CN116794329A - 抗Dok7抗体在制备检测和/或诊断重症肌无力的试剂盒中的应用 - Google Patents
抗Dok7抗体在制备检测和/或诊断重症肌无力的试剂盒中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了抗Dok7抗体在制备检测和/或诊断重症肌无力的试剂盒中的应用，属于生物医药技术领域。本发明首次公开了抗Dok7抗体能够作为检测和/或诊断重症肌无力的标志物，以Dok7为检测抗原，检测抗Dok7抗体的表达能够辅助诊断神重症肌无力疾病，丰富了鉴别重症肌无力生物标志物，提高重症肌无力的检测和/或诊断的准确性。以检测抗Dok7抗体的试剂为主要成分，建立检测重症肌无力的试剂盒，利用本发明试剂盒能够定性或定量分析抗Dok7抗体，操作简便，辅助临床医生对重症肌无力的检测和/或诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及抗Dok7抗体在制备检测和/或诊断重症肌无力的产品的应用。
背景技术
神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)是一种由运动神经元、骨骼肌和包绕在运动神经末梢的雪旺细胞三部分组成的突触结构。NMJ发育异常或功能缺陷会导致神经肌肉相关疾病的发生，包括重症肌无力(myasthenia gravis，MG)、先天性肌无力综合征(congenital myasthenia syndrome，CMS)、脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateralsclerosis)等。
MG是一种针对神经肌肉接头的自身免疫性疾病，任何年龄均可发病，女性患病率大于男性，主要临床表现为波动性肌肉无力，劳累后加重，休息后缓解，其致病机制是体内存在自身抗体，干扰了神经肌肉之间的信号传导，从而导致肌肉无力的发生。目前，MG患者血清中发现的与神经-肌肉接头结构或骨骼肌胞质成分相关的抗体达10余种，包括乙酰胆碱受体(AChR)抗体、肌肉特异性受体酪氨酸激酶(MuSK)抗体、低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)抗体、连接素(titin)抗体、兰尼碱受体(RyR)抗体、聚集蛋白(agrin)抗体、Kv1.4抗体、胶原蛋白Q(COlQ)抗体，皮质蛋白(cortactin)抗体、胶原XIII(collagen XIII)抗体和突触受体关联蛋白(rapsyn)抗体。但是，仍然有一部分患者体内未检测到针对上述靶抗原的自身抗体。
CMS是由于参与NMJ的形成、结构及其维持修饰相关的蛋白，以及神经递质传递相关信号蛋白存在先天性缺陷，从而导致神经末梢至运动终板信号传递功能障碍的一组遗传异质性疾病，临床上主要表现为肌无力和易疲劳。目前已有30多个基因被证实与CMS相关。人们通常依据缺陷基因所编码蛋白在NMJ的解剖学分布和功能，将CMS分为以下5种类型：突触前膜蛋白缺陷、突触间隙蛋白缺陷、突触后膜蛋白缺陷、糖基化缺陷和其他罕见类型，其中，突触后膜缺陷相关蛋白有AChR、agrin、LRP4、MuSK、Dok7以及rapsyn，表达这些蛋白的基因发生突变均会导致CMS的发生。AChR缺陷导致AChR数量减少和突触后结构破坏。agrin缺陷与下游激活MuSK及诱导AChR聚集的功能缺陷有关。LRP4缺陷导致神经肌肉接头发育异常。MuSK缺陷影响与下游的Dok7相互作用，引起AChR簇集障碍。Dok7缺陷可导致终板的破坏和重塑，形成多个小突触。Rapsyn是一种突触后外周膜蛋白，其作用是将烟碱型AChR聚集在运动终板，不同位点突变可通过多种分子机制破坏Rapsyn功能。目前，除了Dok7之外，突触后膜缺陷相关蛋白AChR、agrin、LRP4、MuSK以及rapsyn均为重症肌无力的诊断标志物。
因此，Dok7可能是MG一个新的潜在靶点，但是目前尚无关于Dok7自身抗体是否可作为重症肌无力的一种诊断标志物的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗Dok7抗体在制备检测和/或诊断重症肌无力的试剂盒中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了抗Dok7抗体作为标志物在制备检测和/或诊断重症肌无力的产品中的应用。
