CN117723758A - 检测抗slc3a2自身抗体的试剂在诊断神经系统自身免疫疾病中的应用 - Google Patents
检测抗slc3a2自身抗体的试剂在诊断神经系统自身免疫疾病中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及检测抗SLC3A2自身抗体的试剂在诊断神经系统自身免疫疾病中的应用。本发明对比患有神经系统自身免疫疾病的患者血清和健康人血清，发现存在于患者血清而不存在于健康人血清的信号：识别SLC3A2抗原的自身抗体，并通过检测神经系统疾病患者血清和健康人血清，发现健康人均为抗SLC3A2自身抗体阴性，部分神经系统疾病患者抗SLC3A2自身抗体阳性，确定了抗SLC3A2自身抗体可以作为诊断神经系统自身免疫疾病的标志物，丰富了鉴别神经系统自身免疫疾病生物标志物，提高神经系统自身免疫疾病的诊断的准确性，尤其是能实现神经系统自身免疫疾病的辅助诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及检测抗SLC3A2自身抗体的试剂在诊断神经系统自身免疫疾病中的应用。
背景技术
神经系统自身免疫性疾病是以自身免疫细胞、免疫分子等攻击神经系统为主要致病机制的自身免疫性疾病，具有免疫疾病的复杂性和神经系统疾病的高致死、致残性的特点，因而受到临床医师和研究者的高度关注。神经系统自身免疫性疾病可发生在中枢神经系统、周围神经系统及神经-肌肉接头处，常见的神经系统自身免疫性疾病包括：自身免疫性脑炎(autoimmune encephalitis，AE)、中枢神经系统脱髓鞘疾病、僵人综合征(stiffperson syndrome，SPS)、免疫介导性周围神经病、自身免疫性小脑共济失调、肌无力综合征等。在免疫反应中，作用于神经系统自身抗原的致病抗体统称为神经系统自身抗体。近年来，随着对于神经系统自身抗体认知的扩展及检测技术的进步，越来越多的神经系统自身免疫性疾病被确诊。自身抗体是自身免性疾病的重要标志，每种自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体谱，患者血清中存在高效价自身抗体是自身免疫性疾病的特点之一，也是临床诊断的重要依据。测定自身抗体有助于自身免疫疾病的诊断，对判断疾病的活动程度、观察治疗效果、指导临床用药具有重要的临床意义。
溶质转运蛋白是细胞内数量最多的一类转运蛋白，能够转运包括核酸、氨基酸、糖类、离子、矿物质、药物等物质，是调节和控制细胞内外物质转运的重要通道。其家族成员SLC3A2(solute carrier family 3 member 2)又被称为CD98、FRP1或4F2hc，是一种来自SLC3家族的Ⅱ型跨膜糖蛋白，由529个氨基酸组成，SLC3A2的胞质区是β1/β3整合素的共受体，与β1/β3整合素胞质区的一段高度保守的羧基末端的结构域相结合，从而对其下游信号通路进行重要调控。现有技术(Methods usinganti-SLC3A2 autoantibodies and SLC3A2for detection of glioma brain tμmor frompatient serμm，申请号：PCT/TR2021/051501，公开号：WO2022139775A1)在神经胶质瘤患者血清中发现抗SLC(特别是抗SLC3A2)自身抗体以及与该抗体相互作用的突变体，异构体或修饰的SLC自身抗原的相互作用，提供了具有高灵敏度和特异性的神经胶质瘤诊断方案。但是针对抗SLC3A2自身抗体在神经系统自身免疫疾病患者中的存在情况未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供检测抗SLC3A2自身抗体的试剂在诊断神经系统自身免疫疾病中的应用，特异性诊断神经系统自身免疫疾病，提高神经系统自身免疫疾病的诊断的准确性，尤其是实现神经系统自身免疫疾病的辅助诊断。
本发明提供了检测抗SLC3A2自身抗体的试剂在制备诊断神经系统自身免疫疾病的产品中的应用。
优选的，所述检测抗SLC3A2自身抗体的试剂包括SLC3A2蛋白、SLC3A2蛋白的同系物、SLC3A2蛋白的衍生物、表达SLC3A2蛋白的细胞、表达SLC3A2蛋白的载体和含SLC3A2蛋白的组织中的一种或多种。
优选的，所述SLC3A2蛋白的氨基酸序列包括a)～c)中的任意一种：
a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的10％～80％，并且可以识别抗SLC3A2自身抗体的氨基酸序列；
c)a)或b)中的氨基酸序列经修饰或突变后，并且可以识别抗SLC3A2自身抗体的氨基酸序列。
优选的，所述b)中SLC3A2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述神经系统自身免疫疾病的症状包括恶心，呕吐，复视，头痛，乏力，视力下降，肌肉痉挛、四肢瘫痪，膀胱直肠功能障碍，认知功能障碍，意识障碍，睡眠障碍和运动障碍中的一种或多种。
优选的，所述神经系统自身免疫疾病为中枢神经系统脱髓鞘疾病和/或自身免疫性脑炎。
优选的，所述中枢神经系统脱髓鞘疾病为视神经脊髓炎。
本发明还提供了一种诊断神经系统自身免疫疾病的试剂盒，包括检测抗SLC3A2自身抗体的试剂和标记抗体。
优选的，所述检测抗SLC3A2自身抗体的试剂包括SLC3A2蛋白、SLC3A2蛋白的同系物、SLC3A2蛋白的衍生物、表达SLC3A2蛋白的细胞、表达SLC3A2蛋白的载体和含SLC3A2蛋白的组织中的一种或多种。
优选的，所述SLC3A2蛋白的氨基酸序列包括a)～c)中的任意一种：
a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的10％～80％，并且可以识别抗SLC3A2自身抗体的氨基酸序列；
c)a)或b)中的氨基酸序列经修饰或突变后，并且可以识别抗SLC3A2自身抗体的氨基酸序列。
有益效果
