DE102006048201A1

DE102006048201A1 - Autoantigene zur verbesserten Diagnose, Prognose und Therapie von entzündlichen neurologischen Erkrankungen

Info

Publication number: DE102006048201A1
Application number: DE102006048201A
Authority: DE
Inventors: Ugur Prof. Dr. Sahin; Özlem Prof. Dr. Dr. Türeci; Alexander Dr. Zaigler
Original assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz; Ganymed Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz; Ganymed Pharmaceuticals GmbH
Priority date: 2006-10-11
Filing date: 2006-10-11
Publication date: 2008-04-17
Also published as: US20090252714A1; WO2008043524A8; US8399210B2; WO2008043524A2; EP2076776A2; WO2008043524A3

Abstract

Erfindungsgemäß werden Autoantikörper, deren Auftreten für neurologische Autoimmunerkrankungen, insbesondere Multiple Sklerose, charakteristisch sind, nachgewiesen und die jeweiligen Autoantigene identifiziert. Erfindungsgemäß konnte ferner gezeigt werden, dass verschiedene dieser Autoantigene spezifisch im Gehirn exprimiert werden. Die Identifizierung der Autoantigene und Autoantikörper ist diagnostisch und therapeutisch nutzbar, wobei eine gehirnspezifische Expression der Autoantigene ferner eine wichtige Rolle der Antigene und Antikörper an der Entstehung und am Verlauf neurologischer Autoimmunerkrankungen unterstreicht.

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt Autoantigene, gegen die eine Immunantwort in Patienten mit Multipler Sklerose nachgewiesen werden konnten. Diese Antigene bilden die Grundlage für die Entwicklung von Verfahren zur Diagnose und Prognose entzündlicher neurologischer Autoimmunerkrankungen sowie für die Entwicklung therapeutischer Wirkstoffe gegen entzündliche neurologische Autoimmunerkrankungen.
Hintergrund der Erfindung
Zur Entwicklung von effizienten Serodiagnostika und Therapeutika von neurologischen Autoimmunerkrankungen ist eine möglichst umfassende Analyse der Autoimmunantwort des Immunsystems nötig. Die Serodiagnostik von Autoimmunerkrankungen basiert auf dem Nachweis von im Blut zirkulierenden Autoantikörpern, die spezifisch gegen immunogene Bestandteile (Antigene) eigener Proteine gerichtet sind. Diese Antigene sind auch Angriffspunkte für präventive und therapeutische Strategien von Autoimmunerkrankungen. Die Kenntnis dieser Antigene erlaubt daher die Entwicklung spezifischer diagnostischer und therapeutischer Verfahren von entzündlichen neurologischen Erkrankungen.
Entzündliche neurologische Erkrankungen und insbesondere Multiple Sklerose (MS) sind weit verbreitete Erkrankungen. Nach Angaben der WHO ist Multiple Sklerose mit einer Prävalenz von ca. 1:800 in Europa und Nordamerika weltweit die häufigste neurologische Erkrankung bei jungen Erwachsenen. Die chronisch-entzündliche Erkrankung des Nervensystems, die bei den Patienten in einem Alter zwischen dem 15. und 40. Lebensjahr erstmals auftritt, führt zu einer Demyelinierung von Dendriten des zentralen Nervensystems (ZNS). Dies resultiert in einer progressiven Lähmung der Muskulatur, Sensibilitätsausfällen und psychischen Störungen. Sowohl der klinische Verlauf als auch der Pathologie der Hirnerkrankung sind äußerst heterogen (Lucchinetti et al., 2000. Ann Neurol 47, 707). Die Erkrankung verläuft entweder chronisch-progressiv oder schubartig. Initial treten allgemeine neurologische Symptome auf, die sich nur schwer von anderen neurologischen Erkrankungen differenzieren lassen.
Die Etiologie von neurologischen Autoimmunerkrankungen und insbesondere von MS ist trotz intensiver Forschung bisher nicht vollständig aufgeklärt. Sowohl genetischen als auch immunologischen und viralen/bakteriellen Faktoren werden eine wichtige Rolle zugeordnet (Kalman et al. 1999. Biomed Pharmac 53, 358; Lucchinetti et al., 2001. Curr Opin Neurol 14, 259; Kurtzke 2001. J Clin Epidemiol 54, 1). Eine entscheidende Rolle spielen aber Autoimmunprozesse und unterschiedliche Hypothesen bezüglich der Immundysregulation werden diskutiert. So wird z.B. der Verlust regulatorischer Mechanismen von autoreaktiven T-Zellen beschrieben. Die Pathogenese von MS-Läsionen (Lucchinetti et al., 2000 Arm Neurol 47, 707) unterstützt zusätzlich die Bedeutung von Autoimmunprozessen im Verlauf der Erkrankung. Ursachen für die Autoimmunität könnten z.B. die Ähnlichkeit von Virusantigenen mit enzephalitogenen Antigenen („Molekulares Mimikry") oder traumatischer Gewebsuntergang (Levin et al., 2002. Nat Med 8, 509; Ludewig et al. 2004 J Exp Med 200, 637) als zugrunde liegender Mechanismus sein. Die Bedeutung der Immundysregulation bei entzündlichen neurologischen Erkrankungen wird außerdem durch zahlreiche Experimente in Modellorganismen unterstützt, in denen eine „experimentale Autoimmunenzephalitis" (EAE) durch autoimmunologische Prozesse induziert werden kann ('t Hart et al., 2003. Curr Opin Neurol 16, 375).
Die Diagnose von neurologischen Autoimmunerkrankungen und von MS im Speziellen ist derzeit ein großes Problem. Die erste Symptomatik wie zum Beispiel Seh- oder Koordinationsstörungen sowie Lähmungserscheinungen und Taubheit treffen auf zahlreiche neurologische Erkrankungen zu und eine Differentialdiagnose hinsichtlich Autoimmunerkrankungen ist kaum möglich (Schmitt, 2003. Biomed Pharmacother 57, 261). Erst die Kombination mit anderen Kriterien wie zum Beispiel die Anzahl an entzündlichen Hirnläsionen, die mit Hilfe der MRI-Spektroskopie (magnetic resonance imaging) gewonnen werden, oder die Analyse von oligoklonalen IgG-Banden in Liquor führen letztendlich zur zuverlässigen Diagnose von MS. Eine schnelle und zuverlässige Serum- oder Urindiagnostik ist derzeit nicht möglich, auch wenn verschiedene Marker bezüglich ihrer diagnostischen Aussagekraft analysiert wurden (Berger et al., 2003. New Engl J Med 349, 139; Chamczuk et al. 2002. J Imm Methods 262, 21; Vojdani et al. 2003. J Int Med 254, 363) und immunologische Nachweise in Form von ELISA und RIA kommerziell erhältlich sind (z.B. von Diagnostics Systems Laboratory, Dakocytomation). Weiterhin gibt es bisher keine Labordiagnostik, die den Verlauf von MS in Bezug auf bevorstehende Krankheitsschübe charakterisiert, den Verlauf von Krankheitsschüben charakterisiert und bestimmt, ob Patienten ein aktiverer bzw. aggressiverer Verlauf der Krankheit bevorsteht (z.B. schubartiger Verlauf der Krankheit zu chronisch-progressiv). Letztendlich gibt es auch noch keine Diagnostik, die prognostische Hinweise auf eine mögliche MS gibt und/oder eine Diagnostik, die den Verlauf der Behandlung von MS charakterisiert.
Eine krankheitsspezifische Behandlung von MS ist bisher nicht etabliert. Die Behandlung von MS erfolgt derzeit vor allem symptomatisch mittels entzündungshemmender Medikamente. Insbesondere Steroide und verschiedene Interferone werden eingesetzt (Jacobs et al, 2003. J Exp Med 343, 598; EP1289541 ). Grundsätzlich vermindern diese Medikamente die entzündliche Immunreaktion durch toxische Effekte gegen Lymphozyten, verhindern aber nicht den weiteren schubartigen oder chronisch-progressiven Verlauf der Krankheit. Andere Substanzen, die derzeit erprobt werden, sind Stative ( US2002159974 ) und Glatiramerazetat, das durch Kompetition die T-Zell-Proliferation inhibieren soll (Duda et al, 1999. J Clin Invest 105, 967; EP1467763 ; WO2004078145 ). Zusätzlich werden derzeit einige Antigen-spezifische Ansätze analysiert. Versuche, MS durch T-Zell Vakzinierungen zu behandeln, befinden sich noch in frühen Stadien ( WO9115225 ). Außerdem befinden sich therapeutische Ansätze mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern, die gegen die Antigene α₄-Integrin (Bielekova et al. 2000. Nat Med 6, 1145), CD40 (Patentveröffentlichung: WO03045978 ) und CD52 (Patentveröffentlichung: EP1455826 ) gerichtet sind, in unterschiedlichen klinischen Phasen. Außerdem konnte eine Antigen-spezifische Toleranztherapie in EAE-Modellen erfolgreich erprobt werden (Robinson et al, 2003. Nat Biotechn 21, 1033).
Die bisher gewonnen Erkenntnisse konnten nicht genutzt werden, um möglichst sensitive und spezifische Testverfahren bereitzustellen, die eine zuverlässige und allgemein akzeptierte Serumdiagnostik von neurologischen Autoimmunerkrankungen, insbesondere von Multipler Sklerose ermöglichen. Zudem konnte auf Basis der bis heute bekannten Antigene weder eine wirksame präventive noch eine therapeutische Impfung etabliert werden, auch wenn verschiedenste Verfahren publiziert sind und sich einige Substanzen noch in der Erprobung befinden.
Es besteht daher ein Bedarf für eine wirksame Diagnose, Prognose und Therapie von neurologischen Autoimmunerkrankungen, und insbesondere Multipler Sklerose.
Es war die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zielstrukturen für eine Diagnose, Prognose und Therapie von neurologischen Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose bereitzustellen. Insbesondere war die Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Identifizierung molekularer Marker, die eine Differentialdiagnose zwischen neurologischen Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose und anderen neurologischen Erkrankungen ermöglichen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst.
Erfindungsgemäß werden Autoantikörper, deren Auftreten für neurologische Autoimmunerkrankungen, insbesondere Multiple Sklerose, charakteristisch sind, nachgewiesen und die jeweiligen Autoantigene identifiziert. Erfindungsgemäß konnte ferner gezeigt werden, dass verschiedene dieser Autoantigene spezifisch im Gehirn exprimiert werden. Die Identifizierung der Autoantigene und Autoantikörper ist diagnostisch und therapeutisch nutzbar, wobei eine gehirnspezifische Expression der Autoantigene ferner eine wichtige Rolle der Antigene und Antikörper an der Entstehung und am Verlauf neurologischer Autoimmunerkrankungen unterstreicht.
Dementsprechend betrifft die Erfindung Verfahren, die eine Bewertung und/oder Prognose einer neurologischen Autoimmunerkrankung ermöglichen. Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen vorzugsweise eine Aussage darüber, ob eine Erkrankung an einer neurologischen Autoimmunerkrankung erfolgt ist oder erfolgen wird. Vorzugsweise erlauben die erfindungsgemäßen Verfahren eine Unterscheidung zwischen einer neurologischen Erkrankung, die keine Autoimmunerkrankung ist, und einer neurologischen Autoimmunerkrankung, insbesondere zwischen einer neurologischen Erkrankung, die nicht multiple Sklerose ist, und multipler Sklerose. Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch Aufschluss über den Erfolg einer Behandlung einer neurologischen Autoimmunerkrankung geben. In dieser Ausführungsform wird ein Erfolg einer Behandlung einer neurologischen Autoimmunerkrankung vorzugsweise durch eine Abnahme eines oder mehrerer der hier beschriebenen Autoantikörper oder T-Lymphocyten angezeigt. Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen auch die Überwachung des Krankheitsverlaufs, wobei bei einer Verschlimmerung der Erkrankung wie beispielsweise angezeigt durch eine Zunahme eines oder mehrerer der hier beschriebenen Autoantikörper oder T-Lymphocyten, die Planung einer aggressiveren Therapie wie einer Behandlung durch Immunsuppression ermöglicht wird.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose, Prognose und/oder Überwachung, d.h. Bestimmung der Regression, Progression und/oder des Verlaufs, einer neurologischen Autoimmunerkrankung bei einem Patienten, umfassend den Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge eines Antikörpers, der für ein Protein oder Peptid, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, einem Teil und einem Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist, und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist, oder für einen Teil oder ein Derivat des Proteins oder Peptids spezifisch ist, in einer aus einem Patienten isolierten biologischen Probe. Das Protein oder Peptid, für das der Antikörper spezifisch ist, umfasst vorzugsweise eine Sequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, einem Teil und Derivat davon ausgewählt ist.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner den Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge des Antikörpers in einer aus einem Patienten ohne die Autoimmunerkrankung und/oder ohne ein Risiko für die Autoimmunerkrankung isolierten biologischen Probe.
Ein Vorliegen des Antikörpers und/oder eine im Vergleich zu einem Patienten ohne die Autoimmunerkrankung und/oder ohne ein Risiko für die Autoimmunerkrankung erhöhte Menge des Antikörpers in der biologischen Probe weist vorzugsweise auf das Vorliegen der Autoimmunerkrankung oder ein Risiko für eine Entwicklung der Autoimmunerkrankung hin.
In einer bevorzugten Aushürungsform erfolgt der Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge des Antikörpers mit einem Immunoassay. Vorzugsweise umfasst der Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge des Antikörpers (i) die Kontaktierung der biologischen Probe mit einem Mittel, das spezifisch an den Antikörper bindet, und (ii) den Nachweis der Komplexbildung zwischen dem Mittel und dem Antikörper. Das Mittel, das spezifisch an den Antikörper bindet, ist vorzugsweise auf einem Trägermaterial immobilisiert und/oder ist vorzugsweise ein Protein oder Peptid oder Derivat davon, das spezifisch an den Antikörper bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Protein oder Peptid, das spezifisch an den Antikörper bindet, eine Sequenz, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, einem Teil und einem Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist, und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist. Vorzugsweise umfasst das Protein oder Peptid, das spezifisch an den Antikörper bindet, eine Sequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, und einem Teil davon ausgewählt ist. Ein Derivat des Proteins oder Peptids ist dementsprechend vorzugsweise von einem solchen Protein oder Peptid abgeleitet.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose, Prognose und/oder Überwachung einer neurologischen Autoimmunerkrankung bei einem Patienten, umfassend den Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge eines T-Lymphozyten, der für ein Protein oder Peptid, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, einem Teil und einem Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist, und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist, oder für einen Teil oder ein Derivat des Proteins oder Peptids spezifisch ist, in einer aus einem Patienten isolierten biologischen Probe. Das Protein oder Peptid, für das der T-Lymphocyt spezifisch ist, umfasst vorzugsweise eine Sequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, einem Teil und Derivat davon ausgewählt ist.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner den Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge des T-Lymphozyten in einer aus einem Patienten ohne die Autoimmunerkrankung und/oder ohne ein Risiko für die Autoimmunerkrankung isolierten biologischen Probe.
Ein Vorliegen des T-Lymphozyten und/oder eine im Vergleich zu einem Patienten ohne die Autoimmunerkrankung und/oder ohne ein Risiko für die Autoimmunerkrankung erhöhte Menge des T-Lymphozyten in der biologischen Probe weist vorzugsweise auf das Vorliegen der Autoimmunerkrankung oder ein Risiko für eine Entwicklung der Autoimmunerkrankung hin.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge des T-Lymphocyten mit einem Lymphocyten-Proliferationstest. Vorzugsweise umfasst der Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge des T-Lymphozyten (i) die Kontaktierung der biologischen Probe mit einem Mittel, das spezifisch an den T-Lymphozyten bindet, und (ii) den Nachweis der Komplexbildung zwischen dem Mittel und dem T-Lymphozyten. Das Mittel, das spezifisch an den T-Lymphozyten bindet, ist vorzugsweise auf einem Trägermaterial immobilisiert. In einer Ausführungsform ist das Mittel, das spezifisch an den T-Lymphocyten bindet, ein Protein oder Peptid oder Derivat davon, das spezifisch an den T-Lymphocyten bindet. In einer weiteren Ausführungsform ist das Mittel, das spezifisch an den T-Lymphozyten bindet, ein Komplex, der ein MHC-Molekül oder einen Teil davon und ein Protein oder Peptid oder Derivat davon umfasst, und der spezifisch an den T-Lymphocyten bindet. In einer Ausführungsform wird der Komplex von einer Zelle wie einer Antigen-präsentierenden Zelle präsentiert.
Das Protein oder Peptid, das spezifisch an den T-Lymphzyten bindet, oder das von dem Komplex umfasst ist, der spezifisch an den T-Lymphocyten bindet, umfasst vorzugsweise eine Sequenz, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, einem Teil und einem Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist, und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist. Vorzugsweise umfasst das Protein oder Peptid, das spezifisch an den T-Lymphcyten bindet, oder das von dem Komplex umfasst ist, der spezifisch an den T-Lymphozyten bindet, eine Sequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, und einem Teil davon ausgewählt ist. Ein Derivat des Proteins oder Peptids ist dementsprechend vorzugsweise von einem solchen Protein oder Peptid abgeleitet.
In einer Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren zur Überwachung einer neurologischen Autoimmunerkrankung eine Bestimmung der Regression, des Verlaufs oder des Ausbruchs der Erkrankung in einer Probe aus dem Patienten. In bestimmten Ausführungsformen dienen die erfindungsgemäßen Verfahren zur Überwachung einer neurologischen Autoimmunerkrankung einer Überwachung einer erfolgreichen Therapie der neurologischen Autoimmunerkrankung, wobei eine Abnahme des Spiegels an Antikörpern und/oder T-Lymphozyten, die erfindungsgemäß nachgewiesen und/oder bestimmt werden, auf eine erfolgreiche Therapie hinweist.