本发明还提供了检测抗Dok7抗体的试剂在制备检测和/或诊断重症肌无力的产品中的应用。
在本发明中，所述产品优选包括试剂盒。本发明所述重症肌无力的症状优选包括晨轻暮重、波动性无力、易疲劳，眼睑下垂、视物重影、吞咽困难、肢体乏力，不自主抖动、胸闷、呼吸困难、胸腺瘤。该病可累及全身骨骼肌，包括眼外肌、面肌、咀嚼肌、咽喉肌、颈肌及躯干肌肉。用于检测本发明所述重症肌无力的样本优选包括全血、血清和脑脊液的一种或多种。
本发明抗Dok7自身抗体与神经系统自身免疫疾病密切相关，可区分神经系统自身免疫疾病和其它自身免疫疾病，抗Dok7自身抗体为患有神经系统自身免疫疾病尤其是重症肌无力的诊断提供了依据。
本发明还提供了一种检测重症肌无力的试剂盒，包括检测抗Dok7抗体的试剂、固相载体和标记抗体。
在本发明中，所述检测抗Dok7抗体的试剂优选包括Dok7蛋白、表达Dok7蛋白的细胞、表达Dok7蛋白的组织和含有Dok7蛋白的裂解物中的一种或多种。
所述Dok7蛋白的氨基酸序列优选包括a)～c)中的任意一种：
a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
b)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
c)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的10％～80％；
优选为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，并且可以识别Dok7自身抗体的氨基酸序列；
d)a)或b)或c)中的氨基酸序列经修饰或突变后，可以识别Dok7自身抗体的氨基酸序列；如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示；
所述修饰优选包括糖基化、磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化中的一种或多种。
在本发明中，编码如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列优选包括Ⅰ)～Ⅲ)中的任意一种：
Ⅰ)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
Ⅱ)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的10％～80％；
优选为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，并且可表达识别Dok7自身抗体的氨基酸序列；
Ⅲ)Ⅰ)或Ⅱ)中的核苷酸序列突变后，并且可表达识别Dok7自身抗体的氨基酸序列。
在本发明中，编码如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列优选包括Ⅰ)～Ⅲ)中的任意一种：
Ⅰ)SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
Ⅱ)SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的10％～80％；
优选为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，并且可表达识别Dok7自身抗体的氨基酸序列；
Ⅲ)Ⅰ)或Ⅱ)中的核苷酸序列突变后，并且可表达识别Dok7自身抗体的氨基酸序列。
在本发明中，所述Dok7蛋白优选通过编码Dok7蛋白的基因插入出发载体，将获得的重组载体转入表达系统中表达，纯化后获得。
本发明对所述出发载体的类型没有严格要求，常规选择即可；
所述表达系统优选包括原核表达系统，酵母表达系统，杆状病毒表达系统或哺乳动物细胞表达系统；
所述纯化优选包括亲和层析、分子筛层析、离子交换层析或疏水层析；
本发明对所述纯化的具体方式没有严格要求，常规选择即可。
在本发明中，所述表达Dok7蛋白的组织优选为哺乳动物组织，所述哺乳动物优选包括人、灵长类动物或鼠，所述组织优选包括骨骼肌组织神经肌肉组织接头；所述表达Dok7蛋白的细胞优选包括表达Dok7蛋白的肌肉细胞、HEK293细胞、Hela细胞和CHO细胞；所述的含有Dok7蛋白的裂解物优选包括哺乳动物的肌肉细胞、过表达Dok7蛋白细胞的裂解物。
