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1. Gegenstand der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Überlebensprognose
bei Patienten mit malignem Melanom, bei dem man eine Probe von einem
Patienten auf das Vorhandensein von anti-CD28 Autoantikörpern
untersucht, indem man die Probe mit CD28 in Kontakt bringt, wobei
eine Bindung der Autoantikörper an CD28 auf eine signifikant
schlechtere Überlebensprognose des Patienten mit malignem
Melanom hinweist. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung
von CD28 als Nachweisreagenz für anti-CD28 Autoantikörper
zur Bestimmung der Überlebensprognose bei Patienten mit
malignem Melanom und ein zu diesem Zweck gedachtes Kit, das CD28
und markierte anti-Immunglobulin-Antikörper umfaßt.
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2. Stand der Technik
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Das
maligne Melanom ist ein äußerst aggressiver Tumor,
der von den Melanozyten in der Haut oder anderen Organen ausgeht
und frühzeitig metastasiert. Die Standardtherapie des malignen
Melanoms besteht in der möglichst frühzeitigen
Exzision des Primärtumors. In den fortgeschrittenen Stadien
der Erkrankung gibt es einige unspezifische Parameter, die die Prognose
des Krankheitsverlaufs sowie der Überlebensrate beeinflussen.
Dazu gehört die Erhöhung der Laktatdehydrogenase
(LDH) im Serum sowie eine schlechter Allgemeinzustand. Spezifische
Prognoseparameter, die zum Beispiel mit bestimmten Funktionen des
Immunsystems assoziiert sind, wurden bisher nicht beschrieben (Balch
CM, Buzaid AC, Soong SJ et al. Final version of the American Joint
Committee an Cancer staging system for cutaneous melanoma. J Clin
Oncol 2001; 19: 3635–48.). Als Tumormarker hat
sich in den letzten Jahren der Nachweis des S100 Proteins im Serum
etabliert. Wie bei anderen Tumormarkern auch ist S100 allerdings
nur als Verlaufsparameter bei Patienten mit weit fortgeschrittenen
Melanomen geeignet und gibt lediglich Hinweise auf ein Tumorrezidiv.
Die Prognose des einzelnen Patienten ist nicht mit der Höhe
der S100-Spiegel im Serum korreliert (Harpio R, Einarsson
R. S100 Proteins as cancer biomarkers with focus an S100B in malignant
melanoma. Clin Biochem 2004; 37: 512–8).
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Um
bei Patienten mit malignem Melanom eine Prognose bezüglich
des Gesamtüberlebens stellen zu können, besteht
ein Bedarf, ein entsprechendes Diagnoseverfahren bereit zu stellen.
Da das Melanom im fortgeschrittenen Stadium eine lebensbedrohliche
Erkrankung ist, die sehr häufig zum Tod des Patienten führt,
ist die Prognose von wesentlicher Bedeutung, um das weitere Therapieschema
entsprechend darauf abzustellen und Therapiemaßnahmen zu
ergreifen, die geeignet sind, die Überlebensprognose zu
verbessern. Praktische Konsequenzen aus der Prognose können
zum Beispiel eine intensivierte klinische Überwachung und
Diagnostik bei Patienten mit CD28-positivem Autoantikörper-Status
(CD28+ Ak-Status), möglicherweise das Absetzen der IFNα-Therapie
oder sogar eine immunsuppressive Therapie sein.
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Die
vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf und stellt erstmals
ein Verfahren zur Verfügung, mit dem sich die Überlebensprognose
bei Patienten mit malignem Melanom semiquantitativ bestimmen lässt.
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3. Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Überlebensprognose
bei Patienten mit malignem Melanom, bei dem man eine Probe von einem
Patienten auf das Vorhandensein von anti-CD28 Autoantikörpern
untersucht, indem man die Probe mit CD28 in Kontakt bringt, wobei
eine Bindung der Autoantikörper an CD28 auf eine – im
Vergleich zu Patienten ohne anti-CD28 Autoantikörper – signifikant schlechtere Überlebensprognose
des Patienten mit malignem Melanom hinweist.
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis,
dass das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen CD28 in
Patientenproben, vorzugsweise im Plasma und besonders bevorzugt
im Serum von Patienten mit malignem Melanom, ein statistisch signifikanter
Marker für die Prognose hinsichtlich des Gesamtüberlebens
der Patienten ist. Diese Autoantikörper treten vermehrt
bei Hochrisiko-Melanompatienten auf, die adjuvant mit Interferon-alpha
(IFNα) behandelt werden und verschlechtern bei diesen Patienten
auch das Gesamtüberleben. Daher stellt die Diagnostik von
Autoantikörpern gegen CD28 einen neuen Parameter für
differenzierte Therapieentscheidungen und für die Prognose
bei Patienten mit malignem Melanom dar. Das heißt, dass
man erfindungsgemäß anti-CD28 Autoantikörper
als prognostischen Marker zur Bestimmung der Überlebensprognose
bei Patienten mit malignem Melanom verwendet.
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Unter „Überlebensprognose"
wird vorliegend sowohl das progressionsfreie Überleben
(PFS) als auch das Gesamtüberleben (OS) der Patienten verstanden.