本发明用患有神经系统自身免疫疾病的患者血清和健康人血清孵育大鼠脑组织切片，通过荧光二抗放大信号，并与神经元特异性Marker抗体共染的方式，发现相比健康人血清，患者血清中存在自身抗体，通过免疫共沉淀及质谱鉴定方式筛选出患者血清上的信号为识别SLC3A2抗原的自身抗体，通过血清中和实验验证目标抗原真实性，并且通过将患者血清与过表达目标抗原细胞孵育并对血清有效抗体成分进行回收的方式，制备含SLC3A2自身抗体的实验洗脱抗体和不含SLC3A2自身抗体的对照洗脱抗体，孵育过表达细胞爬片、大鼠脑组织切片及细胞毒性实验验证了目标抗原的真实性和特异性，表明SLC3A2蛋白在鼠脑组织、大鼠神经元中均表达且出现明显的信号，SLC3A2可作为神经系统自身免疫疾病相关自身抗体的识别抗原之一，检测抗SLC3A2自身抗体的试剂能够实现神经系统自身免疫疾病的诊断，尤其是能实现神经系统自身免疫疾病的辅助诊断。
本发明还提供了一种诊断神经系统自身免疫疾病的试剂盒，包括检测抗SLC3A2自身抗体的试剂和标记抗体。本发明首次以检测抗SLC3A2自身抗体的试剂为主要成分，建立诊断神经系统自身免疫疾病的试剂盒。利用本发明试剂盒能够定性或定量分析抗SLC3A2自身抗体，操作简便，实现神经系统自身免疫疾病的诊断，尤其是实现神经系统自身免疫疾病的辅助诊断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1患者1血清和正常对照血清在大鼠脑组织切片上的染色结果；
图2为实施例1患者1血清和NeuN抗体在大鼠脑组织切片上的共染结果；
图3为实施例2患者1血清与正常对照血清免疫沉淀结果；
图4为实施例2患者1血清与正常对照血清免疫沉淀物的Western Blot结果；
图5为实施例3中SLC3A2抗体和NeuN抗体在大鼠脑组织切片上的共染结果；
图6为实施例4中GFAP抗体在原代星形胶质细胞和Vimentin抗体/A2B5抗体在原代Müller细胞的染色结果；
图7为实施例4中SLC3A2抗体和GFAP抗体/A2B5抗体在神经胶质细胞上的共染结果；
图8为实施例5患者1血清在神经胶质细胞上中和实验结果；
图9为实施例5血清洗脱样品在过表达SLC3A2细胞爬片上的染色结果；
图10为实施例5血清洗脱样品在大鼠脑组织切片上的染色结果图；
图11为实施例6血清洗脱样品在星形胶质细胞和Müller细胞上的染色结果图；
图12为实施例7患者1血清与SLC3A2抗体在过表达细胞爬片上的共染结果图；
图13为实施例7筛选出的3例SLC3A2阳性患者图。
具体实施方式
本发明提供了检测抗SLC3A2自身抗体的试剂在制备诊断神经系统自身免疫疾病的产品中的应用。
在本发明中，所述检测抗SLC3A2自身抗体的试剂包括SLC3A2蛋白、SLC3A2蛋白的同系物、SLC3A2蛋白的衍生物、表达SLC3A2蛋白的细胞、表达SLC3A2蛋白的载体和含SLC3A2蛋白的组织中的一种或多种，进一步优选为SLC3A2蛋白。本发明所述SLC3A2蛋白的氨基酸序列优选包括a)～c)中的任意一种：a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的10％～80％，并且可以识别抗SLC3A2自身抗体的氨基酸序列；c)a)或b)中的氨基酸序列经修饰或突变后，并且可以识别抗SLC3A2自身抗体的氨基酸序列。本发明所述b)中SLC3A2蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
在本发明中，编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列优选包括Ⅰ)～Ⅲ)中的任意一种：Ⅰ)SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；Ⅱ)SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的10％～80％，并且可编码识别抗SLC3A2自身抗体的氨基酸序列的核苷酸序列；Ⅲ)Ⅰ)或Ⅱ)中的核苷酸序列突变后，并且可编码识别抗SLC3A2自身抗体的氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明SEQ ID NO.1～4的具体序列如下：
SEQ ID NO.1：MELQPPEASIAVVSIPRQLPGSHSEAGVQGLSAGDDSETGSDCVTQAGLQLLASSDPPALASKNAEVTVETGFHHVSQADIEFLTSIDPTASASGSAGITGTMSQDTEVDMKEVELNELEPEKQPMNAASGAAMSLAGAEKNGLVKIKVAEDEAEAAAAAKFTGLSKEELLKVAGSPGWVRTRWALLLLFWLGWLGMLAGAVVIIVRAPRCRELPAQKWWHTGALYRIGDLQAFQGHGAGNLAGLKGRLDYLSSLKVKGLVLGPIHKNQKDDVAQTDLLQIDPNFGSKEDFDSLLQSAKKKSIRVILDLTPNYRGENSWFSTQVDTVATKVKDALEFWLQAGVDGFQVRDIENLKDASSFLAEWQNITKGFSEDRLLIAGTNSSDLQQILSLLESNKDLLLTSSYLSDSGSTGEHTKSLVTQYLNATGNRWCSWSLSQARLLTSFLPAQLLRLYQLMLFTLPGTPVFSYGDEIGLDAAALPGQPMEAPVMLWDESSFPDIPGAVSANMTVKGQSEDPGSLLSLFRRLSDQRSKERSLLHGDFHAFSAGPGLFSYIRHWDQNERFLVVLNFGDVGLSAGLQASDLPASASLPAKADLLLSTQPGREEGSPLELERLKLEPHEGLLLRFPYAA。