In bestimmten Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren zur Diagnose, Prognose und/oder Überwachung einer neurologischen Autoimmunerkrankung einen Nachweis oder eine Bestimmung der Menge zu einem ersten Zeitpunkt in einer ersten Probe und zu einem zweiten Zeitpunkt in einer weiteren Probe und einen Vergleich der beiden Proben.
Erfindungsgemäß umfasst eine biologische Probe vorzugsweise Körperflüssigkeit und/oder Körpergewebe, wobei die Körperflüssigkeit vorzugsweise ausgewählt ist aus Serum, Plasma, Urin und Cerebrospinalflüssigkeit.
Erfindungsgemäß ist die neurologische Autoimmunerkrankung vorzugsweise Multiple Sklerose.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung in den vorstehenden Aspekten ein Verfahren zur Diagnose einer neurologischen Autoimmunerkrankung, insbesondere Multiple Sklerose.
In bestimmten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren zur Diagnose, Prognose und/oder Überwachung einer neurologischen Autoimmunerkrankung ist der Patient an einer neurologischen Erkrankung, insbesondere an einer neurologischen Autoimmunerkrankung erkrankt, und weist insbesondere Symptome für eine solche Erkrankung auf, steht in Verdacht, an einer neurologischen Erkrankung, insbesondere an einer neurologischen Autoimmunerkrankung erkrankt zu sein oder daran zu erkranken, oder weist ein Risiko für eine neurologische Erkrankung, insbesondere eine neurologische Autoimmunerkrankung auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die aus einem Patienten isolierte biologische Probe mit einer vergleichbaren normalen biologischen Probe wie einer Probe aus einem gesunden Individuum verglichen.
Das für einen Nachweis oder für eine Bestimmung der Menge von Antikörpern oder T-Lymphocyten verwendete Mittel, insbesondere das Protein, Peptid oder Derivat davon, oder das Mittel, das an einen Komplex zwischen einem Antikörper oder T-Lymphocyten und einem daran bindenden Mittel bindet, insbesondere ein Anti-Immunglobulin-Antikörper oder ein gegen T-Lymphocyten gerichteter Antikörper, sind vorzugsweise nachweisbar markiert. In bestimmten Ausführungsformen ist der nachweisbare Marker ein radioaktiver Marker, Fluoreszenzmarker oder Enzymmarker.
In bestimmten Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren einen Nachweis mehrerer der hier beschriebenen Autoantikörper und/oder T-Lymphocyten.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit, der ein oder mehrere Mittel umfasst, die einen Nachweis und/oder eine Bestimmung der Menge der hier beschriebenen Antikörper oder T-Lymphocyten in einer aus einem Patienten isolierten biologischen Probe ermöglichen. Solche Mittel sind hier beschrieben und dem Fachmann bekannt.
Insbesondere betrifft die Erfindung in diesem Aspekt einen Kit zur Diagnose, Prognose und/oder Überwachung einer neurologischen Autoimmunerkrankung bei einem Patienten, umfassend ein Protein oder Peptid, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, und einem Teil davon ausgewählt ist, oder ein Derivat des Proteins oder Peptids. Vorzugsweise ist das Protein oder Peptid oder das Derivat davon auf einem Träger immobilisiert.
Vorzugsweise umfasst der erfindungsgemäße Kit ferner Anweisungen für eine Verwendung des Kits in einem Verfahren zur Diagnose, Prognose und/oder Überwachung einer neurologischen Autoimmunerkrankung bei einem Patienten, wobei das Verfahren vorzugsweise ein erfindungsgemäßes Verfahren ist.
In einer Ausführungsform umfasst der Kit ferner ein Reagenz für einen Nachweis einer Bindung eines Antikörpers an das darin enthaltene Protein oder Peptid oder das Derivat davon, wobei das Reagenz vorzugsweise einen nachweisbar markierter Bindepartner für den Antikörper umfasst. Der Bindepartner für den Antikörper ist vorzugsweise ein anti-Immunglobulin-Antikörper, insbesondere ein mit einem nachweisbaren Marker wie einem Enzym gekoppelter anti-humanes Immunglobulin-Antikörper. Des weiteren kann der erfindungsgemäße Kit auch ein Enzymsubstrat, und Positiv- und Negativkontrollen enthalten.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen oder mehrere Bestandteile, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus: (i) einem Protein oder Peptid, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, und einem Teil davon ausgewählt ist, oder einem Derivat des Proteins oder Peptids, (ii) einer Nukleinsäure, die das Protein oder Peptid oder das Derivat davon unter (i) exprimiert, und (iii) einer Wirtszelle, die die Nukleinsäure unter (ii) umfasst. Die Nukleinsäure kann in einem Expressionsvektor vorliegen. Die Wirtszelle wird das Peptid oder Protein oder das Derivat davon vorzugsweise exprimieren.
Eine in einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Wirtszelle kann das Protein oder Peptid oder das Derivat davon sekretieren, auf der Oberfläche exprimieren oder kann zusätzlich ein MHC-Molekül exprimieren, das an das Protein oder Peptid oder das Derivat davon bzw. an eine prozessierte Form davon bindet. In einer Ausführungsform exprimiert die Wirtszelle das MHC-Molekül endogen. In einer weiteren Ausführungsform exprimiert die Wirtszelle das MHC-Molekül und/oder das Protein oder Peptid oder das Derivat davon rekombinant. Vorzugsweise ist die Wirtszelle nicht-proliferativ. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein Adjuvans umfassen und ist vorzugsweise zur Behandlung einer neurologischen Autoimmunerkrankung, insbesondere zur Behandlung von Multipler Sklerose geeignet.
Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer neurologischen Autoimmunerkrankung, insbesondere Multiple Sklerose, umfassend die Verabreichung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß betrifft der Begriff „Autoantigen" eine Substanz, die eine Immunantwort wie die Produktion von Antikörpern in dem Lebewesen erzeugt, von dem sie abgeleitet ist. Insbesondere betrifft der Begriff „Autoantigen" erfindungsgemäß ein Protein oder Peptid, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, einem Teil und einem Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist, und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist, oder einen Teil oder ein Derivat des Proteins oder Peptids. Insbesondere betrifft der Begriff „Autoantigen" erfindungsgemäß ein Protein oder Peptid, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, einem Teil und Derivat davon ausgewählt ist.
Der Begriff „Autoantikörper" betrifft erfindungsgemäß Antikörper, die gegen ein Autoantigen gerichtet sind. Autoantikörper erkennen ein körpereigenes Antigen und treten unter anderem bei Autoimmunerkrankungen auf. Insbesondere betrifft der Begriff „Autoantikörper" erfindungsgemäß einen Antikörper, der gegen ein vorstehend beschriebenes Autoantigen gerichtet ist und insbesondere spezifisch daran bindet.
Der Begriff „Nachweis und/oder Bestimmung der Menge" in Bezug auf einen Stoff betrifft erfindungsgemäß die Bestimmung des Auftretens oder Fehlens und/oder der absoluten und/oder relativen Menge des Stoffs. Der Begriff umfasst auch Situationen, bei denen kein Stoff nachgewiesen wird, entweder weil er nicht vorhanden ist oder seine Menge unter der Detektionsgrenze des Nachweissystems liegt.
Im Allgemeinen können erfindungsgemäß alle Verfahren, die für einen Nachweis und eine Analyse von Antikörpern oder T-Lymphocyten geeignet sind, für einen Nachweis und/oder eine Bestimmung der Menge derselben eingesetzt werden. Möglichkeiten zur Durchführung eines Nachweises und/oder einer Bestimmung der Menge von Antikörpern und T-Lymphocyten in den erfindungsgemäßen Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Insbesondere kann zur Detektion von Antikörpern erfindungsgemäß jedes beliebige direkte oder indirekte Verfahren zur Anwendung kommen.
Bei den direkten Verfahren wird die Bindung der nachzuweisenden Antikörper an das Antigen über eine Änderung der chemischen oder physikalischen Eigenschaften bestimmt, so dass nachfolgende Detektionsschritte mit markierten Bindungspartnern nicht notwendig sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt der Nachweis von Antikörpern in einem Immunoassay, bevorzugt in einem Festphasenimmunoassay, und unter direkter oder indirekter Kopplung eines Bindungspartners.
Besonders bevorzugt kann der Nachweis in einem ELISA-, einem RIA- oder einem Fluoreszenzimmunoassay erfolgen. Die Durchführung dieser Nachweisverfahren ist dem Fachmann bekannt.
Als feste Phase kann beispielsweise jeder Träger verwendet werden, der fähig ist, an Antigen oder Antikörper zu binden. Solche Träger umfassen Materialien wie Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, natürliche oder modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Der Träger kann eine jegliche mögliche strukturelle Konfiguration aufweisen, sofern das daran gebundene Molekül wie Antigen oder Antikörper fähig ist, an seinen Bindungspartner zu binden. Geeignete Konfigurationen umfassen eine kugelförmige Konfiguration, eine zylindrische Konfiguration wie die Innenseite eines Testgefäßes oder eine flache Konfiguration wie Teststreifen usw.
In einem ELISA wird beispielsweise Antigen direkt oder indirekt an eine Trägersubstanz wie Polystyrol gebunden. Nach Inkubation mit den nachzuweisenden Antikörpern werden Antigen-gebundene Antikörper direkt oder indirekt mittels Enzym-gekoppelter Substanzen nachgewiesen. Diese Substanzen können Antikörper, Fragmente von Antikörpern oder hochaffine Liganden sein. Als Enzyme kommen beispielsweise Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Uresse oder Glucoseoxidase in Betracht. Durch Zugabe eines chromogenen Substrats können die gebundenen Enzyme und damit beispielsweise die gebundenen Antikörper quantifiziert werden.
In einem Radioimmunoassay ist das Antigen direkt oder indirekt an eine Trägersubstanz wie Polystyrol gebunden. Nach Inkubation mit den nachzuweisenden Antikörpern werden Antigen-gebundene Antikörper mittels Substanzen nachgewiesen, die eine radioaktive Markierung wie ¹²⁵I tragen. Diese Substanzen können Antikörper, Fragmente von Antikörpern oder hochaffine Liganden sein. Die gebundene Radioaktivität kann mittels eines geeigneten Messgeräts quantifiziert werden.
Nach dem gleichen Prinzip werden in einem Fluoreszenzimmunoassay die Antigen-gebundenen Antikörper mittels Substanzen nachgewiesen, die eine Fluoreszenzmarkierung wie Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) tragen. Diese Substanzen können Antikörper, Fragmente von Antikörpern oder hochaffine Liganden sein. Die gebundene Menge an Fluoreszenzfarbstoff wird sodann mittels eines geeigneten Messgeräts quantifiziert.
Erfindungsgemäß kann ein Nachweis von Antikörpern auch in einem Agglutinationstest oder Geldiffusionstest erfolgen. Auch diese Nachweisverfahren sind dem Fachmann bekannt.
Beim Geldiffusionstest werden in benachbarte, nahe liegende Vertiefungen von Agar- oder Agaroseplatten vorzugsweise die Antigen- bzw. die Antikörperlösungen gefüllt. Diffundieren die Substanzen aus ihren Vertiefungen, bilden sich ausgehend von den Vertiefungen Konzentrationsgradienten. Wenn die überlappenden Antigen- und Antikörper-Konzentrationen im Gel innerhalb bestimmter Verhältnisse liegen und die Antikörperlösung Antikörper gegen das Antigen enthält, bilden sich im Gel sichtbare Präzipitate.
Beim Agglutinationstest werden Antigen-tragende Partikel wie Partikel aus Latex oder Polystyrol durch Antikörper quervernetzt. Die gebildeten Aggregate lassen sich beispielsweise turbodimetrisch nachweisen.
Ein Nachweis oder eine Bestimmung der Menge eines T-Lymphocyten kann erfindungsgemäß mit einer Zelle erfolgen, die einen Komplex zwischen einem Protein, Peptid oder Derivat davon und einem MHC-Molekül präsentiert, für den der T-Lymphocyt spezifisch ist, wobei die Zelle vorzugsweise eine Antigen-präsentierende Zelle ist. Gegebenenfalls erfolgt der Nachweis oder die Bestimmung der Menge eines T-Lymphocyten durch Nachweis seiner Proliferation, Zytokinproduktion und/oder cytotoxischen Aktivität, die durch die spezifische Stimulation mit dem Komplex zwischen dem Protein, Peptid oder Derivat davon und einem MHC-Molekül ausgelöst wird. Ein Nachweis oder eine Bestimmung der Menge eines T-Lymphocyten kann ferner durch ein rekombinantes MHC-Molekül oder einen Komplex aus zwei oder mehreren MHC- Molekülen, die mit einem oder mehreren Proteinen, Peptiden oder Derivaten davon beladen sind, erfolgen.
In einer Ausführungsform exprimiert die Zelle das MHC-Molekül endogen. In einer weiteren Ausführungsform exprimiert die Zelle das MHC-Molekül und/oder das Protein, Peptid oder das Derivat davon rekombinant. Vorzugsweise ist die Wirtszelle nicht-proliferativ. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle.
Ein Bindemittel wie ein Antikörper ist für sein Ziel wie ein Antigen spezifisch, wenn es daran bindet. Erfindungsgemäß betrifft der Begriff „binden" vorzugsweise eine spezifische Bindung. „Spezifische Bindung" bedeutet, dass eine Bindung an ein Ziel wie ein Epitop, für das ein Bindemittel wie ein Antikörper spezifisch ist, stärker ist im Vergleich zu der Bindung an ein anderes Ziel. Eine „stärker Bindung" kann beispielsweise durch eine niedrigere Dissoziationskonstante charakterisiert werden.
Erfindungsgemäß kann eine „Referenz" wie eine Referenzprobe oder ein Referenzorganismus verwendet werden, um die Ergebnisse, die in den erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, zu korrelieren oder zu vergleichen. Typischerweise ist ein Referenzorganismus eine gesunder Organismus, insbesondere ein Organismus, der nicht an einer neurologischen Autoimmunerkrankung, insbesondere an Multipler Sklerose leidet.
Ein „Referenzwert" kann aufgrund einer Referenz empirisch durch Messung einer ausreichenden Anzahl an Referenzen bestimmt werden.
Eine Nukleinsäure ist erfindungsgemäß vorzugsweise Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA). Nukleinsäuren umfassen erfindungsgemäß genomische DNA, cDNA, mRNA, rekombinant hergestellte und chemisch synthetisierte Moleküle. Eine Nukleinsäure kann erfindungsgemäß als einzelsträngiges oder doppelsträngiges und lineares oder kovalent kreisförmig geschlossenes Molekül vorliegen.
Der Begriff „Nukleinsäure" umfasst erfindungsgemäß auch Derivate von Nukleinsäuren. Mit "Derivat" einer Nukleinsäure ist erfindungsgemäß gemeint, dass einzelne oder multiple, vorzugsweise mindestens 2, mindestens 4, mindestens 6, und vorzugsweise bis 3, bis 4, bis 5, bis 6, bis 10, bis 15 oder bis 20, Substitutionen, -deletionen und/oder -additionen von Nukleotiden in der Nukleinsäure vorliegen.
Weiterhin umfasst der Begriff „Derivat" einer Nukleinsäure auch eine chemische Derivatisierung einer Nukleinsäure an einer Nukleotidbase, am Zucker oder am Phosphat und Nukleinsäuren, die nicht in der Natur vorkommende Nukleotide und Nukleotidanaloga enthalten.
Die erfindungsgemäß bescbriebenen Nukleinsäuren sind vorzugsweise isoliert. Der Begriff "isolierte Nukleinsäure" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Nukleinsäure (i) in vitro amplifiziert wurde, zum Beispiel durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), (ii) rekombinant durch Klonierung produziert wurde, (iii) gereinigt wurde, zum Beispiel durch Spaltung und gelelektrophoretische Auftrennung, oder (iv) synthetisiert wurde, zum Beispiel durch chemische Synthese. Eine isolierte Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die für eine Manipulierung durch rekombinante DNA-Techniken zur Verfügung steht.
Eine Nukleinsäure ist dann zu einer anderen Nukleinsäure „komplementär", wenn die beiden Sequenzen miteinander hybridisieren und ein stabiles Duplex eingehen können, wobei die Hybridisierung vorzugsweise unter Bedingungen erfolgt, die eine spezifische Hybridisierung zwischen Polynukleotiden erlauben (stringente Bedingungen). Stringente Bedingungen sind beispielsweise in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Hrsg., 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 oder Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., New York beschrieben und betreffen beispielsweise die Hybridisierung bei 65°C in Hybridisierungspuffer (3,5 × SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin, 2,5mM NaH₂PO₄ (pH7), 0,5% SDS, 2mM EDTA). SSC ist 0,15 M Natriumchlorid/0,15 M Natriumcitrat, pH 7. Nach der Hybridisierung wird die Membran, auf die die DNA übertragen wurde, beispielsweise in 2 × SSC bei Raumtemperatur und sodann in 0,1–0,5 × SSC/0,1 × SDS bei Temperaturen bis 68°C gewaschen.
Komplementäre Nukleinsäuren weisen erfindungsgemäß mindestens 40%, insbesondere mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% und vorzugsweise mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Identität der Nukleotide auf.
Der Begriff "% Identität" soll einen Prozentwert an Nukleotiden bezeichnen, die zwischen zwei zu vergleichenden Sequenzen bei einem optimalen Alignment identisch sind, wobei dieser Prozentwert rein statistisch ist, die Unterschiede zwischen den zwei Sequenzen zufällig und über die gesamte Sequenzlänge verteilt sein können und die zu vergleichende Sequenz Additionen oder Deletionen im Vergleich zu der Referenzsequenz umfassen kann, um ein optimales Alignment zwischen zwei Sequenzen zu erreichen. Sequenzvergleiche zwischen zwei Sequenzen werden im Allgemeinen durch Vergleich dieser Sequenzen nach einem optimalen Alignment in Bezug auf ein Segment oder "Vergleichsfenster" durchgeführt, um lokale Bereiche einer Sequenzübereinstimmung zu identifizieren. Das optimale Alignment für einen Vergleich kann manuell oder mit Hilfe des lokalen Homologiealgorithmus von Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, mit Hilfe des lokalen Homologiealgorithmus von Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, und mit Hilfe des Ähnlichkeitssuchalgorithmus von Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444, oder mit Hilfe von Computerprogrammen, die diese Algorithmen verwenden, (GAP, BESTFIT, FASIA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.) durchgeführt werden.
