CN112526126A

CN112526126A - 自身抗体的检测

Info

Publication number: CN112526126A
Application number: CN202010877846.9A
Authority: CN
Inventors: S·肖赫麦戈文; A·贝克
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2021-03-19
Also published as: US20210063393A1; EP3786641A1; US11644463B2

Abstract

本发明涉及包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其变体中所示的氨基酸序列的肽的在诊断上有用的载体、试剂盒、组合物、检测方法、用于检测神经学疾病的用途、与脑发育调节蛋白特异性结合的人自身抗体以及用于治疗神经学疾病的治疗性化合物或组合。

Description

自身抗体的检测

本发明涉及包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的肽或其变体的诊断上有用的载体、试剂盒、组合物、检测方法、用于检测神经学疾病的用途、与脑发育调节蛋白(Drebrin)特异性结合的人自身抗体以及用于治疗神经学疾病的治疗性化合物或组合。

神经精神症状(包括反复发作以及认知和行为受损)与独特的自身抗体相关联这一观点从根本上改善了几种严重神经学疾病的诊断和治疗方法。这包括脑炎的疾病谱，包括边缘叶脑炎(limbic encephalitis，LE)。

在脑炎中，自身抗体(AB)谱包括“肿瘤神经(onconeural)”AB，包括双载蛋白(amphiphysin)(抗AMPH)、BMP结合内皮调节因子(抗BMPER；抗CV2)和副肿瘤性Ma抗原2(抗Ma2；抗PNMA2)和靶向细胞内蛋白质结构的抗谷氨酸脱羧酶65(GAD65)。靶向神经元表面蛋白的自身抗体引起过度兴奋的致病概念。这些靶标包括N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)、电压门控钾通道复合物(VGKC)组分诸如富含亮氨酸的神经胶质瘤失活蛋白1(LGI1)或接触蛋白相关蛋白1(CASPR)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体(AMPAR)、γ-氨基丁酸受体B(GABABR)、二肽基肽酶样蛋白-6(DPPX)、代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)10和甘氨酸受体(GLY-Rs)。

与自身抗体的出现同时发生的神经学病况的其它实例包括视神经脊髓炎，一种特征在于视觉和脊髓功能丧失的疾病，以及抗NMDA受体脑炎，其与自主神经功能障碍、换气不足、小脑性共济失调、轻偏瘫、意识丧失或紧张症相关。虽然之前对自身抗体的参与和这些病况本身的性质了解很少，但由于有基于自身抗体检测的测定可供利用，现在可以高效地评估这些疾病中的许多疾病的风险并治疗所述疾病。

然而，尽管在很大一部分的脑炎(尤其是LE)患者中识别自身抗体介导的免疫机制方面取得了进展，但在超过50％的疑似LE患者中未检测到特异性“神经学”抗体。约70％的病因不明的脑炎病例即使在广泛评估了传染性病因后，仍然没有明确的诊断。对血清阴性脑炎患者的免疫机制的更好理解可为受影响个体打开新的治疗选择。

因此，最重要的是开发新的方法来区分与自身抗体相关的神经学病况和与自身抗体无关的神经学病况，并评估受试者发展成这种疾病的风险。此外，需要鉴定与自身抗体结合的新抗原，以提高诊断和治疗水平。

本发明涉及针对脑发育调节蛋白的自身抗体和基于其检测的测定和疗法。就本发明人所知，在现有技术中尚未报道针对脑发育调节蛋白的自身抗体的存在，更不用说它们的有效性。许多公司已将与脑发育调节蛋白结合的重组抗体商业化，包括Santa CruzBiotechnology(C-8,sc-374269)和Abcam(M2F6,ab12350)。

本发明所要解决的问题是提供可用于评估受试者是否可能发展成自身免疫性疾病，优选神经系统的自身免疫性疾病，更优选脑炎、癫痫发作或癫痫的新型试剂、装置和方法。

本发明要解决的另一个问题是提供可用于区分自身免疫性疾病(特别是神经学自身免疫性疾病，更优选选自脑炎、癫痫发作和癫痫)与除自身免疫性疾病外的疾病(例如与神经学症状相关的感染)，特别是用于确定最有希望的治疗方案(更具体地说是免疫抑制治疗是否适合，优选在疾病发作之前)的新型试剂、装置和方法。

本发明要解决的问题可通过所附独立权利要求和从属权利要求的保护主题来解决。

在第一个方面，该问题通过在诊断上有用的载体得以解决，该载体包含含有SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其变体中所示的氨基酸序列的肽。

在第二方面，该问题通过试剂盒来解决，该试剂盒包括本发明的在诊断上有用的载体和用于检测人自身抗体的抗体。

在第三方面，该问题通过用于诊断神经学疾病的方法来解决，该方法包括在患者的样品中检测特异性结合脑发育调节蛋白的自身抗体的存在。

在第四方面，该问题通过组合物来解决，该组合物包含a)包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或其变体中所示的氨基酸序列的肽和b)药学上可接受的载体。

在第五方面，该问题通过本发明的组合物或本发明的在诊断上有用的载体用于诊断神经学疾病来解决。

在第六个方面，该问题通过检测特异性结合脑发育调节蛋白的自身抗体的存在或不存在的方法来解决，该方法包括i)将从患有神经学疾病的受试者中分离的样品与包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其变体的肽接触，其中所述多肽特异性结合与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4结合的自身抗体；ii)检测在与所述肽的复合物中是否存在针对脑发育调节蛋白的自身抗体。

在第七方面，该问题通过使用(i)包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其变体中所示的氨基酸序列的肽，或(ii)编码包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其变体中所示的氨基酸序列的肽的核酸载体制造用于检测神经学疾病的试剂盒来解决。

在第八方面，该问题通过特异性结合脑发育调节蛋白的人自身抗体来解决。

在第九方面，该问题通过用于治疗神经学自身免疫性疾病的治疗性化合物或治疗性化合物的组合来解决，其中所述神经学自身免疫性疾病与特异性结合脑发育调节蛋白的自身抗体相关，其中所述治疗性化合物或组合选自a)丙戊酸(valproate)、拉莫三嗪(lamotrigine)、左乙拉西坦(levetiracetam)、拉考沙胺(lacosamide)、奥卡西平(oxcarbazepine)、氯巴占(clobazam)和唑尼沙胺(zonisamide)；和/或b)免疫抑制剂以及包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其变体中所示的氨基酸序列的肽。

在第十方面，通过在免疫测定中使用患者样品或所述样品的纯化衍生物作为阳性对照来解决该问题，所述样品或所述样品的纯化衍生物各自包含特异性结合脑发育调节蛋白的自身抗体。

在一个优选实施方案中，免疫测定是诊断性免疫测定，其包括对不知晓其中是否存在特异性结合脑发育调节蛋白的自身抗体的流体进行检查。

在一个优选实施方案中，所述载体选自载玻片、生物芯片、微量滴定板、侧向流动装置、测试条、膜、线印迹、色谱柱和珠粒。

在一个优选实施方案中，神经学疾病是神经学自身免疫性疾病，优选为脑炎、癫痫发作或癫痫。

在一个优选实施方案中，样品是血液、血清、血浆、脑脊液(CSF)、尿液或唾液。

在一个优选实施方案中，针对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的自身抗体选自IgG、IgA和IgM类抗体。

在一个优选实施方案中，检测包括印迹测定、化学发光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、光散射免疫测定、放射性标记免疫测定或免疫荧光测定。

在一个优选实施方案中，免疫抑制剂选自泼尼松(prednisone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、芬戈莫德(fingolimod)、多球壳菌素(myriocin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、依维莫司(everolimus)、西罗莫司(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)和环孢素(ciclosporin)。

本发明基于本发明人的如下惊人发现，即存在针对脑发育调节蛋白的自身抗体，并且这种自身抗体的出现与在患者中发现的几种神经学病况相关，特别是脑炎、癫痫发作和癫痫。因此，所述自身抗体的检测可用作诊断性生物标志物测定。另外，本发明人还被允许鉴定脑发育调节蛋白的两个特定区域，这两个区域表现出对这些自身抗体的结合活性。此外，用免疫抑制药物减少抗脑发育调节蛋白自身抗体的量可显著改善患者的病况。因此，抗脑发育调节蛋白自身抗体可用作治疗靶标。

不希望受任何理论束缚，此类自身抗体的存在表明脑发育调节蛋白和/或下游效应子的功能在具有此类抗脑发育调节蛋白自身抗体的患者中受损，从而造成神经学症状发生。

脑发育调节蛋白(UniProt Q16643[人]和Q9QXS 6[小鼠])是由DBN1基因编码的蛋白质。该蛋白是一种胞质型肌动蛋白结合蛋白，在神经元生长过程中发挥作用。脑发育调节蛋白是其调节与大脑发育相关的脑发育调节蛋白蛋白质家族的成员。大脑中脑发育调节蛋白含量的减少被认为是阿尔茨海默病记忆障碍的发病机制中的一种可能的促成因素。已经描述了至少两种编码不同蛋白质同种型的选择性剪接变体，诸如脑发育调节蛋白E(SEQ IDNO:3)和脑发育调节蛋白A(SEQ ID NO:4)。作为本发明的自身抗体的优选靶标以及本发明的用途和方法的优选手段的人、小鼠和大鼠脑发育调节蛋白的序列在本领域是众所周知的。

本发明涉及包含脑发育调节蛋白或与结合脑发育调节蛋白的自身抗体具有反应性的抗原性变体的哺乳动物(优选人)多肽的多肽。哺乳动物脑发育调节蛋白包括来自人、猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠或猪(优选人)的同源物。

在一个更优选的实施方案中，脑发育调节蛋白是由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4(UniProtKB参考：Q16643和Q16643-3；NM_004395、NM_080881、NM_001363541、NM_001364151、NM_001364152)编码的多肽。在整个本申请中，引用的任何数据库代码是指Uniprot数据库，更具体地是本申请或其最早优先权申请的提交日期时的版本。

本发明的教导不仅可使用多肽，特别是包含多肽诸如脑发育调节蛋白的天然序列的多肽或具有本申请中明确(例如通过功能、名称、序列或登录号)或隐含地提及的确切序列的核酸，而且还可使用此类多肽或核酸的变体来实施。

在一个优选实施方案中，如本文中所用，术语“变体”可以指提及的全长序列的至少一个片段，更具体地是指相对于全长序列在一个或两个末端被截短一个或多个氨基酸的一个或多个氨基酸序列或核酸序列。这种片段包含或编码具有原始序列或其变体的至少6个、7个、8个、10个、12个、15个、20个、25个、50个、75个、100个、150个或200个连续氨基酸的肽。变体的总长度可以是至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、750个、1000个或更多个氨基酸。在优选的替代实施方案中，变体的长度不超过645个、不超过640个、不超过630个、不超过620个、不超过610个、不超过600个、不超过550个、不超过500个、不超过450个、不超过400个、不超过350个、不超过300个、不超过250个、不超过200个、不超过180个或不超过160个氨基酸。在更优选实施方案中，变体，特别是上述长度受限的变体，包含SEQ ID NO.3和/或4中所示的氨基酸序列。除了SEQ ID NO.3和/或4的序列之外，长度受限的多肽还可包含源自脑发育调节蛋白和/或非脑发育调节蛋白片段的序列片段，诸如标签。

在其他优选实施方案中，该变体与SEQ ID NO.3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性，并且包含SEQ ID NO.1和/或SEQ IDNO.2的完整序列。