SEQ ID NO.2：MELQPPEASIAVVSIPRQLPGSHSEAGVQGLSAGDDSETGSDCVTQAGLQLLASSDPPALASKNAEVTVETGFHHVSQADIEFLTSIDPTASASGSAGITGTMSQDTEVDMKEVELNELEPEKQPMNAASGAAMSLAGAEKNGLVKIKVAEDEAEAAAAAKFTGLSKEELLKVAGSPGWVRTRWALLLLFWLGWLGMLAGAVVIIVRAPRCRELPAQKWWHTGALYRIGDLQAFQGHGAGNLAGLKGRLDYLSSLKVKGLVLGPKDDVAQTDLLQIDPNFGSKEDFDSLLQSAKKKSIRVILDLTPNYRGENSWFSTQVDTVATKVKDALEFWLQAGVDGFQVRDIENLKDASSFLAEWQNITKGFSEDRLLIAGTNSSDLQQILSLLESNKDLLLTSSYLSDSGSTGEHTKSLVTQYLNATGNRWCSWSLSQARLLTSFLPAQLLRLYQLMLFTLPGTPVFSYGDEIGLDAAALPGQPMEAPVMLWDESSFPDIPGAVSANMTVKGQSEDPGSLLSLFRRLSDQRSKERSLLHGDFHAFSAGPGLFSYIRHWDQNERFLVVLNFGDVGLSAGLQASDLPASASLPAKADLLLSTQPGREEGSPLELERLKLEPHEGLLLRFPYAA
SEQ ID NO.3：MELQPPEASIAVVSIPRQLPGSHSEAGVQGLSAGDDSETGSDCVTQAGLQLLASSDPPALASKNAEVTVETGFHHVSQADIEFLTSIDPTASASGSAGITGTMSQDTEVDMKEVELNELEPEKQPMNAASGAAMSLAGAEKNGLVKIKVAEDEAEAAAAAKFTGLSKEELLKVAGSPGWVRTRWALLLLFWLGWLGMLAGAVVIIVRAPRCRELPAQKWWHTGALYRIGDLQAFQGHGAGNLAGLKGRLDYLSSLKVKGLVLGPIHKNQKDDVAQTDLLQIDPNFGSKEDFDSLLQSAKKKSIRVILDLTPNYRGENSWFSTQVDTVATKVKDALEFWLQAGVDGFQVRDIENLKDASSFLAEWQNITKGFSEDRLLIAGTNSSQILSLLESNKDLLLTSSYLSDSGSTGEHTKSLVTQYLNATGNRWCSWSLSQARLLTSFLPAQLLRLYQLMLFTLPGTPVFSYGDEIGLDAAALPGQPMEAPVMLWDESSFPDIPGAVSANMTVKGQSEDPGSLLSLFRRLSDQRSKERSLLHGDFHAFSAGPGLFSYIRHWDQNERFLVVLNFGDVGLSAGLQASDLPASASLPAKADLLLSTQPGREEGSPLELERLKLEPHEGLLLRFPYAA
SEQ ID NO.4：5'-atggagctacagcctcctgaagcctcgatcgccgtcgtgtcgattccgcgccagttgcctggctcacattcggaggctggtgtccagggtctcagcgcgggggacgactcagagacggggtctgactgtgttacccaggctggtcttcaactcttggcctcaagtgatcctcctgccttagcttccaagaatgctgaggttacagtagaaacggggtttcaccatgttagccaggctgatattgaattcctgacctcaattgatccgactgcctcggcctccggaagtgctgggattacaggcaccatgagccaggacaccgaggtggatatgaaggaggtggagctgaatgagttagagcccgagaagcagccgatgaacgcggcgtctggggcggccatgtccctggcgggagccgagaagaatggtctggtgaagatcaaggtggcggaagacgaggcggaggcggcagccgcggctaagttcacgggcctgtccaaggaggagctgctgaaggtggcaggcagccccggctgggtacgcacccgctgggcactgctgctgctcttctggctcggctggctcggcatgcttgctggtgccgtggtcataatcgtgcgagcgccgcgttgtcgcgagctaccggcgcagaagtggtggcacacgggcgccctctaccgcatcggcgaccttcaggccttccagggccacggcgcgggcaacctggcgggtctgaaggggcgtctcgattacctgagctctctgaaggtgaagggccttgtgctgggtccaattcacaagaaccagaaggatgatgtcgctcagactgacttgctgcagatcgaccccaattttggctccaaggaagattttgacagtctcttgcaatcggctaaaaaaaagagcatccgtgtcattctggaccttactcccaactaccggggtgagaactcgtggttctccactcaggttgacactgtggccaccaaggtgaaggatgctctggagttttggctgcaagctggcgtggatgggttccaggttcgggacatagagaatctgaaggatgcatcctcattcttggctgagtggcaaaatatcaccaagggcttcagtgaagacaggctcttgattgcggggactaactcctccgaccttcagcagatcctgagcctactcgaatccaacaaagacttgctgttgactagctcatacctgtctgattctggttctactggggagcatacaaaatccctagtcacacagtatttgaatgccactggcaatcgctggtgcagctggagtttgtctcaggcaaggctcctgacttccttcttgccggctcaacttctccgactctaccagctgatgctcttcaccctgccagggacccctgttttcagctacggggatgagattggcctggatgcagctgcccttcctggacagcctatggaggctccagtcatgctgtgggatgagtccagcttccctgacatcccaggggctgtaagtgccaacatgactgtgaagggccagagtgaagaccctggctccctcctttccttgttccggcggctgagtgaccagcggagtaaggagcgctccctactgcatggggacttccacgcgttctccgctgggcctggactcttctcctatatccgccactgggaccagaatgagcgttttctggtagtgcttaactttggggatgtgggcctctcggctggactgcaggcctccgacctgcctgccagcgccagcctgccagccaaggctgacctcctgctcagcacccagccaggccgtgaggagggctcccctcttgagctggaacgcctgaaactggagcctcacgaagggctgctgctccgcttcccctacgcggcctga-3'。