Die prozentuale Identität wird durch Bestimmung der Anzahl an identischen Positionen, in denen die zu vergleichenden Sequenzen übereinstimmen, Teilung dieser Anzahl durch die verglichenen Positionen und Multiplikation dieses Ergebnisses mit 100 erhalten.
Beispielsweise kann das Programm BLAST "BLAST 2 sequences", das von der Website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi erhältlich ist, verwendet werden.
Derivate einer bestimmten Nukleinsäure betreffen insbesondere Varianten der Nukleinsäure, insbesondere Splicevarianten, Isoformen und Species-Homologe der Nukleinsäure, insbesondere solche, die natürlicherweise exprimiert werden.
Nukleinsäuren können bezüglich Varianten wie Splicevarianten erfindungsgemäß in an sich bekannter Weise analysiert werden. Techniken zur Analyse von Splicevarianten umfassen Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), Northern Blotting und in situ-Hybridisierung.
Eine „RNAse-Protektion" genannte Technik kann auch verwendet werden, um alternativ gesplicte mRNAs zu identifizieren. RNAse-Protektion umfasst die Transkription einer Gensequenz in synthetische RNA, die an RNA, die beispielsweise von anderen Zellen abgeleitet ist, hybridisiert wird. Die hybridisierte RNA wird sodann mit Enzymen inkubiert, die RNA:RNA-Hybrid-Fehlpaarungen erkennen. Fragmente, die kleiner als erwartet sind, zeigen das Vorliegen alternativ gesplicter mRNAs an. Die putativen alternativ gesplicten mRNAs können in an sich bekannter Weise kloniert und sequenziert werden.
RT-PCR kann auch verwendet werden, um alternativ gesplicte mRNAs zu identifizieren. Bei der RT-PCR wird mRNA in cDNA durch das Enzym reverse Transkriptase in an sich bekannter Weise konvertiert. Die gesamte kodierende Sequenz der cDNA wird sodann mittels PCR unter Verwendung eines Vorwärts-Primers, der in der 3'-nicht-translatierten Region liegt, und eines reversen Primers, der in der 5'-nicht-translatierten Region liegt, amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte können bezüglich alternativer Spliceformen beispielsweise durch Vergleich der Größe der amplifizierten Produkte mit der Größe des erwarteten Produkts aus normal gespliceter mRNA beispielsweise mittels Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert werden. Jegliche Veränderungen hinsichtlich der Größe der Amplifikationsprodukte können ein alternatives Splicen anzeigen.
Von mutierten Genen abgeleitete mRNA aus kann auch einfach mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Techniken zur Identifizierung alternativer Spliceformen identifiziert werden. So können beispielsweise allelische Formen von Genen und die dadurch produzierte mRNA, die erfindungsgemäß als „Mutanten" betrachtet werden, identifiziert werden.
Nukleinsäuren können erfindungsgemäß alleine oder in Kombination mit anderen Nukleinsäuren, die homo- oder heterolog sein können, vorliegen. In bestimmten Ausführungsformen liegt eine Nukleinsäure erfindungsgemäß funktionell in Verbindung mit Expressionskontrollsequenzen vor, die in Bezug zu der Nukleinsäure homolog oder heterolog sein können, wobei hier der Begriff „homolog" bezeichnet, dass eine Nukleinsäure auch natürlicherweise mit der Expressionskontrollsequenz funktionell verbunden ist und der Begriff „heterolog" bezeichnet, dass eine Nukleinsäure nicht natürlicherweise mit der Expressionskontrollsequenz funktionell verbunden ist.
Eine Nukleinsäure, vorzugsweise eine transkribierbare und insbesondere eine für ein Peptid oder Protein kodierende Nukleinsäure, und eine Expressionskontrollsequenz sind dann "funktionell" miteinander verbunden, falls sie derart kovalent miteinander verknüpft sind, dass die Transkription oder Expression der Nukleinsäure unter der Kontrolle oder unter dem Einfluss der Expressionskontrollsequenz steht. Falls die Nukleinsäure in ein funktionelles Peptid oder Protein translatiert werden soll, führt bei einer funktionellen Verbindung einer Expressionskontrollsequenz mit der kodierenden Sequenz eine Induktion der Expressionskontrollsequenz zu einer Transkription der kodierenden Sequenz, ohne dass es zu einer Leserasterverschiebung in der kodierenden Sequenz oder zu einem Unvermögen der kodierenden Sequenz kommt, in das gewünschte Peptid oder Protein translatiert zu werden.
Der Begriff „Expressionskontrollsequenz" umfasst erfindungsgemäß Promotoren, ribosombindende Sequenzen, Enhancer und andere Kontrollelemente, welche die Transkription eines Gens oder die Translation von mRNA steuern. In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind die Expressionskontrollsequenzen regulierbar. Die genaue Struktur von Expressionskontrollsequenzen kann speziesabhängig oder zelltypusabhängig variieren, umfasst jedoch im allgemeinen 5'-nicht-transkribierte und 5'- und 3'-nicht-translatierte Sequenzen, die an der Initiation der Transkription bzw. Translation beteiligt sind wie TATA-Box, Capping-Sequenz, CAAT-Sequenz und ähnliches. Insbesondere umfassen 5'-nicht-transkribierte-Expressionskontrollsequenzen eine Promotorregion, die eine Promotorsequenz für eine transkriptionelle Kontrolle der funktionell verbundenen Nukleinsäure einschließt. Expressionskontrollsequenzen können auch Enhancer-Sequenzen oder stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenzen umfassen.
Der Begriff "Promotor" oder "Promotorregion" betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die stromaufwärts (5') zu der zu exprimierenden Sequenz liegt und die Expression der Sequenz durch Bereitstellen einer Erkennungs- und Bindungsstelle für RNA-Polymerase steuert. Die Promotorregion kann weitere Erkennungs- oder Bindungsstellen für weitere Faktoren beinhalten, die an der Regulation der Transkription eines Gens beteiligt sind. Ein Promotor kann die Transkription eines prokaryontischen oder eukaryontischen Gens steuern. Ein Promotor kann "induzierbar" sein und die Transkription in Reaktion auf ein Induktionsmittel initiieren oder er kann "konstitutiv" sein, falls die Transkription nicht durch ein Induktionsmittel gesteuert wird. Ein induzierbarer Promotor wird nicht exprimiert oder nur in einem sehr geringen Maß exprimiert, wenn ein Induktionsmittel fehlt. In Gegenwart des Induktionsmittels wird das Gen "angeschalten" oder das Transkriptionsniveau erhöht. Dies wird herkömmlicherweise durch die Bindung eines spezifischen Transkriptionsfaktors vermittelt.
Erfindungsgemäß bevorzugte Promotoren sind beispielsweise Promotoren für SP6-, T3- oder T7-Polymerase, humaner U6 RNA Promotor und CMV Promotor.
Der Begriff "Expression" wird erfindungsgemäß in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst die Produktion von RNA oder von RNA und Protein/Peptid. Er umfasst auch eine teilweise Expression von Nukleinsäuren. Des weiteren kann die Expression transient oder stabil erfolgen.
Des weiteren kann eine Nukleinsäure, die für ein Protein oder Peptid kodiert, erfindungsgemäß in Verbindung mit einer anderen Nukleinsäure vorliegen, die für eine Peptidsequenz kodiert, die eine Sekretion des durch die Nukleinsäure kodierten Proteins oder Peptids aus einer Wirtszelle steuert. Auch kann eine Nukleinsäure erfindungsgemäß in Verbindung mit einer anderen Nukleinsäure vorliegen, die für eine Peptidsequenz kodiert, die eine Verankerung des kodierten Proteins oder Peptids auf der Zellmembran einer Wirtszelle oder seine Kompartimentalisierung in bestimmte Organellen dieser Zelle herbeiführt. Gleichermaßen kann eine Verbindung mit einer Nukleinsäure erfolgen, die ein Reportergen oder einen beliebigen „Tag" darstellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Nukleinsäure erfindungsgemäß in einem Vektor, gegebenenfalls mit einem Promotor, der die Expression der Nukleinsäure steuert, vorhanden. Der Begriff "Vektor" wird dabei in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst jegliche intermediären Vehikel für eine Nukleinsäure, die es z.B. ermöglichen, die Nukleinsäure in prokaryotische und/oder in eukaryotische Zellen einzubringen und gegebenenfalls in ein Genom zu integrieren. Solche Vektoren werden vorzugsweise in der Zelle repliziert und/oder exprimiert. Vektoren umfassen Plasmide, Phagemide, Bakteriophagen oder Virusgenome. Der Begriff "Plasmid", wie hierin verwendet, betrifft allgemein ein Konstrukt von extrachromosomalem genetischem Material, gewöhnlich ein zirkuläres DNA-Duplex, das unabhängig von chromosomaler DNA replizieren kann.
Der Begriff „Wirtszelle" betrifft erfindungsgemäß jede Zelle, die mit einer exogenen Nukleinsäure, vorzugsweise DNA oder RNA, transformierbar oder transfizierbar ist. Der Begriff „Wirtszelle" umfasst erfindungsgemäß prokaryontische (z.B. E. coli) oder eukaryontische Zellen (z.B. Säugerzellen, insbesondere Zellen aus Mensch, Hefezellen und Insektenzellen). Besonders bevorzugt sind Säugerzellen wie Zellen aus Mensch, Maus, Hamster, Schwein, Ziege und Primaten. Die Zellen können aus einer Vielzahl von Gewebetypen abgeleitet sein und umfassen primäre Zellen und Zelllinien. Spezifische Beispiele umfassen Keratinocyten, periphere Blutleukocyten, Stammzellen des Knochenmarks und embryonale Stammzellen. In weiteren Ausführungsformen ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, wobei der Begriff „Antigen-präsentierende Zelle" erfindungsgemäß dendritische Zellen, Monocyten und Makrophagen umfasst. Eine Nukleinsäure kann in der Wirtszelle in einer einzigen oder in mehreren Kopien vorliegen und wird in einer Ausführungsform in der Wirtszelle exprimiert.
In den Fällen der Erfindung, in denen ein MHC-Molekül ein Protein oder Peptid präsentiert, kann ein Expressionsvektor auch eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die für das MHC-Molekül kodiert. Die Nukleinsäuresequenz, die für das MHC-Molekül kodiert, kann auf demselben Expressionsvektor wie die Nukleinsäure, die für das Protein oder Peptid kodiert, vorliegen oder beide Nukleinsäuren können auf verschiedenen Expressionsvektoren vorliegen. Im letzteren Fall können die beiden Expressionsvektoren in eine Zelle cotransfiziert werden. Falls eine Wirtszelle weder das Protein oder Peptid noch das MHC-Molekül exprimiert, können beide dafür kodierenden Nukleinsäuren entweder auf demselben Expressionsvektor oder auf verschiedenen Expressionsvektoren in die Zelle transfiziert werden. Falls die Zelle bereits das MHC-Molekül exprimiert, kann nur die Nukleinsäuresequenz, die für das Protein oder Peptid kodiert, in die Zelle transfiziert werden.
Der Begriff "Peptid" betrifft erfindungsgemäß Substanzen, die mindestens zwei, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 6, mindestens 8, mindestens 10, mindestens 13, mindestens 16, mindestens 20 und vorzugsweise bis 8, 10, 20, 30, 50, oder 100 aufeinander folgende Aminosäuren umfassen, die durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind. Der Begriff "Protein" betrifft große Peptide, vorzugsweise Peptide mit mehr als 100 Aminosäuren, jedoch werden die Begriffe „Peptid" und „Protein" hierin im Allgemeinen austauschbar verwendet. Der Begriff „Protein oder Peptid" soll auch, wenn nicht anderes angegeben, Derivate davon umfassen.
Die erfindungsgemäß beschriebenen Proteine und Peptide sind vorzugsweise isoliert. Die Begriffe "isoliertes Protein" oder "isoliertes Peptid" bedeuten, dass das Protein oder Peptid von seiner natürlichen Umgebung getrennt ist. Ein isoliertes Protein oder Peptid kann in einem im Wesentlichen aufgereinigten Zustand vorliegen. Der Begriff "im Wesentlichen aufgereinigt" bedeutet, dass das Protein oder Peptid im Wesentlichen frei von anderen Substanzen vorliegt, mit denen es in der Natur oder in vivo vorliegt.
Proteine und Peptide dienen erfindungsgemäß beispielsweise der Herstellung von Antikörpern und sind in immunologischen oder diagnostischen Assays oder als Therapeutika einsetzbar. Erfindungsgemäß beschriebene Proteine und Peptide können aus biologischen Proben wie Gewebe- oder Zellhomogenaten isoliert werden und können auch rekombinant in einer Vielzahl pro- oder eukaryontischer Expressionssysteme exprimiert werden. Ferner kann erfindungsgemäß eine Synthese von Proteinen und Peptiden an fester oder flüssiger Phase in an sich bekannter Weise erfolgen.
Die hierin beschriebenen Proteine, Peptide oder Derivate davon können in ihrer freien oder gebundenen Form für die Diagnose oder Behandlung von Patienten mit einer neurologischen Autoimmunerkrankung verwendet werden, wobei die Proteine, Peptide oder Derivate davon insbesondere die Fähigkeit aufweisen, Autoantikörper zu binden, neutralisieren und/oder selektiv zu entfernen.
„Derivate" eines Proteins oder Peptids oder einer Aminosäuresequenz im Sinne dieser Erfindung umfassen Aminosäure-Insertionsvarianten, Aminosäure-Deletionsvarianten und/oder Aminosäure-Substitutionsvarianten.
Aminosäure-Insertionsvarianten umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen, sowie Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren in einer bestimmten Aminosäuresequenz. Bei Aminosäure-Sequenzvarianten mit einer Insertion werden ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle in einer Aminosäuresequenz eingebracht, obwohl eine zufällige Insertion mit geeignetem Screening des resultierenden Produkts auch möglich ist. Aminosäure-Deletionsvarianten sind durch das Entfernen von einer oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz charakterisiert. Aminosäure-Substitutionsvarianten zeichnen sich dadurch aus, dass wenigstens ein Rest in der Sequenz entfernt und ein anderer Rest an dessen Stelle eingefügt wird. Vorzugsweise befinden sich die Modifikationen an Positionen in der Aminosäuresequenz, die zwischen homologen Proteinen oder Peptiden nicht konserviert sind und/oder werden Aminosäuren durch andere mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt, wie Hydrophobizität, Hydrophilizität, Elektronegativität, Volumen der Seitenkette und ähnliches (konservative Substitution). Konservative Substitutionen betreffen beispielsweise den Austausch einer Aminosäure durch eine andere, nachstehend in derselben Gruppe wie die substituierte Aminosäure aufgeführte Aminosäure:

1. kleine aliphatische, nicht-polare oder leicht-polare Reste: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2. negativ geladene Reste und ihre Amide: Asn, Asp, Glu, Gln
3. positiv geladene Reste: His, Arg, Lys
4. große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val (Cys)
5. große aromatische Reste: Phe, Tyr, Trp.

Drei Reste sind aufgrund ihrer besonderen Rolle für die Proteinarchitektur in Klammern gesetzt. Gly ist der einzige Rest ohne eine Seitenkette und verleiht der Kette somit Flexibilität. Pro besitzt eine ungewöhnliche Geometrie, die die Kette stark einschränkt. Cys kann eine Disulfidbrücke bilden.
Die oben beschriebenen Aminosäure-Varianten können leicht mit Hilfe von bekannten Peptidsynthesetechniken wie z.B. durch „Festphasensynthese" (Merrifield, 1964) und ähnliche Verfahren oder durch rekombinante DNA-Manipulation hergestellt werden. Die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Proteinen und Peptiden mit Substitutionen, Insertionen oder Deletionen ist z.B. in Sambrook et. al. (1989) ausführlich beschrieben.
„Derivate" von Proteinen oder Peptiden umfassen erfindungsgemäß auch einzelne oder multiple Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen jeglicher Moleküle, die mit dem Protein oder Peptid assoziiert sind, wie Kohlenhydrate, Lipide und/oder Proteine oder Peptide. Ferner erstreckt sich der Begriff "Derivat" auch auf alle funktionellen chemischen Aquivalente der Proteine und Peptide und Substanzen, die nicht nur Aminosäure-Bestandteile, sondern auch nicht-Aminosäure-Bestandteile wie Zucker und Phosphatstrukturen enthalten und umfassen auch Substanzen die Bindungen wie Ester-, Thioether- oder Disulfidbindungen enthalten. Vorzugsweise weist ein Derivat eines Proteins oder Peptids eine bessere Stabilität, vorzugsweise eine höhere in vivo-Halbwertszeit, als das Protein oder Peptid, von dem es abgeleitet ist, auf.
Derivate eines bestimmten Proteins oder Peptids betreffen auch posttranslationell modifizierte Varianten, Isoformen und Species-Homologe des Proteins oder Peptids, insbesondere solche, die natürlicherweise exprimiert werden.