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Die
Erkenntnis, dass das Vorhandensein von anti-CD28 Autoantikörpern
ein statistisch signifikanter, prognostischer Marker bei Patienten
mit malignem Melanom ist, ist umso überraschender, als
das Auftreten von verschiedenen Autoantikörpern oder von
Autoimmunerkrankungen unter der adjuvanten Immuntherapie mit IFNα – die
sich inzwischen in Stadien mit großen Primärmelanomen
oder regionärer Metastasierung als Standardtherapie etabliert
hat (Balch CM, Buzaid AC, Soong SJ et al., a. a. O.; Kirkwood
JM, Strawderman MH, Ernstoff MS et al. Interferon alfa-2b adjuvant
therapy of high-risk resected cutaneous melanoma: the Eastern Cooperative
Oncology Group Trial EST 1684. J Clin Oncol 1996; 14: 7–17) – die
Prognose von Melanompatienten mit hohem Metastasierungsrisiko statistisch
signifikant verbessert (Gogas H, Ioannovich J, Dafni U et
al. Prognostic significance of autoimmunity during treatment of
melanoma with interferon. N Engl J Med 2006; 354: 709–18).
Im Fall des malignen Melanoms hingegen verringert sich das progressionsfreie Überleben (PFS)
signifikant, und das Gesamtüberleben (OS) der Patienten
verringert sich hochsignifikant.
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Die
Erfindung umfasst den semiquantitativen Nachweis von humanen Autoantikörpern
gegen CD28 in Patientenproben, vorzugsweise in Blutproben oder im
Plasma und besonders bevorzugt im Serum von Patienten mit malignem
Melanom, mit Hilfe eines ELISAs, der hierin näher beschrieben
ist.
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Bei
Melanompatienten im Stadium III ist der Nachweis von Autoantikörpern
gegen CD28 mit einem signifikant verschlechterten Gesamtüberleben
verbunden. Das gleichzeitige Vorhandensein von anderen Autoantikörpern
(ANA, anti-Schilddrüsen-Ak), die möglicherweise
die Prognose verbessern, kann diesen prognostisch ungünstigen
Effekt nur unwesentlich ausgleichen.
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Die
Erfindung ermöglicht es erstmals, Melanompatienten mit
einer schlechteren Überlebensprognose zu identifizieren
und daraus therapeutische Konsequenzen abzuleiten. Zum einen sollten
Patienten, die Autoantikörper gegen CD28 im Serum haben,
keine Therapie mit IFNα erhalten, weil dadurch noch höhere
Serumtiter der Autoantikörper gegen CD28 induziert werden
können. Zum anderen sollte bei Patienten, die unter einer
IFNα-Therapie Autoantikörper gegen CD28 entwickeln,
die Immuntherapie abge brochen werden. Alternativ käme auch
der Einsatz von z. B. Interleukin-2 (IL2) oder Chemotherapie in
Betracht.
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Im
Rahmen dieser Erfindung wird als CD28 ein CD28-Molekül
ganzer Länge gemäß SEQ ID NO:1 oder ein
extrazelluläres Fragment davon gemäß SEQ
ID NO:2 oder SEQ ID NO:6 bezeichnet, das von anti-CD28 Autoantikörpern
erkannt werden kann. Das extrazelluläre Fragment von CD28
umfasst die in CD28 ganzer Länge vorkommenden Aminosäuren
mit Ausnahme des intrazellulären Teils und der transmembranen Region.
Die Sequenz gemäß SEQ ID NO:6 beschreibt die Sequenz
des humanen extrazellulären Fragments, und SEQ ID NO:2
ein um insgesamt fünf Aminosäuren kürzeres
Fragment.
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Die
Sequenz von humanem CD28 ganzer Länge ist in SEQ ID NO:1
angegeben. Neben humanen CD28-Molekülen oder Fragmenten
davon sind jedoch auch CD28-Proteine oder Fragmente davon aus anderen
Spezies im Rahmen dieser Erfindung umfasst, wie z. B. aus Maus,
Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Hund, Katze, Pferd oder Rind
(sogen. Speziesvarianten).
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung sind neben den extrazellulären
Fragmenten gemäß SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:2
auch Fragmente (Teile) dieser Sequenzen eingeschlossen, d. h. Teilsequenzen
dieser explizit genannten Fragmente, die ebenso wie die längeren
CD28-Fragmente zum Nachweis von anti-CD28 Autoantikörpern
geeignet sind. Erfindungsgemäß ebenfalls eingeschlossen
sind Derivate dieser Fragmente und Teilsequenzen, die sich von diesen
durch Austausch einzelner, vorzugsweise weniger Aminosäuren
unterscheiden. Dabei werden selbstver ständlich solche Sequenzvarianten
gewählt, die nach wie vor zum Nachweis von anti-CD28 Autoantikörpern
geeignet sind. Vorzugsweise werden solche kürzeren Teile
des extrazellulären CD28-Fragments oder Sequenzvarianten
derselben gewählt, die noch eine ausreichende, vorzugsweise
hohe Spezifität und/oder Selektivität beim Nachweis
von anti-CD28 Autoantikörpern ermöglichen.
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Das
CD28-Molekül ganzer Länge oder extrazelluläre
Fragmente davon können Teil eines Fusionsproteins sein.
Bevorzugt umfaßt das Fusionsprotein ferner Glutathion-S-Transferase
oder ein Histidin-Tag, wobei dies besonders zur Aufreinigung des
rekombinanten Proteins hilfreich ist. Grundsätzlich kann
CD28 aus Zellen aufgereinigt oder rekombinant hergestellt sein.
Das Fusionsprotein kann einen Ig (Immunglobulin)-Teil umfassen,
es ist jedoch bevorzugt, daß dieser nicht in dem Fusionsprotein
enthalten ist, so daß Schwierigkeiten mit möglicher
Kreuzreaktivität von im Patentientenserum vorkommenden
Autoantikörpern gegen den Ig-Teil vermieden werden. CD28
kann jedoch aus CD28-Ig-Fusionsmolekülen abgespalten werden,
z. B. mit Trypsin.
