を少なくすることができ、さらに
その方法は、所望の目的製造物の一層高い総収率によっ
てさらに特徴付けられる。本発明による方法は、完全な
抗体からの二重特異性Ｆ（ab'）２断片の製造に関して
記載している。基本的に、この方法は、TBNによって還
元することができるジスルフィド結合を含む限り、異な
るタンパク質のカップリングに使用することができる。
従って、本発明は、これまでのところ必要であると考
えられていた精製工程を省略することができ、それによ
って実質的に全方法を簡易化し、および費用に対して、
最も効率よくすることができる点で特徴付けられる二重
特異性タンパク質、好ましくは抗体断片の製造方法に関
する。本発明の方法の好ましい態様において、生物学的
に活性な二重特異性抗体断片の製造は本質的に以下の工
程を含む： （ａ）第１および第２抗体をその抗体のFc部位を開裂す
るおよびＦ（ab'）２分子を形成するのに十分な条件下
で断片化工程にかけ； （ｂ）工程（ａ）のそれぞれの製造物をＦ（ab'）２分
子のヒンジ領域におけるジスルフィド結合の消化を可能
にし、同時に得られたSH基を保護基で阻害できるのに十
分な条件下で精製工程にかけずに還元および修飾工程に
かけ； （ｃ）工程（ｂ）のそれぞれの製造物を反応付加生成物
の除去に十分な条件下での精製工程にかけ； （ｄ）工程（ｃ）の第１抗体の製造物を工程（ｂ）の保
護基を開裂するのに十分な条件下で還元工程にかけ、 （ｅ）工程（ｃ）により工程（ｄ）の製造物を精製工程
にかけ；ついで （ｆ）工程（ｃ）の第２抗体製造物および工程（ｅ）の
第１抗体製造物を二重特異性Ｆ（ab'）２分子を形成す
るのに十分な条件下でハイブリダイゼーション工程
（ｅ）にかける。
えられていた精製工程を省略することができ、それによ
って実質的に全方法を簡易化し、および費用に対して、
最も効率よくすることができる点で特徴付けられる二重
特異性タンパク質、好ましくは抗体断片の製造方法に関
する。本発明の方法の好ましい態様において、生物学的
に活性な二重特異性抗体断片の製造は本質的に以下の工
程を含む： （ａ）第１および第２抗体をその抗体のFc部位を開裂す
るおよびＦ（ab'）２分子を形成するのに十分な条件下
で断片化工程にかけ； （ｂ）工程（ａ）のそれぞれの製造物をＦ（ab'）２分
子のヒンジ領域におけるジスルフィド結合の消化を可能
にし、同時に得られたSH基を保護基で阻害できるのに十
分な条件下で精製工程にかけずに還元および修飾工程に
かけ； （ｃ）工程（ｂ）のそれぞれの製造物を反応付加生成物
の除去に十分な条件下での精製工程にかけ； （ｄ）工程（ｃ）の第１抗体の製造物を工程（ｂ）の保
護基を開裂するのに十分な条件下で還元工程にかけ、 （ｅ）工程（ｃ）により工程（ｄ）の製造物を精製工程
にかけ；ついで （ｆ）工程（ｃ）の第２抗体製造物および工程（ｅ）の
第１抗体製造物を二重特異性Ｆ（ab'）２分子を形成す
るのに十分な条件下でハイブリダイゼーション工程
（ｅ）にかける。
工程（ａ）で使用した完全な抗体は、先行技術におい
て公知の方法によって入手可能である（カレント・プロ
トコールズ・イン・イムノロジー（Current Protocols
in Immunology）、コディガン（J.E.Codigan）、クルビ
スベック（A.M.Krbisbeck）、マルグリス（D.H.Marguli
es）、シェバック（E.M.Shevack）、ストロバー（W.Str
ober）編、ジョーン・ウィリー＋サンズ（John Wiley＋
Sons））。個々の反応および精製工程の実行方法は当業
界からも知られており、例えば、ブレンナンら（Scienc
e 229（1985）、81−83）およびユングら（Eur.J.Immun
ol.21（1991）、2491−2495）に記載されている。
て公知の方法によって入手可能である（カレント・プロ
トコールズ・イン・イムノロジー（Current Protocols
