CN116183930A - 抗insrr抗体在制备检测和/或诊断神经系统相关疾病的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗INSRR抗体在制备检测和/或诊断神经系统相关疾病的产品中的应用，本发明首次对比神经系统疾病患者血清和对照血清在脑组织上的信号，发现存在于患者血清而不存在于对照血清的信号，提示患者血清可能存在某种抗体，通过检测神经系统疾病患者血清和对照血清和脑脊液，发现对照均为抗INSRR抗体阴性，大部分神经系统疾病患者为抗INSRR抗体阳性，确定了抗INSRR抗体为检测和/或诊断神经系统相关疾病的标志物，以INSRR为检测抗原，检测抗INSRR抗体的表达能够检测神经系统疾病，丰富了鉴别神经系统相关疾病生物标志物，提高神经系统相关疾病的检测和/或诊断的准确性。

Description

抗INSRR抗体在制备检测和/或诊断神经系统相关疾病的产品 中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种自身免疫系统疾病标志物抗INSRR自身抗体及其产品和应用。

背景技术

神经系统自身免疫性疾病是神经病学领域中的一大类重要疾病，可发生在中枢神经系统、周围神经系统及神经-肌肉接头处，其病理机制主要是自身免疫因子及自身免疫抗体攻击神经系统。神经系统自身免疫性疾病较为罕见，具有免疫疾病的复杂性和神经系统疾病的高致死、致残性的特点，因而受到临床医师和研究者的高度关注。对于患有神经系统自身免疫疾病的患者来说，早期的诊断和治疗极为重要，疾病的确诊及合适的治疗方案在大多数时候会改善患者的病情，甚至会让患者痊愈。但是，目前为止，对于神经性自身免疫病的诊断通常比较困难，需要将临床信息和实验室数据结合起来以辅助疾病的早期诊断。在实验室的获取的数据中，神经系统自身抗体有助于疾病诊断。

通过检测患者样本中的自身抗体：(1)可区分具有神经系统疾病症状的患者是否为自身免疫性神经系统疾病；(2)医生可结合患者的临床症状、生理生化检测指标、疾病标志物检测结果等综合情况，判断患者是否患有某一种神经系统自身免疫性相关疾病或排除患有另一种神经系统自身免疫性疾病的可能；(3)有助于医生为患者选择一个较有希望的治疗方案或治疗药物。

胰岛素受体相关受体(Insulin receptor related receptor，简写为INSRR或IRR)是胰岛素受体酪氨酸激酶家族的一员，在脑、胃、胰腺和心脏组织中均有表达。IRR是作为单一多肽前体合成的，成熟时，两种单体在细胞外部分的近膜区发生蛋白质水解，产生α和β亚基，IRα和IRβ形成异四聚体。在神经系统中，IRR mRNA存在于感觉和交感神经元中，IRR与神经生长因子(NGF)酪氨酸激酶受体TrkA共表达，另有证据表明IRR在前脑胆碱能神经元中表达，此外，在成神经细胞瘤中也检测到IRR，IRR表达与成神经细胞瘤的良好预后显著相关。根据Allen脑图谱(http://mouse.brain-map.org)，IRR在丘脑区域即在PVT区域的表达最高，PVT区域有助于调节行为、压力、动机、情绪和食欲，解剖学数据也显示PVT从参与内脏或内稳态功能的神经元传递信息。

目前，针对INSRR自身抗体在神经系统自身免疫疾病患者中的存在情况未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供抗INSRR抗体作为标志物制备检测和/或诊断神经系统相关疾病的产品的应用，特异性检测和/或诊断神经系统相关疾病，提高神经系统相关疾病的检测和/或诊断的准确性。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了抗INSRR抗体作为标志物在制备检测和/或诊断神经系统相关疾病的产品中的应用。

本发明还提供了检测抗INSRR抗体的试剂在制备检测和/或诊断神经系统相关疾病的产品中的应用。

在本发明中，所述产品优选包括试剂盒。本发明所述神经系统相关疾病的症状优选包括肌肉无力、肌肉疼痛、表情淡漠、呼吸肌麻痹、、呼吸困难、吞咽困难、构音障碍、肢体麻木或感觉缺失、肢体瘫痪、自主神经功能障碍、劳动能力丧失、行为异常、共济失调中的一种或多种表现；所述神经系统相关疾病优选包括重症肌无力、副肿瘤综合征。用于检测本发明所述神经系统相关疾病的样本优选包括全血、血清和脑脊液的一种或多种。