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Die
Probe eines Patienten ist bevorzugt eine Blutprobe oder eine Serumprobe.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im Allgemeinen
in vitro durchgeführt.
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Bevorzugt
ist CD28 an einen Träger gebunden. Ein solcher fester Träger
kann z. B. eine ELISA-Platte, ein magnetisches Kügelchen
oder eine Blotfolie, z. B. eine Nitrozellulosefolie, sein. Als Träger
werden im Rahmen der Erfindung auch Zellen bezeichnet, die CD28
natürlicherweise oder rekombinant an ihrer Oberfläche exprimieren.
CD28 kann direkt an den Träger ge bunden, oder, z. B. über
Antikörper, insbesondere Antikörper gegen einen
mit CD28 verbundenen Tag, wie Glutathion-S-Transferase, an einen
Träger gekoppelt werden. Diese Antikörper sind
keine humanen Antikörper, um Kreuzreaktionen mit sekundären
Antikörpern zu verhindern.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die
Bindung von anti-CD28 Autoantikörpern an CD28 untersucht,
indem man den Träger mit markierten anti-Immunglobulin-Antikörpern
gegen Antikörper der Spezies, der der Patient angehört,
kontaktiert, und man die markierten Antikörper nachweist.
Beispielsweise kann der Patient ein Mensch sein. In diesem Fall
wird bevorzugt humanes CD28 verwendet, und die anti-Immunglobulin-Antikörper
sind anti-humane Immunglobulin-Antikörper.
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Bevorzugt
sind die anti-Immunglobulin-Antikörper spezifisch für
Antikörper des IgG-Isotyps, sie können jedoch
auch gegen IgG und IGM und/oder IgE reaktiv sein.
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Bevorzugt
sind die anti-Immunglobulin-Antikörper mit einem Enzym,
beispielsweise Alkalischer Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase,
Biotin, einem radioaktiven Isotop oder einem Fluoreszenzfarbstoff,
z. B. Fluoresceinisothiozyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE) markiert.
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Die
Untersuchung kann in einem Blot, z. B. einem Dotblot oder einem
Westernblot, einem ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), einem
RIA (Radioimmunoassay), einer FACS (Fluorescence activated cell sorting)-Untersuchung
oder auch in einem Flüssigphasendetektionssystem durchgeführt
werden. Sind die Träger Zellen, so findet die nachfolgende
Untersuchung der Bindung bevorzugt im FACS oder fluoreszenzmikroskopisch
statt.
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Ebenfalls
wird ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens bereitgestellt. Bevorzugt umfasst dieses Kit CD28 und
markierte anti-Immunglobulin-Antikörper.
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Das
CD28 umfasst bevorzugt ein CD28-Molekül ganzer Länge
gemäß SEQ ID NO:1 oder ein extrazelluläres
Fragment davon gemäß SEQ ID NO:2. Bevorzugt handelt
es sich um humanes CD28 und markierte anti-humane Immunglobulin-Antikörper,
insbesondere anti-humane IgG-Antikörper.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße
Kit ferner markierte anti-IgE-Antikörper und ist damit
dazu geeignet, diagnostische Tests zur Bestimmung der Überlebensprognose
bei Patienten mit malignem Melanom sowohl auf Basis der Feststellung
der Konzentration an Gesamt-IgE als auch auf Basis des Nachweises
von CD28 Autoantikörpern durchzuführen, da hohe
IgE-Spiegel ein Indiz dafür sein können, dass
eine geringere Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung eines Melanoms
besteht. Das Kit kann weiterhin unmarkierte anti-IgE-Antikörper
umfassen, so dass der Test auf Gesamt-IgE als Sandwich-ELISA durchgeführt
werden kann. Die unmarkierten Antikörper können
polyklonale anti-IgE-Antikörper sein, die markierten anti-IgE-Antikörper
können polyklonal oder monoklonal sein. Alternativ können
die markierten und die unmarkierten anti-IgE Antikörper
beide jeweils monoklonale Antikörper sein, die jedoch gegen
ein unterschiedliches Epitop gerichtet sein müssen.
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Die
in dem Kit enthaltenen markierten Antikörper können
mit einem Enzym, z. B. alkalischer Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase,
Biotin, einem radioaktiven Isotop oder einem Fluoreszenzfarbstoff,
z. B. FITC oder PE, markiert sein.
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Schließlich
betrifft die Erfindung noch die Verwendung von anti-CD28 Autoantikörpern
als prognostischer Marker zur Bestimmung der Überlebensprognose
bei Patienten mit malignem Melanom und somit die Verwendung eines
hierin beschriebenen Kits zur Bestimmung von anti-CD28 Autoantikörpern
als prognostischer Marker für die Überlebensprognose
bei Patienten mit malignem Melanom.
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Die
vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen weiter
erläutert.
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BEISPIELE
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Anti-CD28
Autoantikörper sind durch verschiedene Methoden nachweisbar,
wie z. B. durch Blot-Techniken (Beispiel 1).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform wurden Seren von Melanompatienten
mit hohem Metastasierungsrisiko, d. h. in den Stadien II und III
(AJCC 2002), mit einem ELISA zum Nachweis von Autoantikörpern gegen
CD28 untersucht (Beispiel 3). Dabei wurde ein Fusionsprotein von
CD28 mit Glutathion-S-Transferase verwendet (Beispiel 2).