在本发明中，所述神经系统自身免疫疾病的症状优选包括恶心，呕吐，复视，头痛，乏力，视力下降，肌肉痉挛、四肢瘫痪，膀胱直肠功能障碍，认知功能障碍，意识障碍，睡眠障碍和运动障碍中的一种或多种。本发明所述神经系统自身免疫疾病优选为中枢神经系统脱髓鞘疾病和/或自身免疫性脑炎；所述中枢脱髓鞘疾病优选为视神经脊髓炎。本发明所述产品优选包括试剂盒。本发明所述诊断优选为辅助诊断。
本发明抗SLC3A2自身抗体与神经系统自身免疫疾病密切相关，能够区分神经系统自身免疫疾病和其它自身免疫疾病，抗SLC3A2自身抗体为神经系统自身免疫疾病的诊断提供了依据。本发明以抗SLC3A2自身抗体为标志物，通过检测抗SLC3A2自身抗体，根据检测结果，医生可结合患者的临床症状、生理生化检测指标、疾病标志物检测结果等综合情况，判断患者是否患有本发明所描述的神经系统自身免疫性相关疾病或排除患有另一种神经系统自身免疫性疾病的可能，有助于医生为患者选择一个较有希望的治疗方案或治疗药物。
本发明还提供了一种诊断神经系统自身免疫疾病的试剂盒，包括检测抗SLC3A2自身抗体的试剂和标记抗体。
本发明所述检测抗SLC3A2自身抗体的试剂的相关内容已在上文记载，在此不做赘述。本发明所述试剂盒优选还包括FITC标记的羊抗人IgG抗体、可与过表达SLC3A2细胞爬片特异结合的阳性对照血清或抗体、阴性对照血清、含有表面活性剂的磷酸盐反应缓冲液和含有表面活性剂的磷酸盐样品稀释液中的一种或多种。本发明所述含有表面活性剂的磷酸盐样品稀释液优选包括PBST溶液；所述反应缓冲液优选为PBST溶液。
本发明以检测抗SLC3A2自身抗体的试剂为主要成分，建立诊断神经系统自身免疫疾病的试剂盒，能够定性或定量分析抗SLC3A2自身抗体，从而诊断神经系统自身免疫疾病，尤其具有辅助诊断作用。本发明利用所述试剂盒进行检测时，对采用的检测方式没有严格要求，采用本发明熟知的方式即可，例如CBA、TBA、ELISA、免疫胶体金法、免疫印迹、免疫斑点、膜条法、化学发光、放射免疫法、液相芯片法、侧向层析或流式细胞。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的抗SLC3A2自身抗体在制备诊断神经系统自身免疫疾病的产品中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中的患者血清均为医院赠予，已经经过本人同意，健康受试者血清来自于医院体检中心赠送的健康体检者血清，已经过体检者本人同意，以其中一个患者样本进行的实验为例，对SLC3A2自身抗体的发现过程进行详细描述，该患者信息如下：
患者1：性别女，年龄38岁，无诱因出现双足麻木，并伴有恶心呕吐，视力下降，后逐渐出现双小腿麻木，行走时间长时疲劳明显，遂前来就医。查体：生命体征平稳，血常规及生化正常，甲状腺功能正常，风湿免疫各项指标均正常，否认吸烟、饮酒等不良嗜好，否认毒物接触史，否认遗传病病史。医生怀疑其患有中枢神经系统自身免疫性疾病，将其样本送往检验科，该样本检测中枢神经系统炎性脱髓鞘病变6项(AQP4.MBP、MOG、GFAP、AQP1.Flotillin1/2)抗体阴性。因自身原因回家休息，3个月后逐渐出现腰部麻木感，伴左下肢无力，不能独立行走，需他人搀扶，并伴有大小便困难，脑脊液IgG增高。医生怀疑其患有其他自身免疫性疾病，将其样本送往检验科，该样本检测自身免疫性脑炎6项(包括NMDAR、AMPAR1.AMPAR2.LGI1.CASPR2.GABABR)抗体阴性，副肿瘤14项(包括Ri、Hu、Yo、CV2.Ma2.Amphiphysin、Titin、Ma1.SOX1.Tr、Zic4.PKCγ、Recoverin、GAD65)抗体阴性。后经综合检查诊断该病例患有视神经脊髓炎。
实施例1
免疫荧光法检测样本在大鼠脑组织冰冻切片的荧光信号
1.制备大鼠脑组织冰冻爬片：
选取成年大鼠进行麻醉，待老鼠四肢硬化后打开腹腔，暴露出心尖，从左心尖灌注PBS，以便全身循环；然后取出脑组织，甲醇固定10～30min；将样本移入质量浓度为30wt.％蔗糖溶液中进行脱水，4℃放置至组织块沉底；将少量包埋剂OCT滴加到标本台，置入-20℃冷冻切片机(厂家：LEICA型号：CM1950)的冷冻台，待组织略微发白时用OCT在标本表面涂一薄层，继续冷冻20min，切片获得大鼠脑组织冰冻爬片。
2.血清孵育：
使用PBST将患者1和正常对照血清分别按1：10的体积进行稀释，分别孵育至大鼠脑组织冰冻切片上，室温孵育1h，PBST洗3次，每次5min；加入稀释好的FITC标记的羊抗人二抗(厂家：Jackson货号：109-095-170)，室温孵育30min，PBST洗3次，每次5min，荧光显微镜下观察，发现患者1血清在大鼠脑组织冰冻切片上海马和皮层部位出现阳性信号，正常对照血清在此部位未出现阳性信号(图1)。
3.抗体共染
使用神经元特异性markerNeuN抗体(厂家：武汉三鹰货号：26975-1-AP)对步骤2孵育过患者1血清的爬片进行抗体共染，NeuN抗体1：200稀释，PBST洗3次，每次5min；AlexaFluor 594标记的羊抗兔IgG(厂家：Jackson货号：115-585-144)室温孵育30min，PBST洗3次，每次5min；DAPI对细胞核进行染色，室温染色10min，PBST洗3次，每次5min；显微镜下观察，发现患者1血清染出的信号与NeuN抗体在大鼠脑组织冰冻切片上的信号重叠(图2)，表明患者1血清中抗体所识别的抗原存在于神经元细胞上。