本发明抗INSRR自身抗体与神经系统自身免疫疾病密切相关，区分神经系统自身免疫疾病和其它自身免疫疾病，抗INSRR自身抗体为患者神经系统疾病的诊断提供了依据。

本发明还提供了一种检测神经系统相关疾病的试剂盒，包括检测抗INSRR抗体的试剂、固相载体和标记抗体。

在本发明中，所述检测抗INSRR抗体的试剂优选包括INSRR蛋白、表达INSRR蛋白的细胞、表达INSRR蛋白的组织和含有INSRR蛋白的裂解物中的一种或多种。

所述INSRR蛋白的氨基酸序列优选包括a)～c)中的任意一种：

a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

b)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的10％～80％；

优选为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，并且可以识别INSRR自身抗体的氨基酸序列；

c)a)或b)中的氨基酸序列经修饰或突变后，可以识别INSRR自身抗体的氨基酸序列；

所述修饰优选包括糖基化、磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化中的一种或多种。

在本发明中，编码如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列优选包括Ⅰ)～Ⅲ)中的任意一种：

Ⅰ)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

Ⅱ)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的10％～80％；

优选为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，并且可表达识别INSRR自身抗体的氨基酸序列；

Ⅲ)Ⅰ)或Ⅱ)中的核苷酸序列突变后，并且可表达识别INSRR自身抗体的氨基酸序列。

本发明SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的具体序列如下：

SEQ ID NO.1：

MAVPSLWPWGACLPVIFLSLGFGLDTVEVCPSLDIRSEVAELRQLENCSVVEGHLQILLMFTATGEDFRGLSFPRLTQVTDYLLLFRVYGLESLRDLFPNLAVIRGTRLFLGYALVIFEMPHLRDVALPALGAVLRGAVRVEKNQELCHLSTIDWGLLQPAPGANHIVGNKLGEECADVCPGVLGAAGEPCAKTTFSGHTDYRCWTSSHCQRVCPCPHGMACTARGECCHTECLGGCSQPEDPRACVACRHLYFQGACLWACPPGTYQYESWRCVTAERCASLHSVPGRASTFGIHQGSCLAQCPSGFTRNSSSIFCHKCEGLCPKECKVGTKTIDSIQAAQDLVGCTHVEGSLILNLRQGYNLEPQLQHSLGLVETITGFLKIKHSFALVSLGFFKNLKLIRGDAMVDGNYTLYVLDNQNLQQLGSWVAAGLTIPVGKIYFAFNPRLCLEHIYRLEEVTGTRGRQNKAEINPRTNGDRAACQTRTLRFVSNVTEADRILLRWERYEPLEARDLLSFIVYYKESPFQNATEHVGPDACGTQSWNLLDVELPLSRTQEPGVTLASLKPWTQYAVFVRAITLTTEEDSPHQGAQSPIVYLRTLPAAPTVPQDVISTSNSSSHLLVRWKPPTQRNGNLTYYLVLWQRLAEDGDLYLNDYCHRGLRLPTSNNDPRFDGEDGDPEAEMESDCCPCQHPPPGQVLPPLEAQEASFQKKFENFLHNAITIPISPWKVTSINKSPQRDSGRHRRAAGPLRLGGNSSDFEIQEDKVPRERAVLSGLRHFTEYRIDIHACNHAAHTVGCSAATFVFARTMPHREADGIPGKVAWEASSKNSVLLRWLEPPDPNGLILKYEIKYRRLGEEATVLCVSRLRYAKFGGVHLALLPPGNYSARVRATSLAGNGSWTDSVAFYILGPEEEDAGGLHVLLTATPVGLTLLIVLAALGFFYGKKRNRTLYASVNPEYFSASDMYVPDEWEVPREQISIIRELGQGSFGMVYEGLARGLEAGEESTPVALKTVNELASPRECIEFLKEASVMKAFKCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSHLRSLRPEAENNPGLPQPALGEMIQMAGEIADGMAYLAANKFVHRDLAARNCMVSQDFTVKIGDFGMTRDVYETDYYRKGGKGLLPVRWMAPESLKDGIFTTHSDVWSFGVVLWEIVTLAEQPYQGLSNEQVLKFVMDGGVLEELEGCPLQLQELMSRCWQPNPRLRPSFTHILDSIQEELRPSFRLLSFYYSPECRGARGSLPTTDAEPDSSPTPRDCSPQNGGPGH