in Immunology）、コディガン（J.E.Codigan）、クルビ
スベック（A.M.Krbisbeck）、マルグリス（D.H.Marguli
es）、シェバック（E.M.Shevack）、ストロバー（W.Str
ober）編、ジョーン・ウィリー＋サンズ（John Wiley＋
Sons））。個々の反応および精製工程の実行方法は当業
界からも知られており、例えば、ブレンナンら（Scienc
e 229（1985）、81−83）およびユングら（Eur.J.Immun
ol.21（1991）、2491−2495）に記載されている。
本発明の方法の好ましい態様において工程（ｃ）は、
同時に溶液をpH8.0へとリバッファリング（rebufferin
g）し、および／または工程（ｅ）は溶液をpH4.0へとリ
バッファリングして行う。
同時に溶液をpH8.0へとリバッファリング（rebufferin
g）し、および／または工程（ｅ）は溶液をpH4.0へとリ
バッファリングして行う。
本発明による方法の同様の好ましい態様において、工
程（ｆ）の製造物をハイブリダイズしていないＦ（a
b'）分子の除去という結果なる条件下でタンパク質分離
工程にかける。
程（ｆ）の製造物をハイブリダイズしていないＦ（a
b'）分子の除去という結果なる条件下でタンパク質分離
工程にかける。
他の好ましい態様において、上記の方法は、得られた
抗体断片が滅菌および／または無発熱素および／または
本質的に無活性ウイルスであるように行う。この態様
は、二重特異性抗体断片が患者における使用を意図する
場合に適切である。この態様は、例えば、二重特異性抗
体断片が診断目的を意図する場合には必ずしも必要とさ
れるわけではない。
抗体断片が滅菌および／または無発熱素および／または
本質的に無活性ウイルスであるように行う。この態様
は、二重特異性抗体断片が患者における使用を意図する
場合に適切である。この態様は、例えば、二重特異性抗
体断片が診断目的を意図する場合には必ずしも必要とさ
れるわけではない。
特に好ましい態様において、少なくとも１つの抗体は
Ｔ細胞の表面抗原を認識する抗体である。
Ｔ細胞の表面抗原を認識する抗体である。
上記方法の他の特に好ましい態様において、少なくと
も１つの抗体は腫瘍細胞の表面抗原を認識する抗体であ
る。
も１つの抗体は腫瘍細胞の表面抗原を認識する抗体であ
る。
本発明の方法は、十分な量の二重特異性抗体を許容し
得る費用で提供することができるので、従来の方法で満
足できないとわかった腫瘍の治療を可能にする。既知の
例として、リンパ性転移性悪性黒色腫が記載される。と
いうのは免疫療法も従来の治療法のいずれもこれまで利
用できなかったものをうまく治療することが可能である
からである。
得る費用で提供することができるので、従来の方法で満
足できないとわかった腫瘍の治療を可能にする。既知の
例として、リンパ性転移性悪性黒色腫が記載される。と
いうのは免疫療法も従来の治療法のいずれもこれまで利
用できなかったものをうまく治療することが可能である
からである。
従って、本発明の方法の他の好ましい態様は、腫瘍細
胞の表面抗原を認識する抗体が黒色腫に特異的である点
で特徴付けられている。
胞の表面抗原を認識する抗体が黒色腫に特異的である点
で特徴付けられている。
上記方法の特に好ましい態様において、腫瘍細胞の表
面抗原認識抗体は、CD3またはCD28に特異的である。
面抗原認識抗体は、CD3またはCD28に特異的である。
他の特に好ましい態様において本発明の方法は、工程
（ａ）における断片化が抗体溶液とペプシンを37℃で３
時間インキュベーションし、トリスバッファーでpHを8.
0に上昇させることにより反応を終結させることを含む
点で特徴付けられる。
（ａ）における断片化が抗体溶液とペプシンを37℃で３
時間インキュベーションし、トリスバッファーでpHを8.