术语“变体”不仅涉及至少一个片段，而且还涉及包含与提及的参考氨基酸序列或其片段具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽或其片段，其中除了对于生物活性(例如抗原与(自身)抗体结合的能力或多肽的折叠或结构)所必需的那些氨基酸外的氨基酸被缺失或取代，和/或以保守方式替换一个或多个此类必需氨基酸，和/或添加氨基酸，使得多肽的生物活性得以保留。现有技术包括可用于比对两个给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的各种方法，参见例如Arthur Lesk(2008),Introduction to bioinformatics,OxfordUniversity Press,2008，第3版。在一个优选实施方案中，使用默认设置来利用ClustalW软件(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007).Clustal W和Clustal X 2.0版.Bioinformatics,23,2947-2948)。

在优选的实施方案中，所述变体和/或片段包含或编码SEQ ID NO:1和/或SEQ IDNO:2中所示的序列。

在一个优选实施方案中，变体是线性的未折叠的多肽，其任选是变性的。

在一个优选实施方案中，所述多肽及其变体可另外包含化学修饰，例如同位素标记或共价修饰，诸如糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧、瓜氨酸化、甲基化、羟基化等。本领域技术人员熟悉修饰多肽的方法。可以设计任何修饰，只要其不会消除变体的生物活性。在更优选的实施方案中，SEQ ID NO:4的647位的丝氨酸被磷酸化。

此外，变体还可通过与其他已知多肽或其变体融合产生，并且包含活性部分或结构域，所述活性部分或结构域优选地当与参考序列的活性部分比对时具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98或99％的序列同一性，其中如本文中所用，术语“活性部分”分别地指小于全长氨基酸序列的氨基酸序列，或者在核酸序列的情况下，编码小于全长氨基酸序列，和/或是天然序列的变体，但保留至少一定的生物活性。

在一个优选实施方案中，术语核酸的“变体”包括其互补链优选在严格条件下与参考或野生型核酸杂交的核酸。杂交反应的严格性可由本领域普通技术人员容易地确定，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，较长的探针需要较高的温度来进行正确的退火，而较短的探针则需要较低的温度来进行正确的退火。杂交通常取决于变性DNA与在低于其解链温度的环境中存在的互补链再退火的能力：探针与可杂交序列之间期望的同源性程度越高，则可使用的相对温度越高。因此，较高的相对温度倾向于使反应条件更严格，而较低的温度则倾向于使反应条件不太严格。关于杂交反应的严格性的其他细节和解释，参见Ausubel,F.M.(1995),Current Protocols in MolecularBiology.John Wiley&Sons,Inc.。此外，本领域技术人员可以遵循手册BoehringerMannheim GmbH(1993)The DIG System Users Guide for Filter Hybridization,BoehringerMannheim GmbH,Mannheim,Germany中以及Liebl,W.,Ehrmann,M.,Ludwig,W.和Schleifer,K.H.(1991)International Journal of Systematic Bacteriology 41:255-260中关于如何通过杂交鉴定DNA序列所给出的说明。在一个优选实施方案中，对任何杂交应用严格条件，即仅当探针与靶序列具有70％或更多同一性时才发生杂交。相对于靶序列具有较低程度的同一性的探针可以杂交，但此类杂交体是不稳定的并且将在严格条件下在洗涤步骤中除去，例如将盐浓度降低至2x SSC，或任选地和随后地，降低至0.5x SSC，而温度按递增的优先顺序为约50℃-68℃，约52℃-68℃，约54℃-68℃，约56℃-68℃，约58℃-68℃，约60℃-68℃，约62℃-68℃，约64℃-68℃，约66℃-68℃。在一个特别优选的实施方案中，温度为约64℃-68℃或约66℃-68℃。可以将盐的浓度调节至0.2x SSC或甚至0.1x SSC。相对于参考或野生型序列具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性程度的核酸序列可以是分离的。在一个优选实施方案中，如本文中所用，术语核酸序列的变体是指按照遗传密码的简并性，与参考核酸序列编码相同的氨基酸序列及其变体的任何核酸序列。

多肽的变体具有生物活性。在一个优选实施方案中，这种生物学活性是与结合脑发育调节蛋白的自身抗体特异性结合的能力，如在患有与这种自身抗体相关的自身免疫性疾病，优选诸如脑炎、癫痫发作或癫痫的神经学疾病或病况的患者中发现的。例如，可以通过确定目标变体是否与来自其自身抗体与野生型脑发育调节蛋白结合的患者样品的自身抗体结合(优选如通过本申请实验部分中描述的间接免疫荧光、酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光免疫测定(CLIA)或线印迹测定所测定的)来检查脑发育调节蛋白的变体是否具有这种生物学活性。

在优选的实施方案中，脑发育调节蛋白的变体是哺乳动物脑发育调节蛋白，其在相应的天然野生型蛋白质的N末端缺少至少310个、至少300个、至少250个、至少200个、至少150个、至少100个、至少70个、至少50个、至少30个、至少20个、至少10个、至少5个、至少10个、至少5个、至少4个、至少3个、至少2个或1个氨基酸。在更优选的实施方案中，脑发育调节蛋白的变体是根据SEQ ID NO.3的人脑发育调节蛋白E的氨基酸319至444和/或氨基酸536至649，或通过序列比对确定的任何其它哺乳动物物种的相应序列。

当用于实施本发明的教导时，根据本发明的任何多肽可以以任何形式和任何纯化的程度提供，从包含以内源形式存在的所述多肽的液体样品、组织或细胞(更优选过表达所述多肽的细胞、此类细胞的粗制裂解物或富集的裂解物)至任选地基本上纯的纯化的和/或分离的多肽)。在一个优选实施方案中，所述多肽是天然多肽，其中如本文中所用，术语“天然多肽”是指折叠的多肽，更优选是指从组织或细胞，更优选从哺乳动物细胞或组织，任选地从非重组组织或细胞纯化的折叠的多肽。在另一个优选实施方案中，所述多肽是重组蛋白质，其中如本文中所用，术语“重组的”是指在生产过程的任何阶段使用基因工程方法(例如通过将编码所述多肽的核酸与用于细胞或组织中过表达的强启动子融合，或者通过对多肽本身的序列进行工程化)产生的多肽。本领域技术人员熟悉用于对核酸和编码的多肽进行工程化(例如，Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning,CSH中或Brown T.A.(1986),Gene Cloning–an introduction,Chapman&Hall中描述的)以及用于产生和纯化天然或重组多肽(例如由GE Healthcare Life Sciences出版的手册“Strategies for Protein Purification”,“Antibody Purification”,“PurifyingChallenging Proteins”(2009/2010)，以及Burgess,R.R.,Deutscher,M.P.(2009),Guideto Protein Purification中)的方法。在一个优选实施方案中，如果如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳然后通过考马斯蓝染色和目视检查所判断的，相应样品中至少60％、70％、80％、90％、95％或99％的多肽由所述多肽组成，则多肽是纯的。

如果本发明的多肽以组织形式提供，则优选地组织是哺乳动物组织，例如人、大鼠、灵长类动物、驴、小鼠、山羊、马、绵羊、猪或牛的组织，更优选脑组织，最优选包含树突的脑组织诸如小脑和海马。如果使用细胞裂解物，优选地细胞裂解物包含胞质级分。如果所述多肽以重组细胞的形式提供，则优选地重组细胞是真核细胞，诸如酵母细胞，更优选来自多细胞真核生物诸如植物、哺乳动物、青蛙或昆虫的细胞，最优选来自哺乳动物例如大鼠、人、灵长类动物、驴、小鼠、山羊、马、绵羊、猪或牛的细胞。

用于实施本发明教导的多肽(包括任何变体)优选被设计为使得其包含至少一个被与脑发育调节蛋白结合的自身抗体识别的表位和/或与结合脑发育调节蛋白的自身抗体特异性结合。与观察到的对其它(自身)抗体的结合相比，所述表位可显示出对结合天然脑发育调节蛋白的自身抗体的最强结合。在一个实施方案中，此类多肽包含6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、113个、125个或更多个，优选至少9个但不超过16个来自脑发育调节蛋白的连续氨基酸的区段。本领域技术人员熟悉用于设计具有足够免疫原性的肽的指导，例如Jackson,D.C.,Fitzmaurice,C.J.,Brown,L.E.,Zeng,W.(1999),Preparation and properties oftotally synthetic immunogenes,Vaccine第18卷，3-4期，September 1999，第355–361页；以及Black,M.,Trent,A.,Tirrell,M.和Olive,C.(2010),Advances in the design anddelivery of peptide subunit vaccines with a focus on Toll-like receptoragonists,Expert Rev Vaccines,2010February；9(2):157–173中描述的指导。简言之，希望肽尽可能多地满足以下要求：(a)其具有高度亲水性，(b)其包含一个或多个选自天冬氨酸、脯氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的残基，(c)为了更高的特异性，其与其他已知的肽或多肽没有或几乎没有同源性，(d)其需要具有足够的可溶性，以及(e)除非出于特定的原因需要，否则其不包含糖基化或磷酸化位点。或者，可以遵循生物信息学方法，例如由Moreau,V.,Fleury,C.,Piquer,D.,Nguyen,C.,Novali,N.,Villard,S.,Laune,D.,Granier,C.和Molina,F.(2008),PEPOP:Computational design of immunogenic peptides,BMCBioinformatics 2008,9:71描述的生物信息学方法。

当根据本发明使用时，本发明的多肽可以以任何种类的构象提供。例如，所述多肽可以是基本上解折叠的多肽、部分或完全折叠的多肽。在一个优选实施方案中，所述多肽在与本发明的自身抗体结合所必需的表位或者该蛋白质或其变体在其整体上采取天然蛋白质在其天然环境中所采取的折叠的意义上是折叠的。本领域技术人员熟悉适合于确定多肽是否折叠以及如果其是折叠的那么具有哪种结构的方法，例如有限蛋白质水解、NMR光谱学、CD光谱学或X射线晶体学(参见例如Banaszak L.J.(2008),Foundations ofStructural Biology,Academics Press，或Teng Q.(2013),Structural Biology:Practical Applications,Springer)，优选使用CD光谱学。

本发明的多肽可以是融合蛋白，其包含除获自脑发育调节蛋白的氨基酸序列外的其他氨基酸序列，特别是C-末端或N-末端标签，优选N-末端标签，如本文中所用，所述标签在一个优选实施方案中是具有一定生物学或物理功能并且可以例如用于纯化、固定、沉淀或鉴定本发明的多肽的具有功能的另外的序列基序或多肽。在一个更优选实施方案中，所述标签是能够与配体特异性结合的序列或结构域，例如选自His标签、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、荧光标签(例如选自包括绿色荧光蛋白的组)的标签。

本发明的多肽可以是固定化多肽。在一个优选实施方案中，如本文中所用，术语“固定化”是指与不溶于水性溶液的固体载体结合(更优选通过共价键、静电相互作用、包封或截留(例如通过使球状多肽在凝胶中变性)，或通过疏水相互作用，最优选通过一个或多个共价键)的分子。各种合适的载体，例如纸、聚苯乙烯、金属、硅或玻璃表面、微流体通道、膜、珠粒诸如磁珠、柱层析介质、生物芯片、聚丙烯酰胺凝胶等已描述于文献，例如Kim,D.,and Herr,A.E.(2013),Protein immobilization techniques for microfluidicassays,Biomicrofluidics 7(4),041501中。这样，可以直接的方式(例如通过过滤、离心或倾析)将固定化分子与不溶性载体一起从水性溶液中分离出来。可以以可逆或不可逆的方式固定固定化分子。例如，如果分子通过可通过添加高浓度的盐来掩蔽的离子相互作用与载体相互作用，或者如果分子通过可裂解的共价键(诸如可通过添加含硫醇的试剂来裂解的二硫桥)结合，固定是可逆的。相反，如果分子通过不能在水性溶液中裂解的共价键(例如通过环氧化物基团与常用于将赖氨酸侧链偶联至亲和柱的胺基团的反应形成的键)系连于载体，则固定是不可逆的。可以例如通过以下方式间接固定蛋白质：固定对所述分子具有亲和力的抗体或其他实体，然后形成复合物以达到固定分子-抗体复合物的效果。固定分子的各种方法描述于文献例如Kim,D.,Herr和A.E.(2013),Protein immobilizsationtechniques for microfluidic assays,Biomicrofluidics 7(4),041501中。另外，用于固定反应的各种试剂和试剂盒可以例如从Pierce Biotechnology商购获得。