SEQ ID NO.2：

atggcagtgcctagtctgtggccctggggagcatgcctgcctgtgatcttcctctccttgggatttggcctggatacagtagaggtgtgccccagcctggatattcgctcagaggtggcagagcttcgtcagctggagaactgcagcgtggtggagggccacctgcagatcctgctcatgttcacagccaccggggaggacttccgcggcctcagcttccctcgcctcacccaggtcaccgactacctgctgctcttccgtgtctacggactggagagcctgcgcgacctcttccccaacctagcagtcatccgcgggacgcgcctcttcctgggctatgcactggtcatctttgagatgccacatctgcgtgacgtggcactgcctgcacttggggccgtgctgcgtggggctgtgcgtgtggagaagaaccaggagctctgccacctctccaccattgactggggactgctgcagccagcacctggcgccaaccacatcgtgggcaacaagctgggcgaggagtgtgctgacgtgtgccctggtgtgctgggtgctgctggtgagccctgtgccaagaccaccttcagcgggcacactgactacagatgctggacctccagccactgccagagagtgtgcccctgcccccatgggatggcttgcacagcgaggggcgagtgctgccacaccgaatgcctggggggctgcagccagccagaagaccctcgtgcctgtgtagcttgccgccacctctacttccagggtgcctgcctgtgggcctgcccgccaggcacctaccagtatgagtcctggcgctgtgtcacagctgagcgctgtgccagcctgcactctgtgcccggccgtgcctccaccttcggcatacaccagggcagttgcctggcccagtgcccttctggcttcacccgtaatagcagcagcatattctgccacaagtgcgaggggctgtgccctaaagagtgcaaggtaggcaccaagaccatcgactccatccaggcggcacaggatcttgtgggctgcacgcatgtggagggaagcctcatcctcaaccttcgccagggctacaacctggagccacagctgcagcacagcctggggctggtagaaaccattactggcttcctcaaaatcaagcactcctttgccctcgtgtccctgggctttttcaagaacctcaaactaatccggggagacgccatggtggatgggaactacactctctacgtgctggacaaccagaacctacaacagctagggtcctgggtggccgcggggctcaccattcccgtgggcaagatctacttcgccttcaacccgcgcctctgcttggaacacatctaccgactggaggaggtgacaggcacgcgaggtcggcagaacaaggctgagatcaacccccgcaccaacggagaccgcgccgcctgccagactcgcaccctgcgcttcgtgtccaacgtgacggaggcagaccgcatcctgctacgctgggagcgctatgagccactggaggcccgcgacctgctcagcttcatcgtgtactacaaggagtccccattccagaacgccacagagcacgtgggtccagatgcttgtggaacccagagctggaacctgctggatgtggagctgcccctaagccgcacccaggagccaggggtgaccctagcctccctcaagccttggacacagtacgcagtgtttgtgcgggccatcacgctaaccactgaggaggacagccctcatcaaggagcccagagtcccatcgtctacctccgaacgctgcctgcagctcccacggtgccccaagacgtcatctccacgtccaactcctcctcccacctcctggtgcgctggaagccaccgacccagcgcaatgggaacctcacctactacctggtgctgtggcagcggctggcagaggacggcgacctctacctcaatgactactgccaccgcggcttgcggctgcccaccagcaacaacgatccgcgcttcgacggcgaagacggggatcctgaggccgagatggagtccgactgctgcccttgccagcacccacctcctggtcaggttctgcccccgctggaggcgcaagaggcctcgttccagaagaagtttgaaaactttctacacaacgcgatcaccatccccatatccccttggaaggtgacgtccatcaacaagagcccccaaagggactcagggcggcaccgccgggcagctgggcccctccggctggggggcaacagctcggatttcgagatccaggaggacaaggtgccccgtgagcgagcggtgctgagcggcctgcgccacttcacggaataccggatcgacatccatgcctgcaaccacgcggcgcacaccgtgggctgcagcgccgccaccttcgtctttgcgcgcaccatgccccacagagaggctgatggtattccaggaaaggtggcctgggaggcctccagcaagaacagtgtccttctgcgctggctcgagccaccagaccccaacggactcatcctcaagtacgaaatcaagtaccgccgcttgggagaggaggccacagtgctgtgtgtgtcccgtcttcgatatgcgaagtttgggggagtccacctggccctgctgccccctggaaactactctgccagggttagggcaacctcactggctggcaatggctcttggacagacagtgttgccttctacatccttggcccagaggaggaggatgctggggggctgcatgtcctcctcactgccacccctgtggggctcacgctgctcatcgttcttgctgcccttggtttcttctacggcaagaagagaaacagaaccctgtatgcttctgtgaatccagagtacttcagcgcctctgatatgtatgtccctgatgaatgggaggtgcctcgggagcagatctcgataatccgggaactgggccagggctcttttgggatggtatatgaggggctggcacgaggacttgaggctggagaggagtccacacccgtggccctgaagacggtgaatgagctggccagcccacgggaatgcattgagttcctcaaggaagcttctgtcatgaaagccttcaagtgtcaccatgtggtgcgtctcctgggtgtggtatctcagggccagccaactctggtcatcatggagttaatgacccgtggggacctcaagagccatcttcgatctttgcggcctgaggcagagaacaaccctgggctcccacagccagcattgggggaaatgatccaaatggctggtgagattgcagacggcatggcctaccttgctgccaacaagtttgtgcaccgagatctagcagcccgcaactgcatggtgtcccaggacttcaccgtcaagatcggggacttcgggatgactcgggacgtgtatgagacagactattaccgcaagggtgggaaggggctgctgcccgtgcgctggatggcccccgagtccctcaaagatgggatcttcaccacccactcggatgtctggtcctttggcgtggtactctgggagattgtgaccctggcagaacaaccctaccagggcctgtccaatgagcaggtgctgaagttcgtcatggatggcggggtcctggaggagctggagggctgtccccttcagctgcaggagctgatgagccgctgctggcagccgaacccacgcctgcgcccatctttcacacacattctggacagcatacaggaggagctgcggccctccttccgcctcctctccttctactacagcccggaatgccggggggcccggggctccctgcctaccaccgatgcagagcctgactcctcacccactccaagagactgcagccctcaaaatgggggtccagggcactga

在本发明中，所述INSRR蛋白优选通过编码INSRR蛋白的基因插入出发载体，将获得的重组载体转入表达系统中表达，纯化后获得。

本发明对所述出发载体的类型没有严格要求，常规选择即可；

所述表达系统优选包括原核表达系统，酵母表达系统，杆状病毒表达系统或哺乳动物细胞表达系统；

所述纯化优选包括亲和层析、分子筛层析、离子交换层析或疏水层析；

本发明对所述纯化的具体方式没有严格要求，常规选择即可。

在本发明中，所述表达INSRR蛋白的组织优选为哺乳动物组织，所述哺乳动物优选包括人、灵长类动物或鼠，所述组织优选包括脑组织；所述表达INSRR蛋白的细胞优选包括表达INSRR蛋白的神经元细胞、HEK293、Hela和CHO细胞；所述的含有INSRR蛋白的裂解物优选包括哺乳动物的神经元细胞、过表达细胞括组织的裂解物，所述哺乳动物优选包括人、灵长类动物或鼠，所述组织优选包括脑组织。

在本发明中，所述固相载体优选包括聚乙烯板、膜(尼龙膜、硝酸纤维素膜或PVDF膜)、载玻片、磁珠、色谱层析填料、微流控通道或聚丙烯酰胺凝胶；

所述标记抗体优选包括辣根过氧化物酶标记抗体、碱性磷酸酶标记抗体、生物素标记的抗体、FITC标记的抗体或Alexa Fluor染料；所述试剂盒优选还包括缓冲液和洗涤液。

本发明所述试剂盒可采用的检测方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)、间接免疫荧光法(包括以细胞为载体的免疫荧光法和以组织为载体的免疫荧光法)、线性印迹或斑点印迹法、免疫共沉淀、免疫磁珠法。当采用不同的方法检测抗INSRR抗体时，在观测结果时可使用的仪器有荧光显微镜、酶标仪、化学发光仪、流式细胞仪、观片灯等。本发明在具体操作过程中，根据试剂盒的具体的检测方法选择对应的标记抗体、缓冲液和洗涤液。