实施例2
原代细胞裂解物的免疫共沉淀和目的抗原的验证与鉴定
1.取6皿大鼠原代神经元细胞，弃上清，PBS洗2遍，0.4wt.％多聚甲醛固定10min，1×HEPES洗3次；使用DMEM将患者1血清和正常对照血清分别1：1000稀释，0.22μm滤膜过滤，分别加入到固定好的原代神经元细胞中，室温孵育2h；取15μLProteinA/G免疫沉淀磁珠(厂家：Selleck)加入到2mL管子中，平衡液洗3遍，用300μL4％BSA封闭2h；将孵育好的细胞置于冰上，弃上清，PBS洗2遍，加入500μL裂解液(以水为溶剂，含有150mM NaCl，1mM EDTA，100mMTris-HCl，0.5％脱氧胆酸钠，1％TritonX-100和0.1％SDS，pH7.5)，收集细胞，加入终浓度为1×的蛋白酶抑制剂，裂解30min，间隔震荡，15000rpm离心30min，取上清，测浓度；将收集的上清加入到处理好的ProteinA/G免疫沉淀磁珠中，4℃过夜旋转孵育；用上述裂解液清洗孵育的磁珠4次，用80μL 2×loading buffer洗脱，收集洗脱液；洗脱液中先加入5×SDS-PAGE loading buffer，再加入终浓度为0.01M的DTT，100℃加热10min，然后再加入终浓度为质量浓度为2wt.％的碘乙酰胺，室温放置30min，即为患者1血清样本和正常对照血清样本的免疫沉淀复合物；将制备好的免疫复合物进行SDS-PAGE电泳后，使用银染试剂盒(厂家：thermo)进行染色，结果表明，在大鼠神经元中，用患者1血清捕获到的免疫沉淀物中检出一种大约40KD～55KD的蛋白质，该蛋白质不存在于类似方法在正常对照血清制备的对照中(图3)。
2.免疫印迹验证
(1)电泳：取步骤1得到的免疫复合物样品进行SDS-PAGE；
(2)转膜：电泳完成后，使用湿法转膜，转膜条件为200mA，90min；
(3)封闭：使用5％的脱脂奶粉室温封闭1h；
(4)血清孵育：使用TBST将患者1血清和正常对照血清分别1：100稀释，室温孵育2h；
(5)洗涤：TBST洗3次，每次5min；
(6)二抗孵育：加入HRP标记的羊抗人IgG二抗(厂家：Jackson)，室温孵育1h；
(7)洗涤：TBST洗3次，每次5min；
(8)显色：加入化学发光液，显色，结果表明用患者1血清在原代神经元细胞中捕获到的免疫沉淀物中存在与患者1血清中自身抗体反应的条带，目的蛋白带处于40KD～55KD之间，而该免疫沉淀物与正常对照血清在40KD～55KD之间不存在反应性条带(图4)，证明患者1血清中存在与神经元蛋白反应的自身抗体。
3.质谱法鉴定目的抗原
切胶回收步骤1在40KD～55KD处条带(图3中箭头位置)，送去诺禾致源生物进行质谱法分析，质谱结果显示切下的胶条内含有SLC3A2蛋白。
实施例3
商业化抗体在大鼠脑组织冰冻切片免疫荧光实验验证目的抗原的表达
使用PBST将商业化SLC3A2抗体1：200稀释(厂家：武汉三鹰货号：15193-1-Ap)，孵育实施例1步骤1中制备的大鼠脑组织冰冻切片，室温孵育1h，PBST洗3次，每次5min；使用1：200稀释的FITC标记的羊抗兔二抗IgG(厂家：Jackson)，室温孵育30min，PBST洗3次，每次5min；使用PBST将NeuN抗体1：200稀释，室温孵育1h，PBST洗3次，每次5min；Alexa Fluor594标记的羊抗鼠IgG(厂家：Jackson)室温孵育30min，PBST洗3次，每次5min；DAPI对细胞核进行染色，室温染色10min，PBST洗3次，每次5min；显微镜下观察，结果发现商业化SLC3A2抗体在大鼠脑组织冰冻切片上的小脑、海马、下丘脑、皮层及延髓部位染出的信号与NeuN抗体的信号重叠(图5)，表明SLC3A2蛋白在神经元细胞上有表达。
实施例4
商业化抗体在在神经胶质细胞上免疫荧光实验验证目的抗原的表达
1.原代神经胶质细胞的分离
(1)原代星形胶质细胞：10％水合氯醛麻醉大鼠，75％酒精浸泡消毒3min，生物安全柜取出大鼠脑组织，在预冷的含有1％BSA的DMEM中；用眼科剪将组织块剪成糜状混合物。加入木瓜蛋白酶，37℃消化处理30min；消化结束后，将细胞移到新的离心管，加入含有1％BSA的DMEM重悬，400g、4℃离心5min，弃上清液，再次加入含有1％BSA的DMEM重悬，200g、4℃离心5min，弃上清液，加入20mL含有10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，按照合适密度种到10cm皿里进行培养一周。细胞传代至铺有细胞爬片的6cm培养皿中，使用1％胎牛血清的DMEM培养基培养24h，备用；
(2)原代Müller细胞：10％水合氯醛麻醉大鼠，75％酒精浸泡消毒3min，生物安全柜取出大鼠脊髓，在预冷的含有1％BSA的DMEM中；用眼科剪将组织块剪成糜状混合物。加入木瓜蛋白酶，37℃消化处理30min；消化结束后，将细胞移到新的离心管，加入含有1％BSA的DMEM重悬，400g、4℃离心5min，弃上清液，再次加入含有1％BSA的DMEM重悬，200g、4℃离心5min，弃上清液，加入20mLNeurobasal培养基重悬细胞。使用培养基(培养基配方：基础培养基Neurobasal(厂家：gibco)+1％B27+10 ng/mLβNGF(厂家：peprotech)+1％谷氨酰胺(厂家：gibco)+1％青链霉素(厂家：gibco))培养1周，更换1％胎牛血清的DMEM培养基培养一周。将细胞传代至铺有细胞爬片的6cm培养皿中，使用1％胎牛血清的DMEM培养基培养24h，备用；
2.原代神经胶质细胞的鉴定