必要的是，用于按照根据本发明的自身抗体的检测的溶液或样品包含抗体(也称为免疫球蛋白)。通常，体液样品包含全部的受试者免疫球蛋白的代表性组。然而，一旦提供，就可对样品或溶液进行进一步处理，所述处理可包括分级分离、离心、富集或分离受试者的全部免疫球蛋白或任何免疫球蛋白类别，这可影响各类免疫球蛋白的相对分布。

在整个本申请中描述的试剂、装置、方法和用途可用于鉴定具有增加的患疾病的风险的受试者。在一个优选实施方案中，所述疾病是神经学疾病。在一个更优选的实施方案中，如本文中所用，术语“神经学疾病”是指与神经系统缺陷相关的任何疾病。在另一个优选的实施方案中，该疾病是与自身免疫(或自身抗体)相关的神经学疾病。这意味着所述神经学病况是由与天然脑发育调节蛋白结合的自身抗体直接或间接引起的。因此，在一个优选实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可以用于鉴定患有神经学疾病的受试者，优选自身免疫性相关神经学疾病，甚至更优选与特异性结合脑发育调节蛋白的自身抗体相关的自身免疫性相关神经学疾病。在进一步更优选的实施方案中，该疾病是脑炎、癫痫发作和/或癫痫。在其他优选实施方案中，脑炎是边缘叶脑炎(limbic encephalitis，LE)。此外，在本发明的替代优选实施方案中，该疾病是心动过缓、脑脊液(CSF)蛋白含量增加、杏仁核和海马肿胀或海马硬化症。另外，患有神经学疾病的患者还可能患有癌症，优选患有白血病诸如慢性粒细胞白血病(CGL)。

在许多情况下，仅仅检测，换句话说，确定是否存在可检测水平的所述抗体，足以用于评估。如果可以检测到自身抗体，这将是有助于临床医生的信息，并且表明患者将患有疾病的可能性增加。在一个优选实施方案中，如果可以使用选自免疫沉淀、间接免疫荧光、ELISA、CLIA或线印迹，优选间接免疫荧光的一种或多种方法检测到自身抗体，则认为其是可检测的。在优选实施方案中，使用定量或定性检测来进行自身抗体的检测。在优选替代实施方案中，可以测定血清中与可在平均健康受试者中发现的水平相比的抗体的相对浓度。虽然在许多情况下确定样品中是否存在或可检测自身抗体可能就足够了，但获得有助于诊断的信息所进行的方法可能涉及确定浓度是否为平均健康受试者中发现的浓度的至少2倍，优选至少5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、10000倍或100000倍。在一个优选实施方案中，使用选自半定量免疫沉淀、半定量间接免疫荧光、ELISA、CLIA或半定量线印迹中的一种或多种方法(优选ELISA或CLIA)测定自身抗体的相对浓度。实验细节是在如本申请的实验部分中或如在本申请优先权日期可获得的教科书或实用手册中所述的。

本领域技术人员将理解，临床医生通常不会仅基于单个参数来判断患者是否将可能患有疾病、病况或病症，而是需要考虑其他方面，例如其他自身抗体、标志物的存在、血液参数、任何症状的临床评估或医学成像或其他非侵入性方法(诸如多导睡眠描记法)的结果。参见Baenkler H.W.(2012),General aspects of autoimmune diagnostics,in Renz,H.,Autoimmune diagnostics,2012,de Gruyter，第3页。根据本发明的药剂或方法的价值也可能存在于排除一种疾病的发展的可能性。在一个优选实施方案中，整个本申请中提及的任何症状或疾病的含义符合本领域技术人员截止申请日或优选地本申请的最早优先权日时的理解(如教科书和科学出版物所证明的)。

任选地用于确定患者是否可能发展疾病的本发明方法、多肽或用途可包括优选地从人受试者获得包含抗体的样品或溶液，确定是否存在与脑发育调节蛋白结合的自身抗体，其中通过使样品与本发明的多肽接触并优选地使用标记的二抗检测在所述多肽与所述自身抗体之间是否发生结合来进行所述测定，其中如果存在于样品中，则所述自身抗体与所述多肽结合，并且如果所述自身抗体经测定存在于样品或溶液中，则将患者评估为更可能患有所述疾病。

本发明涉及包含与本发明的多肽结合的抗体，优选自身抗体的复合物。可作为用于鉴定具有增加的发展疾病的风险的受试者的方法的一部分使用这种复合物或检测这种复合物。如果要检测针对脑发育调节蛋白的自身抗体，则可使用来自受试者的包含抗体的液体样品来实施该方法。这种液体样品可以是来自受试者的包含代表性抗体组的任何体液，优选来自受试者的包含一个免疫球蛋白类别的抗体的样品，所述抗体选自IgG、IgA和IgM类抗体，优选IgG，更优选IgG1和IgG2，更优选IgG1。例如，样品可以是脑脊髓液(CSF)、血液或血清、淋巴液、间质液，优选为血清或CSF，更优选CSF。其优选是离体样品。

使包含抗体的液体样品或溶液与本发明的多肽接触的步骤可以通过在包含抗体的样品或溶液存在的情况下，在与包含相应多肽和与本发明的多肽结合的抗体(优选自身抗体)的复合物的形成相容的条件下孵育所述多肽的固定化形式来进行。随后可除去耗尽了与本发明的多肽结合的抗体的液体样品或溶液，然后进行一个或多个洗涤步骤。最后，可检测包含所述抗体和所述多肽的复合物。在一个优选实施方案中，术语“与复合物的形成相容的条件”是允许特异性抗原-抗体相互作用以构建包含所述多肽和所述抗体的复合物的条件。在一个优选实施方案中，此类条件可包括在25℃在PBS缓冲液中以1:100稀释的样品中孵育多肽30分钟。在一个优选实施方案中，如本文中所用，术语“自身抗体”是指与产生所述自身抗体的动物(优选哺乳动物)的内源性分子特异性结合的抗体，其中更优选地这种抗体的水平相较于与这种内源性分子特异性结合的任何其他抗体的平均水平有升高。在一个更优选实施方案中，自身抗体是与脑发育调节蛋白结合的自身抗体，在甚至更优选实施方案中，自身抗体是结合脑发育调节蛋白的人自身抗体。

根据本发明的方法优选是一种体外方法。在甚至更优选的实施方案中，本发明的组合物和/或本发明的在诊断上有用的载体用于神经学疾病的体外诊断。

在一个优选实施方案中，用于根据本发明的预后、评估、鉴定、方法或测试试剂盒的复合物的检测包括使用选自免疫扩散技术、免疫电泳技术、光散射免疫测定、凝集技术、标记免疫测定(诸如来自包括放射性标记的免疫测定、酶免疫测定(优选ELISA)、化学发光免疫测定和免疫荧光(优选间接免疫荧光技术)的组的那些)的方法。本领域技术人员熟悉这些方法，所述方法也描述于现有技术中，例如Zane,H.D.(2001),Immunology–Theo-retical&Practical Concepts in Laboratory Medicine,W.B.Saunders Company，第14章。

或者，可使用包含含有本发明的多肽的组织的样品而非液体样品。组织样品优选来自表达内源性脑发育调节蛋白的组织，优选来自相较于相应的生物体(优选人体)中的平均组织而言以升高的水平表达内源性脑发育调节蛋白的组织。然后可将这种样品(其可以以固定在载体例如载玻片上(以用于显微镜分析)的组织切片形式存在)和与本发明的多肽结合的本发明的抗体(优选自身抗体)接触。优选标记抗体以允许区分与本发明的多肽结合的内源性抗体，使得可以检测以及任选地定量新形成的复合物。如果形成的复合物的量低于取自健康受试者的样品中发现的量，则已从其获取所检查的样品的受试者可能患有疾病。

可将证明包含所述抗体和本发明多肽的复合物的存在或不存在的任何数据与参考数据产生关联。例如，所述复合物的检测表明提供所分析的样品的患者在将来可能患有疾病。如果患者正在接受治疗并且再次运行获得诊断相关信息的方法，则可将在两次运行中检测到的复合物的量产生关联以弄清关于疾病进展和/或治疗成功的情况。

在一个优选实施方案中，本发明提供了用于分析来自患者的样品以检测一种或多种抗体的装置，所述抗体指示神经学自身免疫性疾病的可能性增加，其中所述抗体是特异性结合脑发育调节蛋白的自身抗体，所述装置包括：

a.载体，其包含用于当样品与载体接触时从样品中捕获至少一种抗体的工具；

b.可检测工具，当其与载体接触时，能够结合所述载体捕获的抗体，特别地可检测工具是能够结合载体上捕获的抗体的标记的二抗；

c.任选地，用于从载体和可检测工具中除去任何样品(优选通过洗涤)的工具；

d.检测装置，其用于检测可检测工具的存在并将结果转换成电信号，以及

e.任选地一种工具，其用于接收来自检测装置的电子信号，并通过与在背景中检测到的信号水平或利用来自健康受试者的样品获得的输入参考值的比较来确定信号的水平是否表示神经学自身免疫性疾病的可能性增加，特别是脑炎、癫痫发作或癫痫的可能性增加。

在另一个优选实施方案中，按照本发明教导的预后、评估、鉴定、方法或测试试剂盒包括间接免疫荧光的使用。本领域技术人员熟悉此类技术和合适样品的制备，其描述于现有技术(US4647543；Voigt,J.,Krause,C.,

E,Saschenbrecker,S.,Hahn,M.,Danckwardt,M.,Feirer,C.,Ens,K,Fechner,K,Barth,E,Martinetz,T.和

W.(2012),Automated Indirect Immunofluorescence Evaluation of AntinuclearAutoantibodies on HEp-2 Cells,”Clinical and Developmental Immunology，第2012卷，doi:10.1155/2012/65105；Bonilla,E.,Francis,L.,Allam,F.等，Immuno-fluorescence microscopy is superior to fluorescent beads for detection ofantinuclear antibody reactivity in systemic lupus erythematosus patients,Clinical Immunology，第124卷，第1期，第18–21页,2007)中。合适的试剂、装置和软件包可以例如从EUROIMMUN,Lübeck,Germany商购获得。