0に上昇させることにより反応を終結させることを含む
点で特徴付けられる。
本発明の方法の他の態様において、工程（ｂ）におけ
る還元および修飾は、室温で20時間DTNB−TNB混合物の
等量の付加を含む。
る還元および修飾は、室温で20時間DTNB−TNB混合物の
等量の付加を含む。
本発明の方法の他の好ましい態様において、工程
（ｃ）および（ｅ）の精製工程はスーパーデックス（Su
perdex）200（ｃ）および／またはセファデックス（Sep
hadex）G20カラム上のゲル濾過を含む。当業者は公知文
献からいかにして上記カラムを用いて製造物（ｃ）およ
び（ｅ）の精製条件を選択するかを知っている。また、
当業者は先行技術から本発明の方法によって得た製造物
の他の精製方法を見出すかもしれない（Current Protoc
ols in Immunology、コディガン、クルビスベック、マ
ルグリス、シェバック、ストロバー編、（John Wiley＋
Sons））。
（ｃ）および（ｅ）の精製工程はスーパーデックス（Su
perdex）200（ｃ）および／またはセファデックス（Sep
hadex）G20カラム上のゲル濾過を含む。当業者は公知文
献からいかにして上記カラムを用いて製造物（ｃ）およ
び（ｅ）の精製条件を選択するかを知っている。また、
当業者は先行技術から本発明の方法によって得た製造物
の他の精製方法を見出すかもしれない（Current Protoc
ols in Immunology、コディガン、クルビスベック、マ
ルグリス、シェバック、ストロバー編、（John Wiley＋
Sons））。
本発明の方法の他の好ましい態様において、工程
（ｄ）における還元工程は、0.1mM DTT中での工程
（ｃ）製造物のインキュベーションを含む。この態様は
特に好ましく、かつ例えばブレンナンら（Science 229
（1985）、81−83）およびユングら（Eur.J.Immunol.21
（1991）2491−2495）参照のように公知の方法に比較し
て、TNBによって阻害されたタンパク質−SH基に関して
非常にわずかな、ほとんと化学量論的DTT濃度を使用す
るが、このことは重鎖および軽鎖間のジスルフィド結合
の還元確率を最小化する。この方法において、二重特異
性抗体断片の総収量だけでなく製造物の質を本発明の方
法を使用することによって高めることができる。
（ｄ）における還元工程は、0.1mM DTT中での工程
（ｃ）製造物のインキュベーションを含む。この態様は
特に好ましく、かつ例えばブレンナンら（Science 229
（1985）、81−83）およびユングら（Eur.J.Immunol.21
（1991）2491−2495）参照のように公知の方法に比較し
て、TNBによって阻害されたタンパク質−SH基に関して
非常にわずかな、ほとんと化学量論的DTT濃度を使用す
るが、このことは重鎖および軽鎖間のジスルフィド結合
の還元確率を最小化する。この方法において、二重特異
性抗体断片の総収量だけでなく製造物の質を本発明の方
法を使用することによって高めることができる。
本方法の特に好ましい他の態様において、工程（ｆ）
におけるハイブリダイゼーションは、pH8.0の0.1Mリン
酸バッファー中のＦ（ab'）−TBNおよびpH4.0の0.02M酢
酸バッファー中のＦ（ab'）−SHの等量反応によっても
たらされる。
におけるハイブリダイゼーションは、pH8.0の0.1Mリン
酸バッファー中のＦ（ab'）−TBNおよびpH4.0の0.02M酢
酸バッファー中のＦ（ab'）−SHの等量反応によっても
たらされる。
図は： 図１ 本発明の方法による二重特異性Ｆ（ab'）２断片
の製造 を示す。
の製造 を示す。
実施例は本発明の説明を提供する。
実施例:1 二重特異性Ｆ（ab'）２断片の製造 本発明による方法の出発点は、先行技術文献に記載さ
れるように入手した完全な抗体である（Current Protoc
ols in Immunology、コディガン、クルビスベック、マ
ルグリス、シェバック、ストロバー編、John Wiley＋So
ns）。本例に関して、黒色腫関連プロテオグリカンまた
は抗原特異的Ｔ細胞受容体に付随するヒトCD3分子に特
異的である抗体を使用した。これらの抗体をpH4.0の酢
酸バッファー中、37℃で３時間ペプシン（シグマ（Sigm
a））で処理し、抗体のFc部位を開裂させた（図１
（１））。その反応をトリスフバッファーでpH値８まで
上昇させることによって停止させ、ついで得られた溶液
を5,5'−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（DTNB;シグ
マ）およびチオニトロベンゾエート（thionitrobenzoat
e）（TNB）（図１（２））の等量混合物で室温で20時間