Ein Teil, d.h. Fragment, oder Derivat eines Proteins oder Peptids weist erfindungsgemäß vorzugsweise eine funktionelle Eigenschaft des Proteins oder Peptids auf, aus dem er/es abgeleitet ist. Solche funktionellen Eigenschaften umfassen beispielsweise Immunreaktivität, insbesondere die Interaktion mit Antikörpern oder die Interaktion mit anderen Peptiden oder Proteinen. Eine bedeutende Eigenschaft ist die Fähigkeit, einen Komplex mit MHC-Molekülen einzugehen und gegebenenfalls eine Immunreaktion beispielsweise durch Stimulation oder Hemmung von cytotoxischen oder Helfer T-Zellen zu erzeugen oder zu verhindern. Ein Teil eines Proteins oder Peptids umfasst vorzugsweise eine Sequenz von mindestens 6, mindestens 8, mindestens 10, mindestens 12, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 30 und vorzugsweise bis zu 8, bis zu 10, bis zu 12, bis zu 15, bis zu 20, bis zu 30 oder bis zu 50 aufeinander folgenden Aminosäuren aus dem Protein oder Peptid. In einer Ausführungsform betrifft ein Teil eines Proteins oder Peptids erfindungsgemäß ein oder mehrere Epitope aus dem vollständigen Peptid oder Protein, wobei die mehreren Epitope in ihrer natürlichen Verbindung vorliegen können oder eine künstliche, d.h. nicht natürlich vorkommende Verbindung aufweisen können, d.h. die Epitope können beispielsweise durch einen künstlichen Linker voneinander getrennt sein. Vorzugsweise betrifft ein Teil eines Proteins oder Peptids erfindungsgemäß eine solche Sequenz, die ein Ziel, insbesondere ein Epitop, für eine Immunreaktion in einem Patienten, insbesondere in einem Patienten mit einer neurologischen Autoimmunerkrankung ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Sequenz Ziel für eine Antikörper- und/oder T-Zell-vermittelte Immunreaktion. Ein erfindungsgemäß verwendetes Peptid, Protein oder Derivat kann auch mehrere solcher Sequenzen umfassen, die Epitope für Antikörper oder T-Zellen darstellen.
Ein Teil, d.h. Fragment, einer Nukleinsäure, die für ein Protein oder Peptid kodiert, betrifft erfindungsgemäß vorzugsweise den Teil der Nukleinsäure, der zumindest für das Protein oder Peptid und/oder für einen Teil des Proteins oder Peptids wie vorstehend definiert kodiert. Ein Teil einer Nukleinsäure, die für ein Protein oder Peptid kodiert, betrifft vorzugsweise den Teil der Nukleinsäure, der dem offenen Leserahmen entspricht. In einer weiteren Ausführungsform ist ein Teil einer Nukleinsäure der Teil einer Nukleinsäure, der nur für ein oder mehrere Epitope des Proteins oder Peptids kodiert, das durch die vollständige Nukleinsäure, insbesondere durch den vollständigen offenen Leserahmen kodiert wird.
Die für eine therapeutische Verwendung eingesetzten Proteine, Peptide oder Derivate davon sind vorzugsweise solche, die eine Bindung der hier beschriebenen Autoantikörper an die hier beschriebenen Autoantigene hemmen bzw. darum kompetitieren und/oder die Stimulation von T-Lymphozyten, die hier beschriebene Autoantigene oder Teile davon erkennen, hemmen, und dadurch einen Patienten vor einer Autoimmunerkrankung des Nervensystems wie Multipler Sklerose schützen. Insbesondere sind solche Proteine, Peptide oder Derivate therapeutisch einsetzbar, die mit der Bindung von T-Zellen über ihren T-Zell-Rezeptor an den MHC/Antigen-Komplex, der für eine Initiierung oder Propagation einer Immunerkennung oder eines entzündlichen Verlaufs notwendig ist, Wechselwirken.
Ein Protein oder Peptid, das ein Antikörper- und/oder ein T-Zell-Epitop umfasst, und erfindungsgemäß an einen Patienten verabreicht wird, kann fähig sein, die Reaktion des Patienten auf ein Autoantigen zu modifizieren, was zur Hemmung einer Autoimmunreaktion führt. Erfindungsgemäß werden daher insbesondere Proteine, Peptide oder Derivate davon verwendet, die mit den Autoantigenen oder Fragmenten davon um eine Erkennung durch T-Lymphozyten oder Autoantikörper kompetitieren können. Erfindungsgemäß sind insbesondere Peptide bevorzugt, die eine modifizierte Version des T-Zell-Epitops aus dem natürlich auftreten Autoantigen umfassen oder darstellen, das an MHC-Moleküle binden kann, jedoch im Gegensatz zu dem natürlich auftretenden Epitop spezifische T-Zellen nicht aktiviert. Die für eine therapeutische Verwendung eingesetzten Proteine, Peptide oder Derivate kompetitieren vorzugsweise um die Bindung von Autoantigenen an Antikörper und/oder MHC-Moleküle und lösen keine Proliferation und/oder Induktion einer T-Zelle, die mit dem Autoantigen oder Teilen davon reaktiv ist, aus.
Kandidaten-Proteine, Peptide, oder Derivate können in einem Test, der eine Bindung, insbesondere eine kompetitive Bindung an Antikörper und/oder MHC-Moleküle misst und/oder einem Test, der eine T-Zell-Proliferation misst, gescreent werden.
„MHC-Bindepeptide" oder „MHC bindende Peptide" betrifft erfindungsgemäß Peptide, die an ein MHC-Klasse I- und/oder ein MHC-Klasse II-Molekül binden. Im Fall von Klasse I-MHC/Peptid-Komplexen sind die Bindepeptide typischerweise 8-10 Aminosäuren lang, obwohl längere oder kürzere Peptide wirksam sein können. Im Fall von Klasse II-MHC/Peptid-Komplexen sind die Bindepeptide typischerweise 10-25 Aminosäuren lang und insbesondere 13-18 Aminosäuren lang, obwohl längere und kürzere Peptide wirksam sein können. Erfindungsgemäß kann ein MHC-Bindepeptid für eine direkte Bindung an MHC-Moleküle verabreicht werden oder ein MHC-Bindepeptid kann nach geeigneter Prozessierung, insbesondere in vivo nach Verabreichung, aus einem verabreichten Protein, Peptid oder Derivat davon entstehen. Auch kann ein MHC-Bindepeptid durch Prozessierung aus einem Autoantigen entstehen. In bestimmten Ausführungsformen ist somit ein MHC-Bindepeptid ein Teil eines verabreichten Proteins, Peptids oder Derivats davon oder eines Autoantigens. Solche Fälle sind umfasst, wenn erfindungsgemäß auf für eine therapeutische Verwendung eingesetzte Proteine, Peptide oder Derivate oder auf mit einem Autoantigen reaktive T-Zellen Bezug genommen wird.
Die Fähigkeit eines Peptids, an einen Antikörper zu binden, kann beispielsweise mit einem der hier beschriebenen Immunoassays bestimmt werden.
Die Fähigkeit, kompetitiv an MHC-Moleküle zu binden, kann erfindungsgemäß beispielsweise mit bekannten Bindungstest, die die Verdrängung eines markierten Bindemoleküls erfassen, bestimmt werden.
Erfindungsgemäß beschriebene Autoantigene können in Peptid-Bibliotheken, einschließlich Phagen-Display-Bibliotheken, eingesetzt werden, um beispielsweise Peptid- Bindepartner von Antikörpern oder MHC-Molekülen zu identifizieren und selektieren. Solche Moleküle können beispielsweise für Screening-Assays, Aufreinigungsprotokolle, für eine Interferenz mit der Funktion der Antikörper oder MHC-Moleküle und für andere Zwecke, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden.
Phagen-Display kann besonders wirksam bei der Identifizierung von bindenden Peptiden sein. Dabei wird beispielsweise eine Phagen-Bibliothek (durch Verwendung beispielsweise des m13-, fd- oder lambda-Phagen) hergestellt, die Inserts einer Länge von 4 bis etwa 80 Aminosäureresten präsentiert. Es werden sodann Phagen ausgewählt, die Inserts tragen, die an das Ziel binden. Dieser Prozess kann über mehrere Zyklen einer Rückselektion von Phagen wiederholt werden, die an das Ziel binden. Wiederholte Runden führen zu einer Anreicherung von Phagen, die bestimmte Sequenzen tragen. Es kann eine Analyse von DNA-Sequenzen erfolgen, um die Sequenzen der exprimierten Peptide zu identifizieren. Der kleinste lineare Anteil der Sequenz, der an das Ziel bindet, kann bestimmt werden.
Das "two-hybrid-System" aus Hefe kann auch für die Identifizierung von Peptiden eingesetzt werden, die an ein Ziel binden.
Die Fähigkeit, eine Proliferation und/oder Induktion von T-Zellen auszulösen, kann einfach durch einen in vitro-Test bestimmt werden. Typischerweise werden T-Zellen für die Tests durch transformierte T-Zelllinien bereitgestellt, wie T-Zell-Hybridome oder T-Zellen, die aus einem Säuger wie einem Menschen oder einem Nagetier wie einer Maus isoliert werden. Geeignete T-Zell-Hybridome sind frei verfügbar oder können in an sich bekannter Weise hergestellt werden. T-Zellen können in an sich bekannter Weise aus einem Säuger isoliert werden; vgl. z.B. Shimonkevitz, R. et al., 1983, J. Exp. Med. 158:303.
Ein geeigneter Test zur Bestimmung, ob ein Peptid zur Modulation der Aktivität von T-Zellen fähig ist, erfolgt wie folgt durch die nachstehenden Schritte 1-4. T-Zellen exprimieren in geeigneter Weise einen Marker, der getestet werden kann und der T-Zell-Aktivierung oder Modulation der T-Zell-Aktivität nach Aktivierung anzeigt. So kann das Maus-T-Zell-Hybridom DO11.10, das Interleukin-2 (IL-2) bei einer Aktivierung exprimiert, verwendet werden. IL-2-Konzentrationen können gemessen werden, um zu bestimmen, ob ein spezifisches präsentiertes Peptid zur Modulation der Aktivität dieses T- Zell-Hybridoms fähig ist. Ein derartiger geeigneter Test erfolgt durch die nachstehenden Schritte:

1. T-Zellen werden z.B. aus einem interessierenden T-Zell-Hybridom oder durch Isolierung aus einem Säuger erhalten.
2. Die T-Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, die eine Vermehrung erlauben.
3. Die wachsenden T-Zellen werden mit Antigen-präsentierenden Zellen in Kontakt gebracht, die ihrerseits mit einem zu präsentierenden Peptid oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure in Kontakt gebracht wurden.
4. Die T-Zellen werden auf einen Marker getestet, z.B. wird die IL-2-Produktion gemessen.

Die in den Tests verwendeten T-Zellen werden unter für eine Vermehrung geeigneten Bedingungen inkubiert. Zum Beispiel wird ein DO11.10-T-Zell-Hybridom geeigneterweise bei etwa 37°C und 5% CO₂ im Vollmedium (RPMI 1640, supplementiert mit 10% FBS, Penicillin/Streptomycin, L-Glutamin und 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol) inkubiert. Serielle Verdünnungen des untersuchten Peptids können getestet werden. T-Zell-Aktivierungssignale werden durch Antigen-präsentierende Zellen bereitgestellt, die mit dem Peptid beladen worden waren.
Alternativ zu der Messung eines exprimierten Proteins wie IL-2 kann die Modulation der T-Zell-Aktivierung in geeigneter Weise durch Veränderungen der Vermehrung von T-Zellen, wie gemessen durch bekannte Radiomarkierungsverfahren, bestimmt werden. Zum Beispiel kann ein markiertes (wie tritiert) Nukleotid in ein Testkulturmedium eingebracht werden. Das Einbringen eines derartigen markierten Nukleotids in die DNA dient als Messgröße für die T-Zell-Vermehrung.
Eine Identifizierung modifizierter und substituierter Proteine oder Peptide, die in den erfindungsgemäßen diagnostischen und therapeutischen Verfahren geeignet sind, kann auch leicht durch ihre Fähigkeit getestet werden, proliferative Reaktionen in vitro von T-Zellen des Patienten oder von T-Zelllinien oder -Klonen, die für ein Autoantigen spezifisch sind, oder eine Bindung des Autoantigens an dafür spezifische Autoantikörper zu hemmen. Epitope in Autoantigenen, gegen die Antikörper und T-Zellen in Patienten mit Multipler Sklerose gerichtet sind, werden durch eine Verwendung verkürzter und/oder mutagenisierter rekombinanter Proteine und Peptide identifiziert. Diese Peptidepitope werden auf ihre Antigenizität bei einer Erzeugung einer T-Zell-Reaktion oder bei einer Bindung an Antikörper getestet.
Das vorstehend für therapeutisch eingesetzten Proteine, Peptide oder Derivate Gesagte gilt sinngemäß für therapeutisch eingesetzte Nukleinsäuren, die solche Proteine, Peptide oder Derivate kodieren.
Hier beschriebene Proteine, Peptide oder Derivate davon, gegebenenfalls in Kopplung an ein Polymer wie PEG, das das Protein, Peptid oder Derivat tolerogen macht, und/oder in Verbindung mit einem Adjuvans, können auch therapeutisch eingesetzt werden, um Toleranz zu erzeugen. Vorzugsweise werden in dieser Ausführungsform die Proteine, Peptide oder Derivate in hohen Dosen eingesetzt. Das Verfahren einer Tolerisierung ist beispielsweise in der WO 94/06828 beschrieben. Somit dient in einer Ausführungsform eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung dazu, einen Patienten gegenüber einem oder mehreren hier beschriebenen Autoantigenen zu tolerisieren. Vorzugsweise umfasst in dieser Ausführungsform die pharmazeutische Zusammensetzung ein Peptid oder Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die einem Sequenzmotif eines hier beschriebene Autoantigens entspricht oder davon abgeleitet ist, das mit einer hier beschriebenen neurologischen Autoimmunerkrankung assoziiert ist. Vorzugsweise binden solche Peptide oder Proteine an MHC-Moleküle, um einen Komplex auszubilden, der autoreaktive T-Zellen in Patienten mit der Autoimmunerkrankung aktiviert. Der Einsatz einer solchen Tolerisierung gegenüber Autoimmunerkrankungen ist bekannt und braucht daher nicht näher erläutert zu werden.
Antikörper, die gegen die hier beschriebenen Autoantigene gerichtet sind, können verwendet werden, um antigene Epitope auf den Autoantigenen zu identifizieren. Sobald solche Epitope identifiziert wurden, können synthetische Peptide hergestellt und beispeilsweise als Antigene in diagnostischen Tests oder Kits oder für die Entwicklung von Therapeutika eingesetzt werden.
Antiseren, die Antikörper enthalten, die an ein Ziel spezifisch binden, können über verschiedene Standardverfahren hergestellt werden;, vgl. beispielsweise „Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" von Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9, „Antibodies: A Laboratory Manual" von Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142 und „Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" von Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447. Dabei ist auch möglich, affine und spezifische Antikörper zu generieren, die komplexe Membranproteine in ihrer nativen Form erkennen (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods. 234: 107-116, 2000). Dies ist vor allem für die Herstellung von Antikörpern von Bedeutung, die therapeutisch eingesetzt werden sollen, aber auch für viele diagnostische Anwendungen. Dazu kann sowohl mit dem gesamten Protein, mit extrazellulären Teilsequenzen, wie auch mit Zellen, die das Zielmolekül in physiologisch gefalteter Form exprimieren, immunisiert werden.
Monoklonale Antikörper werden traditionell mit Hilfe der Hybridoma-Technologie hergestellt (Technische Details: siehe „Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" von Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; „Antibodies: A Laboratory Manual" von Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142, „Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" von Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).
Es ist bekannt, dass nur ein kleiner Teil eines Antikörpermoleküls, das Paratop, an der Bindung des Antikörpers an sein Epitop beteiligt ist (vgl. Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7. Auflage, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Die pFc'- und Fc-Regionen sind z.B. Effektoren der Komplementkaskade, sind jedoch nicht an der Antigenbindung beteiligt. Ein Antikörper, von dem die pFc'-Region enzymatisch abgespalten wurde oder der ohne die pFc'-Region hergestellt wurde, bezeichnet als F(ab')₂-Fragment, trägt beide Antigenbindestellen eines vollständigen Antikörpers. In ähnlicher Weise trägt ein Antikörper, von dem die Fc-Region enzymatisch abgespalten wurde oder der ohne die Fc-Region hergestellt wurde, bezeichnet als Fab-Fragment, eine Antigenbindestelle eines intakten Antikörpermoleküls. Des weiteren bestehen Fab-Fragmente aus einer kovalent gebundenen leichten Kette eines Antikörpers und einem Teil der schweren Kette des Antikörpers, bezeichnet als Fd. Die Fd-Fragmente sind die Haupt-Determinanten der Antikörper-Spezifität (ein einzelnes Fd-Fragment kann mit bis zu zehn verschiedenen leichten Ketten assoziiert werden, ohne die Spezifität des Antikörpers zu verändern) und Fd-Fragmente behalten bei einer Isolierung die Fähigkeit, an ein Epitop zu binden.
Innerhalb des Antigen-bindenden Teils eines Antikörpers befinden sich komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs), die direkt mit dem Epitop des Antigens Wechselwirken, und Gerüstregionen (FRs), die die Tertiärstruktur des Paratops aufrechterhalten. Sowohl in dem Fd-Fragment der schweren Kette als auch in der leichten Kette von IgG-Immunglobulinen befinden sich vier Gerüstregionen (FR1 bis FR4), die jeweils durch drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR1 bis CDR3) getrennt sind. Die CDRs und insbesondere die CDR3-Regionen und noch mehr die CDR3-Region der schweren Kette sind größtenteils für die Antikörper-Spezifität verantwortlich.
Man weiß, dass die Nicht-CDR-Regionen eines Säuger-Antikörpers durch ähnliche Regionen von Antikörpern mit der gleichen oder einer anderen Spezifität ersetzt werden können, wobei die Spezifität für das Epitop des ursprünglichen Antikörpers erhalten bleibt. Dies ermöglichte die Entwicklung sogenannter "humanisierter" Antikörper, bei denen nicht-menschliche CDRs kovalent mit menschlichen FR- und/oder Fc/pFc'-Regionen für die Herstellung eines funktionellen Antikörpers verbunden sind.
