CN114878828B - 用于检测自身免疫性脑炎的抗体组合物及其应用 - Google Patents

用于检测自身免疫性脑炎的抗体组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测自身免疫性脑炎的抗体组合物、试剂和试剂盒及制备方法，涉及免疫检测领域。该抗体组合物能够实现NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2、GABABR六种抗体联合检测，大幅提高自身免疫性脑炎诊断的灵敏度和特异性，可用于自身免疫性脑炎的临床定性以及抗体滴度测定。

Description

用于检测自身免疫性脑炎的抗体组合物及其应用
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，特别是涉及一种用于检测自身免疫性脑炎的抗体组合物及其应用
背景技术
自身免疫性脑炎(autoimmune encephalitis,AE)是一组主要累及中枢神经系统的自身免疫性疾病。自身免疫性脑炎在儿童、青少年、成人均可发生。临床上，自身免疫性脑炎主要表现为急性或亚急性起病的以记忆力下降、癫痫发作、精神症状、运动障碍等症状为特征的脑炎综合征,病情严重者可出现癫痫持续状态、中枢性低通气等情况危及生命，有研究表明部分重症自免脑患者需住重症监护病房，病死率为4.0％-5.2％。因此早期诊断及治疗对自身免疫性脑炎至关重要。
自身免疫性脑炎通常包括两大类，典型的副肿瘤性边缘脑炎(limbicencephalitis，LE)，与抗神经元细胞内抗原的自身抗体(如Hu，Yo，Ma2等)相关；另一类是是与神经元表面或突触抗原自身抗体相关的新型自身免疫性脑炎，一般属于致病性抗体，这种自身抗体与其靶点结合导致不可逆性的神经元功能障碍。自2007年Dalmau等人发现抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)抗体以来，已鉴定出十多种新型自身抗体。这些自身抗体大多与特异性和特征性的症状有关，而这些自身抗体的检测证实了诊断。自2010年我国引进并建立抗NMDAR抗体诊断试验以来，已有数百例自身免疫性脑炎患者被诊断和治疗，改变了我国脑炎治疗的临床方法。
根据中国自免脑炎诊治专家共识，把新型的自免脑分为三个大组，把抗NMDAR脑炎单独分出来作为独立的一组，第二类是以精神行为异常,癫痫发作和近记忆力下降为主要临床表现的边缘性脑炎,可以合并或者不合并肿瘤，最常见的与这类边缘性脑炎相关的抗体有LGI1抗体，GABAb抗体以及AMPA抗体；第三类是其他一些特殊的临床综合征，包括与Caspr2抗体介导的Morvan综合征，多巴胺受体抗体介导的基底节脑炎，以及甘氨酸受体介导的PERM等。
然而，在中国，用于识别这类自身抗体资源十分有限，国内大多数实验室采用商业上可买到的基于细胞的检测方法(CBA，Euromimun，Germany)来诊断神经元细胞表面自身抗体，由于缺乏实验室资源，自身免疫性脑炎的及时诊断往往受到阻碍。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种用于检测自身免疫性脑炎的抗体组合物，能够实现NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2、GABABR六种抗体联合检测，大幅提高自身免疫性脑炎诊断的灵敏度和特异性，可用于自身免疫性脑炎的临床定性以及抗体滴度测定。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于检测自身免疫性脑炎的抗体组合物，包括抗NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2和GABABR的自身抗体。
本发明人在研究过程中发现，基于组织的检测(tissue-based assay，TBA)、基于细胞的检测(cell-based assay,CBA)以及基于活体海马或皮质神经元的间接免疫荧光法和免疫沉淀法可用于细胞内和细胞表面或突触抗体检测。在TBA中，患者血清或脑脊液中的抗体通过小鼠或大鼠脑切片的间接免疫荧光检测，是一种很好的筛选方法，但需要通过更具体的技术来证实。关于肿瘤神经抗体(如Hu、Ma2、Ri等)的检测，用重组蛋白对最常见的自身抗体进行商业免疫印迹是广泛可用的。另一方面，神经元表面自身抗体检测的金标准是CBA，在CBA中，表达适当抗原的细胞(例如人类胚胎肾293细胞)与患者的血清/脑脊液一起孵育，抗体通过间接免疫荧光来识别。这种方法具有高度敏感性和特异性，提高了抗体的检出率。
NMDAR脑炎是目前报道例数最多的自身免疫性脑炎，年轻人多见，且病情危重者较多，很多患者合并有畸胎瘤，影响患者预后。其他诸如LGI1抗体脑炎，CASPR2脑炎，GABABR脑炎，AMPAR脑炎报道相对较多。LGI1脑炎癫痫发作多以各形式颞叶癫痫常见，有患者合并顽固性低钠血症，增加治疗难度。GABABR脑炎常表现为严重且难治的癫痫发作，可进展为癫痫持续状态，影响患者后期脑功能恢复，且约50％GABABR脑炎患者合并小细胞肺癌。因此，抗体的检测对于自身免疫性脑炎的诊断和分型具有重要意义。除了对疾病诊断的意义之外，其滴度和(或)浓度的变化对疾病的进展和疗效具有重要的监测价值。本发明选择包括NMDAR、LGI1及GABABR在内的上述6个抗体进行检测，从而覆盖绝大部分(90％)自身免疫性脑炎患者可能出现的抗体，为患者后续治疗方案及肿瘤筛查提供方向，临床应用价值高。
一般情况，细胞表面抗原抗体采用ELISA等方法存在较为明显的假阳性和假阴性，且与临床症状符合度较差。而NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2、GABABR属于细胞表面抗原，其空间构象对抗体识别非常重要。我们采用基于细胞过表达的间接免疫荧光法(CBA)，可以维持抗原的自身构象，其特异度和灵敏度均具有优势。
在其中一个实施例中，所述自身抗体来源于血液或脑脊液。
本发明还提供了所述的抗体组合物在制备用于检测自身免疫性脑炎的试剂中的应用。
本发明还提供了一种用于检测自身免疫性脑炎的试剂盒，该试剂盒包括用于与所述抗体组合物发生反应的抗原组合。
在其中一个实施例中，所述试剂盒包括：
固定相，所述固定相上结合有所述抗原组合；以及
第二抗体，所述第二抗体可与所述自身抗体结合。
上述试剂盒通过所述抗原组合和所述自身抗体反应，将抗NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2和GABABR的自身抗体固定于固定相上，然后通过第二抗体识别并结合被固定的自身抗体，进而实现自身免疫性脑炎的临床定性以及抗体滴度测定。
在其中一个实施例中，所述第二抗体为抗人抗体。
在其中一个实施例中，所述第二抗体选自：山羊抗人抗体、大鼠抗人抗体、小鼠抗人抗体、猪抗人抗体、驴抗人抗体、绵羊抗人抗体、鸡抗人抗体、马抗人抗体、兔抗人抗体、仓鼠抗人抗体、狗抗人抗体或牛抗人抗体。
在其中一个实施例中，所述第二抗体为山羊抗人抗体。
在其中一个实施例中，所述第二抗体的类型选自：IgG、IgA、IgM、IgG(Fc)或IgG(ab’)2。
在其中一个实施例中，所述第二抗体的类型为IgG。
在其中一个实施例中，所述抗原组合通过以下方法制备得到：
制备质粒：分别构建含有NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2或GABABR基因的质粒；
制备细胞：将所述质粒转染到细胞中，使细胞表达所述抗原组合，即得。
通过上述方法，能够简单易行地同时表达NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2和GABABR基因，得到所述抗原组合。