可以对样品进行测试以仅确定是否存在与脑发育调节蛋白结合的自身抗体，但优选的是，方法、测试、装置等包括确定针对一种或多种另外多肽(优选与神经学自身免疫性疾病相关)的自身抗体的存在，所述多肽优选选自，更优选全部来自包含以下的组：Hu、Yo、Ri、CV2、PNMA1、PNMA2、DNER/Tr、ARHGAP26、ITPR1、ATP1A3、NBC1、Neurochrondrin、CARPVIII、Zic4、Sox1、Ma、MAG、MP0、MBP、GAD65、双载蛋白(amphiphysin)、恢复蛋白、GABA A受体(EP13189172.3)、GABA B受体(EP2483417)、甘氨酸受体、桥尾蛋白(gephyrin)、IgLON5(US2016/0349275)、DPPX(US2015/0247847)、水通道蛋白-4、MOG、NMDA受体、AMPA受体、GRM1、GRM5、LGI1、VGCC以及mGluR1和CASPR2，优选将所述抗原固定在例如医疗装置(诸如线印迹)上。相关标志物Neurochrondrin(EP15001186)、ITPR1(EP14003703.7)、NBC1(EP14003958.7)、ATP1A3(也称为人神经元Na(+)/K(+)ATP酶的α3亚基(EP14171561.5)、阀蛋白1/2(EP3101424)、NSF、STX1B以及VAMP2(EP17001205.8)和RGS8(EP17000666.2)，已在现有技术中有描述。

根据本发明的教导，提供了用于评估或鉴定的与本发明的多肽结合的抗体，优选自身抗体。本领域技术人员熟悉纯化抗体的方法，例如Hermanson,G.T.,Mallia,A.K.和Smith,P.K.(1992),Immobilized Affinity Ligand Techniques,San Diego:AcademicPress中描述的方法。简言之，固定与目标抗体特异性结合的抗原(所述抗原是本发明的多肽)，并将其用于通过亲和色谱从适当的来源纯化目标抗体。可将包含本发明人鉴定的来自患有自身免疫性病症和/或神经学病症的患者的抗体的液体样品用作来源。

根据本发明，提供了抗体，例如人自身抗体，其能够与脑发育调节蛋白特异性结合。反之亦然，脑发育调节蛋白的变体与和脑发育调节蛋白特异性结合的自身抗体特异性结合。在一个优选实施方案中，如本文中所用，术语“抗体”是指任何基于免疫球蛋白的结合部分，更优选包含至少一个免疫球蛋白重链和一个免疫球蛋白轻链的结合部分(包括但不限于单克隆和多克隆抗体以及抗体的变体，特别是片段)，所述结合部分能够与相应的抗原结合，更优选与其特异性结合。在一个优选实施方案中，如本文中可互换所用，术语“特异性结合”、“特异性地结合”或“特异性捕获”意指所述结合要强于特征在于1x 10^-5M，更优选1x10^-7M，更优选1x 10^-8M，更优选1x 10^-9M，更优选1x 10^-10M，更优选1x 10^-11M，更优选1x 10^- ¹²M(如使用Biacore设备在25℃下在pH7的PBS缓冲液中通过表面等离子体共振测定的)的解离常数的结合反应。抗体可以是异质的自身抗体制剂的一部分或可以是同质的自身抗体，其中异质制剂包含如可通过从人供体血清制备(例如通过亲和色谱，其使用固定化抗原以纯化能够与所述抗原结合的任何自身抗体)获得的多种不同的自身抗体种类。抗体可以是糖基化的或非糖基化的。本领域技术人员熟悉可用于鉴定、产生和纯化抗体及其变体的方法，例如EP 2 423 226 A2和其中的参考文献中描述的方法。

本发明提供了一种用于分离与脑发育调节蛋白结合的自身抗体的方法，其包括以下步骤：a)使包含所述抗体的样品与本发明的多肽接触以形成复合物，b)分离在步骤a)中形成的复合物，c)解离在步骤b)中分离的复合物，以及d)将所述抗体与本发明的多肽分离。来自本发明人鉴定的患有新型神经学病症的患者的样品可用作抗体来源。合适的方法描述于现有技术中，例如由GE Healthcare Life Sciences出版的手册“Affinitychromatography”,“Strategies for Protein Purification”and“AntibodyPurification”(2009/2010)中和Philips,Terry,M.,Analytical techniques inimmunochemistry,1992,Marcel Dekker,Inc.中。

本发明提供了包含本发明多肽的药物组合物，所述组合物优选适合施用于受试者，优选哺乳动物受试者，更优选施用于人。这种药物组合物可包含药学上可接受的载体。药物组合物可以例如通过口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、通过滴眼、经直肠、经鼻腔、经颊、经阴道或通过植入的储库施用，其中如本文中所用，术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。药物组合物可以以合适的剂型(例如胶囊、片剂和含水悬浮液和溶液)，优选以无菌形式提供。其可用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明的多肽。在一个优选实施方案中，本发明提供了包含本发明的多肽的疫苗(其任选地包含辅助剂诸如佐剂或缓冲剂)，以及本发明的多肽用于制备疫苗的用途。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有的溶剂(例如水和水基缓冲液)、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适于局部、口服、颊、阴道、直肠、肺、鼻、透皮、静脉内、肌内、皮下、鞘内、脑内或肠胃外施用(例如通过注射)。赋形剂包括药学上可接受的稳定剂和崩解剂。这种介质和试剂用于药物活性物质在本领域中是众所周知的。除了任何常规介质或试剂与肽类化合物不相容以外，还设想了其在药物制剂中的使用。还可将补充活性化合物掺入组合物中。

在本发明的范围内，提供了医学装置，其包含，优选涂覆有用于检测本发明的(自身)抗体和/或本发明的多肽的试剂。优选地，这种医学装置包含本发明的多肽，其形式允许以直接的方式使其与水性溶液，更优选液体人样品接触。特别地，可将本发明的多肽固定(直接或间接)在载体表面上，所述载体优选选自玻璃板或载玻片、生物芯片、微量滴定板、珠粒(例如磁珠)、单采装置、色谱柱、膜等。示例性医疗装置包括线印迹、微量滴定板、用于显微镜检查的载玻片、珠粒(优选磁珠)和生物芯片。除了本发明的多肽以外，医学或诊断装置还可包含另外的多肽，例如阳性或阴性对照，诸如包含或不包含与目标多肽结合的抗体或与具有诊断价值的自身抗体结合的已知的其他抗原(特别是与和一种或多种相同或相似症状相关的其他疾病相关的抗原)的样品。

本发明的教导提供了优选用于鉴定具有增加的发展疾病的风险的受试者的试剂盒。这种试剂盒可包括详细说明如何使用该试剂盒的说明书和用于使本发明的多肽与来自受试者(优选人受试者)的体液样品接触的工具(例如线印迹)，其中将本发明的多肽固定在线印迹上。此外，试剂盒还可包含阳性对照，例如一批已知结合根据本发明的多肽的自身抗体或重组抗体，和阴性对照(例如，对本发明的多肽不具有可检测的亲和力的蛋白质诸如牛血清白蛋白)。最后，这种试剂盒可包含用于制备校准曲线的与脑发育调节蛋白结合的抗体的标准溶液。

在一个优选实施方案中，试剂盒包含用于检测与本发明的多肽结合的自身抗体(优选通过检测包含本发明的多肽和与本发明的多肽结合的抗体的复合物)的工具。此类工具优选是与所述复合物结合并修饰复合物或携带标记物以使复合物可检测的试剂。例如，所述工具可以是在除一抗识别的结合位点外的结合位点处与所述多肽结合或与一抗的恒定区结合的经标记的抗体。或者，所述工具可以是与自身抗体的恒定区结合的二抗，优选对哺乳动物IgG类抗体特异的二抗。更优选地，所述标记的二抗特异性结合人IgG、IgA或IgM。用于检测这种复合物的多种方法和工具已描述于现有技术中，例如Philips,Terry,M.,Analytical techniques in immunochemistry,1992,Marcel Dekker,Inc.中。

如本文中所用，“标记”、“可检测的标记”或“标记物”或“可检测的标记物”在说明书中可互换使用，是指连接到蛋白质或核酸上的任何化学部分，其中连接可以是共价或非共价的。优选地，该标记是可检测的，并且使得该蛋白质或核酸能够由本发明的从业者所检测到。可检测的标记包括发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光猝灭剂、有色分子、放射性同位素或闪烁剂。可检测的标记还包括任何有用的接头分子(如生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、HRP、蛋白A、蛋白G、抗体或其片段、Grb2、多组氨酸、Ni²⁺、FLAG标签、myc标签)、重金属、酶(例子包括碱性磷酸酶、过氧化物酶和萤光素酶)、电子供体/受体、吖啶酯、染料和量热底物。还可以设想，质量的变化可以被认为是可检测的标记，如表面等离子体共振检测的情况。本领域技术人员将容易认识到上述未提及的有用的可检测标记，其可用于本发明的操作中。

脑发育调节蛋白或其变体可以以包含和/或表达编码所述多肽的核酸的细胞的形式产生或提供。如果使用包含编码本发明的多肽或其变体的序列的核酸，则这种核酸可以是未修饰的核酸。在一个优选实施方案中，核酸是这样的核酸，其本身不存在于自然界中并且与天然核酸相比包含至少一种修饰，例如同位素含量或化学修饰，例如甲基化、序列修饰、表示合成来源的标记等。在一个优选实施方案中，所述核酸是重组核酸或核酸的一部分，并且在一个更优选的实施方案中，是载体的一部分，其中其可以与允许核酸表达(优选过表达)的启动子功能性连接。本领域技术人员熟悉各种合适的载体，其可以例如从Origene商购获得。例如，可使用编码具有N末端GFP的融合构建体的载体。细胞可以是真核细胞或原核细胞，优选真核细胞，诸如酵母细胞，更优选为哺乳动物细胞，更优选人细胞，诸如HEK293细胞。哺乳动物细胞的实例包括HEK293、CHO或COS-7细胞。包含编码本发明的多肽的核酸的细胞可以是重组细胞或分离的细胞，其中术语“分离的”意指富集细胞，使得与野生型的所述细胞的环境相比，存在更少的其他分化或种类的细胞或事实不存在此类其他细胞。

在一个优选实施方案中，根据本发明的医疗装置，优选适用于显微镜检查的载玻片，包含来自包含表达(优选过表达)脑发育调节蛋白或其变体的第一真核细胞、表达内源性脑发育调节蛋白的真核(优选哺乳动物)组织诸如大鼠或灵长类动物小脑、第二真核细胞(其是与第一真核细胞相同类型的细胞，但不表达或过表达脑发育调节蛋白)的组的一种或多种(优选所有)组分。第一和第二真核细胞是源自分离的细胞系诸如HEK293的培养细胞。优选地，第一和第二细胞各自用共享相同骨架的载体转染，其中用于转染第一细胞的载体包含编码脑发育调节蛋白或其变体的核酸，并且用于转染第二细胞的载体不包含脑发育调节蛋白或其变体。第二细胞可用作阴性对照。所述组分(细胞和组织)在医疗装置上可以是空间上分开的，使得它们可被独立地评估，来自一种试剂的抗原不会污染另一种试剂。在一个更优选的实施方案中，第一和/或第二细胞是固定的细胞，例如使用甲醇或丙酮固定的。在现有技术中描述了用于固定细胞的方案。作为另外的组分，可提供第二经标记的抗体(优选用荧光染料标记)。所述组分和医疗装置可以是试剂盒的一部分。

在一个优选实施方案中，使用微量滴定板、膜、印迹诸如斑点印迹或线印迹来实施根据本发明的诊断方法。本领域技术人员熟悉线印迹的实验设置，这描述于现有技术(Raoult,D.和Dasch,G.A.(1989),The line blot:an immunoassay for monoclonal andother antibodies.Its application to the serotyping of gram-negativebacteria.J.Immunol.Methods,125(1-2),57-65；WO2013041540)中。如果医疗装置是线印迹，则其可包含固定在膜(优选呈测试条的形状)上的脑发育调节蛋白或其变体。膜可包含一种或多种另外的抗原，其在空间上与脑发育调节蛋白分开。膜可以包含指示样品诸如血液样品添加的对照条带，和/或指示二抗添加的对照条带。试剂盒可包含任何组分，优选全部来自包括线印迹、二抗和洗涤溶液的组。