Als anderes Beispiel beschreibt die WO 92/04381 die Herstellung und Verwendung von humanisierten RSV-Antikörpern aus Maus, bei denen mindestens ein Teil der FR-Regionen aus Maus durch FR-Regionen eines menschlichen Ursprungs ersetzt wurden. Solche Antikörper, einschließlich Fragmente intakter Antikörper mit einer Antigen-Bindefähigkeit werden oft als "chimäre" Antikörper bezeichnet.
Erfindungsgemäß umfasst der Begriff „Antikörper" auch F(ab')₂-, Fab-, Fv- und Fd-Fragmente von Antikörpern, chimäre Antikörper, bei denen die Fc- und/oder FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder leichte Kette-CDR3-Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt wurden, chimäre F(ab)₂-Fragment-Antikörper, bei denen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder leichte Kette-CDR3-Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt wurden, chimäre Fab-Fragment-Antikörper, bei denen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder leichte Kette-CDR3-Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt wurden, und chimäre Fd-Fragment-Antikörper, bei denen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2-Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt wurden. Erfindungsgemäß umfasst der Begriff „Antikörper" auch einzelkettige Antikörper.
Antikörper können auch an spezifische diagnostische Mittel gekoppelt werden, um beispielsweise Zellen und Gewebe darzustellen, die bestimmte Proteine oder Peptide wie die hier beschriebenen Autoantigene exprimieren. Sie können ferner an therapeutische Mittel gekoppelt werden.
Diagnostische Mittel umfassen eine jegliche Markierung, die geeignet ist: (i) ein nachweisbares Signal bereitzustellen, (ii) mit einer zweiten Markierung wechselzuwirken, um das nachweisbare Signal, das durch die erste oder zweite Markierung bereitgestellt wird, zu modifizieren, z.B. FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer), (iii) die Mobilität wie elektrophoretische Mobilität durch Ladung, Hydrophobizität, Form oder andere physikalische Parameter zu beeinflussen oder (iv) eine Abfanggruppe bereitzustellen, z.B. Affinitäts-, Antikörper/Antigen- oder ionische Komplexierung. Geeignet als Markierungen sind Strukturen wie Fluoreszenzmarkierungen, Lumineszenzmarkierungen, Chromophormarkierungen, Radio isotopenmarkierungen, Isotopenmarkierungen, vorzugsweise stabile Isotopenmarkierungen, Enzymmarkierungen, Partikelmarkierungen, insbesondere Metallpartikelmarkierungen, Magnetpartikelmarkierungen, Polymerpartikelmarkierungen, kleine organische Moleküle wie Biotin, Liganden von Rezeptoren oder Bindemolekülen wie Zelladhäsionsproteine oder Lektine, und Markierungssequenzen, die Nukleinsäure- und/oder Aminosäuresequenzen umfassen. Diagnostische Mittel umfassen in nicht begrenzender Weise Bariumsulfat, Iocetaminsäure, Iopansäure, Calcium-Ipodat, Natrium-Diatrizoat, Meglumin-Diatrizoat, Metrizamid, Natrium-Tyropanoat und Radiodiagnostika, einschließlich Positronen-Emitter wie Fluor-18 und Kohlenstoff-11, gamma-Emitter wie Iod-123, Technetium-99m, Iod-131 und Indium-111, und Nuklide für magnetische Kernresonanz wie Fluorin und Gadolinium.
Der Begriff "therapeutisches Mittel" betrifft erfindungsgemäß jede Substanz, die eine therapeutische Wirkung ausüben kann.
Der Begriff „Haupthistokompatibilitätskomplex" oder „MHC" betrifft einen Komplex von Genen, der in allen Vertebraten vorhanden ist. MHC-Proteine oder Moleküle sind bei der Signalgebung zwischen Lymphocyten und Antigen-präsentierenden Zellen in normalen Immunreaktionen beteiligt, wobei sie Peptide binden und diese für eine Erkennung durch T-Zell-Rezeptoren präsentieren. MHC-Moleküle binden Peptide innerhalb eines intrazellulären Prozessierungskompartiments und präsentieren diese Peptide auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen für eine Erkennung durch T-Zellen. Die menschliche MHC-Region, auch HLA genannt, liegt auf Chromosom 6 und umfasst die Klasse I- und Klasse II-Region. In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß aller erfindungsgemäßer Aspekte ist ein MHC-Molekül ein HLA-Molekül.
Der Begriff "Patient", „Lebewesen" oder „Organismus" umfasst erfindungsgemäß Mensch, nicht menschliche Primaten oder ein anderes Tier, insbesondere Säugetier wie Kuh, Pferd, Schwein, Schaf, Ziege, Hund, Katze oder Nagetier wie Maus und Ratte. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Patient ein Mensch.
Der Begriff „Erkrankung" betrifft erfindungsgemäß einen pathologischen Zustand. Der Begriff „Autoimmunerkrankung" betrifft erfindungsgemäß eine Erkrankung, deren Ursache eine überschießende Reaktion des Immunsystems gegen körpereigenes Gewebe ist. Irrtümlicherweise erkennt das Immunsystem körpereigenes Gewebe als zu bekämpfenden Fremdkörper. Dadurch kommt es zu schweren Entzündungsreaktionen, die zu Schäden an den betroffenen Organen führen. Der Begriff „neurologische Autoimmunerkrankung" betrifft erfindungsgemäß eine Autoimmunerkrankung des Nervensystems. Gerät das Immunsystem im ZNS bei einer neurologischen Autoimmunerkrankung außer Kontrolle, können entzündliche Schadenskaskaden einen Nervenzelluntergang und ein damit verbundenes neurologisches Krankheitsbild auslösen. Entzündliche Prozesse und Netzwerke sind an der Entstehung und am Voranschreiten vieler neurodegenerativer Erkrankungen wie Multipler Sklerose, Schlaganfall, Parkinson Krankheit und Alzheimer Krankheit beteiligt.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „neurologische Autoimmunerkrankung" erfindungsgemäß Multiple Sklerose. Multiple Sklerose ist eine inflammatorische, demyelinisierende Erkrankung des zentralen Nervensystems, die motorische, sensorische und kognitive Defizite verursacht. Multiple Sklerose entsteht, wenn T-Lymphozyten und andere Zellen des Immunsystems die weiße Substanz des ZNS unterwandern. Inflammatorische Botenstoffe blockieren die Leitung an den Ranvierschen Schnürringen und lösliche sowie zelluläre Effektoren bewirken den Abbau der Myelinschicht. Es kommt dabei zur so genannten Demyelinisierung bzw. Entmarkung. Dies bewirkt eine fortschreitende Paralyse und andere neurologische Symptome wie zum Beispiel Muskelzittern, Taubheit, Juckreiz, Farbenblindheit, Doppelt-Sehen, Blindheit, Verlust der Koordination und des Gleichgewichts, akute Lähmung sowie eine Verschlechterung der kognitiven Fähigkeiten.
Der Begriff „erhöhte Menge" betrifft vorzugsweise eine Erhöhung um mindestens 10%, insbesondere mindestens 20%, mindestens 50% oder mindestens 100%. Die Menge einer Substanz ist auch dann in einem Testobjekt wie einer biologischen Probe in Bezug auf eine Referenz erhöht, wenn sie in dem Testobjekt nachweisbar ist, jedoch in der Referenz nicht vorhanden und/oder nicht nachweisbar ist.
„Verringern" oder „hemmen" betrifft hier die Fähigkeit, eine Abnahme zu bewirken, wie ein Abnahme um 20% oder mehr, mehr bevorzugt von 50% oder mehr, und am meisten bevorzugt von 75% oder mehr.
Eine biologische Probe kann erfindungsgemäß eine Gewebeprobe, einschließlich Körperflüssigkeiten, und/oder eine zelluläre Probe sein und kann in herkömmlicher Weise gewonnen werden, wie durch Gewebebiopsie, einschließlich Stanzbiopsie, und Entnahme von Blut, Bronchialaspirat, Sputum, Urin, Fäces oder anderen Körperflüssigkeiten. Erfindungsgemäß umfasst der Begriff „biologische Probe" auch Fraktionen von biologischen Proben.
Die Begriffe „T-Zelle" und „T-Lymphocyt" werden hier austauschbar verwendet und umfassen T-Helferzellen und cytolytische T-Zellen wie cytotoxische T-Zellen.
Die erfindungsgemäß bescbriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch präventiv, d.h. als Vakzinen, eingesetzt werden, um die hier beschriebenen Erkrankungen zu verhindern.
Eine Verabreichung von Proteinen und Peptiden kann erfindungsgemäß in an sich bekannter Weise erfolgen.
Erfindungsgemäß kann eine Verabreichung von Nukleinsäuren entweder als nackte Nukleinsäure oder in Verbindung mit einem Verabreichungsreagens erfolgen. Beispielsweise ist erfindungsgemäß auch eine Verabreichung von Nukleinsäuren in vivo mittels Ziel-gesteuerter Liposomen vorgesehen.
Für eine Verabreichung von Nukleinsäuren können Vektoren, die von Adenovirus (AV), Adeno-assoziiertem Virus (AAV), Retroviren (wie Lentiviren (LV), Rhabdoviren, murinem Leukämievirus), oder Herpesvirus abgeleitet sind, und dergleichen eingesetzt werden. Der Tropismus der viralen Vektoren kann durch Pseudotypisierung der Vektoren mit Hüllproteinen oder anderen Oberflächen-Antigenen von anderen Viren oder durch Substitution verschiedenen viraler Kapsidproteine wie geeignet modifiziert werden.
Liposomen können die Zufuhr der Nukleinsäure an ein bestimmtes Gewebe unterstützen und können auch die Halbwertszeit der Nukleinsäure erhöhen. Liposomen, die erfindungsgemäß geeignet sind, werden aus Standard-Vesikel-bildenden Lipiden, die im Allgemeinen neutrale oder negativ geladene Phospholipide einschließen, und einem Sterin wie Cholesterin gebildet. Die Auswahl von Lipiden wird im Allgemeinen durch Faktoren wie die gewünschte Liposomengröße und die Halbwertszeit der Liposomen bestimmt. Eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von Liposomen ist bekannt; vgl. z.B. Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467; and US-PSen 4,235,871 , 4,501,728 , 4,837,028 and 5,019,369 .
In bestimmten Ausführungsformen ist eine Steuerung der Nukleinsäure an bestimmte Zellen bevorzugt. In solchen Ausführungsformen kann ein Träger, der für die Verabreichung einer Nukleinsäure an eine Zelle (z.B. ein Retrovirus oder ein Liposom) eingesetzt wird, ein gebundenes Zielsteuerungsmolekül aufweisen. Zum Beispiel kann ein Molekül wie ein Antikörper, der für ein Oberflächenmembran-Protein auf der Zielzelle spezifisch ist, oder ein Ligand für einen Rezeptor auf der Zielzelle in den Nukleinsäureträger eingebaut oder daran gebunden werden. Falls eine Verabreichung einer Nukleinsäure durch Liposomen erwünscht ist, können Proteine, die an ein Oberflächenmembran-Protein binden, das mit der Endocytose assoziiert ist, in die Liposomenformulierung eingebaut werden, um eine Zielsteuerung und/oder Aufnahme zu ermöglichen. Solche Proteine umfassen Kapsid-Proteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sind, Antikörper gegen Proteine, die internalisiert werden, Proteine, die eine intrazelluläre Stelle ansteuern, und ähnliches.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in pharmazeutisch verträglichen Zubereitungen verabreicht werden. Solche Zubereitungen können gewöhnlich pharmazeutisch verträgliche Konzentrationen von Salzen, Pufferstoffen, Konservierungsstoffen, Trägern, ergänzenden immunitätssteigernden Stoffen wie Adjuvanzien, CpG-Oligonukleotide, Cytokine, Chemokine, Saponin, GM-CSF und/oder RNA und gegebenenfalls andere therapeutische Wirkstoffe enthalten.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Wirkstoffe können auf jedem herkömmlichen Weg verabreicht werden, einschließlich durch Injektion oder durch Infusion. Die Verabreichung kann beispielsweise oral, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan oder transdermal erfolgen.
Geeignete Verfahren für eine Verabreichung von Nukleinsäuren an Zellen umfassen eine Verabreichung der Nukleinsäure an ein Lebewesen mittels einer Genkanone, Elektroporation, Nanopartikel, Mikro-Einkapselung und dergleichen, oder durch parenterale und enterale Zufuhr.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden in wirksamen Mengen verabreicht. Eine "wirksame Menge" betrifft die Menge, die alleine oder zusammen mit weiteren Dosen eine gewünschte Reaktion oder eine gewünschte Wirkung erzielt. Im Fall einer Behandlung einer bestimmten Erkrankung oder eines bestimmten Zustands betrifft die gewünschte Reaktion vorzugsweise die Hemmung des Krankheitsverlaufs. Dies umfasst die Verlangsamung des Fortschreitens der Erkrankung und insbesondere eine Unterbrechung oder Umkehr des Fortschreitens der Erkrankung. Die gewünschte Reaktion bei einer Behandlung einer Krankheit oder eines Zustands kann auch die Verzögerung des Ausbruchs oder eine Verhinderung des Ausbruchs der Krankheit oder des Zustands sein.
Eine wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird von dem zu behandelnden Zustand, der Schwere der Krankheit, den individuellen Parametern des Patienten, einschließlich Alter, physiologischer Zustand, Größe und Gewicht, der Dauer der Behandlung, der Art einer begleitenden Therapie (falls vorhanden), dem spezifischen Verabreichungsweg und ähnlichen Faktoren abhängen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind vorzugsweise steril und enthalten eine wirksame Menge der therapeutisch wirksamen Substanz für die Erzeugung der gewünschten Reaktion oder der gewünschten Wirkung.
Die Dosen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die verabreicht werden, können von verschiedenen Parametern wie der Verabreichungsart, dem Zustand des Patienten, dem gewünschten Verabreichungszeitraum, usw. abhängen. Für den Fall, dass eine Reaktion bei einem Patienten bei einer anfänglichen Dosis unzureichend ist, können höhere Dosen (oder effektiv höhere Dosen, die durch einen anderen, stärker lokalisierten Verabreichungsweg erzielt werden) eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in pharmazeutisch verträglichen Mengen und in pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzungen verabreicht. Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" betrifft ein nicht-toxisches Material, das nicht mit der Wirkung des aktiven Bestandteils der pharmazeutischen Zusammensetzung wechselwirkt. Solche Zubereitungen können gewöhnlich Salze, Pufferstoffe, Konservierungsstoffe, Träger und gegebenenfalls andere therapeutische Wirkstoffe enthalten. Bei einer Verwendung in der Medizin sollten die Salze pharmazeutisch verträglich sein. Nicht-pharmazeutisch verträgliche Salze können jedoch für die Herstellung pharmazeutisch verträglicher Salze davon verwendet werden und sind erfindungsgemäß umfasst. Solche pharmakologisch und pharmazeutisch verträglichen Salze umfassen in nicht begrenzender Weise diejenigen, die aus den nachstehenden Säuren hergestellt werden: Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter-, Phosphor-, Malein-, Essig-, Salicyl-, Citronen-, Ameisen-, Malon-, Bernsteinsäure und ähnliches. Pharmazeutisch verträgliche Salze können auch als Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze wie Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze hergestellt werden.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Der Begriff "pharmazeutisch verträglicher Träger" betrifft erfindungsgemäß einen oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder Kapselsubstanzen, die für eine Verabreichung insbesondere an einen Menschen geeignet sind. Der Begriff "Träger" betrifft einen organischen oder anorganischen Bestandteil, natürlicher oder synthetischer Natur, in dem der aktive Bestandteil kombiniert wird, um eine Anwendung zu erleichtern. Die Bestandteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung sind gewöhnlich derart, dass keine Interaktion auftritt, die die gewünschte pharmazeutische Wirksamkeit wesentlich beeinträchtigt.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können geeignete Pufferstoffe wie Essigsäure in einem Salz, Citronensäure in einem Salz, Borsäure in einem Salz und Phosphorsäure in einem Salz enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch gegebenenfalls geeignete Konservierungsstoffe wie Benzalkoniumchlorid, Chlorbutanol, Parabene und Thimerosal enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden gewöhnlich in einer einheitlichen Dosisform dargeboten und können in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen können beispielsweise in Form von Kapseln, Tabletten, Lutschpastillen, Suspensionen, Sirupen, Elixieren oder als Emulsion vorliegen.
Zusammensetzungen, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen gewöhnlich eine sterile wässrige oder nicht-wässrige Zubereitung des Wirkstoffs, die vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Verträgliche Träger und Lösungsmittel sind beispielsweise Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden gewöhnlich sterile, fixierte Öle als Lösungs- oder Suspensionsmedium eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Abbildungen und Beispiele ausführlich beschrieben, die ausschließlich der Erläuterung dienen und nicht begrenzend zu verstehen sind. Dem Fachmann sind aufgrund der Beschreibung und der Beispiele weitere Ausführungsformen zugänglich, die ebenfalls erfindungsgemäß umfasst sind.
ABBILDUNGEN
1. Schematische Darstellung der Strategie zur Verstellung einer hirnspezifischen cDNA-Expressionsbank.
2. Immunoscreening mit Seren von MS-Patienten und Identifizierung eines reaktiven Antigens.
3. Klassifizierung der erfindungsgemäß identifizierten Antigene.
4: Analyse der CLSTN1–spezifischen Expression.
Quantitative Analyse der CLSTN1-spezifischen Expression in gesunden Gewebeproben. Dargestellt ist die relative Expression (-fache Aktivierung).
5: Analyse der ARPP19–spezifischen Expression.
Quantitative Analyse der ARPP19-spezifischen Expression in gesunden Gewebeproben. Dargestellt ist die relative Expression (-fache Aktivierung).
6: Analyse der CMTM2–spezifischen Expression.
Quantitative Analyse der CMTM2-spezifischen Expression in gesunden Gewebeproben. Dargestellt ist die relative Expression (-fache Aktivierung).
7: Analyse der CPE–spezifischen Expression.