本发明以检测抗INSRR抗体的试剂为主要成分，建立检测神经系统相关疾病的试剂盒，能够定性或定量分析抗INSRR抗体，从而检测神经系统相关疾病。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次对比神经系统疾病患者血清和对照血清在脑组织上的信号，发现存在于患者血清而不存在于对照血清的信号，提示患者血清可能存在某种抗体，通过检测神经系统疾病患者血清和对照血清和脑脊液，发现对照均为抗INSRR抗体阴性，大部分神经系统疾病患者为抗INSRR抗体阳性，确定了抗INSRR抗体为检测和/或诊断神经系统相关疾病的标志物，以INSRR为检测抗原，检测抗INSRR抗体的表达能够检测神经系统疾病，丰富了鉴别神经系统相关疾病生物标志物，提高神经系统相关疾病的检测和/或诊断的准确性。

本发明还提供了一种检测神经系统相关疾病的试剂盒，包括检测抗INSRR抗体的试剂和标记抗体。本发明首次以检测抗INSRR抗体的试剂为主要成分，建立检测神经系统相关疾病的试剂盒。利用本发明试剂盒能够定性或定量分析抗INSRR抗体，操作简便，辅助检测和/或诊断神经系统相关疾病。

附图说明

图1为实施例1中患者血清与对照受试者血清在神经元上的染色；

图2为实施例1中患者血清与神经元marker共染；

图3实施例2患者血清及对照血清在组织上的染色；

图4实施例2为患者血清和对照血清在过表达INSRR的细胞爬片上染色；

图5实施例3WB实验验证INSRR在293T细胞中的过表达；

图6实施例3血清中和实验验证患者样本检出的信号；

图7实施例3血清中和实验验证患者样本检出的信号；

图8实施例3患者血清和INSRR抗体信号共定位染色；

图9实施例5部分患者样本的检测结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的抗INSRR抗体在制备检测和/或诊断神经系统相关疾病的产品中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定：

实施例1免疫荧光法检测样本在大鼠脑组织原代细胞上的信号

步骤1、制备细胞爬片

10％水合氯醛麻醉孕鼠后在生物安全柜取出胎鼠，用预冷的HBSS(137mM NaCl，5.4mM KCl，0.6mM MgSO4·7H₂O，0.5mM MgCl₂·6H₂O，0.3mM Na₂HPO₄·2H₂O，0.4mM kH₂PO₄，5.6mM Glucose，4.2mM NaHCO₃，pH7.2～7.4)冲洗胎鼠，解剖出胎脑，用眼科剪将组织块剪成1m³大小的糜状混合物。加入木瓜蛋白酶(浓度为2mg/ml)于37℃消化处理30分钟，然后将细胞移到新的离心管，加入DMEM重悬，400g，4℃离心5min，弃上清，再次加入DMEM重悬，4℃，400g离心5min，弃上清液，加入20ml Neurobasal培养基重悬细胞。后续实验使用OptiPrep介质上述重选细胞中分离出原代细胞，置于放有玻片的细胞培养皿中培养。将大鼠原代细胞爬片经4％多聚甲醛(PFA)固定10min，HEPES洗2遍，1.25M的甘氨酸终止10min，HEPES洗2遍，得到爬片。

步骤2、抗体孵育：

(1)将患有神经系统疾病的患者(患者1，男，62岁，因出现呼吸困难、吞咽困难，肌肉疼痛无力、劳动力丧失就医，CT显示胸部病变，诊断为胸腺瘤；实验室检查脑脊液中细胞增多，蛋白和IgG水平升高，初步确诊为肌无力综合征。)血清使用PBS按照1:10的比例进行稀释后孵育至步骤1制备好的爬片，孵育时间为1h，HEPES洗2遍，每次5min；再用FITC标记的羊抗人IgG孵育30min，HEPES洗2遍，每次5min；DAPI对细胞核进行染色，10min后使用HEPES洗2遍，每次5min；显微镜下观察，结果如图1所示。根据图1可以看出，患者1血清出现阳性信号，提示患者1血清中可能存识别神经元细胞抗原的抗体。

(2)用稀释200倍的神经元marker MAP2抗体孵育患者1血清孵育过的爬片，HEPES洗2次，每次5min；Alexa Fluor 594标记的羊抗兔IgG(jackson购买)孵育30min，HEPES洗2次，每次5min；显微镜下观察，结果如图2所示。根据图2可以看出，患者1血清染出的信号与MAP2抗体信号重叠，表明患者1血清中的抗体所识别的抗原存在于神经元细胞。

实施例2靶抗原的筛选鉴定

步骤1、使用过表达已知自身抗体靶抗原的细胞爬片和鼠脑组织冰冻切片制备成的生物芯片对患者样本进行染色

根据实施例1所述的实验结果，该患者1的血清中存在识别神经元抗原的抗体，因此，本实施例选取分别表达以下54种抗原的重组293T细胞爬片和鼠脑海马组织切片制备成的载玻片生物芯片进行样本染色，54种抗原分别是：AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2、GABABR、DPPX、IgLON5、GlyRα1、GABAARα1、GABAARβ3、GABAARγ2、mGluR5、D2R、N3、KCNA4、NMDAR2a、NMDAR2b、klhl-11、GAD65、AK5、Homer3、ITPR1、ATP1A3、ARHGAP26、Septin5、NCDN、NF155、NF186、CNTN1、CNTN2、CASPR1、AQP4、MOG、MBP、GFAP、AQP1、Flotillin1/2、LRP4、MAG、musk、Hu、Yo、Ri、Ma2、Ma1、CV2、Amphiphysin、Tr、Zic4、PKCγ、Recoverin、Titin、SOX1、GAD65，具体实验步骤如下：

(1)检测芯片的制备：将上述54种抗原基因合成至pcDNA3.1上，将合成好的重组载体转化至克隆菌TOP10中进行扩增，然后大提质粒备用。将上述重组载体使用PEI转染试剂(转染试剂购自于thermo公司，参照说明书进行转染)分别转染至生长在6cm×6cm爬片上的293T细胞中，转染48h后经洗涤、固定及干燥后，将6cm×6cm的细胞爬片裁剪成2.5mm×2.5mm大小的细胞爬片备用；另取大鼠海马组织制备成冰冻切片，与上述54种抗原的细胞爬片共同粘贴在载玻片上，即为检测芯片。