在本发明中，所述固相载体优选包括聚乙烯板、膜(尼龙膜、硝酸纤维素膜或PVDF膜)、载玻片、磁珠、色谱层析填料、微流控通道或聚丙烯酰胺凝胶；
所述标记抗体优选包括辣根过氧化物酶标记抗体、碱性磷酸酶标记抗体、生物素标记的抗体、FITC标记的抗体或Alexa Fluor染料；所述试剂盒优选还包括缓冲液和洗涤液。
本发明所述试剂盒可采用的检测方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)、间接免疫荧光法(包括以细胞为载体的免疫荧光法和以组织为载体的免疫荧光法)、线性印迹或斑点印迹法、免疫共沉淀、免疫磁珠法。当采用不同的方法检测抗Dok7抗体时，在观测结果时可使用的仪器有荧光显微镜、酶标仪、化学发光仪、流式细胞仪、观片灯等。本发明在具体操作过程中，根据试剂盒的具体的检测方法选择对应的标记抗体、缓冲液和洗涤液。
本发明以检测抗Dok7抗体的试剂为主要成分，建立检测重症肌无力的试剂盒，能够定性或定量分析抗Dok7抗体，从而辅助临床医生对重症肌无力的诊断。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次在患有重症肌无力的患者中检测到抗Dok7蛋白的抗体，对比重症肌无力患者血清和对照血清在过表达Dok7抗原的细胞爬片上的信号，能够明确获得存在于患者血清中而不存在于对照血清的信号，提示患者血清中存在抗Dok7蛋白的抗体，确定了抗Dok7抗体能够作为检测和/或诊断重症肌无力的标志物，以Dok7为检测抗原，检测抗Dok7抗体的表达能够辅助诊断神重症肌无力疾病，丰富了鉴别重症肌无力生物标志物，提高重症肌无力的检测和/或诊断的准确性。
本发明还提供了一种检测重症肌无力相关自身抗体的试剂盒，包括检测抗Dok7抗体的试剂和标记抗体。本发明首次以检测抗Dok7抗体的试剂为主要成分，建立检测重症肌无力的试剂盒。利用本发明试剂盒能够定性或定量分析抗Dok7抗体，操作简便，辅助临床医生对重症肌无力的检测和/或诊断。
附图说明
图1为563例疑似MG样本的自身抗体检测阳性结果图；
图2为5例Dok7自身抗体阳性样本及1例正常人样本的免疫荧光染色结果；
图3为中和实验验证患者样本中的信号；
图4为抗体和血清共染实验验证患者样本中的信号；
图5为CBA法上Dok7和Dok7-4在识别同一样本时的比较结果；
图6为免疫印迹法上Dok7和Dok7-4在识别同一样本时的比较结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
实施例1用于检测重症肌无力自身抗体的细胞爬片的制备及样本筛选
本实施例将现有与11种重症肌无力自身抗体(AChR抗体、MuSK抗体、LRP4抗体、titin抗体、RyR抗体、agrin抗体、Kv1.4抗体、COlQ抗体、cortactin抗体、collagen XIII抗体和rapsyn抗体)结合的靶抗原的基因以及Dok7基因过表达至真核细胞293T中，制备成干燥的细胞爬片，然后将上述12种细胞爬片粘贴至同一载玻片上，对563例疑似重症肌无力的样本及10例正常人样本(由合作医院赠与)进行检测，统计分析检测结果，为Dok7自身抗体作为重症肌无力的诊断标志物提供数据支持。
具体制备包括以下步骤：
步骤1，重组载体的构建
通过人工合成的方法，将人的AChR(参考专利号为ZL202111021985.2：一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用当中质粒序列号进行后续转染)、MuSK(NCBI序列号：NM_005592.4)、LRP4(NCBI序列号：NM_002334.4)、titin(NCBI序列号：NM_001267550.2，选择47689-48552bp进行克隆、表达)、RyR(NCBI序列号：NM_000540.3)、agrin(NCBI序列号：NM_001305275.2)、Kv1.4(NCBI序列号：NM_002233.4)、COlQ(NCBI序列号：NM_005677.4)、cortactin(NCBI序列号：NM_005231.4)、collagen XIII(NCBI序列号：NM_001130103.2)、rapsyn(NCBI序列号：NM_005055.5)以及Dok7(Dok7的剪接变体1，序列号为：NM_173660.5)基因连至pCDNA3.1上，得到重组载体，构建好的重组载体经测序正确后大提备用；