Quantitative Analyse der CPE-spezifischen Expression in gesunden Gewebeproben. Dargestellt ist die relative Expression (-fache Aktivierung).
8: Analyse der LITAF–spezifischen Expression.
Quantitative Analyse der LITAF-spezifischen Expression in gesunden Gewebeproben. Dargestellt ist die relative Expression (-fache Aktivierung).
9: Analyse der TUBG1–spezifischen Expression.
Quantitative Analyse der TUBG1-spezifischen Expression in gesunden Gewebeproben. Dargestellt ist die relative Expression (-fache Aktivierung).
10. Differentielle Serologie ausgewählter Antigene.
A: Darstellung der qualitativen Analyse der Signalintensität bei ausgewählten Antigenen nach Inkubation mit Seren von MS-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollseren.
B: Zusammenfassung der Signalintensitäten aller in 10 A dargestellten Antigene nach Inkubation mit Seren von MS-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollseren.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung einer hirnspezifischen cDNA Bank
Es wurde eine hirnspezifische cDNA-Expressionsbank in Lambda-Phagen hergestellt (1). In diesem System ist in einem Lambda-Phagen-Genom ein komplettes pBluescript-Plasmid enthalten und vereint damit die Eigenschaften eines Phagen und eines Plasmids. Menschliche mRNA, die aus Hirngewebe isoliert worden war, wurde in einer Erststrangsynthese mittels einer Reversen Transkriptase und einem Oligo-dT-Linker, an dessen 5'-Ende eine XhoI-Schnittstelle angefügt wurde, in methylierte cDNA umgeschrieben. Nach dem gezielten Abbau der mRNA wurde die DNA in einer Zweitstrangsynthese doppelsträngig gemacht. An die doppelsträngige DNA wurde ein EcoRI-Linker ligiert und das Konstrukt anschließend mit der Restriktionsendonuklease XhoI gespalten. Die Verwendung methylierter dCTPs in der Erstrangsynthese schützt den cDNA-Erststrang vor XhoI-Spaltung. Die Klonierung der so erhaltenen cDNA-Fragmente erfolgte in zuvor XhoI-/EcoRI-gespaltenen Vektor. Es wurden über 1 × 10⁶ rekombinante Klone erhalten.
Beispiel 2: Immunscreeningverfahren und Antigenidentifikation
Das Immunoscreening wurde wie bereits in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Hrsg., 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, oder Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., New York, beschrieben durchgeführt. Die Methode ist schematisch in 2 dargestellt. Bakterien des von E.coli K12-abgeleiteten Stammes XL1 MRF wurden in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet, auf eine OD₆₀₀ = 0,5 eingestellt und mit den Lambda-Phagen der beschriebenen Expressionsbank infiziert. Die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten (plaque-forming-units, pfu) wurde derart eingestellt, dass eine Subkonfluenz der Plaques vorlag (z.B. ∼5000 pfu/145 mm Petrischale). Unter Zusatz von TOP-Agar und IPTG wurde der Infektionsansatz auf Agarplatten mit Tetrazyklin ausplattiert. In einer Übernachtkultur bei 37°C bildeten sich auf dem Bakterienrasen Phagenplaques. Jeder einzelne Plaque repräsentiert einen Lambda-Phagen-Klon mit der in diesen Klon inserierten Nukleinsäure und enthält gleichzeitig das von der Nukleinsäure kodierte rekombinant exprimierte Protein.
Nitrozellulosemembranen wurden aufgelegt, um Abklatschpräparate der rekombinanten Proteine herzustellen (Plaque Lift). Nach Waschschritten in TBS-Tween und Blocken unspezifischer Bindungsstellen in TBS + 10% Milchpulver erfolgte die Inkubation im Serum über Nacht. Es wurde zu diesem Zweck Serum verwendet und 1:100 – 1:1.000 verdünnt. Nach weiteren Waschschritten wurden die Nitrozellulose-Membranen mit einem gegen humanes IgG gerichteten, sekundären AP-konjugierten Antikörper inkubiert. Bindungen von Serumantikörpern an in Phagenplaques rekombinant exprimierte Proteine konnten auf diese Weise durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht werden. Klone, die als reaktiv mit Seren identifiziert wurden, konnten auf die Kulturplatte zurückverfolgt und von dort das entsprechende Phagenkonstrukt monoklonal isoliert werden. Nach erneuter Ausplattierung wurden solche positiven Klone bestätigt. Durch in vivo Exzision wurde der Lambdaphagenklon zum Phagemid rezirkularisiert.
Für die Analyse der hirnspezifischen Phagenbank wurden insgesamt ca. 1.000.000 Klone analysiert, wobei insgesamt 17 unterschiedliche Seren verwendet wurden. Teilweise wurden gepoolten Seren verwendet. Primär identifizierte Klone wurden zunächst oligoklonal unter Zunahme von benachbarten nicht-reaktiven Phagenplaques isoliert und nach Bestätigung monoklonalisiert. Durch PCR mit den T7/T3 Standardprimern des integrierten Plasmidvektors wurden aus den monoklonalen Klonen die integrierte humane DNA amplifiziert und das Amplifikat anschließend mit Standardverfahren sequenziert. Die so ermittelten Sequenzen wurden über BLAST-Analyse mit bekannten Sequenzen in der Genbank abgeglichen. Durch die Analyse konnten insgesamt 44 unterschiedliche Klone isoliert werden, die mit Serum von MS-Patienten reaktiv waren. Die Antigene wurden gemäß ihrer Eigenschaften unterschiedlichen Gruppen zugeordnet (3).
Beispiel 3: Molekularbiologische und serologische Validierung der Autoantigene
Zur Nutzung der Autoantigene für immuntherapeutische Zwecke (Antikörpertherapie mittels monoklonaler Antikörper, Vakzinierung zur Induktion einer verbesserten Autoantigentoleranz, T-Zell Rezeptor-vermittelte therapeutische Ansätze; vgl. EP-B-0 879 282 ) oder andere zielgerichtete Ansätze (small compounds, siRNA etc.) bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen sowie für diagnostische Fragestellungen ist die Validierung der erfindungsgemäß identifizierten Antigene von zentraler Bedeutung. Die Validierung erfolgt dabei durch Expressionsanalyse RNA-Ebene sowie durch serologische Analysen.
1. Untersuchung der RNA Expression
Die erste Validierung der identifizierten Autoantigene erfolgt mit Hilfe von RNA, die aus verschiedenen Geweben bzw. aus gewebespezifischen Zelllinien gewonnen wird. Dabei hat die hirnspezifische Expression der mit den neurologischen Erkrankungen assoziierten Autoantigene eine entscheidende Bedeutung für die spätere therapeutische Anwendung. Die Isolierung von Gesamt-RNA aus nativen Gewebeproben oder aus Zelllinien erfolgt mit Verfahren, die in der Molekularbiologie Standard sind. Zum Beispiel kann die Isolierung mit Hilfe des RNeasy Maxi Kits (Qiagen, Kat. Nr. 75162) nach Vorschrift durch den Hersteller erfolgen. Dieses Isolierungsverfahren beruht auf der Verwendung von Guanidiniumisothiocyanat als chaotropes Reagenz. Alternativ kann die Isolierung mit saurem Phenol durchgeführt werden (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987). Nach Aufarbeitung des Gewebes mittels Guanidiniumisothiocyanat wird die RNA mit saurem Phenol extrahiert, anschließend die RNA mit Isopropanol gefällt und in DEPC-behandeltes Wasser aufgenommen.
2-4 μg der so isolierten RNA werden anschließend z.B. mittels Superscript II (Invitrogen) entsprechend dem Protokoll des Herstellers in cDNA umgeschrieben. Das Priming der cDNA Synthese erfolgt dabei mit Hilfe von zufälligen Hexameren (z.B. Roche Diagnostics) nach Standardprotokollen des jeweiligen Herstellers. Zur Qualitätskontrolle werden die cDNAs mit Primern in 30 Zyklen amplifiziert, die spezifisch für das nur gering exprimierte p53 Gen sind. Nur p53 positive cDNA Proben werden für die weiteren Reaktionsschritte verwendet.
Zur detaillierten Analyse werden die Target-Kandidaten wird mittels PCR bzw. quantitativer PCR (qPCR) auf ihre Expression in einem umfangreichen Set an Normalgeweben untersucht. Dazu werden 0,5 μl cDNA aus dem obigen Ansatz mit einer DNA-Polymerase (z.B. 1 U HotStarTaq DNA-Polymerase, Qiagen) analog den Protokollen des jeweiligen Herstellers amplifiziert (Gesamtvolumen des Ansatzes: 25-50 μl). Neben der Polymerase enthält der Amplifikationsansatz 0,3 mM dNTPs, Reaktionsbuffer (Endkonzentration 1 x, abhängig vom Hersteller der DNA-Polymerase) und je 0,3 mM des gen-spezifischen „forward" und „reverse" Primers.
Die spezifischen Primer des Zielgens werden, soweit möglich, so ausgewählt, das sie in zwei unterschiedlichen Exons liegen und somit genomische Kontaminationen nicht zu falsch positiven Ergebnissen führen. Bei einer nicht quantitativen Endpunkt-PCR wird die cDNA typischerweise 15 Minuten bei 95°C inkubiert, um die DNA zu denaturieren und um das Hot-Start-Enzyms zu aktivieren. Anschließend wird die DNA in 35 Zyklen amplifiziert (1 min 95°C, 1 min Primer spezifische Hybridisierungstemperatur (ca. 55-65°C), 1 min 72°C zur Elongation der Amplifikate). 10 μl des PCR Ansatzes werden anschließend auf Agarosegelen aufgetragen und im elektrischen Feld aufgetrennt. Durch Färben mit Ethidiumbromid wird die DNA in den Gelen sichtbar gemacht und das Ergebnis der PCR durch ein Foto dokumentiert.
Alternativ zur konventionellen PCR kann die Expressionsanalyse eines Zielgens auch durch quantitative real time PCR erfolgen. Zu dieser Analyse sind inzwischen verschiedene Analysesysteme erhältlich, die bekanntesten sind das ABI PRISM Sequence detection system (TaqMan, Applied Biosystems), der iCycler (Biorad) sowie der Light cycler (Roche Diagnostics). Wie oben beschrieben wird ein spezifischer PCR Ansatz einem Lauf in den real time Geräten unterzogen. Durch Zusatz eines DNA interkalierenden Farbstoffes (z.B Ethidiumbromid, CybrGreen) wird die neu synthetisierte DNA durch spezifische Lichtanregung (nach Angaben der Farbstoffhersteller) sichtbar gemacht. Durch eine Vielzahl von Messpunkten während der Amplifikation kann der gesamte Prozess verfolgt und eine quantitative Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration des Zielgens durchgeführt werden. Die Normalisierung des PCR Ansatzes erfolgt durch Messung eines „housekeeping Gens" (z.B. 18S RNA, β-Actin). Alternative Strategien über Fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden erlauben ebenfalls die quantitative Bestimmung des Zielgens aus einer spezifischen Gewebeprobe (siehe TaqMan Applikationen der Fa. Applied Biosystems).
2. Klonierung
Die Klonierung des gesamten Zielgens, die für die weitere Charakterisierung des Antigens notwendig ist, erfolgt nach gängigen molekularbiologischen Verfahren (z.B. in „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience). Zur Klonierung bzw. Sequenzanalyse des Zielgens wird dieses zunächst mit einer DNA-Polymerase mit „proof reading Funktion" (z.B. pfu, Roche Diagnostics) amplifiziert. Das Amplifikat wird anschließend mit Standardverfahren in einen Klonierungsvektor ligiert. Positive Klone werden durch Sequenzanalyse identifiziert und anschließend mit Hilfe von Prädiktionsprogrammen und bekannten Algorithmen charakterisiert.
3. Expression und Reinigung
Zur detaillierten Charakterisierung und für Produktentwicklungen ist es notwendig, die identifizierten Antigene in einem Expressionssystem zu synthetisieren und anschließend zu reinigen.
Für die Antigenexpression sind verschiedenste Systeme gut etabliert und kommerziell zugänglich, einige Beispiele für kommerzielle Anbieter sind angegeben, detaillierte Protokolle sind von den Anbietern veröffentlicht. Die gängigsten Expressionssysteme sind die in vitro Transkription/Translation (Roche Diagnstics, Invitrogen), die Antigenexpression in E. coli (Qiagen, Invirtorgen), in Hefe (Invitrogen, Stratagene, RCT) und in eukaryontischen Zellen nach Transfektion der Zellen oder nach Infektion mit viralen Expressionsvektoren wie z.B. mit rekombinanten Baculoviren oder Vacciniaviren (Invitrogen, Roche Diagnostics). Zur Transfektion von Zellen mit DNA für die Antigenexpression sind die verschiedensten Verfahren (z.B. Elektroporation, auf Liposomen basierende Transfektion, Kalziumphosphatpräzipitation) gut etabliert (z.B. Lemoine et al., Methods Mol. Biol. 75: 441-7, 1997).
Nach der Antigenexpression erfolgt die Reinigung des Antigens mit kommerziell erhältlichen Verfahren. Insbesondere ist eine breite Auswahl von chromatographische Verfahren etabliert (Biorad, Amersham Biosciences). Insbesondere eine Affinitätschromatographie eignet sich zur Antigenreinigung. Dafür können zum einen kurze, universell einsetzbare Proteinanker wie zum Beispiel der „His-Tag", der „FLAG-Tag" oder die Glutation-S-Transferase (GST) eingesetzt werden (Biorad, Amersham Biosciences, Qiagen). Die Reinigung erfolgt dann über die spezifischen Eigenschaften des Ankermoleküls. Die Affinitätschromatographie kann aber auch mittels eines Antigenspezifischen Antikörpers erfolgen. Eine Vielzahl von Protokollen finden sich bei den kommerziellen Anbietern oder in der Literatur, z.B. in den „Current Protocols of Proteinsciences" (John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience).
4. Serologische Analyse der identifizierten Antigene
Um krankheits-assoziierte Antigene zu erfassen, werden alle gefundenen Antigene auf das Vorhandensein von spezifischen Immunantworten (Antikörper) in Patienten mit MS, sowie in nicht erkrankten Kontrollgruppen untersucht. Dies erlaubt die Determinierung der Antigene, die klinisch relevant sind. Dazu können mehrere Detektions- bzw. Messverfahren wie auf Proteomanalysen basierende Protein-Arrays oder meist immunologische Analyseverfahren wie z.B. ELISA, CrELISA oder Western blot eingesetzt werden. Auch ein direkter serologischer Nachweis mit Hilfe des im Immunoscreening verwendeten Expressionssystems ist möglich.
Das am weitesten verbreitete serologische Nachweisverfahren ist der „enzyme-linked immune sorbent assay" (ELISA), der in verschiedensten Ausführungsformen publiziert ist. Grundsätzlich wird dazu ein Protein (Peptid, Antigen oder Antikörper) an einer Oberfläche gebunden. Anschließend wird die zu analysierende Probe mit diesem gebundenen Protein analysiert. Im nächsten Schritt folgt eine Inkubation in der Regel mit einem weiteren Antikörper, der mit einem Farbstoff (z.B. FITC, Cy3) oder einem Enzym (z.B. Peroxidase, Alkalische Phosphatase) gekoppelt ist. Abhängig von der gekoppelten Substanz erfolgt anschließend der Antigennachweis z.B. durch eine Farbreaktion oder durch Fluoreszenz. ELISA zum Nachweis von verschiedensten Antigene sind kommerziell erhältlich (Amersham Bioscience, Biorad etc etc), detaillierte Protokolle sind z.B. in den „Short Protocols in Molecular Biology" (Asubel, 2003; Wiley & sons, ISBN: 047132938X) oder in den „Current Protocols of Proteinsciences" (John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience). Analog zum ELISA basiert der „crude lysate enzyme-linked immune sorbent assay" (CrELISA) auf die Bindung von Bakterienlysaten der Antigenexprimierenden auf einer Oberfläche (Türeci et al. 2004. J Imm Methods 289, 191). Anschließend wird die zu analysierende Probe mit diesem gebundenen Protein analysiert. Im nächsten Schritt folgt eine Inkubation in der Regel mit einem weiteren Antikörper, der mit einem Farbstoff (z.B. FITC, Cy3) oder einem Enzym (z.B. Peroxidase, Alkalische Phosphatase) gekoppelt ist. Abhängig von der gekoppelten Substanz erfolgt anschließend der Antigennachweis z.B. durch eine Farbreaktion oder durch Fluoreszenz. Ein direkter Nachweis unter Verwendung des Expressionssystems, das für das Antigenscreening verwendet wurde, ist mit der „SEROGRID" Methode möglich (Krause et al. 2003. J Imm Methods 283, 261). Dazu werden E. coli Bakterien in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und mit antigenspezifischen, monoklonalen Lambdaphagen subkonfluent infiziert. Unter Zusatz von TOP-Agar und IPTG wurde der Infektionsansatz auf großflächigen Agarplatten mit Tetrazyklin ausplattiert. Die einzelnen Klone wurden dabei mit Hilfe von Spacern voneinander getrennt. Bei der Übernachtkultur bei 37°C bildeten sich auf dem Bakterienrasen Phagenplaques, wobei jeder einzelne Plaque einen spezifischen Lambda-Phagen-Klon mit der inserierten Nukleinsäure des zu analysierenden Antigens repräsentiert, das rekombinant exprimiert wird. Anschließend werden die Antigene wie im normalen Immunscreeningverfahren auf eine Nitrozellulosemembran geblottet und anschließend mit den humanen Seren inkubiert. Der Vorteil des SEROGRID Verfahrens ist die parallelisierte Analyse zahlreicher identifizierter Antigene in einem Versuchsansatz.