在其中一个实施例中，所述固定相通过以下方法制备得到：
将所述细胞固定于玻片上，即得。在其中一个实施例中，所述第二抗体上连接有标记物，所述标记物选自：荧光素或酶。
采用上述方式，可通过标记物的生效或失活来判断生物样本中是否存在所述自身抗体，或测定所述自身抗体的滴度情况。
在其中一个实施例中，所述荧光素包括以下原料中的至少1种：异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明异硫氰酸盐、Texas Red荧光染料、藻红蛋白、碘化丙啶、Alexa Fluor系列荧光染料、Dylight系列荧光染料或iFluor系列荧光染料。
本发明还提供了所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
固定相的制备：制备用于与权利要求1所述的抗体组合物发生反应的抗原组合，将所述抗原组合固定于固定相上；
第二抗体制备：将可与所述自身抗体结合的第二抗体与标记物连接，即得。
上述制备方法得到的试剂盒，通过将同时表达6种抗原的细胞固定于固定相上，使其通过与所述自身抗体结合，将自身抗体固定，然后第二抗体识别并结合被固定的自身抗体，引发第二抗体连接的标记物的生效或失活，从而实现自身免疫性脑炎的临床定性以及抗体滴度测定。
在其中一个实施例中，所述第二抗体制备步骤中，所述连接包括直接连接或间接连接。
在其中一个实施例中，所述间接连接为所述第一抗体通过偶联基团与所述标记物偶联的基团发生结合。
在其中一个实施例中，所述固定相通过以下方法制备得到：
制备质粒：分别构建含有NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2或GABABR基因的质粒；
制备细胞：将所述质粒转染到细胞中，使细胞表达所述抗原组合；
制备固定相：将所述细胞固定于玻片上，即得。
在其中一个实施例中，所述制备细胞步骤中，所述转染为瞬时转染。
在其中一个实施例中，所述细胞为293T细胞。
本发明还提供了一种用于非诊断治疗目的自身免疫性脑炎的检测方法，包括以下步骤：
第一孵育：将生物样本和权利要求3-7中任一项所述试剂盒的抗原组合混合，进行孵育，孵育温度为20-30℃，孵育时间为40-80min；
第二孵育：加入可与所述自身抗体结合的第二抗体，进行孵育，孵育温度为20-30℃，孵育时间为20-40min。
采用上述检测方式，通过第一孵育，使过表达的所述抗原组合和所述自身抗体反应，使自身抗体被固定，然后再通过第二孵育，使被固定的自身抗体被所述第二抗体识别，并特异性结合，引发第二抗体连接的标记物的生效或失活，从而实现自身免疫性脑炎的临床定性以及抗体滴度测定。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种用于检测自身免疫性脑炎的抗体组合物、试剂和试剂盒及制备方法，该抗体组合物能够实现NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2、GABABR六种抗体联合检测，大幅提高自身免疫性脑炎诊断的灵敏度和特异性，可用于自身免疫性脑炎的临床定性以及抗体滴度测定。该试剂盒通过分别构建NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2、GABABR质粒，瞬时转染载体细胞使其过表达上述基因对应的6种抗原，形成抗原组合，和抗NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2和GABABR的自身抗体结合，再通过细胞免疫荧光染色法(cell basedassay,CBA)定性或定量检测患者样本中所述自身抗体产生情况。这种新型CBA方法提高了自身免疫相关性脑病患者抗NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2、GABABR抗体检出的灵敏性、特异性和准确性，检测方法便捷、效率高及特异性强等特点，广大患者的辅助诊断提供了更加便利的途径及更进一步的“金标准”。且和目前市面上常用的口试剂盒辅助检测诊断自身免疫相关性脑病方法相比，该试剂盒降低了成本，易于流通，检测方法简单易操作，为广大临床患者的辅助诊断减少了经济成本和时间成本。
附图说明
图1为实施例1中过表达NMDAR/AMPA1/AMPA2/LGI1/CASPR2/GABABR的质粒图谱；
图2为实验例中，采用实施例1检测试剂盒检测抗体阳性患者的血清染色结果图；
图3为实验例中，采用实施例1检测试剂盒检测抗体阴性患者的血清染色结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
定义：
本发明所述的IgG(Fc)：指将生物活性蛋白与IgG的铰链区和Fc片段进行基因重组而表达的融合蛋白。
IgG(ab’)2：指具有与完整IgG一样的抗原结合活性，但无法与效应分子结合，Ig的两个臂通过二硫键仍连在一起的IgG蛋白。
荧光素：指可以产生明亮荧光的染料物质。
Texas Red荧光染料：是一种红色荧光染料，呈紫红色粉末。
Alexa Fluor系列荧光染料：是美国分子探针公司开发的系列荧光染料，可应用于生物医学研究中对组织、细胞和生物分子等的标记、定位。
Dylight系列荧光染料：由Dyomics和赛默飞世尔科技合作开发的系列荧光染料，具有光谱宽度广、荧光强度高、光学稳定性好、对pH不敏感、分子较小渗透性好等优点，结合荧光显微镜等设备，可应用于生物医学研究中对组织、细胞和生物分子等的标记、定位。
iFluor系列荧光染料：指一系列高度水溶性荧光染料，用于标记生物分子，如蛋白质和抗体。
来源：
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；试验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试验方法。
实施例1
制备试剂盒。
1、制备质粒。
分别构建含有NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2或GABABR基因的质粒，构建方法为：设计目的基因引物，PCR技术扩增目的基因，利用核酸内切酶，DNA连接酶等将目的基因与载体DNA进行切割并连接在一起。将组建好的质粒导入感受态大肠杆菌中。将大肠杆菌涂板后于培养箱中培养，挑出单克隆菌株进行测序并保种。将鉴定测序正确的克隆菌涂于固体培养基上。予37℃培养箱培养1-2天，将长出的菌落置于液体培养基中，振荡培养过夜。离心扩增后菌液，用质粒大量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。nanodrop测量质粒浓度,分装后-20℃保存。
NMDAR基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；AMPA1基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；AMPA2基因的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；LGI1基因的碱基序列如SEQ ID NO:4所示；CASPR2基因的碱基序列如SEQ ID NO:5所示；GABABR基因的碱基序列如SEQ ID NO:6所示；
过表达NMDAR/AMPA1/AMPA2/LGI1/CASPR2/GABABR质粒图谱如图1所示。
2、制备细胞。
(1)细胞转染。