步骤2，细胞转染
(1)293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，待细胞铺满时按1:5～1:6传代至放置6cm*6cm细胞爬片的10cm培养皿中，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中过夜培养；
(2)待细胞密度为30％～40％时，将编码上述12种抗原的重组质粒及对照质粒pCDNA3.1通过PEI转染试剂转入(转染试剂、质粒用量及实验操作过程按照thermo公司的说明书进行操作)细胞中；
步骤3，爬片固定
(1)洗涤：将生长48h的细胞用PBS洗涤2次；
(2)固定：加入丙酮于4℃固定5min；
(3)洗涤：丙酮固定后的爬片用PBS洗涤2次，进行干燥；
(4)裁片及粘片：细胞爬片干燥完成后，将13种6cm*6cm的细胞爬片均裁剪成0.25cm*0.25cm大小的细胞爬片，粘贴在同一载玻片上，备用。
步骤4患者血清染色
(1)爬片洗涤：使用PBST洗涤步骤3获得的细胞爬片；
(2)样本孵育：将573例样本按照1:10比例稀释后加至爬片上，室温孵育1h；
(3)洗涤：PBST洗3次，每次5min；
(4)二抗孵育：加入FITC标记的抗人二抗，室温孵育40min；
(5)洗涤：PBST洗3次，每次5min；
(6)显微镜下观察结果，拍照并统计实验数据。
实验结果：
在563例疑似MG样本中，有287例样本为12种自身抗体(AChR抗体、MuSK抗体、LRP4抗体、Titin抗体、RyR抗体、agrin抗体、Kv1.4抗体、COlQ抗体、cortactin抗体、collagenXIII抗体、rapsyn、Dok7)当中的一种或多种阳性，单阳性样本和多阳性样本在总样本中的占比情况如图1所示，另外276例疑似MG样本及10例正常人的样本均未检出阳性信号。本次实验共筛出5例Dok7自身抗体阳性的样本，其中有4例为Dok7自身抗体单阳性，1例为AChR和Dok7自身抗体双阳性，5例阳性样本信息如表1所示，5例阳性样本及1例正常人样本的免疫荧光染色结果如图2所示。经与临床医生沟通，5例Dok7自身抗体阳性患者均确诊为MG。
结论：5例MG疑似血清在过表达Dok7的细胞爬片上出现了比正常人血清明显的信号，且5例MG疑似患者最终被确诊为患有重症肌无力疾病。因此，Dok7自身抗体可能是MG疾病的一个诊断标志物。
表1DOK7阳性重症肌无力患者的信息情况
实施例2血清中和实验及抗体共染实验验证患者样本在细胞爬片上出现的信号
由实施例1结果可知，在疑似MG患者的样本中筛选到了识别过表达Dok7抗原的样本，为了进一步验证该信号的真实性，本实施例采用血清中和实验验证过表达细胞爬片上出现的阳性信号。
1、血清中和实验验证细胞爬片上出现的信号
1)中和蛋白的制备
通过人工合成的方法，将Dok7基因(Dok7的剪接变体4，序列号为：NM_001301071.2)基因连至pCDNA3.1上，得到重组载体，构建好的重组载体经测序正确后大提备用，为了与Dok7的剪接变体1区分，将该载体命名为pcDNA3.1-Dok7-4，由该载体表达的蛋白命名为Dok7-4；
将实施例1步骤1中制备得到的重组表达载体pcDNA3.1-Dok7使用PEI转染试剂(转染试剂购自于thermo公司，参照说明书进行转染)转染至293T细胞；收集过表达Dok7的293T细胞1皿(10cm皿)，加入200μL PBS，超声破碎(破碎条件为：10％功率，破碎3s，停6s，共超声1min)，作为Dok7中和蛋白；
Dok7-4中和蛋白的制备条件及方法与Dok7中和蛋白的制备相同；
以转染空载pcDNA3.1的细胞制备对照蛋白，制备条件及方法与Dok7中和蛋白的制备相同；
2)中和实验验证患者样本在过表达Dok7细胞爬片上出现的信号
制备4份100μL用PBST稀释100倍的患者血清(包括患者1和患者2，每个患者均制备4份样本)，分别加入20μL PBST、20μL Dok7中和蛋白、20μL Dok7-4中和蛋白及20μL对照蛋白，室温结合10min，然后将其分别孵育至实施例1制备好的过表达Dok7的细胞爬片，室温孵育1h；PBST洗3次，每次5min；一抗孵育完成后分别加入FITC标记的二抗，室温孵育1h，PBST洗3次，每次5min，显微镜下观察结果。