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Beispiel 1:
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Enzymatische Spaltung des rekombinaten
CD28-Ig Fusionsprotein mit Trypsin und Nachweis von Autoantikörpern
gegen CD28 im Immunoblot
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Das
rekombinante CD28-Ig Fusionsprotein (R & D Systems Inc. Minneapolis, USA)
wurde in PBS-Puffer (2,7 M NaCl, 54 mM KCl, 87 mM Na2HPO4, 30 mM KHPO4, pH
7,4) in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst und 100 μl
dieser Lösung wurden mit 50 μl Trypsin (10 mg/ml)
bei 37°C für 15 Minuten verdaut. Am Ende der Inkubationszeit
wurden 1,5 μl Aprotinin (10 mg/ml) und 2,5 μl
TLCK (Nα-p-Tosyl-L-lysin-chlormethylketon, 20 mg/ml) hinzugefügt,
um die enzymatische Aktivität von Trypsin zu hemmen. Die
Lösung kann bis zum weiteren Gebrauch bei –20°C
gelagert werden.
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Die
gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinen (SDS-PAGE) wird
nach der Methode von Lughtenberg et al. (Lughtenberg, B.
(1975), FEBS Lett. 58, 254) durchgeführt. Die
Spaltprodukte wurden durch SDS-Gel Elektrophorese (10%iges Gel)
mit einem 4% Sammelgel (110 V, 150 Minuten) unter nicht-reduzierenden
Bedingungen aufgetrennt. Anschließend wurden die Spaltprodukte
bei einer Stromstärke von 50 mA 3 Stunden lang auf PVDF
(Polyvinylidenfluorid)-Membranen (Segin-Blot, Biorad, Germany) transferriert.
Anschließend wurden die Membranen mit 5% Magermilchpulver
für 60 Minuten bei Raumtemperatur blockiert und mit PBS
dreimal gewaschen.
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Die
Sensitivität und Spezifität des Immunblots wurde
mit den folgenden Antikörpern kontrolliert: monoklonaler
Maus antihuman CD28 Antikörper (R&D Systems, Minneapolis, USA), 1:5.000 in
PBS verdünnt, biotinylierter polyklonaler Maus anti-human
CD28 Antikörper (R&D
Systems, Minneapolis, USA), 1:5.000 in PBS verdünnt, monoklonaler
Maus anti-human Fc Antikörper (Dianova, Hamburg, Germany),
1:10.000 in PBS verdünnt, und polyklonaler Kaninchen anti-human
IgG Antikörper (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany), 1:3.500 in
PBS verdünnt.
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Ein
Spaltprodukt des CD28-Ig Fusionsproteins wird eindeutig nur von
den Anti-CD28 Antikörpern erkannt, nicht aber von Antikörpern
gegen IgG oder Fc.
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Zum
Nachweis der Autoantikörper gegen CD28 im Serum wurden
die in Streifen geschnittenen PVDF-Membranen in 1:10 verdünntem
humanem Serum für 1 Stunde auf einem Schwenktisch bei Raumtemperatur
inkubiert. Als Kontrollen dienten spezifische Antiseren gegen humanes
Fc (Dianova, Hamburg) und humanes CD28 (R&D, Wiesbaden). Anschließend
wurden die Blots wieder dreimal gewaschen und dann für
1 Stunde bei Raumtemperatur mit einem sekundären, AP-konjugierten
Antikörper gegen humanes IgG (Fa. Serva, Heidelberg) inkubiert.
Die Bindung wurd durch eine enzymatische Farbreaktion (BCIP/NBT,
5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/p-nitroblue tetrazolium chloride)
sichtbar gemacht.
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Mit
Hilfe des Immunoblots können im Serum spezifische IgG-Antikörper
gegen CD28 nachgewiesen werden.
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Beispiel 2:
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Herstellung eines CD28-GST-Fusionsproteins
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RNA-Präparation aus humanem Vollblut
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Zunächst
wurde aus humanem Vollblut mit Hilfe des QIAamp RNA Blond Mini-Kit
der der Firma Qiagen (Hilden, Katalognummer: 52304) RNA präpariert.
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RT-PCR zur Herstellung von cDNA
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5 μg
der präparierten RNA wurden mit dem superscript-Kit (Invitrogen,
Karlsruhe) mit random hexamer-Primern (Katalognummer: 53034) in
Blut-cDNA umgeschrieben.
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Klonierung der CD28 cDNA
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Anschließend
wurde der für den extrazellulären Bereich (IgG-artige
Domäne, ohne Transmembranregion und Signalpeptid) dieses
Proteins kodierende cDNA-Bereich mit Hilfe einer Polymerasekettenreaktion (PCR)
amplifiziert. Als Referenz diente die online bei NCBI abfragbare
Sequenz NM_006139 (SEQ ID NO: 3).