镜下观察细胞，细胞密度70％-80％左右开始转染。取无菌1.5ml EP管，标记A，分别依次加入OPTI-MEM 125μL、NMDAR/AMPA1/AMPA2/LGI1/CASPR2/GABABR质粒5μg、P300010μL，轻轻吹匀2-3次，避免气泡；另取无菌1.5ml EP管，标记B，分别依次加入OPTI-MEM125μL、Lipofectamine 3000 3.8μL，轻轻吹匀2-3次，避免气泡。将A液加入B液中，轻轻吹匀5-7次，避免气泡，静置13分钟。将AB混合液逐滴加入6孔板中，轻轻摇晃，37℃培养箱中过夜培养，于10小时换成新的DMEM完全培养基，继续于CO2培养箱中培养1-2天，直至细胞铺满玻片。
(2)转染细胞固定与保存。
转染后细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)2mL/孔洗涤2次，每次5min；每孔中加入4％多聚甲醛2mL固定30min；PBS 2mL/孔洗涤2次，每次5min；通风橱风干10-15min直至完全看不见水渍，4℃保存。
(3)转染细胞玻片裁切。
从冰箱中取出装有转染细胞玻片的六孔板复温5-10min。用尖头镊子从6孔板中取出转染细胞玻片，用镊子的尖头轻轻撬起细胞玻片的一角，小心夹住细胞玻片的一角，贴于一张干净的载玻片上，可使用微量的PBS将细胞玻片紧贴在载玻片上。注意：镊子不要划到玻片的细胞面。切割时沿玻片的边缘切割，先切割下一个长条，宽3-5mm，然后再将切下来的长条玻片切割成3×3mm-5×5mm大小的细胞片。选取细胞密集的小玻片经UV无影胶黏贴于免疫组化用的载玻片上。-NMDAR/AMPA1/AMPA2/LGI1/CASPR2/GABABR及无转染空白片贴在一起，形成一个组合，每张载玻片上可以贴两组。切割好的玻片放置在4℃冰箱内可保存。
3、制备试剂盒。
在本实施例中，所述自身免疫性脑炎检测试剂盒还包括载玻片、封闭液、工作浓缩液、用于细胞核染料、盖玻片、洗涤盒、质控品。具体组成如下表所示。
表1 20人份试剂盒的组成
Figure BDA0003593990310000061
Figure BDA0003593990310000071
对比例1
采用ELISA法进行检测，检测步骤如下：
1、提前1小时从冰箱中取出试剂盒、样本，平衡至室温。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成400ml工作浓度的洗涤液，未用完的放回4℃；20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。
2、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
3、设置标准品孔，空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。
4、样本孔中加待测样本50μL；空白孔加样板稀释液50μL。
5、空白孔，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
6、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
7、每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
8、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
9、绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
对比例2
采用CBA法检测LGI1/Caspr2/mGlur5/mGlur1/IgLon5/GAD65，检测步骤如下：
1、制备质粒。
分别构建含有LGI1/Caspr2/mGlur5/mGlur1/IgLon5/GAD65基因的质粒，构建方法为常规的碱裂解法分离质粒，步骤依次为：设计引物、PCR合成目的基因、目的基因和载体连接、转化涂板、测序、摇菌保菌、质粒提取。
2、制备细胞。
(1)细胞转染。
镜下观察细胞，细胞密度70％-80％左右开始转染。取无菌1.5ml EP管，标记A，分别依次加入OPTI-MEM 125μL、LGI1/Caspr2/mGlur5/mGlur1/IgLon5/GAD65质粒5μg、P300010μL，轻轻吹匀2-3次，避免气泡；另取无菌1.5ml EP管，标记B，分别依次加入OPTI-MEM 125μL、Lipofectamine 3000 3.8μL，轻轻吹匀2-3次，避免气泡。将A液加入B液中，轻轻吹匀5-7次，避免气泡，静置13分钟。将AB混合液逐滴加入6孔板中，轻轻摇晃，37℃培养箱中过夜培养，于10小时换成新的DMEM完全培养基，继续于CO2培养箱中培养1-2天，直至细胞铺满玻片。
(2)转染细胞固定与保存。
转染后细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)2mL/孔洗涤2次，每次5min；每孔中加入4％多聚甲醛2mL固定30min；PBS 2mL/孔洗涤2次，每次5min；通风橱风干10-15min直至完全看不见水渍，4℃保存。
(3)转染细胞玻片裁切。
从冰箱中取出装有转染细胞玻片的六孔板复温5-10min。用尖头镊子从6孔板中取出转染细胞玻片，用镊子的尖头轻轻撬起细胞玻片的一角，小心夹住细胞玻片的一角，贴于一张干净的载玻片上，可使用微量的PBS将细胞玻片紧贴在载玻片上。注意：镊子不要划到玻片的细胞面。切割时沿玻片的边缘切割，先切割下一个长条，宽3-5mm，然后再将切下来的长条玻片切割成3×3mm-5×5mm大小的细胞片。选取细胞密集的小玻片经UV无影胶黏贴于免疫组化用的载玻片上。LGI1/Caspr2/mGlur5/mGlur1/IgLon5/GAD65及无转染空白片贴在一起，形成一个组合，每张载玻片上可以贴两组。切割好的玻片放置在4℃冰箱内可保存。
3、检测
(1)取出分区载玻片，室温放置10分钟，使细胞充分贴壁。
(2)将载玻片放入在湿盒中，向每个反应区加入工作液(约200μL，确保每个细胞片都被覆盖)，室温静置5分钟。
(3)封闭：吸去工作液，向每个反应区加入封闭液(约200μL)室温封闭30分钟。
(4)样品孵育：吸去封闭液，向每个反应区加入待检测样品(约200μL左右)，室温孵育1小时。
(5)清洗：吸去待检测样品，在洗涤盒中放置约20mL工作液清洗载玻片3次，每次5分钟。(注：摇床上洗涤摇速约60次/分钟)。
(6)孵育：向每个反应区加入200μL已稀释的试剂1，室温孵育30分钟。从此步骤起，请避光操作。
(7)清洗：吸去反应区中的试剂1，在洗涤盒中放置约20mL工作液清洗载玻片3次，每次5分钟。(注：摇床上洗涤摇速约60次/分钟)。
(8)封片：向每个反应区加入试剂2(约70μL)，用以染细胞核，并防止荧光淬灭。
(9)盖上盖玻片，避免产生气泡。
(10)镜下读取绿色荧光结果，20倍物镜下观察。
4、阳性判断值、结果分析。
实验例
1、生物样本及试剂准备。
(1)工作液：按1：9稀释，每次染色需约150mL工作液。例：15mL工作浓缩液中加入135mL纯化水稀释，充分震荡混匀。该工作液现配现用，工作浓缩液需震荡混匀后使用，避免结晶。
(2)提取生物样本：分别从5名患者的脑脊液、血清中提取9份生物样本。检测前取出生物样本使其恢复室温。如生物样本为冻存标本，需待其完全溶解后检测。
(3)稀释生物样本：稀释范围为1：9-1：99。初次检测建议1：9稀释。步骤：20μL生物样本加入180μL工作液，混匀。用工作液稀释的生物样本只能用于当日检测实验，不能再次储存。
(4)稀释试剂1：按1：49稀释。步骤：4μL试剂1加入196μL工作液稀释。
(5)质量控制：取工作液200μL加入到质控品中进行稀释，混匀后使用。
2、自身免疫性脑炎检测。
将本实验例步骤1准备好的生物样本，采用实施例1制备得到的检测试剂盒进行检测的同时，送检欧盟。
采用实施例1制备得到的检测试剂盒，实施以下检测步骤：