由图3可以看出，患者1和患者2的血清信号均可被Dok7及Dok7-4中和蛋白封闭，而对照蛋白未封闭住过表达Dok7细胞爬片上出现的信号，表明患者1和患者2的血清染出的信号为特异性识别Dok7抗原的信号。另外，由于Dok7-4中和蛋白可减弱患者样本在Dok7细胞爬片上染出的信号，因此，患者1和患者2样本中的自身抗体也可识别Dok7-4，Dok7自身抗体识别的表位包含Dok7和Dok7-4的共有序列。
2、血清和抗体共染实验验证细胞爬片上出现的信号
按照实施例1步骤4对患者1和患者2的血清进行免疫荧光染色，染色完成后再用稀释200倍的商业化Dok7抗体孵育，PBST洗2次，每次5min；Alexa Fluor 594标记的羊抗兔IgG(jackson购买)孵育30min；显微镜下观察，结果如图4所示。根据图4可以看出，患者1和患者2的血清信号与Dok7抗体信号重叠，表明患者1和患者2血清中存在的自身抗体的靶抗原的确为Dok7蛋白。
实施例3Dok7不同剪接变体检测患者样本中的信号
按照实施例1的步骤2及步骤3的方法制备过表达Dok7-4的细胞爬片。使用过表达Dok7-4的细胞爬片检测实施例1的部分阳性样本以观察在免疫荧光法(CBA)及免疫印迹法(WB)上同一血清识别不同的Dok7剪接变体时的差异。
1、CBA法验证同一血清识别不同的Dok7剪接变体时的差异
按照实施例1步骤4对患者1的样本进行染色，染色所用的细胞爬片为实施例1制备的过表达Dok7的细胞爬片及本实施例过表达Dok7-4的细胞爬片。实验结果如图5所示。
2、WB验证同一血清识别不同Dok7剪接变体时的差异
(1)蛋白样品的制备：蛋白上样样品为实施例2的中和蛋白；
(2)上样及转膜：分别取20μg过表达Dok7的中和蛋白、20μg过表达Dok7-4的中和蛋白和20μg空载pCDNA3.1蛋白进行上样，共制备4组，电泳结束后采用转膜条件为300mA，90min进行湿法转膜；5％的脱脂奶粉室温封闭1h；
(3)抗体孵育及显色：分别使用Dok7抗体、阳性患者1、阳性患者2及正常人血清作为一抗，4℃孵育过夜；次日，TBST洗3次，每次5min；加入HRP标记的羊抗人二抗(厂家：Jackson货号：109-035-098)，室温孵育1h；TBST洗3次，每次5min；加入ECL化学发光液显色拍照，实验结果如图6所示。
结论：使用CBA法及WB均可检测出重症肌无力患者样本中的Dok7自身抗体，患者样本中的Dok7自身抗体可识别Dok7的不同剪接变体，包含Dok7剪接变体1和Dok7剪接变体4；Dok7自身抗体的识别表位包含线性表位，本申请所检测的患者样本中的Dok7自身抗体可识别的表位为Dok7剪接变体1和Dok7剪接变体4共有序列。
实施例4Dok7不同突变体检测患者样本中的信号
本实施例选择人Dok7基因的3个缺失突变体进行血清学验证。突变体1缺失了Dok7蛋白的第70～83个氨基酸(SEQ ID NO.5)、突变体2缺失了Dok7蛋白的第256～264个氨基酸(SEQ ID NO.6)，突变体3缺失了Dok7蛋白的第304～312个氨基酸(SEQ ID NO.7)，按照实施例1记载的步骤进行载体构建、制备过表达缺失Dok7基因的细胞爬片及对患者血清检测。结果显示，Dok7的突变体1和突变体3识别患者血清中的抗Dok7抗体，Dok7的突变体2不识别患者血清中的抗Dok7抗体。
实施例5抗Dok7蛋白自身抗体的特异性
1、取实施例7已经干燥好的过表达Dok7的细胞爬片，备用；
2、选取具有各种神经自身抗体(抗Hu、Yo、CV2、Ma2、Amphiphysin、Ma1、SOX1、NMDAR、AMPAR1、AMPAR2、LGI1、CASPR2、GABABR、DPPX、IgLON5)的32位患者和45位健康对照的血清，进行免疫荧光染色，具体步骤如下：(1)一抗孵育：按照1:100的比例孵育患者血清，室温孵育1h；(2)洗涤：PBST洗3次，每次5min；(3)二抗孵育：加入FITC标记的二抗，室温孵育40mi；(3)洗涤：PBST洗3次，每次5min；(4)；显微镜下观察结果。