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Die
amplifizierte cDNA kodiert für die Aminosäuresequenz:
PSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLF
(SEQ ID NO: 2)
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Als
Primer dienten:
Sense 5'-AAAGAATTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAAC-3'
(SEQ
ID NO: 4)
Antisense 5'-AAACCCGGGAAATAGGGGACTTGGACAAAG-3'
(SEQ
ID NO: 5)
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Die
Integration der cDNA in die multiple-cloning-site des Vektors pGEX-4T-1
(Amersham Biosciences, Freiburg, Katalognummer: 27-4580-01) erfolgte über
Schnittstellen für die Restriktionsenzyme EcoRI und SmaI,
die bereits in die zur Amplifikation eingesetzten Primer 5' integriert
waren (in der Primersequenz unterstrichen). Dazu wurde das PCR-Amplifikat
ebenso wie der Vektor pGEX-4T-1 zunächst mit SmaI (New
England Biolabs, Frankfurt a. M., Katalognummer: #R0141S) und anschließend
mit EcoRI (New England Biolabs, Katalognummer #R0101S) im Reaktionspuffer
NEB4 bei 20°C bzw. 37°C für jeweils zwei
Stunden inkubiert. Anschließend erfolgte eine Aufreinigung
der geschnittenen DNA über das Agarose Gel DNA Extraction-Kit
der Firma Roche (Basel, Katalognummer: 1696505). Der linearisierte
Vektor wurde anschließend dephosphoryliert, wozu die eluierte
DNA bei 37°C mit 10 U alkalischer Phosphatase (Roche, Katalognummer:
713023) nach Zugabe des entsprechenden Puffers inkubiert wurde.
Die Restriktionsansätze wurden anschließend in
einem einprozentigen Agarose-Gel bei 100 V aufgetrennt. Nach Ethidium-Bromid-Färbung
konnte eine Bande von ca. 400 bp auf einem UV-Transilluminator visualisiert
und ausgeschnitten werden. Die geschnittene cDNA wurde dann mit
Hilfe des Roche Agarosegel-Elution kits in 50 μl H2O eluiert. Anschließend wurde ein
Ligationsansatz mit T4-Ligase (Invitrogen, Katalognummer: E111-01),
100 ng Vektor und 200 ng cDNA-Fragment angesetzt und bei 12°C
mehrere Stunden inkubiert. Hieraus ergibt sich ein Konstrukt, bei
dem die Glutathion S-Transferase 5'-wärts des im Leserahmen
befindlichen CD28-Bereichs liegt.
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Anschließend
wurden kompetente Bakterien (XL1 Blue, HB 101) mit einem Fünftel
des Ligationsansatzes transformiert. Dazu wurde zu 50 μl
auf Eis aufgetauter kompetenter Bakterien ein Fünftel eines
Ligationsansatzes oder 0,5 μg einer DNS-Präparation
hinzupipettiert und 30 min auf Eis inkubiert.
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Anschließend
wurden die Bakterienansätze 5 min auf 37°C erwärmt.
Danach wurden 950 μl SOC Medium zugegeben und zwischen
50 μl und 1 ml des Ansatzes auf LB-Agar-Platten mit 150 μg/ml
Ampicillin mit einer Pipette gleichmäßig ausgestrichen
und über Nacht bei 37°C inkubiert.
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Minipräparation von
Plasmid-DNA aus Bakterien
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Einzelne
Kolonien transformierter Bakterien wurden in 2,5 ml Medium mit entsprechendem
Antibiotikumszusatz angeimpft und über Nacht inkubiert.
Die Bakterien wurden dann bei 2400 g pelletiert, der Überstand
abgesaugt und das Pellet in 200 μl STET (8% Sukrose, 5%
Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA) mit 1 μg/ml
Lysozym auf dem Schüttler resuspendiert. Anschließend
wurde der Ansatz für 2 Minuten auf 95°C erhitzt
und dann 10 min bei 16000 g zentrifugiert. Das Sediment wurde nun
mit einem Zahnstocher entfernt und verworfen. Dem Überstand
wurden 10 μl 5%iger CTAB-Lösung (Cetyl-Trimethyl-Ammoniumbromid)
zugegeben, kurz geschüttelt und das Präzipitat
bei 16000 g pelletiert. Der Überstand wurde abgesaugt und
das Pellet in 300 μl 1,2 M NaCl auf dem Schüttler
gelöst. Dann wurden 750 μl Ethanol 100% zugegeben, der
Ansatz kräftig geschüttelt und bei 10 min bei
16000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt, das Pellet
nun in 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen, 5 min bei 16000 g zentrifugiert
und der Überstand erneut verworfen. Das DNA-Pellet wurde
nun getrocknet und in 30 μl H2O
aufgenommen.
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Die
Richtigkeit der Sequenz des eingefügten Bereichs erfolgte
durch anschließende Sequenzierung.
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Präparation des rekombinanten
CD28-GST-Fusionsproteins
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Kompetente
BL21-RILsuppl. Bakterien (ein proteasedefizienter E. coli-Stamm)
wurden mit dem cDNA-Konstrukt transformiert und nach halbstündiger
Vorinkubation in SOC-Medium bei 37°C auf LB-Agar-Platten
mit 150 μg/ml Ampicillin ausgestrichen. Nach 14stündiger
Inkubation wurde eine 30 ml LB-Medium mit Ampicillin mit einer Kolonie
beimpft.
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Diese
Vorkultur wurde über Nacht bei 37°C im Schüttler
inkubiert. Diese wurde dann in 500 ml LB-Medium mit Ampicillin überführt
und bis zu einer optischen Dichte von 0,6–0,8 bei 600 nm
unter ständigem Schütteln bei 37°C inkubiert
(ca. 1,5 Stunden).