在另一个优选实施方案中，医疗装置是包含至少8个孔的微量滴定板。至少一个孔直接或间接包被有脑发育调节蛋白或其变体。提供至少3种，优选4种，更优选5种校准物，其包含确定浓度的针对脑发育调节蛋白的抗体，并且可用于建立用于半定量分析的校准曲线。可提供包含酶促活性标记物的二抗。试剂盒可包含任何组分，优选全部来自包含微量滴定板、校准物、洗涤溶液和二抗的组。

在另一个优选实施方案中，医疗装置是直接或间接包被有脑发育调节蛋白或其变体的珠粒。珠粒可选自磁珠和荧光珠。可使用包含能够提供化学发光或发荧光的标记物的二抗。可提供包含针对脑发育调节蛋白的抗体的阳性对照。可提供至少3种，优选4种，更优选5种校准物，所述校准物包含确定浓度的针对脑发育调节蛋白的抗体，并且可用于建立用于半定量分析的校准曲线。如果标记物能够产生化学发光，则可提供包含化学发光反应所需的其他组分的溶液。例如，如果标记物是酶，则溶液包含底物。如果标记物是能够产生化学发光的化合物诸如吖啶酯，则在溶液中提供反应所需的其他化合物。试剂盒可包含任何组分，优选全部来自包含珠粒、二抗、校准物、洗涤溶液和包含其他组分的溶液的组。

本发明的教导不仅可用于评估或鉴定，而且还可用于预防或治疗疾病，更具体地说，用于预防或治疗疾病的方法，其包括以下步骤：a)降低受试者的血液中与本发明的多肽结合的自身抗体的浓度，和/或b)施用一种或多种免疫抑制药物，所述免疫抑制药物优选选自利妥昔单抗、泼尼松、甲泼尼龙、环磷酰胺、吗替麦考酚酯(mycophenolatemofetil)、静脉注射免疫球蛋白、他克莫司、环孢菌素、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、地塞米松、氢化可的松、巯基嘌呤、芬戈莫德(fingolimod)、多球壳菌素(myriocin)、霉酚酸、依维莫司、西罗莫司、丙戊酸、拉莫三嗪、左乙拉西坦、拉科沙胺、奥卡西平、氯巴占、唑尼沙胺和/或药物组合物。

在一个优选实施方案中，本发明提供了用于检测针对脑发育调节蛋白的自身抗体的试剂或与这种自身抗体结合的试剂，或编码脑发育调节蛋白或变体的核酸或与编码脑发育调节蛋白的核酸特异性杂交的核酸或包含所述核酸的载体或细胞在制备用于诊断疾病的试剂盒中的用途。

在一个优选实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可以用于体外测试设计用于从患者血液中去除自身抗体的医疗装置的功效，其中对除患者血液外的液体进行所述测试。在将医疗装置用于患者后，可通过使包含针对脑发育调节蛋白的抗体的溶液运行通过所述装置，然后使用根据本发明的方法确认已通过装置的溶液中存在较少的抗体或没有抗体(即显示该装置仍具有从溶液中除去抗体的能力)来检查其去除自身抗体的能力。或者，从包含大量装置的批次中，可以测试少量装置，以在质量控制的意义上确认或测试整个批次的质量，其中样品或溶液可包含已知浓度的针对脑发育调节蛋白的抗体。

在另一个优选实施方案中，该方法可用于确认抗体检测测定的可靠性，并且可涉及检测溶液中的针对脑发育调节蛋白的抗体，所述溶液不是来自患者的样品，而是已知包含针对脑发育调节蛋白的抗体(优选以已知的浓度)。或者，溶液可以是不包含所述抗体的阴性对照以检查背景。可将这种方法与诊断方法并行地、在其之后或在其之前运行。在一个优选实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可以用于产生自身抗体谱，优选用于检测哺乳动物(优选人)的疾病。在一个优选实施方案中，任何方法或用途可以用于检测来自神经学疾病患者的样品中的疾病相关标志物。

在一个优选实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可用于鉴定具有患神经学疾病或发展出神经学疾病，优选自身免疫相关神经学疾病的风险的受试者。

图1显示了抗脑发育调节蛋白AB⁺患者的临床血清学参数。图例：Pat.–患者；age–癫痫发作的年龄；m–男性；f–女性；ANA–抗核抗体；neg.–阴性；CSF–脑脊液；↑–增加；↓–减少；pleoc.–脑脊液细胞增多；EEG–脑电图；L–左；R–右；bilat–双侧；temp–颞颥的；front–额的；CGL–慢性粒细胞性白血病；FD–首次诊断；MTX–甲氨蝶呤；Pred.–泼尼松龙；MRI–磁共振成像；hip–海马体；amy–杏仁核；hem–半球；swelling–体积增加和T2/FLAIR-高强度；V–体积。

图2显示了抗脑发育调节蛋白AB⁺患者的临床血清学方面的神经心理学动态。图例：Pat.–患者；AED–抗癫痫药，数字指每日剂量，单位为mg；Val–丙戊酸；拉莫三嗪；Lev–左乙拉西坦；Lac–拉考沙胺；Oxc–奥卡西平；Clob–氯巴占；Zon–唑尼沙胺；IS–免疫抑制剂疗法；Pred.(p.)–泼尼松龙(脉冲)；MRI–磁共振成像；R–右；L–左；↑–体积增加；↓–体积减小；hip–海马体；amy–杏仁核；hemis–半球；par–顶骨；temp-pol–颞侧；AB status–抗脑发育调节蛋白自身抗体状态，数字指具体的滴度；s–血清；csf–脑脊液；Exec./Verb./Fig.Mem.–执行/语言/形象记忆；BDI–贝克斯抑郁量表；空白空间：这些时间点没有可用的数据；对于IQ，执行/语言/形象记忆，BDI:++++–高于平均水平的表现；+++–平均表现；++–低于平均水平1个SD的表现；+–低于平均水平2个SD的表现；0–比平均值低2个SD以上的表现；1(06/13)。

图3显示了抗脑发育调节蛋白AB⁺患者的代表性cMRI和神经病理学发现。(A-D)cMRI扫描(T2-FLAIR(流体衰减反转恢复)图像)上的发现范围从非常细微到广泛变化，不仅涉及边缘结构，而且还涉及皮质结构。(A)2号患者的cMRI显示右侧杏仁样区域的肿胀以及T2高强度(白色箭头)以及右侧海马结构的内部器官样结构的一定损失(B,白色箭头)。(C)与这些局限性边缘改变相反，在4号患者中，cMRI显示左半球广泛萎缩(白色箭头)以及左侧杏仁核的一些肿胀。(D)另外，左侧海马体的体积仅略微减小(白色箭头)。(E)在4号患者的皮质活组织检查中的HE(苏木精和伊红)染色中，可以看到密度相当大的单核细胞浸润，病灶位于较深的皮质层(星号)。有明显的水肿，并且除了淋巴细胞簇集在神经元周围(E，插图中的黑色箭头)，还存在巨噬细胞浸润。(F)单核细胞浸润对应于CD3阳性的T淋巴细胞(黑色箭头)以及(G)簇集在血管结构周围(箭头)和定位在实质内位置(星号)的CD8阳性T淋巴细胞。(H)用抗NeuN(神经元细胞核)抗体进行的免疫组织化学显示在下皮层中有大量的神经元细胞丢失(星号)。(I)同时，GFAP免疫组织化学中存在广泛的纤维和细胞星形胶质细胞增生(星号)。(J)相应地，用抗HLA-DR抗体进行的免疫组织化学显示了广泛活化的、高度分枝的小神经胶质细胞浸润(星号)以及巨噬细胞的存在，其中一些位于血管周围(黑色箭头；条形图对应于200μm(在E、G及H中)、50μm(在E中的插图中)、100μm(在F、I和J中))。不存在syndecan阳性浆细胞(数据未显示)。

图4显示了与治疗方面相关的癫痫发作和抗脑发育调节蛋白自身抗体滴度的动力学。1号、3号和4号患者在血清学参数和癫痫发作结果方面对免疫疗法反应良好。在免疫疗法下，1号和4号患者通过一系列cMRI检查评估的杏仁核和海马体积减小。2号患者在AED(抗癫痫药)疗法后临床症状有所改善。无癫痫发作间隔以灰色突出显示。结果(三角形)是根据维克里的分类报告的：0-无癫痫发作，1-先兆，2-1-10次癫痫发作/年；3–>10次癫痫发作/年。杏仁核/海马体积(等长T1-序列)是以百分比表示的杏仁核/海马的平均相对体积(mamy/m-hc)。AED-抗癫痫药；pred–泼尼松龙脉冲。

图5显示了抗脑发育调节蛋白自身抗体的表征。(A)在人、大鼠、小鼠和突触体级分裂解物包被的印迹上孵育代表性患者的血清，显示出显著的强条带模式(～130kDa、～105kDa、～70kDa和～55kDa，星号)。(B)用免疫印迹筛选阴性对照和索引患者(1号患者)的血清进行免疫沉淀后用考马斯染色的SDS-PAGE，后者具有约为70kDa的条带(星号)，经MS鉴定为脑发育调节蛋白。(C)从细菌中纯化的人脑发育调节蛋白蛋白质的考马斯染色的凝胶。由于该蛋白质中有大量带负电荷的残基，检测到的条带大小与计算出的分子量不同。(D)本系列中包括的4名患者的血清显示出与纯化的人脑发育调节蛋白蛋白质的反应性(星号)。考马斯染色显示了同一条带，用抗脑发育调节蛋白和His标签的抗体也检测到该条带。(E)在培养的原代海马神经元中来自1号索引患者的人抗脑发育调节蛋白自身抗体的代表性免疫标记，与小鼠单克隆抗脑发育调节蛋白抗体相比。这两种抗体在树突棘上显示出类似的具有强免疫反应性的神经毡(neuropil)表达模式，支持与同一靶蛋白脑发育调节蛋白的结合。(F)患者血清和小鼠单克隆抗脑发育调节蛋白抗体强烈地标记其中富集了脑发育调节蛋白的树突棘。(G)利用针对突触后蛋白PSD95或Homer的抗体的共染色显示出在树突棘处的强共定位，表明在兴奋性突触后处存在脑发育调节蛋白。

图6显示了使用来自脑发育调节蛋白敲除小鼠对比野生型小鼠的脑切片的个体患者血清反应性的比较。(A_1-4)抗脑发育调节蛋白AB⁺患者血清和(A₆)小鼠单克隆抗脑发育调节蛋白抗体在野生型小鼠的海马结构中显示出强标记。(B_1-4)相反地，在使用来自脑发育调节蛋白敲除小鼠的海马的平行实验中，在海马切片上未检测到结合模式。(B₆)对于商业小鼠单克隆抗脑发育调节蛋白抗体，也不存在染色。(C_1-5)相应地，野生型小鼠(D_1-4)小脑分子层中的现有结合模式在脑发育调节蛋白敲除小鼠(C₆，D₆)中被消除，类似于小鼠单克隆抗脑发育调节蛋白抗体。在使用NHS的阴性对照(约1500个来自健康个体(A₅、B₅、C₅、D₅)的混合样品)中无可见的染色。与患者血清一起孵育的野生型小鼠的海马和小脑分子层中的精细神经毡结合模式强烈地概括了小鼠单克隆抗脑发育调节蛋白抗体的模式。