(1)取出分区载玻片，室温放置10分钟，使细胞充分贴壁。
(2)将载玻片放入在湿盒中，向每个反应区加入工作液(约200μL，确保每个细胞片都被覆盖)，室温静置5分钟。
(3)封闭：吸去工作液，向每个反应区加入封闭液(约200μL)室温封闭30分钟。
(4)样品孵育：吸去封闭液，向每个反应区加入待检测样品(约200μL左右)，室温孵育1小时。
(5)清洗：吸去待检测样品，在洗涤盒中放置约20mL工作液清洗载玻片3次，每次5分钟。(注：摇床上洗涤摇速约60次/分钟)。
(6)孵育：向每个反应区加入200μL已稀释的试剂1，室温孵育30分钟。从此步骤起，请避光操作。
(7)清洗：吸去反应区中的试剂1，在洗涤盒中放置约20mL工作液清洗载玻片3次，每次5分钟。(注：摇床上洗涤摇速约60次/分钟)。
(8)封片：向每个反应区加入试剂2(约70μL)，用以染细胞核，并防止荧光淬灭。
(9)盖上盖玻片，避免产生气泡。
(10)镜下读取绿色荧光结果，20倍物镜下观察。
3、阳性判断值、结果分析。
阳性结果的判定条件：20倍物镜下，与空白组爬片对比，观察实验组爬片有无阳性信号。
分别采用实施例1、对比例1、对比例2对随机抽选的9例疑似患者进行检测，同时送检欧盟，结果如下表所示。
表2实施例1、对比例1、对比例2的检测试剂盒、欧盟送检的结果
Figure BDA0003593990310000091
Figure BDA0003593990310000101
结果分析：采用实施例1的检测试剂盒检测得到NMDAR/AMPA1/AMPA2/LGI1/CASPR2/GABABR相应抗体阳性和抗体阴性患者血清染色结果如图2、图3所示。
由上表和图2、图3可见，实施例1的检测试剂盒，能够高灵敏性检测生物样本中的NMDAR/AMPA1/AMPA2/LGI1/CASPR2/GABABR抗体，可用于自身免疫性脑炎的临床定性以及抗体滴度测定。且实施例1中得到的抗体滴度略高于欧盟送检结果，说明本发明试剂盒灵敏度高于欧盟，对于抗体滴度不高的样本检测更有意义，可以帮助临床工作减少漏诊的风险，具有较高的检出灵敏性、特异性和准确性，检测方法便捷、效率高及特异性强等特点，广大患者的辅助诊断提供了更加便利的途径及更进一步的“金标准”。
除此之外，与ELISA(对比例1)相比，本试剂盒还具有检测时间短，假阳性率低的特点，6小时之内即可出检测结果，且检测结果一目了然，无需换算。
与CBA法检测LGI1/Caspr2/mGlur5/mGlur1/IgLon5/GAD65(对比例2)相比，本试剂盒对疑似患者检出率更高，而对比例2选择的抗体组合，存在一定的漏检。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 天津天海新域生物科技有限公司
<120> 用于检测自身免疫性脑炎的抗体组合物及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2832
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagcacca tgcgcctgct gacgctcgcc ctgctgttct cctgctccgt cgcccgtgcc 60
gcgtgcgacc ccaagatcgt caacattggc gcggtgctga gcacgcggaa gcacgagcag 120
atgttccgcg aggccgtgaa ccaggccaac aagcggcacg gctcctggaa gattcagctc 180
aatgccacct ccgtcacgca caagcccaac gccatccaga tggctctgtc ggtgtgcgag 240
gacctcatct ccagccaggt ctacgccatc ctagttagcc atccacctac ccccaacgac 300
cacttcactc ccacccctgt ctcctacaca gccggcttct accgcatacc cgtgctgggg 360
ctgaccaccc gcatgtccat ctactcggac aagagcatcc acctgagctt cctgcgcacc 420
gtgccgccct actcccacca gtccagcgtg tggtttgaga tgatgcgtgt ctacagctgg 480
aaccacatca tcctgctggt cagcgacgac cacgagggcc gggcggctca gaaacgcctg 540
gagacgctgc tggaggagcg tgagtccaag agtaaaaaaa ggaactatga aaacctcgac 600
caactgtcct atgacaacaa gcgcggaccc aaggcagaga aggtgctgca gtttgaccca 660
gggaccaaga acgtgacggc cctgctgatg gaggcgaaag agctggaggc ccgggtcatc 720
atcctttctg ccagcgagga cgatgctgcc actgtatacc gcgcagccgc gatgctgaac 780
atgacgggct ccgggtacgt gtggctggtc ggcgagcgcg agatctcggg gaacgccctg 840
cgctacgccc cagacggcat cctcgggctg cagctcatca acggcaagaa cgagtcggcc 900
cacatcagcg acgccgtggg cgtggtggcc caggccgtgc acgagctcct cgagaaggag 960
aacatcaccg acccgccgcg gggctgcgtg ggcaacacca acatctggaa gaccgggccg 1020
ctcttcaaga gagtgctgat gtcttccaag tatgcggatg gggtgactgg tcgcgtggag 1080
ttcaatgagg atggggaccg gaagttcgcc aactacagca tcatgaacct gcagaaccgc 1140
aagctggtgc aagtgggcat ctacaatggc acccacgtca tccctaatga caggaagatc 1200
atctggccag gcggagagac agagaagcct cgagggtacc agatgtccac cagactgaag 1260
attgtgacga tccaccagga gcccttcgtg tacgtcaagc ccacgctgag tgatgggaca 1320
tgcaaggagg agttcacagt caacggcgac ccagtcaaga aggtgatctg caccgggccc 1380
aacgacacgt cgccgggcag cccccgccac acggtgcctc agtgttgcta cggcttttgc 1440
atcgacctgc tcatcaagct ggcacggacc atgaacttca cctacgaggt gcacctggtg 1500
gcagatggca agttcggcac acaggagcgg gtgaacaaca gcaacaagaa ggagtggaat 1560
gggatgatgg gcgagctgct cagcgggcag gcagacatga tcgtggcgcc gctaaccata 1620
aacaacgagc gcgcgcagta catcgagttt tccaagccct tcaagtacca gggcctgact 1680
attctggtca agaaggagat tccccggagc acgctggact cgttcatgca gccgttccag 1740