(1)使用星形胶质细胞特异性marker GFAP抗体1：1000稀释(厂家：Invitrogen货号：14-9892-80)，孵育2％多聚甲醛+甘氨酸固定的原代星形胶质细胞，室温孵育1h，PBST洗3次，每次5min；使用DAPI对细胞核进行染色，室温染色10min，PBST洗3次，每次5min；显微镜下观察，发现GFAP抗体在原代星形胶质细胞上染出的信号与DAPI染出的细胞核信号完全重叠上(图6)，表明所分离出的细胞全部为原代星形胶质细胞。
(2)使用Müller细胞特异性marker Vimentin抗体(厂家：武汉三鹰货号：10366-1-AP)，孵育100％乙醇固定的原代Müller细胞，室温孵育1h，PBST洗3次，每次5min；使用DAPI对细胞核进行染色，室温染色10min，PBST洗3次，每次5min；显微镜下观察，发现Vimentin抗体在原代Müller细胞上染出的信号与DAPI染出的细胞核信号完全重叠上(图6)，表明所分离出的细胞全部为原代Müller细胞。
(3)使用A2B5抗体(厂家：美天旎货号：130-093-392)孵育鉴定后的原代Müller活细胞，室温孵育1h，PBST洗3次，每次5min；使用DAPI对细胞核进行染色，室温染色10min，PBST洗3次，每次5min；显微镜下观察，发现A2B5抗体在原代Müller细胞上染出的信号与DAPI染出的细胞核信号重叠(图6)，表明原代Müller细胞上表达A2B5蛋白。
3.活细胞染色
使用PBST将商业化SLC3A2抗体1：100稀释(厂家：武汉三鹰货号：15193-1-Ap)，分别孵育至步骤1培养24h的原代星形胶质细胞和原代Müller细胞，室温孵育1h，PBST洗3次，每次5min；使用1：200稀释的FITC标记的羊抗兔二抗IgG(厂家：Jackson)，室温孵育30min，PBST洗3次，每次5min；
4.抗体共染
使用0.4％多聚甲醛固定步骤2染过SLC3A2抗体的原代星形胶质活细胞和原代Müller活细胞，制备细胞爬片，室温固定10min，PBST洗3次，每次5min；使用PBST将GFAP抗体1：1000稀释(厂家：Invitrogen货号：14-9892-80)，将A2B5抗体1：100稀释(厂家：美天旎货号：130-093-392)，分别孵育至原代星形胶质细胞爬片和原代Müller细胞爬片，4℃过夜孵育，PBST洗3次，每次5min；使用1：200稀释的Alexa Fluor 594标记的羊抗鼠二抗IgG(厂家：Jackson)和1：200稀释的AlexaFluor 594标记的羊抗鼠二抗IgM(厂家：Jackson货号：115-585-075)，分别孵育至原代星形胶质细胞爬片和原代Müller细胞爬片，室温孵育30min，PBST洗3次，每次5min，使用DAPI对细胞核进行染色，室温染色10min，PBST洗3次，每次5min；显微镜下观察，结果表明，商业化SLC3A2抗体染出的信号与GFAP抗体在原代星形胶质细胞上的信号重叠，与A2B5抗体在原代Müller细胞上的信号重叠(图7)，表明SLC3A2蛋白在原代星形胶质细胞和原代Müller细胞上均有表达。
实施例5
血清中和实验及回收血清自身抗体验证患者血清所检信号
1.重组载体的构建
通过PCR或人工合成的方法，将SLC3A2基因(SEQ ID NO.2)通过分子克隆方法连至pCDNA3.1上，插入位点为NheⅠ/NotⅠ，得到重组载体pCDNA3.1-SLC3A2，构建好的重组载体经测序正确后大提备用；
2.血清中和实验
(1)目的基因转染：使用CD05培养基(厂家：奥普迈)于100mL培养瓶中培养293F悬浮细胞20mL，共计2瓶，置于37℃，5％CO2细胞培养摇床中。待细胞密度达到3×106/mL时，使用PEI转染试剂(厂家：thermo，货号：BMS1003)将pCDNA3.1-SLC3A2重组载体和空载pCDNA3.1分别转染至293F细胞中，并进行标记，第二天离心换液；
(2)细胞固定：转染后生长96h的两瓶悬浮细胞分别离心后用PBS洗涤2次，使用5mLPBS重悬，加入无水乙醇固定10min，离心去乙醇，PBS洗涤2次，置于2mL EP管中加入1mLPBS重悬；
(3)血清中和：分别取12μL患者1血清加入到两管固定后的细胞中，4℃孵育过夜，次日离心，孵育过表达SLC3A2悬浮细胞的离心上清标记为中和血清，孵育空载pCDNA3.1悬浮细胞的离心上清标记为对照血清；
(4)免疫荧光实验：使用中和血清和对照血清分别孵育神经胶质活细胞和Müller活细胞(细胞分离和培养参考实施例4)，室温孵育1h，PBST洗3次，每次5min；加入稀释好的FITC标记的羊抗人二抗(厂家：Jackson货号：109-095-170)，室温孵育30min，PBST洗3次，每次5min；显微镜下观察，结果表明，在星形胶质细胞和Müller细胞上，中和血清信号减弱，而对照血清信号依然明显(图8)，表明患者血清被过表达SLC3A2悬浮细胞中和的信号为特异性识别SLC3A2抗原的信号。
3.回收抗体实验
(1)抗体洗脱：将步骤2中血清中和时离心收集的两管细胞用PBS重悬，重复洗4次，每次5min；洗涤结束后，每管加入500μLpH＝3的0.1M甘氨酸洗脱液，室温旋转摇床洗脱15min，洗脱结束后离心收集洗脱液，向洗脱液中加入10μL 1M的Tris中和至洗脱液pH为7.0-8.0，加入1/10体积的PBS，共得到2份500μL洗脱样品，其中一份是患者1血清与过表达SLC3A2细胞结合后的实验洗脱抗体；另一份是患者血清与对照pCDNA3.1结合后的对照洗脱抗体。
(2)过表达SLC3A2细胞爬片和空载pCDNA3.1对照细胞爬片的制备：
DMEM高糖培养基与FBS按9：1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，待293T细胞铺满时按1：5～1：6传代，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中过夜培养；待细胞密度为30％～40％时，将pCDNA3.1-SLC3A2转入细胞中，空载pCDNA3.1操作相同；将生长48h的细胞用PBS洗涤2次，加入丙酮固定5min；丙酮固定后的爬片用PBS洗涤2次，干燥，得到过表达SLC3A2细胞爬片和空载pCDNA3.1对照细胞爬片；