图7显示了脑发育调节蛋白片段的结合分析。(A)全长脑发育调节蛋白蛋白质的示意图，显示其结构域、外显子结构和重叠的脑发育调节蛋白片段1-6。(B)用人自身抗体(来自1至4号患者的血清)标记的全长脑发育调节蛋白及其片段1-6的代表性免疫印迹检测到全长脑发育调节蛋白以及片段4和6(星号)。考马斯和抗His标签染色显示了经加载用于免疫印迹的纯化蛋白的量。

本申请包括一系列序列，更具体地：

SEQ ID NO 1(人脑发育调节蛋白的片段_(G319-T444))

GSHLDSHRRMAPTPIPTRSPSDSSTASTPVAEQIERALDEVTSSQPPPLPPPPPPAQETQEPSPILDSEETRAAAPQAWAGPMEEPPQAQAPPRGPGSPAEDLMFMESAEQAVLAAPVEPATADAT

SEQ ID NO 2(人脑发育调节蛋白的片段_(L536-D649))

LPEPPATFCDPEEVEGESLAAPQTPTLPSALEELEQEQEPEPHLLTNGETTQKEGTQASEGYFSQSQEEEFAQSEELCAKAPPPVFYNKPPEIDITCWDADPVPEEEEGFEGGD

SEQ ID NO 3(人脑发育调节蛋白E)

MAGVSFSGHRLELLAAYEEVIREESAADWALYTYEDGSDDLKLAASGEGGLQELSGHFENQKVMYGFCSVKDSQAALPKYVLINWVGEDVPDARKCACASHVAKVAEFFQGVDVIVNASSVEDIDAGAIGQRLSNGLARLSSPVLHRLRLREDENAEPVGTTYQKTDAAVEMKRINREQFWEQAKKEEELRKEEERKKALDERLRFEQERMEQERQEQEERERRYREREQQIEEHRRKQQTLEAEEAKRRLKEQSIFGDHRDEEEETHMKKSESEVEEAAAIIAQRPDNPREFFKQQERVASASAGSCDVPSPFNHRPGSHLDSHRRMAPTPIPTRSPSDSSTASTPVAEQIERALDEVTSSQPPPLPPPPPPAQETQEPSPILDSEETRAAAPQAWAGPMEEPPQAQAPPRGPGSPAEDLMFMESAEQAVLAAPVEPATADATEIHDAADTIETDTATADTTVANNVPPAATSLIDLWPGNGEGASTLQGEPRAPTPPSGTEVTLAEVPLLDEVAPEPLLPAGEGCATLLNFDELPEPPATFCDPEEVEGESLAAPQTPTLPSALEELEQEQEPEPHLLTNGETTQKEGTQASEGYFSQSQEEEFAQSEELCAKAPPPVFYNKPPEIDITCWDADPVPEEEEGFEGGD

SEQ ID NO 4(人脑发育调节蛋白A)

MAGVSFSGHRLELLAAYEEVIREESAADWALYTYEDGSDDLKLAASGEGGLQELSGHFENQKVMYGFCSVKDSQAALPKYVLINWVGEDVPDARKCACASHVAKVAEFFQGVDVIVNASSVEDIDAGAIGQRLSNGLARLSSPVLHRLRLREDENAEPVGTTYQKTDAAVEMKRINREQFWEQAKKEEELRKEEERKKALDERLRFEQERMEQERQEQEERERRYREREQQIEEHRRKQQTLEAEEAKRRLKEQSIFGDHRDEEEETHMKKSESEVEEAAAIIAQRPDNPREFFKQQERVASASAGSCDVPSPFNHRPGRPYCPFIKASDSGPSSSSSSSSSPPRTPFPYITCHRTPNLSSSLPCSHLDSHRRMAPTPIPTRSPSDSSTASTPVAEQIERALDEVTSSQPPPLPPPPPPAQETQEPSPILDSEETRAAAPQAWAGPMEEPPQAQAPPRGPGSPAEDLMFMESAEQAVLAAPVEPATADATEIHDAADTIETDTATADTTVANNVPPAATSLIDLWPGNGEGASTLQGEPRAPTPPSGTEVTLAEVPLLDEVAPEPLLPAGEGCATLLNFDELPEPPATFCDPEEVEGESLAAPQTPTLPSALEELEQEQEPEPHLLTNGETTQKEGTQASEGYFSQSQEEEFAQSEELCAKAPPPVFYNKPPEIDITCWDADPVPEEEEGFEGGD

本发明通过以下非限制性实施例进一步说明，从所述实施例中可以获得本发明的其它特征、实施方案、方面和有利方面。

实施例

概述

方法：对4名具有成人发作癫痫和疑似慢性脑炎(病因尚未确定)的患者的血清和在基于免疫印迹的自身抗体筛查的相应结果进行靶标鉴定。因此，免疫印迹之后进行免疫沉淀和质谱分析、原代神经元培养物中的亚细胞结合模式分析以及野生型小鼠和脑发育调节蛋白敲除小鼠脑中的免疫组织化学。

结果：在具有成人发作癫痫和疑似脑炎的患者中，检测到～70kDa的免疫印迹条带，对于所述免疫印迹条带的免疫沉淀和质谱分析显示脑发育调节蛋白为推定抗原。免疫印迹结果相同的另外3名患者也是抗脑发育调节蛋白自身抗体阳性。在1500份混合的正常人血清样品中未检测到这些自身抗体。除了癫痫发作、记忆受损和脑脊液中蛋白质含量增加外，抗脑发育调节蛋白自身抗体阳性患者还会出现风湿性症状和白血病。大脑磁共振成像的改变包括杏仁核-海马T2信号增强，但也包括海马硬化症。诊断性活检显示，在一名抗脑发育调节蛋白自身抗体阳性患者中发现了细胞毒性T淋巴细胞性脑炎。抗脑发育调节蛋白自身抗体滴度、癫痫发作以及神经精神症状对免疫抑制剂疗法有反应，并在免疫疗法逐渐减弱时复发。

患者

对四名具有神经精神症状(包括复发癫痫发作以及认知和行为受损)的患者的探查在免疫印迹筛查中显示了约70kDa的主条带。在四名患者中，没有一名患者使用商业诊断试剂盒检测到常见的“神经学”自身抗体。所有程序都是根据赫尔辛基宣言进行的。从每个患者获得了书面知情同意书。

图1、2和4中概述了所有4名患者的临床数据。

新型自身抗体的筛选测试

潜在新型自身抗体的筛选测试包括免疫印迹和间接免疫荧光测试(IIFT)。对于免疫印迹，分离并通过电泳分开大鼠和小鼠脑的蛋白质裂解物、来自进行癫痫手术以缓解癫痫发作的药物抗性颞叶癫痫患者的人海马组织的蛋白质裂解物以及鼠粗制突触体的蛋白质裂解物，并且对其进行印迹。在用于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)、2％(w/v)胎牛血清(FCS)、0.2％(w/v)冷水鱼明胶封闭后，将蛋白质以7ml的总体积与血清(1:500)和CSF(1:100)一起孵育过夜，用PBS/Tween 20洗涤，与山羊抗人IRDye800CW(Odyssey，926-32232)一起孵育45分钟，并在另一洗涤步骤之后用Odyssey成像系统(LI-COR)进行成像。

在IIFT筛查中，使用了定制的基于生物芯片的测定(IIFT：Neurologie-Mosaik28,Euroimmun,FA 111-1005-28)，包括大鼠和猿猴小脑及海马切片，以筛查LE患者血清和CSF(稀释度：血清1:10，脑脊液1:1)中自身抗体的结合模式。所有IIFT测定都由专家审查员(AJB)进行分析。

免疫沉淀和质谱分析

将1g新鲜解剖的大鼠脑组织在5ml含蛋白酶抑制剂的缓冲液(100mmol/L三(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)–HCl pH 6.5，150mmol/L氯化钠，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1％(w/v)脱氧胆酸钠，和1％(w/v)Triton X-100，1％(w/v)正辛基-β-D-吡喃型葡萄糖苷)中匀浆。将裂解物在4℃旋转3小时，并在4℃以21000xg离心15分钟。在加入蛋白G Dynabeads(Thermo Fisher Scientific)并孵育过夜之前，将澄清的上清液与生物材料在4℃孵育3小时。如上所述，使用缓冲液洗涤珠粒三次。使用含有25mmol/L二硫苏糖醇的NuPAGE LDS样品缓冲液(Thermo Fisher Scientific)在70℃下洗脱10分钟。在进行4-12％SDS-PAGE(NuPAGE system,Thermo Fisher Scientific)之前，进行了氨基甲酰甲基化。蛋白质用Roti-Blue溶液(Roth)显现。从凝胶中切下与对于健康对照的血清/CSF观察到的模式相比较的额外条带，用50％和100％w/v乙腈脱色和脱水。用0.4μg胰蛋白酶在37℃下消化蛋白质6小时。为了提取肽，加入100μl浓度递增(50％，100％w/v)的乙腈，孵育5分钟并收集上清液。将肽冻干并转移到质谱(MS)中进行蛋白质鉴定。

脑发育调节蛋白片段的克隆

将全长人脑发育调节蛋白cDNA序列分成6个长度相似的片段，片段两端有51bp的重叠。将脑发育调节蛋白片段1-6经由EcoRI/NotI限制性位点通过取代全长脑发育调节蛋白而克隆到pETDuet1-T7-His-hDrebrin(wt)(Addgene质粒号4036224)中。质粒通过测序进行验证。

抗脑发育调节蛋白自身抗体结合的验证

按照Qiagen方案通过Ni⁺-亲和纯化对重组人脑发育调节蛋白蛋白质和脑发育调节蛋白片段1-6进行纯化。因此，将pETDuet1-T7-His-hDrebrin(wt)质粒(Addgene质粒号4036224)和新产生的pETDuet1-T7-His-Drebrin片段1-6转化到感受态BL21大肠杆菌(E.coli)细胞中。加入1mM IPTG(异丙基β-D-1硫代吡喃型半乳糖苷)诱导蛋白质表达，并且将细胞在裂解缓冲液(50mmol/l磷酸钠，300mmol/l氯化钠，5mmol/l咪唑，pH 8.0)中超声裂解。将裂解物离心后，上清液用Ni⁺-次氮基三乙酸(NTA)-琼脂糖(Qiagen)孵育1小时。用含有递增的咪唑浓度的洗涤缓冲液(5-80mmol/l咪唑，50mmol/l磷酸钠，300mmol/l氯化钠，pH8.0)洗涤Ni⁺-NTA琼脂。用250mmol/l的咪唑溶液洗脱蛋白质三次，持续30分钟。将800ng的蛋白质加载在SDS-PAGE上，用考马斯染色或印迹并封闭，如上所述。将该膜转移到Mini-PROTEAN II Multiscreen装置(Bio-Rad)中，并与不同的生物材料(所有四种抗脑发育调节蛋白自身抗体阳性患者，正常人血清(NHS)；稀释度：血清1:100；CSF 1:1)和商业抗脑发育调节蛋白(ab12350，abcam，1:200)和抗His标签(ab18184，abcam，1:1000)抗体在封闭缓冲液中一起孵育过夜。如上所述，使用山羊抗小鼠和山羊抗人IRDye 800CW(926-32210，926-32232，Odyssey)二抗显现条带。

原代神经元细胞的免疫细胞化学

制备原代培养小鼠海马神经元，用于PBS中的4％低聚甲醛(PFA)固定15分钟，然后在PBS中进行3次洗涤步骤。用PBS/Tween 20(0.3％(w/v)Triton X-100)透化细胞10分钟。在4℃将神经元与一抗(抗脑发育调节蛋白，ab12350，abcam，1:1000；抗PSD95，75-028，neuromab，1:500；抗Homer，160004，synaptic system，1:1000)或相应患者的血清(1:200)在PBS/Tween 20(0.1％(w/v)Triton X-100)中一起孵育过夜。在进行3次PBS洗涤步骤后，将Alexa