agcacactgt ggctgctggt ggggctgtcg gtgcacgtgg tggccgtgat gctgtacctg 1800
ctggaccgct tcagcccctt cggccggttc aaggtgaaca gcgaggagga ggaggaggac 1860
gcactgaccc tgtcctcggc catgtggttc tcctggggcg tcctgctcaa ctccggcatc 1920
ggggaaggcg cccccagaag cttctcagcg cgcatcctgg gcatggtgtg ggccggcttt 1980
gccatgatca tcgtggcctc ctacaccgcc aacctggcgg ccttcctggt gctggaccgg 2040
ccggaggagc gcatcacggg catcaacgac cctcggctga ggaacccctc ggacaagttt 2100
atctacgcca cggtgaagca gagctccgtg gatatctact tccggcgcca ggtggagctg 2160
agcaccatgt accggcatat ggagaagcac aactacgaga gtgcggcgga ggccatccag 2220
gccgtgagag acaacaagct gcatgccttc atctgggact cggcggtgct ggagttcgag 2280
gcctcgcaga agtgcgacct ggtgacgact ggagagctgt ttttccgctc gggcttcggc 2340
ataggcatgc gcaaagacag cccctggaag cagaacgtct ccctgtccat cctcaagtcc 2400
cacgagaatg gcttcatgga agacctggac aagacgtggg ttcggtatca ggaatgtgac 2460
tcgcgcagca acgcccctgc gacccttact tttgagaaca tggccggggt cttcatgctg 2520
gtagctgggg gcatcgtggc cgggatcttc ctgattttca tcgagattgc ctacaagcgg 2580
cacaaggatg ctcgccggaa gcagatgcag ctggcctttg ccgccgttaa cgtgtggcgg 2640
aagaacctgc aggatagaaa gagtggtaga gcagagcctg accctaaaaa gaaagccaca 2700
tttagggcta tcacctccac cctggcttcc agcttcaaga ggcgtaggtc ctccaaagac 2760
acgcagtacc atcccactga tatcacgggc ccgctcaacc tctcagatcc ctcggtcagc 2820
accgtggtgt ga 2832
<210> 2
<211> 2721
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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ttccccaaca atatccagat cgggggatta tttccaaacc agcagtcaca ggaacatgct 120
gcttttagat ttgctttgtc gcaactcaca gagcccccga agctgctccc ccagattgat 180
attgtgaaca tcagcgacag ctttgagatg acctatagat tctgttccca gttctccaaa 240
ggagtctatg ccatctttgg gttttatgaa cgtaggactg tcaacatgct gacctccttt 300
tgtggggccc tccacgtctg cttcattacg ccgagctttc ccgttgatac atccaatcag 360
tttgtccttc agctgcgccc tgaactgcag gatgccctca tcagcatcat tgaccattac 420
aagtggcaga aatttgtcta catttatgat gccgaccggg gcttatccgt cctgcagaaa 480
gtcctggata cagctgctga gaagaactgg caggtgacag cagtcaacat tttgacaacc 540
acagaggagg gataccggat gctctttcag gacctggaga agaaaaagga gcggctggtg 600
gtggtggact gtgaatcaga acgcctcaat gctatcttgg gccagattat aaagctagag 660
aagaatggca tcggctacca ctacattctt gcaaatctgg gcttcatgga cattgactta 720
aacaaattca aggagagtgg cgccaatgtg acaggtttcc agctggtgaa ctacacagac 780
actattccgg ccaagatcat gcagcagtgg aagaatagtg atgctcgaga ccacacacgg 840
gtggactgga agagacccaa gtacacctct gcgctcacct acgatggggt gaaggtgatg 900
gctgaggctt tccagagcct gcggaggcag agaattgata tatctcgccg ggggaatgct 960
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ctgcagcagg tgcgatttga aggtttaaca ggaaacgtgc agtttaatga gaaaggacgc 1080
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ggtttttgtt tgatcccaca gcaatccatc aacgaagcca tacggacatc gaccctcccc 2580
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<210> 3
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gaatactatc aatgggacaa gtttgcatac ctctatgaca gtgacagagg cttatcaaca 480
ctgcaagctg tgctggattc tgctgctgaa aagaaatggc aagtgactgc tatcaatgtg 540
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ggatttactg atggagacct attaaaaatc cagtttggag gtgcaaatgt ctctggattt 780
cagatagtgg actatgatga ttcgttggta tctaaattta tagaaagatg gtcaacactg 840
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cgctatgagg gctactgtgt tgacctggct gcagaaatcg ccaaacattg tgggttcaag 1380
tacaagttga caattgttgg tgatggcaag tatggggcca gggatgcaga cacgaaaatt 1440