Eine weitere Validierung der identifizierten Antigene erlaubt die Verwendung von protein-Arrays, die die gleichzeitige Analyse vieler Antigene in einem Ansatz ermöglicht. Hierbei werden die Antigen-Moleküle an bestimmte Positionen in Vertiefungen oder auf planare Oberflächen wie z.B. auf Filtermembranen wie Nitrozellulose oder modifizierte Glasoberflächen gebunden. Die Bindung der Antigene kann kovalent durch chemische Linker oder nicht kovalent über hydrophobe van der Waals-, ionische oder andere Interaktionen erfolgen. Die gerichtete Bindung der Antigene an die Oberfläche kann z.B. über einen Tag (z.B. Histidin-Tag) erleichtert werden. Das Spotting der Proteinarrays erfolgt meist über Pin-basierte Systeme, die Lösungen im Nanoliter-Bereich transferieren. Der Antigennachweis basiert häufig auf Fluoreszenz. Eine Anwendung von Protein-Arrays ist die Untersuchung von Antigen-Antikörper-Interaktionen. Die Protein-Array-Technologie kann auch als klinische Diagnosetests eingesetzt werden.
Beispiel 4: Gewinnung von Antikörpern
Antikörper können beispielsweise zur Charakterisierung der erfindungsgemäßen Peptide und/oder Proteine und in den erfindungsgemäßen diagnostischen und therapeutischen Verfahren verwendet werden. Dabei können Antikörper Proteine in nativem und/oder denaturierten Zustand erkennen (Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000; Kayyem et al., Eur. J. Biochem. 208: 1-8, 1992; Spiller et al., J. Immunol. Methods 224: 51-60, 1999).
Antiseren, die spezifische Antikörper enthalten, die an das Zielprotein spezifisch binden, können über verschiedene Standardverfahren hergestellt werden; vgl. beispielsweise „Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" von Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9, „Antibodies: A Laboratory Manual" von Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142 und „Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" von Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447. Dabei ist auch möglich, affine und spezifische Antikörper zu generieren, die komplexe Membranproteine in ihrer nativen Form erkennen (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods. 234: 107-116, 2000). Dies ist vor allem für die Herstellung von Antikörpern von Bedeutung, die therapeutisch eingesetzt werden sollen, aber auch für viele diagnostische Anwendungen. Dazu kann sowohl mit dem gesamten Protein als auch mit extrazellulären Teilsequenzen immunisiert werden.
Immunisierung und Gewinnung von polyklonalen Antikörpern
Eine Spezies (z.B. Kaninchen, Mäuse) wird durch eine erste Injektion des gewünschten Zielproteins immunisiert. Durch eine zweite oder dritte Immunisierung innerhalb eines definierten Zeitraums (z.B. ca. 2-4 Wochen nach der letzten Immunisierung) lässt sich die Immunantwort des Tieres gegen das Immunogen verstärken. Wiederum nach verschiedenen definierten Zeitabständen (z.B. 1. Blutung nach 4 Wochen, anschließend alle 2-3 Wochen bis zu 5 Entnahmen) wird den Tieren Blut entnommen und Immunserum gewonnen. Die so entnommenen Immunseren enthalten polyklonale Antikörper, mit denen das Zielprotein im Western Blot, durch Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenz oder Immunhistochemie nachgewiesen und charakterisiert werden kann.
Die Immunisierung der Tiere erfolgt in der Regel über eines von vier gut etablierten Verfahren, wobei auch andere Verfahren existieren. Immunisiert werden kann dabei mit für das Zielprotein spezifischen Peptiden, dem gesamten Protein, mit extrazellulären Teilsequenzen eines Proteins, das experimentell oder über Prädiktionsprogramme identifiziert werden kann. Da die Prädiktionsprogramme nicht immer fehlerfrei arbeiten wird u.U. auch mit zwei Domänen gearbeitet, die voneinander durch eine Transmembrandomäne getrennt sind. Eine der beiden Domänen muss dann extrazellulär sein, was dann experimentell belegt werden kann (siehe nachstehend).

(1) Im ersten Fall werden Peptide (mit einer Länge von z.B. 8-12 Aminosäuren) über in vitro Verfahren synthetisiert (durch einen kommerziellen Service möglich) und diese Peptide zur Immunisierung verwendet. In der Regel erfolgen 3 Immunisierungen (z.B. mit einer Konzentration von 5-100 μg/Immunisierung). Die Durchführung der Immunisierung kann auch als Service von Dienstleistern erfolgen.
(2) Alternativ kann die Immunisierung durch rekombinante Proteine erfolgen. Dazu wird die klonierte DNA des Zielgens in einen Expressionsvektor kloniert und das Zielprotein analog den Bedingungen des jeweiligen Herstellers (z.B. Roche Diagnostics, Invitrogen, Clontech, Qiagen) z.B. zellfrei in vitro, in Bakterien (z.B. E. coli), in Hefe (z.B. S. pombe), in Insektenzellen oder in Säugetierzellen synthetisiert. Dabei ist auch die Synthese des Zielproteins mit Hilfe von viralen Expressionssystemen möglich (z.B. Baculovirus, Vacciniavirus, Adenvirus). Nach Synthese in einem der Systeme wird das Zielprotein aufgereinigt. Die Aufreinigung erfolgt dabei in der Regel über chromatographische Verfahren. Dabei können auch Proteine für die Immunisierung verwendet werden, die über einen molekularen Anker als Hilfsmittel zur Reinigung verfügen (z.B. His-Tag, Qiagen; FLAG-Tag, Roche Diagnostics; GST-Fusionsproteine). Eine Vielzahl von Protokollen befinden sich z.B. in den „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience. Nach Reinigung des Zielproteins erfolgt eine Immunisierung wie vorstehend beschrieben.
(3) Falls eine Zelllinie zur Verfügung steht, die das gewünschte Protein endogen synthetisiert, kann auch diese Zelllinie direkt zur Herstellung des spezifischen Antiserums verwendet werden. Die Immunisierung erfolgt dabei in 1-3 Injektionen mit jeweils ca. 1-5 × 10⁷ Zellen.
(4) Die Immunisierung kann auch durch Injektion von DNA (DNA-Immunisierung) erfolgen. Dazu wird das Zielgen zunächst in einen Expressionsvektor kloniert, so dass die Zielsequenz unter der Kontrolle eines starken eukaryontischen Promotors steht (z.B. CMV-Promotor). Anschließend wird DNA (z.B. 1-10 μg pro Injektion) als Immunogen mit einer „gene gun" in stark durchblutete, kapillare Bereiche eines Organismus transferiert (z.B. Maus, Kaninchen). Die transferierte DNA wird von Zellen des Tieres aufgenommen, das Zielgen wird exprimiert und das Tier entwickelt schließlich eine Immunantwort gegen das Zielprotein (Jung et al., Mol. Cells 12: 41-49, 2001; Kasinrerk et al., Hybrid Hybridomics 21: 287-293, 2002).

Gewinnung monoklonaler Antikörper
Monoklonale Antikörper werden traditionell mit Hilfe der Hybridoma Technologie hergestellt (Technische Details: siehe „Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" von Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; „Antibodies: A Laboratory Manual" von Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142, „Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" von Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447). Als ein neues Verfahren wird auch die so genannte „SLAM" Technologie eingesetzt. Hierbei werden B-Zellen aus Vollblut isoliert und die Zellen monoklonalisiert. Anschließend wird der Überstand der vereinzelten B-Zelle auf ihre Antikörperspezifität hin analysiert. Im Gegensatz zur Hybridomatechnologie wird anschließend die variable Region des Antikörpergens durch eine Einzelzell-PCR amplifiziert und in einen geeigneten Vektor kloniert. Auf diese Art und Weise wird die Gewinnung von monoklonalen Antikörpern beschleunigt (de Wildt et al. J. Immunol. Methods 207:61-67, 1997).
Beispiel 5: Aufbau eines Testsystems zur Diagnose von Autoimmunerkrankungen
Die identifizierten Autoantigene bilden die Basis eines Diagnosesystems spezifisch für die Diagnose von Autoimmunerkrankungen und/oder spezifisch für die Diagnose bzw. die Prognostik von Multipler Sklerose. Die Diagnose involviert dabei die Detektion des Vorhandenseins bzw. die Quantifizierung eines oder mehrerer menschlicher Autoantikörper spezifisch für ein Epitop oder spezifisch für mehrere Epitope der identifizierten Autoantigene. Das Vorhandensein oder die erhöhte Konzentration einzelner oder mehrer dieser Autoantikörper deutet dabei auf ein bestimmtes MS-Krankheitsstadium oder auf ein mögliches aggressiveres Krankheitsstadium hin.
Ein Testsystem zur Diagnose kann hierbei auf die Verwendung von einem bzw. auf die Verwendung einer Kombination der identifizierten Autoantigene beruhen. Dies beinhaltet spezifische Antigene als Marker für Autoimmunerkrankungen und/oder Multiple Sklerose und/oder polyklonale/monoklonale Antikörper spezifisch für Antigene, deren Prävalenz mit Autoimmunerkrankungen assoziiert sind. Das Testsystem zur Diagnose beruht auf der Verwendung der Antigene bzw. Antikörper z.B. in Immunoassays wie z.B. ELISA-Assays oder Protein-Arrays (siehe Beispiel 3). Die Detektion beinhaltet die Entnahme einer biologischen Probe wie z.B. Serum oder CSF aus MS-Patienten.
Beispiel 6: Identifizierung von CLSTN1 als Autoantigen
Calsyntenin 1 oder CLSTN1 (SEQ ID NO: 1) ist ein Gen, das auf Chromosom 1 (1p36.22) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein Typ I Transmembranprotein mit einer Größe von ca. 110 kDa (SEQ ID NO: 2). Das Protein enthält zwei Cadherin-Domänen und könnte nach Homologieanalysen ein Calcium-abhängiger Neurotransmitter sein.
Erfindungsgemäß konnte CLSTN1 als ein Autoantigen im Autoimmunscreen identifiziert werden. Zur Analyse der gewebsspezifischen Expression von CLSTN1 wurde nach der Etablierung einer genspezifischen quantitativen RT-PCR (Primerpaar SEQ ID NO: 89 und 90) die Menge der spezifischen Transkripte in verschiedenen Hirnregionen und in anderen gesunden Geweben analysiert. CLSTN1 ist in allen untersuchten Hirnregionen im Vergleich zu den anderen untersuchten Geweben deutlich überexprimiert (4) und ist somit als hirnspezifisch anzusehen. Die Expression in den analysierten Geweben könnte auf eine Expression im peripheren Nervengewebe zurückzuführen sein.
Beispiel 7: Identifizierung von ARPP-19 als Autoantigen
Das „cyclic AMP Phsophoprotein 19" oder ARPP-19 (SEQ ID NO: 3) ist ein Gen, das auf Chromosom 15 (15q21) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein wahrscheinlich zytoplasmatisch lokalisiertes Protein mit einer Größe von ca. 12 kDa (SEQ ID NO: 4). Homologienanalysen deuten darauf hin, dass ARPP-19 ein Phosphoprotein ist und zur Endosulfin-Familie gehört. Damit könnte APPP-19 ein Substrat für eine cAMP-abhängige Kinase sein.
Erfindungsgemäß konnte ARPP-19 als ein Autoantigen im Autoimmunscreen identifiziert werden. Zur Analyse der gewebsspezifischen Expression von ARPP-19 wurde nach der Etablierung einer genspezifischen quantitativen RT-PCR (Primerpaar SEQ ID NO: 91 und 92) die Menge der spezifischen Transkripte in verschiedenen Hirnregionen und in anderen gesunden Geweben analysiert. ARPP-19 ist in allen untersuchten Hirnregionen im Vergleich zu den anderen untersuchten Geweben mindestens 10-fach überexprimiert (5) und ist somit als hirnspezifisch anzusehen. Die Expression in den analysierten Geweben könnte auf eine Expression im peripheren Nervengewebe zurückzuführen sein.
Beispiel 8: Identifizierung von CMTM2 als Autoantigen
CMTM2 (SEQ ID NO: 5) ist ein Gen, das auf Chromosom 16 (16q22.1) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein integrales Membranprotein mit einer Größe von ca. 27 kDa (SEQ ID NO: 6). Das Protein zählt zur Familie der „Chemokine-like factors" und hat außerdem signifikante Homologien zur Familie der Signalmoleküle mit vier Transmembrandomänen. CMTM2 könnte demnach ein wichtiges Molekül in der zellulären Signaltransduktion sein. Erfindungsgemäß konnte CMTM2 als ein Autoantigen im Autoimmunscreen identifiziert werden. Zur Analyse der gewebsspezifischen Expression von CMTM2 wurde nach der Etablierung einer genspezifischen quantitativen RT-PCR (Primerpaar SEQ ID NO: 93 und 94) die Menge der spezifischen Transkripte in verschiedenen Hirnregionen und in anderen gesunden Geweben analysiert. CMTM2 ist in der immunprivilegierten Testis stark überexprimiert (6). In den anderen untersuchten Geweben war CMTM2 sehr selektiv vor allem in den verschiedenen Hirnregionen exprimiert, so dass die Autoimmunantwort als hirnspezifisch anzusehen ist.
Beispiel 9: Identifizierung von CPE als Autoantigen
Die Carboxypeptidase E oder CPE (SEQ ID NO: 7) ist ein Gen, das auf Chromosom 4 (4q32) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 53 kDa (SEQ ID NO: 8), das zytoplasmatisch lokalisiert ist. CPE ist eine Carboxypeptidase, die Prohormone und Neurotransmitter durch ihre enzymatische Funktion aktiviert und damit in die Biosynthese dieser biologischen Regulatoren involviert ist.
Erfindungsgemäß konnte CPE als ein Autoantigen im Autoimmunscreen identifiziert werden. Zur Analyse der gewebsspezifischen Expression von CPE wurde nach der Etablierung einer genspezifischen quantitativen RT-PCR (Primerpaar SEQ ID NO: 95 und 96) die Menge der spezifischen Transkripte in verschiedenen Hirnregionen und in anderen gesunden Geweben analysiert. In einer quantitativen RT-PCR konnte eine zumindest 5-fache Überexpression im Gehirn im Vergleich zu allen anderen untersuchten Geweben nachgewiesen werden (7).
Beispiel 10: Identifizierung von LITAF als Autoantigen
„LPS-induced TNF-alpha factor" oder LITAF (SEQ ID NO: 9) ist ein Gen, das auf Chromosom 16 (16p13) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 24 kDa (SEQ ID NR.: 10), das nukleär lokalisiert ist. LITAF hat eine wichtige Rolle bei der Transkriptionsregulation des Zytokins TNF-alpha und wird mit der neurologischen Erkrankung „Charcot-Marie-Tooth" in Zusammenhang gebracht (Street, 2003. Neurology 60: 22-26).
Erfindungsgemäß konnte LITAF als ein Autoantigen im Autoimmunscreen identifiziert werden. Zur Analyse der gewebsspezifischen Expression von LITAF wurde nach der Etablierung einer genspezifischen quantitativen RT-PCR (Primerpaar SEQ ID NO: 97 und 98) die Menge der spezifischen Transkripte in verschiedenen Hirnregionen und in anderen gesunden Geweben analysiert. Es konnte eine zumindest 2- bis 5-fache Überexpression im Gehirn im Vergleich zu allen anderen untersuchten Geweben nachgewiesen werden (8).
Beispiel 11: Identifizierung von TUBG1 als Autoantigen
Tubulin gamma 1 oder TUBG1 (SEQ ID NO: 11) ist ein Gen, das auf Chromosom 17 (16q21) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 51 kDa (SEQ ID NO: 12), das nukleär lokalisiert ist. TUBG1 ist ein Mitglied der Tubulin- Familie und Bestandteil der Mikrotubuli im Zellkern. Das Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der Zellkernteilung.
Erfindungsgemäß konnte TUBG1 als ein Autoantigen im Autoimmunscreen identifiziert werden. Zur Analyse der gewebsspezifischen Expression von TUBG1 wurde nach der Etablierung einer genspezifischen quantitativen RT-PCR (Primerpaar SEQ ID NO: 99 und 100) die Menge der spezifischen Transkripte in verschiedenen Hirnregionen und in anderen gesunden Geweben analysiert. Es konnte eine zumindest 2- bis 5-fache Überexpression im Gehirn im Vergleich zu allen anderen untersuchten Geweben nachgewiesen werden (9).
Beispiel 12: Identifizierung von NAP1L3 als Autoantigen
„Nucleosome assembly Protein 1-like 3" oder NAP1L3 (SEQ ID NO: 13) ist ein Gen, das auf Chromosom X (Xq21-22) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 58 kDa (SEQ ID NO: 14), das nuklear lokalisiert ist. NAP1L3 ist ein Mitglied der „nucleosome assembly"-Familie und spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des Zellkerns.
Beispiel 13: Identifizierung von ENO2 als Autoantigen
Enolase 2 oder ENO2 (SEQ ID NO: 15) ist ein Gen, das auf Chromosom 12 (12q13) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 47 kDa (SEQ ID NO: 16), das cytoplasmatisch lokalisiert ist. Das ENO2-Gen kodiert für ein Enzym des glykolytischen Stoffwechselweges, das hauptsächlich in Neuronen und Zellen neuronalen Ursprings exprimiert wird.
Beispiel 14: Identifizierung von Autoantigenen, die bereits mit anderen Autoimmunerkrankungen assoziiert sind
Überraschend konnten durch das Immunscreening insgesamt vier Autoantigene identifiziert werden, die bereits zuvor im Zusammenhang mit anderen Autoimmunreaktionen beschrieben wurden.
Das Gen SDCCAG8 (SEQ ID NO: 17) ist auf Chromosom 1 (1q43-44) lokalisiert. Das Gen kodiert für ein Protein mit einer Größe von ca. 49 kDa (SEQ ID NO: 18) mit bisher unbekannter Funktion. SDCCAG8 wurde als ein kolonspezifisches Tumorautoantigen beschrieben.