二抗(山羊抗人A11013,invitrogen；山羊抗小鼠A11001，Invitrogen 1:1000；山羊抗豚鼠A11-073，Invitrogen 1:1000)和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI 1:100)在PBS/Tween20中孵育45分钟。在用

封固之前，再将细胞洗涤三次。用共焦显微镜(Nikon Eclipse Ti共焦显微镜，Nikon Instruments)拍摄图像。

野生型和脑发育调节蛋白敲除小鼠的免疫组织化学

将成年雄性脑发育调节蛋白敲除(Jung G等人J Neurochem.2015；134:327-39)和年龄匹配的野生型小鼠在深度异氟醚麻醉下处死。将脑迅速取出，在4℃下于4％的PFA中固定1小时，在40％的蔗糖中再孵育24小时，然后在用液态氮冷却的异戊烷中速冻。将18μm厚的冷冻切片风干，然后用3％H₂O₂和0.5％Triton X-100孵育20分钟，用10％山羊血清孵育1小时，和用患者或对照血清(1:200)或单克隆小鼠抗脑发育调节蛋白抗体(ab12350，abcam，1:1000)在4℃孵育过夜。使用合适的生物素化二抗(Life technologies,1:500)后，用标准的抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶法检测反应性。

神经病理学

将一名回顾性抗脑发育调节蛋白自身抗体阳性患者的活检脑组织经神经外科手术切除用于诊断目的。如前所述，将组织在PFA中固定过夜，并包埋在石蜡中。将脱蜡的4.0μm切片用苏木精和伊红(HE)以及对分化簇3(CD3)、分化簇8(CD8)、神经元细胞核(NeuN)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和人白细胞抗原-DR同种型(HLA-DR)特异的商业抗体染色。使用抗生物素蛋白-过氧化物酶法观察染色。

神经成像

患者在两种不同的系统中接受cMRI。利用以下参数在Achieva 3.0T TX(PhilipsHealthcare Best,The Netherlands)上获得3D T1加权序列：体素尺寸＝1×1×1mm³，TR＝8.1ms，TE＝3.7ms，翻转角度＝8°，矩阵＝256×256像素。T1加权磁化准备快速采集梯度回波序列(MPRAGE)是在3T Siemens MAGNETOM Trio(Siemens Healthineers,Erlangen,Germany)上使用32通道头线圈采集的：体素尺寸＝0.8×0.8×0.8mm³,TR＝1660ms,TE＝2.54ms,翻转角度＝9°，矩阵＝320×320像素。使用Freesurfer v6.0.0图像分析套件对杏仁核、海马和颅内体积进行体积分析。由两个独立的评分员对分割结果的准确性和比对进行目视检查。所有分析的体积都通过颅内体积减去脑室体积进行调整。

对照

将NHS(约1500个来自健康个体的混合样品)用作对照。

实施例1：1-4号患者的临床诊断和治疗性治疗

所有四名抗脑发育调节蛋白自身抗体检测呈阳性的患者(抗脑发育调节蛋白AB⁺；1名男性，3名女性；发病年龄45岁，范围23-68岁)发展为亚急性进行性脑病，主要症状为神经精神受损，包括抑郁和认知受损和/或经证实或临床怀疑的局灶性癫痫发作或癫痫持续状态(图1)。CSF改变包括所有患者的蛋白水平升高，以及至少一个个体中单核细胞脑脊液细胞增多。T2加权图像中的cMRI变化包括动态海马体积变化以及海马外萎缩(图3A至图3D中2号患者的代表性cMRI成像)。这些病例中的一个病例(4号患者)在发病10年后通过诊断性脑活检获得了用于神经病理学分析的大脑组织，其揭示了T淋巴细胞驱动的神经退行性脑炎(图3E至J)。在三名患者(1-3号患者)中，个体免疫疗法导致癫痫发作控制方面以及自身抗体滴度降低和/或神经心理学表现的临床改善(图2和图4)。索引患者(1号患者)在啮齿动物和猿猴海马切片上具有神经毡结合模式，以及在免疫印迹上与几个条带具有显著的反应性，所述条带包括在所有脑蛋白质裂解物以及突触体裂解物(其在所有使用的对照中不存在)中的约55kDa、约70kDa、约100kDa和约130kDa的条带(图5A，星号)。这一观察表明，除了常见的神经学自身抗体之外，还存在其他抗体，这种抗体以前在该血清样本中已被排除。

实施例2：靶抗原脑发育调节蛋白的鉴定

在用从索引患者(1号患者)血清中分离的抗体对大鼠脑裂解物进行IP后，考马斯染色的SDS-PAGE也显示了额外的70kDa条带(图5B，星号)，这在任何对照中都不存在。在多个独立实验中，该条带的质谱将脑发育调节蛋白(分子量:71kDa)鉴定为在切取的凝胶块中存在的最丰富的蛋白质。在本患者系列(图5A)的脑和突触体匀浆物的免疫印迹筛选中检测到多个条带可能是由于蛋白质降解、脑发育调节蛋白的复杂翻译后修饰或存在少量额外的至今未解析的自身抗体。

为了建立筛选测定，将来自细菌的多组氨酸-(6x-His)-标记的重组人脑发育调节蛋白蛋白质纯化用于患者血清的免疫印迹实验(图5C)。用索引患者(1号患者)的血清进行的免疫印迹显示预期大小约为90kDa的条带(图5D)。据报道，由于该蛋白质的强负电荷，脑发育调节蛋白在SDS-PAGE中比其计算的质量更高地走样。接下来，我们筛选了所有四名患者的血清-1号患者和另外三名在脑和突触体匀浆物的初始免疫印迹筛选中具有相同结果的患者-以及作为阳性对照的小鼠单克隆抗脑发育调节蛋白抗体。我们观察到约90kDa处的反应性(图5D)。四名患者血清中的滴度范围为1:1000至1:10000，在三名患者中，在相应的CSF样品中也检测到抗脑发育调节蛋白自身抗体，滴度范围为1:1至1:100。NHS对照(约1500个来自健康个体的混合样品)未显示出对重组脑发育调节蛋白蛋白质的任何反应性。

实施例3：在培养的海马神经元中分析患者的生物材料反应性

所有四名患者的血清在透化的培养小鼠原代海马神经元上显示出微小的树突反应性，反映了小鼠单克隆抗脑发育调节蛋白抗体的模式(图5E中的代表性染色)。培养的神经元中的结合模式显示了对神经毡(特别是在树突棘处)的反应性，并且与商业单克隆抗脑发育调节蛋白抗体的模式相比较是类似的(图5F中的代表性染色)。所有患者的抗脑发育调节蛋白自身抗体在兴奋性突触后密度上显示出与突触后密度蛋白95(PSD95)和Homer的共定位(图5G中的代表性染色)。

实施例4：脑发育调节蛋白敲除小鼠中的抗脑发育调节蛋白自身抗体的验证

为了验证来自脑发育调节蛋白敲除和年龄匹配的野生型小鼠的患者生物材料脑切片中抗脑发育调节蛋白自身抗体的存在，将所述切片暴露于抗脑发育调节蛋白AB⁺患者的血清。所有四名患者的血清(图6A1-4)以及商业抗脑发育调节蛋白抗体(图6A6)在野生型小鼠切片上显示出强反应性，其中海马结构和小脑分子层中的结合增加(图6C1-4、6)。这种模式在敲除小鼠的组织(图6B1-4、6，D1-4、6)和阴性对照(图6A5、C5)中完全不存在。

实施例5：所有四名患者的脑发育调节蛋白自身抗体结合区的表征

为了找到脑发育调节蛋白与自身抗体结合的区域，将脑发育调节蛋白蛋白质编码序列分成6个片段，长度为113-127aa，两端有17aa的重叠区域(图7A)。通过His标签纯化脑发育调节蛋白片段1-6并通过SDS-PAGE进行分析(图7B)。蛋白质的考马斯和抗His标签标记显示片段4-6高于预期进行走样，而片段1低于预期进行走样，这可能分别归因于它们更强的负电荷和正电荷，这也解释了全长脑发育调节蛋白在SDS-PAGE上以比计算的分子量更高的分子量出现。用1号患者血清进行的免疫印迹显示，与脑发育调节蛋白片段6的反应强，与片段4的相互作用较弱。当使用其他患者的生物材料时，检测到相同的片段。片段4被3号和4号患者的血清染色，片段6被2号患者的血清检测到。片段1-3和5未有显示与任何患者的血清反应(图7B)。

本文引用的所有文件在此通过引用整体并入。

可在本文中未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制不存在的情况下适当地实施本文说明性描述的发明。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被广泛地而非限制地理解。另外，本文采用的术语和表述已经被用作描述性而非限制性的术语，并且在使用此类术语和表述时无意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，而是应当认识到，在要求保护的本发明的范围内各种修改是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已经通过优选实施方案和可选特征被具体公开，但本领域技术人员可对本文公开的本发明进行修改和变化，并且此类修改和变化被认为在本发明的范围内。本发明在本文中已经被广泛和一般地描述。属于一般公开的每一个较窄的种类和亚属分组也形成本发明的一部分。这包括对本发明的一般性描述，其中附带条件或负面限制将任何主题从该属中去除，而不管被移除的材料是否在本文中被具体描述。另外，在本发明的特征或方面是根据马库什组描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此根据马库什组的任何单个成员或成员的亚组来描述。根据以下权利要求，本发明的其它实施方案将变得显而易见。

序列表

<110> EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG

<120> 自身抗体的检测

<130> 19PP069EP

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人大脑发育调节蛋白的片段

<400> 1

Gly Ser His Leu Asp Ser His Arg Arg Met Ala Pro Thr Pro Ile Pro

1 5 10 15

Thr Arg Ser Pro Ser Asp Ser Ser Thr Ala Ser Thr Pro Val Ala Glu

20 25 30

Gln Ile Glu Arg Ala Leu Asp Glu Val Thr Ser Ser Gln Pro Pro Pro

35 40 45

Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Gln Glu Thr Gln Glu Pro Ser Pro