インキュベートした。DTNB−TNB混合物のモル比は20:30
であり、10mM DTT溶液と共に40mM DTNB溶液を２、３分
間インキュベートすることによって調製した。0.1mM DT
T（シグマ）で25℃で１時間、２つの修飾したＦ（ab'）
断片のうちの１つを繰り返し、還元後（図１（３））、
入手したＦ（ab'）−TNBおよびＦ（ab'）−SH断片は、2
5℃で１時間ハイブリダイズして二重特異性抗体Ｆ（a
b'）２断片を生じる（図１（４））。得た二重特異性Ｆ
（ab'）２断片をスーパーデックス200カラム上でのゲル
濾過により精製した。完全な抗体の量に基づく収率は約
20％であった。先行技術に記載される方法と比較して、
したがって収率は50％〜100％増加することができた。
れるように入手した完全な抗体である（Current Protoc
ols in Immunology、コディガン、クルビスベック、マ
ルグリス、シェバック、ストロバー編、John Wiley＋So
ns）。本例に関して、黒色腫関連プロテオグリカンまた
は抗原特異的Ｔ細胞受容体に付随するヒトCD3分子に特
異的である抗体を使用した。これらの抗体をpH4.0の酢
酸バッファー中、37℃で３時間ペプシン（シグマ（Sigm
a））で処理し、抗体のFc部位を開裂させた（図１
（１））。その反応をトリスフバッファーでpH値８まで
上昇させることによって停止させ、ついで得られた溶液
を5,5'−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（DTNB;シグ
マ）およびチオニトロベンゾエート（thionitrobenzoat
e）（TNB）（図１（２））の等量混合物で室温で20時間
インキュベートした。DTNB−TNB混合物のモル比は20:30
であり、10mM DTT溶液と共に40mM DTNB溶液を２、３分
間インキュベートすることによって調製した。0.1mM DT
T（シグマ）で25℃で１時間、２つの修飾したＦ（ab'）
断片のうちの１つを繰り返し、還元後（図１（３））、
入手したＦ（ab'）−TNBおよびＦ（ab'）−SH断片は、2
5℃で１時間ハイブリダイズして二重特異性抗体Ｆ（a
b'）２断片を生じる（図１（４））。得た二重特異性Ｆ
（ab'）２断片をスーパーデックス200カラム上でのゲル
濾過により精製した。完全な抗体の量に基づく収率は約
20％であった。先行技術に記載される方法と比較して、
したがって収率は50％〜100％増加することができた。
実施例2: 二重特異性Ｆ（ab'）２断片の機能性および安定性 使用したすべての抗体およびその二重特異性構築物を
標準的方法によりその機能性および安定性を調査した
（ユングら、Eur.J.Immunol.21（1991）、2341−243
5））。本発明の方法により製造されたＦ（ab'）２断片
の機能性および安定性は従来の方法により製造された断
片のそれと比較できた。これはとりわけ、ヒト腫瘍物質
との結合、リンパ球増殖における活性および細胞毒性試
験およびイン・ビボ条件下での安定性をいう；使用した
構築物を37℃のヒト血清中でインキュベートし、数ヶ月
間５℃のリン酸バッファー中で、少なくとも６日間機能
的に安定であった。
標準的方法によりその機能性および安定性を調査した
（ユングら、Eur.J.Immunol.21（1991）、2341−243
5））。本発明の方法により製造されたＦ（ab'）２断片
の機能性および安定性は従来の方法により製造された断
片のそれと比較できた。これはとりわけ、ヒト腫瘍物質
との結合、リンパ球増殖における活性および細胞毒性試
験およびイン・ビボ条件下での安定性をいう；使用した
構築物を37℃のヒト血清中でインキュベートし、数ヶ月
間５℃のリン酸バッファー中で、少なくとも６日間機能
的に安定であった。
実施例3: マウスのB16黒色腫細胞における二重特異性Ｆ（ab'）２
断片の試験 本発明の方法によって製造された二重特異性抗体断片
はまた、動物試験におけるイン・ビボ活性に関して試験
した。これらの試験により、上記Ｆ（ab'）２断片はマ
ウスにおける黒色腫細胞の増殖を阻害することができ、
その結果、全未処理動物が100％死亡するのに、処理し
た動物の半分より多くが生き残る。
断片の試験 本発明の方法によって製造された二重特異性抗体断片
はまた、動物試験におけるイン・ビボ活性に関して試験
した。これらの試験により、上記Ｆ（ab'）２断片はマ
ウスにおける黒色腫細胞の増殖を阻害することができ、
その結果、全未処理動物が100％死亡するのに、処理し
た動物の半分より多くが生き残る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 16/46 C07K 1/14 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (13)