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gacaagctga aaaacaaatg gtggtacgat aaaggtgaat gtggagccaa ggactctgga 2400
agtaaggaaa agaccagtgc cctcagtctg agcaacgttg ctggagtatt ctacatcctt 2460
gtcgggggcc ttggtttggc aatgctggtg gctttgattg agttctgtta caagtcaagg 2520
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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tatttcctat gtctcttatc tgcgcttttg ctgactgagg ggaagaaacc agcgaagcca 120
aaatgccctg ccgtgtgtac ttgtaccaaa gataatgctt tatgtgagaa tgccagatcc 180
attccacgca ccgttcctcc tgatgttatc tcattatcct ttgtgagatc tggttttact 240
gaaatctcag aagggagttt tttattcacg ccatcgctgc agctcttgag ccttgcaaac 300
aacaatctcc agacactccc aaaagatatt ttcaaaggcc tggattcttt aacaaatgtg 360
gacctgaggg gtaattcatt taattgtgac tgtaaactga aatggctagt ggaatggctt 420
ggccacacca atgcaactgt tgaagacatc tactgcgaag gccccccaga atacaagaag 480
cgcaaaatca atagtctctc ctcgaaggat tttgattgca tcattacaga atttgcaaag 540
tctcaagacc tgccttatca atcattgtcc atagacactt tttcttattt gaatgatgag 600
tatgtagtca tcgctcagcc ttttactgga aaatgcattt tccttgaatg ggaccatgtg 660
gaaaagacct tccggaatta tgacaacatt acaggcacat ccactgtagt atgcaagcct 720
atagtcattg aaactcagct ctatgttatt gtggcccagc tgtttggtgg ctctcacatc 780
tataagcgag acagttttgc aaataaattc ataaaaatcc aggatattga aattctcaaa 840
atccgaaaac ccaatgacat tgaaacattc aagattgaaa acaactggta ctttgttgtt 900
gctgacagtt caaaagctgg ttttactacc atttacaaat ggaacggaaa cggattctac 960
tcccatcaat ccttacacgc gtggtacagg gacactgatg tggaatatct agaaatagtc 1020
agaacacctc agacactcag aacgcctcat ttaattctgt ctagtagttc ccagcgtcct 1080
gtaatttatc agtggaacaa agcaacacaa ttattcacta accaaactga cattcctaac 1140
atggaggatg tgtacgcagt gaagcacttc tcagtgaaag gggacgtgta catttgcttg 1200
acaagattca ttggtgattc caaagtcatg aaatggggag gctcctcgtt ccaggatatt 1260
cagaggatgc catcgcgagg atccatggtg ttccagcctc ttcaaataaa taattaccaa 1320
tatgcaattc ttggaagtga ttactccttt actcaagtgt ataactggga tgcagagaaa 1380
gccaaatttg tgaaatttca ggaattaaat gttcaggcac caagatcatt cacacatgtg 1440
tccattaata agcgtaattt tctttttgct tccagtttta agggaaatac acagatttac 1500
aaacatgtca tagttgactt aagcgcatga 1530
<210> 5
<211> 3996
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcaggcgg ctccgcgcgc cggctgcggg gcagcgctcc tgctgtggat tgtcagcagc 60
tgcctctgca gagcctggac ggctccctcc acgtcccaaa aatgtgatga gccacttgtc 120
tctggactcc cccatgtggc tttcagcagc tcctcctcca tctctggtag ctattctccc 180
ggctatgcca agataaacaa gagaggaggt gctgggggat ggtctccatc agacagcgac 240
cattatcaat ggcttcaggt tgactttggc aatcggaagc agatcagtgc cattgcaacc 300
caaggaaggt atagcagctc agattgggtg acccaatacc ggatgctcta cagcgacaca 360
gggagaaact ggaaacccta tcatcaagat gggaatatct gggcatttcc cggaaacatt 420
aactctgacg gtgtggtccg gcacgaatta cagcatccga ttattgcccg ctatgtgcgc 480
atagtgcctc tggattggaa tggagaaggt cgcattggac tcagaattga agtttatggc 540
tgttcttact gggctgatgt tatcaacttt gatggccatg ttgtattacc atatagattc 600
agaaacaaga agatgaaaac actgaaagat gtcattgcct tgaactttaa gacgtctgaa 660
agtgaaggag taatcctgca cggagaagga cagcaaggag attacattac cttggaactg 720
aaaaaagcca agctggtcct cagtttaaac ttaggaagca accagcttgg ccccatatat 780
ggccacacat cagtgatgac aggaagtttg ctggatgacc accactggca ctctgtggtc 840
attgagcgcc aggggcggag cattaacctc actctggaca ggagcatgca gcacttccgt 900
accaatggag agtttgacta cctggacttg gactatgaga taacctttgg aggcatccct 960
ttctctggca agcccagctc cagcagtaga aagaatttca aaggctgcat ggaaagcatc 1020