50 55 60

Ile Leu Asp Ser Glu Glu Thr Arg Ala Ala Ala Pro Gln Ala Trp Ala

65 70 75 80

Gly Pro Met Glu Glu Pro Pro Gln Ala Gln Ala Pro Pro Arg Gly Pro

85 90 95

Gly Ser Pro Ala Glu Asp Leu Met Phe Met Glu Ser Ala Glu Gln Ala

100 105 110

Val Leu Ala Ala Pro Val Glu Pro Ala Thr Ala Asp Ala Thr

115 120 125

<210> 2

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人大脑发育调节蛋白的片段

<400> 2

Leu Pro Glu Pro Pro Ala Thr Phe Cys Asp Pro Glu Glu Val Glu Gly

1 5 10 15

Glu Ser Leu Ala Ala Pro Gln Thr Pro Thr Leu Pro Ser Ala Leu Glu

20 25 30

Glu Leu Glu Gln Glu Gln Glu Pro Glu Pro His Leu Leu Thr Asn Gly

35 40 45

Glu Thr Thr Gln Lys Glu Gly Thr Gln Ala Ser Glu Gly Tyr Phe Ser

50 55 60

Gln Ser Gln Glu Glu Glu Phe Ala Gln Ser Glu Glu Leu Cys Ala Lys

65 70 75 80

Ala Pro Pro Pro Val Phe Tyr Asn Lys Pro Pro Glu Ile Asp Ile Thr

85 90 95

Cys Trp Asp Ala Asp Pro Val Pro Glu Glu Glu Glu Gly Phe Glu Gly

100 105 110

Gly Asp

<210> 3

<211> 649

<212> PRT

<213> 人

<400> 3

Met Ala Gly Val Ser Phe Ser Gly His Arg Leu Glu Leu Leu Ala Ala

1 5 10 15

Tyr Glu Glu Val Ile Arg Glu Glu Ser Ala Ala Asp Trp Ala Leu Tyr

20 25 30

Thr Tyr Glu Asp Gly Ser Asp Asp Leu Lys Leu Ala Ala Ser Gly Glu

35 40 45

Gly Gly Leu Gln Glu Leu Ser Gly His Phe Glu Asn Gln Lys Val Met

50 55 60

Tyr Gly Phe Cys Ser Val Lys Asp Ser Gln Ala Ala Leu Pro Lys Tyr

65 70 75 80

Val Leu Ile Asn Trp Val Gly Glu Asp Val Pro Asp Ala Arg Lys Cys

85 90 95

Ala Cys Ala Ser His Val Ala Lys Val Ala Glu Phe Phe Gln Gly Val

100 105 110

Asp Val Ile Val Asn Ala Ser Ser Val Glu Asp Ile Asp Ala Gly Ala

115 120 125

Ile Gly Gln Arg Leu Ser Asn Gly Leu Ala Arg Leu Ser Ser Pro Val

130 135 140

Leu His Arg Leu Arg Leu Arg Glu Asp Glu Asn Ala Glu Pro Val Gly

145 150 155 160

Thr Thr Tyr Gln Lys Thr Asp Ala Ala Val Glu Met Lys Arg Ile Asn

165 170 175

Arg Glu Gln Phe Trp Glu Gln Ala Lys Lys Glu Glu Glu Leu Arg Lys

180 185 190

Glu Glu Glu Arg Lys Lys Ala Leu Asp Glu Arg Leu Arg Phe Glu Gln

195 200 205

Glu Arg Met Glu Gln Glu Arg Gln Glu Gln Glu Glu Arg Glu Arg Arg

210 215 220

Tyr Arg Glu Arg Glu Gln Gln Ile Glu Glu His Arg Arg Lys Gln Gln

225 230 235 240

Thr Leu Glu Ala Glu Glu Ala Lys Arg Arg Leu Lys Glu Gln Ser Ile

245 250 255

Phe Gly Asp His Arg Asp Glu Glu Glu Glu Thr His Met Lys Lys Ser

260 265 270

Glu Ser Glu Val Glu Glu Ala Ala Ala Ile Ile Ala Gln Arg Pro Asp

275 280 285

Asn Pro Arg Glu Phe Phe Lys Gln Gln Glu Arg Val Ala Ser Ala Ser

290 295 300

Ala Gly Ser Cys Asp Val Pro Ser Pro Phe Asn His Arg Pro Gly Ser

305 310 315 320

His Leu Asp Ser His Arg Arg Met Ala Pro Thr Pro Ile Pro Thr Arg

325 330 335

Ser Pro Ser Asp Ser Ser Thr Ala Ser Thr Pro Val Ala Glu Gln Ile

340 345 350

Glu Arg Ala Leu Asp Glu Val Thr Ser Ser Gln Pro Pro Pro Leu Pro

355 360 365

Pro Pro Pro Pro Pro Ala Gln Glu Thr Gln Glu Pro Ser Pro Ile Leu

370 375 380

Asp Ser Glu Glu Thr Arg Ala Ala Ala Pro Gln Ala Trp Ala Gly Pro

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405 410 415

Pro Ala Glu Asp Leu Met Phe Met Glu Ser Ala Glu Gln Ala Val Leu

420 425 430

Ala Ala Pro Val Glu Pro Ala Thr Ala Asp Ala Thr Glu Ile His Asp

435 440 445

Ala Ala Asp Thr Ile Glu Thr Asp Thr Ala Thr Ala Asp Thr Thr Val

450 455 460

Ala Asn Asn Val Pro Pro Ala Ala Thr Ser Leu Ile Asp Leu Trp Pro

465 470 475 480

Gly Asn Gly Glu Gly Ala Ser Thr Leu Gln Gly Glu Pro Arg Ala Pro

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515 520 525

Thr Leu Leu Asn Phe Asp Glu Leu Pro Glu Pro Pro Ala Thr Phe Cys

530 535 540

Asp Pro Glu Glu Val Glu Gly Glu Ser Leu Ala Ala Pro Gln Thr Pro

545 550 555 560

Thr Leu Pro Ser Ala Leu Glu Glu Leu Glu Gln Glu Gln Glu Pro Glu

565 570 575

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Glu Glu Glu Gly Phe Glu Gly Gly Asp

645

<210> 4

<211> 695

<212> PRT

<213> 人

<400> 4

Met Ala Gly Val Ser Phe Ser Gly His Arg Leu Glu Leu Leu Ala Ala

1 5 10 15

Tyr Glu Glu Val Ile Arg Glu Glu Ser Ala Ala Asp Trp Ala Leu Tyr

20 25 30

Thr Tyr Glu Asp Gly Ser Asp Asp Leu Lys Leu Ala Ala Ser Gly Glu

35 40 45

Gly Gly Leu Gln Glu Leu Ser Gly His Phe Glu Asn Gln Lys Val Met

50 55 60

Tyr Gly Phe Cys Ser Val Lys Asp Ser Gln Ala Ala Leu Pro Lys Tyr

65 70 75 80

Val Leu Ile Asn Trp Val Gly Glu Asp Val Pro Asp Ala Arg Lys Cys

85 90 95

Ala Cys Ala Ser His Val Ala Lys Val Ala Glu Phe Phe Gln Gly Val

100 105 110

Asp Val Ile Val Asn Ala Ser Ser Val Glu Asp Ile Asp Ala Gly Ala

115 120 125

Ile Gly Gln Arg Leu Ser Asn Gly Leu Ala Arg Leu Ser Ser Pro Val

130 135 140

Leu His Arg Leu Arg Leu Arg Glu Asp Glu Asn Ala Glu Pro Val Gly

145 150 155 160

Thr Thr Tyr Gln Lys Thr Asp Ala Ala Val Glu Met Lys Arg Ile Asn

165 170 175

Arg Glu Gln Phe Trp Glu Gln Ala Lys Lys Glu Glu Glu Leu Arg Lys

180 185 190

Glu Glu Glu Arg Lys Lys Ala Leu Asp Glu Arg Leu Arg Phe Glu Gln

195 200 205

Glu Arg Met Glu Gln Glu Arg Gln Glu Gln Glu Glu Arg Glu Arg Arg

210 215 220

Tyr Arg Glu Arg Glu Gln Gln Ile Glu Glu His Arg Arg Lys Gln Gln

225 230 235 240

Thr Leu Glu Ala Glu Glu Ala Lys Arg Arg Leu Lys Glu Gln Ser Ile

245 250 255

Phe Gly Asp His Arg Asp Glu Glu Glu Glu Thr His Met Lys Lys Ser

260 265 270

Glu Ser Glu Val Glu Glu Ala Ala Ala Ile Ile Ala Gln Arg Pro Asp

275 280 285

Asn Pro Arg Glu Phe Phe Lys Gln Gln Glu Arg Val Ala Ser Ala Ser

290 295 300

Ala Gly Ser Cys Asp Val Pro Ser Pro Phe Asn His Arg Pro Gly Arg

305 310 315 320

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325 330 335

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Pro Arg Thr Pro Phe Pro Tyr Ile Thr

340 345 350

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Asp Ser His Arg Arg Met Ala Pro Thr Pro Ile Pro Thr Arg Ser Pro

370 375 380

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405 410 415

Pro Pro Pro Ala Gln Glu Thr Gln Glu Pro Ser Pro Ile Leu Asp Ser

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435 440 445

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450 455 460

Glu Asp Leu Met Phe Met Glu Ser Ala Glu Gln Ala Val Leu Ala Ala

465 470 475 480

Pro Val Glu Pro Ala Thr Ala Asp Ala Thr Glu Ile His Asp Ala Ala

485 490 495

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515 520 525

Gly Glu Gly Ala Ser Thr Leu Gln Gly Glu Pro Arg Ala Pro Thr Pro

530 535 540

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Glu Glu Val Glu Gly Glu Ser Leu Ala Ala Pro Gln Thr Pro Thr Leu

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675 680 685

Glu Gly Phe Glu Gly Gly Asp

690 695

Claims

1.一种在诊断上有用的载体，其包含

含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其变体中所示的氨基酸序列的肽。

2.根据权利要求1所述的在诊断上有用的载体，其中所述载体选自载玻片、生物芯片、微量滴定板、侧向流动装置、测试条、膜、线印迹、色谱柱和珠粒。

3.一种试剂盒，其包括根据权利要求1或2所述的在诊断上有用的载体和用于检测人自身抗体的抗体。

4.一种用于诊断神经学疾病的方法，其包括

在患者的样品中检测特异性结合脑发育调节蛋白的自身抗体的存在。

5.一种组合物，其包含：

a)包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或其变体中所示的氨基酸序列的肽，和

b)药学上可接受的载体。

6.根据权利要求5所述的组合物或者根据权利要求1或2所述的在诊断上有用的载体，其用于诊断神经学疾病。

7.一种检测特异性结合脑发育调节蛋白的自身抗体的存在或不存在的方法，其包括

i)将从患有神经学疾病的受试者中分离的样品与包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4或其变体的肽接触，其中所述肽特异性结合与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4结合的自身抗体；

ii)检测在与所述肽的复合物中是否存在针对脑发育调节蛋白的自身抗体。

8.(i)包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其变体中所示的氨基酸序列的肽或(ii)编码包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其变体中所示的氨基酸序列的肽的核酸载体在制备用于检测神经学疾病的试剂盒中的用途。

9.根据权利要求4所述的方法、根据权利要求6所述的用于所述用途的组合物或载体或载体或者根据权利要求8所述的用途，其中所述神经学疾病是神经学自身免疫性疾病，优选脑炎、癫痫发作或癫痫。

10.根据权利要求4或7所述的方法，其中所述样品是血液、血清、血浆、脑脊液(CSF)、尿液或唾液。

11.根据权利要求4所述的方法或根据权利要求7所述的方法，其中所述针对SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的自身抗体选自IgG、IgA和IgM类抗体。

12.根据权利要求4所述的方法、根据权利要求7所述的方法或根据权利要求8所述的用途，其中所述检测包括印迹测定、化学发光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、光散射免疫测定、放射性标记免疫测定或免疫荧光测定。

13.一种与脑发育调节蛋白特异性结合的人自身抗体。

14.各自包含与脑发育调节蛋白特异性结合的自身抗体的患者样品或所述样品的纯化衍生物在免疫测定中作为阳性对照的用途。

15.一种用于治疗神经学自身免疫性疾病的治疗性化合物或治疗性化合物的组合，其中所述神经学自身免疫性疾病与特异性结合脑发育调节蛋白的自身抗体相关，其中所述治疗性化合物或组合选自

a)丙戊酸、拉莫三嗪、左乙拉西坦、拉考沙胺、奥卡西平、氯巴占和唑尼沙胺；和/或

b)免疫抑制剂以及包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其变体中所示的氨基酸序列的肽。

16.根据权利要求15所述的用于所述用途的治疗性化合物或治疗性化合物的组合，其中所述免疫抑制剂选自泼尼松、地塞米松、氢化可的松、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、芬戈莫德、多球壳菌素、霉酚酸、依维莫司、西罗莫司、他克莫司和环孢素。