Das Gen HSP90B1 (SEQ ID NO: 19) ist auf Chromosom 12 (12q24) lokalisiert und kodiert für ein Protein mit einer Größe von ca. 92 kDa (SEQ ID NO: 20). Das Gen gehört zur Familie der Chaperone, die im Lumen des ER eine wichtige Funktion bei der Genese und dem Transport von sezernierten Proteinen haben. HSP90B1 ist in Myelomen hochreguliert.
Das Gen SAT (SEQ ID NO: 21) ist auf dem X-Chromosom (Xp22) lokalisiert und kodiert für ein ca. 20 kDa großes Protein (SEQ ID NO: 22). Das lösliche Enzym liegt im Zytoplasma als Homotetramer vor und erfüllt eine katalytische Funktion bei der Regulation von Polyaminen.
Das Gen EXOSC5 (SEQ ID NO: 23) ist auf Chromosom 19 (19q13) lokalisiert und kodiert für ein nukleäres, ca. 25 kDa großes Protein (SEQ ID NO: 24). Das Enzym besitzt eine Exonuklease-Aktivität und ist Bestandteil des nuklearen Exosoms. Bei Patienten mit Myopathien und Hauterkrankungen konnten EXOSC5-spezifische Autoantikörper nachgewiesen werden.
Beispiel 15: Identifizierung von Autoantigenen mit bisher unbekannter Funktion
Überraschend konnten durch das Immunscreening insgesamt zehn neue, bisher hypothetische Gene bzw. einige chromosomale Regionen, denen bisher noch kein Gen zugeordnet werden konnte, identifiziert werden. Dementsprechend sind Funktion und Eigenschaften ihrer Genprodukte unbekannt. Diese Gene bzw. die zugehörigen Genprodukte sind wie folgt: Chromosom 20 Sequenz: SEQ ID NO: 25, 26; CEP63: SEQ ID NO: 27, 28; LOC115648: SEQ ID NO: 29, 30; Chromosom 18 Sequenz: SEQ ID NO: 31, 32; Chromosom 14 Sequenz 1: SEQ ID NO: 33, 34; Chromosom 14 Sequenz 2: SEQ ID NO: 35, 36; IQWD1: SEQ ID NO: 37, 38; C60ORF199: SEQ ID NO: 39, 40; Chromosom 22 Sequenz: SEQ ID NO: 41, 42; LOC400843: SEQ ID NO: 43, 44. Das Genprodukt mit der SEQ ID NO: 28 ist ein lösliches centrosomal lokalisiertes Protein unbekannter Funktion. IQWD1 kodiert für ein nukleares Protein einer Größe von ca. 96 kDa (SEQ ID NO: 38) mit mehreren WD40-Domänen und einer nuklearen Translokationssequenz. WD40-Domänen haben wahrscheinlich eine Funktion bei Protein-Protein-Interaktionen. Das Gen mit der SEQ ID NO: 39 kodiert für ein Protein mit einer Größe von ca. 48 kDa, das eventuell mitochondrial lokalisiert ist und eine Adenylat-Kinase Funktion hat.
Beispiel 16: Identifizierung von weiteren humanen Autoantigenen
Überraschend konnten durch das Immunscreening insgesamt 17 zelluläre Antigene identifiziert werden, von denen bisher nicht bekannt war, dass sie an Autoimmunreaktionen beteiligt sind.
"Interferon regulatory factor 2 binding Protein 2" oder IRF2BP2 (SEQ ID NO: 45) ist ein Gen, das auf Chromosom 1 (1p42) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 61 kDa (SEQ ID NO: 46), das wahrscheinlich nukleär lokalisiert ist. Die genaue Funktion von IRF2BP2 ist noch nicht bekannt. Das Protein bindet an den Transkriptionsfaktor IRF2 und beeinflusst die IRF2-spezifische Genregulation.
Der „sterol regulatory element binding factor 1" oder SREBF1 (SEQ ID NO: 47) ist ein Gen, das auf Chromosom 17 (17p11) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein Protein mit einer Größe von ca. 122 kDa (SEQ ID NO: 48). SREBF1 besitzt eine Transmembrandomäne und spielt eine Rolle bei der Transkriptsionsregulation und beim Transport von Sterol. Im nicht aktivierten Zustand ist SREBF1 im ER lokalisiert, nach Aktivierung erfolgt eine Translokation in den Kern, wo das Protein über direkte DNA-Bindung die Transkription verschiedener Gene reguliert.
Exportin4 oder XPO4 (SEQ ID NO: 49) ist ein Gen, das auf Chromosom 1 (13q11) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 130 kDa (SEQ ID NO: 50). XPO4 bindet an den Elongationsfaktor eIF-5A und vermittelt den Transport des Elongationsfaktur vom Kern in das Zytoplasma.
Das "zinc finger Protein 64" oder ZFP64 (SEQ ID NO: 51) ist ein Gen, das auf Chromosom 1 (20q13) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 75 kDa (SEQ ID NO: 52), das nukleär lokalisiert ist. Wahrscheinlich bindet ZFP64 an DNA und hat die Funktion eines Transkriptionsfaktors.
Das "formin binding binding Protein 1" oder FNBP1 (SEQ ID NO: 53) ist ein Gen, das auf Chromosom 9 (9q34) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 70 kDa (SEQ ID NO: 54), das wahrscheinlich zytoplasmatisch lokalisiert ist. Dem Protein wird eine Funktion in der zellulären Wachstumsregulation zugeordnet.
CCL4 (SEQ ID NO: 55) ist ein Gen, das auf Chromosom 17 (17q24) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 10,5 kDa (SEQ ID NO: 56), das sezerniert wird. Das Protein bindet an Cytokinrezeptoren und gehört zur Familie der Chemokine.
COPA (SEQ ID NO: 57) ist ein Gen, das auf Chromosom 1 (1q23-25) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 138 kDa (SEQ ID NO: 58), das zytoplasmatisch lokalisiert ist. Das Protein ist an der Regulation von sekretorischen Vesikeln beteiligt und wird dabei auch sezerniert.
GHITM (SEQ ID NO: 59) ist ein Gen, das auf Chromosom 10 (10q23.1) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein integrales Membranprotein mit einer Größe von ca. 34 kDa (SEQ ID NO: 60), dessen Expression wahrscheinlich chemokinabhängig ist. Dem Protein wird eine Funktion im Interferonsignalsystem und eine potentielle Rezeptorfunktion zugeordnet.
NGLY1 (SEQ ID NO: 61) ist ein Gen, das auf Chromosom 3 (3q24.2) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein integrales Membranprotein mit einer Größe von ca. 55 kDa (SEQ ID NO: 62). Dem Protein wird eine Funktion in der Degradation falsch gefalteter Proteine zugeordnet.
KTN1 (SEQ ID NO: 63) ist ein Gen, das auf Chromosom 14 (14q22.1) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein Membranprotein mit einer Größe von ca. 156 kDa (SEQ ID NO: 64). Dem Protein wird eine Funktion als Kinesin-Rezeptor und somit an der Kinesin-getriebenen Vesikelmotilität zugeordnet.
SFRS11 (SEQ ID NO: 65) ist ein Gen, das auf Chromosom 1 (1q31) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 54 kDa (SEQ ID NO: 66), das wahrscheinlich nukleär lokalisiert ist. Dem Protein wird eine Funktion im Pre-mRNA-Splicing zugeordnet.
NME1-NME2 (SEQ ID NO: 67) ist ein Gen, das auf Chromosom 17 (17q21.3) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 17 kDa (SEQ ID NO: 68), das wahrscheinlich cytoplasmatisch und nukleär lokalisiert ist. Das Protein hat als Nukleosid-Diphosphat-Kinase eine Funktion in der Synthese von nicht-ATP-Nukleosidtriphosphaten.
RPS15 (SEQ ID NO: 69) ist ein Gen, das auf Chromosom 19 (19q13.3) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 17 kDa (SEQ ID NO: 70), das wahrscheinlich cytoplasmatisch lokalisiert ist. RPS15 ist ein Mitglied der „S19P"-Familie ribosomaler Proteine und spielt eine Rolle bei der Proteinsynthese.
APC2 (SEQ ID NO: 71) ist ein Gen, das auf Chromosom 19 (19q13.3) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 245 kDa (SEQ ID NO: 72), das cytoplasmatisch, eventuell ko-lokalisiert mit tubulären Strukturen bzw. dem Golgi-Apparat, lokalisiert ist. Dem Protein wird eine Funktion als Tumorsuppressor zugeordnet.
GLS2 (SEQ ID NO: 73) ist ein Gen, das auf Chromosom 12 (12q13) lokalisiert ist. Das Gen kodiert ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 66 kDa (SEQ ID NO: 74), das mitochondrial lokalisiert ist. Dem Protein wird eine enzymatische Funktion als Glutaminase bei der Hydrolyse von Glutamin zugeordnet.
TECAL8 (SEQ ID NO: 75) ist ein Gen, das auf Chromosom X (Xq22.1) lokalisiert ist. Das Gen kodiert für ein lösliches Protein mit einer Größe von ca. 14 kDa (SEQ ID NO: 76). Dem Protein wird eine Funktion als Transkriptions-Elongationsfaktor zugeordnet.
PPIF (SEQ ID NO: 77) ist ein Gen, das auf Chromosom 10 (10q22-q23) lokalisiert ist. Das Gen kodiert für ein Protein mit einer Größe von ca. 22 kDa (SEQ ID NO: 78), das mitochondrial lokalisiert ist. Dem Protein wird eine enzymatische Funktion bei der Proteinfaltung und eine mögliche Funktion bei der Induktion von apoptotischem und nekrotischem Zelltod zugeordnet.
Beispiel 17: Identifizierung von mitochondrialen Autoantigenen
Durch das Immunscreening konnten insgesamt fünf mitochondriale Gene identifiziert werden, gegen deren Genprodukte Autoantikörper in Patienten mit Multipler Sklerose gebildet werden. Diese Gene bzw. zugehörige Genprodukte sind wie folgt: ND4: SEQ ID NO: 79, 80; ATP5H: SEQ ID NO: 81, 82; COX1: SEQ ID NO: 83, 84; COX2: SEQ ID NO: 85, 86; COX3: SEQ ID NO: 87, 88.
Beispiel 18: Serologische Analyse ausgewählter Autoimmunantigene
Um die Prävalenz der identifizierten Antigene in Patienten mit Multipler Sklerose zu untersuchen, wurden 24 der identifizierten 44 Antigene mit bis zu 12 Seren von MS-Patienten und bis zu 18 Seren von Kontrollpatienten in einer Serogridanalyse (Krause et al. 2003. J Imm Methods 283, 261) untersucht (s. Beispiel 3). Das Ergebnis der Analyse ist in 10 dargestellt. Die identifizierten Antigene waren in fast allen untersuchten Proben, die von Patienten mit einer MS-Erkrankung stammten, mittel bis stark positiv und wiesen damit eine hohe Prävalenz der identifizierten Autoantikörper in Patienten mit Multipler Sklerose nach. Dagegen konnte in den Kontrollproben (n=18), die von gesunden Probanden stammten, nur eine allenfalls schwache Reaktivität nahe der Detektionsgrenze identifiziert werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Diagnose, Prognose und/oder Überwachung einer neurologischen Autoimmunerkrankung bei einem Patienten, umfassend den Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge eines Antikörpers, der für ein Protein oder Peptid, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, einem Teil und einem Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist, und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist, oder für einen Teil oder ein Derivat des Proteins oder Peptids spezifisch ist, in einer aus einem Patienten isolierten biologischen Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein oder Peptid, für das der Antikörper spezifisch ist, eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, einem Teil und Derivat davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das ferner den Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge des Antikörpers in einer aus einem Patienten ohne die Autoimmunerkrankung und/oder ohne ein Risiko für die Autoimmunerkrankung isolierten biologischen Probe umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei ein Vorliegen des Antikörpers und/oder eine im Vergleich zu einem Patienten ohne die Autoimmunerkrankung und/oder ohne ein Risiko für die Autoimmunerkrankung erhöhte Menge des Antikörpers in der biologischen Probe auf das Vorliegen der Autoimmunerkrankung oder ein Risiko für eine Entwicklung der Autoimmunerkrankung hinweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge des Antikörpers mit einem Immunoassay erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge des Antikörpers (i) die Kontaktierung der biologischen Probe mit einem Mittel, das spezifisch an den Antikörper bindet, und (ii) den Nachweis der Komplexbildung zwischen dem Mittel und dem Antikörper umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Mittel, das spezifisch an den Antikörper bindet, auf einem Trägermaterial immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Mittel, das spezifisch an den Antikörper bindet, ein Protein oder Peptid oder Derivat davon ist, das spezifisch an den Antikörper bindet.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Protein oder Peptid, das spezifisch an den Antikörper bindet, eine Sequenz umfasst, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, einem Teil und einem Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist, und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Protein oder Peptid, das spezifisch an den Antikörper bindet, eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, und einem Teil davon ausgewählt ist.
Verfahren zur Diagnose, Prognose und/oder Überwachung einer neurologischen Autoimmunerkrankung bei einem Patienten, umfassend den Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge eines T-Lymphozyten, der für ein Protein oder Peptid, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, einem Teil und einem Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist, und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist, oder für einen Teil oder ein Derivat des Proteins oder Peptids spezifisch ist, in einer aus einem Patienten isolierten biologischen Probe.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Protein oder Peptid, für das der T-Lymphocyt spezifisch ist, eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, einem Teil und Derivat davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, das ferner den Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge des T-Lymphocyten in einer aus einem Patienten ohne die Autoimmunerkrankung und/oder ohne ein Risiko für die Autoimmunerkrankung isolierten biologischen Probe umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei ein Vorliegen des T-Lymphocyten und/oder eine im Vergleich zu einem Patienten ohne die Autoimmunerkrankung und/oder ohne ein Risiko für die Autoimmunerkrankung erhöhte Menge des T-Lymphocyten in der biologischen Probe auf das Vorliegen der Autoimmunerkrankung oder ein Risiko für eine Entwicklung der Autoimmunerkrankung hinweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei der Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge des T-Lymphocyten mit einem Lymphozyten-Proliferationstest erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei der Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge des T-Lymphozyten (i) die Kontaktierung der biologischen Probe mit einem Mittel, das spezifisch an den T-Lymphozyten bindet, und (ii) den Nachweis der Komplexbildung zwischen dem Mittel und dem T-Lymphozyten umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Mittel, das spezifisch an den T-Lymphocyten bindet, auf einem Trägermaterial immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei das Mittel, das spezifisch an den T-Lymphocyten bindet, ein Protein oder Peptid oder Derivat davon ist, das spezifisch an den T-Lymphocyten bindet.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei das Mittel, das spezifisch an den T-Lymphocyten bindet, ein Komplex ist, der ein MHC-Molekül oder einen Teil davon und ein Protein oder Peptid oder Derivat davon umfasst, und der spezifisch an den T-Lymphocyten bindet.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Komplex von einer Zelle präsentiert wird. (APC)
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Protein oder Peptid, das spezifisch an den T-Lymphcyten bindet, oder das von dem Komplex umfasst ist, der spezifisch an den T-Lymphocyten bindet, eine Sequenz umfasst, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, einem Teil und einem Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist, und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei das Protein oder Peptid, das spezifisch an den T-Lymphcyten bindet, oder das von dem Komplex umfasst ist, der spezifisch an den T-Lymphocyten bindet, eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, und einem Teil davon ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Überwachung der Autoimmunerkrankung eine Bestimmung der Regression, des Verlaufs oder des Ausbruchs der Erkrankung in einer Probe aus dem Patienten umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei das Verfahren einen Nachweis oder eine Bestimmung der Menge zu einem ersten Zeitpunkt in einer ersten Probe und zu einem zweiten Zeitpunkt in einer weiteren Probe und einen Vergleich der beiden Proben umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die biologische Probe Körperflüssigkeit und/oder Körpergewebe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Körperflüssigkeit ausgewählt ist aus Serum, Plasma, Urin und Cerebrospinalflüssigkeit.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die neurologische Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose ist.
Kit zur Diagnose, Prognose und/oder Überwachung einer neurologischen Autoimmunerkrankung bei einem Patienten, umfassend ein Protein oder Peptid, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, und einem Teil davon ausgewählt ist, oder ein Derivat des Proteins oder Peptids.
Kit nach Anspruch 28, wobei das Protein oder Peptid oder das Derivat davon auf einem Träger immobilisiert ist.
Kit nach Anspruch 28 der 29, der ferner Anweisungen für eine Verwendung des Kits in einem Verfahren zur Diagnose, Prognose und/oder Überwachung einer neurologischen Autoimmunerkrankung bei einem Patienten umfasst.
Kit nach Anspruch 30, wobei das Verfahren ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27 ist.
Kit nach einem der Ansprüche 28 bis 31, der ferner ein Reagenz für einen Nachweis einer Bindung eines Antikörpers an das Protein oder Peptid oder das Derivat davon umfasst.
Kit nach Anspruch 32, wobei das Reagenz einen nachweisbar markierter Bindepartner für den Antikörper umfasst.
Kit nach Anspruch 33, wobei der Bindepartner für den Antikörper ein anti-Immunglobulin-Antikörper ist.
Kit nach einem der Ansprüche 28 bis 34, wobei die neurologische Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen oder mehrere Bestandteile umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus: (i) einem Protein oder Peptid, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, und einem Teil davon ausgewählt ist, oder einem Derivat des Proteins oder Peptids, (ii) einer Nukleinsäure, die das Protein oder Peptid oder das Derivat davon unter (i) exprimiert, und (iii) einer Wirtszelle, die die Nukleinsäure unter (ii) umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 36, wobei die Nukleinsäure in einem Expressionsvektor vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 36, wobei die Wirtszelle das Peptid oder Protein oder das Derivat davon sekretiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36 bis 38 zur Behandlung einer neurologischen Autoimmunerkrankung.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 39, wobei die neurologische Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose ist.
Verfahren zur Behandlung einer neurologischen Autoimmunerkrankung, umfassend die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36 bis 40.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei die neurologische Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose ist.