aactacaatg gcgtcaacat tactgatctt gccagaagga agaaattaga gccctcaaat 1080
gtgggaaatt tgagcttttc ttgtgtggaa ccctatacgg tgcctgtctt tttcaacgct 1140
acaagttacc tggaggtgcc cggacggctt aaccaggacc tgttctcagt cagtttccag 1200
tttaggacat ggaaccccaa tggtctcctg gtcttcagtc actttgcgga taatttgggc 1260
aatgtggaga ttgacctcac tgaaagcaaa gtgggtgttc acatcaacat cacacagacc 1320
aagatgagcc aaatcgatat ttcctcaggt tctgggttga atgatggaca gtggcacgag 1380
gttcgcttcc tagccaagga aaattttgct attctcacca tcgatggaga tgaagcatca 1440
gcagttcgaa ctaatagtcc ccttcaagtt aaaactggcg agaagtactt ttttggaggt 1500
tttctgaacc agatgaataa ctcaagtcac tctgtccttc agccttcatt ccaaggatgc 1560
atgcagctca ttcaagtgga cgatcaactt gtaaatttat acgaagtggc acaaaggaag 1620
ccgggaagtt tcgcgaatgt cagcattgac atgtgtgcga tcatagacag atgtgtgccc 1680
aatcactgtg agcatggtgg aaagtgctcg caaacatggg acagcttcaa atgcacttgt 1740
gatgagacag gatacagtgg ggccacctgc cacaactcta tctacgagcc ttcctgtgaa 1800
gcctacaaac acctaggaca gacatcaaat tattactgga tagatcctga tggcagcgga 1860
cctctggggc ctctgaaagt ttactgcaac atgacagagg acaaagtgtg gaccatagtg 1920
tctcatgact tgcagatgca gacgcctgtg gtcggctaca acccagaaaa atactcagtg 1980
acacagctcg tttacagcgc ctccatggac cagataagtg ccatcactga cagtgccgag 2040
tactgcgagc agtatgtctc ctatttctgc aagatgtcaa gattgttgaa caccccagat 2100
ggaagccctt acacttggtg ggttggcaaa gccaacgaga agcactacta ctggggaggc 2160
tctgggcctg gaatccagaa atgtgcctgc ggcatcgaac gcaactgcac agatcccaag 2220
tactactgta actgcgacgc ggactacaag caatggagga aggatgctgg tttcttatca 2280
tacaaagatc acctgccagt gagccaagtg gtggttggag atactgaccg tcaaggctca 2340
gaagccaaat tgagcgtagg tcctctgcgc tgccaaggag acaggaatta ttggaatgcc 2400
gcctctttcc caaacccatc ctcctacctg cacttctcta ctttccaagg ggaaactagc 2460
gctgacattt ctttctactt caaaacatta accccctggg gagtgtttct tgaaaatatg 2520
ggaaaggaag atttcatcaa gctggagctg aagtctgcca cagaagtgtc cttttcattt 2580
gatgtgggaa atgggccagt agagattgta gtgaggtcac caacccctct caacgatgac 2640
cagtggcacc gggtcactgc agagaggaat gtcaagcagg ccagcctaca ggtggaccgg 2700
ctaccgcagc agatccgcaa ggccccaaca gaaggccaca cccgcctgga gctctacagc 2760
cagttatttg tgggtggtgc tgggggccag cagggcttcc tgggctgcat ccgctccttg 2820
aggatgaatg gggtgacact tgacctggag gaaagagcaa aggtcacatc tgggttcata 2880
tccggatgct cgggccattg caccagctat ggaacaaact gtgaaaatgg aggcaaatgc 2940
ctagagagat accacggtta ctcctgcgat tgctctaata ctgcatatga tggaacattt 3000
tgcaacaaag atgttggtgc attttttgaa gaagggatgt ggctacgata taactttcag 3060
gcaccagcaa caaatgccag agactccagc agcagagtag acaacgctcc cgaccagcag 3120
aactcccacc cggacctggc acaggaggag atccgcttca gcttcagcac caccaaggcg 3180
ccctgcattc tcctctacat cagctccttc accacagact tcttggcagt cctcgtcaaa 3240
cccactggaa gcttacagat tcgatacaac ctgggtggca cccgagagcc atacaatatt 3300
gacgtagacc acaggaacat ggccaatgga cagccccaca gtgtcaacat cacccgccac 3360
gagaagacca tctttctcaa gctcgatcat tatccttctg tgagttacca tctgccaagt 3420
tcatccgaca ccctcttcaa ttctcccaag tcgctctttc tgggaaaagt tatagaaaca 3480
gggaaaattg accaagagat tcacaaatac aacaccccag gattcactgg ttgcctctcc 3540
agagtccagt tcaaccagat cgcccctctc aaggccgcct tgaggcagac aaacgcctcg 3600
gctcacgtcc acatccaggg cgagctggtg gagtccaact gcggggcctc gccgctgacc 3660
ctctccccca tgtcgtccgc caccgacccc tggcacctgg atcacctgga ttcagccagt 3720
gcggattttc catataatcc aggacaaggc caagctataa gaaatggagt caacagaaac 3780
tcggctatca ttggaggcgt cattgctgtg gtgattttca ccatcctgtg caccctggtc 3840