(2)一抗孵育：将患者1血清和对照受试者血清分别按照1:100的比例稀释后孵育至生物芯片上，孵育1h后用PBST洗3次，每次5min；

(3)二抗孵育：使用FITC标记的二抗继续孵育生物芯片，二抗孵育30min；PBST洗3次，每次5min；显微镜下观察拍照。

结果：患者1血清与上述54种抗原的细胞爬片均不发生反应(未产生比对照血清强的信号)，但患者1血清在鼠脑小脑组织上，却产生了明显强于对照血清的点状及丝状信号，如图3所示，因此，患者1样本中存在与鼠脑小脑组织抗原结合的抗体。

步骤2、使用过表达78种脑组织抗原的细胞爬片制备成的生物芯片对患者样本进行染色

(1)生物芯片的制备：选取在脑组织中表达的78种抗原基因(与步骤1中的54种基因不同的基因)合成至pcDNA3.1上，将合成好的重组载体转化至克隆菌TOP10中进行扩增，然后大提质粒备用。将上述重组载体使用PEI转染试剂(转染试剂购自于thermo公司，参照说明书进行转染)分别转染至生长在6cm×6cm爬片上的293T细胞中，转染48h后经洗涤、固定及干燥后，将6cm×6cm的细胞爬片裁剪成2.5mm×2.5mm大小的细胞爬片备用，将这些细胞爬片制备好后粘贴至载玻片上进行样本的检测。

(2)一抗孵育：将患者1血清和对照受试者血清分别按照1:10的比例稀释后孵育至生物芯片上，孵育1h后用PBST洗3次，每次5min；

(3)二抗孵育：使用FITC标记的二抗继续孵育生物芯片，二抗孵育30min；PBST洗3次，每次5min；显微镜下观察拍照。

结果：患者1血清与上述78种脑组织抗原中的其中一种发生反应，产生了阳性信号，而对照血清与78种脑组织抗原均有反应；经查，与患者1血清发生反应的抗原为INSRR(胰岛素受体相关受体，Insulin receptor related receptor)。患者1血清与对照受试者血清的检测结果如图4所示。

实施例3血清中和实验及血清与抗体共染实验验证患者样本检出的信号步骤1、血清中和实验验证患者样本检出的信号

(1)中和蛋白的制备

将实施例2步骤2中制备得到的重组表达载体pcDNA3.1-INSRR使用PEI转染试剂(转染试剂购自于thermo公司，参照说明书进行转染)将重组表达载体转染至293T细胞；收集过表达INSRR的293T细胞1皿(10cm皿)，加入200μL PBS，超声破碎(破碎条件为：10％功率，破碎3s，停6s，共超声1min)，作为INSRR中和蛋白；

以转染空载pcDNA3.1的细胞制备对照蛋白，制备条件与方法与INSRR中和蛋白的制备相同；

(2)INSRR中和蛋白的鉴定

将制备好的INSRR中和蛋白和对照蛋白电泳，电泳完成后，使用湿法转膜，转膜条件为200mA，60min，5％的脱脂奶粉室温封闭1h后孵育INSRR抗体(购自于santa cruze)，室温孵育2h，TBST洗3次，每次5min；然后加入HRP标记的抗人二抗，室温孵育1h，TBST洗3次，每次5min；加入化学发光液显色拍照，结果如图5所示。由图5可以看出，INSRR蛋白成功在293T细胞中表达，但是空载细胞仍有较多条带，推测可能是抗体与293T细胞本身表达的部分蛋白产生了非特异性的结合。

(3)中和实验验证患者样本在过表达INSRR细胞爬片上出现的信号

制备3份100μL用PBST稀释100倍的患者1血清，分别加入20μL PBST、20μL INSRR中和蛋白及20μL对照蛋白，室温结合10min，然后将其分别孵育至实施例3制备好的过表达INSRR的细胞爬片，室温孵育1h；PBST洗3次，每次5min；一抗孵育完成后分别加入FITC标记的二抗，室温孵育1h，PBST洗3次，每次5min，显微镜下观察结果。由图6可以看出，患者1血清信号被INSRR中和蛋白封闭，而对照蛋白未封闭住过表达INSRR细胞爬片上出现的信号，表明该信号为特异性识别INSRR抗原的信号。

(4)中和实验验证患者样本在组织切片上出现的信号

取鼠脑的组织切片，使用中和实验验证患者样本在组织切片上出现的信号，验证过程及实验体系和中和实验验证患者样本在过表达INSRR细胞爬片上出现的信号相同。结果如下，由图7可以看出，患者1血清信号被INSRR中和蛋白封闭，而对照蛋白未封闭住组织切片上出现的信号，表明该点状及丝状信号为该信号为鼠脑小脑组织上表达的INSRR抗原的特异性信号。

步骤2、血清和抗体共染实验验证患者样本检出的信号

将孵育过患者1血清的细胞爬片(过表达INSRR的细胞爬片)，再用稀释200倍的INSRR抗体孵育，PBST洗2次，每次5min；Alexa Fluor 594标记的羊抗兔IgG(jackson购买)孵育30min；显微镜下观察，结果如图8所示。根据图8可以看出，患者1血清信号与INSRR抗体信号重叠，表明患者1血清中存在的自身抗体的靶抗原为INSRR蛋白。