(3)洗脱抗体在过表达细胞片上验证目标抗原
使用步骤(1)中得到的实验洗脱抗体和对照洗脱抗体分别孵育步骤(2)的过表达SLC3A2细胞爬片和空载pCDNA3.1对照细胞爬片，室温孵育1h，PBST洗3次，每次5min；使用1：200稀释的FITC标记的羊抗人IgG，室温孵育30min，PBST洗3次，每次5min；荧光显微镜下观察，结果表明，与过表达SLC3A2悬浮细胞结合的实验洗脱抗体在过表达SLC3A2细胞爬片上有明显阳性信号，而对照洗脱抗体没有(图9)，表明与过表达SLC3A2悬浮细胞结合的实验洗脱抗体可特异性识别过表达细胞爬片上的SLC3A2抗原。
(4)洗脱抗体在大鼠脑组织切片上验证目标抗原
参考实施例1，制备大鼠脑组织冰冻切片，使用步骤(1)得到的实验洗脱抗体和对照洗脱抗体分别孵育大鼠脑组织切片，室温孵育1h，PBST洗3次，每次5min；使用1:200稀释的FITC标记的羊抗人IgG，室温孵育30min，PBST洗3次，每次5min；荧光显微镜下观察，结果表明，实验洗脱抗体在大鼠脑组织切片上有明显阳性信号，而对照洗脱抗体信号很弱(皮层)或没有(海马)(图10)，表明与过表达SLC3A2悬浮细胞结合的实验洗脱抗体可特异识别大鼠脑组织切片上表达的SLC3A2抗原。
实施例6
抗SLC3A2自身抗体在神经胶质细胞上的致病性实验
1.原代神经胶质细胞分离与培养
参考实施例4，分离与培养原代星形胶质细胞和原代Müller细胞，分别将细胞传代至铺有细胞爬片的6cm培养皿中，使用1％胎牛血清的DMEM培养基培养24小时，备用；
2.毒性实验
参考实施例5的步骤制备实验洗脱抗体和对照洗脱抗体，每皿细胞中加入900μLDMEM培养基，再分别加入无菌过滤的100μL实验洗脱抗体作为实验组或100μL对照洗脱抗体作为对照组，分别培养原代星胶细胞或原代Müller细胞24h；
3.活细胞染色
将商业化SLC3A2抗体(厂家：武汉三鹰货号：15193-1-Ap)1：100稀释后，分别孵育至分离出的原代星形胶质细胞和原代Müller细胞，室温孵育1h，PBST洗3次，每次5min；使用1：200稀释的FITC标记的羊抗兔二抗IgG，室温孵育30min，PBST洗3次，每次5min；
4.抗体共染
使用0.4％多聚甲醛固定步骤2染过SLC3A2抗体的原代星形胶质细胞和原代Müller细胞，制备细胞爬片，室温固定10min，PBST洗3次，每次5min；使用PBST将GFAP抗体1：1000稀释(厂家：Invitrogen货号：14-9892-80)，将A2B5抗体1：100稀释(厂家：美天旎货号：130-093-392)，分别孵育至原代星形胶质细胞爬片和原代Müller细胞爬片，4℃过夜孵育，PBST洗3次，每次5min；使用1:200稀释的Alexa Fluor 594标记的羊抗鼠二抗IgG和1：200稀释的Alexa Fluor 594标记的羊抗鼠二抗IgM，分别孵育至星形胶质细胞爬片和Müller细胞爬片，室温孵育30min，PBST洗3次，每次5min，使用DAPI对细胞核进行染色，室温染色10min，PBST洗3次，每次5min；显微镜下观察，结果表明在对照洗脱抗体孵育24h后的原代星形胶质细胞上SLC3A2抗体染出明显信号，并且可与GFAP抗体染出的信号重叠，在对照洗脱抗体孵育24h后的原代Müller细胞上SLC3A2抗体染出明显信号，并且可与A2B5抗体染出的信号重叠，而在实验洗脱抗体孵育24h后的星形胶质细胞和Müller细胞上SLC3A2抗体染出的信号很弱(图11)，表明在实验洗脱抗体作用24h后的原代星形胶质细胞和原代Müller细胞比在对照洗脱抗体作用24h后的两种细胞中SLC3A2蛋白的表达变少，由此可以推断患者1血清中的SLC3A2自身抗体，导致原代星形胶质细胞和原代Müller细胞中SLC3A2蛋白的表达下调，因此可以得出结论：患者1样本中的SLC3A2自身抗体对体外培养的原代星形胶质细胞和原代Müller细胞具有致病性。
实施例7
抗SLC3A2自身抗体在疑似神经系统自身免疫疾病样本的检出率
1.参照实施例5的步骤制备过表达SLC3A2细胞爬片和空载pCDNA3.1对照细胞爬片；
2.免疫荧光染色
(1)血清孵育：使用PBST将患者1的血清稀释10倍，分别加至步骤1获得的过表达SLC3A2细胞爬片和空载pCDNA3.1对照细胞爬片，室温孵育1h；PBST洗3次，每次5min；加入FITC标记的羊抗人IgG二抗，室温孵育1h；PBST洗3次，每次5min；
(2)抗体共染：使用PBST将商业化SLC3A2抗体1：100稀释后分别加至过表达SLC3A2细胞爬片和空载pCDNA3.1对照细胞爬片上，室温孵育1h；PBST洗3次，每次5min；加入AlexaFluor 594标记的羊抗兔IgG，室温孵育1h；PBST洗3次，每次5min；显微镜下观察，结果表明患者1血清在过表达SLC3A2细胞爬片上出现的染色信号与商业化SLC3A2抗体在过表达SLC3A2细胞爬片上出现的染色信号重叠(图12)，表明患者1血清中抗体与过表达SLC3A2细胞爬片上的SLC3A2蛋白特异性识别。
3.选取3013例具有神经系统疾病患者样本，这些患者表现出的症状有：疑似脑炎、副肿瘤综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、周围神经病。参照步骤2，使用过表达SLC3A2的细胞爬片和空载pCDNA3.1对照细胞爬片进行检测，筛选SLC3A2自身抗体阳性血清样本，共筛选出23例SLC3A2自身抗体阳性样本，部分患者结果如图13所示。抗SLC3A2自身抗体的检出率为0.7633％，并且经临床医生确诊，检出23例抗SLC3A2抗体的患者患有视神经脊髓炎，其中2例视神经脊髓炎患者合并自免脑炎疾病。本发明为实现视神经脊髓炎的诊断提供了待测的与自身抗体结合的新抗原，抗SLC3A2自身抗体可在患有神经系统症状的患者中检出，说明该抗体对神经系统自身免疫疾病的诊断具有辅助作用。
实施例8
基于细胞的免疫荧光法验证抗SLC3A2自身抗体的特异性