- 【請求項１】（ａ）第１および第２抗体を、抗体のFc部
位を開裂し、Ｆ（ab'）２断片を形成するのに十分な条
件下で断片化工程にかけ； （ｂ）DTNB/TNB混合物を添加することにより、工程
（ａ）のそれぞれの製造物を中間精製工程なしにＦ（a
b'）２分子のヒンジ領域におけるジスルフィド結合の消
化および同時に得られたSH基の保護基による阻害が十分
可能である条件下で、還元および修飾工程にかけ； （ｃ）工程（ｂ）のそれぞれの製造物を反応付加物を除
去するのに十分な条件下で精製工程にかけ； （ｄ）工程（ｃ）の第１抗体の製造物を工程（ｂ）の保
護基の開裂に十分な条件下で還元工程にかけ； （ｅ）工程（ｄ）の製造物を工程（ｃ）による精製工程
にかけ；ついで （ｆ）工程（ｃ）の第２抗体の製造物および工程（ｅ）
の第１抗体の製造物を特異的なＦ（ab'）２分子を形成
するのに十分な条件下でのハイブリダイゼーション工程
にかける 工程を含む生物学的に活性な二重特異性抗体断片の製造
方法。 - 【請求項２】工程（ｃ）がpH8.0に該溶液を同時にリバ
ッファリングする間に起こり、および／または工程
（ｅ）がpH4.0に同時にリバッファリングする間に起こ
ることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】工程（ｆ）の製造物をハイブリダイズして
いないＦ（ab'）２分子を除去する結果となる条件の下
でタンパク質分離工程にかける工程を実行することによ
って特徴付けられる請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】該得られた抗体断片が滅菌、無発熱素およ
び本質的に無活性ウイルスであることを特徴とする請求
項１から３のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項５】少なくとも１つの抗体がＴ細胞の表面抗原
を認識することを特徴とする請求項１から４のいずれか
１つに記載の方法。 - 【請求項６】少なくとも１つの抗体が腫瘍細胞の表面抗
原を認識することを特徴とする請求項１から５のいずれ
か１つに記載の方法。 - 【請求項７】該腫瘍細胞の表面抗原を認識する抗体が黒
色腫に特異的であることを特徴とする請求項６に記載の
方法。 - 【請求項８】腫瘍細胞の表面抗原を認識する抗体がCD3
またはCD28に特異的であることを特徴とする請求項５か
ら７のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項９】工程（ａ）における断片化が、ペプシンと
抗体溶液を37℃で３時間インキュベートし、ついでトリ
スバッファーでpHを8.0まで上昇させることによって反
応を終結させることを含むことを特徴とする請求項１か
ら８のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項１０】工程（ｂ）における還元および修飾がDT
NB/TNB等量混合物を室温で20時間添加することにより行
うことを特徴とする請求項１から９のいずれか１つに記
載の方法。 - 【請求項１１】工程（ｃ）および（ｅ）における精製工
程がスーパーデックス200−（ｃ）上および／またはセ
ファデックスG20カラム上でのゲル濾過を含むことを特
徴とする請求項１から10のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項１２】工程（ｄ）における還元工程が0.1mM DT
T中で製造物をインキュベートすることを含むことを特
徴とする請求項１から11のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項１３】工程（ｆ）におけるハイブリダイゼーシ
ョンが、pH8.0の0.1Mリン酸バッファー中のFab−TNBお
よびpH4.0の0.02M酢酸バッファー中のFab−SHの等量の
反応液によってもたらされることを特徴とする請求項１
から12のいずれか１つに記載の方法。
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-
1996
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- 1996-07-25 JP JP50840298A patent/JP3266276B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-25 DK DK96927598T patent/DK0912612T3/da active
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