实施例4基于细胞的免疫荧光法验证抗INSRR自身抗体的特异性

步骤1、取实施例2步骤2已经干燥好的过表达INSRR自身抗体的细胞爬片，备用；

步骤2、取患者的血清，再选取具有如下54种自身抗体(AMPA1、AMPA2、LGI1、CASPR2、GABABR、DPPX、IgLON5、GlyRα1、GABAARα1、GABAARβ3、GABAARγ2、mGluR5、D2R、N3、KCNA4、NMDAR2a、NMDAR2b、klhl-11、GAD65、AK5、Homer3、ITPR1、ATP1A3、ARHGAP26、Septin5、NCDN、NF155、NF186、CNTN1、CNTN2、CASPR1、AQP4、MOG、MBP、GFAP、AQP1、Flotillin1/2、LRP4、MAG、musk、Hu、Yo、Ri、Ma2、Ma1、CV2、Amphiphysin、Tr、Zic4、PKCγ、Recoverin、Titin、SOX1、GAD65)阳性的48位患者和51位健康对照的血清，进行免疫荧光染色，具体步骤如下：(1)一抗孵育：将上述99例血清按照1:100的比例进行稀释，分别孵育至过表达INSRR的细胞爬片上，室温孵育1h；(2)洗涤：PBST洗3次，每次5min；(3)二抗孵育：加入FITC标记的二抗，室温孵育40min；(3)洗涤：PBST洗3次，每次5min；(4)；显微镜下观察结果发现在表达INSRR的293T细胞上，上述血清均不产生与患者血清相似的细胞形态。

由此可以看出，患有本发明首次描述的神经系统疾病的患者具有针对INSRR蛋白的自身抗体，而另一些患有神经系统疾病的患者和对照样本没有这种抗体。

实施例5抗INSRR自身抗体在疑似自身免疫性神经系统疾病样本中的检出率

取192例具有神经系统疾病患者样本，这些患者具有以下一种或两种以上的症状：肌肉无力、肌肉疼痛、表情淡漠、呼吸肌麻痹、呼吸困难、吞咽困难、构音障碍、肢体麻木或感觉缺失、肢体瘫痪、自主神经功能障碍、劳动能力丧失、行为异常、共济失调等，详细信息见表1。使用实施例2步骤2的过表达INSRR的细胞爬片进行检测，阳性数为6例，抗INSRR抗体的检出率为3.125％。经临床医生确诊，检出抗INSRR抗体的患者患有重症肌无力或副肿瘤综合征，本发明为实现神经系统疾病的诊断提供了待测的与自身抗体结合的新抗原，说明该抗体对重症肌无力或副肿瘤综合征的诊断具有辅助作用。部分患者样本的筛选结果见图9。

表1患者的信息情况

实施例6INSRR突变体检测患者血清中的INSRR自身抗体

本实施例选择人INSRR基因的4个突变体，即缺失了INSRR蛋白的第13-21位氨基酸和81-89位氨基酸的突变体(SEQ ID NO.3)、缺失了INSRR蛋白的第106-138位氨基酸的突变体(SEQ ID NO.4)，缺失了INSRR蛋白的第249-260位氨基酸的突变体(SEQ ID NO.5)和缺失了INSRR蛋白的第1272-1294位氨基酸的突变体(SEQ ID NO.6)，按照实施例2记载的步骤进行载体构建、制备过表达重组INSRR缺失突变体的细胞爬片以及对患者血清进行检测，结果显示，4个INSRR的缺失突变体中有三个仍能识别患者血清中的抗INSRR抗体(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)，有1个不能识别患者血清中的抗INSRR抗体(SEQ ID NO.6)，表明第1272-1294位的氨基酸序列即LPTTDAEPD SSPTPRDCSPQNGG为INSRR自身抗体的识别表位。

SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的具体氨基酸序列如下：

SEQ ID NO.3：

MAVPSLWPWGACFGLDTVEVCPSLDIRSEVAELRQLENCSVVEGHLQILLMFTATGEDFRGLSFPRLTQVTGLESLRDLFPNLAVIRGTRLFLGYALVIFEMPHLRDVALPALGAVLRGAVRVEKNQELCHLSTIDWGLLQPAPGANHIVGNKLGEECADVCPGVLGAAGEPCAKTTFSGHTDYRCWTSSHCQRVCPCPHGMACTARGECCHTECLGGCSQPEDPRACVACRHLYFQGACLWACPPGTYQYESWRCVTAERCASLHSVPGRASTFGIHQGSCLAQCPSGFTRNSSSIFCHKCEGLCPKECKVGTKTIDSIQAAQDLVGCTHVEGSLILNLRQGYNLEPQLQHSLGLVETITGFLKIKHSFALVSLGFFKNLKLIRGDAMVDGNYTLYVLDNQNLQQLGSWVAAGLTIPVGKIYFAFNPRLCLEHIYRLEEVTGTRGRQNKAEINPRTNGDRAACQTRTLRFVSNVTEADRILLRWERYEPLEARDLLSFIVYYKESPFQNATEHVGPDACGTQSWNLLDVELPLSRTQEPGVTLASLKPWTQYAVFVRAITLTTEEDSPHQGAQSPIVYLRTLPAAPTVPQDVISTSNSSSHLLVRWKPPTQRNGNLTYYLVLWQRLAEDGDLYLNDYCHRGLRLPTSNNDPRFDGEDGDPEAEMESDCCPCQHPPPGQVLPPLEAQEASFQKKFENFLHNAITIPISPWKVTSINKSPQRDSGRHRRAAGPLRLGGNSSDFEIQEDKVPRERAVLSGLRHFTEYRIDIHACNHAAHTVGCSAATFVFARTMPHREADGIPGKVAWEASSKNSVLLRWLEPPDPNGLILKYEIKYRRLGEEATVLCVSRLRYAKFGGVHLALLPPGNYSARVRATSLAGNGSWTDSVAFYILGPEEEDAGGLHVLLTATPVGLTLLIVLAALGFFYGKKRNRTLYASVNPEYFSASDMYVPDEWEVPREQISIIRELGQGSFGMVYEGLARGLEAGEESTPVALKTVNELASPRECIEFLKEASVMKAFKCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSHLRSLRPEAENNPGLPQPALGEMIQMAGEIADGMAYLAANKFVHRDLAARNCMVSQDFTVKIGDFGMTRDVYETDYYRKGGKGLLPVRWMAPESLKDGIFTTHSDVWSFGVVLWEIVTLAEQPYQGLSNEQVLKFVMDGGVLEELEGCPLQLQELMSRCWQPNPRLRPSFTHILDSIQEELRPSFRLLSFYYSPECRGARGSLPTTDAEPDSSPTPRDCSPQNGGPGH