ttcctgatcc ggtacatgtt ccgccacaag ggcacctacc ataccaacga agcaaagggg 3900
gcggagtcgg cagagagcgc ggacgccgcc atcatgaaca acgaccccaa cttcacagag 3960
accattgatg aaagcaaaaa ggaatggctc atttga 3996
<210> 6
<211> 2826
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggcttccc cgcggagctc cgggcagccc gggccgccgc cgccgccgcc accgccgccc 60
gcgcgcctgc tactgctact gctgctgccg ctgctgctgc ctctggcgcc cggggcctgg 120
ggctgggcgc ggggcgcccc ccggccgccg cccagcagcc cgccgctctc catcatgggc 180
ctcatgccgc tcaccaagga ggtggccaag ggcagcatcg ggcgcggtgt gctccccgcc 240
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ctgcggctct atgacacgga gtgcgacaac gcaaaagggt tgaaagcctt ctacgatgca 360
ataaaatacg ggcctaacca cttgatggtg tttggaggcg tctgtccatc cgtcacatcc 420
atcattgcag agtccctcca aggctggaat ctggtgcagc tttcttttgc tgcaaccacg 480
cctgttctag ccgataagaa aaaataccct tatttctttc ggaccgtccc atcagacaat 540
gcggtgaatc cagccattct gaagttgctc aagcactacc agtggaagcg cgtgggcacg 600
ctgacgcaag acgttcagag gttctctgag gtgcggaatg acctgactgg agttctgtat 660
ggcgaggaca ttgagatttc agacaccgag agcttctcca acgatccctg taccagtgtc 720
aaaaagctga aggggaatga tgtgcggatc atccttggcc agtttgacca gaatatggca 780
gcaaaagtgt tctgttgtgc atacgaggag aacatgtatg gtagtaaata tcagtggatc 840
attccgggct ggtacgagcc ttcttggtgg gagcaggtgc acacggaagc caactcatcc 900
cgctgcctcc ggaagaatct gcttgctgcc atggagggct acattggcgt ggatttcgag 960
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accgtgggct acacgaccgc ttttggggcc atgtttgcaa agacctggag agtccacgcc 1740
atcttcaaaa atgtgaaaat gaagaagaag atcatcaagg accagaaact gcttgtgatc 1800
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ctgcgaagga cagtggagaa gtacagcatg gagccggacc cagcaggacg ggatatctcc 1920
atccgccctc tcctggagca ctgtgagaac acccatatga ccatctggct tggcatcgtc 1980
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atcatgtgca tcatcggggc cgctgtctcc ttcctgaccc gggaccagcc caatgtgcag 2160
ttctgcatcg tggctctggt catcatcttc tgcagcacca tcaccctctg cctggtattc 2220
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cacgcctacc tcccatccat cggaggcgtg gacgccagct gtgtcagccc ctgcgtcagc 2760
cccaccgcca gcccccgcca cagacatgtg ccaccctcct tccgagtcat ggtctcgggc 2820
ctgtaa 2826

Claims (6)

1.一种用于检测自身免疫性脑炎的试剂盒，其特征在于，包括用于与抗NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2和GABABR的自身抗体组合物发生反应的抗原组合；
所述抗原组合通过以下方法制备得到：
制备质粒：构建含有NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2和GABABR基因的质粒，NMDAR基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；AMPA1基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；AMPA2基因的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；LGI1基因的碱基序列如SEQ ID NO:4所示；CASPR2基因的碱基序列如SEQ ID NO:5所示；GABABR基因的碱基序列如SEQ ID NO:6所示；
制备细胞：将所述质粒转染到细胞中，使细胞表达所述抗原组合，即得。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
固定相，所述固定相上结合有所述抗原组合；以及
第二抗体，所述第二抗体可与所述自身抗体结合。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述固定相通过以下方法制备得到：
将所述细胞固定于玻片上，即得。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗体上连接有标记物，所述标记物选自：荧光素或酶。
5.权利要求1-4中任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
固定相的制备：制备用于与权利要求1所述的自身抗体组合物发生反应的抗原组合，将所述抗原组合固定于固定相上；
第二抗体制备：将可与所述自身抗体结合的第二抗体与标记物连接，即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述固定相通过以下方法制备得到：
制备质粒：分别构建含有NMDAR、AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2或GABABR基因的质粒；
制备细胞：将所述质粒转染到细胞中，使细胞表达所述抗原组合；
制备固定相：将所述细胞固定于玻片上，即得。
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