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Sobald
diese Dichte erreicht war, wurde die Proteinexpression mit 1 mM
IPTG (Isopropyl bD-thiogalactopyranosid, Biomol, Hamburg, Katalognummer:
05684-1) induziert. Nach ca. 4 Stunden wurden die Bakterien bei
4000 g und 4°C für 10 Minuten pelletiert, der
Kulturüberstand verworfen und das Pellet in 5–10
ml eiskaltem PBS resuspendiert. Diese Suspension wurde nun fünfmal
einer Ultraschallbehandlung von je 10 Sekunden Dauer unterzogen
(Branson Sonifier 250, Stufe 6) und anschließend 20 Minuten
bei 30000 g zentrifugiert. Nun erfolgte die Affinitätsreinigung über
den GST-Tag. Glutathion-Sepharose 4B (Amersham Biosciences, Katalognummer:
27-4574-01) wurde bis zu einem Bettvolumen von 1 ml in eine gravitationsgetriebene Poly propylensäule
geladen und in einem fünffachem Volumen PBS äquilibriert.
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Anschließend
wurde das Bakterienlysat aufgeladen und der Durchfluss erneut auf
die Säule gegeben. Der zweite Durchfluss wurde verworfen
und die Säule mit dem fünf- bis zehnfachen des
Bettvolumens PBS gewaschen. Eluiert wurde in 10 mM reduziertem Glutathion,
50 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10% Glycerol.
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Das
eluierte Protein wurde anschließend aliquotiert und bei –80°C
aufbewahrt. Benötigte
Materialien
| PBS | 137
mM NaCl |
| | 2,7
mM KCl |
| | 7,4
mM Na2HPO4 |
| | 1,5
mM KH2PO4 |
| | |
| STET | 8%
Sucrose |
| | 0,1%
Triton X |
| | 50
mM EDTA |
| | 50
mM Tris pH 8 |
| | |
| TAEx50 | 2
M Tris Base |
| | 5,71%
Eisessig |
| | 50
mM EDTA |
| | |
| TE | 20
mM Tris pH 7,5 |
| | 1
mM EDTA |
| | |
| Auftragpuffer × 5 (für
Nukleinsäuren) | 40%
Sucrose |
| 0,25%
Bromphenolblau |
| | 0,25%
Xylene X |
| | in
TE |
| SOC
Medium | 2%
bacto-trypton |
| | 0,5%
Bacto Hefe Extrakt |
| | 10
mM NaCl |
| | 2,5
mM KCl |
| | 5
N NaOH auf pH 7,0 |
| Autoklavieren und anschließend
auf 60°C abkühlen. | |
| | 10
mM MgCl2 |
| | 10
mM Glukose |
| | |
| Dyt
Medium | 1,6%
Bacto-tryptone |
| | 1%
Bacto Hefe Extrakt |
| | 100
mM NaCl |
| LB
Medium | 1%
Bacto-tryptone |
| | 0,5%
Bacto Hefe Extrakt |
| | 200
mM NaCl |
| mit NaOH auf pH 7,5 einstellen | |
| | |
| Y-broth | LB
Medium |
| | 4
mM MgSO4 |
| | 5
mM KCl |
| | |
| TFB
1 | 15%
Glycerin |
| | 10
mM CaCl2 |
| | 30
mM Kaliumacetat |
| mit Essigsäure
auf pH 5,8 einstellen | |
| | 100
mM RbCl |
| | |
| | 50
mM MnCl2 |
| | |
| TFB
2 | 15%
Glycerin |
| | 10
mM MOPS |
| | 75
mM CaCl2 |
| | 10
mM RbCl |
| LB
Medium | 1%
Bacto-tryptone |
| | 0,5%
Bacto Hefe Extrakt |
| | 200
mM NaCl |
| mit NaOH auf pH 7,5 einstellen | |
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Herstellung kompetenter Bakterien
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XL1blue
Bakterien wurden auf einer LB-Platte ausgestrichen und über
Nacht bei 37°C inkubiert. Morgens wurden einige Kolonien
mit je 2 ml Y-broth angeimpft und 2 Stunden bei 37°C im
Schüttler inkubiert. Anschließend wurden diese
Vorkulturen in 500 ml Y-broth gegossen und bis zu einer OD bei 600
nm von 0,3–0,35 inkubiert. Dann wurde die Kultur auf zwei
50 ml Polypropylenröhrchen verteilt, kurz auf Eis gestellt
und bei 4°C und 2000 g pelletiert. Der Überstand
wurde dekantiert, das Pellet in je 15 ml in TFB 1 (15% Glycerin,
10 mM CaCl2, 30 mM Kaliumacetat, mit Essigsäure
auf pH 5,8 eingestellt, 100 mM RbCl, 50 mM MnCl2)
resuspendiert und 60–90 Minuten auf Eis gestellt.
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Anschließend
wurde erneut mit 2000 g pelletiert, der Überstand dekantiert
und das Pellet in je 2 ml TFB 2 (15% Glycerin, 10 mM MOPS, 75 mM
CaCl2, 10 mM RbCl) resuspendiert. Die Bakterien
wurden dann in 200 μl Aliquots aufgeteilt und sofort in
Flüssigstickstoff schockgefroren und anschließend
bei –80°C gelagert.
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Beispiel 3: ELISA zum Nachweis spezifischer
Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne
des humanen CD28
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Die
Kavitäten von Mikrotiterplatten (Maxisorp, Nunc) wurden
mit 100 μl monoklonalem Maus anti-Gluthation-S-Transferase
(GST) Antikörper (spezifisch für GST aus Schistosoma
japonicum, 1:2000 in PBS vorverdünnt) beschichtet. Nach
einer Inkubationszeit von 1 h bei Raumtemperatur wurden die Kavitäten
dreimal mit PBS + 0,1% Tween 20 gewaschen.