SEQ ID NO.4：

MAVPSLWPWGACLPVIFLSLGFGLDTVEVCPSLDIRSEVAELRQLENCSVVEGHLQILLMFTATGEDFRGLSFPRLTQVTDYLLLFRVYGLESLRDLFPNLAVIRVRVEKNQELCHLSTIDWGLLQPAPGANHIVGNKLGEECADVCPGVLGAAGEPCAKTTFSGHTDYRCWTSSHCQRVCPCPHGMACTARGECCHTECLGGCSQPEDPRACVACRHLYFQGACLWACPPGTYQYESWRCVTAERCASLHSVPGRASTFGIHQGSCLAQCPSGFTRNSSSIFCHKCEGLCPKECKVGTKTIDSIQAAQDLVGCTHVEGSLILNLRQGYNLEPQLQHSLGLVETITGFLKIKHSFALVSLGFFKNLKLIRGDAMVDGNYTLYVLDNQNLQQLGSWVAAGLTIPVGKIYFAFNPRLCLEHIYRLEEVTGTRGRQNKAEINPRTNGDRAACQTRTLRFVSNVTEADRILLRWERYEPLEARDLLSFIVYYKESPFQNATEHVGPDACGTQSWNLLDVELPLSRTQEPGVTLASLKPWTQYAVFVRAITLTTEEDSPHQGAQSPIVYLRTLPAAPTVPQDVISTSNSSSHLLVRWKPPTQRNGNLTYYLVLWQRLAEDGDLYLNDYCHRGLRLPTSNNDPRFDGEDGDPEAEMESDCCPCQHPPPGQVLPPLEAQEASFQKKFENFLHNAITIPISPWKVTSINKSPQRDSGRHRRAAGPLRLGGNSSDFEIQEDKVPRERAVLSGLRHFTEYRIDIHACNHAAHTVGCSAATFVFARTMPHREADGIPGKVAWEASSKNSVLLRWLEPPDPNGLILKYEIKYRRLGEEATVLCVSRLRYAKFGGVHLALLPPGNYSARVRATSLAGNGSWTDSVAFYILGPEEEDAGGLHVLLTATPVGLTLLIVLAALGFFYGKKRNRTLYASVNPEYFSASDMYVPDEWEVPREQISIIRELGQGSFGMVYEGLARGLEAGEESTPVALKTVNELASPRECIEFLKEASVMKAFKCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSHLRSLRPEAENNPGLPQPALGEMIQMAGEIADGMAYLAANKFVHRDLAARNCMVSQDFTVKIGDFGMTRDVYETDYYRKGGKGLLPVRWMAPESLKDGIFTTHSDVWSFGVVLWEIVTLAEQPYQGLSNEQVLKFVMDGGVLEELEGCPLQLQELMSRCWQPNPRLRPSFTHILDSIQEELRPSFRLLSFYYSPECRGARGSLPTTDAEPDSSPTPRDCSPQNGGPGH

SEQ ID NO.5：

MAVPSLWPWGACLPVIFLSLGFGLDTVEVCPSLDIRSEVAELRQLENCSVVEGHLQILLMFTATGEDFRGLSFPRLTQVTDYLLLFRVYGLESLRDLFPNLAVIRGTRLFLGYALVIFEMPHLRDVALPALGAVLRGAVRVEKNQELCHLSTIDWGLLQPAPGANHIVGNKLGEECADVCPGVLGAAGEPCAKTTFSGHTDYRCWTSSHCQRVCPCPHGMACTARGECCHTECLGGCSQPEDPRACVAACPPGTYQYESWRCVTAERCASLHSVPGRASTFGIHQGSCLAQCPSGFTRNSSSIFCHKCEGLCPKECKVGTKTIDSIQAAQDLVGCTHVEGSLILNLRQGYNLEPQLQHSLGLVETITGFLKIKHSFALVSLGFFKNLKLIRGDAMVDGNYTLYVLDNQNLQQLGSWVAAGLTIPVGKIYFAFNPRLCLEHIYRLEEVTGTRGRQNKAEINPRTNGDRAACQTRTLRFVSNVTEADRILLRWERYEPLEARDLLSFIVYYKESPFQNATEHVGPDACGTQSWNLLDVELPLSRTQEPGVTLASLKPWTQYAVFVRAITLTTEEDSPHQGAQSPIVYLRTLPAAPTVPQDVISTSNSSSHLLVRWKPPTQRNGNLTYYLVLWQRLAEDGDLYLNDYCHRGLRLPTSNNDPRFDGEDGDPEAEMESDCCPCQHPPPGQVLPPLEAQEASFQKKFENFLHNAITIPISPWKVTSINKSPQRDSGRHRRAAGPLRLGGNSSDFEIQEDKVPRERAVLSGLRHFTEYRIDIHACNHAAHTVGCSAATFVFARTMPHREADGIPGKVAWEASSKNSVLLRWLEPPDPNGLILKYEIKYRRLGEEATVLCVSRLRYAKFGGVHLALLPPGNYSARVRATSLAGNGSWTDSVAFYILGPEEEDAGGLHVLLTATPVGLTLLIVLAALGFFYGKKRNRTLYASVNPEYFSASDMYVPDEWEVPREQISIIRELGQGSFGMVYEGLARGLEAGEESTPVALKTVNELASPRECIEFLKEASVMKAFKCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSHLRSLRPEAENNPGLPQPALGEMIQMAGEIADGMAYLAANKFVHRDLAARNCMVSQDFTVKIGDFGMTRDVYETDYYRKGGKGLLPVRWMAPESLKDGIFTTHSDVWSFGVVLWEIVTLAEQPYQGLSNEQVLKFVMDGGVLEELEGCPLQLQELMSRCWQPNPRLRPSFTHILDSIQEELRPSFRLLSFYYSPECRGARGSLPTTDAEPDSSPTPRDCSPQNGGPGH