3、拍照：在表达Dok7的HEK293细胞上，上述血清均不产生与患者血清相似的免疫荧光图案。
实施例6抗Dok7自身抗体在疑似自身免疫性神经系统疾病样本中的检出率
取1482例具有神经系统疾病患者样本，这些患者表现出的症状有：全身无力、易疲劳、眼球运动困难、吞咽困难、肢体乏力、张力减退、肢体僵硬、不协调、认知障碍、精神障碍、言语障碍、意识障碍、精神行为异常、不自主运动、共济失调、步态不稳、眩晕、幻动视听、震颤、肿瘤等。使用实施例2步骤2的过表达Dok7的细胞爬片进行检测，阳性数为7例，抗Dok7抗体的检出率为0.47％。经临床医生确诊，7例检出抗Dok7抗体的患者均患有重症肌无力，其中有1例为septin5和Dok7自身抗体阳性患者，该患者抬头无力、吞咽困难、精神行为异常、具有幻动视听、震颤，经临床医生诊断，该患者为重症肌无力合并脑炎患者。本发明为实现重症肌无力的诊断提供了待测的与自身抗体结合的新抗原，说明该抗体对重症肌无力诊断具有辅助作用。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.抗Dok7抗体作为标志物在制备检测和/或诊断重症肌无力的产品中的应用。
2.检测抗Dok7抗体的试剂在制备检测和/或诊断重症肌无力的产品中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测抗Dok7抗体的试剂包括Dok7蛋白、表达Dok7蛋白的细胞、表达Dok7蛋白的组织和含有Dok7蛋白的裂解物中的一种或多种；
其中，Dok7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2所示；或者，对SEQ IDNO.1或者SEQ ID NO.2所示氨基酸序列进行改造和/或修饰后的序列，如SEQ ID NO.5或SEQID NO.7所示。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述修饰包括糖基化修饰、磷酸化修饰、乙酰化修饰、甲基化修饰和泛素化修饰中的一种或多种。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Dok7蛋白通过编码Dok7蛋白的基因插入出发载体，将获得的重组载体转入表达系统中表达，纯化后获得；其中：
表达系统包括原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统或哺乳动物细胞表达系统；
纯化操作包括亲和层析、分子筛层析、离子交换层析或疏水层析。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，表达Dok7蛋白的细胞包括表达Dok7蛋白的肌肉细胞、HEK293细胞、Hela细胞CHO细胞；表达Dok7蛋白的组织为哺乳动物组织；含有Dok7蛋白的裂解物包括哺乳动物的肌肉细胞、过表达Dok7蛋白细胞的裂解物。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，抗Dok7抗体的检测方法包括酶联免疫吸附法、间接免疫荧光法、线性印迹或斑点印迹法、免疫共沉淀、免疫磁珠法。
8.一种检测和/或诊断重症肌无力的试剂盒，其特征在于，包括检测抗Dok7抗体的试剂、固相载体和标记抗体。
9.如权利要求8所述的检测和/或诊断重症肌无力的试剂盒，其特征在于，所述检测抗Dok7抗体的试剂包括Dok7蛋白、表达Dok7蛋白的细胞、表达Dok7蛋白的组织和含有Dok7蛋白的裂解物中的一种或多种；
其中，Dok7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2所示；或者，对SEQ IDNO.1或者SEQ ID NO.2所示氨基酸序列进行改造和/或修饰后的序列，如SEQ ID NO.5或SEQID NO.7所示。
10.如权利要求8所述的检测和/或诊断重症肌无力的试剂盒，其特征在于，所述固相载体包括聚乙烯板、膜、载玻片、磁珠、色谱层析填料、微流控通道或聚丙烯酰胺凝胶；
所述标记抗体包括辣根过氧化物酶标记抗体、碱性磷酸酶标记抗体、生物素标记的抗体、FITC标记的抗体或Alexa Fluor染料。
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