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Dann
wurde mit 250 μl PBS mit 1% Magermilchpulver und 0,1% Tween
20 für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend
wurde erneut dreimal mit PBS + 0,1% Tween 20 gewaschen. Während
in die Vertiefungen der Spalten 1 und 2 jeweils 100 μl
1:2 vorverdünntes CD28-GST Antigen (PBS + 0,1% Tween 20)
pipettiert wurden, kamen in die Vertiefungen der dritten und vierten
Spalte nur je 100 μl PBS + 0,1% Tween 20. Entsprechend
wurden die übrigen Spalten der Mikrotiterplatte vorbereitet.
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Nach
1 h bei Raumtemperatur folgten erneut drei Waschschritte. Anschließend
wurden die Patientenseren sowie das positive Kontrollserum, ein
polyklonaler Kaninchen anti-human CD28 Antikörper (Santa
Cruz, Heidelberg), Konzentration 1 μg/ml, 1:200 in PBS
+ 0,1% Tween 20 vorverdünnt.
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Der
Leerwert enthielt das Antigen, aber kein Kontrollserum, die Negativkontrolle
enthielt das Kontrollserum, aber kein Antigen und der Blank enthielt
weder Kontrollserum noch Antigen. Jedes Patientenserum wurde in
Doppelbestimmungen gegen Antigen und – zum Ausschluss unspezifischer
Reaktionen – gegen PBS + 0,1 %/Tween 20 gemessen.
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Anschließend
wurde die Mikrotiterplatte für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert
und anschließend dreimal gewaschen. Im nächsten
Schritt wurde der Sekundärantikörper hinzugegeben.
In die Vertiefungen mit dem Kontrollserum (B 1–4) wurden
je 100 μl eines anti Kaninchen IgG Antikörpers
(Fc-spezifisch; Sigma, München) und für die Patientenseren
je 100 μl eines anti-human IgG Antikörpers (Fc-spezifisch;
Sigma, München) verwendet. Beide Antikörper wurden
1:5000 vorverdünnt und sind mit alkalischer Phosphatase
markiert. Die Inkubationszeit betrug bei Raumtemperatur 60 min.
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Danach
wurde fünfmal gründlich gewaschen und in jede
Vertiefung wurden 100 μl der p-Nitrophenyl Substratlösung
gegeben (pNPP Substrat Tabletten Set, Sigma, München) und
sechzig Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Farbentwicklung
wurde nach 30 und nach 60 Minuten bei 405 nm gemessen.
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Das
Ergebnis für jedes Serum wurde nach der folgenden Formel
berechnet:
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Der
Quotient wurde für alle getesteten Seren errechnet. Der
Grenzwert wurde mit den Seren der gesunden Probanden errechnet.
Es zeigte sich, daß 95% aller errechneten Quotienten der
gesunden Probanden unter 9 lagen, so daß Werte, die > 10 waren als positiv
gewertet wurden, d. h. sie enthielten Autoantikörper gegen
CD28.
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Zusätzlich
wurden Seren, die sicher keine Autoantikörper gegen CD28
enthielten und solche, die sicher CD28 Autoantikörper enthielten
in einer Verdünnungsreihe getestet. Es zeigte sich, dass
Seren, die CD28 Autoantikörper enthalten, auch noch bei
einer Verdünnung von 1:700 eine eindeutig höhere
OD zeigten als die negativen Seren.
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Kreuzreagierende
Antikörper in den Patientenseren gegen GST konnten ausgeschlossen
werden. Dazu wurden 32 Seren getestet und in keinem Serum fanden
sich Antikörper gegen das in diesem ELISA verwendete GST.
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Beispiel 4: Untersuchtes Patientenkollektiv
bestehend aus 116 Melanompatienten im klinischen Stadium IIIA–C.
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Seren
von 116 Patienten mit metastasierendem malignem Melanom im Stadium
III wurden untersucht. Die demographischen Daten des untersuchten
Kollektivs sind in 1 (= Tabelle 1) zusammengefasst.
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Das
Kollektiv war weitgehend homogen zusammengesetzt, d. h. jeweils
ca. ein Drittel der Patienten waren im Stadium IIIA, II-IB und IIIC,
so dass die Überlebenswahrscheinlichkeiten der Patienten
als normalverteilt angenommen werden konnten.
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Beispiel 5: Autoantikörper im
Serum von Patienten mit malignem Melanom im Stadium IIIIA–C.
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In 2 (=
Tabelle 2) ist die Zahl der Patienten mit und ohne Autoantikörper
gegen CD28, Anti-Nukleäre Antikörper (ANAs) und
anti-Thyreoglobuln-Antikörper vor Beginn einer IF-Na-Therapie
im Stadium III aufgeführt. In den fortgeschrittenen Stadien
IIIB und IIIC wurden mehr Patienten mit Autoantikörpern
gefunden.
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Beispiel 5: Vergleich des Progressionsfreies Überlebens
und des Gesamtüberlebens zwischen Patienten mit und ohne
Autoantikörper gegen CD28
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In 3 ist
das progressionsfreie Überleben (PFS) und das Gesamtüberleben
(OS) der Patienten ohne CD28-Autoantikörper (n = 82) und
mit CD28-Autoantikörpern (n = 34) dargestellt. Es sind
die Überlebenszeiten seit der Erstdiagnose des klinischen
Stadiums III, d. h. dem Auftreten von regionären Metastasen.
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Das
PFS betrug bei Patienten mit CD28 Autoantikörpern (CD28+)
im Median 39,7 Monate (95% Konfidenzintervall (CI): 21.91; 57.49
Monate) und bei den Patienten ohne Autoantikörper gegen
CD28 (CD28-) wurde das mediane Überleben nicht erreicht.