SEQ ID NO.6：

MAVPSLWPWGACLPVIFLSLGFGLDTVEVCPSLDIRSEVAELRQLENCSVVEGHLQILLMFTATGEDFRGLSFPRLTQVTDYLLLFRVYGLESLRDLFPNLAVIRGTRLFLGYALVIFEMPHLRDVALPALGAVLRGAVRVEKNQELCHLSTIDWGLLQPAPGANHIVGNKLGEECADVCPGVLGAAGEPCAKTTFSGHTDYRCWTSSHCQRVCPCPHGMACTARGECCHTECLGGCSQPEDPRACVACRHLYFQGACLWACPPGTYQYESWRCVTAERCASLHSVPGRASTFGIHQGSCLAQCPSGFTRNSSSIFCHKCEGLCPKECKVGTKTIDSIQAAQDLVGCTHVEGSLILNLRQGYNLEPQLQHSLGLVETITGFLKIKHSFALVSLGFFKNLKLIRGDAMVDGNYTLYVLDNQNLQQLGSWVAAGLTIPVGKIYFAFNPRLCLEHIYRLEEVTGTRGRQNKAEINPRTNGDRAACQTRTLRFVSNVTEADRILLRWERYEPLEARDLLSFIVYYKESPFQNATEHVGPDACGTQSWNLLDVELPLSRTQEPGVTLASLKPWTQYAVFVRAITLTTEEDSPHQGAQSPIVYLRTLPAAPTVPQDVISTSNSSSHLLVRWKPPTQRNGNLTYYLVLWQRLAEDGDLYLNDYCHRGLRLPTSNNDPRFDGEDGDPEAEMESDCCPCQHPPPGQVLPPLEAQEASFQKKFENFLHNAITIPISPWKVTSINKSPQRDSGRHRRAAGPLRLGGNSSDFEIQEDKVPRERAVLSGLRHFTEYRIDIHACNHAAHTVGCSAATFVFARTMPHREADGIPGKVAWEASSKNSVLLRWLEPPDPNGLILKYEIKYRRLGEEATVLCVSRLRYAKFGGVHLALLPPGNYSARVRATSLAGNGSWTDSVAFYILGPEEEDAGGLHVLLTATPVGLTLLIVLAALGFFYGKKRNRTLYASVNPEYFSASDMYVPDEWEVPREQISIIRELGQGSFGMVYEGLARGLEAGEESTPVALKTVNELASPRECIEFLKEASVMKAFKCHHVVRLLGVVSQGQPTLVIMELMTRGDLKSHLRSLRPEAENNPGLPQPALGEMIQMAGEIADGMAYLAANKFVHRDLAARNCMVSQDFTVKIGDFGMTRDVYETDYYRKGGKGLLPVRWMAPESLKDGIFTTHSDVWSFGVVLWEIVTLAEQPYQGLSNEQVLKFVMDGGVLEELEGCPLQLQELMSRCWQPNPRLRPSFTHILDSIQEELRPSFRLLSFYYSPECRGARGSPGH

根据上述实施例可以看出，抗INSRR抗体可以作为检测和/或诊断神经系统相关疾病的生物标志物，通过检测抗INSRR抗体能够实现神经系统相关疾病准确诊断和筛查。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.抗INSRR自身抗体的试剂在制备检测和/或诊断神经系统症状相关疾病的产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，抗INSRR自身抗体的试剂包括INSRR蛋白、表达INSRR蛋白的细胞、表达INSRR蛋白的组织和含有INSRR蛋白的裂解物中的一种或多种；其中：

所述INSRR蛋白的氨基酸序列包括a)、b)或c)：

a)、如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

b)、如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的10％～80％，并且可以识别INSRR自身抗体的氨基酸序列；

c)、a)或b)中的氨基酸序列经修饰或突变后，能够识别INSRR自身抗体的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，编码如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列包括I)、II)或III)：

I)、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

II)、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的10％～80％，并且能够表达识别INSRR自身抗体的氨基酸序列；

III)、Ⅰ)或Ⅱ)中的核苷酸序列突变后，并且能够表达识别INSRR自身抗体的氨基酸序列。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，c)所述的氨基酸序列包括：如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序、如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或如SEQ IDNO.5所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神经系统症状相关疾病包括重症肌无力或副肿瘤综合征。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述神经系统症状相关疾病的症状包括肌肉无力、肌肉疼痛、表情淡漠、呼吸肌麻痹、呼吸困难、吞咽困难、构音障碍、肢体麻木或感觉缺失、肢体瘫痪、自主神经功能障碍、劳动能力丧失、行为异常、共济失调。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。

8.一种检测INSRR自身抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗INSRR自身抗体的试剂，抗INSRR抗体的试剂包括INSRR蛋白、表达INSRR蛋白的细胞、表达INSRR蛋白的组织和含有INSRR蛋白的裂解物中的一种或多种；其中：

所述INSRR蛋白的氨基酸序列包括a)、b)或c)：

a)、如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

b)、如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的10％～80％，并且可以识别INSRR自身抗体的氨基酸序列；

c)、a)或b)中的氨基酸序列经修饰或突变后，能够识别INSRR自身抗体的氨基酸序列。

9.如权利要求8所述的检测INSRR自身抗体的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒在检测时是检测样品与INSRR蛋白结合的自身抗体，所述样品为全血或血清。

10.抗INSRR抗体作为标志物在制备检测和/或诊断神经系统相关疾病的产品中的应用。

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