选取50例(其中anti-Hu+4例、anti-Ri+5例、anti-CV2+4例、anti-Yo+4例、anti-GAD65+4例、anti-NMDAR+6例、anti-GABABR+4例、anti-CASPR2+3例、anti-LGI1+3例、anti-AQP4+5例、anti-MBP+3例、anti-MOG+5例)患有神经系统自身免疫疾病患者血清和50例健康对照的血清，使用实施例7中制备好的过表达SLC3A2的细胞爬片进行免疫荧光检测，具体操作步骤参考实施例7，免疫荧光结果显示，所选取的50例神经系统自身免疫病患者和50例健康对照的血清均不与过表达SLC3A2细胞爬片产生类似于实施例7中筛出的23例患者血清相似的细胞形态。
实施例9
SLC3A2突变体检测患者血清中的SLC3A2自身抗体
本实施例选择人SLC3A2基因的2个突变体，即缺失了SLC3A2蛋白的第265-269位氨基酸的突变体(SEQ ID NO.3)和缺失了SLC3A2蛋白的第385-387位氨基酸的突变体(SEQ IDNO.4)，按照实施例2记载的步骤进行载体构建、制备过表达重组SLC3A2缺失突变体的细胞爬片以及对患者血清进行检测，结果显示，SLC3A2的缺失突变体仍能识别患者血清中的抗SLC3A2抗体。
根据上述实施例可以看出，抗SLC3A2自身抗体可以作为诊断神经系统自身免疫疾病的生物标志物，通过检测抗SLC3A2自身抗体能够实现神经系统自身免疫疾病的诊断和筛查，尤其是能够实现神经系统自身免疫疾病的辅助诊断。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.检测抗SLC3A2自身抗体的试剂在制备诊断神经系统自身免疫疾病的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测抗SLC3A2自身抗体的试剂包括SLC3A2蛋白、SLC3A2蛋白的同系物、SLC3A2蛋白的衍生物、表达SLC3A2蛋白的细胞、表达SLC3A2蛋白的载体和含SLC3A2蛋白的组织中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述SLC3A2蛋白的氨基酸序列包括a)～c)中的任意一种：
a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的10％～80％，并且可以识别抗SLC3A2自身抗体的氨基酸序列；
c)a)或b)中的氨基酸序列经修饰或突变后，并且可以识别抗SLC3A2自身抗体的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述b)中SLC3A2蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神经系统自身免疫疾病的症状包括恶心，呕吐，复视，头痛，乏力，视力下降，肌肉痉挛、四肢瘫痪，膀胱直肠功能障碍，认知功能障碍，意识障碍，睡眠障碍和运动障碍中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述神经系统自身免疫疾病为中枢神经系统脱髓鞘疾病和/或自身免疫性脑炎。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述中枢神经系统脱髓鞘疾病为视神经脊髓炎。
8.一种诊断神经系统自身免疫疾病的试剂盒，其特征在于，包括检测抗SLC3A2自身抗体的试剂和标记抗体。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗SLC3A2自身抗体的试剂包括SLC3A2蛋白、SLC3A2蛋白的同系物、SLC3A2蛋白的衍生物、表达SLC3A2蛋白的细胞、表达SLC3A2蛋白的载体和含SLC3A2蛋白的组织中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述SLC3A2蛋白的氨基酸序列包括a)～c)中的任意一种：
a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的10％～80％，并且可以识别抗SLC3A2自身抗体的氨基酸序列；
c)a)或b)中的氨基酸序列经修饰或突变后，并且可以识别抗SLC3A2自身抗体的氨基酸序列。
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| CN202311719530.7A CN117723758A (zh) | 2023-12-14 | 2023-12-14 | 检测抗slc3a2自身抗体的试剂在诊断神经系统自身免疫疾病中的应用 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311719530.7A CN117723758A (zh) | 2023-12-14 | 2023-12-14 | 检测抗slc3a2自身抗体的试剂在诊断神经系统自身免疫疾病中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117723758A true CN117723758A (zh) | 2024-03-19 |
Family
ID=90204629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311719530.7A Pending CN117723758A (zh) | 2023-12-14 | 2023-12-14 | 检测抗slc3a2自身抗体的试剂在诊断神经系统自身免疫疾病中的应用 |
Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN117723758A (zh) |
-
2023
- 2023-12-14 CN CN202311719530.7A patent/CN117723758A/zh active Pending
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