Das Signifikanzniveau zwischen den beiden Gruppen betrug p = 0.0657,
d. h. es war knapp signifikant.
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Das
OS betrug bei Patienten mit CD28 Autoantikörpern (CD28+)
im Median 51.3 Monate (95% CI: 0.00; 111.04 Monate). Bei Pati enten
ohne CD28 Autoantikörper im Serum (CD28-) wurde das mediane Überleben
nicht erreicht. Das Gesamtüberleben war für Patienten
mit Autoantikörpern gegen CD28 hochsignifikant schlechter
(p = 0.0074).
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Beispiel 6: Vergleich des progressionsfreien Überlebens
und des Gesamtüberlebens bei Patienten mit verschiedenen
Autoantikörpern.
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Im
Folgenden wurden Patienten verglichen, die entweder keine Autoantikörper
im Serum hatten oder nur Autoantikörper gegen CD28 oder
nur ANAs bzw. anti-Schilddrüsen Antikörper. Eine
weitere Gruppe bildeten die Patienten, die Autoantikörper
gegen alle getesteten Antigene hatten.
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In 4 sind
das progressionsfreie Überleben (PFS) und das Gesamtüberleben
(OS) der verschiedenen Patientengruppen mit Kaplan-Meier-Kurven
dargestellt. Die Grafiken zeigen, dass das Überleben dann schlechter
ist, wenn anti-CD28 Autoantikörper vorhanden sind (p < 0.05). Die Anwesenheit
der anderen Autoantikörper, die das Gesamtüberleben
positiv beeinflussen, kann diesen nachteiligen Effekt auf die Prognose der
Melanompatienten nicht ausgleichen.
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Das
Vorhandensein von Autoantikörpern gegen CD28 ist auch nach
Durchführung einer Varianzanalyse mit anderen relevanten
Parametern wie Alter, Geschlecht und Tumorstadium die einzig signifikante
Einflußgröße für das Gesamtüberleben
der untersuchten Patienten (5 = Tabelle
3).
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Beispiel 7: Vergleich des Auftretens von
Autoantikörpern vor und nach IFNα Therapie.
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In 6 (=
Tabelle 4) ist die Zahl der Patienten mit und ohne Autoantikörper
gegen CD28, ANAs und anti-Thyreoglobulin-Antikörper vor
und nach einer IFNα-Therapie im Stadium III aufgeführt. 7 zeigt
die Titer der Autoantikörper im Serum der Melanompatienten
vor und nach einer IFNα-Therapie.
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Die
beiden Abbildungen zeigen, dass sowohl die Zahl der Patienten mit
Autoantikörpern als auch die Serumtiter durch die IFNα-Therapie
deutlich gesteigert werden. Insbesondere die Titer der Autoantikörper
gegen CD28 und gegen Schilddrüsengewebe werden signifikant
durch die IFNα-Therapie gesteigert.
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Beispiel 8: Vergleich des progressionsfreien Überlebens
und des Gesamtüberlebens bei Patienten mit und ohne Autoantikörper
gegen CD28 nach Durchführung einer IFNα-Therapie.
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Sowohl
das progressionsfreie Überleben als auch das Gesamtüberleben
war bei Melanompatienten, die Autoantikörper gegen CD28
produzieren, nach Beginn einer IFNα-Therapie deutlich verschlechtert (8).
Bereits 18 Monate nach Beginn der Therapie mit IFNα verschlechterten
sich sowohl das progressionsfreie Überleben als auch das
Gesamtüberleben der Patienten, die Autoantikörper
gegen CD28 entwickelten.
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Abbildungen:
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1:
Demographie des untersuchten Patientenkollektivs, das aus Seren
von 116 Melanompatienten im Stadium III (AJCC 2002) bestand.
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2:
Autoantikörper bei Patienten im Stadium IIIA–C
vor Beginn einer IFNα Therapie.
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3:
Kaplan-Meier-Kurven für das progressionsfreie Überleben
(A) und das Gesamtüberleben (B) der Patienten mit und ohne
anti-CD28 Autoantikörper (n = 116).
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4:
Kaplan-Meier-Kurven für das Progressionsfreie-(A) und das
Gesamtüberleben (B) der Patienten mit malignem Melanom
im Stadium III (n = 116). Die verschiedene Patientengruppen sind:
CD28–/Auto-Ak-, CD28+/Auto-Ak-, CD28–/Auto-Ak+
und CD28+/Auto-Ak+.
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5:
Univariate Cox Regressions Analyse des progressionsfreien und des
Gesamtüberlebens. CI, Konfidenz Intervall, NE nicht evaluierbar,
and NR nicht erreicht. P-Werte wurden mit dem Wald-Test berechnet.
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6:
Autoantikörper im Serum von Patienten vor und nach IFNα Therapie
im Stadium III.
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7:
Die Produktion von anti-CD28 Autoantikörpern wird durch
eine Interferon-Therapie signifikant gesteigert, d. h. mehr Patienten
produzieren diese Autoantikörper. Das gilt auch für
ANAs und anti-Thyreoglobulin-Autoantikörper.
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8:
Progressionsfreies Überleben und Gesamtüberleben
der Patienten ohne CD28-Autoantikörper und mit CD28-Autoantikörpern
nach Behandlung mit Interferon-alpha. Zeit seit Beginn der IFNα-Therapie im
Stadium III. SEQUENZPROTOKOLL
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
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